INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA … · conheci durante minha estada em Piracicaba e por quem aprendi a ter especial carinho. Ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt),

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ASPECTOS MORFOANATÔMICOS, BIOQUÍMICOS E GENÉTICOS DE HIMATANTHUS SUCUUBA WOOD., EM AMBIENTE DE VÁRZEA

E DE TERRA FIRME DA BACIA AMAZÔNICA

CRISTIANE DA SILVA FERREIRA

Manaus, Amazonas

Outubro, 2006

CRISTIANE DA SILVA FERREIRA

ASPECTOS MORFOANATÔMICOS, BIOQUÍMICOS E GENÉTICOS DE HIMATANTHUS SUCUUBA WOOD., EM AMBIENTE DE VÁRZEA

E DE TERRA FIRME DA BACIA AMAZÔNICA

Orientadora: Dra. Maria Teresa Fernandez Piedade

Co-orientador: Dr. Antônio Vargas de Oliveira Figueira

Tese apresentada ao Programa Integrado

de Pós-Graduação em Biologia Tropical e

Recursos Naturais, como parte dos

requisitos para obtenção do título de

Doutor em CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, área

de concentração em BOTÂNICA.

ii

Projeto INPA/Max-Planck de Cooperação Brasil-Alemanha

Manaus, Amazonas Outubro, 2006

F383 Ferreira, Cristiane da Silva Aspectos morfoanatômicos, bioquímicos e genéticos de Himatanthus Sucuuba Wood., em ambiente de várzea e de terra firme da bacia Amazônica/

Cristiane da Silva Ferreira-- /Manaus : [s.n.], 2006. 90p. : 7 il. Tese (Doutorado)--- INPA/UFAM. Programa de Pós- Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais. Orientador : Maria Teresa Fernandez Piedade Co-orientador: Antônio Vargas de Oliveira Figueira

Área de concentração : Botânica 1. Himatanthus sucuuba – Ciclo de vida. 2. Himatanthus sucuuba - Amazônia. 3. Himatanthus sucuuba – Avaliação genética. I. Título.

Sinopse: Himatanthus sucuuba Wood. (Apocynaceae), é uma espécie que habita ecossistemas de várzea e de terra firme na Amazônia Central. Plântulas obtidas de sementes oriundas dos dois ambientes foram submetidas a experimentos diferenciados de inundação, durante os quais foram verificadas as respostas morfoanatômicas e metabólicas da espécie ao alagamento. Análises de similaridade genética entre as populações dos dois ambientes, em regiões eqüidistante ao longo do Rio Solimões, foram realizadas por meio do marcador molecular ITS (internal transcribed spacer).

Palavras-Chave: Adaptações ao alagamento, diferença entre populações, metabolismo de carboidratos, anoxia, biomassa.

iii

A minha querida avó,

Maria Furtunata Miranda, que muito antes eu começar a descobrir a

importância da Amazônia para os outros povos, antes de eu descobrir um mundo

além de suas matas, me iniciou no conhecimento das plantas e me ensinou a

respeitar todos os outros elementos da floresta. Minha primeira professora de

Botânica.

Dedico

A Deus

e a minha família

Ofereço

iv

v

“Não quero ser o grande rio caudaloso Que figura nos mapas.

Quero ser o cristalino fio d'água

Que canta e murmura na mata silenciosa” ( Helena K.)

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter conseguido concluir mais uma etapa da minha vida

profissional, e a Nossa Senhora, que me iluminou em toda essa caminhada.

Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais INPA/UFAM e a Coordenação do Curso de Botânica pela oportunidade

concedida na realização desse curso.

Agradeço a CAPES pela concessão de minha bolsa de estudos, ao Projeto

Inpa/Max-Planck e PPI nº 3600 que financiaram parte dessa pesquisa.

À minha orientadora, Dra. Maria Teresa Fernandez Piedade pelo apoio e

compreensão demonstrada desde a época do mestrado. Admirável figura como

pesquisadora dos segredos dessa Amazônia, e como amiga para os segredos dessa aprendiz

amazônida.

Agradeço especialmente ao Dr. Antônio Vargas de Oliveira Figueira por ter

aceitado me co-orientar, disponibilizado toda infra-estrutura do laboratório e por ter

dedicado parte de seu tempo para tentar solucionar as perguntas que eu lhe apresentava.

Aos Drs. Marcos Silveira Buckeridge e Marco Aurélio Tiné pela assistência na

parte de bioquímica da tese e pela paciência e atenção dispensada durante a discussão dos

resultados.

Ao Dr. Junk pelo apoio e a confiança depositada em mim nos seis anos no Projeto

INPA/Max-Planck e durante toda a elaboração deste trabalho.

Ao Exército Brasileiro, Comando de Fronteira Solimões / 8º Batalhão de Infantaria

de Selva, na pessoa do Tenente Coronel Francisco José Fonseca de Medeiros, que nos

forneceram o apoio logístico em campo e nos acompanharam nas coletas em Tabatinga e

Benjamin Constant.

Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP) e de forma

diferenciada ao grupo do Laboratório de Melhoramento de Plantas, em especial a Janaína,

que esteve presente desde meus primeiros dias em Piracicaba, colega de classe, de

laboratório, de apartamento, dos dias alegres e daqueles difíceis; Débora, Lorena, Rachel e

Danielle, queridas amigas, que me fizeram sentir em casa mesmo estando tão distante; a

Jurema, que chegou depois, mas que se tornou igualmente especial; ao Paulo Albuquerque

e José Carlos, pelas nossas conversas científicas ou não no dia-a-dia do laboratório II ao

lado da salinha radioativa; ao Raul, Joni, Vagner, Rogério, Tercílio, Gildemberg (Jupará),

vii

João, Renato e Nebó, que sempre me falaram com otimismo, mesmo quando no 10º gel de

agarose, nada aparecia; a Raquel, Eduardo e Wlamir, sempre prestativos e queridos.

Aos amigos de fora do Laboratório Yuri, Licínia, Isabele, Roberta e Thomas, que

conheci durante minha estada em Piracicaba e por quem aprendi a ter especial carinho.

Ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt), de forma singular ao Laboratório de

Fisiologia e Bioquímica, que forneceu a estrutura para a realização das análises

bioquímicas. Aos colegas de bancada: Aline, Marina, Paty Pinho, Vanessa, Kelly,

Fernanda, Fernandinha, Naira, Amanda Sousa (Amandona), Amanda Sousa (Amandinha),

Amanda Asega, Fabinho, Rodrigo, Rosana e Ludimila pelo carinho e a amizade com que

me receberam. E aos demais colegas, técnicos e pesquisadores da Seção, em especial a

Dra. Maríliia, Dra. Rita, Dra. Márcia e Dr. Marcos Aidar, pela especial atenção, nos

momentos que os procurei.

Aos colegas de alojamento do IBt, com os quais aprendi valores importantes e que

se estenderam além da vida acadêmica. Às colegas de quarto: Angélica, Fernanda,

Cristiane, Andréa e Crosseti; e demais colegas residentes ou passageiros que sempre

encontraram uma forma alegre de passar o tempo e diminuir a saudade de casa. Pelo

companheirismo especial de alguns colegas de “Aloja” nas conversas que se estendiam

pela noite, e parceiros também de futebol, no campo improvisado no estacionamento do

IBt: Patrícia Jungbluth, Priscila, Milton Félix, Adriano e Sandra.

Aos colegas, que ainda estão ou que passaram pelo Inpa: Marcicleide, Kinupp,

Dayson, Helenires, Elen, Valéria, Tânia, Márcio, KK Bonates, Keid e Tony. A amizade de

vocês foi um dos bens mais precioso que adquiri ao longo dessa Pós-Graduação “inpiana”.

A Keillah Mara, Socorro Lira, Josephina Veiga e Carol Schwendener, verdadeiras

amigas-irmãs. Pelos favores, colos, discussão e momentos de muita alegria.

Ao querido casal Cecília & Reinaldo pelas discussões sérias ou simplesmente para

passar o tempo, por todo o apoio e pela amizade que me dedicaram.

Aos colegas pesquisadores, técnicos e estagiários do Projeto INPA/Max-Planck,

obrigada por terem me recebido carinhosamente de volta: a Astrid, que acompanhou mais

de perto os momentos da finalização e muitas vezes de aflição da tese e que sempre me

passou otimismo; ao Florian, Rubens Piedade, Auristela, Maristela, Jomber, Jochen,

Suzana, Aline, Eva, Maria Astrid, Daniel, Liene e de forma especial ao Sinomar, Robson,

Arianna, Sammya e Joneide, sempre dispostos a dar uma força quando foi necessário; a

Araceli e a Nina, que chegaram do outro lado do mundo e souberam de forma rápida se

viii

tornarem queridas; ao Valdeney, Celso, Lúcia, Wallace e Edivaldo que me acompanharam

e apoiaram durante as várias fases deste trabalho.

A Neide que sempre foi mais que a secretária do curso. Pela dedicação e seriedade

com que cuida dos que passam pela Botânica. É uma botânica nata, a verdadeira “alma” do

Programa, por toda essa amizade que nasceu durante meu período de Pós.

À turma da secretaria geral, Charles, Pedrinho, Arnoldo, Elci, Lira e Bia, sempre

prestativos. Por todo o auxílio nas várias fases da minha trajetória na Pós.

Agradeço também aos meus amigos Luis Carneiro e Patrícia Cordeiro, que mesmo

distantes, sempre reforçaram a torcida pelo meu sucesso.

Meus primos Ednaldo Nelson e Veridiana Scudeller, por me ampararem quando eu

mais precisei, no momento fundamental de toda essa jornada, e especialmente por

colocarem na minha vida as pessoinhas que tiveram, sem saber, um papel importantíssimo

nessa hora, o Pedro e a Luisa.

Às minhas primas Édsa, Lucinéia e Moara, além de tudo, minhas grandes e

queridas amigas.

Aos meus irmãos Vera, Cleisiane, Sérgio, Carlos Junio e Rodrigo; meus cunhados

Rayson e Jerry, e ao meu tio Dornélio, sou grata pela segurança e estímulos ao longo da

minha caminhada.

Aos meus sobrinhos Rayssa, Rayanne, Railson, Eduardo, Cayque e Larissa, minhas

preciosidades.

À minha mãe Dalva e minha avó Maria, pelo amor que me dedicaram e que foram

meus exemplos de força e perseverança. Meu pai Carlos Alberto, in memoriam, que de

alguma forma esteve sempre presente.

Ao querido amigo e companheiro Augusto que soube ser tão especial a todo o

momento, tendo um pouquinho de cada personagem importante que atuou nessa fase de

final da tese, e ao mesmo tempo foi único, nas vezes em que se esforçou para compartilhar

comigo sua experência, além da força e a energia que me foram essenciais.

E a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse realizado.

ix

RESUMO GERAL

As plantas que ocorrem em ambientes sujeitos a ciclos anuais de inundação exibem

uma série das adaptações que permitem a essas espécies sobreviver a longos períodos de

redução ou mesmo ausência de oxigênio em todas as fases do seu ciclo de vida. Por outro

lado, não se espera que uma espécie da terra firme apresente estes tipos de adaptação.

Entretanto, este não parece ser caso de Himatanthus sucuuba, uma árvore que é encontrada

naturalmente colonizando as florestas de terra firme e de várzea ao longo do rio

Amazonas/Solimões. Estudos morfoanatômicos, bioquímicos e genéticos foram realizados

com populações de H. sucuuba que habitam a várzea e a terra firme na tentativa de

compreender os mecanismos que permitem que esta espécie colonize com sucesso estes

dois ecossistemas com características ambientais contrastantes. A síntese do conhecimento

atual (Capítulo I) fornece a fundamentação teórica necessária para a execução deste estudo.

Foi feita análise comparativa da constituição de reservas das sementes nas duas populações

(várzea e terra firme) e, por meio de experimentos independentes de inundação das

plântulas, em condições controladas, foram acompanhados: a) os aspectos do crescimento,

sobrevivência e incremento de biomassa, assim como alterações na morfologia da plântula

e na anatomia das folhas como resposta ao alagamento (Capítulo II). Essas respostas foram

analisadas em termos de suas implicações para o metabolismo e estabelecimento das

plântulas. Esses aspectos foram posteriormente desenvolvidos no Capítulo III, onde as

modificações no metabolismo de carboidratos nas plântulas de várzea e terra firme sujeitas

a anoxia na ausência de luz foram analisadas. Pelo fato de que estudos prévios com

populações desta espécie das regiões próximas a Manaus mostraram diferenças

bioquímicas e morfoanatômicas entre as populações dos dois ambientes, procedeu-se a

avaliação genética, pela análise de polimorfismo, em populações da espécie coletadas em

três regiões eqüidistantes ao longo do rio Solimões: Benjamim Constant, Tefé e Manaus

(Capítulo IV). As diferenças entre as populações se manifestam em níveis bioquímicos,

anatômicos e de incorporação e partição de biomassa nas plântulas em resposta ao

alagamento experimental, assim como na análise das seqüências de ITS (Internal

Transcribed Spacer). Por outro lado, a morfologia externa mostrou-se similar entre as duas

populações. Desta forma, são necessários ainda estudos dos sistemas reprodutivos e coletas

adicionais para confirmar ou não as tendências observadas e discutidas. Entretanto, pode

ser sugerida para a região amazônica uma diversidade florística bem superior àquela

presentemente assumida.

x

ABSTRACT

Plants that occur in environments that are subjected to annual cycles of flooding

have a series of adaptations to survive long periods of oxygen deprivation in all phases of

the life cycle. On the other hand, it is not expected that terra firme species would exhibit

these types of adaptation. However, this should not be the case of Himatanthus sucuuba, a

tree that is naturally found in both the terra firme and varzea forests along the

Amazon/Solimões River. Morphoanatomic, biochemical and genetic studies were

performed in terra firme and the varzea populations of H. sucuuba in an attempt to

understand the mechanisms that allow this species to successfully colonize these two

contrasting environments, the terra firme and the varzea. A synthesis of the current

knowledge is presented in chapter 1, which provides the necessary background for the

performed studies. I compared the seed reserve constitution of both the varzea and terra

firme populations of H. sucuuba. Seedling survival, growth, biomass accumulation,

changes in seedling morphology and in leaf anatomy in response to experimentally

controlled flooding were followed in seedlings from terra firme and varzea populations

subjected to partial and complete submersion (Chapter 2). The seedling response was

analyzed in terms of its implications for plant establishment and plant metabolism. This

was further developed in chapter 3, where the modifications of carbohydrate metabolism of

terra firme and varzea seedlings subjected to anoxia and absence of light was analyzed.

Because previous studies with Manaus populations of this species has suggested that terra

firme and varzea populations differed both in terms of morphoanatomy and biochemistry,

the genetic constitution of terra firme and varzea populations of this species was evaluated

by polymorphism analyses (chapter IV) using plant material collected in three equidistant

regions along the Solimões/Amazonas river: Bejamim Constant, Tefé and Manaus. H.

succuba showed genetic variation both between the terra firme and varzea populations

(variation between habitats) as well as along the Solimões/Amazonas River (latitudinal

difference). In addition there were clear differences at the biochemical level, in anatomy

and in biomass accumulation and partition between terra firme and varzea seedlings in

response to experimental flooding, as well as concerning sequences of the ITS (Internal

Transcribed Spacer). On the other hand external morphology was similar between both

populations. Therefore, additional studies are still necessary especially on the reproductive

systems in order to reinforce the trends observed and discussed. However, so far, we may

suggest for the Amazon region a higher floristic diversity than the currently assumed.

xi

ÍNDICE

RESUMO GERAL....................................................................................................... IX

ABSTRACT................................................................................................................. X

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................. XIV

LISTA DE TABELAS................................................................................................. XVI

CAPÍTULO I: Caracterização dos ambientes e ecofisiologia da vegetação................ 1

INTRODUÇÃO........................................................................................................... 2

1. Características gerais da Amazônia Ocidental......................................................... 2

1.1. Área total e as áreas inundáveis.............................................................................

1.2. Florestas de terra firme da Amazônia....................................................................

1.3. Características das florestas inundáveis: diferenças entre várzea e igapó.............

1.4. Florestas de várzeas na Amazônia.........................................................................

2

2

3

4

1.5. Florestas de várzea versus florestas de terra firme................................................ 5

2. Características das plantas inundadas....................................................................... 6

2.1. Germinação e desenvolvimento inicial: fases críticas na tolerância a inundação. 6

2.2. Alterações metabólicas das plantas sob alagamento............................................. 7

2.3. Sobrevivência de plantas ao alagamento das várzeas na Amazônia Central......... 9

3. Informações botânicas e econômicas da espécie em estudo..................................... 10

3.1. Distribuição geográfica.......................................................................................... 10

3.2. Morfologia e ecologia............................................................................................ 11

3.3. Importância econômica.......................................................................................... 12

OBJETIVO GERAL.................................................................................................... 13

HIPÓTESE................................................................................................................... 13

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 13

CAPÍTULO II: Respostas das plântulas de H. sucuuba ao alagamento: aspectos

morfoanatômicos das folhas, análise de crescimento, biomassa e sobrevivência........

20

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 21

2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 23

2.2. Áreas de estudo e coleta de material vegetal......................................................... 23

2.2.1. Fase da planta em estudo.................................................................................... 24

xii

2.3. Estabelecimento do experimento de alagamento................................................... 24

2.4. Crescimento, avaliação morfológica e sobrevivência das plântulas...................... 25

2.5. Biomassa................................................................................................................ 25

2.6. Número de folhas, área foliar e análise anatômica das folhas............................... 26

2.7. Delineamento experimental e análises estatísticas................................................ 27

3. RESULTADOS........................................................................................................ 27

3.1. Crescimento........................................................................................................... 27

3.2. Alterações na morfologia das plântulas................................................................. 28

3.3. Sobrevivência das plântulas durante os experimentos de submersão.................... 30

3.4. Acumulação de biomassa...................................................................................... 30

3.6. Número de folhas, área foliar total (AFT) e freqüência estomática...................... 32

3.7. Características da epiderme................................................................................... 34

4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 35

CONCLUSÃO............................................................................................................. 39

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 39

CAPÍTULO III: Análises bioquímicas das sementes e de raízes de plântulas de

Himatanthus sucuuba...................................................................................................

43

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 44


2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo................................. 46

2.2. Análises da composição das sementes................................................................... 46

2.2.1. Sementes inteiras................................................................................................ 46

2.2.2. Análise das reservas do endosperma.................................................................. 47

2.2.3. Produção de plântulas para o estabelecimento dos experimentos de

alagamento....................................................................................................................

48

2.2.4. Análises bioquímicas das raízes das plântulas................................................... 49

2.2.5. Análise estatísticas dos dados............................................................................ 49

3. RESULTADOS........................................................................................................ 50

3.1. Análise das sementes............................................................................................. 50

3.2. Análise bioquímica das raízes das plântulas sob alagamento............................... 52

4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 56

4.1. Análise das reservas nas sementes......................................................................... 56

4.2. Análise do metabolismo das raízes de plântulas de H. sucuuba........................... 59

xiii

5. CONCLUSÕES........................................................................................................ 62

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 63

CAPÍTULO IV: Análise filogenética de Himatanthus sucuuba, baseada na

seqüência de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA..................................................

68

1.INTRODUÇÃO......................................................................................................... 69


2.1 Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo.................................. 71

2.2 Análises moleculares..............................................................................................

2.2.1. Extração de DNA genômico total.......................................................................

73

73

2.2.2 Amplificação enzimática de fragmentos (PCR, Polymerase Chain Reaction).... 74

2.2.3 Clonagem e seqüenciamento das regiões de ITS................................................ 74

2.2.4 Análise das seqüências....................................................................................... 75

3.RESULTADOS........................................................................................................ 75

3.1 Eletroforese e seqüenciamento das regiões de ITS................................................ 75

3.2 Análise de similaridade entre as seqüências........................................................... 77

4. DISCUSSÃO............................................................................................................ 79

5. CONCLUSÃO......................................................................................................... 82

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................

CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................

Literatura citada........................................................................................................

82

85

90

ANEXOS

xiv

LISTA DE FIGURAS

Capitulo I

Figura 1 – Detalhes da espécie em estudo H. sucuuba: A) árvore com cerca de 20m de

altura; B) disposição das folhas e posição da inflorescência (seta); C) fruto folículo

geminado; e D) sementes aladas....................................................................................12

Capitulo II

Figura 1 – Mapa das áreas de coleta de sementes de H. sucuuba, nas áreas de várzea e terra

firme próximas a Manaus. .............................................................................................23

Figura 2 – Crescimento médio acumulativo das plântulas de H. sucuuba, durante os 90 dias

de experimentação: A) populações da várzea e B) populações da terra firme. Dados

expressos em termos de média + erro padrão, n = 10...................................................28

Figura 3 – Detalhes das raízes de plântulas de H. sucuuba, submetidas ao tratamento de

submersão parcial. A) tratamento VZSP; B) tratamento TFSP. L = lenticelas e R = raízes

adventícias.....................................................................................................................29

Figura 4 – Raízes de plântulas de H. sucuuba aos 90 dias do tratamento de inundação total.

A = várzea e B = terra firme. ........................................................................................30

Figura 5 – Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de

H. sucuuba. pc) parede celulósica; ct) cutícula; e) estômato; cg) células guardas; cs) células

subsidiárias. ..................................................................................................................34

Figura 6 – A) epiderme abaxial com estômatos geminados (eg). B) detalhe da epiderme

abaxial mostrando os estômatos. .................................................................................35

Figura 7 – Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de

H. sucuuba, submetidas ao tratamento de alagamento total. ct) cutícula; e)

estômato.......................................................................................................................35

Capítulo III

Figura 1 – Área dos constituintes do endosperma da semente de H.

sucuuba........................................................................................................................51

xv

Capítulo IV

Figura 1 – Mapa do Estado do Amazonas, com a identificação das regiões dos municípios

de Benjamin Constant, Tefé e Manaus, localizados as margens do Rio

Solimões......................................................................................................................71

Figura 2 – A) Coleta de material vegetal das plantas de sucuúba, para uso nas análises

moleculares. B) a seta indica a região do câmbio (camada esbranquiçada, mais superficial)

retirada e armazenada em sílica gel. I = raio de 1cm..................................................72

Figura 3 – Gel de eletroforese 1% agarose. As bandas visualizadas são: 1 = TFBC1; 2 =

VZBC1; 3 = TFTF1; 4 = VZTF1; 5 = TFMN1 e 6 = VZMN1. MM = marcador molecular -

foi usado λHindIII.......................................................................................................76

Figura 4 – Esquema da região de ITS (ITS1 e ITS2) do gene de ribossomo (rDNA). Os

genes são representados pelos retângulos, com os espaços intergênicos entre eles. A seta

indica a direção dos primers utilizados para amplificação da região intergênica.

.....................................................................................................................................76

Figura 5 – Árvore filogenética mostrando a relação entre as populações de sucuúba da terra

firme e da várzea, nas três regiões geográficas amostradas: Benjamin Constant (VZBC e

TFBC); Tefé (VZTF e TFTF) e Manaus (VZMN e TFMN). Os números nas ramificações

representam o percentual de 1000 bootstrap. .............................................................78

Figura 6 – Fenograma resultante do alinhamento das seqüências de ITS1-58.S – ITS2

rDNA das populações de sucuúba, ao longo da calha do Rio

Solimões/Amazonas....................................................................................................79

Figura 7 – Sobreposição de padrões de endemismo em plantas, borboletas e pássaros do

Neotrópico, identificadas como “refúgios” [Retirado de Haffer & Prance

(2002)].........................................................................................................................81

Considerações Finais

Figura 1. Fluxograma com as principais características demonstradas pelas populações de

Himatanthus sucuuba, durante a fase de germinação e de estabelecimento de plântulas em

ambientes de várzea e de terra firme. * dados complementares de Ferreira (2002)...88

xvi

LISTA DE TABELAS

Capítulo II

Tabela 1 – Presença (S), ausência (N) e intensidade (+) das alterações morfológicas

apresentadas pelas plântulas em função do alagamento...............................................29

Tabela 2 – Taxa de sobrevivência das plântulas após 90 dias do início dos experimentos de

submersão. n = 10.........................................................................................................30

Tabela 3 – Valores médios da biomassa total (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a

partir de sementes das populações de várzea e de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob

diferentes tratamentos de submersão............................................................................31

Tabela 4 – Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas

a partir de sementes das populações de várzea, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos

de submersão................................................................................................................32

Tabela 5 – Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas

a partir de sementes das populações de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob diferentes

tratamentos de submersão. P51..................................................................................32

Tabela 6 – Média dos valores de número de folhas, área foliar total (AFT) da plântula e

freqüência estomática de H. sucuuba, 30 dias após o início dos tratamentos de submersão.

...................................................................................................................................33

Tabela 7 – Influência do alagamento no comprimento e na largura de estômatos; e no

tamanho do poro estomático das folhas de plântulas de H. sucuuba, dos ambientes de

várzea e terra firme....................................................................................................34

Capitulo III

Tabela 1 – Concentração de amido e açúcares solúveis totais em lotes de três sementes de

H. sucuuba de populações da várzea e da terra firme. n = 51..................................50

Tabela 2 – Valores médios da massa seca de lotes com 10 sementes de H. sucuuba: massa

do endosperma, do embrião e total (semente inteira). n = 5...................................50

Tabela 3 – Percentual (área) dos monossacarídeos de reserva de parede, no endosperma de

H. sucuuba............................................................................................................51

xvii

Tabela 4 – Valores médios das concentrações de malato (μg.g-1 MS) nos diferentes

tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme ao 15 e 30 dias de

avaliação. n = 3 ....................................................................................................52

Tabela 5 – Valores médios das concentrações de citrato (μg.g-1 MS) nos diferentes


avaliação. n = 3......................................................................................................53

Tabela 6 – Valores médios das concentrações de frutose (μg.g-1 MS) nos diferentes


avaliação. n = 3......................................................................................................54

Tabela 7 – Valores médios das concentrações de glucose (μg.g-1 MS) nos diferentes


avaliação. n = 3......................................................................................................54

Tabela 8 – Valores médios das concentrações de mioinositol (μg.g-1 MS) nos diferentes


avaliação. n = 3. ....................................................................................................55

Tabela 9 – Valores médios das concentrações de sacarose (μg.g-1 MS) nos diferentes


avaliação. n = 3.....................................................................................................56

Capítulo IV

Tabela 1 – Identificação das amostras de sucuúba coletadas de populações que colonizam

áreas ao longo da Bacia Amazônica.....................................................................73

Tabela 2 – Tamanho dos fragmentos amplificados via PCR utilizando os primers ITS1 e

ITS4, nas populações de terra firme (TF) e várzea (VZ) das três regiões geográficas

(municípios de Benjamin Constant, Tefé e Manaus).......................................... 77

1

CAPÍTULO I

Caracterização dos ambientes e ecofisiologia da vegetação

2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1. Características gerais da Amazônia Ocidental

1.1 - Área total e as áreas inundáveis

A Amazônia é a maior reserva de diversidade biológica do mundo e também o

maior bioma brasileiro em extensão, ocupando quase a metade do território nacional

(49,29%). A bacia amazônica cobre 2/5 da América do Sul e 5% da superfície terrestre.

Sua área, de aproximadamente 6,5 milhões de quilômetros quadrados, abriga a maior rede

hidrográfica do planeta, que escoa cerca de 1/5 do volume de água doce do mundo.

Sessenta por cento da bacia amazônica se encontra em território brasileiro, se estendendo

pela totalidade de cinco unidades da federação (Acre, Amapá, Amazonas, Pará e Roraima),

grande parte de Rondônia (98,8%), mais da metade de Mato Grosso (54%), além de parte

do Maranhão (34%) e Tocantins (9%) (IBGE, 2004).

Apesar de aparentar uniformidade em termos fisionômicos, a observação detalhada

mostra que não só a composição de espécies varia grandemente entre as diversas áreas que

compõem o Bioma, como é muito evidente a correlação entre tipos similares de florestas e

a bacia hidrográfica associada. Foi com base nesse padrão que Pires & Prance, em 1985,

dividiram a vegetação amazônica em dois grupos principais: a vegetação de terra firme e a

vegetação inundável, esta última subdividida em diversos grupos.

A floresta de terra firme é o tipo de formação dominante e ocupa cerca de 80% da

área total da Amazônia brasileira (Pires, 1973; Prance, 1978). Segundo a classificação de

Braga (1979), a área remanescente de 20% corresponde a outros oito tipos de biomas, dos

quais os mais importantes são as florestas inundáveis, classificadas genericamente como

várzeas e igapós. Juntas essas áreas alagáveis somam 6% da área total da Amazônia

brasileira, ou cerca de 300.000 km2, sendo 100.000 km2 áreas de igapó e 200.000 km2

áreas de várzea, o que corresponde a maior porção de florestas inundáveis do mundo (Junk,

1993).

1.2. Florestas de terra firme na Amazônia

O termo terra firme se aplica a todas as florestas que não são sazonalmente

inundadas pelas cheias dos rios, diferenciadas assim das florestas de várzea e igapó

(Ribeiro et aI., 1999).

A maioria dos solos que compõem esse tipo de formação tem um baixo potencial

para suprir nutrientes como o cálcio e o potássio para as plantas, o que está relacionado a

3

fatores abióticos como altas temperaturas e pesadas chuvas, bem como a história geológica

da região. A exposição a intensas lixiviações durante milhões de anos removeu os

nutrientes dos minerais que formam o solo (Sioli & Klinge, 1962; Jordan, 1985). No

entanto, a despeito da pobreza nutricional dos solos, as florestas de terra firme

caracterizam-se por apresentar uma alta diversidade e elevada biomassa (Pires & Prance,

1985; Moreira & Malavolta, 2002). Isso é o resultado de uma circulação fechada de

nutrientes ou a permanente reciclagem dos mesmos, promovida pelos microorganismos do

solo, tornando-a independente da pobreza de nutrientes no substrato (Jordan, 1982; Sioli,

1985; Dalal, 1998; Moraes et al., 2004).

A floresta de terra firme da Amazônia, embora seja em geral menos conhecida e

menos utilizada que a floresta de várzea, apresenta maior diversidade de espécies e é muito

mais extensa (Prance et al., 1976; Ribeiro et al., 1999; Oliveira & Amaral, 2005). Embora

pareça fisionomicamente única em imagens espaciais, a floresta tropical úmida não é

florística-, nem estruturalmente homogênea (Pires & Prance, 1985; Ribeiro et al., 1999).

Por exemplo, as florestas da Amazônia Ocidental geralmente são consideradas mais ricas

em espécies que as da Amazônia Oriental, devido a maior pluviosidade e qualidade do solo

(Oliveira & Mori, 1999). Por outro lado, na região de Manaus há a ocorrência de uma

estação seca bem definida e o solo apresenta-se pobre. Contudo, nessa área verifica-se um

endemismo muito grande de espécies, explicado pela teoria dos refúgios (Haffer & Prance,

2001; 2002). Essa alta diversidade estaria relacionada também a confluências de regiões

fitogeográficas distintas (Oliveira & Daly, 1999).

1.3. Características das florestas inundáveis: diferenças entre várzea e igapó

Pires & Prance (1985), classificaram os principais tipos de florestas inundáveis na

Amazônia como várzea e igapó. As várzeas são definidas como áreas alagadas por águas

brancas ou lamacentas, enquanto que os igapós associam-se às áreas alagadas por águas

pretas ou claras. Embora esses termos sejam oriundos da terminologia popular e tenham

sido freqüentemente no passado motivo de confusões, após as revisões de Sioli (1950) e

Prance (1979), eles passaram a ser amplamente aceitos pela comunidade científica.

Os rios de águas pretas drenam regiões de solos arenosos, pobres em nutrientes,

intercalados com praias arenosas e pH da água ácido, variando de 4 a 5, enquanto os rios

de águas brancas são nutricionalmente ricos, carregando muitos sedimentos,

freqüentemente originados dos Andes e encostas pré-Andinas, e apresentam pH próximo

4

da neutralidade (Klinge & Ohly, 1964; Prance, 1978; Junk & Fürch, 1980; Fürch, 1984;

Junk, 1984).

Devido a movimentos de deposição e ressurgimento de sedimentos ou mesmo o

represamento de lagos e canais ao longo do ciclo hidrológico, mudanças na coloração das

águas podem ocorrer, sem que estas sejam necessariamente relacionadas à fisico-química

do sistema (Ayres, 1993). Por esse motivo, uma diferenciação mais precisa entre os

ambientes de várzea e igapó, deve considerar além da cor das águas, sua relação com os

solos e as formações geológicas das áreas de captação, que vão influenciar as condições

químicas e fisico-químicas da água (Sioli & Klinge, 1962; Klinge & Ohly, 1964; Junk &

Fürch, 1980), como também a florística desses ambientes (Worbes, 1997).

1.4. Florestas de várzeas na Amazônia

A previsibilidade dos ciclos de inundação e seca, anuais, decorrentes da repetição

desses eventos em tempo geológico, é responsável pela presença de organismos altamente

adaptados a esses ambientes (Junk et al., 1989). Essas peculiaridades têm sido relacionadas

à história geológica de sua formação, que data da época do Pleistoceno, quando ocorreram

flutuações no nível do mar, resultando em mudanças climáticas globais (Irion et al., 1983).

O nível do mar desceu cerca de 100 m abaixo do seu nível atual e o rio Amazonas e seus

tributários formaram largos e profundos vales; os rios fluíam mais rapidamente. Depois do

período glacial, os vales dos rios de águas brancas encheram-se de sedimentos, devido às

reduções na correnteza, e formaram a paisagem plana, hoje existente (Irion, 1976; Junk,

1980; Junk, 1984).

De maneira geral, pode-se dizer que as várzeas amazônicas são submetidas

basicamente a dois regimes de inundação, que são as enchentes periódicas dos rios

resultantes da alta pluviosidade e as enchentes diárias resultantes das marés (Arima & Uhl,

1996; Lima & Tourinho, 1996).

Na Amazônia Central, as florestas de várzea são submetidas todos os anos a

períodos regulares de inundação por aproximadamente sete meses (Junk et al., 1989), em

que a altura da coluna de água pode aumentar em média até 10 m (Junk, 1989). Durante

esse período, as águas que invadem as planícies carregam apreciáveis quantidades de

sedimentos, que são depositados na superfície dos terrenos marginais. A conseqüência

desse fenômeno é uma renovação cíclica desses solos, responsável por sua elevada

fertilidade (Sioli, 1951; Irion et al., 1983).

5

Essa periodicidade do pulso de inundação o transforma em um fator de grande

importância na determinação dos fenômenos fenológicos da vegetação que coloniza as

áreas de várzea. Estudos indicam que nesses ambientes as plantas tendem a ajustar a

dinâmica dos eventos, tais como a queda e o lançamento de folhas, floração e frutificação,

ao hidroperíodo (Junk et al., 1989; Waldhoff et al., 1998; Wittmann & Parolin, 1999;

Parolin, 2000; Piedade et al., 2000).

O estresse por alagamento reduz a diversidade de espécies na várzea (Junk, 1993).

Dessa forma, a composição florística nessas áreas depende do regime de inundação, teor de

sedimentos e intensidade da inundação (Junk, 1980). Entretanto, devemos considerar ainda

o fator genético, pois a tolerância ao estresse ambiental é desencadeada por um pool de

genes que atuam em conjunto na planta, modulando o metabolismo dessas espécies (Way

et al. 2005; Zhang et al., 2005) e cuja eficiência, pode determinar indivíduos com maior ou

menor tolerância aos fatores a que são expostos.

2.5. Florestas de várzea versus florestas de terra firme

De acordo com Klinge et al. (1995), na Amazônia, o alagamento anual pelas águas

brancas do rio Solimões tem duas conseqüências maiores que diferenciam este biótopo

daquele da floresta não alagada ou de terra firme. O primeiro aspecto é o pulso monomodal

de inundação, que exige das plantas a capacidade de se adaptarem e suportarem

anualmente inundações prolongadas, intercaladas por períodos secos. O segundo fator diz

respeito à riqueza nutricional das águas brancas que, ao invadirem as planícies inundáveis,

promovem o acúmulo de camadas de sedimentos e a fertilização natural desses solos.

Assim, enquanto que nas várzeas as características ambientais mais marcantes são o

pulso de inundação e uma elevada fertilidade do solo, nas áreas de terra firme esses fatores

são a sazonalidade da precipitação e a acentuada pobreza nutricional dos solos. Com base

nessas diferenças marcantes, é de se supor a existência de diferenças na flora dos dois

sistemas. De fato, os estudos disponíveis até o momento, mostram que no máximo cerca de

31% de coincidências são encontradas no nível de espécie na Amazônia Central,

particularmente em áreas alagáveis adjacentes às terras altas de maior fertilidade (Piedade

et al., 2000; Wittmann et al., 2006). Similaridades maiores, de até 45%, são relatadas para

as áreas de extremos de bacia, especialmente nos flancos andinos (Campbell et al., 1986).

Uma das espécies que tem populações colonizando naturalmente as duas áreas,

várzea e terra firme, é Himatanthus sucuuba, uma Apocynaceae de hábito arbóreo (Plumel,

1991). A adaptação dessa espécie a ecossistemas tão contrastantes, possivelmente envolve

6

interações morfoanatômicas e metabólicas, capazes de propiciar grande tolerância de suas

populações ao alagamento (Ferreira, 2002). Entretanto, mesmo nesta, as sementes de

populações que colonizam as várzeas, quando comparadas àquelas que colonizam a terra

firme, mostraram de forma significativa maior sucesso germinativo sob condições de

alagamento (Ferreira et al., 2005). Ao ser analisada a produção de plântulas em substrato

alagado, as diferenças tornaram-se marcantes (Ferreira et al., 2005), a ponto de sugerir

algum grau de diferenciação genética entre as populações da várzea e aquelas da terra

firme.

2. Características das plantas inundadas

2.1. Germinação e desenvolvimento inicial: fases críticas na tolerância à inundação.

A saturação periódica do solo é normalmente acompanhada por alterações na

química do solo, que incluem a diminuição de seu potencial redox, traduzido numa

demanda progressiva de oxigênio para o solo e num estresse adicional para as raízes das

plantas (Pezeshki, 2001).

Esse é um dos principais motivos pelo qual o alagamento do solo tem profundo

efeito nos organismos que nele habitam, especialmente nas plantas, por serem sésseis

(Piedade et al., 2001). A maioria das sementes de plantas terrestres que possui alta taxa de

germinação no solo não germina na água, uma vez que estas perdem rapidamente a

viabilidade sob tais condições (Hook, 1984; Parolin, 2001a). A ativação dos processos

fisiológicos necessários para a germinação requer um suprimento adequado de oxigênio e o

alagamento do solo restringe a disponibilidade de oxigênio para o embrião, impedindo a

germinação ou impondo dormência nas sementes de muitas espécies (Kozlowski, 1997;

Kozlowski & Pallardy, 1997).

Depois da germinação, flutuações de diferentes magnitudes no nível da água podem

determinar a sobrevivência das plântulas. A princípio, a sobrevivência depende da

capacidade da plântula em alongar-se rapidamente, de forma a se projetar acima do nível

de água, evitando a submersão total das folhas (Kozlowski, 1997; Parolin, 2001b; Ferreira

& Piedade, 2004).

O alagamento também induz o rápido fechamento dos estômatos nas epidermes

abaxial e adaxial de folhas em várias espécies, diminuindo a atividade fotossintética das

mesmas (Kozlowski, 1997). A redução na atividade fotossintética pode ser atribuída ainda

a diversos fatores, como: redução do potencial hídrico da folha e da condutância

estomática; baixa atividade das enzimas fotossintéticas; interrupções no transporte dos

7

fotoassimilados; e índice mais baixo do teor de clorofila (Liao & Lin, 1994; Pezeshk,

2001).

Claramente, o déficit de oxigênio no solo, devido à redução intensa, exerce uma

profunda influência no transporte do oxigênio e sua liberação para a rizosfera (Pezeshk,

2001). Espécies consideradas bem adaptadas ao estresse de ambientes alagados se

previnem dos danos decorrentes das baixas concentrações de oxigênio acumulando em

suas raízes, ou em outros tecidos, grandes quantidades de açúcar durante o período não

alagado para utilizar como reserva na fase de anoxia (Harborne, 1988; Junk, 1989;

Piedade, 1998).

As plântulas são mais sensíveis às injúrias por alagamento que as plantas mais

velhas, sendo, portanto mais dependentes do desenvolvimento de estratégias eficientes de

sobrevivência durante essa fase crítica. A interação entre essa habilidade espécie-específica

das plântulas em tolerar a inundação, associada à periodicidade do alagamento, duração da

saturação de água no solo, velocidade e qualidade da água, além da taxa de sedimentação,

é que irão determinar a composição e o padrão de zonação de espécies, nas planícies

alagáveis ao longo dos rios (Junk & Piedade, 1997; Kozlowski, 1997).

2.2. Alterações metabólicas das plantas sob alagamento

Alterações exibidas pelas plantas em decorrência do estresse hídrico são mediadas

por mudanças nos processos bioquímicos (Kozlowski & Pallardy, 1984). A capacidade do

sistema radicular em realizar atividades essenciais para a sobrevivência do indivíduo, como

a absorção de água, nutriente e produção de fitohormônios, depende essencialmente de

manter o fornecimento ininterrupto de uma quantidade mínima de energia (Lobo & Joly,

1998).

O alagamento leva a uma redução nas trocas gasosas entre a planta e a atmosfera,

devido à difusão dos gases, em particular o oxigênio, que é cerca de 10.000 vezes menor

na água do que no ar (Armstrong, 1979). Isto conduz a circunstâncias hipóxicas ou mesmo

anóxicas em torno das raízes, que são os determinantes principais dos efeitos adversos da

inundação. O oxigênio é vital no modelo central que fornece energia para a célula, e a

presença ou a ausência dessa molécula determina a atividade metabólica e a produção de

energia. O oxigênio é o aceptor final de elétron no modelo de fosforilação oxidativa que

gera o ATP, a fonte principal da energia para o metabolismo celular, regenerando o cofator

essencial NAD+ e o poder redutor do NADH que sustentam modelos bioquímicos, como

por exemplo, a glicólise (Dennis et al., 2000; Taiz & Zeiger, 2004).

8

Sob condições anaeróbicas ocorre o bloqueio do ciclo de Krebs e da cadeia

transportadora de elétrons. Como conseqüência a planta desvia a via metabólica para

formação de outros produtos, com a finalidade de regenerar o NAD+. A via alternativa

comumente citada em plantas sob anaerobiose é a fermentativa, com formação de álcool

como produto final (Crawford, 1978; Harbone, 1988; Dennis et al., 2000; Sousa & Sodek,

2002). Essa resposta, no entanto, gera um baixo rendimento energético compensado pela

aceleração da via glicolítica (Crawford, 1978; Ito et al., 1999; Dennis et al., 2000). O

resultado é um aumento da taxa de fermentação alcoólica, que envolve a desidrogenase

alcoólica (ADH) como uma das enzimas chave nesse processo (Ito et al., 1999; Ferreira,

2002), além das enzimas mobilizadoras de sacarose, necessárias à manutenção do

fornecimento de substrato para a produção de energia sob anaerobiose (Fox et al., 1994;

Rivoal & Hanson, 1994; Ellis et al., 1999; Dennis et al., 2000). Entretanto, o acúmulo de

produtos finais do metabolismo anaeróbico nas plantas, em especial o etanol, é tóxico,

podendo ser letal para as espécies não tolerantes (Crawford, 1992; Kozlowski, 1997; Lobo

& Joly, 1998).

Uma das hipóteses formuladas para explicar a tolerância de algumas plantas a

inundação é a “hipótese bioquímica” postulada por Crawford (1978), baseada parcialmente

nas respostas de animais à condições anóxicas. Essa hipótese sugere que sob condições de

depleção de oxigênio, a via glicolítica é desviada, de tal forma que, os compostos

intermediários da quebra de carboidratos, ao contrário de terminarem em compostos

tóxicos, terminam em outros produtos como malato, lactato ou alanina, que podem ser

acumulados em conseqüências menos danosas para a planta. A produção de etanol nesse

caso é pequena, ocorrendo em níveis não tóxicos para a planta (Crawford, 1992; Lobo &

Joly, 1998). Contudo, à exceção de evidencias circunstanciais obtidas com plantas

herbáceas, como a formação de malato nas raízes de Juncus effusus e de glicerol em Alnus

incana (Harbone, 1988), a hipótese de Crawford não pôde ser provada bioquimicamente.

Entretanto, outros estudos (Good & Crosby 1989; Menezes Neto, 1994; Fan et al.,

1997; Gaston et al., 2002) apresentam evidências que levantam a discussão da hipótese de

Crawford, sugerindo que as plantas possuem mecanismos distintos de tolerância à

inundação e que estes variam com a espécie ou até mesmo com o tecido, podendo mais de

um mecanismo atuar concomitantemente (Harborne, 1988; Menezes Neto, 1994; Lobo &

Joly, 1998; Sousa & Sodek, 2002).

9

2.3. Sobrevivência de plantas ao alagamento das várzeas na Amazônia Central

A maioria das plantas suporta períodos de anoxia que variam de poucas horas a

alguns dias. Entretanto, quando períodos mais longos de inundação são impostos, injúrias e

morte de raízes têm sido observadas, sendo as mesmas atribuídas ao acúmulo de produtos

finais tóxicos do metabolismo anaeróbico, a queda na energia metabólica ou a falta de

substrato para a respiração (Drew, 1997). Na Amazônia Central a duração da inundação

pode chegar a 210 dias todos os anos (Junk, 1989) e, na maioria das vezes, as adaptações

exibidas pelas espécies sincronizam com o pulso hidrológico (Junk, 1989; Wittmann &

Parolin, 1999; Waldhoff et al., 2002). Estratégias distintas têm sido verificadas para as

espécies que colonizam esses ambientes, relacionadas com local em que a planta está

estabelecida no gradiente do solo e que define a cota de inundação a qual é submetida

(Junk, 1989; Wittmann et al., 2002; Parolin et al., 2004).

A sobrevivência de plantas nas planícies inundáveis da Amazônia, como em outras

florestas que sofrem alagamento, parece ser o resultado da combinação de mais de um

mecanismo de adaptação (Scarano, 1998; Scarano et al., 1998). Espécies que apresentam

bom desempenho em relação ao crescimento e taxa fotossintética quando parcialmente

submersas não necessariamente o fazem quando totalmente submersas. Estes dois tipos de

alagamento eventualmente requerem diferentes adaptações para o crescimento e

sobrevivência das plantas (Parolin, 2001b; Ferreira, 2002; Waldhoff et al., 2002). Além de

existir uma ampla gama de adaptações, as respostas das plantas ao alagamento variam

ainda com a espécie, o genótipo, a idade da planta e o tempo de exposição ao alagamento

(Drew & Lynch, 1980; Kozlowski, 1984; 1997).

Ao contrário da terra firme, onde períodos de anoxia são raros, em geral causados

por fortes chuvas que normalmente duram de algumas horas a poucos dias, as plântulas

que habitam as várzeas da Amazônia precisam ajustar o seu metabolismo em consonância

com as peculiaridades desses ambientes (Junk, 1993; Parolin, 2000; Piedade et al., 2000).

Sob condições de alagamento, a primeira resposta apresentada pelas plantas é fisiológica

(Crawford, 1978; Harborne, 1988), porém, em um segundo momento, o acúmulo de

produtos finais tóxicos provenientes do metabolismo pode induzir o aparecimento de

adaptações anatômicas, como é o caso do tecido aerênquima, resultante da dissolução das

membranas das células, que formam grandes espaços intercelulares e favorecem a

eliminação de produtos tóxicos acumulados para o meio externo, entre outros, através de

adaptações morfológicas como as lenticelas hipertróficas e raízes adventícias (Hook, 1984;

10

Jackson & Drew, 1984; Kozlowski & Pallardy, 1984; Pimenta et al., 1994; Waldhoff &

Fürch, 2002).

A habilidade para modificar o metabolismo sob condições de inundação, de forma

a colonizar com maior ou menor sucesso áreas alagáveis divide as plantas em dois grandes

grupos: espécies consideradas tolerantes e espécies não tolerantes à inundação. Essa

capacidade varia dentro de um mesmo gênero de plantas (Medri, 1979; Botelho, 1996;

Tribuzy, 1998) ou ainda dentro de uma espécie (Harbone, 1988; Ferreira, 2002), definindo

variedades tolerantes ou não tolerantes à inundação (Harbone, 1988).

Nas várzeas amazônicas, as espécies que toleram o alagamento prolongado e

chegam a ficar totalmente submersas (Ex. Symmeria paniculata ou Eschweilera tenuifolia)

se estabelecem nos locais mais baixos, que podem permanecer inundados por cerca de sete

meses no ano. As espécies menos tolerantes (Ex. Mora paraensis ou Pentaclethra

macroloba) são restritas às partes superiores, próximas da terra firme, que são inundadas

por períodos mais curtos (Junk, 1989; Ferreira, 2000; Wittmann et al., 2002). Somente

poucas espécies (Ex. Malouetia furfuracea) são generalistas e podem colonizar tanto os

locais elevados quanto aqueles mais baixos (Worbes, 1997).

Um outro fator que deve ser levado em consideração ao tentar entender a tolerância

das plantas às mudanças das condições ambientais extremas, nos ecossistemas de várzea na

Amazônia Central, é a rota de colonização desses ambientes, uma vez que parece haver

ocorrido pelas espécies da terra firme, que invadiram as planícies fluviais durante os

eventos geológicos recentes (Haffer & Prance, 2001; 2002). O grau de adaptação seria

então dependente do tempo em que essa colonização ocorreu, como também do potencial

de adaptabilidade das diferentes espécies (Kubitzki, 1989; Parolin, 2001b).

3. Informações botânicas e econômicas da espécie em estudo

3.1. Distribuição geográfica

A espécie escolhida para a realização deste estudo foi Himatanthus sucuuba Wood.,

Apocynaceae, cuja ocorrência se dá em áreas de várzea e de terra firme na Amazônia. Nas

áreas de estudo a espécie habita, no ambiente inundável, a várzea baixa, onde pode

permanecer até seis meses sob inundação ininterrupta (Wittmann et al., 2002), enquanto

que na terra firme pode ser encontrada em florestas de vertentes, áreas que não sofrem

nenhum estresse resultante de excesso de água. Este último tipo de floresta é considerado

de transição e o solo apresenta aspecto inclinado, que corresponde a um gradiente

topográfico, semelhante nas partes mais altas às florestas de platô, enquanto que nas mais

11

baixas a vegetação possui características fisionômicas mais parecidas à campinarana

(Prance, 1979), sem no entanto apresentar as espécies que a caracterizam, particularmente

alta densidade de epífitas (Ribeiro et al., 1999).

As apocináceas possuem uma distribuição pantropical, ocorrendo principalmente

em florestas tropicais do velho e novo mundo (Heywood, 1993). A família compreende

cerca de 300 gêneros e 2.000 espécies tropicais e subtropicais, sendo 400 espécies e 41

gêneros registrado na flora brasileira, habitando diversas formações (Barroso et al., 1986;

Ribeiro et al., 1999).

O gênero Himatanthus possui treze espécies e ocorre no continente sul-americano,

dispersas na zona tropical desde a latitude 10º Norte até o Trópico de Capricórnio. No

entanto, seus representantes são encontrados predominantemente na bacia amazônica

(Plumel, 1991). A espécie H. sucuuba, de nome popular, “sucuúba” ou “sucuúba

verdadeira”, distribui-se nas regiões alagadas e não alagadas, em solo arenoso ou argiloso,

da Bacia Amazônica de 0º a 15º latitude Sul: Venezuela, Guiana Inglesa, Guiana Francesa,

Bolívia, Peru e Brasil, onde existem registros de coletas nos Estados do Pará, Amazonas,

Mato Grosso, Rondônia e Acre (Plumel, 1991). Próximas a Manaus, a espécie é encontrada

freqüentemente nas áreas de várzea baixa e na terra firme em ambientes de baixios,

vertentes e capoeiras da região (Plumel, 1991; Ribeiro, 1999).

3.2. Morfologia e ecologia

É uma planta arbórea (Fig. 1A), lactescente de 20 a 30 m de altura. Possui um

tronco ereto e mais ou menos cilíndrico, com casca rugosa. As folhas são simples, alternas

espiraladas, totalmente glabras em ambas as faces, de margens inteiras, coriáceas,

apresentando de 20 a 25 cm de comprimento e 5 a 7 cm de largura. As inflorescências são

em cimeiras terminais, com poucas flores brancas e vistosas. O fruto é folículo geminado,

curvado como um chifre, glabro e anguloso, de 20 a 26 cm de comprimento, com

deiscência ventral, e numerosas sementes elipsóides aladas (Fig. 1B/C/D) (Plumel, 1991;

Albuquerque, 1989; Lorenzi, 1998).

B

A

C

D

cm

Fig. 1. Detalhes da espécie em estudo H. sucuuba: A) árvore com cerca de 20m de

altura; B) disposição das folhas e posição da inflorescência (seta); C) fruto folículo

geminado; e D) sementes aladas.

A espécie é perenifólia, heliófila e sua floração ocorre durante um longo período do

ano, sendo predominante entre os meses de agosto a outubro. A dispersão é descontínua e

irregular, sendo realizada por meio do vento e/ou água, o que a caracteriza como

anemocórica e hidrocórica (Plumel, 1991; Ferreira et al., 2005). As espécies de

Sphingidae, uma família pequena de mariposas, são relatadas como principais

polinizadores de H. sucuuba, que visitam durante a noite suas flores brancas, tubulosas e

perfumadas (Plumel, 1991; Ribeiro et al., 1999). No entanto, existem poucos estudos de

observações no campo das relações entre as flores de Apocynaceae e seus polinizadores

(Schlindwein et al., 2004). Para as espécies de Himathantus, dados sobre o mecanismo de

polinização são raros ou inexistentes.

3.3. Importância econômica

H. sucuuba possui a madeira leve, indicada para obras internas em construção civil,

para confecção de embalagens, brinquedos e para cabos de ferramentas e instrumentos

12

13

agrícolas, bem como lenha para carvão (Lorenzzi, 1998). A árvore apresenta qualidades

ornamentais que a recomendam para arborização paisagística (Lorenzzi, 1998, Ribeiro et

al., 1999). A látex da planta possui propriedades terapêuticas, tendo recebido atenção na

medicina popular para o tratamento de várias moléstias, é usado principalmente em

emplastos, no tratamento de fraturas e indicado como antireumático, antifúngico e

anticancerígeno (Van den Berg, 1982; Albuquerque, 1989; Silva et al., 1998; Villegas et

al., 1997; Ribeiro et al., 1999). Alguns estudos encontram-se em andamento, tendo sido

identificados e isolados produtos químicos que confirmam suas funções medicinais

(Miranda et al., 2000; Wood et al., 2001).

4. OBJETIVO GERAL

Verificar se as plântulas de Himatanthus sucuuba geradas a partir de sementes de

populações que habitam as áreas de várzea ou de terra firme, apresentam as mesmas

respostas às alterações das condições hídricas ambientais. Os indicadores utilizados serão

os caracteres morfoanatômicos e bioquímicos, associados à anoxia ou hipóxia do sistema

radicular, além de alterações em nível do genótipo.

5. HIPÓTESE

O pulso de inundação, que regularmente alaga grandes áreas ao longo do rio

Solimões/Amazonas, pode ter imposto uma forte pressão seletiva sobre Himatanthus

sucuuba durante o processo de colonização deste tipo de ambiente, levando a diferenciação

na sua morfologia, anatomia, bioquímica, que resultou em uma forte divergência em

relação a população original que se reflete na sua estrutura genética a ponto de sugerir

uma especiação.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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20

CAPÍTULO II

Respostas das plântulas de Himatanthus sucuuba ao

alagamento: aspectos morfoanatômicos das folhas, análise

de crescimento, biomassa e sobrevivência das plântulas

21

INTRODUÇÃO

Muitas espécies de plantas, quando submetidas ao alagamento, sofrem profundas

modificações morfo-anatômicas, inibição do crescimento e mortalidade prematura. As

respostas mais comuns são o retardamento da expansão das folhas e dos entrenós, clorose,

epinastia, indução da abscisão e senescência foliar, decréscimo na taxa de crescimento em

altura, diminuição da área foliar e da freqüência estomática, redução do incremento da

matéria seca de folhas, hastes e raízes, hipertrofia de lenticelas e caules, formação de raízes

adventícias e aerênquimas (Drew & Lynch, 1980; Kawase, 1981; Kozlowski, 1984; 1997;

Waldhoff et al., 1998; Florentine et al.,2006).

Em termos fisiológicos, uma das principais conseqüências do alagamento é a

limitação da respiração aeróbica devido à redução da disponibilidade de oxigênio. Plantas

apresentam modificações morfoanatômicas que facilitam a captação e a difusão do

oxigênio em seu interior, como lenticelas hipertrofiadas, formação de raízes adventícias e

de aerênquima nas raízes (Tsukahara & Kozlowski, 1985; Pimenta et al., 1996; Crawford

& Braendle, 1996; Kozlowski, 1997; Medri et al., 1998; Waldhoff et al., 1998; Dennis et

al., 2000; Mielke et al., 2003).

Como conseqüência dos custos com a manutenção do metabolismo sob hipoxia ou

mesmo circunstâncias anóxicas, as espécies vegetais que habitam as áreas inundáveis

normalmente apresentam baixo incremento de matéria seca. Entre os fatores que levam à

perda ou baixa incorporação de biomassa nessas plantas, destaca-se a diminuição na

atividade fotossintética, alterações do pH e do potencial de oxi-redução do solo, a perda de

carboidratos para a respiração anaeróbica, a perda de partes da planta devido à senescência

prematura e necrose de partes da planta, especialmente do sistema radicular, e as

limitações ambientais ligadas à temperatura e a saturação de água no solo (Kozlowski et

al., 1991; Long & Hällgren, 1993; Pezeshki, 2001). O suprimento de água também mantém

forte relação com os valores de área foliar da planta e, conseqüentemente, com sua

fotossíntese e crescimento (Kozlowski & Pallardy, 1984; Kozlowski et al., 1991).

Pelo fato do excesso de água no solo afetar o funcionamento das raízes e

conseqüêntemente o suprimento de água para a parte aérea (Kozlowski, 1984), é de se

esperar que nas várzeas amazônicas a submersão das raízes ou da planta por inteiro tenha

um forte efeito em seu crescimento, podendo causar reduções severas no mesmo (Menezes

Neto, 1994; Pezeshki, 2001; Ferreira & Piedade, 2004). Esse efeito, no entanto, pode variar

entre as diferentes espécies, uma vez que se conhece que para algumas, o alagamento

apenas do sistema radicular tende a aumentar o crescimento da planta (Parolin, 2001).

22

A inibição do crescimento, senescência e epinastia prematura das folhas nas plantas

jovens sob alagamento, podem ser atribuídas à mudanças no balanço de fitohormônios

produzidos pelas folhas e raízes. Nas folhas, o amarelecimento seguido de necrose é o

sintoma visual mais comum. No entanto, a senescência também pode ocorrer pela

deficiência mineral, em conseqüência da diminuição do transporte de íons dependentes de

energia (Wolffe et al., 1988 apud Ramos, 1999).

Devido as condições extremas de alagamento das planícies amazônicas, a maioria

das espécies é altamente adaptada (Parolin et al., 2004), com distribuição restrita a este

ecossistema particular. Entretanto, algumas espécies ocorrem sobre uma grande escala de

condições ambientais. Estima-se que cerca de 20% das espécies de árvores que crescem

nas áreas inundadas da Amazônia são comuns às florestas não inundadas (florestas de terra

firme) de áreas adjacentes (Piedade et al., 2001). Uma dessas é Himatanthus sucuuba

(Apocynaceae), que tem ampla distribuição geográfica na bacia Amazônica e ao longo da

calha do rio Solimões.

O fato de H. sucuuba ser uma espécie que ocorre naturalmente nos dois

ecossistemas, várzea (sensu Prance, 1979) e terra firme, a torna ideal para estudos que

investiguem as respostas adaptativas das plantas a condições extremas de alagamento

existentes na Amazônia. O transbordamento anual das águas dos rios que compõem a bacia

amazônica e que invade as florestas de várzea deixando as plântulas e muitas árvores

totalmente submersas poderia resultar em pressões seletivas que levassem a uma

divergência acentuada na sua capacidade de suportar a inundação entre as duas populações

dessa espécie, especialmente naquelas que colonizam as florestas de terra firme.

Alternativamente, a ausência de diferenças na sobrevivência e crescimento entre as duas

populações ressaltaria a importância da plasticidade em resposta à inundação.

A compreensão dos mecanismos adaptativos das plantas em habitats diferentes

auxilia o conhecimento dos seus limites de tolerância aos fatores ambientais. Essas

informações são de grande importância, particularmente no estágio de plântulas, que é o

mais suscetível às mudanças ambientais (Kozlowski, 1984; Junk, 1993). Nas planícies

inundáveis essa é a fase que corresponde ao período de maiores taxas de perdas dos

indivíduos em uma população (Piedade et al., 2001). Informações sobre a germinação e

estabelecimento de plantas em ambientes com variações sazonais, tornam-se ferramentas

importantes para fins de manejo e de recolonização desses ecossistemas.

Neste estudo objetivou-se, especificamente, avaliar a influência de diferentes

regimes de inundação (parcial, total) em plântulas oriundas das populações de H. sucuuba

da várzea ou da terra firme. Para comparar o desempenho das plântulas, os caracteres

utilizados como indicadores foram alterações morfoanatômicas relacionadas ao

alagamento, à taxa de sobrevivência das plântulas, crescimento e incremento de biomassa.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.2. Áreas de estudo e coleta do material vegetal

Os sítios de coleta situaram-se nas áreas próximas a Manaus, Estado do Amazonas

(Fig. 1). A área de várzea localizou-se na Ilha de Marchantaria e cercanias (03º 15’ S,

60º 00’ W), enquanto que a de terra firme, às margens da Rodovia Manaus-Itacoatiara

(AM 010), nas proximidades da Reserva Florestal Adolpho Ducke (02º 53’ S, 59º 58’ W).

23

Figura 1. Mapa das áreas de coleta das sementes nas áreas de várzea (Ilha de Marchantaria e cercanias) e as áreas de terra firme próximas a Manaus (Reserva Ducke). [Escala 1:100.000].

Nas duas áreas, frutos maduros foram coletados diretamente das árvores e

transportados para as instalações do INPA, em Manaus, onde os mesmos foram deixados

ao sol para completar a abertura e liberação das sementes. Estas foram colocadas para

germinar em casa de vegetação, seguindo as instruções descritas por Ferreira et al. (2005).

Os estudos anatômicos foram executados no Laboratório de Anatomia Vegetal, da

Coordenação de Pesquisas em Botânica, no INPA. O experimento de alagamento das

plântulas e as demais análises, morfológicas e biométricas, foram conduzidos nas

dependências do Projeto INPA/Max-Planck.

Manaus

IIllhhaa ddee MMaarrcchhaannttaarriiaa Fonte: Embrapa/2000

RReesseerrvvaa DDuucckkee

24

2.2.1. Fase da planta em estudo

O estudo foi desenvolvido com plântulas das populações da várzea e da terra firme

que apresentavam 17,7 cm e 13,4 cm de altura, respectivamente, e cerca de 90 dias. Porém,

a definição de plântula é bastante discutida entre os pesquisadores da área. No sentido

fisiológico exato, a planta desenvolvida da semente é uma plântula enquanto depende das

reservas desta (Fenner, 1987), sendo o tempo de duração dessa fase bastante questionável

(Kitajima, 1996; Vázquez-Yanes & Orozco-Segovia, 1996). Kitajima (1996) sugere que

uma planta jovem deve ser chamada de plântula até que uma proporção significativa de sua

biomassa seja construída.

Alguns autores consideram plântulas as plantas jovens que se encontram no período

mais susceptível às mudanças ambientais, o que pode variar com o meio e a espécie

considerada (Kozlowski, 1997). Algumas vezes, essa fase pode corresponder ao primeiro

ano de desenvolvimento da planta, após a germinação (Fuchs et al., 2000). Neste estudo,

será adotada esta última definição considerando-se, portanto plântula a fase de um ano, a

partir da germinação das sementes, o que incluiu todo o período dos experimentos de

alagamento.

2.3. Estabelecimento do experimento de alagamento

O experimento foi realizado em viveiro e para simulação do alagamento foram

utilizados quinze tanques de amianto (1000 L), com três tratamentos. Dentro de cada

tanque foram dispostas oito plântulas de H. sucuuba com idade aproximada de três meses,

já transplantadas e estabelecidas em vasos de polietileno medindo 19x16 cm (uma

plântula/vaso), quatro provenientes da várzea e quatro da terra firme, tendo como substrato

solo de várzea. Cada tanque foi considerado uma unidade amostral, com exceção das

análises para o estudo de crescimento e sobrevivência das plântulas, onde a unidade

amostral considerada foi o vaso.

As plântulas foram submetidas durante 90 dias aos tratamentos de alagamento

estabelecidos conforme o que se segue: controle (irrigação diária), submersão parcial

(sistema radicular e parte do caulículo alagado, coluna de água de 25cm) e submersão total

(alagamento total da planta, coluna de água de 70cm). A identificação de cada tratamento

foi feita de acordo com o esquema a seguir:

1- Controle (C) ⇒ VZC Várzea 2- Submersão parcial (SP)

25

⇒ VZSP (VZ) 3- Submersão total (ST) ⇒ VZST Procedência da semente

1- Controle (C) ⇒ TFC Terra firme 2- Submersão parcial (SP) ⇒ TFSP (TF) 3- Submersão total (ST) ⇒ TFST

2.4. Crescimento, avaliação morfológica e sobrevivência das plântulas

Para as avaliações do crescimento acumulativo e sobrevivência foram utilizadas 10

plântulas, sendo duas plântulas por tanque, originárias de cada um dos ambientes (várzea

ou terra firme), que foram acompanhadas durante os 90 dias de duração dos experimentos

de inundação. Em caso de morte da plântula, esta era substituída por outra de igual

tamanho, mantida sob mesmas condições. Para determinar o alongamento do caule, as

plântulas foram medidas desde a região do colo até o ápice caulinar.

As medidas de crescimento foram tomadas quando do estabelecimento dos

experimentos e, posteriormente, em intervalos quinzenais. Na oportunidade em que as

medidas eram tomadas foram avaliadas as alterações morfológicas, por meio de

observações visuais e anotações da presença ou não dos seguintes sintomas: clorose,

epinastia e abscisão das folhas, lenticelas nos caules e formação de raízes adventícias.

2.5. Biomassa

As análises de biomassa foram realizadas em todos os tratamentos aos 30 e 90 dias

do experimento. Foi utilizado o método de coleta destrutiva, descrito por Piedade (1988)

para herbáceas, com adaptação para arbóreas. Para tanto, foram utilizadas três plântulas (1

plântula/tanque) de cada tratamento. No laboratório, as plântulas foram retiradas dos vasos

e cuidadosamente lavadas individualmente. Em seguida foram deixadas para secar em

temperatura ambiente por cerca de uma hora, e divididas nas seguintes categorias: raiz,

caule e folhas. A biomassa total da plântula foi obtida por meio do somatório das médias

dos valores das diferentes categorias de material. Após a determinação da massa fresca, as

plântulas foram levadas para secar em estufa de circulação forçada a 95º C, até massa

constante. Cada parte da plântula foi pesada em balança analítica, modelo Belmarq 210 A,

com precisão de 0,0001g.

26

2.6. Número de folhas, área foliar e análise da epiderme foliar.

Tanto as análises do número de folhas e área foliar, quanto da epiderme foliar,

foram realizadas em cinco plântulas de cada tratamento (1 plântula/tanque) apenas aos 30

dias de indução do alagamento, uma vez que a partir desse período as plântulas do

tratamento de submersão total perderam as folhas.

Inicialmente as plântulas de cada tratamento foram selecionadas e o número de

folhas de cada uma delas foi anotado. Em seguida as folhas foram destacadas para

obtenção da área foliar total de cada uma das plântulas e, posteriormente, obtenções das

médias de área foliar das plântulas, por tratamento (AFM). As áreas foliares foram

determinadas por meio de um medidor de área foliar (Leaf Area Meter, Delta-T Devices).

Algumas destas folhas, conforme descrito abaixo, foram ainda utilizadas para realizar a

dissociação das epidermes e visualização em microscópio óptico, para descrição das

estruturas anatômicas.

Para os estudos das epidermes da folha, de cada uma das plântulas amostradas

coletou-se a segunda ou terceira folha a partir do ápice, totalmente expandida, e produzida

após o início do experimento de submersão. As folhas foram fixadas em FAA 50%

(Johansen, 1940) e armazenadas em etanol 70%. Do material coletado foram retiradas

secções do ápice, nervura central (região mediana) e base da folha, cujas epidermes foram

dissociadas em solução de Jefrey (Johansen, 1940) para as análises de sua estrutura. As

epidermes foram coradas com azul de astra e fucsina básica, desidratadas em série

alcoólica crescente, para a montagem de lâminas semipermanentes com gelatina

glicerinada (Johansen, 1940). A partir dessas lâminas foi feita a análise da freqüência

estomática por mm2, onde foram contados os estômatos presentes em 25 campos

aleatoriamente escolhidos de cada parte da folha, totalizando 75 campos por folha, em cada

tratamento. As observações foram realizadas utilizando um microscópio Kyoa, nos

aumentos 10x e 40x, com fator de correção de 0,46. Foram feitas fotomicrografias com um

microscópio Zeiss MC63 nos aumentos de 10x, 25x e 40x.

O comprimento e a largura dos estômatos foram obtidos em 5 campos de cada

amostra da região mediana das folhas, de cada uma das cinco plântulas, num total de 25

campos por tratamento. Todas as medidas foram obtidas através de uma ocular

micrométrica. Os estômatos foram classificados segundo Apezzato-da-Glória (2003),

enquanto que os tecidos e demais estruturas anatômicas da folha foram descritos conforme

Metcalfe & Chalk (1950) e Fahn (1985).

27

2.7. Delineamento experimental e análises estatísticas

O delineamento experimental inteiramente casualizado (DIC), com seis tratamentos

(VZC, TFC, VZSP, TFSP, VZST, TFST) e repetições, determinadas de acordo com a

análise efetuada, conforme descrição abaixo:

a) Crescimento e sobrevivência: cada vaso foi considerado uma unidade amostral,

sendo 2 vasos/tanque, num total de 10 repetições. Foi feita a comparação entre as

duas populações (várzea e terra firme) nos tempos: 0, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias;

b) Biomassa: Cada tanque foi considerado uma unidade amostral, num total de três

repetições, sendo uma planta/tanque. Foi feita a comparação entre as duas

populações (várzea e terra firme) nos tempos: 30 e 90 dias;

c) Número de folhas, área foliar e epiderme foliar: cada tanque foi considerado uma

unidade amostral, com cinco repetições.

Todos os dados foram tratados por meio de análise de variância (ANOVA) e a

comparação entre as médias dos fatores estudados foi realizada com base no teste de

Tukey, a 5% de probabilidade. Para execução das análises estatísticas foi usado o

programa Statistica, versão 8.0.

3. RESULTADOS

3.1. Crescimento

O alagamento reduziu o crescimento das plântulas de H. sucuuba nas populações

provenientes dos dois ambientes (várzea e terra firme), em relação aos controles. O

crescimento médio acumulado das plântulas da várzea submetidas ao tratamento de

submersão parcial (VZSP) diferiu (p≤0,05) em relação aos comprimentos das plântulas do

controle (VZC), a partir da análise realizada aos 30 dias, tendo atingido ao final dos 90 dias

de tratamento, alturas de 31,5 e 35,6 cm, respectivamente. No tratamento de submersão

total (VZST), as plântulas praticamente paralisaram o crescimento, diferenciando

significativamente este tratamento dos outros dois (p≤0,05). Neste último caso, o valor

médio de comprimento da parte aérea ao final do experimento foi de 18,6 cm, enquanto o

valor inicial era de 17,7 cm (Fig. 2A).

O padrão de crescimento das plântulas da terra firme que foram submetidas ao

alagamento parcial (TFSP) foi o mesmo daquele observado nas plântulas da várzea,

mostrando uma diferença significativa (p≤0,05) no crescimento com relação ao controle

(TFC), a partir do 30º dia. Nesse tratamento as plântulas apresentaram, ao final dos 90 dias

de duração do experimento, os valores médios de comprimento da parte aérea de 18,2 cm,

TFSP, e 27,8 cm, TFC. Assim como observado para as plântulas da várzea, o alagamento

total das plântulas da terra firme (TFST) também levou à estagnação do crescimento, tendo

sido atingido ao final do experimento o comprimento de 13,6 cm, valor praticamente igual

àquele obtido no início do tratamento de inundação que foi de 13,4 cm (Fig. 2B).

05

10152025303540

0 15 30 45 60 75 90tempo (dias)

altu

ra d

as p

lânt

ulas

(cm

)

controle submersão parcial submersão total

A B

05

10152025303540

0 15 30 45 60 75 90tempo (dias)

altu

ra d

as p

lânt

ulas

(cm

)

controle submersão parcial submersão total

Figura 2 – Crescimento médio acumulativo das plântulas de H. sucuuba, durante os 90 dias de experimentação: A) populações da várzea e B) populações da terra firme. Dados expressos em termos de média + erro padrão, n = 10.

Analisando os padrões dos resultados expressos nas Figuras 2 A/B ao final do

período de 90 dias, observa-se que, embora o crescimento das plântulas oriundas da várzea

e da terra firme, nos tratamentos controle (VZC e TFC) e de submersão parcial (VZSP e

TFSP), tenham sido significativos, os valores diferem (p≤0,05) entre as duas populações ao

longo de todos os períodos avaliados. O tratamento VZC mostrou um crescimento cerca de

20% acima do verificado no TFC e essa diferença foi ainda maior quando em submersão

parcial, onde a média de crescimento do tratamento VZSP (31,5 cm) foi quase o dobro do

TFSP (18,2 cm).

3.2. Alterações na morfologia das plântulas

A Tabela 1 mostra um quadro com as alterações na morfologia observadas nas

plântulas ao longo do período experimental de 90 dias.

28

Tabela 1. Presença (S), ausência (N) e intensidade (+) das alterações morfológicas apresentadas pelas plântulas em função do alagamento.

Controle Submersão parcial Submersão total

VZ TF VZ TF VZ TF

Raízes adventícias N N S S N N

Abscisão das folhas N N N N S* S*

Clorose N N N + +++ * +++ *

Epinastia N N N N N* N*

Lenticelas N N S S N N

+ = clorose até 30% da folha; ++ = clorose > 30% até 50% da folha; +++ = clorose acima de 50% da folha. * avaliados até o 30º dia do experimento, quando não mais apresentavam folhas.

A presença de lenticelas hipertróficas e de raízes adventícias (Fig. 3) foi observada

nas plântulas provenientes dos dois ambientes a partir do 15º dia de submersão parcial

(VZSP e TFSP). Outras características morfológicas como a clorose e epinastia das folhas

não foram evidenciadas neste tratamento.

B A

29

Figura 3 – Detalhes das raízes de plântulas de H. sucuuba, submetidas ao tratamento de submersão parcial. A) tratamento VZSP; B) tratamento TFSP. L = lenticelas e R = raízes adventícias.

Após o 15º dia, algumas folhas das plântulas da várzea que foram totalmente

submersas (VZST) apresentaram sintomas de clorose, seguida da abscisão das mesmas.

Esse fenômeno foi observado nas plântulas da terra firme por volta da quarta semana dos

tratamentos de submersão (TFST), período no qual as plântulas da várzea já haviam

perdido todas as folhas, situação que perdurou até o término do experimento. Contudo,

neste tratamento, foi observado também que muitas folhas, tanto de plântulas da várzea

quanto de terra firme, se desprenderam do caule ainda totalmente verdes.

Nos tratamentos VZST e TFST, não foi observada a presença de lenticelas ou raízes

adventícias em nenhuma das plântulas, independente do ambiente de origem. Porém, nas

L L

R

R Ferreira, 2002 Ferreira, 2002

plântulas do tratamento VZST, o número de raízes formadas foi visualmente maior que

aquelas do tratamento TFST. Plântulas dos tratamentos controle (VZC e TFC), não

apresentaram nenhuma evidência de alterações morfológicas dos parâmetros avaliados

(Tab. 1).

3.3. Sobrevivência das plântulas durante os experimentos de submersão

O alagamento não influenciou a sobrevivência das plântulas das populações de

várzea, uma vez que em todos os tratamentos 100% das plântulas permaneceram vivas até

o final dos 90 dias (Tab. 2).

Tabela 2 – Taxa de sobrevivência das plântulas após 90 dias do início dos experimentos de

submersão. n = 10.

Tratamentos

Ambiente Controle Submersão parcial Submersão total

Várzea 100 % 100% 100%

Terra firme 100 % 90% 40%

Por meio de observações visuais, verificou-se que o primeiro órgão da planta a ser

comprometido foi a raiz, que mostrava sinais de decomposição (Fig. 4).

BA

Ferreira, 2002

Figura 4 – Raízes de plântulas de H. sucuuba aos 90 dias do tratamento de inundação total.

A = várzea e B = terra firme.

3.4. Acumulação de biomassa

O alagamento não alterou de forma significativa (p≤0,05) os valores de biomassa

total nas duas populações (várzea e terra firme) aos 30 dias (Tab. 3), embora tenha sido

30

31

possível verificar uma tendência de diminuição da biomassa nos tratamentos de submersão

total (VZST e TFST). Todavia, aos 90 dias essa diferença apresentava-se significativa,

mostrando que quando o alagamento é prolongado, os valores médios de biomassa

diminuíram significativamente, sendo o efeito maior para as plantas totalmente submersas.

Ao relacionarmos os valores médios de biomassa dos tratamentos de submersão (parcial e

total), entre os diferentes ambientes (várzea e terra firme), verificamos que não existe

diferença significativa entre estes nos dois períodos avaliados (30 e 90 dias). No entanto, a

biomassa total do tratamento controle da várzea (VZC) foi duas vezes o valor verificado no

tratamento controle da terra firme (TFC), sendo este resultado significativo (Tab. 3).

Tabela 3. Valores médios da biomassa total (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a partir de sementes das populações de várzea e de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos de submersão.

Biomassa total (g)

Várzea Terra firme

30 dias 90 dias 30 dias 90 dias

Controle 2,06 A 6,52 A* 0,91 A 3,02 A*

Submersão parcial 2,02 A 2,79 B 1,20 A 1,54 B

Submersão total 1,57 A 0,84 C 1,06 A 0,56 C

Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes, no mesmo período (VZ e TF). Tukey a 5% de probabilidade. n = 3.

Nas análises aos 30 dias não foi encontrada diferença significativa (p≤0,05) na

alocação de biomassa no caule e nas raízes das plântulas dos dois ambientes (Tab. 4 e 5),

em nenhum dos tratamentos. Por outro lado, com o aumento do período de alagamento

para 90 dias, as plântulas da várzea apresentaram uma redução significativa dos valores de

biomassa em todas as partes analisadas (Tab. 4). Já nas plântulas da terra firme essa

tendência não foi confirmada para as análises de raiz aos 90 dias, que não mostraram

diferença significativa nos valores de biomassa após a inundação (Tab. 5).

Ao analisarmos os controles das duas populações (VZC e TFC) verificamos que a

alocação de biomassa ocorre de forma diferente entre as partes das plântulas nesse

tratamento. Enquanto na várzea (VZC) existe um aumento significante nos valores médios

de biomassa na raiz e no caule aos 90 dias (Tab. 4), na terra firme (TFC) esse aumento

acontece no caule e nas folhas (Tab. 5).

32

Devido a abscisão das folhas após 30 dias de indução no alagamento total, não foi

possível realizar a análise dessa parte da planta aos 90 dias, nesse tratamento, e tampouco a

correlação entre os dois ambientes para esse período.

Tabela 4. Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a partir de sementes das populações de várzea, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos de submersão.

Raiz (g) Caule (g) Folhas (g)

30 dias 90dias 30 dias 90 dias 30 dias 90 dias

Controle 0,46 A* 2,08 A* 0,80 A* 2,29 A* 0,80 A 1,47 A

Submersão parcial 0,50 A 1,00 B 0,91 A 1,34 B 0,46 AB 0,45 B

Submersão total 0,77 A 0,36 C 0,80 A 0,48 C 0,15 B -

Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha, para cada parte da planta: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois períodos (30 e 90 dias). Tukey a 5% de probabilidade. n = 3.

Tabela 5. Valores médios da biomassa parcial (g) de plântulas de H. sucuuba, produzidas a partir de sementes das populações de terra firme, aos 30 e 90 dias, sob diferentes tratamentos de submersão.

Raiz (g) Caule (g) Folhas (g)

30 dias 90dias 30 dias 90 dias 30 dias 90 dias

Controle 0,31 A 0,77 A 0,18 A* 0,92 A* 0,42 A* 1,33 A*

Submersão parcial 0,38 A 0,61 A 0,37 A 0,58 B 0,44 A 0,34 B

Submersão total 0,46 A 0,44 A 0,20 A 0,13 C 0,40 A -

Na mesma coluna: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si; Na mesma linha, para cada parte da planta: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois períodos (30 e 90 dias). Tukey a 5% de probabilidade. n = 3.

3.6. Número de folhas, área foliar total (AFT) e freqüência estomática

Sob submersão total, as plântulas de sementes oriundas dos dois ambientes

perderam completamente as folhas no período máximo de cinco semanas. Assim, os

resultados apresentados na Tabela 6 referem-se aos dados coletados das plântulas até os 30

dias de experimentação.

Os valores médios do número de folhas nos tratamentos de submersão parcial

foram significativamente (p≤0,05) maiores entre as plântulas das populações da várzea e

da terra firme (VZSP e TFSP), quando comparados aos tratamentos controle (VZC e TFC),

sem diferença entre os ambientes (Tab. 6). No entanto, neste mesmo tratamento a AFT foi

menos da metade dos valores apresentados pelas plântulas do controle (p≤0,05).

33

O alagamento reduziu significativamente a AFT, da mesma forma que elevou os

valores da freqüência estomática nas plântulas de todos os tratamentos (p≤0,05). Não

houve diferença nos valores médios destes dois parâmetros, entre as plantas de várzea e

terra firme nos tratamentos controles e de submersão (Tab. 6).

Tabela 6. Média dos valores de número de folhas, área foliar total (AFT) da plântula e freqüência estomática de H. sucuuba, 30 dias após o início dos tratamentos de submersão.

nº de folhas AFT (m2) Freq. estomática (mm2)

VZ TF VZ TF VZ TF

Controle 08 A* 07 A* 0,38 A* 0,32 A* 64 A* 49 A*

Submersão parcial 09 B 09 B 0,14 B* 0,11 B* 99 B* 68 B*

Submersão total 04 C* 03 C* 0,16 C* 0,11 C* 94 B* 73 B*

Na mesma coluna: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si; Na mesma linha: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes (VZ e TF). Tukey a 5% de probabilidade. n = 5

Nas plântulas oriundas das populações de várzea a submersão (VZSP e VZST) levou a

uma diminuição no tamanho dos estômatos (Tab. 7), o que foi aferido pelas medidas de

comprimento e largura dos mesmos. Contudo, essa redução foi significante (p≤0,05)

apenas no tratamento de submersão total (VZSP), permanecendo uma tendência no

tratamento de submersão parcial (VZST). Esses resultados diferem (p≤0,05) dos

apresentados pelas plântulas da terra firme, nos dois tratamentos (TFSP e TFST), cujos

valores médios foram semelhantes ao do controle (TFC) do mesmo ambiente (Tab. 7). Não

houve diferença significativa entre os tratamentos controle (VZC e TFC), com relação aos

valores médios de comprimento e largura dos estômatos.

Quando se avaliou o tamanho do poro estomático, as plântulas da população de terra

firme mostraram uma redução significante destes, em função do alagamento. Essa

tendência, entretanto, não se confirmou para as plântulas da população de várzea (Tab. 7).

Tabela 7. Influência do alagamento no comprimento e na largura de estômatos; e no tamanho do poro estomático das folhas de plântulas de H. sucuuba, dos ambientes de várzea e terra firme.

Comprimento (μm) Largura (μm) Poro (μm)

VZ TF VZ TF VZ TF

Controle 21,26 A 21,84 A 16,48 A 15,86 A 10,90 A* 12,46 A*

Submersão parcial 20,43 AB* 21,89 A* 13,97 AB* 16,30 A* 11,22 A 10,96 B

Submersão total 19,46 B* 22,83 A* 13,81 B* 16,85 A* 11,38 A 11,36 AB

Na mesma coluna: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si; Na mesma linha, para cada medida: (*) = diferenças significativas entre as médias dos dois ambientes (VZ e TF). Tukey a 5% de probabilidade. n = 5.

3.7. Características da epiderme

Na descrição das estruturas epidérmicas feita com base nas análises das plântulas

dos tratamentos controles (VZC e TFC), são apontadas as diferenças na anatomia, em

resposta a inundação.

A constituição das epidermes foliares adaxial e abaxial das plântulas de H. sucuuba

não diferiu nos dois ambientes, várzea e terra firme. Em vista frontal, a epiderme adaxial

(Fig. 5 A) é glabra, com as paredes periclinais externas sinuosas, espessadas por celulose,

sem pontuações aparentes. Possui certa uniformidade nos tamanhos das células e apresenta

uma cutícula estriada contínua. Da mesma forma, a epiderme abaxial (Fig. 5 B) é glabra,

porém suas células apresentam sinuosidade das paredes periclinais externas mais

acentuadas que as da epiderme adaxial, com igual espessamento da parede celular. Nesta

superfície é evidente a diferença nas formas e tamanhos das células.

A B cs

pc e

ct ct

cg pc

40 μm 40 μm

Figura 5. Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de H. sucuuba. pc) parede celulósica; ct) cutícula; e) estômato; cg) células guardas; cs) células subsidiárias.

34

A B

eg

40 μm 45 μm

Figura 6. A) epiderme abaxial com estômatos geminados (eg). B) detalhe da epiderme abaxial mostrando os estômatos.

A espécie é hipoestomática e os estômatos são do tipo anomocíticos, dispostos nas

regiões intercostais, estando ausentes nas nervuras. Em todos os tratamentos observou-se a

presença de estômatos geminados (Fig. 6 A/B), cujo número aumentou dos tratamentos

controle para os de submersão parcial. No entanto, nas folhas das plântulas submetidas à

submersão total essa tendência não foi observada. Nesse tratamento (VZST e TFST), em

visão frontal, não foi possível distinguir a delimitação das paredes das células, devido a

deformação da cutícula que resultou no seu excessivo estriamento (Fig. 7 A).

A B e

ct

ct

40 μm 45 μm

Figura 7. Vista frontal das epidermes adaxial (A) e abaxial (B) das folhas de plântulas de H. sucuuba, submetidas ao tratamento de alagamento total. ct) cutícula; e) estômato.

4. DISCUSSÃO

Alterações na biometria e morfologia plantas são comumente observadas em

função do alagamento do solo (Joly, 1994; Kozlowski, 1997; Waldhoff et al., 1998; Ito et

al., 1999; Gunawardena et al., 2001; Parolin et al., 2004; Florentine et al., 2006). Em H.

sucuuba, plântulas oriundas das duas populações (várzea e terra firme) tiveram essas

alterações intensificadas pelo aumento da coluna de água e do período de submersão.

35

36

Embora esse efeito tenha sido observado na maioria das avaliações, diferenças

significativas foram verificadas apenas ao final dos 90 dias de submersão.

As plântulas da várzea dos tratamentos VZC e VZSP apresentaram um crescimento

médio superior àquelas de terra firme sob mesmas condições (TFC e TFSP), o que pode

indicar uma adaptação diferenciada entre as duas populações, sugerindo que plântulas

oriundas da várzea, em tais situações, utilizam a estratégia de “escape” (Parolin, 2003), que

consiste em crescer mais rapidamente a fim manter as folhas fora da água e garantir a

continuação do processo fotossintético. Por outro lado, as plântulas sob submersão total

(VZST e TFST), paralisaram o crescimento e perderam as folhas após 30 dias de

submersão.

A paralisação do crescimento é descrita também para plântulas de outras espécies

tolerantes ao alagamento quando sob condições de saturação hídrica do solo, como o açaí

(Euterpe oleracea) e ingá (Inga vera) (Menezes Neto, 1994; Tribuzy, 1998). Tais

evidências corroboram as afirmações de Crawford (1992) em que os pesados custos

impostos pelo metabolismo anaeróbico implicam que, sob prolongados períodos de déficit

de oxigênio, apenas as plantas tolerantes consigam sobreviver. De fato, em experimento

com plântulas de açaí, Menezes Neto (1994) observou que, após a aeração pela retirada da

água, o crescimento foi retomado. Estudos da fluorescência da clorofila em algumas

espécies de áreas alagáveis, sob diferentes períodos e profundidades de inundação,

mostraram a recuperação do fotossistema II (PSII) tão logo a inundação foi suprimida

(Waldhoff et al., 2002). Além de adaptações fisiológicas, adaptações anatômicas e

morfológicas de folhas (Waldhoff, 2003) são importantes coadjuvantes para que as plantas

superem com sucesso as condições de anoxia e as dificuldades de manutenção de um

balanço hídrico adequado sob inundação.

Quando o alagamento foi imposto apenas ao sistema radicular, permanecendo a

parte aérea das plântulas em contato com o ar, seu crescimento nos tratamentos de

submersão parcial (VZSP e TFSP) permaneceu contínuo, mostrando, porém, valores

médios menores do que aqueles apresentados pelos seus respectivos controles (VZC e

TFC), como resultado do efeito negativo do alagamento do solo para o crescimento das

plântulas. Segundo Kozlowski (1997), essa diminuição nas taxas de crescimento é

conseqüência da redução da área fotossintética, verificada em muitas plantas quando

alagadas. De fato, em H. sucuuba a área foliar total, sofreu redução significativa após a

submersão das plântulas.

37

Redução da área foliar, estômatos menores e densidades estomáticas maiores são

características fortemente associadas a folhas xeromórficas (Fahn & Cutler, 1992;

Bosabalidis & Kofidis, 2002), já que o aumento na densidade dos estômatos e o

decréscimo simultâneo em seu tamanho permitem um melhor controle da transpiração,

adaptação favorável em ambientes que induzem a perda excessiva de água pelas plantas ou

cuja disponibilidade de água é restrita (Fahn & Cutler, 1992; Panou-Filotheou et al., 2001).

Essas características podem ser um indicativo de que, apesar de se encontrarem em meio

com excesso de água, esta não estaria disponível para a planta, podendo dessa maneira,

gerar uma seca fisiológica. Evidências dessa tendência em folhas de várias espécies

arbóreas de áreas alagáveis amazônicas são citadas por Waldhoff & Furch (2002),

notadamente durante os períodos de pico das cheias, quando apenas a copa das árvores

permanece acima da coluna de água. O investimento prioritario em sistema radicular é uma

outra resposta típica em plantas expostas ao déficit hídrico. Enquanto em plantas de várzea

a razão massa de raiz/parte aérea foi 0,55 para os controles e para as que foram expostas à

submersão parcial por 90 dias, houve um aumento considerável para as plantas da terra

firme, em que a razão aumentou de 0,34 para os controles para 0,66 em plantas expostas à

submersão parcial.

O aumento no número de estômatos em plantas de ambientes alagados também foi

observado por Botelho (1996), sugerindo estar relacionado à eficiência da fotossíntese.

Entretanto, essa afirmação é válida apenas para as plantas sob submersão parcial, onde as

folhas permaneceram em contato com a atmosfera aerada que possibilitou as trocas

gasosas. Para as plântulas totalmente submersas, que tiveram a abscisão de todas as folhas

após o primeiro mês de alagamento, esse ajuste, obviamente, não faz sentido. Dessa forma

acredita-se que tais características sejam inerentes ao genótipo, funcionando como uma

resposta da espécie à inundação. Por outro lado, a diminuição observada na área foliar

explicaria, pelo menos em parte, o aumento da freqüência estomática se o número de

estomatos por unidade de lâmina foliar permanecer constante em planta parcialmente

submersa. Contudo, essa análise não pôde ser realizada para essa planta por interferência

do estriamento da cutícula, que impossibilitou a visualização definida da parede celular.

O aumento no número de estômatos geminados nas plântulas sob alagamento pode

ser um indicativo de teratogenia induzida pelo estresse. Já, a presença da cutícula sobre as

epidermes é uma estrutura comum nas plantas (Araújo & Mendonça, 1998; Fahn & Cutler,

1992; Ferreira et al., 2002; Waldhoff & Furch, 2002) e normalmente está relacionada com

38

a prevenção contra perda excessiva de água, o que reforça a evidência de necessidade de

controle da perda de água na planta.

A saturação hídrica altera a constituição química do solo, devido a mudanças em

seu potencial redox (Pezeshki, 2001). Como resultado, podem ocorrer mudanças na

absorção de nutrientes pelas raízes com efeito direto no crescimento da planta e incremento

de biomassa. No presente estudo, o alagamento prolongado reduziu de forma significativa

as taxas de incremento de biomassa nas populações de ambos os ambientes ao longo dos

90 dias de aplicação dos tratamentos. Além disso, a área foliar total teve uma redução

considerável com a imposição dos tratamentos de submersão, reduzindo assim a superfície

fotossintética, ou seja, a sua capacidade de assimilação de carbono.

Com relação ao incremento de biomassa, nas plântulas controle da várzea (VZC) as

médias obtidas foram maior que as plântulas da terra firme (TFC), sob mesmas condições.

O tratamento VZC apresentou quase duas vezes o valor do incremento de massa seca

verificado para o TFC, mesmo tendo sido utilizado solo da várzea, mais fértil (Furch,

1984), para ambos os tratamentos. Esses resultados sugerem que plântulas de populações

que habitam a várzea previnem-se para o alagamento prolongado, acumulando massa e

reservas durante a fase favorável de recuo das águas ou em que a água dos rios retorna ao

seu leito original, para utilizá-las como substrato para a respiração durante a fase de

submersão da planta. Estes aspectos serão discutidos no capítulo III, que trata do

metabolismo das plantas sob alagamento.

Embora em quantidades menores que o controle, houve acúmulo de biomassa entre

as plântulas do tratamento de submersão parcial (VZSP e TFSP). Isso se deve,

provavelmente, ao fato dessas plântulas manterem as folhas e desenvolverem adaptações

morfológicas como lenticelas e raízes adventícias, para suprir a deficiência de oxigênio e

ajudar a restaurar o metabolismo aeróbico. No tratamento de submersão total (VZST e

TFST), foi verificada uma perda de biomassa e paralisação do crescimento, com a planta

entrando em um estágio de dormência, onde o uso das reservas é lento. Esse resultado é

plausível, uma vez que H. sucuuba, quando totalmente submersa perde as folhas, não

desenvolve estruturas adaptativas para a captação de oxigênio atmosférico e mantém o

metabolismo desviando a via glicolítica para formação de etanol (Ferreira, 2002). Devido

às elevadas taxas de ADH, que indicam uma eficiente respiração anaeróbica nas

populações de H. sucuuba da várzea, em comparação às populações de terra firme

(Ferreira, 2002), é possível sugerir que as plântulas do ambiente de várzea não só possuem

mais reservas, mas as utilizam mais eficientemente, alocando-as para o funcionamento de

39

um metabolismo de manutenção, durante o alagamento. Desta forma, plantas oriundas da

várzea com apenas três meses de idade já acumulam reservas suficientes para tolerar pelo

menos 90 dias de submersão total, enquanto que as populações oriundas da terra firme

aparentemente têm uma menor acumulação de reservas, pois tiveram uma diminuição

acentuada da sobrevivência no mesmo período de tempo.

A alocação de biomassa diferiu entre os compartimentos da planta, nas duas

populações. No tratamento VZC a biomassa acumulou nas raízes e caules, no tratamento

TFC os valores mais elevados foram encontrados nas folhas, seguido do caule. Essa

compartimentalização diferenciada da biomassa da planta certamente se relaciona com o

ambiente de origem da mesma, mostrando que as plântulas da várzea tendem a acumular

biomassa nos órgãos como caule e raiz para uso no alongamento da plântula, como

mecanismo de fuga da inundação e para a acumulação de reservas que possam ser

utilizadas nos períodos prolongados de submersão que ficam anualmente expostas durante

o ciclo de inundação que caracteriza a várzea. Por outro lado, as plântulas da terra firme

parecem estar investindo a energia mais em área fotossintética e tecido estrutural. Esta

análise parece plausível, já que diferenças genéticas foram encontradas entre populações de

várzea e terra firme em um gradiente latitudinal na bacia amazônica, conforme será

abordado no capítulo IV.

CONCLUSÃO

Plântulas de H. sucuuba são tolerantes ao alagamento, podendo responder de forma

diferenciada, em função do ambiente de origem das sementes. O estudo da espécie

avaliando diferentes níveis de inundação demonstrou que mais do que o alagamento, a

tolerância da espécie varia com a duração da inundação e com a altura da coluna de água.

Plântulas dos ambientes de várzea apresentam maior capacidade de tolerar períodos

prolongados de alagamento, demonstrado pela elevada sobrevivência em condições de

submersão total.

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43

CAPÍTULO III

Análises bioquímicas de sementes e de raízes

de plântulas de Himatanthus sucuuba

44

1. INTRODUÇÃO

Várias espécies de plantas podem crescer em áreas nas quais seus sistemas

radiculares e as porções mais baixas do caule ou a planta inteira são submetidos mais da

metade do ano à inundação, seguida de períodos de seca variáveis (Harborne, 1988). Dado

o caráter séssil da vegetação lenhosa, esta deve ter a habilidade de conviver com tais

condições ao longo de seu ciclo de vida (Piedade et al., 2001). Para isto, espécies

colonizando esses ambientes devem possuir a capacidade de, regularmente, readaptar seu

metabolismo para sobreviver à alternância entre um ambiente aeróbico, hipóxico ou

mesmo anóxico resultante da inundação (Harborne, 1988; Lobo & Joly, 1998; Crawford &

Braendle, 1996; Menezes Neto et al., 1995; Dennis et al., 2000; Ferreira, 2002; Taiz &

Zeiger, 2004).

A anaerobiose do sistema radicular tem como conseqüência mudanças nos níveis de

intermediários metabólicos e aumento do fluxo glicolítico. Esse aumento é acompanhado

pelo acúmulo de um número variável de produtos, cuja toxidez pode levar à morte da

célula em plantas não tolerantes (Crawford & Braendle, 1996; Ellis et al., 1999; Dennis et

al., 2000; Ferreira, 2002; Felle, 2005).

Devido a aceleração da taxa de fermentação anaeróbica, que resulta na depleção das

reservas de carboidratos, muitas plantas acumulam açúcares em seus tecidos no período

aerado, como forma de se prevenir para situações de anoxia (Albrecht et al., 2004). Uma

vez que a via fermentativa ocorre através da glicólise, a taxa de fermentação é controlada

pelo suprimento de açúcares solúveis disponíveis (Su et al. 1998). Dessa forma, a

disponibilidade de açúcares para uso no metabolismo é que vai definir o nível de tolerância

de uma espécie para a redução de oxigênio no meio (Perata et al., 1997; Schlüter &

Crawford, 2001).

Na Amazônia Central, as florestas alagáveis associadas aos grandes rios são

ambientes nos quais essas condições de alternância entre uma fase aquática e uma fase

terrestre são particularmente extremas (Junk et al., 1989), impondo a algumas árvores e,

principalmente às plântulas, períodos anuais de inundação superiores a 200 dias (Parolin,

2000). Dado que a tolerância ao alagamento difere entre espécies, a composição de

espécies em áreas alagáveis é influenciada pela combinação de fatores como a freqüência e

duração da inundação, a tolerância das plântulas à saturação hídrica do solo e as

características físico-químicas do solo sob tais condições (Kozlowski, 1984; Pezeshk,

2001). Como a distribuição de espécies se dá em um gradiente ascendente de elevação de

terreno, inversamente proporcional à inundação de cada faixa de relevo, é de se esperar que

45

sua composição varie ao longo deste gradiente (Kozlowski, 1984). De fato, a zonação de

espécies arbóreas nos gradientes de inundação das florestas alagáveis amazônicas,

especialmente nas várzeas, é bem documentada (Junk, 1989; Worbes et al., 1992;

Wittmann et al., 2004) mostrando que devido à inundação, a diversidade de espécies na

várzea é reduzida (Junk, 1993; Capon, 2005).

O estabelecimento de plântulas e a regeneração de áreas degrada podem ser

estimulados ou impedidos pela inundação, dependendo de sua duração e da espécie

considerada (Kozlowski, 1997). Embora a importância desse compartimento para a

perpetuação das espécies seja indiscutível, notadamente em ambientes extremos como as

áreas alagáveis amazônicas, as informações disponíveis, especialmente quanto aos

condicionantes para a germinação das sementes e sobrevivência das plântulas, são escassas

(Scarano, 1998; Parolin, 2001, Scarano et al., 2003; Ferreira et al., 2005; Oliveira-

Wittmann et al. no prelo).

Em diversas espécies as reservas contidas no endosperma das sementes contém a

maioria dos nutrientes necessários para o desenvolvimento inicial de plântulas (Perata et

al., 1997). Neste sentido, análises dos compostos de reservas que possam ser utilizados

como fontes de energia e carbono nos processos de germinação e de estabelecimento da

plântula no ambiente são ferramentas importantes para entender as adaptações de plantas a

ambientes inundados (Buckeridge et al., 2004a; b).

Esses estudos devem levar em consideração que a capacidade germinativa e o

desenvolvimento de plântulas podem variar dentro de um mesmo gênero (Medri, 1979;

Botelho, 1996; Tribuzy, 1998) ou espécie (Harbone, 1988; Ferreira et al., 2005). A esse

respeito, embora os determinantes ambientais sejam indicados como indutores da presença

de diferentes floras entre a várzea e terra firme na Amazônia (Piedade et al. 2001;

Wittmann et al., 2006), algumas espécies podem ocorrer em ambos os ambientes, em

condições distintas no que se refere à inundação. Isto implica em possíveis diferenças no

metabolismo, devidos as diferenças nas condições ambientais, às quais estão expostas. Para

verificar esses aspectos, foram feitas análises das reservas metabólicas em sementes das

populações de Himatanthus sucuuba de ecossistemas de várzea e de terra firme, bem como

o acompanhamento de possíveis alterações no metabolismo das raízes de plântulas quando

totalmente submersas, visando responder as seguintes questões:

1) Poderia o pulso de inundação, que anualmente alaga grandes áreas ao longo

do rio Solimões/Amazonas, induzir dentro de uma mesma espécie respostas

46

distintas no metabolismo dessas populações, relacionadas aos ambientes de

origem?

2) Seriam essas diferenças expressas em tal ordem de magnitude a ponto de

segregar as populações dos dois ambientes, em termos do estabelecimento?


2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo

As sementes foram coletadas de dez indivíduos nas várzeas da Ilha de Marchantaria

(03º 15’ S, 60º 00’ W) e cercanias, e de dez indivíduos nas áreas de terra firme que

abrangem a Reserva Florestal Adolpho Ducke (02º 53’ S, 59º 58’ W), ao longo da Rodovia

Manaus-Itacoatiara (AM 010). Essas áreas estão cerca de 40km de distância uma da outra,

separadas pelos rios Negro e Solimões. Em ambos os sítios, na várzea e na terra firme,

foram coletadas sementes em no mínimo três populações, com cerca de 1km de distância

entre si. Essas sementes foram então homogeneizadas, para garantir a aleatoridade das

amostras e utilizadas no estudo. O material fértil dessas plantas foi depositado no herbário

do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), sob o registro 210133.

As sementes coletadas foram acondicionadas em sacos de papel e transportadas

para o Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, do Instituto de Botânica de São

Paulo (IBt), São Paulo, SP, para realização das análises bioquímicas e produção de

plântulas para uso nos experimentos de inundação.

2.2. Análises da composição das sementes

2.2.1. Sementes inteiras

Foram analisados os teores de amido, açúcares totais e a composição dos açúcares nas

sementes inteiras de H. sucuuba provenientes de matrizes nas populações da várzea e da

terra firme. Inicialmente foram separados cinco lotes de três sementes para cada um dos

ambientes de origem (várzea ou terra firme), tendo sido cada lote considerado uma

repetição. A seguir, foi feita a retirada manual da casca das sementes que foram

posteriormente liofilizadas e pesadas (em grupos de três) para obtenção da massa seca e,

posteriormente, moídas em moinho de bola (Tecnal Ltda) para a extração de açúcares e

amido.

Para as análises, 50 mg de cada amostra de pó foram submetidas a três extrações

com 500 µL de etanol 80% (v/v), incubada em banho-maria a 80 ºC por 10 minutos. Após

47

cada extração, a mistura foi centrifugada. Em seguida, procedeu-se a coleta do

sobrenadante que foi seco a vácuo e usado na quantificação de açúcares solúveis totais pelo

método colorimétrico a A498 nm (Buckeridge & Dietrich, 1996). A curva padrão utilizada

foi de glucose. Os açúcares solúveis em álcool foram quantificados por HPLC.

As amostras foram deionizadas através de passagem por resinas Dowex catiônica e

aniônica e em seguida filtradas (Millipore 0,25 μm) para análise da composição dos

açúcares solúveis por Cromatografia de Troca Iônica de Desempenho com Detector de

Pulso Amperométrico (HPAEC/PAD) modelo DX500, em coluna CarboPac PA-1 (Dionex

Corporation, Sunnyvale, CA, EUA) através de eluição isocrática com 200 mM de

hidróxido de sódio em água, com fluxo 1mL/min : 0-15 min 50 % NaOH 200 mM e 50 %

H2O, 15-20 min 100 % NaOH 200 mM, 20-25 min 50 % NaOH 200 mM e 50 % H2O. As

áreas de cada pico foram corrigidas de acordo com a sensitividade do detector para cada

açúcar.

A análise de amido foi feita com base na metodologia descrita por Santos et al. (2004),

na qual o resíduo da extração etanólica foi seco em liofilizador e após a secagem foram

adicionados 500 µL de α-amilase termoestável (120U.mL-1). As amostras foram incubadas

a 75 ºC por 30 minutos (esse procedimento foi repetido mais uma vez). Em seguida foram

adicionados 400 µL de amiloglucosidase (30 U/mL-1) e a mistura de incubação foi mantida

por 30 minutos a 50 ºC (esse procedimento foi repetido mais uma vez). A amostra foi

submetida à digestão com ácido perclórico para a quantificação colorimétrica A490 nm,

com curva padrão de glucose.

2.2.2. Análise das reservas do endosperma

Três lotes de 10 sementes de H. sucuuba das populações da várzea e da terra firme

foram mergulhadas em água por 24 horas. Nessas sementes foi feita a retirada manual do

envoltório alado, para facilitar a embebição (Ferreira et al., 2005). Depois de embebidas,

foi feita a limpeza do restante da casca da semente até a exposição completa do

endosperma, que foi separado do embrião. Essas partes foram mantidas em liofilizador

para a determinação da massa seca. Do endosperma da semente foi obtido o teor de

carboidratos de reserva e de proteínas.

A extração dos carboidratos de reserva foi baseada no método descrito por Buckeridge

& Dietrich (1990), que consistiu em adicionar 100 mL de água destilada em 1g de amostra

do endosperma e em mantê-la em placa aquecida a 80 °C, sob agitação constante, por um

período aproximado de 4 horas. Após a extração, a amostra foi filtrada em tecido e

48

adicionado três volumes de etanol 96 ºGL, permanecendo em repouso a 5 oC durante a

noite (“overnight”), para a precipitação da amostra. Após esse período a amostra foi lavada

com acetona PA, centrifugada, e o resíduo foi liofilizado. A amostra seca foi ressuspensa

em água. A quantificação dos carboidratos foi feita em espectrofotômetro no comprimento

de onda de A498 nm pelo método de Dubois et al. (1956), e a de proteínas a A595 nm pelo

método de Bradford (1976).

A presença de percentuais elevados de carboidratos de reserva constituindo o

endosperma levou à realização da análise de fragmentação destes em monossacarídeos,

quantificados em HPLC, conforme metodologia descrita no tópico anterior (sementes

inteiras).

2.2.3. Produção de plântulas para o estabelecimento dos experimentos de alagamento

As sementes foram colocadas para germinar diretamente em vasos com capacidade

para 2L, em temperatura ambiente (média 20º C). O substrato utilizado para o plantio foi

areia, com cobertura superficial de vermiculita para conservar a umidade. Entretanto, após

14 dias de observação, foi verificado que as sementes embeberam, porém não germinaram,

sendo então transferidas para câmaras a 30 ºC. Sob as novas condições, a germinação

(emissão de radícula geotrópica) ocorreu entre o segundo e o quinto dia, após o qual, foi

feita a transferência destas para a casa de vegetação, onde se acompanhou a produção e o

estabelecimento de plântulas. O critério utilizado para iniciar a indução do alagamento foi

a emissão e completa expansão do segundo par de folhas pelas plântulas.

Para o experimento de alagamento foram utilizados tanques de polietileno (40 L) e

dentro de cada tanque foram dispostos quatro vasos (2 L), com 5 plântulas/vaso, geradas a

partir de sementes da várzea ou da terra firme, com idade aproximada de um mês. Cada

plântula foi considerada uma unidade amostral. O substrato utilizado no experimento foi

areia.

Durante o período de 30 dias as plântulas foram submetidas aos seguintes tratamentos:

Controle (irrigação diária e luz natural); Escuro (irrigação diária com a planta mantida no

escuro); Alagado com luz (submersão total da planta, com coluna de água de 20 cm); e

Alagado no escuro (submersão total da planta, com coluna de água de 20 cm e cobertura

com plástico preto 100% sem luz).

49

2.2.4. Análises bioquímicas das raízes das plântulas

No período de 15 e 30 dias após o início dos experimentos de alagamento, foi

realizada a coleta de três plântulas de H. sucuuba de cada ambiente, por tratamento. As

plântulas foram retiradas do vaso, lavadas com água corrente, separadas em raiz e parte

aérea e acondicionadas dentro de envelopes de alumínio, devidamente identificados,

mantidos em nitrogênio líquido. Posteriormente era feito o armazenamento das mesmas em

freezer a -20ºC.

As análises de carboidratos de baixo peso molecular e de poliálcoois foram

realizadas nas raízes das plântulas, em todos os tratamentos e para os dois períodos

avaliados, utilizando o sistema GC/MS (Cromatógrafo a Gás com Espectrometria de

Massa).

As raízes foram levadas ao liofilizador até peso constante. Depois de secas, foram

maceradas utilizando pistilo e almofariz e transferidas para tubos de Eppendorf. Para as

análises químicas foram utilizados 30 mg de massa seca, de cada amostra coletada nos

diversos tratamentos.

A extração foi feita adicionando às amostras de material liofilizado, 500 µL da

mistura de metanol:clorofórmio:água (12:5:3 v/v), contendo fenil-β-D-glucopiranoside,

como padrão interno. As amostras foram incubadas em banho-maria a 60 ºC por 30

minutos. Para facilitar a separação das fases foi adicionado 500 µL de água deionizada e

foi feita a centrifugação a 10.000 g por 2 minutos. Em um tubo vial de 1,5 mL foi pipetado

50 µL do sobrenadante obtido. A silanização das amostras foi feita adicionando ao tubo

200 µL de pirimidina, 25 µL da mistura de N,O-bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide

(BSTFA) e trimethyl-chlorosilane (TMCS), adicionado ao tubo. Os vials foram incubados

em banho seco a 75 ºC por 60 minutos e a quantificação dos compostos foi efetuada no

GC/MS, de acordo com a metodologia descrita por Roessner et al. (2000).

2.2.5. Análise estatística dos dados

De posse das concentrações de açúcares solúveis, amido, carboidratos e proteínas

presentes na semente inteira ou no seu endosperma, procederam-se aos ajustes das

equações por meio de análise de regressão. O teor de cada composto foi calculado com

base na quantidade de massa seca da semente. Para os experimentos de alagamento o

delineamento experimental foi completamente casualizado com três repetições. A análise

foi em esquema fatorial 2 (épocas de avaliação) x 3 (repetições) x 2 (ambientes, várzea ou

terra firme). Foi feita análise de variância (ANOVA) e a comparação entre as médias dos

50

fatores estudados foi feita com base no teste Tukey a 5% de probabilidade. As análises

estatísticas foram realizadas utilizando o programa Statistic 8.0.

3. RESULTADOS

3.1. Análise das sementes

Em H. sucuuba, cerca de 34 ± 5 mg.g-1 da massa seca das sementes da população da

várzea e 36 ± 2 mg.g-1 da população da terra firme, é constituída por açúcares solúveis.

Esses valores correspondem a quase 15% da massa seca total das sementes em ambas as

populações (Tab. 1). Do total de açúcares solúveis, as maiores concentrações foram de

rafinose e sacarose. Sementes de H. sucuuba não apresentam amido como carboidrato

principal de reserva, uma vez que apenas traços deste composto foram detectados (Tab. 1).

Tabela 1. Concentração de amido e açúcares solúveis totais em lotes de três sementes de H. sucuuba de populações da várzea e da terra firme. n = 5.

Composição dos açúcares totais (%) Ambiente Amido

(%)

Açúcares totais

(%) glucose sacarose rafinose

Várzea traços 14 4 27 69

Terra firme traços 13 2 40 58

Nas duas populações (várzea e terra firme), a semente embebida revelou a presença de

endosperma que contribui com mais da metade (55%) de sua massa seca total (Tab. 2).

Apesar dos valores de massa seca das sementes mostrarem-se maiores entre as populações

da terra firme, em relação às da várzea, estatisticamente não houve diferença.

Tabela 2. Valores médios da massa seca de lotes com 10 sementes de H. sucuuba: massa do endosperma, do embrião e total (semente inteira). n = 5 lotes.

Várzea Terra Firme

(mg-1. g MS) (%) (mg-1. g MS) (%)

Eixo 338 45 399 45

Endosperma 413 55 488 55

Total 752 100 887 100

A análise realizada para verificar a composição do endosperma nas sementes das duas

populações mostrou similaridade quanto aos constituintes, mas não entre a partição destes

(Fig. 1). Embora a maior parte do endosperma fosse formada de polissacarídeos de parede

celular, esses valores foram mais elevados na população de várzea. Por outro lado, nas

plântulas da terra firme a porcentagem de açúcares solúveis foi cerca de dez vezes o valor

daqueles medidos nas plântulas da várzea (Fig. 1).

várzea 4,5% 2,5%

93%

polissacarídeos proteínas açúcares solúveis

terra firme 4% 22%

74%

polissacarídeos proteínas açúcares solúveis

Figura 1. Percentual (área) dos constituintes do endosperma da semente de H. sucuuba.

A hidrólise ácida destes polissacarídeos mostrou diferenças na constituição em

monossacarídeos das sementes das duas populações. Em ambas, o carboidrato de reserva

com maior área é um manano. No entanto, enquanto nas sementes oriundas da várzea cerca

de 94% de sua constituição é formada por manose, nas sementes da terra firme verificou-se

uma razão de manose e galactose de aproximandamente 3:1 (Tab. 3). Isto sugere a

presença de um galactomanano nessas sementes como principal polissacarídeo de reserva

de parede.

Tabela 3. Percentual (área) dos monossacarídeos de reserva de parede, no endosperma de H. sucuuba.

Várzea

(%)

Terra firme

(%)

fucose traços 0,5

arabnose 1,5 9,7

rhamnose 0,3 2

galactose 3 17,7

glucose 0,5 2,6

xilose 0,4 2,9

manose 94,3 64,6

51

52

3.2. Análise bioquímica das raízes das plântulas sob alagamento

Sementes de H. sucuuba apresentaram comportamento quiescente, uma vez que a

germinação e o início da formação da plântula aconteceu apenas após a transferência das

sementes para câmaras com temperatura semelhante àquela encontrada no ambiente natural

de ocorrência da espécie, a floresta amazônica, onde a temperatura elevada (média de 28º

C) é praticamente constante, com pouca variação.

As análises realizadas aos 15 dias mostraram que as plântulas do controle da várzea

apresentavam em suas raízes concentrações de malato menores (p≤0.05) que aquelas

submetidas aos demais tratamentos (escuro, alagado na luz e alagado no escuro). Nas

plântulas da terra firme não houve diferença significativa entre os tratamentos. Aos 30 dias

foi verificado um decréscimo nas concentrações de malato nas duas populações, em

comparação com o controle, porém, somente no tratamento alagado no escuro essa redução

foi significativa. Plântulas da terra firme aos 30 dias apresentaram valores de concentração

de malato maiores (p≤0.05) que as plântulas da várzea (Tab. 4).

Tabela 4. Valores médios das concentrações de malato (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

MALATO (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 4,07 2,77 12,52* 27,45*

Escuro 10,73 4,97 7,74 18,93

Alagado luz 10,20 17,51 8,81 10,49

Alagado escuro 11,46 7,69 3,33 6,56 (*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

O alagamento por 15 dias, em condições de escuro, elevou (p≤0.05) os valores de

citrato nas raízes das plântulas da várzea. O mesmo não foi observado nas plântulas da

terra firme, que não apresentou diferença (p≤0.05). Por outro lado, aos 30 dias, neste

mesmo tratamento, houve redução significativa na concentração de citrato entre as

plântulas da terra firme, quando comparadas ao controle, enquanto as plântulas de várzea

sob as mesmas condições não diferiram do controle. Contudo, os valores apresentados

pelas plântulas da várzea aos 30 dias foram diferentes (p>0.05) daqueles observados aos 15

53

dias, mostrando decréscimo em sua concentração. Para os outros tratamentos, nos dois

períodos analisados as diferenças não foram significativas. Aos 30 dias verificou-se que

sob condições de alagamento, tanto na luz quanto no escuro, as concentrações de citrato

nas raízes de plântulas da várzea foram mais elevadas (p≤0.05) que naquelas da terra firme

(Tab. 5).

Tabela 5. Valores médios das concentrações de citrato (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

CITRATO (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 18,60* 2,47* 25,87 24,02

Escuro 17,19 6,96 19,96 12,10

Alagado luz 19,06 21,31 18,31* 5,43*

Alagado escuro 44,28* 14,02* 8,83* 3,68* (*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

O alagamento levou ao aumento significativo nas concentrações de mioinositol nas

raízes de plântulas da várzea aos 15 dias. Aos 30 dias a diferença se manteve somente nas

plântulas alagadas no escuro. Embora raízes sob alagamento na luz permanecessem com

valores elevados, sem diferença para as análises aos 15 dias, seus valores não foram

diferentes do controle. Nos dois períodos de avaliação das plântulas da terra firme (15 e 30

dias), aumentos significativos foram verificados no tratamento daquelas alagadas na luz.

Nos demais tratamentos, comparados ao controle, as concentrações mantiveram-se

constantes. Diferenças significativas entre as populações dos dois ambientes foram

verificadas aos 15 dias, onde as plântulas da várzea apresentaram valores mais elevados

(p≤0.05) que da terra firme (Tab. 6).

54

Tabela 6. Valores médios das concentrações de mioinositol (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

MIOINOSITOL (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 0,23 0,14 0,60 0,24

Escuro 0,35 0,08 0,27 0,12

Alagado luz 0,55* 0,30* 0,87 0,70

Alagado escuro 0,76* 0,29* 0,83 0,53 (*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Não houve diferença (p≥0.05) nas concentrações de frutose entre os tratamentos aos

15 e 30 dias. Entretanto, quando um mesmo tratamento foi comparado nos dois períodos de

avaliação, verificou-se que na população da várzea o tratamento com as plântulas no

escuro e alagadas no escuro levou a um decréscimo significativo nas concentrações de

frutose. Nestes tratamentos, as concentrações desse composto nas raízes das plântulas

permaneceram sempre mais elevadas entre aquelas da várzea (Tab. 7). Nos tratamentos

controles aos 15 e 30 dias, as plântulas da várzea mostraram uma tendência à redução na

concentração de frutose, enquanto as da terra firme elevaram seus valores, mas sem

diferença significativa para ambos (Tab. 7).

Tabela 7. Valores médios das concentrações de frutose (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

FRUTOSE (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 8,26* 0,66* 3,54 1,65

Escuro 5,53* 0,14* 1,39* 0,28*

Alagado luz 2,13 2,09 2,92 1,34

Alagado escuro 11,47* 0,64* 3,46* 0,93*

(*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

55

Plântulas da várzea com 15 dias no escuro ou alagadas com luz reduziram de forma

significativa as concentrações de glucose em suas raízes, já o tratamento de alagamento no

escuro manteve constante a concentração desse composto. Aos 30 dias não houve

diferença em relação ao controle, mas verificou-se a elevação na concentração de glucose

(p≤0.05) dos 15 aos 30 dias, nas raízes das plântulas alagadas com luz. Aos 15 dias apenas

o tratamento de alagamento na luz não apresentou diferença (p≥0.05) nas concentrações de

glucose entre as plântulas dos dois ambientes (Tab. 8). Nos três tratamentos restantes

(controle, escuro e alagado no escuro) as plântulas da várzea apresentaram concentrações

de glucose nas suas raízes mais elevadas que nas de terra firme. Aos 30 dias essa diferença

não foi observada (Tab. 8).

Tabela 8. Valores médios das concentrações de glucose (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

GLUCOSE (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 28,41* 7,05* 20,39 20,64

Escuro 7,73* 1,93* 13,54 16,88

Alagado luz 4,92 11,77 40,93 31,27

Alagado escuro 35,75* 11,88* 42,87 20,15 (*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

As análises realizadas aos 15 e aos 30 dias mostraram que plântulas de H. sucuuba,

tanto da várzea quanto da terra firme, elevam as concentrações de sacarose (p≤0.05) sob

condições ideais de luz e água (tratamentos controles). Quando submetidas ao escuro as

plântulas reduziram a concentração do composto (p≤0.05). Plântulas sob alagamento em

condições de escuro mantiveram as concentrações de sacarose constantes durante todo o

período experimental, sem diferença (p≥0.05) para os valores apresentados pelo controle

aos 15 dias. Nas plântulas da várzea, após 15 dias no tratamento de alagamento com luz,

ocorreu a redução na concentração de sacarose (p≤0.05), diferente das plântulas da terra

firme, que não apresentaram diferenças em relação ao controle (p≥0.05). Aos 30 dias de

experimento, nas duas populações, os valores apresentados pelos controles foram

superiores (p≤0.05) àqueles dos tratamentos de luz e inundação. Neste tratamento, as

56

plântulas da população de várzea apresentaram valores maiores (p≤0.05) de concentração

de sacarose que aquelas da terra firme (Tab. 9).

Tabela 9. Valores médios das concentrações de sacarose (μg.g-1 MS) nos diferentes tratamentos em plântulas das populações de várzea e de terra firme aos 15 e 30 dias de avaliação. n = 3.

SACAROSE (μg.g-1 MS)

15 dias 30 dias

VZ TF VZ TF

Controle 51,04 40,88 167,31* 101,34*

Escuro 3,19 1,27 2,70 2,09

Alagado luz 8,14 25,32 23,12 13,54

Alagado escuro 56,12 35,22 49,56 25,28 (*) = na mesma linha, mostra diferença significativa entre as médias das populações da várzea e da terra firme no mesmo período de avaliação (15 ou 30 dias). Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

4. DISCUSSÃO

4.1. Análise das reservas nas sementes

As sementes de H. sucuuba da população da várzea apresentaram a mesma

composição de reservas que aquelas da população da terra firme, no entanto, variações

importantes nas concentrações dessas substâncias foram observadas entre os dois

ambientes.

Independente da população estudada, várzea ou terra firme, as maiores

concentrações de açúcares solúveis nas sementes de H. sucuuba foram verificadas para

sacarose e rafinose. Esses compostos são considerados como principais derivados de

carboidratos que atuam como reserva na semente durante a germinação (Koops &

Groeneveld, 1990; Karner et al., 2004). Em sementes quiescentes, estes costumam ser os

carboidratos de reserva mais abundantes, normalmente associados aos oligossacarídeos da

série rafinósica (rafinose, estaquiose, verbascose) (Berna-Lugo & Leopold, 1992;

Buckeridge et al., 2004a).

A sacarose é excepcionalmente eficaz na proteção da integridade da membrana nos

sistemas expostos a secas, enquanto a rafinose é conhecida por realçar os efeitos protetores

da sacarose, evitando assim a dessecação da semente (Berna-Lugo & Leopold, 1992;

Karner et al., 2004). Esses compostos geralmente têm suas concentrações aumentadas no

57

final do período de maturação das sementes e, por possuírem a característica de reservas de

uso rápido para a produção de energia, sua função principal é servir como fonte de carbono

para a semente durante o processo germinativo (Koops & Groeneveld, 1990; Buckeridge et

al., 2004a). Desta forma, uma vez que H. sucuuba germina em um curto período de tempo

quando em condições ambientais favoráveis (Ferreira et al., 2005), compostos de

degradação rápida são necessários como fonte de energia para o desenvolvimento do

embrião e protrusão da radícula.

Nas sementes das duas populações, grande parte do endosperma é formada por

polissacarídeos de parede celular (93% várzea e 74% terra firme). Estas substâncias são

mobilizadas após a germinação, durante o desenvolvimento da plântula (Buckeridge et al.,

2000b), estágio especialmente sensível do ciclo de vida, em que o crescimento e a

sobrevivência inicial podem ser fortemente influenciados pelas reservas que a semente tem

disponível (Santos & Buckeridge, 2004). Por outro lado, da mesma forma que as maiores

concentrações de polissacarídeos de reserva de parede são verificadas no endosperma da

semente das populações da várzea, a contribuição dos açúcares solúveis na formação do

endosperma é quase dez vezes maior nas sementes de populações da terra firme.

A biossíntese e a deposição dos polissacarídeos na parede celular ocorrem na fase

final de maturação da semente e requerem açúcar-nucleotídeos como doadores de

monossacarídeos (Buckeridge et al., 2000a). Isto pode indicar que no período final da

maturação das sementes de H. sucuuba ocorre um acúmulo de sacarose que, em seguida, é

convertida em um polissacarídeo de reserva de parede. Com base nessas evidências,

podemos sugerir que a população da várzea investe na produção de carboidratos para o

desenvolvimento da plântula, enquanto que a população da terra firme aloca também

grande quantidade de carbono em compostos utilizados na germinação. Esta interpretação

é mais plausível ainda se, na análise, for considerada a importância dessas características

diferenciais no ambiente natural de origem de cada uma dessas populações. Enquanto na

várzea as plantas dispõem de um período de tempo relativamente curto antes da inundação

para o estabelecimento da plântula (cerca de três meses), essa pressão ambiental não é

imposta às plantas que habitam a terra firme.

Nas sementes de H. sucuuba de populações da várzea, mais de 90% dos

polissacarídeos de parede são constituídos por manose, sendo encontrado apenas 3% de

galactose. Da mesma forma, no endosperma das sementes de populações da terra firme,

estes também foram os monossacarídeos mais abundantes, no entanto, a relação entre esses

dois compostos foi cerca de 3:1. De acordo com as características de classificação dos

58

mananos (Buckeridge et al., 2000a;b), as sementes da várzea apresentam um manano puro

e as sementes das populações da terra firme possuem um galactomanano como

polissacarídeo reserva de parede celular.

O galactomanano é um dos polissacarídeos de reserva mais abundantes na natureza,

constituindo o endosperma de sementes de um grande número de espécies (Reid et al.,

2003; Buckeridge et al., 2004a). Pelo fato de que sua distribuição em grupos de plantas é

uma característica bastante específica e robusta, sua presença e concentração se constitui

em uma importante ferramenta do ponto de vista taxonômico. Os galactomananos são

compostos constituídos por uma cadeia principal de manose com ramificações de galactose

(Buckeridge et al., 2004a). A quantidade de ramificações de galactose é que vai determinar

o grau de solubilidade dos galactomananos em água, pois acima de uma razão igual a

quatro os galactomananos se tornam insolúveis (Buckeridge et al., 2004a).

Adicionalmente, estudos realizados até o momento indicam que o galactomanano

tem características de molécula bifuncional, exercendo papel no controle da embebição no

início da germinação, servindo, posteriormente, como reserva de carbono para o

crescimento inicial da plântula (Potomati, 2000). Exemplo dessa natureza do

galactomanano foi documentado para Sesbania virgata (Leguminosae - Faboideae) que

acumula esse polissacarídeo no endosperma, onde o mesmo funciona muito mais como

provedor de reserva de água para as sementes do que de carbono para o embrião (Potomati

& Buckeridge, 2002). Aparentemente esse não é caso de H. sucuuba, uma vez que se

conhecem os aspectos da germinação e produção de plântulas da espécie (Ferreira et al.,

2005). Assim sendo, pode-se concluir que as reservas utilizadas na fase inicial sejam

provenientes do endosperma da semente, que adquirem assim grande importância.

Os resultados de bioquímica das sementes são plenamente compatíveis com os

resultados de biomassa obtidos para H. sucuuba (Capítulo II), indicando que funções

ecológicas distintas parecem estar sendo exercidas pelos polissacarídeos e suas diferentes

concentrações acumuladas nas sementes da espécie em cada um dos ambientes

comparados. Muitas espécies que colonizam a várzea, entre elas H. sucuuba, têm a

capacidade de germinar e iniciar a produção de plântulas em solo saturado de água

(Scarano et al., 2003; Ferreira et al., 2005; Oliveira-Wittmann et al., no prelo) ou, antes da

descida total das águas e exposição do solo. Conseqüentemente, espera-se que na

germinação as sementes da população da várzea mobilizem suas reservas mais

rapidamente do que aquelas da terra firme. Também nessas sementes, os compostos

estruturais da parede da célula, que são necessários para permitir o crescimento inicial

59

rápido da plântula, são de importância fundamental no ecossistema de várzea, onde a

planta pode escapar da submergência total ao crescer em altura antes da elevação do nível

da água, sendo esse um fator essencial da colonização bem sucedida neste ambiente.

4.2. Análise do metabolismo das raízes de plântulas de H. sucuuba

Nas plantas a produção de açúcares por meio da fotossíntese é um processo vital, e

a composição, concentração e localização dos açúcares em seus diferentes compartimentos

modulam e coordenam os reguladores internos e as respostas aos estímulos ambientais, que

governam o crescimento e o desenvolvimento (Koch, 1996; Smeekens, 2000; Koroleva et

al., 2001). A fotossíntese ocorre nas células do mesofilo da folha madura e o fotossintato é

transportado, primeiramente como sacarose, aos meristemas e aos órgãos em

desenvolvimento. A luz e os açúcares regulam as atividades do crescimento por uma

modulação coordenada da expressão de genes e atividades enzimáticas, tanto no tecido que

exporta (fonte) quanto naquele que importa (dreno) o carboidrato. Isto assegura a síntese e

o uso ótimo do carbono e dos recursos de energia, e permite o ajuste do metabolismo de

carboidratos às mudanças nas condições ambientais e disponibilidade de nutrientes

(Coruzzi & Bush, 2001; Grossman & Takahashi, 2001).

Nas várzeas da Amazônia Central, os rios de águas brancas que invadem as

florestas nas épocas de cheia, permitem uma penetração limitada de luz nesses sistemas,

inferior a um metro de profundidade (Junk, 1984). Uma vez que H. sucuuba permanece

inundada em média por cinco meses sob uma coluna de água de cerca de 8 m (Ferreira,

2002), as plântulas dessa espécie sobrevivem em total ausência de luz. Nesse caso, além da

anoxia desses ambientes, a luz também pode ser um limitante, uma vez que ambos,

oxigênio e luz, são essenciais aos processos mais importantes para a sobrevivência da

planta, respiração e fotossíntese (Taiz & Zeiger, 2004).

Quando organismos aeróbicos estão expostos a ambientes com limitação de O2 (por

exemplo, em solo inundado), a fosforilação oxidativa na mitocondria é inibida, o

metabolismo é desviado para a fermentação, com finalidade de sustentar a glicólise por

regeneração direta do NAD (Tadege et al., 1999; Dennis et al., 2000), conduzindo ao

acúmulo de produtos diversos tais como o etanol, lactato, alanina, succinato e malato (Fan

et al., 1997). O etanol é o principal produto da fermentação na maioria das plantas, e isso

independe do grau de tolerância ao déficit de O2.

Himatanthus sucuuba é um exemplo de espécie com metabolismo alcoólico quando

em anaerobiose (Ferreira, 2002). Entretanto, pelo fato do etanol ser um composto tóxico e

60

pelo baixo rendimento energético gerado, hipóteses como a de Crawford (1978), sobre a

diversificação da via metabólica a fim de produzir compostos menos tóxicos para a planta,

foram formuladas para tentar explicar a tolerância das espécies à inundação. Além disso,

acredita-se também que outras vias metabólicas poderiam atuar simultaneamente nos

indivíduos (Lobo & Joly, 1998; Sousa & Sodek, 2002). Contudo, no presente estudo essa

hipótese não pôde ser comprovada como um mecanismo eficiente em longo prazo para

plântulas de H. sucuuba, pois foi verificado que estas acumulam malato, independente da

imposição de estresse, sendo constatada uma elevação significativa na concentração deste

composto nas raízes das plântulas das duas populações, várzea e terra firme, no tratamento

controle.

Nos primeiros 15 dias de tratamento as plântulas da população da várzea tiveram a

concentração de malato elevada de forma significativa em todos os tratamentos (luz e

alagamento), em comparação ao controle, retornando ao valor inicial na análise realizada

aos 30 dias, com exceção das plântulas das duas populações expostas ao tratamento de

alagamento no escuro, em que a concentração de malato foi menor do que o valor medido

nos tratamentos controles. Estes eventos observados aos 30 dias sugerem que as raízes das

plântulas sob alagamento poderiam possuir um mecanismo de aclimatação às condições de

alagamento no escuro, que são as condições encontradas naturalmente na várzea.

Resultados semelhantes foram evidenciados no tecido de raiz de cevada (Hordeum

vulgare), submetida a 24h de anaerobiose, que apresentou níveis de concentração de

malato elevados nas primeiras 12h, depois das quais retornou a valores semelhantes aos

medidos no controle oxigenado. Nesse experimento, que avaliou diversos compostos

resultantes do metabolismo anaeróbico da cevada, apenas o etanol continuou a ser

produzido até o final das 24h (Good & Muench, 1993). Isto sugere que as plântulas podem

apresentar respostas metabólicas diferenciadas de curto e longo período sob circunstâncias

anóxicas, o que parece ser o caso de H. sucuuba.

A presença de citrato foi observada em todos os tratamentos, com diferença apenas

entre as plântulas da várzea do tratamento de alagamento no escuro, que elevou de forma

significativa a concentração do composto nas raízes. Contudo, quando se comparam as

plântulas das duas populações, várzea e terra firme, foi observado que aquelas da várzea

apresentaram maiores concentrações de citrato em suas raízes, especialmente sob

alagamento. Isto pode estar relacionado com a absorção de fósforo (P) pela planta, uma vez

que por causa de sua afinidade elevada para cátions divalentes e trivalentes, o citrato pode

61

deslocar P dos complexos insolúveis e torná-lo disponível para a absorção pela planta

(Marschner, 1995; Zhang et al., 1997; López-Bucio et al., 2000).

Em solos alcalinos a exudação de ácidos orgânicos por algumas espécies de plantas

desempenha um importante papel na absorção de P (López-Bucio et al., 2000). Se for

considerado o fato de que os solos de várzea (alcalinos) apresentam uma depleção de P nas

camadas menos superficiais, tornando-os mais deficientes nesse mineral do que as

reconhecidamente pobres áreas alagáveis por águas pretas ou claras (igapós) da região

amazônica (Furch, 1984), pode-se inferir que nas áreas de várzea, plantas com a

capacidade de concentrar citrato podem ter favorecida a absorção de P pelas raízes,

adaptação positiva que demonstraria a forte adaptabilidade a esses ambientes.

Outro composto que sofreu influencia do alagamento foi o mioinositol, que elevou

seus níveis de concentração em relação ao controle nos primeiros 15 dias de tratamento,

especialmente nas plântulas das populações da várzea. Na análise realizada aos 30 dias, os

níveis mantiveram-se elevados, no entanto foram semelhantes ao verificados para o

controle no mesmo período. O mioinositol é um poliálcool e seu papel está relacionado

à síntese de fosfolipídios e, portanto, na biogênese e na integridade da membrana (Nelson

et al., 1998). É um composto normalmente presente em plantas sob condições de estresse e

suas funções incluem a mediação de respostas celulares a estímulos externos. Em plantas

tolerantes à salinidade, atua como um sinalizador da folha-à-raiz para que a planta capture

sódio (Nelson et al., 1999). Entretanto, recentemente, Lorence et al. (2004) apresentaram

evidencias bioquímicas e moleculares de que o mioinositol é um possível precursor de

antioxidantes, como o ácido ascórbico. Em raízes de plântulas de H. sucuuba a função

desse composto não pôde ser esclarecida, mas parece plausível que esteja relacionado com

a manutenção da integridade da membrana celular. Tendo em vista que a via alternativa do

metabolismo anaeróbico é a etanólica, e o acúmulo de álcool, em qualquer quantidade,

pode levar a danos nas membranas. Contudo, sua possível função na rota para produção de

antioxidantes não pode ser descartada nas plantas sob alagamento.

As raízes são relativamente sensíveis ao déficit de oxigênio e postula-se que a

tolerância de uma planta a anoxia causada por inundação do solo é determinada pelo nível

de reservas de açúcar disponíveis na raiz (Su et al., 1998; Schlüter & Crawford, 2001).

Para sustentar um metabolismo fermentativo ativo, a planta necessita da disponibilidade de

carboidratos prontamente fermentáveis (Guglielminetti et al., 1995). Os açúcares solúveis,

especialmente a sacarose, glucose e frutose, executam um papel importante na estrutura e

na manutenção das funções de todas as células vivas. Eles estão envolvidos nas respostas a

62

vários estresses e agem como nutrientes e sinalizadores metabólicos de moléculas que

ativam modelos específicos de transdução de sinais de hormônios (Couée et al., 2006).

As plântulas de H. sucuuba da população da várzea, quando alagadas, apresentaram

em suas raízes concentrações maiores de frutose e glucose do que as plântulas da

população da terra firme. Entretanto, em ambas as populações o açúcar em maior

quantidade nos tratamentos controles foi a sacarose, com valores significantemente mais

altos nas raízes de populações da várzea. De uma maneira geral, as concentrações de

sacarose diminuíram em resposta ao alagamento, no entanto, a diminuição foi menor no

tratamento de alagamento no escuro. Estes resultados sugerem que a sacarose seja

acumulada pela planta para uso no metabolismo anaeróbico, uma vez que se sabe que as

plântulas da população da várzea apresentam melhor desempenho no desvio da via

metabólica em resposta à inundação (Ferreira, 2002). Esses resultados também reforçam a

hipótese de que H. sucuuba seja uma planta que apresenta estratégias preventivas ao

estresse causado pelas pressões ambientais sofridas nesse ambiente, principalmente o

alagamento por um longo período de tempo.

No caso das plântulas do tratamento controle, os resultados mostram um acúmulo

de reservas que podem ser rapidamente utilizadas em resposta ao alagamento. Por outro

lado, quando em alagamento no escuro, típico das condições de várzea, há uma utilização

lenta dessas reservas, evidenciada pela paralisação do crescimento, como observado no

Capítulo II, com as plântulas sob submersão total.

5. CONCLUSÕES

Himatanthus sucuuba mostrou diferenças nas reservas presentes em suas sementes

entre as populações da várzea e da terra firme, notadamente quando uma análise mais

detalhada dessas reservas foi realizada. Essas diferenças podem ser explicadas diante dos

condicionantes impostos pela periodicidade e recorrência do pulso de inundação anual ao

qual as plantas desses ambientes estão sujeitas. Embora classificada como uma mesma

espécie, independente de ocorrer na várzea ou na terra firme, as diferenças se manifestam

também na análise das reservas presentes nas raízes das plântulas, parecendo ser de grande

importância ecológica para assegurar o sucesso no estabelecimento das mesmas em cada

um dos ambientes.

Enquanto nas plantas da terra firme o processo germinativo é mais lento e

energeticamente custoso, nas populações da várzea, o alongamento das plantas parece ser o

63

fator determinante para o sucesso na colonização. Estas evidências associadas a trabalhos

anteriores com a bioquímica da espécie (Ferreira, 2002), como também os resultados dos

capítulos I e III do presente estudo, suportam a hipótese de que as diferenças entre as

populações dos dois ambientes são suficientes para segregá-las no que diz respeito aos seus

mecanismos de estabelecimento.


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68

CAPÍTULO IV

Análise filogenética de Himatanthus sucuuba,

baseada na seqüência de nucleotídeos da

região ITS-5.8S rDNA

69

1. INTRODUÇÃO

Himatanthus sucuuba Wood., ou sucuúba, é uma Apocynaceae arbórea que na

Amazônia Central coloniza naturalmente dois dos mais importantes ecossistemas da

região, a terra firme e a várzea. Esses ecossistemas apresentam características ambientais

peculiares e contrastantes. Enquanto as áreas de terra firme são caracterizadas por não

apresentarem suas planícies inundadas por águas aluviais (Veloso et al., 1991), as áreas de

várzea são submetidas a uma inundação anual que dura cerca de seis meses, seguido de um

período de seca quando as águas retornam ao leito normal dos rios. Durante a cheia, a

coluna de água pode chegar a atingir a altura média de 10 m (Junk, 1989), inundando

grandes áreas de florestas marginais.

Se por um lado na terra firme as condições climáticas e hidrológicas são

praticamente constantes, sendo a pluviosidade o principal fator influenciando a

fenodinâmica das espécies nesses ambientes (Araújo, 1970; Alencar et al., 1979; Reich &

Bordechert,1984), na várzea as plantas precisam se adaptar periodicamente a essa

alternância entre uma fase aquática e outra terrestre (Piedade et al., 2000), que muitas

vezes envolve interações entre a morfologia, anatomia e fisiologia das mesmas, como

estratégias de sobrevivência a tais condições (Kozlowski, 1997; Piedade et al.,2001;

Parolin, 2001; Ferreira, 2002). As respostas das plantas ao alagamento variam ainda com a

espécie, o genótipo, a idade do indivíduo e o tempo de exposição ao alagamento (Drew &

Lynch, 1980; Kozlowski, 1984; Kozlowski, 1997). De forma que, como padrão geral, o

estresse por inundação reduz a diversidade de espécies na várzea (Junk, 1993).

A diferença entre os dois ecossistemas se reflete na composição florística, uma vez

que é a similaridade entre a flora da várzea e da terra firme na Amazônia Central são

estimadas em no máximo 30% (Piedade et al., 2000; Wittmann et al., 2006). Porém, a

existência de algumas espécies arbóreas ocorrendo naturalmente nos dois ambientes é

peculiar e deve ser investigada. Caso essa distribuição reflita, de fato, uma grande

plasticidade fenotípica das espécies, que lhes confere a capacidade de se adaptarem

temporariamente ao estresse de inundação, esses estudos tornam-se relevantes para o

entendimento dos limites de tolerância das plantas a fatores ambientais, como a seca e o

alagamento. Estudos dessa natureza são importantes por fornecer subsídios para o manejo

e recolonização desses ecossistemas. Por outro lado, embora estejam sendo classificadas

como a mesma espécie, as populações da terra firme podem não tolerar ou apresentar

respostas adaptativas à inundação, diferentes daquelas das populações da várzea, sugerindo

algum grau de separação genética entre elas (Ferreira et al., 2005).

70

No caso de sucuúba, Ferreira (2002) e Ferreira & Piedade (2004) verificaram que

plântulas dessa espécie, produzidas de sementes de populações que habitam a várzea ou a

terra firme, quando submetidas a um período prolongado de submersão total, apresentam

respostas fisiológicas distintas, relacionadas ao ambiente de origem das sementes. Para

essa espécie, diferenças na tolerância à inundação entre as duas populações foram

verificadas ainda durante a germinação, onde apenas aquelas sementes oriundas das

populações da várzea conseguiram produzir plântulas sob condições de submersão

(Ferreira et al., 2005).

Esses estudos levaram à formulação da hipótese de que o rio poderia estar atuando

como uma barreira geográfica promovendo o isolamento das populações que sofrem

inundações prolongadas e aquelas da mesma espécie que habitam as planícies não

alagadas. Neste caso o “pulso de inundação” (Junk, 1989) e as grandes dimensões dos rios

amazônicos que banham as florestas de várzea, poderiam servir como barreiras naturais de

fluxo gênico entre os dois ambientes (várzea e terra firme). Essa confirmação revelaria a

Amazônia como um ecossistema ainda mais diverso do que percebemos atualmente.

Para testar essa hipótese, optou-se pela realização de análises moleculares de

indivíduos de sucuúba, pertencentes a populações que ocorrem nos dois ecossistemas ao

longo da calha do principal rio da Bacia Amazônica, o Rio Solimões/Amazonas, em

regiões eqüidistantes geograficamente, afim de verificar se o padrão encontrado se

repetiria. Para tanto, foi utilizada a técnica baseada na análise de polimorfismo do rDNA,

que é o DNA que codifica os genes RNA ribossomais e a região não codificadora IGS

(Intergenic spacers) ou ITS (internal transcribed spacer). Atualmente o marcador rDNA

tem sido amplamente utilizado na identificação e diferenciação de espécies (Förster et al.,

2000; Rosa et al., 2003; Podoplelova & Ryzhakov, 2005). O rDNA possui uma região

codificadora para os genes rRNA 18S, 5.8S e 28S, e dois espaçadores internos (ITS 1 e

ITS 2) que separam essas regiões. As regiões rDNA 18S e 28S são muito conservadas e

podem ser utilizadas para diferenciação em nível de gênero e espécies (Rosa et al., 2003;

Jansen et al., 2006), enquanto que as regiões espaçadores de ITS acumulam mais

variabilidade e são utilizadas de forma eficiente na diferenciação de espécies ou entre

linhagens da mesma espécie por serem transcritos mas não codificadores (Andreasen et al.,

1999; Foster et al., 2000; Podoplelova & Ryzhakov, 2005). Esse trabalho objetivou

determinar as similaridades entre as populações de sucuúba que habitam as áreas de várzea

e de terra firme, ao longo da calha do rio Amazonas, por meio de análise de topologias das

árvores filogenéticas. Essas árvores foram construídas a partir de seqüências de

nucleotídeos da região de ITS das populações estudadas.


2.1. Áreas de coleta e obtenção do material vegetal para estudo

As coletas foram realizadas em populações de sucuúba que colonizam as áreas

localizadas ao longo da calha do rio Solimões, em ecossistemas de várzea e de terra firme

(Licença do IBAMA nº 02005.000906/04-34) dos municípios de Benjamin Constant

(4°38’ S, 70°0,3’ W), Tefé (3º35’ S, 64º71’ W) e Manaus (3º10’ S, 60º02’ W), no

Amazonas (Fig. 1).

Manaus Tefé

Benjamin Constant

Fonte: Embrapa/2000

Figura 1. Mapa do Estado do Amazonas, com a identificação das regiões dos municípios de Benjamin Constant, Tefé e Manaus, localizados as margens do Rio Solimões.

Em cada uma das três regiões (Benjamin Constant, Tefé e Manaus) foram realizadas

coletas em dois ambientes (ecossistema de várzea e de terra firme), sendo duas populações

por ambiente, totalizando 12 sítios de coleta. Em Benjamin Constant (parte da região

denominada Alto Solimões), as coletas ocorreram nas populações de sucuúba nas margens

do Rio Javari (afluente do Rio Solimões) e em áreas de terra firme adjacentes à sede do

município. Em Tefé (Médio Solimões) as coletas foram nas várzeas da Reserva de

Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, e em terra firme da Reserva de Desenvolvimento

Sustentável Amanã; e em Manaus, nas várzeas próximas a Ilha de Marchantaria (Baixo

71

Solimões), situada às margens do Rio Solimões, e nas florestas de terra firme ao longo da

AM 010, que liga Manaus ao Município de Itacoatiara, AM.

Inicialmente, dez indivíduos foram marcados de forma aleatória, na várzea e na terra

firme, e serviram de matrizes para a coleta de material vegetal utilizado nas análises

moleculares. Esses indivíduos estavam distribuídos em duas populações diferentes em cada

ambiente (Tab. 1), a fim de evitar a coleta em progênies de um mesmo parental. O material

vegetal constou de folhas e amostras de tecido vascular (câmbio). As folhas, depois de

coletadas, foram secadas em estufa de campo a 40 ºC e transportadas em exsicatas, para o

laboratório do INPA em Manaus. Enquanto que as amostras de câmbio foram obtidas com

auxílio de um coletor, medindo 1 cm de raio (Fig. 2 A/B), e o armazenamento foi feito em

sílica gel, cerca de 10g por grama de tecido fresco.

BA

Figura 2. A) Coleta de material vegetal das plantas de sucuúba, para uso nas análises moleculares. B) a seta indica a região do câmbio (camada esbranquiçada, mais superficial) retirada e armazenada em sílica gel. I = raio de 1cm.

A partir do INPA as amostras foram transportadas para o Laboratório de

Melhoramento de Plantas do Centro de Energia Nuclear na Agricultura – CENA da

Universidade de São Paulo, em Piracicaba, São Paulo, para a realização das análises

moleculares.

A identificação das amostras (Tab. 1) foi feita com base na combinação entre o

ambiente de origem da planta: várzea (VZ) ou terra firme (TF); área geográfica: Benjamin

Constant (BC), Tefé (TF) e Manaus (MN); e seqüência da amostra (população 1 ou 2).

72

73

Tabela 1. Identificação das amostras de sucuúba coletadas de populações que colonizam áreas ao longo da Bacia Amazônica.

Ambiente Município População Identificação

Terra firme (TF) Benjamin Constant (BC) 1 e 2 TFBC1 e TFBC2

Várzea (VZ) Benjamin Constant (BC) 1 e 2 VZBC1 e VZBC2

Terra firme (TF) Tefé (TF) 1 e 2 TFTF1 e TFTF2

Várzea (VZ) Tefé (TF) 1 e 2 VZTF1 e VZTF2

Terra firme (TF) Manaus (MN) 1 e 2 TFMN1 e TFMN2

Várzea (VZ) Manaus (MN) 1 e 2 VZMN1 e VZMN2

2.2. Análises moleculares

Inicialmente foram realizadas diversas tentativas de adequação do método de extração

do DNA genômico, descrito abaixo, a partir de amostras da folha de sucuúba. No entanto,

a presença de grande quantidade de compostos fenólicos impossibilitou sua análise.

Apenas da extração utilizando o tecido do câmbio foi possível obter um DNA de boa

qualidade para uso neste estudo.

2.2.1. Extração de DNA genômico total

Para extração do DNA foi utilizado como base o protocolo de CTAB (brometo de

hexadeciltetrametilamônio), modificado por Doyle & Doyle (l990). Amostras de 50 mg de

material vegetal (câmbio) foram maceradas em nitrogênio líquido e a extração foi realizada

em tampão 2% CTAB, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA

(ethilenodiamonotetraacetato) pH 8,0, 1% PVP (polivinilpirrolidona) MW 10,000. Foi

incorporado a uma alíquota do tampão 5% β-mercaptoethanol, a fim de evitar a oxidação.

Para ajudar na remoção dos compostos fenólicos foi adicionado fenol:clorofórmio:álcool

isoamíl (25:24:1). O DNA foi ressuspendido em tampão TE (Tris-HCl pH 8,0, Na2 EDTA

pH 8.0) contendo ribonuclease [RNAse] (10 µg.ml-l). A qualidade do DNA foi analisada

em gel eletroforese 1% agarose TAE (Tris, Acetato, EDTA), corado com Sybr green,

visualizado sob luz ultravioleta no transiluminador. A quantificação foi realizada por meio

de fluorômetro. Para o uso nas análises moleculares, as amostras foram diluídas na

concentração de 1ng/μL e estocadas a - 20 °C.

74

2.2.2. Amplificação via reação da polimerase em cadeia (PCR)

O DNA genômico foi usado na amplificação de região de ITS (Internal

Transcribed Spacer) por reação da polimerase em cadeia (PCR), com primers universais

de ITS1-18S (5’ CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG 3’) e ITS4 (5’ TCC TCC GCT TAT

TGA TAT GC 3’), que amplifica ITS1 + 5.8S + ITS2 e possui um tamanho aproximado de

700 pb (pares de base) (White et al., 1990). Cada 25 μL da reação de amplificação

continha 5 ng de DNA genômico, tampão da enzima (50 mM KCl; 0,1% Triton X-100; 10

mM Tris-HCl pH 8.0), 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (de cada um dATP, dGTP, dCTP, e

TTP), 0,2 μm de cada primer ITS1 e ITS4, 1 unidade de Taq polymerase (Invitrogen). Para

a amplificação foi usado um programa de termociclador de 3 min a 94 oC (1x para

desnaturar); 30 s a 94 oC; 60 s a 58 oC, adicionando 60 s a 72 oC por ciclo, para extensão,

de um total de 35 ciclos, e uma extensão final de 7 min 72 oC. Uma alíquota do produto da

amplificação foi separada para visualização em gel 1% agarose, corado com Sybr green,

usando λ HindIII como marcador, o restante foi mantido a – 20 oC para posterior clonagem

dos fragmentos.

2.2.3. Clonagem e seqüenciamento das regiões de ITS

Ligação: inicialmente, foi feita a ligação do fragmento (produto da amplificação por PCR

das regiões de ITS) ao vetor pGEM-T Easy (Promega), por adição do tampão e da enzima

T4 DNA ligase (Invitrogen). A reação de ligação foi incubada por toda a noite a 4oC. Após

esse período, a reação de ligação foi usada para transformação de células de bactérias.

Transformação de bactérias e clonagem dos fragmentos: células competentes de

Escherichia coli DH10B (Invitrogen), previamente preparadas, foram transformadas por

eletroporação. A reação de eletroporação (40 μL de células de DH10B, 1 μL de reação de

ligação) foi colocada em cubeta 0.1 cm e em seguida, submetida a um pulso elétrico. Após

o tratamento, as células foram colocadas em meio SOC (Sambrook & Russell, 2001) por

uma hora a 37 oC. Destas, 100 μL da cultura foi plaqueada em meio LB sólido (bacto

triptona, extrato de levedura, NaCl) contendo 100 mg/mL de Ampicilina, solução de IPTG

(Isopropiltio-β-D-galactosídeo) 100 mM e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-

galactosidase). As placas foram incubadas, invertidas, por toda a noite a 37oC. A

identificação das colônias contendo os plasmídeos recombinantes foi realizada por

“screening” azul/branco. A coloração branca das colônias indicava que as bactérias

continham o inserto clonado. A cultura de bactérias transformadas foi feita inoculando as

75

colônias brancas em 5 mL de meio LB líquido com 100 mg/mL de Ampicilina e incubada

por toda a noite a 37 oC, sob agitação.

Purificação e quantificação: para o isolamento e a purificação de DNA de plasmídeos das

células transformadas, foi utilizado como base o método de lise alcalina, proposto

originalmente por Birnboim & Doly (1979). O DNA foi isolado de 3 mL da cultura de

bactérias, utilizando o procedimento de mini-preparação de DNA de plasmídeos usando

lise alcalina e ressuspendido em 50 μL de TE, contendo 50 μg/mL de RNAse. A presença

do inserto clonado, antes do seqüenciamento, foi verificada por meio de PCR usando os

primes universais T7 e SP6 (Invitrogen). O produto da amplificação foi observado em gel

1% agarose e quantificado por comparação usando padrão Lambda HindIII. Os produtos

purificados e quantificados foram seqüenciados em um analisador automático de DNA 377

ABI (Applied Biosystems).

2.2.4. Análise das seqüências

Após o seqüenciamento, foi feita análise do cromatogramas nos programas Phred-

Phrap-Crossmatch-Consed (Ewing & Green, 1998; Ewing et al., 1998) e as seqüências

resultantes foram submetidas à busca por similaridade entre aquelas disponíveis na base de

dados do GenBank <http://www.ncbi.nih.gov>, usando BLASTn (Altschul et al., 1997).

As seqüências foram traduzidas conceitualmente nos aminoácidos usando EXPASY

Translate tool <http://www.expasy.ch/tools/dna.html>. A identificação da substituição do

aminoácido funcional foi conduzido usando PSI-BLAST (Altschul et al., 1997). As

seqüências do nucleotídeo foram alinhadas usando ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997) e

visualizadas. As análises de Parcimônia das seqüências de nucleotídeos e dos aminoácidos

foram conduzidas usando o software PAUP 4.0b10 (Swofford, 1998).

3. RESULTADOS

3.1. Eletroforese e seqüenciamento das regiões de ITS

A primeira análise constou de apenas uma das duas populações amostradas em cada

ambiente, várzea e terra firme, nas três regiões de coleta, num total de seis populações. Os

produtos purificados e quantificados foram visualizados em gel de eletroforese 1% agarose

(Fig. 3), que mostrou as bandas com valores aproximados de 700 pb. Entretanto, foi

detectada, visualmente, diferença entre os produtos amplificados da região de ITS nas

populações analisadas.

http://www.ncbi.nih.gov/

http://www.expasy.ch/tools/dna.html

MM 1 2 3 4 5 6

≅ 700pb

Figura 3. Gel de eletroforese 1% agarose. As bandas visualizadas são: 1 = TFBC1; 2 = VZBC1; 3 = TFTF1; 4 = VZTF1; 5 = TFMN1 e 6 = VZMN1. MM = marcador molecular - foi usado λ-HindIII.

Após a análise dos resultados preliminares, um novo PCR foi realizado com

indivíduos diferentes para obter a confirmação da tendência. Esse material foi purificado,

quantificado e reunido ao anterior para ser seqüenciado. Os dados das seqüências obtidas

encontram-se no Anexo 1.

As regiões de ITS foram analisadas nessas seqüências com o objetivo de verificar

de forma clara, a existência ou não de uma diferenciação entre as populações de sucuúba

que habitam os ecossistemas de várzea ou de terra firme na Amazônia. Ao utilizar os

primers ITS-18S e o ITS4 obteve-se o fragmento das regiões englobando ITS1+5.8S+IT2

(Fig. 4) de todas as populações amostradas.

ITS-18S

76

Figura 4. Esquema da região de ITS (ITS1 e ITS2) do gene de ribossomo (rDNA). Os genes são representados pelos retângulos, com os espaços intergênicos entre eles. A seta indica a direção dos primers utilizados para amplificação da região intergênica.

Os fragmentos amplificados variaram de 592 a 754 pb (Tab. 2). A confirmação da

identidade das seqüências de nucleotídeos dos fragmentos clonados foi feita por meio da

comparação com seqüências de ITS1-18S e ITS2 do rDNA de outras espécies, inclusive de

indivíduos da família Apocynaceae, disponíveis no GenBank (Anexo 2).

18S 28S 5.8S ITS 1 ITS 2

ITS-4

77

Tabela 2. Tamanho dos fragmentos amplificados via PCR utilizando os primers ITS-18S e ITS-4, nas populações de terra firme (TF) e várzea (VZ) das três regiões geográficas (municípios de Benjamin Constant, Tefé e Manaus).

Localização População Tamanho do fragmento

(em pb)

TF – Benjamin Constant 1

2

690

691

VZ – Benjamin Constant 1

2

692

690

TF – Tefé 1

2

690

692

VZ – Tefé 1

2

592

597

TF – Manaus 1

2

754

754

VZ – Manaus 1

2

677

687

3.2. Análise de similaridade entre as seqüências

A análise filogenética usando PAUP (Anexo 3) gerou, através do método do

agrupamento do vizinho mais próximo “Neighbor-joining” (Saitou & Nei, 1987), uma

árvore filogenética entre as 12 seqüências (Fig. 5). A árvore consensual resultante dessa

análise teve o suporte de seus clados avaliados por bootstrap (Felsenstein, 1995) e foi

visualizada no programa Treeview (Page, 1996). A árvore consenso foi gerada no

programa MEGA (Kumar et al., 2004). O método de bootstrap faz uma reamostragem

aleatória dos caracteres, repetindo-a “n” vezes, e computa a freqüência em que os nós

aparecem nos resultados combinados. Para este estudo foram feitas 1000 repetições.

A análise da topologia da árvore (Fig. 5) mostra que existe diferença detectada em

nível genético entre as populações de sucuúba que habitam os ambientes de terra firme e

de várzea, em todas as regiões de coleta. Essa diferença varia com a área geográfica, sendo

menor nos extremos da bacia (região de Benjamin Constant).

Ao analisar a Fig. 5 e a Tabela 2, verifica-se que apesar de algumas das populações

que habitam a terra firme ou aquelas da várzea, diferirem entre si no tamanho da seqüência

de nucleotídeos, essa diferença não é suficiente para separá-las, uma vez que os ramos

agrupam consistentemente com indivíduos da mesma população (bootstrap 100%).

As populações da terra firme de Manaus (TFMN1, TFMN2), várzea de Manaus

(VZMN1, VZMN2) e várzea de Tefé (VZTF1, VZTF2) foram as que apresentaram valores

mais elevados de bootstrap (100%), quando a análise considerou cada região amostrada.

Figura 5. Árvore filogenética mostrando a relação entre as populações de sucuúba da terra firme e da várzea, nas três regiões geográficas amostradas: Benjamin Constant (VZBC e TFBC); Tefé (VZTF e TFTF) e Manaus (VZMN e TFMN). Os números nas ramificações representam o percentual de 1000 bootstrap.

As populações de sucuúba de Benjamin Constant das áreas de terra firme (TFBC1,

TFBC2), áreas de várzea (VZBC1, VZBC2) e as populações de terra firme de Tefé

(TFTF1, TFTF2), tiveram seus valores de bootstrap variando em 60, 72 e 77%,

respectivamente, quando da análise por região. Entretanto, essas seis populações

agruparam fortemente (bootstrap de 100%), em relação às demais (várzea de Tefé, terra

firme e várzea de Manaus). Populações da várzea de Benjamin Constant (VZBC1,

VZBC2) foram as únicas que apresentaram os ramos em nós diferentes, entretanto essas

populações agruparam robustamente na análise da árvore consenso (Fig. 6).

78

TFBC

1TFBC2

VZBC2 TFTF

1

TFTF2

VZBC1

VZTF1

VZTF2

TFMN1TFM

N2

VZMN

1

VZMN2

0.1 Figura 6. Fenograma resultante do alinhamento das seqüências de ITS1-58.S – ITS2 rDNA das populações de sucuúba, ao longo da calha do rio Solimões.

A árvore consenso mostrou claramente a separação de três ramos (Fig. 6), com as

populações da várzea e terra firme de Benjamin Constant agrupadas com a terra firme de

Tefé. Estas, no entanto, separaram-se da várzea de Tefé, que ficou isolada, separada

também da várzea e da terra firme de Manaus, que por sua vez formaram um grupo distinto

das demais.

4. DISCUSSÃO

Os valores altos de bootstrap deixam evidente a diferença entre as populações de H.

sucuuba da terra firme e da várzea nas três regiões geográficas amostradas (Benjamin

Constant, Tefé e Manaus), uma vez que em nenhuma das subamostragens realizadas essas

populações apresentaram forte relação umas com as outras. Esses resultados, inicialmente,

parecem corroborar o que foi proposto por Ferreira (2002), que nas áreas de várzea da

Amazônia Central, as características ambientais extremas de inundação e/ou as grandes

dimensões dos rios podem induzir a especiação em árvores.

Estudos germinativos e fisiológicos realizados previamente com H. sucuuba

(Ferreira & Piedade, 2003; Ferreira et al., 2005), que utilizaram sementes de populações

naturais da várzea e da terra firme de áreas adjacentes a Manaus, mostraram respostas

distintas ao alagamento para as duas populações. Ao acompanhar o ciclo de vida da

79

80

espécie, desde a germinação até o estabelecimento das plântulas (Ferreira, 2002), foi

observado que, quando submetidas experimentalmente a um período prolongado de 120

dias de submersão total as plântulas da terra firme não sobreviveram, ao contrário daquelas

da várzea que apresentaram a taxa de sobrevivência elevada (70%). Naquele estudo, as

respostas quanto às taxas de germinação e alterações do metabolismo anaeróbico

mostraram relações com os ambientes de origem das sementes. Da mesma forma, no

presente estudo, verifica-se que na região de Manaus a seqüência do gene ITS1-58.S –

ITS2 rDNA da população de terra firme possui cerca de 70 pb a mais que as de várzea, e

que estas estão fortemente separadas (bootstrap de 100%). Essa tendência foi observada

entre os dois ecossistemas, nas três áreas, ao longo da bacia, o que reforça a idéia de que o

rio pode atuar como barreira reprodutiva, que leva à divergência das populações entre os

ambientes.

Por outro lado, a análise consenso separou as populações em três agrupamentos

diferentes, seguindo um padrão peculiar. As populações de terra firme e várzea de

Benjamin Constant terem, conjuntamente, se agrupado com a população da terra firme de

Tefé, mostra a existência de uma maior similaridade entre elas, indicando uma maior

diversidade nessa região, possivelmente resultante de um maior fluxo gênico entre essas

populações, decorrente da menor distância entre as margens do rio e, conseqüentemente,

maior contigüidade dos ambientes. Estes resultados são compatíveis com os estudos de

Campbell et al. (1986) e Wittmann et al. (2006) que mostram que na Amazônia os

extremos da bacia, especialmente nas proximidades dos Andes, são mais diversos e a

similaridade entre a flora dos dois sistemas é de aproximadamente 45%.

As mais robustas teorias sobre a evolução da flora amazônica na análise de Haffer

& Prance (2002) suportam que, tanto no Pleistoceno quanto em períodos geológicos

anteriores a ele, mudanças em larga escala na vegetação da Amazônia ocorreram devido a

mudanças climáticas (precipitação, temperatura, gás carbônico) como também de variações

no nível do mar e rios, levando à expansão de vegetações florestais e não-florestais

adaptadas à seca. Sob tais circunstâncias, as vegetações típicas de florestas úmidas ficaram

restritas a áreas com precipitação mais elevada ou maior disponibilidade de água, nos

períodos mais secos, ou maiores elevações, nos períodos inundados, os refúgios (Prance,

1985). Essas ilhas de vegetação florestal foram intercaladas por vários tipos de florestas

secas e outros tipos intermediários de vegetações que atuaram como barreiras. Nas ilhas

vegetadas, processos de extinção e especiação foram intensos.

A análise dos resultados da árvore consenso à luz dessas teorias sobre a evolução

geológica e da vegetação da Amazônia, inclusive suas várzeas, parece suportar a idéia de

que, após o último evento de recolonização da região a partir dos refúgios (Figura 7),

espécies como H. sucuuba se estabeleceram nas áreas alagáveis a partir das áreas de terra

firme adjacentes.

Essa suposição torna-se mais plausível quando são comparadas as análises da

região de Benjamin Constant e de Manaus, uma vez que estas correspondem a áreas

refúgios distintos (Figura 7). Os resultados mostram que em cada uma dessas regiões a

relação entre as populações de terra firme e de várzea foi consistente (bootstrap de 100%).

Contudo, não se verificou qualquer relação entre as duas áreas geográficas. Uma vez que

não há relação entre as populações de Benjamin Constant e Manaus, pode-se sugerir que a

colonização em cada uma dessas localidades nas áreas alagáveis é mais dependente da

terra firme próxima.

Figura 7. Sobreposição de padrões de endemismo em plantas, borboletas e pássaros do Neotrópico, identificadas como “refúgios” [Retirado de Haffer & Prance (2002)].

Por outro lado, os resultados deste estudo diferem do que recentemente tem sido

encontrado para animais (Farias et al., 2004; Cantanhede et al., 2005) onde se observa um

contínuo de similaridade entre os organismos da várzea ao longo da bacia do Solimões.

Isto certamente reflete os processos diferenciados de colonização entre animais e plantas,

provavelmente devido à motilidade dos primeiros vesus o caráter séssil dos últimos.

Contudo, dado que o fluxo gênico entre as plantas depende grandemente de sua biologia e

dos sistemas reprodutivos, que envolvem polinizadores e dispersores de sementes e seus

81

82

movimentos e eficiência, um estudo detalhado considerando esses aspectos para H.

sucuuba é fundamental.

Confirmando essa necessidade, observou-se que na região de Tefé as populações da

várzea encontram-se isoladas das de terra firme e demais populações estudadas (Manaus e

Benjamin Constant). Se aplicarmos o conceito postulado acima de que as populações da

várzea derivaram daquelas das terras firmes adjacentes, esperar-se-ia que na análise

consenso essa população agrupasse de forma mais consistente com a terra firme de Tefé ou

que ambas se mantivessem próximas a Benjamin Constant, o que não ocorreu. Isto pode

indicar que essas populações evoluíram de forma independente, a partir de alguma área de

refúgio mais ao norte da bacia (Prance, 1985). Contudo, isso pode apenas estar refletindo o

fato de que as populações de terra firme que colonizaram as várzeas dessa região provêm

de sítios que não foram amostrados, merecedores de novas coletas e análises posteriores a

fim de entender a história filogenética das populações de H. sucuuba nesses ambientes.

5. CONCLUSÃO

Populações de H. sucuuba que habitam as áreas de várzea são diferentes em sua

constituição genética das populações dessa espécie que habitam a terra firme. Entretanto,

as diferenças encontradas para as espécies mostram padrões complexos, onde somente a

barreira do rio e o pulso de inundação, como também a colonização da várzea a partir das

populações das terras firmes adjacentes, não conseguem explicar a complexidade genética

evidenciada para a espécie no presente trabalho. Estudos dos sistemas reprodutivos e

coletas adicionais são necessários para corroborar as tendências e cenários discutidos.


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85

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Plantas ocorrendo em ambientes sujeitos a inundações periódicas anuais são

reconhecidamente detentoras de adaptações para sobreviver períodos de redução extrema

ou mesmo ausência de oxigênio, em todas as fases de seu ciclo de vida. Assim, seria de se

esperar que espécies que colonizam os ambientes não inundados da terra firme não

ocorressem nos ambientes inundados, por esses exigirem das plantas tais tipos de

adaptação. Entretanto, algumas espécies ocorrem naturalmente tanto nas terras firmes,

quanto nas várzeas, ao longo de toda a bacia do rio Solimões/Amazonas.

O fato de haver espécies que colonizam áreas sob uma grande escala de condições

ambientais, especialmente aquelas consideradas extremas à sobrevivência de uma planta,

desperta a atenção e a curiosidade para tentarmos entender quais são e como a planta

utiliza os mecanismos adaptativos de forma a garantir o sucesso de sua colonização nos

diversos ecossistemas. Esses foram os motivos que levaram à elaboração desse estudo,

cujos objetivos derivam dos questionamentos levantados durante a elaboração da

dissertação de mestrado da autora (Ferreira, 2002).

A escolha da espécie ocorreu após um trabalho de revisão de literatura, que utilizou

listas de espécies em inventários realizados nas áreas de várzea e terra firme da Amazônia

e em coleções de herbário, de forma a identificar plantas que ocorriam nos dois

ecossistemas. Himatanthus sucuuba foi eleita por ser encontrada em áreas não perturbadas

e, portanto, estar colonizando naturalmente os sítios de coleta na várzea e na terra firme

nas proximidades de Manaus. Os primeiros estudos (Ferreira, 2002), analisaram a

germinação em diferentes substratos e o crescimento de plântulas em situações que

simularam as condições de campo (solo alagado e não-alagado). Os resultados revelaram

estratégias distintas de tolerância às condições ambientais existentes para cada população

(Fig. 1), relacionadas, em grande parte, ao ambiente de ocorrência natural das populações

analisadas. As plântulas da população da terra firme não sobreviveram ao prolongado

período de alagamento, ao contrário daquelas da população da várzea.

No presente trabalho, buscou-se novas evidências baseadas em caracteres

morfológicos, biométricos, anatômicos e metabólicos, para corroborar, ou não, as

tendências e diferenças anteriormente evidenciadas, visando responder a seguinte questão:

- Quais os mecanismos exibidos pelas populações da várzea que propiciam a sobrevivência

de suas plântulas por longos períodos (superiores a 5 meses) sob uma coluna de água

86

elevada (até 8 metros) em condições de total ausência de luz, de forma a garantir a

perenização da espécie nesse ecossistema?

As respostas para esta questão começam a se configurar já no capítulo II deste

trabalho. As plântulas apresentam estratégias adaptativas distintas para sobreviver aos

diferentes níveis de alagamento ao qual são expostas. Alterações em sua morfoanatomia,

como a manutenção das folhas com redução da área foliar, formação de raízes adventícias,

lenticelas e aerênquima nas raízes, são verificadas quando o alagamento acontece apenas

nas raízes e parte inferior do caule. Porém, quando ocorre a submersão total da plântula,

verifica-se a abscisão das folhas, paralisação do crescimento e formação de aerênquima nas

raízes, sem qualquer outra alteração morfológica aparente.

Nos tratamentos controles e de submersão parcial, as plântulas das populações de

várzea apresentam crescimento rápido, com valores significativamente maiores do que os

exibidos pelas plântulas das populações de terra firme, confirmando os resultados já

obtidos no trabalho de Ferreira (2002). Entretanto, naquele experimento, os solos utilizados

para a produção das plântulas foram obtidos nas áreas de coleta de cada população (várzea

ou terra firme) e estes poderiam ter influência no crescimento em altura das diferentes

populações, enquanto que nesse trabalho ambas populações foram plantadas num único

tipo de solo, o de várzea, reconhecido como o mais rico em nutrientes. Contudo, os

resultados obtidos no presente estudo vêm mostrar que o crescimento da plântula não está

relacionado com o tipo de solo, mas às condições hídricas do ambiente, que levam à

depleção do oxigênio.

O capítulo III revelou que existe uma predisposição para que a planta cresça e se

estabeleça com maior rapidez no ambiente de várzea, verificado por meio dos tipos de

compostos armazenados como reservas nas sementes. As sementes da várzea apresentaram

uma quantidade maior de galactomanano no endosperma, um polissacarídeo de reserva de

parede celular que é degradado após a germinação da semente e cujos produtos da

degradação são utilizados pela plântula em crescimento.

A tolerância das plântulas à anoxia foi relacionada com a disponibilidade de

açúcares nos tecidos da raiz para uso no metabolismo anaeróbico. Os resultados mostraram

que, como padrão geral, as plântulas das populações de várzea foram as que exibiram os

maiores valores de concentração de açúcares solúveis, entre esses, a sacarose, que é o

açúcar que chega aos demais tecidos da planta, transportado como produto da fotossíntese

para ser prontamente utilizado ou armazenado. Nessas plântulas, concentrações elevadas

de sacarose foram encontradas nas raízes do tratamento controle, enquanto que

87

concentrações elevadas de glucose foram observadas nas raízes de plântulas alagadas. Uma

vez que a glucose é um dos açúcares utilizado como substrato para a via glicolítica, sua

maior concentração nas raízes das plântulas das populações da várzea pode estar indicando

a aceleração da glicólise devido à fermentação, o que explicaria os níveis elevados de

ADH nas raízes de H. sucuuba da várzea, medidos por Ferreira (2002).

O fluxograma a seguir (Fig. 1) destaca as principais características evidenciadas

para populações de H. sucuuba dos ecossistemas de várzea ou de terra firme, quando

submetidas experimentalmente a alterações nas condições hídricas similares àquelas

observadas naturalmente no ambiente de várzea.

↑ Germinação sob

alagamento*

Produz plântulas

sob alagamento *

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Figura 1. Fluxograma com as principais características demonstradas pelas populações de Himatanthus sucuuba, durante a fase de germinação e de estabelecimento de plântulas em ambientes de várzea e de terra firme. * dados complementares de Ferreira (2002).

Sementes

22% açúcares 74% galactomanano 93% galactomanano

Não produz plânt

b ala

ulas

so gamento↓ Germinação sob

alagamento * *

↑ Concentração de açúcares solúveis

nas raízes

Estabelecimento de plântulas

↓ Concentração de açúcares solúveis nas

raízes Crescimento lento > Biomassa em folhas e caule

Crescimento rápido > Biomassa em

caule e raiz

Submersão parcial:

Plântulas sob alagamento

Aerênquima lisígeno* Aerênquima

esquizógeno*

Lenticelas; Raízes adventícias;

↓ Área foliar

Morte das raízes

↑ Concentração de compostos para a manutenção da integridade da

membrana

Submersão total:

Paralisação do crescimento; Abscisão das folhas

↓ Atividade da ADH* ↑ Atividade da ADH*

Legenda:

Comum às duas populações

População da várzea ↓ Sobrevivência ↑ Sobrevivência População da terra firme

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A análise detalhada dos Capítulos II e III, em conjunto com o que foi verificado por

Ferreira (2002) para a espécie, conforme sintetizado no fluxograma apresentado na figura

1, leva à formulação das seguintes questões: Porque plântulas de H. sucuuba, estabelecidas

em regiões de terra firme na Amazônia Central, demonstram não possuir as mesmas

características adaptativas ao alagamento verificadas para populações da mesma espécie

encontradas na várzea? Poderia a pressão ambiental, devido, especialmente, ao pulso de

inundação ao qual essas populações são expostas periodicamente, desencadear um

processo de especiação induzindo a separação entre as populações que colonizam os

ambientes de várzea e populações da terra firme?

O Capítulo IV foi elaborado com o propósito de responder essa pergunta. Nesse

capítulo, por meio de análises das seqüências de nucleotídeos da região de ITS (Internal

Transcribed Spacer) do gene ribossomal (rDNA), objetivou-se determinar as similaridades

entre as populações de sucuúba que habitam as áreas de várzea e de terra firme, não apenas

das cercanias de Manaus, como também daquelas ao longo da calha do rio Amazonas.

A análise filogenética permitiu constatar a nítida separação (bootstrap 100%) entre

as populações de H. sucuuba que habitam várzea, daquelas que habitam a terra firme, nas

proximidades de Manaus, sendo que esse padrão se repetiu para as populações amostradas

ao longo do Rio Solimões, para os dois ambientes, nos municípios de Benjamim Constant

e Tefé, áreas geográficas eqüidistantes no Estado do Amazonas. Entretanto, as diferenças

filogenéticas encontradas entre as populações da espécie mostram padrões complexos,

onde somente a barreira do rio e o pulso de inundação, como também a colonização da

várzea a partir das populações das terras firmes adjacentes, não conseguem explicar a

complexidade genética evidenciada no presente trabalho. Estudos dos sistemas

reprodutivos e coletas adicionais são necessários para corroborar as tendências e cenários

discutidos.

Este trabalho vem mostrar que, embora possa existir uma grande similaridade entre

as espécies nos diferentes ecossistemas amazônicos, a elaboração de planos de manejo e de

recuperação de áreas degradadas bem sucedidos, deve levar em consideração não apenas a

lista de espécies encontradas no local, mas o ambiente de coleta das matrizes. Diante das

dimensões e magnitude da região Amazônica, é natural que esta ainda seja pouco

conhecida, especialmente no que diz respeito a trabalhos que analisam diferenças em

níveis específicos, como os verificados nos estudos de fisiologia e genética desenvolvidos

no corpo do presente estudo. Este problema de abordagem e integração pode estar

contribuindo para que, em muitos casos, a diversidade da região esteja sendo subestimada.

90

Nesse sentido, estudos ecofisiológicos associados a observações botânicas de fenologia,

biologia floral e análises genéticas, são indicados para a elaboração de projetos que visem

o conhecimento da diversidade, de forma a subsidiar políticas públicas sólidas para traçar

estratégias de manutenção dos recursos genéticos da vegetação da região.

LITERATURA CITADA


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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA … · conheci durante minha estada em Piracicaba e por quem aprendi a ter especial carinho. Ao Instituto de Botânica de São Paulo (IBt),