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Introdução:. Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis . 9 milhões de novos casos por ano. 1,8 milhões de mortes por ano. Introdução:. Por que a procura de antígenos novos são importantes? Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas. PPD. - PowerPoint PPT Presentation
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Introdução:
• Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis.
• 9 milhões de novos casos por ano.• 1,8 milhões de mortes por ano.
• Por que a procura de antígenos novos são importantes?
• Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas.
Introdução:
PPD
• O genoma do M. tuberculosis possui 16 regiões do genoma deletadas em outras Mycobactérias (utilizadas para BCG, por exemplo)
Introdução:
• Rv3874• Rv3875• Rv3619c
Introdução:
Proteína inteira• In vivo
O que se tinha?
Overlaping (peptídeos sintéticos)• In vitro (ativação de linfócitos T)
O que foi feito:
Clonagem:
Amplificação: PCR• DNA M. tuberculosis• Iniciadores• dNTPs• Enzima + Tampão
Purificação
Ligação
Ligação: vetor de clonagem univeral
Transformação: Choque térmico
• Eletroporação
• Genegun
• Vírus
Outras técnicas de transformação:
Seleção das culturas: Ampicilina
• Bioluminescência • Azul/branco
Outras técnicas de seleção:
Restrição enzimática: BamHI e Hind III
Ligação no vetor de expressão:
Inseriram a sequencia para cauda de histidina no pGEX
Vantagem: duplo sistema de purificação
• Transformação: Choque térmico
• Seleção das colônias
• SequenciamentoExpressão:
IPTG
Purificação:
• Resina, para retirar a GST +• Coluna de Ni, para retirar a cauda de Histidina
Purificação:
Western Blotting:Anticorpo: anti- GST
Anticorpo: anti- His
Imunização:
• Rv3874• Rv3875• Rv3619c
+
• Adjuvante de Freud• 2 apresentações com 2 semanas de
intervalo • Após 2 semanas retira-se o soro
Elisa:
Resposta Imune celular:
Linfócito B
Epítopos lineares:
Proteínas também geraram epítopos lineares, assim como os peptídeos, na imunização
ABCPred Predition server
• O vetor construído e a dupla purificação são eficientes
• As proteínas são imunogênicas nos coelhos
Conclusões:
Questionamento:
• Qual a vantagem da produção da proteína recombinante para a resposta imune em coelhos?