Introdução às Práticas Laboratoriais em Imunologia

Prof. Helio José Montassier

Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em imunologia:

•Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como hemácias (carneiro, galinha).

•Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina, gamaglobulina) e polissacarídeos.

Tipos de diluentes:-

•Solução Salina (NaCl 0,15 M)

•PBS ou Tampão Fosfato com Salina (NaCl a 0,15M e Fosfatos Ácido e Básico de Sódio a 0,04 M)

Sangue colhido

c/ anticoagulante

e s/ centrifugar

Sangue colhido

c/ anticoagulante

e centrifugado p/

separar a fração

líquida do

sobrenadante

Sangue colhido

s/ anticoagulante

e depois de

coagulado é

centrifugado

Esquema de Componentes Ppais. e Ativação da Via de

Coagulação do Sangue

•PLASMA é o sobrenadante obtido após a centrifugação do sangue total, colhido em tubo

com anticoagulante.

•Os anticoagulantes mais utilizados no laboratório clínico são : heparina, EDTA e Citrato

de sódio.

•A heparina previne a coagulação pois liga-se à trombina, já o EDTA e o Citrato ligam-se

ao Ca²+ e Mg²+ , cuja interferência se dá nas enzimas cálcio e magnésio-dependentes

envolvidas na cascata de coagulação.

•O citrato é utilizado em coletas de sangue para transfusão.

•SORO é o sobrenadante obtido após coleta de sangue total e deixado para coagulação

espontânea (que leva de 30 a 45 minutos) . Durante o processo de coagulação , o

fibrinogênio é convertido em fibrina, é a clivagem proteolítica da trombina, e a sua maior

diferença entre plasma e soro é a ausência de fibrinogênio no soro.

SOROLOGIA

Imunologia e Sorologia:-

Imunologia é o ramo da biologia que estuda o sistema imune.

• Funcionamento do sistema imune de um indivíduo (vertebrado) no

estado sadio ou não.

• Características físicas, químicas e fisiológicas dos

componentes do sistema imune.

SOROLOGIA

Doenças diagnosticadas por técnicas imunológicos a

partir do soro (+ frequente), do plasma (- frequente) ou do

sangue total (- frequente):-

•Doenças Infecciosas

•Doenças autoimunes

•Reações de Hipersensibilidade (Alergias)

•Seleção de doadores de sangue (Imuno-hematologia)

•Seleção de doadores de órgãos ou tecidos para transplantes

SOROLOGIA

Exames e técnicas laboratoriais para a detecção de anticorpos

(+frequente) ou de antígenos (-frequente).

• ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) – cinomose, peste

suína clássica, toxoplasmose, etc.

•Reação de Imunofluorescência (RIF) – leishmaniose, toxoplasmose,

leptospirose, etc.

•Látex – Aglutinação – Detecção de Fator Reumatóide, Proteína C

Reativa, rotavirus, coronavirus, etc.

•Rádio-Imuno-Ensaio – Dosagem de hormônios.

Técnica de Diluições Seriadas

Importância – permitir a determinação das quantidades relativas

de anticorpos em testes sorológicos

Técnica de diluições seriadas:-Séries com razão constante e diluições sucessivas. -Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade adequada de diluente.

Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2:-

1) Distribuir numa série de tubos com 1 ml de diluente.

2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material.

3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2.

4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3.

5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.

Ao final as diluições obtidas serão: 1:2; 1:4; 1:8; 1:l6; 1:32; 1:64

Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a 10:-

1) Distribuir 0,9ml de diluente numa série de tubos.

2) Ao tubo 1 adicionar 0,1 ml do material não diluído.

3) Transferir 0,1 ml do tubo 1 para o tubo 2.

4) Transferir 0,1 ml do tubo 2 para o tubo 3.

5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.

As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000.

Problemas: -

1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800?

2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3 a 10-8?

Perguntas:-

1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica de hemácias a

5%, sem fazer a aferição por espectrofotometria?

2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%,

num volume final de 5ml?

3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a obtenção

de soros:

a) Precipitantes b) Aglutinantes

4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas?

5. O que são:

a) Solução anti-coagulante de Alsever

b) Solução salina d) Soro

c) Plasma e) Solução salina tamponada