Investigação da Atividade Biológica de Foeniculum vulgare ... · CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Investigação da Atividade Biológica de Foeniculum vulgare Mill (Umbelliferae/Apiaceae)

como Alternativa Terapêutica

ROSILMA DE OLIVEIRA ARAUJO

RECIFE-PE 2010

ROSILMA DE OLIVEIRA ARAUJO

Investigação da Atividade Biológica de Foeniculum vulgare Mill (Umbelliferae/Apiaceae) como Alternativa Terapêutica

RECIFE-PE Fevereiro, 2010

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração: Obtenção e Avaliação de Produtos Naturais e Bioativos Orientadora: Profa Dra Ivone Antônia de Souza Co-Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani

Araujo, Rosilma de Oliveira

Investigação da atividade biológica de Foeniculum vulgare Mill (Umbelliferae/Apiaceae) como alternativa terapêutica / Rosilma de Oliveira Araujo. – Recife: O Autor, 2010.

97 folhas: il., tab., fig., gráf.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.

Inclui bibliografia.

1. Farmacologia. 2. Foeniculum vulgare Mill – Toxidade aguda. 3. Atividade analgésica. 4. Atividade antimicrobiana. I. Título.

615.322 CDU (2.ed.) UFPE

615.1

CDD (22.ed.) CCS2010-022

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS MESTRADO EM OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DE PRODUTOS

NATURAIS E BIOATIVOS

AMARO HENRIQUE PESSOA LINS REITOR

GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA VICE-REITOR

ANÍSIO BRASILEIRO DE FREITAS DOURADO PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

JOSÉ THADEU PINHEIRO DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

MÁRCIO ANTÔNIO DE A. COELHO GUEIROS VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DALCI JOSÉ BRONDANI CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS

PEDRO JOSÉ ROLIM NETO COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

BEATE SAEGESSER SANTOS VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

“A beleza e a vitalidade são presentes da natureza para aqueles que vivem segundo suas leis”.

(Leonardo da Vinci)

Aos meus pais e meu noivo que estiveram ao meu lado me dando forças para superar meus limites e vencer mais esta etapa de minha vida.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por sempre iluminar meus caminhos e minha mente, pelo infinito amor e sua eterna bondade.

Aos meus irmãos, Rosângela de Oliveira Araújo Siqueira, Ramilton de Oliveira Araujo e Roseane de Oliveira Araujo, pela eterna ajuda e orientação. Aos meus pais, minha maior riqueza, pelo verdadeiro amor, carinho, dedicação e por lutarem sempre por mim. Ao meu Amor, Endrigo Alves dos Santos, pela dedicação, compreensão e imensa paciência durante o período acadêmico de minha vida. À minha orientadora Profa. Ivone pela oportunidade no desenvolvimento deste trabalho que foi valioso no meu aprendizado; mas também pela sua amizade, compreensão, atenção e dedicação. Ao Prof. Dalci, agradeço pela oportunidade de crescimento profissional e por sua imensa paciência em ensinar-me seus tão valiosos conhecimentos. À minha adorada Profa Kêsia pelos ensinamentos, pelos conselhos, pela amizade e por compartilhar sua experiência de vida, mas por principalmente me ensinar a ser uma verdadeira professora e uma pessoa melhor. Espero continuar preparando as aulas de Exames.

Ao Prof. Haroudo pela sua inestimável colaboração e pelos momentos de descontração, mas principalmente por sua visão aguçada em descobrir novas substâncias.

As minhas amigas do Curso de mestrado, Liliane, Aracelly, Leila, Elda e Aline pelos momentos compartilhados e conhecimentos mutuamente trocados. Espero que nossas amizades permaneçam eternas.

Aos meus eternos colaboradores e mestres Aldo e Elis pela ajuda e incentivo trocados durante todo o período de realização do trabalho. E aos demais colegas do biotério: Isla, Felipe, Renata, Guilherme e Grace pela assistência técnica imprescindível.

Aos meus amigos, Julia e Joselito, pelas palavras de incentivo e pelas desculpas dadas aos momentos de minha ausência. À minha amiga Evelyne, que compartilhou comigo trabalhos e anseios de perspectivas profissionais melhores. Obrigada por sua amizade constante.

À Profa. Norma Gusmão pela incessante troca de conhecimento e amizade.

E a todos que contribuíram para a realização do presente trabalho e que não foram citados, peço que recebam o meu eterno reconhecimento e apreço.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE GRAFICOS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO 09 2.REVISÃO DA LITERATURA 14 2.1 Estudos sobre Foeniculum vulgare Mill. 142.1.1 Botânico 142.1.2 Fitoquímico 162.1.3 Farmacológico 192.1.4 Toxicológico 202.1.4.1 Toxicidade Aguda 212.5 Multiressistência Bacteriana 22 3. OBJETIVOS 25 253.1 Geral 253.2 Específicos 4. ARTIGO I- TOXICOLOGICAL STUDY OF SEEDS OF Foeniculum vulgare MILL. 26

ABSTRACT 27RESUMO 271. Introduction 282. Materials and Methods 302.1 Plant Material 302.2 Animals 302.3 Experimental Protocols 312.4 Statistical Analysis 323. Results 324. Discussion 335. Conclusion 35Acknowledgements 35References 35

5. ARTIGO II- ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Foeniculum vulgare (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE) 40

RESUMO 41ABSTRACT 411. Introdução 422. Materiais e Métodos 432.1 Material Botânico 432.2 Preparação dos Extratos 442.3 Avaliação da Atividade Antimicrobiana 443. Resultados e Discussão 464. Conclusão 51Referêrencias Bibliográficas 52 6. ARTIGO III- AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Foeniculum vulgare (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE) FRENTE A ISOLADOS CLÍNICOS

55

RESUMO 56ABSTRACT 561. Introdução 572. Materiais e Métodos 592.1 Material Botânico 592.2 Preparação do Extrato 592.3 Avaliação da Atividade Antimicrobiana 603. Resultados e Discussão 614. Conclusão 66Referêrencias Bibliográficas 66 7. ARTIGO IV- PERFIL FITOQUÍMICO E ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE ANALGÉSICA DO EXTRATO BRUTO DAS SEMENTES DE Foeniculum vulgare Mill (UMBELLIFERAE/APICIAE)

69

RESUMO 70ABSTRACT 701. Introdução 712. Materiais e Métodos 732.1 Local de Trabalho 732.2 Identificação do Material Botânico 742.3 Obtenção do Material Botânico 742.4 Investigação Fitoquímica 742.5 Contorções Abdominais 763. Resultados e Dsicussão 764. Conclusão 79Referêrencias Bibliográficas 80

8. CONCLUSÕES 85 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87

LISTA DE ABREVIATURAS % Porcentagem ºC Graus Celsius a. C. antes de Cristo AcOEt Acetato de Etila AcOH Ácido Acético HCOOH Ácido Fórmico ATCC Bacteriology Collection BuOH Butanol ANOVA Análise de Variância CAPES CCB Centro de Ciências Biológicas CCDA Cromatografia de Camada Delgada CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CMI Concentração Mínima Inibitória D1 Dose Mínima D2 Dose Máxima DL50 Dose Letal Média EBAC Extrato Bruto Acetato de EtilaEBE Extrato Bruto Etanólico EBH Extrato Bruto HexânicoEtOH Etanol g Grama g/Kg Grama por Kilograma GC Cromatografiaa à Gas h Horas H2O Água HPLC Cromatografia Líquida de Alta Performance MS Espectrometria de massa MIC Minimum Inibitorial Concentration mL Mililitro mm Milimetro MeOH Metanol mg/Kg Miligrama por Quilograma N.T. Não TestadoS.A. Sem AtividadeSOD Superóxido Dismutase S.IDT Sem Identificação T Teste T de Student UFC/mL Unidades Formadores de Colônia por Mililitro UFPE Universidade Federal de Pernambuco UFPEDA Departamento de Antibióticos da UFPE V.O. Via Oral V.I. Via Intrapperitoneal µg Micrograma µg/mL Micrograma por Mililitro µL Microlitro

LISTA DE FIGURAS REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1. Foeniculum vulgare Mill 15Figura 2. Umbela de F. vulgare Mill. 15Figura 3. Sementes de Foeniculum vulgare Mill. 15Figura 4. Estrutura Química da Foeniculina. 17Figura 5. Estrutura Química dos principais monoterpênicos presentes em F.

vulgare Mill. 17

Figura 6. Estrutura Química do Anetol (83,13%). 17

Figura 7. Estrutura Química da fenchona (23,05%). 18Figura 8. Estrutura Química de outros monoterpênicos presentes em F.

vulgare Mill 18

LISTA DE TABELAS

ARTIGO I- TOXICOLOGICAL STUDY OF SEEDS OF Foeniculum vulgare MILL. Table 1. Main related mannering reactions to the doses managed in the preliminary phase of the evaluation of the acute toxicity for intraperithoneal routee.

37

Table 2. Main related mannering reactions to the doses managed in the definitive phase of the evaluation of the acute toxicity for saw intraperithoneal.

38

ARTIGO II- ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Foeniculum vulgare (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE) Tabela 1. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

47

Tabela 2. Atividade antimicrobiana de extrato bruto acetato de etila das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

48

Tabela 3. Atividade antimicrobiana de extrato bruto Hexânico das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

49

ARTIGO III- AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Foeniculum vulgare (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE) FRENTE A ISOLADOS CLÍNICOS Tabela1. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Staphylococcus aureus.

65

Tabela 2. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. Realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Entecococcus faecalis.

65

Tabela 3. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. Realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Micrococcus spp.

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ARTIGO IV- PERFIL FITOQUÍMICO E ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE ANALGÉSICA DO EXTRATO BRUTO DAS SEMENTES DE Foeniculum vulgare Mill (UMBELLIFERAE/APICIAE) Tabela 1 – Metabólitos, sistemas de eluição, reveladores e referencias bibliográficas utilizadas para a investigação fitoquímica de Foeniculum vulgare Mill.

75

Tabela 2 - Metabólitos secundários das frações das sementes de F. vulgare Mill.

77

LISTA DE GRÁFICOS ARTIGO I- TOXICOLOGICAL STUDY OF SEEDS OF Foeniculum vulgare MILL. Graph 1: Curve dose-reply of the acute toxicity for intraperitoneal routee of the ethanolic extract of the seeds of Foeniculum vulgare Mill in female mice. The values represent the percentage of deaths of animals (n=6/grupo).

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ARTIGO IV- PERFIL FITOQUÍMICO E ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE ANALGÉSICA DO EXTRATO BRUTO DAS SEMENTES DE Foeniculum vulgare Mill (UMBELLIFERAE/APICIAE) Gráfico 1. Efeito do extrato etanólico de F. vulgare Mill. nas dosagens de 298, 149 e 74,5 mg/Kg nas contorções abdominais em camundongos. Resultados expressos em média ±desvio padrão. *P <. 0,05 vs. controle

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RESUMO Foeniculum vulgare Mill, família Umbelliferae/Apiaceae, é uma erva aromática bienal, de folhas invaginantes verde-amareladas e com flores amarelas que se reúnem em umbelas. Conhecida pelo nome de funcho, falso anis e erva-doce-brasileira, é nativo na Europa mediterrânea, norte da África e Ásia ocidental, sendo amplamente cultivada em todo o Brasil. Seu uso é difundido na medicina tradicional de muitos países para o tratamento de várias doenças como: desordens digestivas e problemas menstruais, sendo também empregada como: analgésico, diurético, expectorante, lactígeno, antiinflamatório e antiespasmódico. Este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda, atividade farmacológica (antinociceptiva em roedores), realizar um estudo fitoquímico, bem como identificar a atividade antimicrobiana dos extratos da semente de Foeniculum vulgare Mill. Os ensaios de toxicidade aguda foram realizados por via oral e intraperitoneal, com observações das respectivas alterações comportamentais para cada dose administrada. Os resultados demonstraram pela via intraperitoneal efeitos estimulantes e depressores; e via oral demonstraram baixas reações comportamentais. Os resultados indicaram que a DL50 de Foeniculum vulgare Mill foi 3g/kg via intraperitoneal. Para a avaliação da atividade antimicrobiana, in vitro, usou-se o método de difusão em disco de papel. Os resultados obtidos mostraram que os extratos testados foram ativos apenas frente à bactérias Gram-positivas, não inibindo bactérias Gram-negativas e levedura, apresentando melhores resultados o extrato acetato de etila. O estudo fitoquímico foi realizado em cromatografia de camada delgada e identificou a maioria dos compostos secundários presentes na fração metanólica, foram observados: triterpenos, glicosídeos de flavanóides, terpenos menores (monoterpenóides, sesquiterpenóide e diterpenóides) e açucares redutores. Para a atividade antinociceptiva utilizou-se o modelo de contorções abdominais induzida pelo ácido acético e os resultados demonstraram que apenas a dosagem de 298 mg/Kg comparado ao padrão conseguiu uma redução significativa no número de contorções. O extrato etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill não indicou evidências da toxicidade oral, porém apresentou moderada toxicidade intraperitoneal. Estudos posteriores devem ser realizados para a identificação e isolamento de alguns compostos secundários, bem como a realização de outros protocolos de analgesia e atividade antimicrobiana. Palavras-chaves: Foeniculum vulgare Mill., Umbelliferae/Apiaceae, toxicidade aguda, atividade antimicrobiana, atividade analgésica e estudo fitoquímico.

ABSTRACT Foeniculum vulgare Mill, Umbelliferae/Apiaceae family, is a biennial aromatical grass, of green-yellowish invaginants leves and with yellow flowers if they congregate in umbels. Known for the name of funcho, false anise and grass-candy-Brazilian, are native in the Mediterranean Europe, north of Africa and Asia occidental person, being widely cultivated in all Brazil. Its use is spread out in the traditional medicine of many countries for the treatment of some illnesses as: digestive clutters and menstrual problems, being also used as: analgesic, diuretic, expectorant, lactgene, antiinflammatory and antispasmodic. This work had as objective to evaluate the acute toxicity and farmacology activity (antinociceptive in rodents), to carry through a phytochemical study, as well as identifying to the antibacterial activity of extracts of the seed of Foeniculum vulgare Mill. The assays of acute toxicity had been carried through by orraly and intraperihtonealy, with comments of the respective mannering alterations for each managed dose. The results had demonstrated for the intraperitoneal way effect stimulants and depressors; e oral route had demonstrated low mannering reactions. The results had indicated that the DL50 of Foeniculum vulgare Mill was 3g/kg, intraperithonealy. For the avaliation of the antibacterial activity, in vitro, used the method of diffusion in paper record. The gotten results had shown that the tested extracts had been active only front to the Gram-positive bacteria, not inhibiting Gram-negative bacteria and leavening, presenting better resulted the extract acetate of etila. The phytochemical study it was carried through in chromatography of thin layer and it identified to the majority of secondary composites gifts in the metanolic fraction, had been observed: lesser triterpenoids, glycosides of flavanoids, terpenos (monoterpenoids, sesquiterpenoids and diterpenoids) and you sweeten reducing. For the antinociceptive activity was used the model of abdominal contorces induced for acid acetic and the results had demonstrated that only the dosage of 298 mg/Kg when compared with the standard obtained a significant reduction in the number of abdominal contorces. The etanolic extract of the seeds of Foeniculum vulgare Mill did not indicate evidences of the orally toxicity, however showed moderate intraperithonealy toxicity. Posterior studies must be carried through for the identification and isolation of some secondary composites, as well as the accomplishment of other protocols of analgesia and antibacterial activity. Key words: Foeniculum vulgare Mill., Umbelliferae/Apiaceae, acute toxicity, antibacterial activity, analsesic activity and phytochemical study.

1. Introdução

Araujo, R. O. Investigação da Atividade Biológica de Foeniculum vulgare Mill.(Umbelliferae/Apiaceae)..

9

1. INTRODUÇÃO

Foi através da observação e da experimentação pelos povos primitivos que as

propriedades terapêuticas de determinados vegetais foram descobertas e propagadas de

geração em geração (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). Essas informações foram se

acumulando gradativamente, até o surgimento de documentos escritos em placas,

papiros e outras relíquias, fazendo referência a listas de plantas medicinais constantes de

“farmacopéias” ligadas a antigas culturas. Talvez o mais famoso desses achados

arqueológicos seja o Papyrus de Ebers, datado do século XVI a.C, contendo mais de

oitocentas fórmulas e prescrições de fármacos usadas na região Mesopotâmica

(THOMSON, 1981; HANSEL et al., 2000; OGA, 2003).

No Brasil, o uso de plantas com propriedades curativas, baseado no conhecimento

popular, é uma prática secular deixada como herança pelos índios, e largamente utilizada

principalmente na Região Nordeste. “As plantas medicinais brasileiras não curam

apenas, fazem milagres”; com esta célebre frase, Von Martius definiu bem a capacidade

de nossas ervas medicinais. É bem provável que das cerca de 200.000 espécies vegetais

que possam existir no Brasil, na opinião de alguns autores, pelo menos a metade pode ter

alguma propriedade terapêutica útil à população, mas menos de 1% dessas espécies com

potencial curativo, foi objeto de estudos adequados. Em comunidades com baixo acesso

a medicamentos, como ocorre em algumas regiões do Brasil, agregar garantias

científicas a essa prática terapêutica traz inúmeras vantagens (MATOS, 1989; SANTOS,

1988).


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No inicio do século XIX o isolamento da tubocurarina, princípio ativo do Curare

proveniente da planta Strychnus guianeses e em 1817 o isolamento da morfina, princípio

ativo do ópio, extraído da Papaver somniferum, marcaram o inicio do processo de

extração de princípios ativos de plantas (VIEGAS JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO,

2006). Sucessivamente outras substâncias foram isoladas como a quinina e a quinidina,

obtidas da Cinchona sp., e a atropina da Atropa belladona (SCHENKEL; GOSMAN;

PETROVICK, 2001).

Ainda no início do século XX, a consolidação do processo de industrialização e

o aumento na produção de compostos terapêuticos sintéticos, mais puros, ativos e com

menos efeitos colaterais aliados ao difícil controle de qualidade dos extratos vegetais

utilizados, ocasionaram uma preferência mundial por medicamentos farmacêuticos

industrializados (TOLEDO, 2002).

E no século XXI, nota-se um retorno do interesse por plantas medicinais, devido

a grande procura por terapias alternativas. Isto se deve ao alto custo dos medicamentos

sintéticos, além da busca da população por tratamentos menos agressivos ao organismo

humano, principalmente no atendimento primário a saúde (RIBEIRO; LEITE;

DANTAS-BARROS, 2005).

Com o reconhecimento da fitoterapia pela Organização Mundial de Saúde

(OMS), na Conferência de Alma Ata em 1978, o aproveitamento de plantas medicinais

foi ressaltado como parte do Programa Saúde Para Todos no ano 2000, recomendando-

se inclusive, a realização de mais estudos e a propagação do uso das plantas medicinais

regionais nos programas de atenção primária à saúde. Esta prática pode se constituir

numa alternativa muito útil devido a sua eficácia aliada a um baixo custo operacional, a


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relativa facilidade para aquisição das plantas e a compatibilidade cultural do programa

com a população atendida (YAMADA, 1998; MATOS, 1994; AMORIM, 1999).

Segundo uma definição divulgada pela OMS, planta medicinal é “todo e qualquer

vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com

fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos”. O estudo

prévio quanto a aspectos agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos, e o

desenvolvimento de metodologias analíticas e tecnológicas constituem a fundamentação

científica necessária ao desenvolvimento de um produto fitoterápico, o que o diferencia

das preparações utilizadas na Medicina Popular (PETROVICK; GONZÁLEZ-

ORTEGA; BASSANI, 1997).

A Resolução RDC / ANVISA Nº. 48/2004, que dispõe sobre o registro de

medicamentos fitoterápicos, define droga vegetal como sendo uma planta medicinal ou

suas partes, após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra,

rasurada, triturada ou pulverizada e derivados de drogas vegetais como produtos de

extração da matéria prima vegetal: extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco, e outros; e

finalmente, fitoterápico como um medicamento obtido empregando-se exclusivamente

matérias-primas ativas vegetais. Este último é caracterizado pelo conhecimento da

eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua

qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas através de levantamentos

etnofarmacológicos de utilização, documentações técnico-científicas em publicações ou

ensaios clínicos fase 3 (São estudos realizados em grandes e variados grupos de

pacientes, com o objetivo de determinar: o resultado do risco/benefício a curto e longo

prazos das formulações do princípio ativo). Medicamentos contendo em sua


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composição, substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, ou associações destas com

extratos vegetais não podem ser considerados fitoterápico.

No Brasil é visível o crescimento da utilização de fitoterápicos. Alguns fatores

poderiam explicar o aumento do uso desses medicamentos: os efeitos adversos de

fármacos sintéticos, os avanços ocorridos na área científica que permitiram o

desenvolvimento de fitoterápicos reconhecidamente seguros e eficazes, devido o seu

melhor conhecimento químico, farmacológico e clínico das drogas vegetais e seus

derivados, como também uma forte tendência de busca, pela população, por terapias

menos agressivas destinadas ao atendimento primário à saúde. Outro fator importante,

atualmente, é o preço desses medicamentos que estão ganhando popularidade entre os

habitantes de áreas rurais e urbanas (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007;

CAÑIGUERAL; DELLACASSA; BANDONI, 2003; VIEIRA, 2001; YUNES;

PEDROSA; CECHINEL- FILHO, 2001).

Muitas dessas plantas são, inclusive, empregadas para fins medicinais diferentes

daqueles utilizados pelos silvícolas (VIEGAS-JÚNIOR; PINTO; MACIEL, 2005). Em

um estudo realizado pelo Instituto Brasileiro de Plantas Medicinais, foi concluído que

menos que 10% dos extratos vegetais biologicamente ativos haviam sido estudados. A

pesquisa etnofarmacológica é, portanto, um grande desafio em nosso país (BRITO;

BRITO, 1996).


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2.Revisão da

Literatura


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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Estudos sobre Foeniculum vulgare Mill.

2.1.1 Botânico

Foeniculum vulgare Mill. é conhecida popularmente no Brasil como Funcho ou

erva-doce brasileira (nacional). É uma planta pertencente à Ordem Umbelliflorae e à

Família Umbelliferae/Apiaceae. Segundo alguns autores, é originária do continente

africano, Ilha da Madeira e Açores; outros acreditam que é nativa da Europa Meridional

e Central e da Ásia Menor. Possivelmente, veio para o Brasil junto com os colonos

portugueses (SILVA, 2001).

Apresenta como sinônimos científicos: Foeniculum officinale All, Foeniculum

capillaceum, Foeniculum Dulce DC, Anethum foeniculum, Foeniculum foeniculum

Karsten (OLIVEIRA; AKISUE; AKISUE, 1998; MOREIRA- FILHO, 1972), e vários

nomes vulgares: Bata-anduru (Ceilão), Chamar (Egito), Chelun-helu (Líbia), Fencher

(Alemanha), Fennel (Inglaterra), Finocchio (Itália), Hinojo (Espanha e Guatemala)

(CORRÊA, 1984).

É uma planta bienal ou perene, aromática, glabra e ramosa, que mede de 40 a

180 cm de altura e apresenta cor verde brilhante (BALMÉ, 2004). As folhas

invaginantes, excessivamente recortadas e reduzidas a segmentos divididos em lacínias

filiformes alongadas, freqüentemente verde-amareladas; folhas superiores com bainha

muito comprida e limbo curto. As hastes têm 3 ou 4 pés elevados, eretos, contínuos,

redondos, estriados, lisos, frondosos, e abundantemente ramificado. Os caules são

alternos, tripla pinulados e divididos em numerosos segmentos filiformes (caules


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fistulosos) e estriados. As flores amarelo-esverdeadas se reúnem em umbelas grandes,

compostas e terminais, radiadas, muito variáveis, de 10-30 raios (CORRÊA, 1984).

Foeniculum vulgare Mill. é uma erva empregada, amplamente, na culinária e na

industria farmacêutica nas preparações de artigos de perfumaria. A base da haste é

empregada na culinária como legume, enquanto os frutos, vulgarmente chamados de

sementes, têm sido empregado desde a mais remota antiguidade na forma de chá

medicamentoso nos casos de disturbios digestivos (LORENZI; MATOS, 2002).

Figura 1. Foeniculum vulgare Mill Figura 2. Umbela de F. vulgare Mill.

(www.google.com.br) (www.google.com.br)

O fruto é do tipo cremocarpo, oblongo, quase cilíndrico, às vezes, ovóide, direito

e levemente arqueado, de 4 a 5 mm de comprimento por 2 a 4 mm de largura, glabro, e

de cor verde-acinzentada ou verde-pardacenta (OLIVEIRA; AKISUE; AKISUE, 1998).

Figura 3. Sementes de Foeniculum vulgare Mill. (www.google.com.br)


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2.1.2 Fitoquímico

Estudos realizados por Seher; Ivanov (1976) descreveram que os resíduos

remanescentes da extração do óleo contêm: 14 a 22% de proteínas e 12 a 18,5% de

gordura. O óleo graxo contém 4% de ácido palmítico, 22% de ácido oléico, 14% de

ácido linoléico e 60% de ácido petro-selênico. Os frutos contêm 1,5 a 3% de óleo

essencial e 9 a 21% de óleo graxo, elevada quantidade de ácido petroselínico (67 a

69%). Os tocoferóis somam 50 a 60mg/100 mg do óleo, como 75% gama-tocotrienol

(muito para óleos vegetais estudados), 7,9% alfa-tocoferol, 0,0% a 9 de α-tocotrienol,

1,5 a 2% de β-tocoferol. O β-tocototrienol, e 5 A 6% de alfa-tocoferol.

Os frutos (sementes) fornecem uma essência que varia de 1,5 a 6%. Essa

essência contém 63-84% de anetol e 3,3% de seu isômero, o estragol ou metilchavicol e

ainda p-anisaldeído, foeniculina, d-fenchona, álcool fenchílico, limoneno, mirceno, e ou

outros constituintes em menores quantidades. Outros autores referem ainda α-amirina,

várias cumarinas, esteróides, vanilina, flavanóides, ácido cafeíco e clorogênico,

tocoferois e ácidos graxos livres ou combinados sob a forma de óleo fixo (SOUZA et al,

1991).

Alguns componentes químicos importantes são: α-pineno, canfeno, felandreno,

dipenteno, fenchona, estragol, foeniculina, d-fencoria, metil chavibetol, anisaldeído,

ácido anísico, dipinenoandrol, traços de taninos, ácido fosfórico, ácido málico, ácido

succínico e metileugenol (OLIVEIRA; AKISUE; AKISUE, 1998; INVENTÁRIO DAS

PLANTAS MEDICINAIS, 1979).


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Figura 4. Estrutura Química da Foeniculina (TESKE; TRENTINI, 1995).

O estudo realizado por Dadalioglu; Evrendilek (2004) revelaram que a

composição química do óleo essencial das partes áreas de Foeniculum vulgare a partir

da determinação por Cromatografia à Gás (GC) e por Espectrofotometria de massa

(MS) foi: α-pineno (0,27%), limoneno (3,77 %), estragol (5,12%), carvona (0,94%), ρ-

anisaldeido (2,61%) e trans-anetol (83,13 %).

Figura 5. Estrutura Química dos principais monoterpênicos presentes em F. vulgare Mill

Figura 6. Estrutura Química do Anetol (83,13%) (TESKE; TRENTINI, 1995)

(0,27%) (3,77%) (0,94%)


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O estudo realizado por Simándi; Deák; Rónyai (1999) evidenciaram na análise

por cromatografia gasosa de extratos obtidos a partir da extração supercrítica com CO2

que as três frações continham: trans-anetol (56,15%), fenchona (23,05%),

metilcharvicol (5,44%), e limoneno (4,86%), como principais componentes. α-pineno

(3,12%), canfeno (0,43%), β-pineno (0,65%), β-mirceno (2,10%), α-felandreno

(0,97%), e cis-anetol (1,01%) foram encontrados na primeira fração. Apenas α-pineno,

β-pineno, e 3-careno (1,39%) apareceram na segunda fração. E a terceira fração

continha apenas os quatro principais componentes.

Figura 7. Estrutura Química da fenchona (23,05%) (TESKE; TRENTINI, 1995).

Figura 8. Estrutura Química de outros monoterpênicos presentes em F. vulgare Mill

(3,12%) (0,43%) (0,65%)

(2,10%) (0,97%) (1,39%)


19

2.1.3 Farmacológico

Devido aos óleos voláteis contidos, o vegetal tem ação no trato digestivo, atua na

mucosa gástrica, aumenta o peristaltismo intestinal e reduz a produção de gases.

Também favorece a secreção brônquica, removendo o excesso de muco do aparelho

respiratório e estimula as funções fisiológicas. Devido ao seu teor em sais de potássio

apresenta propriedades diuréticas. Favorece a secreção láctea, sendo muito útil na

amamentação. Estimula a dilatação dos capilares, aumenta a circulação cutânea e em

altas doses estimula o fluxo menstrual (TESKE; TRENTINI, 1995).

A luz solar provoca a transformação do trans-anetol, não tóxico, em cis-anetol

que é tóxico, com formação de dianetol e fotoanetol que têm atividade estrogênica o

que, de certo modo, explica a utilização desta planta nos casos de distúrbios menstruais

e como galactagogo (LORENZI; MATOS, 2002).

Segundo List (1979), como remédio é descrito ser analgésico, afrodisíaco,

aromático, cardiotônico, carminativo (anti-flatulência), digestivo, diurético, emenagogo

(estimulador mestrual), expectorante, lactígeno, estomacal, tônico e vermicida, sendo

um remédio popular para aerofagia (deglutição de ar), amenorréia (ausência da

mestruação), cólica e dispepsia (indigestão). Também é utilizado para feridas, dor de

estômago, bronquites e pneumonia (DUKE, 1985; CORREA, 1984; JACOBS, 1995).

Outras propriedades terapêuticas de Foeniculum vulgare Mill. são: eupéptica

(facilitador da digestão), purgativa, anti-séptica, antiespasmódica (INVENTÁRIO DE

PLANTAS MEDICINAIS, 1979).


20

De acordo como Hartwell (1971), emplastros do caldo de Foeniculum vulgare

Mill. é um remédio popular para escleroses (endurecimento de tecidos orgânicos) das

glândulas mamarias, carcinoma (câncer) e feridas cancerosas. As sementes servem para

ajudar escleroses do fígado e do baço, tumores da úvula, baço, garganta, e condiloma.

Segundo Morton (1981), as sementes são tostadas e pulverizadas para fazer um

colírio. A raiz, em xarope, é usada para aliviar endurações do baço e fígado. A flor e o

fruto favorecem o peristaltismo intestinal. A folhagem ajuda em inflamações dos órgãos

internos, cólicas e enfermidades dos olhos. Na áfrica o extrato alcoólico é usado para

espasmos, diarréia e dor de estômago. Os jamaicanos usam a planta contra resfriados.

O óleo do funcho em quantidades pequenas como 1 a 5 mL tem causado edema

pulmonar, alterações respiratórias e doenças repentinas. Por isso, a automedicação com

o funcho deve ser restringido ao uso dos frutos (sementes) e o óleo essencial não deve

ser usado (DUKE, 1985).

Tem sido demonstrado in vivo que as plantas como: anis-verde (Pimpinella

anisum L.), o endro (Anethum gaveolens) e o funcho (Foeniculum vulgare Mill.)

possuem óleos essenciais similares e que a aminação dos anéis substituídos destes óleos

pode resultar em uma série de três anfetaminas alucinógenas (DUKE, 1985). Logo, o

óleo essencial do Foeniculum vulgare Mill. pode causar irritações em alguns casos e em

doses elevadas pode provocar alucinações, excitação e convulsões (TESKE;

TRENTINI, 1995).

2.1.4 Toxicológico

A Toxicologia pode ser definida como aquela que se preocupa com o estudo dos

tóxicos ou venenos, é possível considerar estes como qualquer agente capaz de produzir


21

uma resposta prejudicial num sistema biológico, destruindo uma vida ou

comprometendo uma função (SCHVARTSMAN, 1985).

Toda substância, segundo a Toxicologia, pode ser considerada um agente tóxico,

dependendo das condições de exposição, como: dose administrada ou absorvida, tempo

e freqüência de exposição e vias pela qual é administrada. Desta forma, faz-se

necessário conhecer as condições de uso seguro de substâncias químicas para a saúde

humana e ambiental (OGA, 2003).

2.1.4.1 Toxicidade Aguda

A Toxicidade Aguda é definida como os efeitos adversos que ocorrem dentro de

um período curto após a administração de uma dose única ou doses múltiplas dentro de

24 h. O estudo da Toxicidade aguda tem por objetivo caracterizar a relação dose-

resposta que conduz ao calculo da DL50 (OGA, 2003).

A avaliação toxicológica compreende a análise dos dados toxicológicos de uma

substância ou composto químico com o objetivo de classificá-lo toxicologicamente e, ao

mesmo tempo, fornecer informações a respeito da forma concreta de seu emprego, bem

como as medidas preventivas e curativas quando do uso inadequado (LARINI, 1941).

Dentro dos parâmetros de estudos toxicológicos agudos devem-se ressaltar

princípios como efeitos das substancias químicas produzidas em animais de laboratório,

adequadamente qualificados e extrapolados para seres humanos e que a exposição

destes animais a altas doses é um método válido e necessário para descobrir efeitos e

danos possíveis em seres humanos expostos a doses muito menores. (GILMAN et al,

2003). Pode-se utilizar a DL50 como parâmetro para calcular o indice terapêutico (É a


22

relação entre a dose máxima tolerada, ou também tóxica, e a dose terapêutica (Dose

tóxica/dose terapêutica) de uma droga, fornecendo uma margem de segurança definida

como o indicador famacodinâmico que expressa a diferença entre a dose tóxica e a dose

efetiva no uso da mesma (DALE; RANG; RITTER, 2001).

2.1.5 Multirresistência Bacteriana

O desenvolvimento da quimioterapia antimicrobiana começou com a descoberta

das sulfonamidas em 1930. Cinco anos após, a penicilina foi descoberta como agente

quimioterápico eficaz, e daí até os próximos 25 anos correntes a pesquisa

quimioterápica foi reconhecida como a era eufórica denominada a “Era Antibiotica”

(JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 1998).

Pouco tempo depois na década de 50 começaram a surgir os primeiros

microrganismos resistentes à penicilina. Um novo surto na década de 70 começou a

chamar a atenção da resistência adquirida aos antimicrobianos, pois neste momento

apareciam linhagens multirresistentes a diferentes tipos de antibióticos (COUTO;

PEDROSA, 1999).

As bactérias tornam-se resistentes a agentes quimioterápicos principalmente por

três mecanismos: destruição ou inativação da droga; prevenção da penetração no sítio-

alvo dentro do micróbio, e alteração dos sítios-alvo das drogas. Podendo haver

variações nestes mecanismos (TORTORA et al, 2003).

Apesar de a indústria farmacêutica ter produzido um grande número de novos

antibióticos nas últimas décadas, a resistência a essas drogas, por parte dos

microrganismos, tem aumentado consideravelmente. O estudo dos vegetais como


23

produtos naturais para manutenção da saúde humana tem apresentado um grande valor,

especialmente nos últimos anos com os intensivos estudos sobre terapias naturais

(NASCIMENTO et al, 2000).

Bactérias resistentes a múltiplos antibióticos representam um desafio no

tratamento de infecções. É imprescindível, portanto, a pesquisa de novas substâncias

com propriedades antimicrobianas para o combate a esses microrganismos. Diversas

plantas encontradas na nossa flora são utilizadas na medicina natural, no tratamento de

doenças tropicais, incluindo infecções bacterianas (PEREIRA et al, 2004).


24

3.Objetivos


25

3.0 Objetivos

3.1 - Geral

Este trabalho tem como objetivo avaliar os estudos fitoquímicos e biológicos

(toxicológico, microbiológico e farmacológico) da espécie Foeniculum vulgare Mill.

3.2 – Específicos

- Classificação botânica do vegetal;

- Obtenção de extratos brutos das sementes seguida de partição por diferentes

solventes orgânicos;

- Investigar a toxicidade aguda do extrato etanólico de Foeniculum vulgare Mill

(DL50);

- Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato etanólico e sub-extratos de

Foeniculum vulgare Mill. frente aos microrganismos selecionados. Comparar a

resistência e a sensibilidade dos microrganismos selecionados, detectados pelo

antibiograma, com os resultados obtidos através dos testes com os extratos e as

formulações comerciais de acordo com o Nacional Commitee for Clinical

Laboratory Standarts – NCCLS.

- Verificar a presença dos diversos grupos fitoquímicos no extrato etanólico e

partições do vegetal;

- Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato etanólico de Foeniculum vulgare

Mill;


26

4.Artigo I

Artigo submetido ao Journal of Ethnopharmacology


27

TOXICOLOGICAL STUDY OF SEEDS OF Foeniculum vulgare MILL.

*Rosilma de Oliveira Araujo1, Elisângela Christhianne Barbosa da Silva.2; Aldo César Passilongo da Silva.2; Ivone Antônia de Souza.3; Dalci José Brondani4.

1Program of After-Graduation in Pharmaceutical Sciences- Department of

Pharmaceutical Sciences - Federal University of Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brazil.

2 Master in Pharmaceutical Sciences - Department of Pharmaceutical Sciences - Federal University of Pernambuco - UFPE, Recife-PE, Brazil. 3 Antibiotic Department - Federal Universityof Pernambuco - UFPE, Recife-PE, Brazil. 4 Department of Pharmaceutical Sciences - Federal University of Pernambuco - UFPE, Recife-PE, Brazil. *Contact with the author: R. Prof. Arthur Sá, S/N, University City, Cep: 50.740-520, Recife-PE, Brazil/Tel: (55) 81 - 2126-8511/fax: (55) 81-2126-8510/ email adress: [email protected] ABSTRACT

Foeniculum vulgare Mill., Umbelliferae/Apiaceae, is a aromatic plant, long used in various ailments as digestive disorders, dysentery, flatulence and menstrual problems. There is a little information about its possible toxicity. In this study, acute toxicity of seeds of Foeniculum vulgare Mill. in mice have been evaluated. For the study have been used the methodology of Karber and Behrens (1964). The animals received intraperitonealy ten different single doses and orally two dose of ethanolic extract and the general effects were observed during 60 min and continued about 72 h after injections. The results had demonstrated that for it intraperithoneal routee effect stimulants and depressive reactions. The results obtained in the toxicity orally had demonstrated low comportment reactions and increase significantly gastric-intestinal transit as well diureses. The results indicated that DL50

of Foeniculum vulgare Mill. is 3g/kg body weight for intraperithoneal route. It is proved that the ethanolic extract of seeds of Foeniculum vulgare Mill. did not indicate evidences of toxicity orally, however presented moderate toxity intraperithoneally. Keywords: Foeniculum vulgare Mill.; DL50, Mouse

RESUMO Foeniculum vulgare Mill, Umbelliferae/Apiaceae, é uma planta aromática, usada por muito tempo em várias doenças como: desordens digestivas, disenteria, flatulência e problemas menstruais. Há pouca informação sobre sua possível toxicidade. Neste estudo, a toxicidade aguda das sementes de Foeniculum vulgare Mill. foi avaliada em camundongos. Para o estudo foi utilizada a metodologia de Karber e de Behrens (1964). Os animais receberam intraperitonealmente dez únicas doses diferentes e oralmente duas doses do extrato etanólico e os efeitos gerais foram observados durante 60 minutos e aproximadamente 72 h continuados após as injeções. Os resultados demonstraram


28

pela via intraperitoneal efeitos estimulantes e depressores. Os resultados obtidos da toxicidade oral demonstraram baixas reações comportamentais e aumento significativo do trânsito gastrointestinal, bem como diurese. Os resultados indicaram que DL50 de Foeniculum vulgare Mill foi 3g/kg via intraperitoneal. Foi comprovado que o extrato etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill. não indicou evidências da toxicidade oral, porém apresentou moderada toxicidade intraperitoneal. Palavras-chave: Foeniculum vulgare Mill, DL50, camundongo 1. Introduction

Foeniculum vulgare Mill. it is known popularly in Brazil as fennel or Brazilian

grass-candy. It is a pertaining plant to the Umbelliflorae Order and the

Umbelliferae/Apiaceae Family. According to some authors, she is originary of the

African continent, Island of Madeira and Açores; others believe that she is native of the

Southern and Central Europe and of Lesser Asia. Possibly, it together with came to

Brazil the Portuguese colonists (SILVA, 2001).

Foeniculum vulgare Mill. can be an annual, biannual, or perennial plant species,

depending on which species, piperitum or Vulgare, or variety is examined. Subspecies

Vulgare includes three varieties: Vulgare, dulce, and azoricum. The sweet (dulce) and

bitter (Vulgare) varieties grow wild in Mediterranean countries; however, it is the sweet

fennel that is cultivated (FAUDALE et al, 2008)

Is a tropical aromatic plant of the Mediterranean area, long used as medicinal and

spice herb. As remedy he is described to be analgesic, aphrodisiac, aromatic,

cardiotonic, digestive, diuretic, lactigene and vermicide, being a popular remedy for

amenorrhea, colic and dyspepsia (MININJA; THOPPHIL, 2002). It is also used to

flavor foods, liqueurs and in the perfumer industry. Essential oils are mainly

concentrated in the mericarps (fruits) and provide the unique aroma and taste (CHOI;

HWANG, 2004).


29

The aromatic proprieties of the fruits of Foeniculum vulgare Mill. is exploited by

the pharmaceutical industry to correct the flavor of medicines and, above all, of some

laxatives of plant origin. In the case of fennel oil, an effect on the digestive processes

has been ascertained; hence, it may exert an additive effect (CANTORE et al , 2004).

In India, F. vulgare Mill. is grown in plains of northern states as a cold weather

crop. It is well accepted that adequate use of irrigation and chemical fertilizer improve

yield and quality of essential oil on aromatic plants (KAPOOR; GIRI; MUKERJI,

2003).

The antioxidant and antimicrobial properties of the essential oil have been also

recognized. Most of the papers published are related to the analysis of essential oil

constituents and chemosystematic studies of fennel, involving the use of gas

chromatography (GC). Much less work has been done using high-performance liquid

chromatography (HPLC) in the analysis of fennel teas and essential oil (KRIZMAN;

BARICEVIC; PROSEK, 2007)

The experimental toxicology develops studies for briefing of the mechanisms of the

toxic agents on the biological systems and for evaluation of the decurrently effect of this

action. The evaluation of the toxicity of substances is made, using different species of

animals, following the rigorous norms praised for the regulating agencies of the country

(OGA, 2003).

You inform of the actions of the ethanolic extract of the seeds of Foeniculum

vulgare Mill to them are very diverse, however scientific information do not exist on the

acute toxicity of this plant. The objective of this work was to evaluate the toxicity of the


30

ethanolic extract of the seeds of Foeniculum vulgare Mill. in mice for it intraperithoneal

and it orally route.

2. Materials and Methods

2.1 Plant material

Samples of the seeds of the Foeniculum vulgare Mill. had been acquired through

purchase in establishment M.J. Flag Natural Products (located in the Square Vital Dom

Nº 101 - São Jose Recife-PE) in the period of October of 2007. The conditioned vegetal

material in plastic bags was taken to the Horto of the Biotech of the Department

Antibiotic of the Federal of Pernambuco and kept University in aired place, to the

ambient temperature. The acquired seeds of had been submitted to the process of

maceration with absolute ethylic alcohol Remaining in contact with the solvent for a

period of 48 hours to the ambient temperature, being agitated manually, sporadically,

and kept protected from the light. The extract gotten after filtration was concentrate, to

the ambient temperature in rotaevaporador to the dryness. The voucher specimen

(register number 50.572) was placed in the Geraldo Mariz Herbarium of the same

University.

2.2 Animals

Albinic mice Swiss (Mus muscullus), adults with 60 days of age, 25 and 35g of

weights corporeal had been used female, proceeding from the Biotitic of the Antibiotic

Department of the Pernambuco Federal University (UFPE). Environmental conditions

were maintained at a temperature of 23±2 ◦C and a relative humidity of 40±10% with

12 h light/dark cycle. The animals had been kept in polypropylene river, had received

water ad libitum.


31

2.3 Experimental Protocol

The animals had been divided in groups (six for group), which had been private of

ration for 12 hours before the accomplishment of the assays. For the accomplishment of

the inquiry of the acute toxicity, the methodology praised for Karber; Behrens (1964)

was used. The assay was divided in two phases: definitive and preliminary. In the

preliminary phase, doses in increasing concentrations had been managed following a

geometric progression of reason 2. The purpose was to determine which is the biggest

dose that does not present lethality (D1) and which is the lesser dose capable to provoke

death in 100% of the animals of the group (D2). On the basis of the data of the

preliminary stage were initiated the definitive phase, where increasing doses between

D1 and D2 had been managed, with the purpose of if determining the DL50 (lethal dose

for 50% of the animals), concluding the definitive phase. The animals had been under

comment during 72 hours. The administration of the ethanolic extract of the seeds of F.

vulgare Mill was carried through by intraperithoneal route in ten different single dose

(1g/kg, 1,25g/kg, 1,50 g/kg, 2g/kg, 2,15g/kg, 2,25g/kg, 2,5g/kg, 2,275, 2, 285 e 3g/kg)

and by oral route in two single dose (3g/kg and 4g/kg); e the observed parameters had

been as: toxic signals of general character, mannering effect on the deambulation,

reactions and alterations of the respiratory frequency, number of deaths and

macroscopic examinations of agencies. The group control received physiological serum

0.9% used in the dissolution from the extract of F. vulgare Mill. all the animals had

been observed in order to verify the effect presented for each concentration of the

extract.


32

2.4 Statistical analysis

After that the percentage of mortality for the calculation of lethal doses was carried

through. The values had been express as average ± error standard of the average (epm).

The differences between the groups had been analyzed through the variance analysis

(ANOVA), followed for test T Student. The level of significance for rejection of the

nullity hypothesis was always p≤ 0,05.

3. Results

No mortalities had occurred, in oral route, during the study and clinical

observations and measurements did not indicate evidences of substance-related toxicity.

The oral acute toxicity of Foeniculum vulgare Mill. was, therefore, considered as

unclassified, since a dose of 4 g/kg did not induce deaths or toxic symptoms. However,

in intraperithoneal route, the mortality rate increase progressively with the increase the

dose.

In tables 1 and 2 the doses are related for intraperithoneal routee, expressing the

effect and mannering reactions of the toxicity evaluation in the assays preliminary and

definitive, respectively. In first the 10 and 20 minutes of the administration of the

extract of F. vulgare Mill. had been verified excitatory reactions such as exophthalmia,

agitation, movements stereotyped and circular, among others as: aggressiveness, coarse

reactions of escape and tremors had been observed. After this period, depressive

reactions such as lowering of the posterior train, prostration, halides and reduction of

the cardiac frequency if had become more evidences. Important effect as diarrhea,

spasms, abdominal contorces and alteration of march had been also evidenced.


33

In the evaluation of the acute toxicity he was registered the number of deaths for

each dose managed in the preliminary assays for attainment of D1 and D2. In the

definitive assays we in accordance with got the concentrations the doses for

construction of the curve express dose-reply. The DL50 determined for intraperithoneal

route was of 3g/kg of body weight. Graph 1 represents the curve dose-reply for

intraperithoneal route of the toxicity evaluation of the ethanolic extract of the seeds of

the Foeniculum vulgare Mill.

4. Discussion

The acute toxicity is defined as the adverse effect that inside occur of a short period

after the administration of 24-hour an only or multiple dose inside of a period. The only

dose is used to determine the power of substantiates Inside of the parameters of acute

toxicological studies principles must be stranded out as effect of produced chemical

substances in animals of laboratory, adequately qualified and surpassed for human

beings and that the exposition of these animals the high doses is a method valid and

necessary to discover possible effect and damages in human beings displayed the doses,

to the times, very lesser (OGA, 2003).

The mannering reactions for saw intraperithoneal, in first the 10 and 20 minutes had

been stimulants, as well as the animals had presented effect observed in the Autonomus

Nervous System, as diarrhea, abdominal contorces and spasms, that had predominated

in all the managed doses. Had to contain volatile oils, the vegetable has action in the

digestive treatment, acts in the gastric mucosa, increases the intestinal peristalsis and

reduces the production of gases (TESKE; TRENTINI, 1995).


34

The effect observed after the 40 minutes of the administration of the extract saw

intraperithoneal, had passed of stimulants for depressors characterized for a reduction of

the respiratory frequency and a picture of prostration. The observed general depression

must it reduction of the amount of set free neurotransmitters stimulants during the

excitatory phase. The essential oils of Foeniculum vulgare fruits are composed of

several monoterpenes and phenylpropanoids, where trans-anethole, estragole, fenchone

and limonene exist as main constituents. Trans-anethole, often the most prevalent

constituents, counts for the anise taste, fenchone provides the bitterness, and estragole

(methylchavicol) the sweetness (CHOI; HWANG, 2004). The pharmacological actions

of the grass-candy must, to a large extent, to the presence of anethole, that structurally it

is related with the catecholamine adrenalin, noradrenalin and dopamine (ALBERT-

PULEO, 1980).

The excitabilities reactions, stereotyped increase of the cardiac frequency, circular

movements, convulsions and tremors, among others suggest composite presence

stimulants of the Central Nervous System or simply substances that provoke sharp

reactions for saw intraperitoneal. The prostration picture if only evidenced in the doses

highest, in which the animals had generally been to the death. He has been demonstrated

in alive that the plants as: anise-green (Pimpinella anisum L.), endro (Anethum

gaveolens) and fennel (Foeniculum vulgare Mill.) possess similar essential oils and that

the amination of substituted rings of these oils can to result in a series of three

hallucinogens amphetamines (DUKE, 1985). Soon, the essential oil of the Foeniculum

vulgare Mill. it can cause irritations in some cases and in high doses it can provoke

hallucinations, excitement and convulsions (TESKE; TRENTINI, 1995).


35

The determination of a substance with therapeutical dose insurance is of utmost

importance for its use. Through the DL50, it is possible to calculate the therapeutical

index of a product, being supplied some idea of the safety margin in the use of the same

(DALE et al, 2000). The joined doses had indicated the biggest toxicity clearly for saw

intraperithoneal. From the found DL50, a dose adjusted for accomplishment of the study

of its biological activity in a security band was esteem appropriate daily pay-clinic.

5. Conclusion

The oral toxicity evaluations in this study suggest that Foeniclum vulgare Mill. is a

relatively nontoxic plant. Based on the results of this study it can be concluded that the

risk of intraperithoneal toxicity to mammals is not negligible. In addition, these results

may contribute to the interpretation of the pharmacological effects of this medicinal and

aromatic plant and support the possibility that fennel has protective effects on human

health.

Acknowledgements

The authors would like to express their appreciation to Dr. Ivone Antonia de Souza,

for his initial assistance in toxicology analysis and the technicians of the Biotech of the

Department Antibiotic of the University Federal of Pernambuco. Thanks for promoting

the institution: CAPES (Coordination of Improvement of Higher Education) for

financial support.

References ALBERT-PULEO, M. Fennel and anise as estrogenic agents. Journal of Ethnopharmacology. p.337-344, 1980.


36

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TESKE, M.; TRENTINI, A. M. M. Herbarium-Compêndio de Fitoterapia. Curitiba: Herbarium Laboratório Botânico. p.136-137, 1995.


37

Table 1. Main related mannering reactions to the doses managed in the preliminary phase of the evaluation of the acute toxicity for intraperithoneal routee.

- = without effect + = light effect ++ = moderate effect +++ = accented effect

Ations /Parameters Dilutions 1/100 1/125 1/150 1/200 1/215

Number of death 0 0 1 2 2 CENTRAL SN

Stimulants Increase respiratory frequency

++ +++ +++ +++ +++

Agitation ++ +++ +++ +++ +++ Exophthalmia +++ +++ +++ +++ +++ Estereotipades movements

+++ +++ +++ ++ ++

Circular movements +++ +++ +++ +++ +++ Convulsion clonic - + + - - Convulsion - - + - - Tremors coarse/ fine - ++ +++ +++ +++ Reaction of escape +++ +++ +++ ++ ++

Depressors Lowering of posterior train

+ + + ++ -

Dispneia - ++ ++ ++ - Decrease Respiratory frequency

- ++ - - -

Sedation - - - - - Prostration +++ +++ + - -

Other behaviors Alteration of march ++ ++ +++ +++ +++ Abdominal contorces +++ +++ +++ +++ +++

AUTONOMOUS SN Spasms ++ ++ ++ +++ ++ Distension abdominal +++ +++ +++ ++ ++ Increase Diereses - + + + + Irritancies of conjunctiva

+++ +++ +++ ++ ++

Cianose - ++ ++ +++ +++


38

Table 2. Main related mannering reactions to the doses managed in the definitive phase of the evaluation of the acute toxicity for saw intraperithoneal.

Actions/Parametres diluitions 1/225 1/250 1/275 1/285 1/300

Number of death 2 3 4 5 6 SN CENTRAL

Stimulants Increase respiratory frequency

+++ +++ +++ +++ +++

Agitation +++ +++ +++ +++ +++ Exophthalmia ++ ++ ++ ++ ++ Estereotipades movements

+++ +++ +++ +++ +++

Circular movements +++ ++ ++ + + Convulsion clonic - - ++ +++ +++ Tremors coarse/ fine +++ +++ ++ + + Reaction of escape +++ +++ +++ +++ +++

Depressors Lowering of posterior train

++ ++ ++ ++ ++

Dispneia ++ ++ +++ +++ +++ Decrease respiratory frequency

- - - - -

Sedation - - - - - Prostration ++ ++ ++ + +

Other behaviors Alteration of march +++ +++ +++ +++ +++ Abdominal contorces +++ +++ +++ +++ +++ SN AUTONOMOUS Spasms +++ +++ +++ ++ ++ Distension abdominal +++ +++ +++ +++ +++ Increase Diereses ++ + + + + Cianose +++ +++ +++ +++ +++ - = without effect + = light effect ++ = moderate effect +++ = accented effect


39

Graph 1: Curve dose-reply of the acute toxicity for intraperitoneal routee of the ethanolic extract of the seeds of Foeniculum vulgare Mill in female mice. The values represent the percentage of deaths of animals (n=6/grupo).


40

5.Artigo II

Artigo submetido a Revista Brasileira de Farmacognosia


41

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE Foeniculum vulgare (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE)

Rosilma de O. Araujo,*1 Ivone A. de Souza2, Kêsia X. F. R. Sena2, Dalci José

Brondani3; Evelyne G. Solidônio4

1 Programa de Pós-Graduação em Ciencias Farmacêuticas-Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 2 Departamento de Antibióticos -Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 3 Departamento de Ciências Farmacêuticas- Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 4 Departamento de Energia Nuclear- Universidade Federal de Pernambuco– UFPE, Brasil. *Contato com o autor: R. Prof. Arthur Sá, S/N, Cidade Universitária, Cep: 50.740-520, Recife-PE, Brasil/Tel: (55) 81 - 2126-8511/fax: (55) 81-2126-8510/ e-mail: [email protected] RESUMO: Foeniculum vulgare Mill. (Umbelliferae) é uma planta herbácea originária da Europa Meridional e amplamente distribuída em todo o território brasileiro. É conhecida popularmente como funcho ou erva-doce. Usado na medicina como: analgésico; digestivo; carminativo; diurético; expectorante; lactígeno; antiinflamatório; antiespasmódico. Extratos brutos foram preparados a partir de sementes compradas no estabelecimento comercial J.M. Bandeira –Recife-PE para a verificação da atividade antimicrobiana, in vitro, pelo método de difusão em disco de papel. A concentração inibitória mínima (CMI) foi determinada para os extratos que exibiram melhores atividades. Os resultados obtidos mostraram que os extratos etanólico, acetato de etila e hexânico das sementes foram ativos apenas frente à bactérias Gram-positivas, não inibiu bactérias Gram-negativas e levedura. A menor concentração inibitória (CMI = 62,5 µg/mL) foi obtida para o extrato acetato de etila frente a M. luteus. Palavras-chave: erva-doce, atividade antimicrobiana, Foeniculum vulgare. ABSTRACT: Foeniculum vulgare Mill. (Umbelliferae) it is an originary herbaceous plant of the widely distributed Southern Europe and in all the Brazilian territory. It is known popularly as fennel or grass-candy. Used in the medicine as: analgesic; digestive carminative; diuretic agent; expectorant; lactogoge; anti-inflammatory; antispasmodic. Crude extracts had been prepared from seeds bought in commercial establishment J.M, using standard techniques to test their in vitro antibacterial activity using the paper disk-diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined for the extracts that had shown better activities. The gotten results had shown that the extracts ethanol, acetate of etila and hexane of the seeds had been active only front to the Gram-positive bacteria, not inhibited Gram-negative bacteria and leavening. The lowest inhibitory concentration (MIC= 62,5 µg/mL) was obtained with the extract acetate of etila against M. luteus. Keywords: grass-candy, antimicrobial activity, Foeniculum vulgare


42

1. Introdução

Foeniculum vulgare Mill. foi usada por séculos dentro a área mediterrânea como

uma erva aromática e igualmente na medicina popular, devido às propriedades

farmacológicas de seu óleo essencial. Tipicamente, suas preparações são usadas para

curar as várias desordens, atuando como um carminativo, digestivo, lacttígeno e agente

diurético. As propriedades antioxidantes e antimicrobianas do óleo essencial foram

reconhecidas igualmente (KRIZMAN, et al, 2006).

As sementes de F. vulgare Mill. além de serem usadas como remédio, também

servem para condimentar os alimentos, licores e na indústria de perfumaria. Os óleos

essenciais são concentrados principalmente nos mericarpos (frutas) e fornecem o aroma

e o sabor original. São compostos de diversos monoterpenos e fenilpropanoides, onde o

trans-anetol, o estragol, o fenchona e o limoneno existem como componentes principais.

O trans-anetol, frequentemente é o mais prevalente constituinte e contribui para o sabor

do anis, a fenchona fornece a amargura, e o estragol (metilchavicol) a doçura (CHOI;

HWANG, 2004).

A composição química do óleo essencial desta espécie tem sido bastante

estudada. O estudo realizado por Dadaliogl; Evrendilek (2004) revelou que a

composição química do óleo essencial das partes aéreas de Foeniculum vulgare a partir

da determinação por Cromatografia à Gás (GC) e por Espectrofotometria de massa

(MS) foi: α-pineno (0,27%), limoneno (3,77 %), estragol (5,12%), carvona (0,94%), ρ-

anisaldeido (2,61%) e trans-anetol (83,13 %).

Vários estudos biológicos têm sido realizados com o óleo essencial desta

espécie. O óleo essencial de sementes demonstrou atividades caminativa e estimulante,


43

assim como ações do espasmolíticas no músculo liso de animais. Atividades

antiinflamatórias, analgésicas e antioxidantes das sementes têm sido relatadas (SINGH;

KALE, 2008).

O essencial óleo de F. vulgare Mill. exibiu atividade antibacteriana e atividade

antiviral (RUBERTO et al, 2000). Os extratos aquosos e o etílico de sementes de erva-

doce exibiram propriedades antioxidantes potenciais in vitro em estudos (SHUKLA;

DUBEY; CHATUVEDI, 1988).

O uso de extratos de plantas e seus constituintes fitoquímicos, com conhecidas

propriedades antimicrobianas, são de grande importância terapêutica infecções. A ação

antimicrobiana deve-se a síntese de componentes do metabolismo secundário dos

vegetais, tais como óleos essenciais, compostos fenólicos e taninos. Baseado nestas

propostas, esta pesquisa investigou a ação antimicrobiana e a concentração mínima

inibitória do extrato etanólico, acetato de etila e hexânico, das sementes de Foeniculum

vulgare Mill.

2. Material e Métodos

2.1. Material botânico

Amostras das sementes de Foeniculum vulgare Mill foram adquiridas através de

compra no estabelecimento M. J. Bandeira-Produtos Naturais (localizado na Praça Dom

Vital, Nº. 101- São José-Recife-PE) em outubro de 2007.


44

O vegetal foi acondicionado em sacos plásticos e levado ao Horto do Biotério do

Departamento Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco e mantido em local

arejado, à temperatura ambiente.

Uma exsicata da espécie vegetal foi depositada no Herbário Professor Geraldo

Mariz do Departamento de Botânica/CCB/UFPE com o n ° 50.572.

2.2. Preparação dos extratos

Após a secagem, as sementes da planta foram submetidas à trituração e moagem.

Após isto, o extrato bruto etanólico (EtOH) foi obtido através da maceração do material

colhido (sementes) em álcool etílico absoluto durante sete dias à temperatura ambiente,

e após este período o material foi filtrado e separado a torta do extrato etanólico.

Este foi concentrado por meio de um rotaevaporador, em seguida uma

quantidade do material foi colocada em suspensão com água destilada e submetida a

partições sucessivas para obtenção das frações com os seguintes solventes: hexano e

acetato de etila (AcOEt), restando a fase aquosa (H2O). Os extratos alcoólicos foram

evaporados a secura para posterior utilização nos testes microbiológicos.

2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana foi verificada in vitro, pelo método de difusão em

disco de papel (BAUER; KIRBY, 1966). Os extratos foram testados frente aos

seguintes microrganismos que pertencem à coleção de microrganismos do


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Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco: Staphylococcus

aureus UFPEDA 01; Bacillus subtilis UFPEDA 16; Enterococcus faecalis UFPEDA

138; Micrococcus luteus UFPEDA 06; Escherichia coli UFPEDA 224; Pseudomonas

aeruginosa UFPEDA 39; Serratia marcescens UFPEDA 398; Mycobacterium

smegmatis UFPEDA 71; Candida albicans UFPEDA 1007.

Os microrganismos teste foram padronizados pela turvação equivalente ao tubo

0,5 da escala de McFarland em solução fisiológica (BARRY, 1986; KONEMAN,

1997), correspondente a uma concentração de aproximadamente 107UFC/mL para

leveduras e 108UFC/mL para bactérias.

Sobre o meio inoculado, Mueller Hinton agar (S. aureus, B. subtilis, M. luteus,

E. coli, P. aeruiginosa e S. marcescens); glicose extrato de levedura (E. faecalis e M.

smegmatis) e Sabouraud (C. albicans), foram colocados discos de papel xarope estéreis,

de 6 mm de diâmetro, embebidos com 10 µL da solução do extrato a 200.000 µg/mL.

Após a colocação dos discos, as placas foram incubadas durante 24 h e 48 h à

temperatura de 30 ºC e 35 ºC.

Todos os extratos brutos de F. vulgare Mill. foram testados frente às bactérias

Gram-positivas, Gram-negativas, álcool-ácido resistente e levedura. Os extratos que

apresentaram boa atividade antimicrobiana foram retestados em triplicata e os diâmetros

dos halos foram expressos pela média ± desvio padrão dos resultados obtidos nas três

repetições. Halos iguais e superiores a 10 mm foram considerados significativos de

atividade antibiótica (AWADH et al., 2001; BAKSHU; RAM; RAJU, 2001; KHAN

KHAN; KIHARA; OMOLOSO, 2001; SILVA et al., 2007; NASCIMENTO et al.,

2007). Os antibióticos kanamicina e cetoconazol foram utilizados no testes como


46

padrões, nas concentrações de 30 µg/disco e 300 µg/disco, respectivamente. A

kanamicina foi utilizada como padrão para as bactérias, enquanto o cetoconazol foi

utilizado para a levedura.

A concentração inibitória mínima (CMI) foi determinada, para os extratos que

exibiram melhores atividades antimicrobianas, pelo método de diluições seriada em

meio sólido (CARVALHO et al, 2002). Alíquotas de diferentes volumes (1,0; 0,5; 0,25;

0,125; 0,06, 0,03 e 0,01 mL) de uma solução a 20.000 µg/mL foram colocadas em placa

de Petri e homogeneizadas com 10 mL do meio de cultura ideal para o crescimento de

cada microrganismo. Os microrganismos teste foram semeados, em estrias, sobre a

superfície do meio e as placas foram incubadas à 35 ºC e 30 ºC por 24 h e 48 h. Valores

de CMI iguais ou superiores a 1000 µg/mL não foram considerados satisfatórios

(HOLETZ et al. 2002).

3. Resultados e Discussão

Os extratos etanólico e acetato de etila apresentaram atividade antimicrobiana

para as mesmas bactérias testadas (S. aureus 01; M. luteus 06; B. subtilis 16; M.

smegmatis 71 e E. faecalis 138), enquanto que o extrato hexânico apresentou ação

antimicrobiana frente a S. aureus, M. luteus e M. smegmatis.

O extrato etanólico frente às cepas 01, 06, 16, 71 e 138 apresentou halos de

inibição 11,0±1,0; 13,0±1,0; 13,6±0,6; 11,6±0,6 e 10,3±0,6, respectivamente (Tabela 1).

Estes resultados permitem afirmar que o extrato eatnólico apresenta uma atividade

antimicrobiana intermediária quando comparada ao padrão Kanamicina 30µg cujos


47

halos para as mesmas cepas foram de 23, 28, 19, 13 e 15. A concentração mínima

inibitória (CMI) foi satisfatória para as cepas 01, 06, 16 e 71 com valor de 500 µg/mL,

embora a CMI para a cepa 138 foi insatisfatória cujo valor foi de 2000 µg/mL.

Tabela 1. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

Microganismos

Extrato a 2000 µg/disco

Padrões

EBE Kanamicina (30µg/disco)

Cetoconazol (300µg/disco)

CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm S. aureus 01 11,0±1,0 23 - 500 M. luteus 06 13,0±1,0 28 - 500 B. subtilis 16 13,6±0,6 19 - 500 P. aeruginosa 39 s.a. 20 - n.t. M. smegmatis 71 11,6±0,6 13 - 500 E. faecalis 138 10,3±0,6 15 - 2000 E. coli 224 s.a. 15 - n.t. S. marcescens 398 s.a. 15 - n.t. C. albicans1007 s.a. - 24 n.t. EBE: Extrato bruto etanólico; s.a.: sem atividade; n.t: não testado.

Entretanto o extrato acetato de etila demostrou atividade antimicrobiana

considerada satisfatória uma vez que os halos de inibição frente às bactérias S. aureus

01; M. luteus 06; B. subtilis 16; M. smegmatis 71 e E. faecalis 138 de 20,3±0,6;

24,6±0,6; 19;3±1,1; 24,0±1,0; 13,7±1,1, respectivamente (Tabela 2). Resultados que se

aproximaram dos valores de halos obtidos com o padrão Kanamicina 30µg (23, 28, 19,

13 e 15) para as estirpes 01, 06, 16 e 138, enquanto que para a cepa 71 o valor obtido

pelo extrato foi superior ao do padrão. A concentração mínima inibitória foi satisfatória

para os microrganismos 01, 06, 16 e 71 cujos valores foram 125; 62,5; 125 e 125

µg/mL, respectivamante, entretanto a CMI para a cepa 138 não foi satisfatória com


48

valor de 1000 µg/mL. Estes resultados sugerem que a substâncias ou as substâncias que

possuem atividade antimicrobiana estão presentes nesta fração, podendo ainda melhorar

esta ação através da extração com um solvente mais polar.

Tabela 2. Atividade antimicrobiana de extrato bruto acetato de etila e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

Microganismos


Padrões

EBAC Kanamicina (30µg/disco)


CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm S. aureus 01 20,3±0,6 23 - 125 M. luteus 06 24,6±0,6 28 - 62,5 B. subtilis 16 19,3±1,1 19 - 125 P. aeruginosa 39 s.a. 20 - n.t. M. smegmatis 71 24,0±1,0 13 - 125 E. faecalis 138 13,7±1,1 15 - 1000 E. coli 224 s.a. 15 - n.t. S. marcescens 398 s.a. 15 - n.t. C. albicans1007 s.a. - 24 n.t. EBAC: Extrato bruto acetato de etila; s.a.: sem atividade;n.t: não testado.

Já o extrato hexânico apresentou baixa atividade antimicrobiana para as cepas

01, 06 e 71 com halos de inibição de 9,3±0,6; 9,0±1,0 e 8,6±1,1, respectivamente

(Tabela 3). Em relação ao padrão Kanamicina 30µg cujos valores foram 23, 28 e 13,

respectivamante. Os valores da concentração mínima inibitória (CMI) foram todos

insatisfatórios com valores de 1000 µg/mL para as cepas 01 e 06, e 2000 µg/mL para a

cepa 71.


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Tabela 3. Atividade antimicrobiana de extrato bruto Hexânico e CMI as sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco).

Microganismos


Padrões

EBH Kanamicina (30µg/disco)


CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm S. aureus 01 9,3±0,6 23 - 1000 M. luteus 06 9,0±1,0 28 - 1000 B. subtilis 16 s.a. 19 - s.a P. aeruginosa 39 s.a. 20 - n.t. M. smegmatis 71 8,6±1,1 13 - 2000 E. faecalis 138 s.a. 15 - n.t. E. coli 224 s.a. 15 - n.t. S. marcescens 398 s.a. 15 - n.t. C. albicans1007 s.a. - 24 n.t. EBH: Extrato bruto hexânico; s.a.: sem atividade;n.t: não testado.

A atividade antimicrobiana de F. vulgare Mill frente às bactérias Gram-positivas

verificada no presente estudo, não foi constatada para o óleo essencial extraído das

raízes, da haste, das sementes e das folhas da erva-doce pelo método da destilação de

vapor d’ água frente a S. aureus ATCC 25923 e B. subtilis (ABED, 2007).

Entretanto, o mesmo estudo de Abed (2007) confirma a ausência de inibição

frente a E. coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC 27853 encontrada no nosso estudo.

Enquanto que segundo Cantore et al (2004), o óleo essencial da semente de Foeniculum

vulgare Mill, inibiu o crescimento de cepas de importantes bactérias patogênicas de

plantas tais como: gênero de bactérias Gram-negativas (Pseudomonas, Erwinia,

Xantomonas e Agrobacterium) e gênero de bactérias Gram-positivas (Clavibacter,

Curtobacterium e Rhodococcus).


50

A ausência de atividade antifúngica dos extratos etanólico, acetato de etila e

hexânico do nosso estudo não corroboram com os resultados de Minija; Thopphil

(2002) no qual o óleo essencial das sementes de Foeniculum vulgare Mill possui

atividade contra a Candida albicans. Outros estudos também demonstraram essa ação,

tais como: o estudo adicional de Abed (2007) afirma a ação antifúngica frente à

Candida albicans no qual o óleo das sementes foi testado frente a quatro Candidas de

sítios diversos (C. albicans ATCC 10231; C. albicans- swab vaginal; C. tropicalis-

urina; C. glabrata- urina) no qual foram obtidos os seguintes halos de inibição: 20 mm;

20 mm; 18 mm; 0.0 mm, respectivamente.

O estudo realizado por Gulfraz (2008) mostrou que o óleo essencial tem

atividade antimicrobiana frente ao Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus

pumilus, Bacillus substilis, Eschericha coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus

luteus, Pseudomonos pupida, Pseudomonos syringae, e Candida albicans. No entanto o

estudo referido acima permite afirmar que os extratos testados no nosso estudo

apresentam menores efeitos antimicrobianos quando comparados ao óleo essencial, tais

quais aos extratos metanólico e etanólico utilizados por Gulfraz (2008) que

apresentaram menores efeitos antimicrobianos que o óleo essencial das sementes de F.

vulgare Mill.

A atividade antimicrobiana observada no nosso estudo para extratos brutos de F.

vulgare Mill, demonstrou que nas condições de cultivo em que as plantas e os métodos

de extração e os solventes permitem uma variação dos princípios ativos com ação

antimicrobiana, uma vez que os estudos comparativos tiveram grandes divergências.


51

Com relação aos constituintes químicos de F. vulgare Mill nos estudos

realizados os compostos mais citados são: trans-anetol, fenchona, metilcharvicol,

limoneno, α-pineno, canfeno, mirceno e α-felandreno. Destes compostos o anetol que

corresponde à 99.69% do óleo essencial presente nas sementes, sendo portanto o

constituinte principal. Vários estudos estão sendo realizados para verificar as ações do

anetol como o estudo de Patra; Midgely; Dikshit (2002) relataram que o anetol e seus

isômeros são responsáveis para atividades antimicrobianas do óleo de erva-doce.

Nenhuma publicação referiu ação antimicrobiana de extratos brutos frente à

Enterococcus faecalis e Mycobacterium smegmatis sendo, portanto, estudo o primeiro a

verificar a ação de extratos brutos da espécie para estes microrganismos.

A avaliação da concentração inibitória mínima (CMI) dos extratos das sementes

de F. vulgare Mill (acetato de etila, etanólico e hexânico), mostrou concentrações

inibitórias 62,5; 500 e 1000 µg/mL respectivamente para M. luteus.

4. Conclusão

Os extratos etanólico e acetato de etila das sementes de F. vulgare apresentaram

atividade frente a S. aures, M. luteus, B. subtilis, M. smegmatis e E. faecalis, enquanto

que o extrato hexânico mostrou uma baixa atividade frente a S. aureus, M. luteus e M.

smegmatis. O extrato acetato de etila demostrou atividade antimicrobiana considerada

satisfatória frente às bactérias S. aureus 01; M. luteus 06; B. subtilis 16; M. smegmatis

71 e E. faecalis 138 resultados que se aproximaram dos valores obtidos com o padrão

Kanamicina 30µg.


52

O uso de extratos da planta podia fornecer uma alternativa potencial para a

utilização como antibiótico, uma vez que é crescente a resistência bacteriana e se faz

necessário a descoberta de novas substâncias químicas que possam atua como

antibacteriano.

A atividade antimicrobiana observada com os extratos das sementes de F.

vulgare Mill estimularão novas pesquisas de substâncias isoladas com o intuito de ser

um alvo futuro para substituir agentes antibacterianos sintéticos.

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6. Artigo III

Artigo a ser submetido a Revista Brasileira de Plantas Medicinais


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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FOENICULUM VULGARE (MILL.) (UMBELLIFERAE/APIACEAE) FRENTE A ISOLADOS

CLÍNICOS

Rosilma de O. Araujo,*1 Ivone A. de Souza2, Kêsia X. F. R. Sena2, Dalci José Brondani; Evelyne G. Solidônio4

1 Programa de Pós-Graduação em Ciencias Farmacêuticas-Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 2 Departamento de Antibióticos -Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 3 Departamento de Ciências Farmacêuticas- Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 4 Deapartamento de Energia Nuclear- Universidade Federal de Pernambuco– UFPE, Brasil. *Contato com o autor: R. Prof. Arthur Sá, S/N, Cidade Universitária, Cep: 50.740-520, Recife-PE, Brasil/Tel: (55) 81 - 2126-8511/fax: (55) 81-2126-8510/ e-mail: [email protected] RESUMO: Foeniculum vulgare Mill. é uma herbácea da família Umbelliferae, nativa da região do Mediterrâneo e da Ásia Menor, amplamente distribuída em todo o território brasileiro. É conhecida popularmente como funcho ou erva-doce. Usado na medicina como: analgésico; digestivo; carminativo; diurético; expectorante; lactígeno; antiinflamatório; antiespasmódico. As folhas e as sementes (frutos) têm o aroma agradável. As sementes da erva-doce contem o óleo essencial no mericarpo. Faz parte oficial nas farmacopéias da maioria dos países. O óleo de erva-doce é fonte rica de anetol é largamente usado como condimento em preparações culinárias, confeitaria, licores e empregado ocasionalmente como essência de sabões. O extrato bruto etanólico foi preparado a partir de sementes compradas no estabelecimento comercial J.M. Bandeira –Recife-PE para a verificação da atividade antimicrobiana, in vitro, pelo método de difusão em disco de papel. Os microrganismos testados foram isolados clínicos multirresistentes obtidos do Setor de Bacteriologia do Hospital das Clínicas de Pernambuco. A concentração inibitória mínima (CMI) do extrato foi determinada em todos os microrganismos testados. Os resultados obtidos mostraram que o extrato etanólico apresentou maior atividade frente à Micrococcus spp.(CMI=250µg/mL). Palavras-chave: erva-doce, atividade antimicrobiana, Foeniculum vulgare. ABSTRACT: Foeniculum vulgare Mill. (Umbelliferae) it is an herbaceous plant of family Umbelliferae, native of the region of the Mediterranean and Lesser Asia, widely distributed in all the Brazilian territory. It is known popularly as fennel or grass-candy. Used in the medicine as: analgesic; digestive carminative; diuretic agent; expectorant; lactogoge; anti-inflammatory; antispasmodic. The foliage and fruits have pleasant aroma. The fennel fruits contain essential oil in oil glands in the mericarp. They are official in pharmacopoeias of most of the countries. The fennel oil is rich source of anethol and is largely used as flavoring agent in culinary preparations, confectionary and liqueurs and occasionally employed in scenting soaps. Crude ethanolic extract had been prepared from seeds bought in commercial establishment J.M, using standard


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techniques to test their in vitro antibacterial activity using the paper disk-diffusion method. The tested microorganisms had been isolated gotten physicians multiresists of the Hospital of the Clinics of Pernambuco. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the extract was determined in all the tested microorganisms. The gotten results had shown that the etanólico extract presented greater activity front Micrococcus spp. (MIC=250µg/mL). Keywords: fennel, antimicrobial activity, Foeniculum vulgare 1. Introdução

Foeniculum vulgare Mill. família Umbelliferae/Apiaceae é uma erva aromática

anual, bienal ou perene, dependendo da variedade, é conhecida desde a antiguidade na

Europa e na Ásia Menor. Segundo alguns autores, é originária do continente africano,

Ilha da Madeira e Açores; outros acreditam que é nativa da Europa Meridional e Central

e da Ásia Menor. Possivelmente, veio para o Brasil junto com os colonos portugueses

(SILVA, 2001).

As folhas, as hastes e as sementes (frutos) são comestíveis. As frutas secas

aromáticas são empregadas extensamente em preparações culinárias para condimento de

pão e pastelaria, em doces, e em licores alcoólicos do tipo francês, bem como em

preparações cosméticas e medicinais (FARRELL, 1993; HÄNSEL; KELLER;

RIMPLER, 1993).

Muitos trabalhos têm sido feitos recentemente sobre o rendimento e a

composição de extratos e óleos essenciais da erva-doce de diversas variedades e de

diversos locais. Para aspectos de classificação o trans-anetol e a fenchona são os

componentes mais importantes. No óleo essencial da erva-doce variação dulce a

quantidade de fechona geralmente não excede 5%, todavia nos tipos amargos seu índice

é elevado na maioria das vezes podendo chegar a 20%. O trans-anetol na variação Dulce


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alcança um índice de 84-90%, onde sua proporção na erva-doce amarga é de 61-70%

(LAWRENCE, 1994).

Como remédio é descrito ser analgésico, afrodisíaco, aromático, cardiotônico,

carminativo, digestivo, diurético, emenagogo, expectorante, lactígeno, estimulante,

estomacal, tônico e vermicida, sendo um remédio popular para aerofagia, amenorréia,

dores nas costas, cólera, cólica, dispepsia, enterite. Também é utilizado para feridas,

espasmos, dor de estômago, dor de dente, bronquites, pneumonia e febre tifóide

(DUKE, 1985; CORREA, 1984; JACOBS, 1995).

Vários estudos biológicos têm sido realizados com o óleo essencial desta

espécie. O óleo essencial de sementes de erva-doce demonstrou atividades caminativa e

estimulante, assim como ações espasmolíticas no músculo liso de animais

experimentais. Atividades antiinflamatórias, analgésicas e antioxidantes das sementes

da erva-doce têm sido relatadas (SINGH; KALE, 2008)

O óleo essencial da erva-doce exibiu atividade antibacteriana e atividade

antiviral (RUBERTO et al, 2000). Os extratos aquoso e etílico de sementes de erva-doce

exibiram propriedades antioxidantes potenciais em estudos in vitro (SHUKLA;

DUBEY; CHATUVEDI, 1988).

O uso de extratos de plantas e seus constituintes fitoquímicos, com conhecidas

propriedades antimicrobianas, são de grande importância terapêutica em infecções. A

ação antimicrobiana deve-se a síntese de componentes do metabolismo secundário dos

vegetais, tais como óleos essenciais, compostos fenólicos e taninos. Com base nisso,

esta pesquisa investigou a ação antimicrobiana e a concentração mínima inibitória do

extrato etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill. frente a isolados clínicos.


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2. Material e Métodos

2.1. Material botânico



Vital, Nº. 101- São José-Recife-PE) em de outubro de 2007.

O material vegetal acondicionado em sacos plásticos foi levado ao Horto do

Biotério do Departamento Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco e

mantido em local arejado, à temperatura ambiente.

Uma exsicata da espécie vegetal foi depositada no Herbário Professor Geraldo

Mariz do Departamento de Botânica/CCB/UFPE com o n ° 50.572.

2.2. Preparação do extrato

Para obtenção do extrato das sementes do Foeniculum vulgare Mill. foi utilizado

o processo de maceração. O material, após limpeza e pesagem, foi submetido a

maceração com álcool absoluto. Permaneceu em contato com o solvente por um período

de 48 horas à temperatura ambiente, sendo agitado manualmente, esporadicamente, e

mantido ao abrigo da luz. O extrato bruto etanólico (EBE) obtido após filtração foi

concentrado, à temperatura ambiente em rotaevaporador até secura.


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2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana foi verificada in vitro, pelo método de difusão em

disco de papel (BAUER; KIRBY, 1966). Discos de 6 mm de diâmetro foram

impregnados com 10 µL da solução do extrato bruto a 200.000µg/mL, de modo que

cada disco ficou com a concentração de 2.000µg/mL.

Os discos foram colocados sobre a superfície do meio semeado com as

suspensões microbianas padronizadas pela turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de

McFarland em solução fisiológica (BARRY, 1986; KONEMAN, 1997), correspondente

a uma concentração de aproximadamente 107UFC/mL para leveduras e 108UFC/mL

para bactérias, em placas de Petri. As placas foram incubadas a 35˚ C, por um período

adequado de acordo com o microrganismo. Após o período de incubação foi realizada a

leitura dos resultados, pela medição do diâmetro do halo de inibição formado em volta

do disco.

Foram considerados resultados significativos halos de 12 mm ou mais para os

isolados clínicos. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos pela

media aritmética dos diâmetros dos halos de inibição em mm e calculado o desvio

padrão. Foram usados com padrões a Ampicilina e a Cefalexina nas concentrações 10

µg e 30 µg, respectivamente. O extrato etanólico foi testado frente os isolados clínicos,

de diversas origens e setores hospitalares, obtidos e identificados no Setor de

Bacteriologia da Unidade Laboratorial do Hospital das Clínicas da UFPE. As cepas

desses microrganismos sua maioria apresentam multirresistência. Foram testadas 12

cepas de Staphylococcus aureus, 2 de Micrococcus spp. e 8 de Entecococcus spp.


61

A concentração inibitória mínima (CMI) do extrato etanólico de F. vulgare Mill

foi determinada para todos os microrganismos testados, pelo método de diluições

seriada em meio sólido (Carvalho et al. 2002). Alíquotas de diferentes volumes (1,0;

0,5; 0,25; 0,125; 0,06, 0,03 e 0,01 mL) de uma solução a 20.000 µg/mL foram

colocadas em placa de Petri e homogeneizadas com 10 mL do meio de cultura ideal

para o crescimento de cada microrganismo. Os microrganismos teste foram semeados,

em estrias, sobre a superfície do meio e as placas foram incubadas à 35 ºC e 30 ºC por

24 h e 48 h. Valores de CIM iguais ou superiores a 1000 µg/mL não foram considerados

satisfatórios (HOLETZ et al. 2002).


O extrato etanólico apresentou atividade antimicrobiana intermediária para

Staphylococcus aureus, sensível para Micrococcus spp, entretanto demonstrou baixa

atividade frente às cepas de Enterococcus faecalis.

A padronização dos halos de inibição em mm para os antibióticos utilizados nos

antibiogramas das cepas de Staphylococcus aureus, Micrococcus spp., Enterococcus

faecalis de acordo com o CLSI ( Clinical Laboratory Standards Institute / M100-S14)

estabelece que para a Ampicilina 10µg é considerado halo sensível ≥ 29, intermediário

não existe halo definido e halo resistente ≤ 28. Para a Cefalexina 30µg halo sensível ≥

18, halo intermediário 15-17 e halo resistente ≤ 14.

Para as cepas de S. aureus de numeração 1, 2, 3, 4, 9, 10 o extrato etanólico

apresentou halos de inibição de 11,3±0,6; 12,0±0,0; 13,0±1,0; 11,0± 0,0; 12,0±0,0;


62

11,3±0,6 respectivamente, estes resultados indicam uma atividade antimicrobiana baixa.

Com relação aos padrões utilizados para estes microrganismo verificou-se que as cepas

1 e 2 apresentaram resistência à Cefalexina 30µg (0,0±0,0 e 12,6± 0,6), enquanto as

cepas 3, 4, 9, 10 foram sensíveis (33,6±0,6; 26,6±0,6; 31,6± 0,6; 28,3± 0,6), para o

padrão Ampicilina 10 µg apresentaram resistência as cepas: 1, 2, 3 e 10 (0,0±0,0;

13,3±0,6; 16,6±0,6 e 22,3± 0,6), enquanto as cepas 4 e 9 foram sensíveis (39,3±0,6 e

35,6±0,6). A avaliação da concentração inibitória mínima (CMI) do extrato das

sementes de F. vulgare Mill para estas estirpes microbianas foi de 2000 µg/mL

(Tabela1).

Em relação as cepas de S. aureus de numeração 5 e 11 o extrato promoveu halos

de inibição de 14,3± 0,6 e14,6± 0,6, desta forma o extrato apresentou atividade

antimicrobiana intermediária. Em comparação com os padrões, a cepa 11 foi resistente a

Cefalexina 30µg (11,6± 0,6) e resistente a Ampicilina 10 µg (15,6±0,6), enquanto que a

cepa 5 foi sensível a Cefalexina 30µg (34,3± 0,6) e e resistente a Ampicilina 10 µg

(28,6±0,6). A concentração inibitória mínima (CMI) do extrato para estas cepas

microbianas foi de 1000 µg/mL (Tabela1).

Com relação à atividade do extrato etanólico de F. vulgare Mill frente às cepas

de Staphylococcus aureus verificou-se uma atividade satisfatória para as cepas de

numeração 6, 7, 8, 12 verificando halos de inibição de 17,0± 1,0; 16,0± 0,0; 18,0± 0,6 e

16,6± 0,6, respectivamente. Correlacionando com os padrões observou-se que as cepas

6, 7 e 8 demonstraram resistência a Cefalexina 30µg (0,0± 0,0; 0,0± 0,0 e 0,0± 0,0),

embora a cepa 12 foi sensível (29,6±0,6), o mesmo resultado também foi verificado

para a Ampicilina 10 µg onde as cepas 6, 7 e 8 foram resistentes (0,0± 0,0; 10,3± 0,6 e


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13,3± 0,6) e a cepa 12 sensível (34,6± 0,6).A concentração inibitória mínima (CMI) do

extrato para estas estirpes microbianas foi de 500 µg/mL (Tabela1).

O extrato etanólico demonstrou baixa atividade antimicrobiana para a maioria

das cepas de Enterococcus faecalis como: 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 8 apresentando halos de

inibição (10,0± 0,0; 11,3± 1,5; 11,0± 0,0; 11,3± 1,5; 8,3± 1,1; 8,3± 1,1 e 10,0 ± 1,00

respectivamente. Embora o extrato tenha demonstrado atividade intermediária frente a

cepa 6 (14,3± 0,6). Todas as cepas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 mostraram suscetibilidade

intermediária frente à Cefalexina 30µg (15,6± 0,6; 14,3± 0,6; 16,6± 0,6; 17,3± 2,0;

16,6± 0,6; 15,6± 0,6; 16,3± 1,1 e 17,3± 2,0). Da mesma maneira todas as cepas 1, 2, 3,

4, 5, 6, 7 e 8 foram sensíveis a Ampicilina 10 µg (39,6± 0,6; 37,6± 0,6; 38,3± 0,6;

36,6± 0,6; 37,6± 0,6; 36,0± 1,0; 37,3 ± 0,6 e 38,6± 0,6). A concentração inibitória

mínima (CMI) do extrato para as estirpes microbianas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 foi de 2000

µg/mL e para a cepa 6 foi de 1000 µg/mL (Tabela 2).

Para as estirpes de Micrococcus spp de numeração 1 e 2 o extrato apresentou

halos de inibição de 20,3±0,6 e 24,0±1,0, permitindo concluir que o mesmo possui

atividade satisfatória frente a estas cepas. Com relação aos padrões utilizados para estes

microrganismos verificou-se que as cepas 1 e 2 foram sensíveis à Cefalexina 30µg

(35,3± 0,6 e 35,6± 0,6), para o padrão Ampicilina 10 µg apresentaram também

sensibilidade (36,3± 0,6 e 34,6± 0,6). A concentração inibitória mínima (CMI) do

extrato para as estirpes 1 e 2 foi de 250µg/mL e 500 µg/mL, respectivamente (Tabela

3).

Os resultados obtidos em relação às cepas de S. aureus mostraram-se muito

variáveis, uma vez que cada cepa apresentava um padrão de resistência diferente entre si


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à antibióticos padronizados e previamente testados no local de coleta, onde algumas

cepas eram multirresitentes, enquanto outras eram bastante sensíveis.

Em relação aos Enterococcos faecalis como geralmente são cepas

freqüentemente multirresistentes, os resultados obtidos eram esperados. E para as cepas

de Micrococcus spp o extrato demonstrou boa atividade antimicrobiana.

Em comparação com outros trabalhos a atividade antimicrobiana de F. vulgare

Mill frente às bactérias Gram-positivas verificada no presente estudo, não foi constatada

para o óleo essencial extraído das raízes, da haste, das sementes e das folhas da erva-

doce pelo método da destilação de vapor da água frente a S. aureus ATCC 25923 e B.

subtilis (ABED, 2007).

Estudos realizados por Mininja; Thoppil (2002) demonstraram que o óleo

essencial das sementes de Foeniculum vulgare Mill. possui atividade antimicrobiana

contra bactérias e fungos, principalmente contra a Candida albicans. A atividade

antimicrobiana é atribuída a presença de componentes biologicamente ativos presentes

no óleo essencial, principalmente o anetol que corresponde à 99.69% do óleo essencial

presente nas sementes.

Segundo Cantore et al (2004), o óleo essencial da semente de Foeniculum

vulgare Mill, inibiu o crescimento de cepas de importantes bactérias patogênicas de

plantas tais como: gênero de bactérias Gram-negativas (Pseudomonas, Erwinia,

Xantomonas e Agrobacterium) e gênero de bactérias Gram-positivas (Clavibacter,

Curtobacterium e Rhodococcus).

Vários estudos referentes à atividade antimicrobiana estão sendo realizados com

Foeniculum vulgare Mill, entretanto a maioria dos estudos é realizada com bactérias de


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origem padronizada ATCC ou de coleções microbianas. Por isso a ausência de dados

referentes a estudos antimicrobianos com cepas de isolados clínicos dificulta a nossa

discussão.

Tabela1. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Staphylococcus aureus.

Microganismos

Extrato a 2000 µg/disco Padrões

EBE Cefalexina 30µg

Ampicilina 10 µg

CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm (X±δ) 1.[21231] S. aureus 11,3 ± 0,6 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 2000 2.[20981] S. aureus 12,0 ± 0,0 12,6 ± 0,6 13,3 ± 0,6 2000 3.[21036] S. aureus 13,0 ± 1,0 33,6 ± 0,6 16,6 ± 0,6 2000 4.[20489] S. aureus 11,0 ± 0,0 26,6 ± 0,6 39,3 ± 0,6 2000 5.[20794] S. aureus 14,3 ± 0,6 34,3 ± 0,6 28,6 ± 0,6 1000 6.[20905] S. aureus 17,0 ± 1,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 500 7.[20092] S. aureus 16,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 10,3 ± 0,6 500 8.[20449] S. aureus 18,0 ± 0,6 0,0 ± 0,0 13,3 ± 0,6 500 9.[19924] S. aureus 12,0 ± 0,0 31,6 ± 0,6 35,6 ± 0,6 2000 10.[20696] S. aureus 11,3 ± 0,6 28,3 ± 0,6 22,3 ± 0,6 2000 11.[21141] S. aureus 14,6 ± 0,6 11,6 ± 0,6 15,6 ± 0,6 1000 12.[S.IDT] S. aureus 16,6 ± 0,6 29,6 ± 0,6 34,6 ±0,6 500 EBE: Extrato bruto etanólico; S. aureus: Staphylococcus aureus; S.IDT: sem identificação Tabela 2. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. Realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Entecococcus faecalis.

Microganismos



Ampicilina 10 µg

CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm 1.[21675] E. faecalis 10,0 ± 0,0 15,6 ± 0,6 39,6 ± 0,6 2000 2.[21752] E. faecalis 11,3 ± 1,5 14,3 ± 0,6 37,6 ± 0,6 2000 3.[21944] E. faecalis 11,0 ± 0,0 16,6 ± 0,6 38,3 ± 0,6 2000 4.[24614] E. faecalis 11,3 ± 1,5 17,3 ± 2,0 36,6 ± 0,6 2000 5.[24622] E. faecalis 8,3 ± 1,1 16,6 ± 0,6 37,6 ± 0,6 2000 6.[24708] E. faecalis 14,3 ± 0,6 15,6 ± 0,6 36,0 ± 1,0 1000 7.[24902] E. faecalis 8,3 ± 1,1 16,3 ± 1,1 37,3 ± 0,6 2000 8.[25392] E. faecalis 10,0 ± 1,0 17,3 ± 2,0 38,6 ± 0,6 2000 EBE: Extrato bruto etanólico; E. faecalis: Enterococcus faecalis


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Tabela 3. Atividade antimicrobiana de extrato bruto etanólico e CMI das sementes de Foeniculum vulgare Mill. Realizada a partir da planta seca (2000 µg/disco) frente a cepas de Micrococcus spp.

Microganismos



Ampicilina 10 µg

CMI (µg/mL)

Halos de inibição em mm 1.[21061] Micrococcus spp 20,3±0,6 35,3 ± 0,6 36,3 ± 0,6 250 2.[21068] Micrococcus spp 24,0±1,0 35,6 ± 0,6 34,6 ± 0,6 500 EBE: Extrato bruto etanólico;

4. Conclusão

O extrato etanólico das sementes de F. vulgare Mill. apresentou atividade

intermediária frente a S. aureus, satisfatória para Micrococcus spp e baixa para E.

faecalis.Vale ressaltar que esse resultados são de extrema importância pelo fato das

amostras testadas serem multirresistentes e isoladas de ambiente hospitalar.

A atividade antimicrobiana observada para os extratos das sementes de F.

vulgare Mill. representa mais uma alternativa terapêutica para infecções com

microrganismos resistentes aos antibióticos sintéticos.

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7. Artigo IV

Artigo a ser submetido a Revista Brasileira de Farmacognosia


70

PERFIL FITOQUÍMICO E ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE ANALGÉSICA DO EXTRATO BRUTO DAS SEMENTES DE Foeniculum

vulgare Mill (UMBELLIFERAE/APICIAE)

Rosilma de O. Araujo,*1 Ivone A. de Souza2, Kêsia X. F. R. Sena2, Dalci José Brondani3, Haroudo Sátiro Xavier3, Evelyne G. Solidônio4

1 Programa de Pós-Graduação em Ciencias Farmacêuticas-Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 2 Departamento de Antibióticos -Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 3 Departamento de Ciências Farmacêuticas- Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Brasil. 4 Deapartamento de Energia Nuclear- Universidade Federal de Pernambuco– UFPE, Brasil. *Contato com o autor: R. Prof. Arthur Sá, S/N, Cidade Universitária, Cep: 50.740-520, Recife-PE, Brasil/Tel: (55) 81 - 2126-8511/fax: (55) 81-2126-8510/ e-mail: [email protected] RESUMO:

A erva-doce (Foeniculum vulgare Mill) foi usada por séculos na área mediterrânea como uma erva aromática e igualmente na medicina popular, devido às propriedades farmacológicas de seu óleo essencial. Tipicamente, suas preparações são usadas para curar as várias desordens, atuando como carminativo, digestivo e lactogogo. O presente trabalho compreendeu um perfil fitoquímico das frações obtidas a partir do extrato bruto etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill, bem como verificou a atividade antinociceptiva do extrato etanólico. O estudo fitoquímico identificou a maioria dos compostos secundários presentes na fração metanólica das sementes do vegetal, foram observados: triterpenos, glicosídeos de flavanóides, terpenos menores (monoterpenóides, sesquiterpenóide e diterpenóides) e açucares redutores. Os resultados da avaliação da atividade antinociceptiva demonstraram que apenas a dosagem de 298 mg/Kg quando comparado com o padrão indometacina conseguiu uma redução significativa no numero de contorções abdominais dos animais. Estudos posteriores deverão ser realizados para a identificação e isolamento de alguns compostos secundários, bem como a realização de outros protocolos de analgesia.

ABSTRACT:

The grass-candy (Foeniculum vulgare Mill) was used per centuries in the Mediterranean area as a aromatical grass and equally in the popular medicine, had to the farmacological properties of its essential oil. Typically, its preparations are used to cure some clutters, acting as carminativo, digestive and lactogogo. The present work understanded a phytochemical profile of the fractions gotten from the ethanolic rude extract of the seeds of Foeniculum vulgare Mill, as well as verifyed the antinociceptive activity of the ethanolic extract. The phytochemical study it identified to the majority of secondary composites gifts in the metanolic fraction of the seeds of the vegetable, had


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been observed: lesser triterpenoids, glycosides of flavanoids, terpenos (monoterpenoids, sesquiterpenoids and diterpenoids) and you sweeten reducing. The results of the evaluation of the antinocipeptive activity had demonstrated that only the dosage of 298 mg/Kg when compared with the indometacina standard it obtained a significant reduction in it number of abdominal contorções of the animals. Posterior studies will be to carry out for the identification and isolation of some secondary composites, as well as the accomplishment of other protocols of analgesia.

1. Introdução

Foeniculum vulgare, também conhecido pelo nome de funcho, falso anis,

finóquio e erva-doce-brasileira, é nativo na Europa mediterrânea, norte da África e Ásia

ocidental, sendo amplamente cultivado em todo o Brasil, principalmente em quintais.

As maiores produções brasileiras são encontradas no Paraná. Mas encontram-se também

áreas de produção comercial no agreste nordestino, especialmente na Paraíba,

Pernambuco e Sergipe, quase sempre em sistema de agricultura familiar. Foi

introduzido no Brasil no início da colonização, pelos italianos, aclimatando-se tão bem

que hoje é encontrado em estado espontâneo em alguns locais (JACOBS,1995).

Foeniculum vulgare Mill. pertence à família botânica, Umbelliferae. Outros

nomes incluem shamer, finocchio, carosella e erva-doce de Florença. É uma erva

aromática, diurética que alivia problemas digestivos, aumenta o fluxo de leite, relaxa

espasmos e reduz a inflamação com propriedades expectorante, carminativa e

aromática. Os extratos da planta têm sido usados como antiespasmódico, diurético,

analgésico e antipirético e têm propriedades antimicrobianas; pode igualmente ser usado

para desordens de pele, conjuntivite e blefarite dos olhos (RUBERTO et al., 2000)

Trabalhos prévios mostraram que o óleo essencial de Foeniculum vulgare Mill.

contém anetol, estragol e fenchona mais uns 18 componentes adicionais os quais

incluem α-pineno, camfeno, β-pineno, α-felandreno, myrceno, limoneno, β-felandreno,


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o γ-terpineno, o cis-ocimeno, terpinoleno, carvacol, cânfora, borneol, cineol e p-cimeno

(KARLSEN, 1969; KWON, 2002; RUBERTO et al., 2000; MIMICA-DUKIC, 2003).

Estes compostos, especial carvacol, borneol, cânfora e anetol, foram relatados por inibir

o crescimento de infestações de Phytophora. A produção de esporangial foi inibida pelo

óleo essencial da erva-doce (SOYLU; SOYLU; KURT, 2006)

O anetol é o principal componente ativo das sementes de erva-doce o qual exibiu

a atividade anticancerígena (SINGHI; KALE, 2008). A atividade antitumoral do anetol

frente ao carcinoma ascítico de Ehrlich foi relatada (AL HARBI et al, 1995).

Os principais componentes do óleo essencial das sementes de erva-doce são

trans-anetol, fenchona, e estragol (carvicol metílico) no caso do ssp. vulgare e R-

phellandrene no ssp. piperitum. A concentração relativa destes compostos varia

consideravelmente dependendo da origem e do estado fenológico do vegetal. Como

suas sementes, suas hastes apresentam igualmente um aroma do como o Anis e são

usadas como condimentos. O odor produzido por esta e por outras plantas aromáticas é

causado por seus compostos voláteis. O acumulo destes compostos dentro da planta é

variável, parecendo praticamente em qualquer uma destas partes (raízes, hastes, folhas,

flores, e frutas ou sementes) (DÍAZ-MAROTO et al, 2006 ).

A composição química do óleo essencial da erva-doce e da fração volátil de

diferentes partes da planta já tem sido descrito na literatura. Entretanto, a ocorrência de

outros compostos não-voláteis, tais como ácidos fenólicos e flavonóides, não recebeu

muita atenção (PAREJO et al, 2004).

O óleo essencial das sementes do funcho demonstrou atividades carminativas e

estimulantes assim como ações do espasmóliticas no músculo liso de animais


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experimentais (LEUNG; FOSTER, 1996). As atividades antiinflamatória, analgésica e

antioxidante da fruta da erva-doce foram relatadas por Choi e Hwang (2004). O óleo

essencial da erva-doce exibiu atividade anti-bacteriana (RUBERTO et al, 2000) e a

atividade antiviral (SHUKLA; DUBEY; CHATUVEDI, 1988). Os extratos aquosos e

etanólico das sementes de erva-doce exibiram potenciais propriedades antioxidantes em

estudos in vitro (OKTAY; GULCIN; KUFREVIOGLU, 2003). Extratos metanólicos da

planta inteira administrada por quatro dias sucessivos melhorou o efeito amnésico da

escopolamina (0.4 mg/kg) e o envelhecimento induziu déficits de memória nos ratos.

Esta propriedade da planta pode ser útil para o tratamento de desordens cognitivas como

demência e doença de Alzhemier (JOSHI, 2006).

A atividade antimicrobiana de óleos essenciais é atribuída a um número

terpenóides menores e de compostos fenólicos, os quais demonstram a atividade

antibacteriana elevada quando isolados (CONNER, 1993).

O presente trabalho compreendeu um perfil fitoquímico das frações obtidas a

partir do extrato bruto etanólico das sementes de Foeniculum vulgare Mill através do

emprego de cromatografia de camada delgada empregando reveladores específicos para

cada classe de metabólitos, bem como verificou a atividade antinociceptiva do extrato

etanólico.

2. Materiais e Métodos

2.1 Local de Trabalho

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Farmacognosia do

Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal de Pernambuco.


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2.2 Identificação do Material Botânico

A exsicata da espécie vegetal foi identificada pela Drª. Marlene Barbosa, botânica

do Herbarium Geraldo Mariz, UFPE, e armazenada neste herbarium sob numero

50.572.

2.3 Obtenção do Material Botânico



Vital, Nº. 101- São José-Recife-PE) no período de outubro de 2009.

Para obtenção do extrato das sementes do Foeniculum vulgare Mill. foi utilizado o

processo de maceração. O material, após limpeza e pesagem, foi submetido à

maceração com álcool absoluto. Permaneceu em contato com o solvente por um período

de 48 horas à temperatura ambiente, sendo agitado manualmente, esporadicamente, e

mantido ao abrigo da luz. O extrato bruto etanólico (EBE) obtido após filtração foi

concentrado, à temperatura ambiente em rotaevaporador até secura.

2.4 Investigação fitoquímica

Para a execução dos ensaios fitoquímicos cerca de 3 g do extrato bruto etanólico

seco foi submetido à infusão metánolica, hexânica, acetato de etila, butanólica e acetona

durante 30 minutos. Alíquotas destes extratos (10µL) foram submetidas à cromatografia

em camada delgada analítica (CCDA), empregando-se como fase estacionária placas

cromatográficas prontas de gel de sílica (Merck-Alemanha, art.105554), diversas fases

móveis e reveladores consoante a classe de compostos a analisar (Tabela 1).


75

Esta investigação fitoquímica colocou em evidências os principais tipos de

metabólitos secundários: Alcalóides, terpenóides (monoterpenóides, sesquiterpenóides,

diterpenóides, triterpenóides, esteróides, iridóides, saponósideos), e polifenóis

(cumarinas, derivados cinâmicos, taninos, fenilpropanoglicoseideos, flavonóides e

proantocianidinas) e açúcares redutores.

Tabela 1 – Metabólitos, sistemas de eluição, reveladores e referencias bibliográficas utilizadas para a investigação fitoquímica de Foeniculum vulgare Mill.

Metabólito Sistema de eluição Revelador Referência

Alcalóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

100: 11: 11: 26 v/v Dragendorff Wagner (1996)

Monoterpenoides, sesquiterpenóide e diterpenóides

Tolueno-AcOEt 97:3

Vanilina sulfúrica

Wagner (1996)

Triterpenóides, Esteróides

Tolueno-AcOEt 90:12

Liebermn-Burchard

Wagner (1996)

Iridóides AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

100: 11: 11: 26 v/v Vanilina sulfúrica

Harbone (1998)

Saponinas -------- Afrogenicidade Schenkel, Gosman,

Athayde (2000)

Cumarinas AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

100: 11: 11: 26 v/v U.V. Wagner (1996)

Derivados cinâmicos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

100: 11: 11: 26 v/v NEU Wagner (1996)

Fenilpropanoglicosídeos AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O

100: 11: 11: 26 v/v NEU Wagner (1996)

Flavanóides

AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O 100: 2: 2: 2 v/v


NEU Markham (1982) Harbone (1998)

Proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas


Vanilina clorídrica

Robertson (1956)


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2.5 Contorções abdominais

Cinco grupos de 6 camundongos cada, mantidos em jejum de 6 a 12 horas foram

tratados por via oral (gavagem) com o extrato etanólico nas dosagens de 74,5 , 149 e

298 mg/ Kg , indometacina (10mg/ Kg) e controle (NaCl 0,9%). Após 60 minutos do

tratamento, foi administrado ácido acético a 1% diluído em salina (0,1ml/ 10g, i.p.).

As contrações da parede abdominal seguido de torções do tronco e extensão dos

membros posteriores (KOSTER; ANDERSON; BEER, 1959) produzidas pelo ácido

acético foram contadas durante 30 minutos. Os resultados foram expressos como o

número de contorções abdominais acumuladas a cada 5 minutos durante 30 minutos.


Conforme demonstrado na tabela 2, a abordagem fitoquímica da espécie F. vulgare

Mill. realizada na fração metanólica e na fração acetato de etila das sementes do vegetal,

indicou a marcante presença de triterpenos, glicosídeos de flavanóides, terpenos

menores (monoterpenóides, sesquiterpenóide e diterpenóides) e açucares redutores.

Enquanto que na fração hexânica não foram observados os glicosídeos de flavanóides,

embora alguns derivados cafeoil foram visualizados. A ausência dos compostos

polifenóis nesta fração pode ser explicada pelo fato deste composto ser bastante polar

devido à presença de hidroxilas no mesmo.

A presença de polifenóis está de acordo com os dados da literatura que apontam

somente alguns agliconas e os flavonóides glicosídeos têm sido relatados na erva-doce

var.amarga, considerando que o ácido clorogênico, os derivados do ácido


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hidroxibenzóico, os glicosídeos de flavonóides e algumas cumarinas foram

identificados na erva-doce var.doce (PAREJO et al, 2004).

Os polissacarídeos foram verificados no extrato, ocorrendo a presença do açúcar

(glicose). Os polissacarídeos pertencem a uma importante classe dos produtos naturais

dotados de atividade bioativas como: antiinflamatórios, antivirais, hipoglicemiantes,

anticoagulantes, imunoestimuladores, antitumorais e como quimioprevenção a diversos

tipos de câncer (SIMÕES, 2004).

Na fração acetônica foram visualizados monoterpenóides, sesquiterpenóide e

diterpenóides, bem como triterpenos dentre os quais se pode identificar o β-sitosterol.

Estes compostos terpenóides são as primeiras substancias que compõem as misturas

chamadas óleos voláteis e são os responsáveis por atividades farmacológicas com anti-

séptico e expectorante, bem como bactericida fungicida, analgésica e antitumoral, dados

já relatados sobre o óleo essencial de F. vulgare Mill (MENDES, 2004). Todos os

outros grupos investigados não foram constatados, nem mesmo como traços.

Tabela 2 - Metabólitos secundários das frações das sementes de F. vulgare Mill. Metabólitos Frações

Metanólica Hexânica Acetato de etila

Butanólica Acetônica

Alcalóides - - - - - Monoterpenóides, sesquiterpenóides e diterpenóides

- - +++ - +++

Triterpenóides +++ - +++ - +++ Iridóides - - - - - Saponinas - - - - - Açúcares redutores +++ - - - - Flavanóides +++ + + + + - - - - - Expressão dos resultados: (+) = positivo; (-) = negativo; (+++) = fortemente positivo


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Os resultados obtidos com a administração prévia do extrato etanólico de F.

vulgare Mill, nas doses de 298, 149 e 74,5 mg/Kg demonstraram que apenas a dosagem

de 298 mg/Kg quando comparado com o padrão indometacina conseguiu uma redução

significativa no numero de contorções abdominais dos animais. As demais dosagens

apresentaram efeito dose-resposta, uma vez que a diminuição gradativa das dosagens

implicou em resultados semelhantes aos obtidos com o controle salina (Figura 1).

Gráfico 1. Efeito do extrato etanólico de F. vulgare Mill. nas dosagens de 298, 149 e 74,5 mg/Kg nas contorções abdominais em camundongos. Resultados expressos em média ±desvio padrão. *P <. 0,05 vs. controle

Uma vez que este teste permite a avaliação de substâncias analgésicas de ação

central e/ou periféricas dotadas dos mais variados mecanismos de ação, os resultados

obtidos neste trabalho corroboram com o estudo de Choi; Hwang (2004) no qual a

administração oral de 200 mg/kg do extrato metanólico de F. vulgare Mill. reduziu

significativamente a estimulação térmica do hot-plate. O teste do Hot-plate é usado

normalmente para estudar os efeitos analgésicos centrais das drogas.


79

Conseqüentemente, é provável que o extrato metanólico de F. vulgare Mill. produza

seus efeitos analgésicos centralmente ou, como já conhecido para os AINE’S, pois ele

inibiu os receptores da dor no local da inflamação.

Os estudos de Choi; Hwang, 2004 também relataram a administração oral do

extrato metanólico das sementes da erva-doce exibiu efeito inibitório frente às doenças

inflamatórias agudas e subagudas e reações alérgicas tipo IV e mostrado um efeito

analgésico central. E significativamente um aumento das atividades específicas da

superóxido dismutase (SOD) e da catalase, assim como significativamente diminuição

do nível da lipropoteína de alto peso molecular do colesterol junto com uma diminuição

no dano peroxidativo.

Alguns estudos adicionais são necessários para explicar inteiramente o

mecanismo da ação da atividade analgésica do extrato etanólico de F. vulgare Mill.

4. Conclusão

O estudo fitoquímico identificou a maioria dos compostos secundários estavam

presentes na fração metanólica e na fração acetato de etila das sementes do vegetal,

foram observados: triterpenos, glicosídeos de flavanóides, terpenos menores

(monoterpenóides, sesquiterpenóide e diterpenóides) e açucares redutores.

Os resultados da avaliação da atividade antinocipeptiva demonstraram que apenas

a dosagem de 298 mg/Kg quando comparado com o padrão indometacina conseguiu

uma redução significativa no numero de contorções abdominais dos animais.


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Estudos posteriores deverão ser realizados para a identificação e isolamento de

alguns compostos secundários, bem como a realização de outros protocolos de

analgesia.

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.


84

8. Conclusões


85

8. CONCLUSÕES - O extrato etanólico das sementes de F. vulgare Mill. apresentou ausência de

toxicidade oral e moderada toxicidade intraperitoneal;

- Os extratos etanólico, hexânico e acetato de etila das sementes de F. vulgare Mill.

apresentaram atividade frente a bactérias Gram-positivas, e não foi observada ação

antimicrobiana frente às Gram-negativas;

- O extrato acetato de etila demostrou atividade antimicrobiana considerada

satisfatória frente às bactérias S. aureus; M. luteus; B. subtilis; M. smegmatis e E.

faecalis resultados que se aproximaram dos valores obtidos com o padrão

Kanamicina 30µg.

- O extrato etanólico das sementes de F. vulgare Mill. apresentou para as amostras

testadas e isoladas de ambiente hospitalar multirresistentes: atividade intermediária

frente a S. aures, satisfatória para M. spp e baixa para E. faecalis.

- O estudo fitoquímico identificou que a maioria dos compostos secundários estavam

presente na fração metanólica e na fração acetato de etila das sementes do vegetal e

foram observados: triterpenos, glicosídeos de flavanóides, terpenos menores

(monoterpenóides, sesquiterpenóide e diterpenóides) e açucares redutores;

- Os resultados da avaliação da atividade antinocipeptiva demonstraram que o extrato

etanólico apresentou atividade analgésica moderada;


86

9. Referências Bibliográficas


87

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Investigação da Atividade Biológica de Foeniculum vulgare ... · CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ANTÔNIO RODOLFO DE FARIA VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS