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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA
ANA CAROLINA CABRAL CARVALHAES COSTA
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS LÁTICAS PRODUTORAS DE BACTERIOCINAS E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE
FRENTE A PATÓGENOS ALIMENTARES EM SISTEMA DE BIOCONSERVAÇÃO DE PRODUTO LÁCTEO
Goiânia 2016
ANA CAROLINA CABRAL CARVALHAES COSTA
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS LÁTICAS PRODUTORAS DE BACTERIOCINAS E AVALIAÇÃO DE SUA ATIVIDADE
FRENTE A PATÓGENOS ALIMENTARES EM SISTEMA DE BIOCONSERVAÇÃO DE PRODUTO LÁCTEO
Dissertação de mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás, como exigência para a obtenção do título de mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Flávio Alves da Silva Co-Orientadora: Profª. Dra. Virgínia Farias Alves
Goiânia 2016
A Deus, que guia meus passos, ilumina meus caminhos e me
dá forças. Ao meu esposo Eduardo, por todo apoio,
compreensão e todo companheirismo. Aos meus pais,
Roberto e Ana, por todo empenho ao longo desses anos em
minha criação e formação e por todo amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus o dom da vida, seu amor e misericórdia infinitos, por traçar planos tão belos para mim. A meus pais e irmão, a compreensão das ausências, todo esforço, toda abdicação ao longo da vida em nosso favor. Quero sempre poder honrá-los. A meu esposo, meu companheiro de todas as horas. Ao professor Flávio Alves da Silva, a orientação e o auxílio prestados. A professora Virgínia, a confiança depositada, a compreensão, o esforço em ajudar, e todo incentivo. As colegas de pesquisa Luíza Toubas, Aline Neves, Adrielle Silva, Larissa Gonçalves, toda ajuda na concretização desse trabalho, sem vocês eu não teria conseguido. A todos da Faculdade de Farmácia e aos amigos do Centro Analítico em Controle Qualidade de Alimentos e Medicamentos, a acolhida, o apoio e a amizade de sempre.
A dona Vilma, que com muito carinho sempre procura ajudar os alunos. A professora Keyla, a paciência, o enorme empenho em ajudar. Saber que ainda existem pessoas que se dispõe a ajudar outras que mal conhecem nos dá esperança para um mundo melhor. A Vanessa Maciel e profª. Dr. Elaine de Martinis, os materiais emprestados, e todo auxílio. Ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP e ao Centro de Sequenciamento de Ácidos Nucléicos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Aos amigos, que também compreendem as ausências e torcem pelo nosso sucesso. Aos amigos do Lanagro-GO, todo apoio, carinho e força.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás.
Muito obrigada!
RESUMO
Devido à sua atividade antagonística contra micro-organismos indesejáveis, as bactérias ácido láticas (BAL) constituem uma alternativa promissora para a conservação e melhora da segurança de alimentos. O objetivo deste trabalho foi isolar, a partir de queijo Minas frescal, BAL produtoras de bacteriocinas com potencial para utilização em sistemas de bioconservação de produtos lácteos. Para tanto, amostras de queijo foram avaliadas no início e final de sua vida útil e o isolamento das BAL realizado por plaqueamento em ágar MRS. Verificou-se a atividade inibitória das bactérias pelo de ensaio de antagonismo em ágar usando Listeria monocytogenes ATCC 7644 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 como micro-organismos indicadores. As BAL selecionadas nessa etapa foram submetidas aos testes spot-on-the-lawn, coloração de Gram, produção da catalase e oxidase e metabolismo da glicose em meio Hugh e Leifson. Descartou-se ocorrência de inibição pela produção de ácidos orgânicos e por bacteriófagos. A natureza proteica das substâncias antagonísticas foi confirmada utilizando-se proteases. Após realização do ensaio well diffusion, quatro BAL com atividade antagonística satisfatória frente aos micro-organismos indicadores utilizados foram selecionadas para identificação por sequenciamento do gene 16S do RNA. Todas foram identificadas como Lactococcus lactis. Com base nos testes de antagonismo, a cepa Lactococcus lactis QMF 11 foi selecionada para utilização no ensaio de co-inoculação com patógenos em leite pasteurizado mantido a 8oC por 10 dias. Lactobacillus sakei ATCC 15521 foi usado como controle negativo para produção de bacteriocinas. Após o período de incubação, Listeria monocytogenes em monocultura atingiu 8 log UFC/mL e na presença de Lactobacillus sakei chegou a 7,3 log UFC/mL. Entretanto, quando co-inoculada com Lactococcus lactis QMF11, as médias das contagens do patógeno ao final do experimento não ultrapassaram 2,3 log UFC/mL. Em relação a Staphylococcus aureus, as contagens finais foram: 5,4 log UFC/mL (monocultura), 5,0 log UFC/mL (co-inoculado com L. sakei) e 4,7 log UFC/mL (co-inoculado com Lactococcus lactis QMF 11). Apesar da menor inibição do crescimento de Staphylococcus aureus, em comparação à Listeria monocytogenes, sua multiplicação foi significantemente afetada (p<0.005) pela presença de Lactococcus lactis QMF 11, indicando que a cepa tem potencial para uso como cultura bioconservadora em produtos lácteos.
Palavras-chave: bactérias ácido láticas; biopreservação; Lactococcus lactis; Listeria
monocytogenes; Staphylococcus aureus.
ISOLATION OF BACTERIOCIN - PRODUCING LACTIC ACID BACTERIA AND THEIR ACTIVITY AGAINST FOOD PATHOGENS IN A BIOPRESERVATION
SYSTEM OF DAIRY PRODUCTS
ABSTRACT
Due to their antagonistic activity against undesirable microorganisms, lactic acid bacteria (LAB) are a promising alternative for conservation and improvement of food safety. The aim of this work was isolate, from fresh Minas cheese, bacteriocin producing LAB with potential for use in biopreservation systems of dairy products. For this purpose, cheese samples were evaluated at the beginning and end of their shelf life and the isolation was performed by surface plating on MRS agar. The antimicrobial activity was verified by antagonism assay using Listeria monocytogenes ATCC 7644 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 as indicators microorganisms. The selected LAB were submitted to the spot-on-the-lawn test, Gram stain, catalase and oxidase production and glucose metabolism in Hugh & Leifson broth. The occurrence of inhibition due to the production of organic acids and bacteriophages was discarded. The protein nature of antagonistic substances was confirmed by using proteases. After the well-diffusion assay, four LAB with satisfactory antagonistic activity against the indicators microorganisms were selected for identification by sequencing of the 16S RNA gene. All bacteria were identified as Lactococcus lactis. Based on antagonism assay, Lactococcus lactis QMF 11 was selected for use in co-inoculation studies with pathogens in pasteurized milk, kept at 8°C for 10 days. Lactobacillus sakei ATCC 15521 was used as negative control for bacteriocin production. After incubation period, monocultures of Listeria monocytogenes reached 8 log cfu mL-1 and in the presence of Lactobacillus sakei ATCC its population achieved 7.3 log cfu mL-1. However, when co-inoculated with Lactococcus lactis QMF 11, Listeria monocytogenes counts were maintained at the initial inoculum levels, not surpassing 2.3 log cfu mL-1 at the end of analysis. Regarding to Staphylococcus aureus, in the end of the experiment, cultures counts were 5.4 log cfu mL-1 (monocultures), 5.0 log cfu mL-1 (co-inoculation with Lactobacillus sakei) and 4.7 log cfu mL-1 (co-inoculation with Lactococcus lactis QMF 11). Despite the lower growth inhibition in comparison with Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus growth was significantly affect (p < 0.005) by the presence of Lactococcus lactis QMF 11, indicating that this strain has potential for use as biopreservative culture in dairy products.
Key words: Lactic acid bacteria; biopreservation; Lactococcus lactis, Listeria
monocytogenes; Staphylococcus aureus.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 8
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................................ 11
2.1 Doenças Transmitidas por Alimentos................................................................... 11
2.2 Listeria monocytogenes e listeriose............................................................................ 12
2.3 Staphylococcus aureus produtor de enterotoxinas.................................................. 13
2.4 Bactérias ácido láticas e bacteriocinas..................................................................... 14
2.5 Aplicação de bactérias ácido láticas e bacteriocinas em produtos lácteos............ 16
3 OBJETIVOS............................................................................................................... 19
3.1 Objetivo geral............................................................................................................. 19
3.2 Objetivos específicos.................................................................................................. 19
4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 20
4.1 Isolamento das Bactérias Ácido Láticas (BAL) a partir de queijo Minas frescal 21
4.2 Teste Spot-on-the-lawn …………………………………………….….…………… 21
4.3 Verificação da inibição por bacteriófagos................................................................ 22
4.4 Teste do metabolismo da glicose............................................................................... 22
4.5 Verificação da natureza proteica das substâncias antagonísticas......................... 23
4.6 Ensaio de difusão em poços (Well diffusion assay).................................................. 23
4.7 Identificação das Bactérias Ácido Láticas (BAL)................................................... 24
4.8 Experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado........................................... 25
4.9 Análises estatísticas.................................................................................................... 28
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 29
5.1 Isolamento das Bactérias Ácido Láticas (BAL) a partir de queijo Minas frescal 29
5.2 Teste Spot-on-the-lawn …………………………………………….…………….... 30
5.3 Verificação da inibição por bacteriófagos............................................................... 32
5.4 Teste do metabolismo da glicose.............................................................................. 33
5.5 Verificação da natureza proteica das substâncias antagonísticas......................... 34
5.6 Ensaio de difusão em poços (Well diffusion assay)................................................. 35
5.7 Extração de DNA, amplificação genética e sequenciamento de Bactérias Ácido Láticas (BAL).............................................................................................................
39
5.8 Experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado........................................... 40
6 CONCLUSÕES......................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS........................................................................................................ 51
8
1 INTRODUÇÃO
As Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) são tipicamente causadas por bactérias
ou seus metabólitos, parasitas, vírus ou toxinas e representam problema de saúde pública
mundial. A importância das diferentes DTA varia entre países, dependendo dos tipos de
alimentos consumidos e sensibilidade da população (ICMSF, 2006). Nos países onde há
sistemas de registro de casos de DTA, têm-se verificado aumento significativo, ao longo das
últimas décadas, na incidência de doenças causadas por micro-organismos em alimentos. No
Brasil, entre 2000 e 2015, foram notificados mais de onze mil surtos de DTA, sendo que, em
43% dos surtos o alimento incriminado não foi identificado (MS, 2016). Sabe-se que o número
de surtos provavelmente é ainda maior, posto que no Brasil e no mundo a sub-notificação e as
falhas nas etapas de investigação comprometem a geração de informações, podendo também
resultar em processos não conclusivos.
Existem diversas etapas no processamento de alimentos e cada uma delas pode servir de
porta de entrada para os micro-organismos patogênicos: produção, elaboração, transporte,
armazenamento, distribuição. Com alta capacidade de adaptação, os micro-organismos
conseguem sobreviver, multiplicar-se e produzir compostos tóxicos nos mais diversos
ambientes produtivos. Dessa forma, surtos envolvendo patógenos conhecidos ou emergentes,
veiculados por alimentos de origem animal ou vegetal, são relatados com frequência
(HAVELAR et al., 2009).
Para a redução da carga microbiana em alimentos, visando maior durabilidade e
segurança, existem vários métodos de conservação. Processos térmicos como pasteurização,
esterilização, secagem e evaporação são muito comuns nas indústrias de alimentos (PEREIRA;
VICENTE, 2010). Entretanto, além de serem de elevado gasto energético, estes métodos
podem provocar alterações indesejáveis nos alimentos como desnaturação de proteínas, perda
de vitaminas e outros compostos, além disso, esses processos não fazem distinção entre micro-
organismos patogênicos e não-patogênicos, reduzindo todos. Métodos não-térmicos, como Alta
Pressão Hidrostática, Campo Elétrico Pulsado e Embalagem em Atmosfera Modificada,
provocam mudanças menores no sabor e na quantidade de nutrientes e vitaminas, contudo,
faltam estudos a respeito do impacto ambiental desses processos (LADO; YOUSEF, 2002).
Além disso, é cada vez maior por parte dos consumidores a busca por alimentos minimamente
processados, seguros, prontos para o consumo e com uso menor de aditivos sintéticos. Para
satisfazer essa demanda, apesar de antimicrobianos sintéticos serem aceitos por vários países, a
9
tendência atual é a pesquisa e utilização de conservadores naturais na fabricação de alimentos,
que, além de tudo, podem também possibilitar o desenvolvimento de novos produtos
(ARQUÉS et al., 2011; CLEVELAND et al., 2001; NEGI, 2012).
O uso de micro-organismos saprófitas ou seus metabólitos para melhorar a segurança
microbiológica ou estender a vida útil de alimentos é definido como biopreservação (ROSS;
MORGAN; HILL, 2002; STILES; HASTINGS, 1991). Sabe-se que culturas starter podem
produzir vários compostos antimicrobianos e substâncias de natureza proteica, havendo muitos
exemplos de casos de inibição de bactérias patogênicas e deteriorantes por bactérias ácido
láticas (HOLZAPFEL, GEINSEN, SCHILLINGER, 1995; KLAENHAMMER, 1988).
As bactérias ácido láticas (BAL) constituem um grupo heterogêneo de bactérias capazes
de fermentar açúcares predominantemente em ácido lático, promovendo uma acidificação do
ambiente. São naturalmente encontradas em diversos tipos de alimentos e, em outros, são
adicionadas no intuito de melhorar atributos sensoriais dos produtos como sabor e textura ou
melhorar a segurança, vida útil ou até mesmo a qualidade nutritiva (DJADOUNI; KIHAL,
2012). Algumas BAL são de interesse na biopreservação de alimentos devido à capacidade de
restringir a multiplicação de micro-organismos indesejáveis, por competição e/ou produção de
agentes antimicrobianos, entre eles bacteriocinas, que são pequenos peptídeos que podem
apresentar atividade antimicrobiana (CHEN; HOOVER, 2003). Tendo se mostrado seguras e
eficazes como conservadores naturais, é cada vez maior o interesse no uso das bacteriocinas
devido também ao amplo espectro bacteriano e várias possibilidades de aplicação em
alimentos, como em produtos cárneos e lácteos, frutas, vegetais, cereais e bebidas (SOBRINO-
LÓPEZ, MARTÍN-BELLOSO, 2008; CLEVELAND, et al. 2001).
Rico em nutrientes, o leite constitui um excelente meio de cultura para o
desenvolvimento de diversos micro-organismos e, por isso, derivados lácteos são alimentos
frequentemente incriminados em surtos de DTA. Dados do IBGE (2013) apontam que a
produção de leite do país gira em torno dos 32 milhões de litros por ano e movimenta a
economia principalmente de pequenas e médias cidades brasileiras. Entretanto, a qualidade do
produto brasileiro impede que o leite atinja mercados mais exigentes, fazendo com que a
balança comercial de produtos lácteos do Brasil seja negativa há alguns anos (MAPA, 2014).
Em 2015, a produção de leite na região centro-oeste girou em torno de 13% do total de
leite produzido em todo o país, sendo o estado de Goiás o 5º maior produtor (CONAB, 2016).
A validade do leite tratado por pasteurização lenta é de cerca de apenas 10 dias, sendo assim,
pesquisas que visem melhorar a qualidade, a segurança e a vida útil desses alimentos são de
extrema relevância para a economia tanto do estado de Goiás quanto do Brasil.
10
Com isso, é evidente a importância de estudos que conduzam à descoberta de micro-
organismos ou seus produtos, com potencial aplicação em sistemas de bioconservação de
alimentos de origem láctea. A utilização de BAL é uma alternativa importante a ser
considerada para a melhoria da segurança microbiológica de alimentos, sendo sua pesquisa
para aplicação em leite e também em outras matrizes alimentícias, de verdadeira relevância,
possibilitando o aumento da segurança dos alimentos, bem como de sua vida útil, ao mesmo
tempo em que visam promover uma menor utilização de aditivos sintéticos para sua
conservação, tornando-os mais atraentes para a população e indústria de alimentos. Perante esse
contexto, o objetivo deste estudo foi isolar bactérias ácido láticas produtoras de bacteriocinas e
aplicá-las em estudo de bioconservação em leite pasteurizado para verificar a inibição a dois
patógenos alimentares comumente encontrados neste tipo de alimento.
11
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doenças Transmitidas por Alimentos
Problema de saúde pública, as doenças transmitidas por alimentos (DTA) são
provocadas por micro-organismos patogênicos e também por substâncias químicas que podem
contaminar alimentos. Existem mais de 250 diferentes tipos de DTA, a maioria infecções
causadas por bactérias, vírus e parasitas (CDC, 2016). A apresentação clínica mais comum é
representada por sintomas gastrointestinais: náuseas, vômitos, diarréia, que costumam aparecer
em 2-3 dias na maioria dos indivíduos. Contudo, também podem haver outros tipos de sintomas
e complicações que incluem hospitalização por sepse, síndrome hemolítico urêmica, síndrome
de Guillan-Barré e outros que podem até levar à morte (LINSCOTT, 2011; WHO, 2016).
Em grande parte dos surtos ocorridos no Brasil entre 2000 e 2015 o alimento
incriminado não foi identificado (51,4%). Os alimentos mistos corresponderam à maior
porcentagem dos surtos com causa identificada, seguida por ovos e produtos a base de ovos,
água, doces e sobremesas, produtos cárneos bovinos e em sexto lugar ficaram os produtos
lácteos (MS, 2016).
De acordo com dados do Food And Drug Administration (FDA) um dos micro-
organismos relacionados a surtos envolvendo produtos lácteos é a Listeria monocytogenes,
encontrada principalmente em leites não-pasteurizados e queijos leves feitos destes leites
(FDA, 2016; LINSCOTT, 2011). Um grande problema que envolve estes tipos de alimentos e
esta bactéria reside no fato de L. monocytogenes resistir a temperaturas de refrigeração, sendo
que a multiplicação é uma forma comum de conservação de alimentos e não suficiente portanto
contra este patógeno (SILVA et al., 2011). A RDC nº 12 de 02 de janeiro de 2001 estabelece
padrões microbiológicos para alimentos, e, de acordo com a norma, a pesquisa de Listeria
monocytogenes só é solicitada em produtos lácteos, para os quais o parâmetro é ausência do
micro-organismo.
No Brasil, dentre os mais de onze mil surtos de DTA notificados à Secretaria de
Vigilância em Saúde entre 2000 e 2015, S. aureus foi o segundo agente etiológico mais
identificado, perdendo apenas para Salmonella spp. (MS, 2015). Estima-se que a intoxicação
por Staphylococcus provoque cerca de 185 mil casos de DTA anualmente, sendo que o
patógeno pode ser encontrado em diversos alimentos como carne e produtos cárneos, peixes,
leite e produtos lácteos, saladas, produtos de confeitaria entre outros (IFT, 2004).
12
2.2 Listeria monocytogenes e listeriose
As bactérias do gênero Listeria são cocobacilos Gram-positivos, não esporulados, não
produtores de ácidos, anaeróbios facultativos, isoladas de águas superficiais, esgotos
domésticos, águas residuárias de indústrias de laticínios e de abatedouros, solos, insetos, adubo
orgânico e fezes de animais (NOJIMOTO; SOUZA; VALADÃO, 1997). Dentre as várias
espécies de Listeria, L. monocytogenes é reconhecidamente um patógeno para o ser humano.
Difere de muitos patógenos alimentares por sua natureza ubiquitária, psicrotrófrica e
microaerófila. São capazes de suportar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento
(LOU; YOUSEF, 1999) e se multiplicam em presença de concentrações relativamente elevadas
de cloreto de sódio e em ampla faixa de pH (PATCHETT; KELLY; KROLL, 1992). Sua
emergência está diretamente associada às mudanças nos hábitos alimentares dos países
industrializados, especialmente com o aumento do consumo de alimentos minimamente
processados refrigerados (JOFRÉ et al., 2005).
A listeriose é uma doença bacteriana grave ocasionada pelo consumo de alimentos
contaminados com L. monocytogenes (VOETSCH et al., 2007). São 13 os sorotipos conhecidos
de L. monocytogenes, entretanto, mais de 95% dos surtos e casos esporádicos de listeriose no
mundo são causados por cepas dos sorotipos 4b, 1/2a e 1/2b (LIANOU et al., 2006). No Brasil,
predominam os sorotipos 4b e 1/2a (HOFER; REIS; HOFER, 2006). Duas formas de listeriose
são reconhecidas até o momento: uma mais branda, caracterizada pelo desenvolvimento de
febre, diarreia, náusea, vômito, dor de cabeça e mialgia, e outra mais grave, manifestando
meningite, encefalite e abscessos (DUFFY et al., 1999). A incidência da doença é maior nas
populações que se enquadram no grupo de risco: idosos, provavelmente devido à
imunosenescência da imunidade mediada por células T e prevalência de doenças subjacentes;
pacientes em uso de imunossupressores ou com doenças autoimunes (GOULET et al., 2012) e
gestantes, neste caso podendo levar a morte fetal, parto prematuro, doença neonatal
(JACKSON; IWAMOTO; SWERDLOW, 2010). Surtos envolvendo indivíduos saudáveis,
apesar de incomuns, existem e são caracterizados por sintomas gastrintestinais (BRANCO et
al., 2003), podendo ocorrer após ingestão de elevado número de células de L. monocytogenes
ou quando certos antiácidos e/ou compostos contendo cimetidina são utilizados no tratamento
de úlceras de estômago e azia (SELBY et al., 2006).
O primeiro caso identificado de listeriose de origem alimentar ocorreu em 1981,
envolvendo salada de repolho tipo coleslaw. Desde então, numerosos surtos envolvendo
diferentes tipos de alimentos foram identificados. Em 2011, melões contaminados com L.
13
monocytogenes causaram o surto com maior mortalidade ocorrido nos Estados Unidos nos
últimos 90 anos: 33 mortes e um aborto (CDC, 2012). Os surtos e/ou casos de listeriose são
subdiagnosticados e/ou subnotificados no Brasil (CRUZ; MARTINEZ; DESTRO, 2008),
mesmo assim há vários registros da presença de L. monocytogenes em leite e derivados. Essa
bactéria tem sido isolada de vários queijos macios produzidos na América do Sul,
especialmente de queijo Minas frescal (QMF) no Brasil (BRITO et al., 2008). A umidade
relativamente alta, valores de pH não muito baixos, baixos teores de sal, ausência de fermentos
definidos e considerável manipulação durante a fabricação por pequenas e microempresas, são
fatores que podem proporcionar um ambiente favorável para a contaminação, sobrevivência e
multiplicação de L. monocytogenes nesses queijos (PEREIRA; LIMA; SANTANA, 2006).
2.3 Staphylococcus aureus produtor de enterotoxinas
As bactérias do gênero Staphylococcus possuem forma esférica e se agrupam em cachos
similares aos de uva. São imóveis, não esporuladas, suportam atividade de água mínima de 0,85
e concentrações de até 25% de cloreto de sódio, o pH e temperatura ótimos para crescimento
estão respectivamente entre 4,2-9,3 e 35-45ºC (SILVA et al., 2010). Staphylococcus aureus é
uma bactéria Gram-positiva, causadora de um amplo espectro de infecções em seres humanos,
desde espinhas e furúnculos até a síndrome do choque tóxico e septicemia. Os principais nichos
ecológicos dessa bactéria são as cavidades nasais e a pele de animais de sangue quente,
inclusive o homem. Largamente distribuído na natureza, esse patógeno pode ser transmitido aos
alimentos por meio da matéria prima, do ambiente de processamento ou por atividade humana
durante o preparo e manipulação (KLUYTMANS; WERTHEIM, 2005).
Algumas espécies desse gênero são capazes de produzir e liberar substâncias
termoestáveis, as enterotoxinas, que permanecem no alimento mesmo após o cozimento, e
quando ingeridas, podem provocar intoxicação alimentar (CUNHA NETO; SILVA;
STAMFORD, 2002). As enterotoxinas estafilocócicas (ES) são exoproteínas com peso
molecular de 26,000 a 29,600 Da, resistentes a pH baixo e ao calor, apresentando valores D de
três a oito minutos a 121ºC (ASPERGER; ZANGERL, 2003). Dessa forma, podem estar
presentes em alimentos mesmo na ausência das formas viáveis dos estafilococos
(JORGENSEN et al., 2005), as quais são mais suscetíveis a temperaturas elevadas e à acidez.
As ES são resistentes também às enzimas proteolíticas do sistema digestivo, e chegam
inalteradas ao trato gastrointestinal onde provocam seus principais efeitos: náuseas a êmese
14
severa com fortes dores abdominais, e a diarreia que pode ou não estar presente (BALABAN;
RASSOLY, 2000; BORGES et al., 2008). A intensidade e severidade dos sintomas podem
variar de acordo com o grau de suscetibilidade do indivíduo, com a quantidade de alimento
ingerida e a concentração de enterotoxina no alimento (JABLONSKI; BOHACH, 2001).
Existem substâncias que são consideradas indicadoras da atividade enterotoxigênica de
cepas de Staphylococcus. A coagulase, por exemplo, é uma enzima extracelular capaz de
promover a coagulação do plasma sanguíneo e de produção correlacionada à enterotoxinas
(WONG, BERGDOLL, 2002). As bactérias do grupo produtoras dessa enzima são conhecidas
como estafilococos coagulase positiva. Entretanto, a relação entre a produção da enzima e de
enterotoxinas não é absoluta, de forma que há cepas produtoras de coagulase não produtoras de
enterotoxinas e outras não produtoras de coagulase que produzem enterotoxinas (SEO;
BOHACH, 2007).
Entre os alimentos envolvidos em casos de intoxicação e surtos de origem estafilocócica
destacam-se o leite cru, o leite pasteurizado e os queijos (IKEDA et al., 2005). Sabe-se que
bactérias do gênero Staphylococcus são capazes de provocar mastite, inflamação da glândula
mamária que pode manifestar sinais ou não (STEWART, 2005). S. aureus é responsável por
cerca de 30-40% dos casos de mastite bovina, entre casos clínicos e subclínicos (sem sinais
aparentes), podendo contaminar o leite ou seus co-produtos no momento da ordenha ou
também durante a manipulação, processamento e distribuição (SCHERRER et al., 2004).
2.4 Bactérias ácido láticas e bacteriocinas
As bactérias ácido láticas (BAL) são micro-organismos sob a forma de cocos ou bacilos
Gram-positivos, catalase negativos, não formadores de esporos, anaeróbios, aerotolerantes,
resistem bem a ambientes ácidos e com concentrações relativamente altas de sal e têm como
produto da fermentação de açúcares, principalmente, o ácido lático (AXELSSON, 2004). Estão
amplamente distribuídas na natureza e podem ser encontradas na água, em solos, plantas, no
trato intestinal de animais e humanos, sendo, consequentemente, encontradas em diferentes
produtos alimentares como fermentados, carnes, derivados lácteos, vegetais, bebidas (BRUNO;
CARVALHO, 2009; CARR; CHILL; MAIDA, 2002; LIU, 2003).
Devido à sua capacidade fermentativa, é muito comum o uso dessas bactérias como
culturas starter ou iniciadoras na produção de alimentos fermentados como queijos, leites
fermentados, iogurtes, vinho, pães, conservas vegetais entre outros, nos quais contribuem para
15
o desenvolvimento de características sensoriais diferenciais desses produtos como aroma,
textura e flavour (CHARLIER et al., 2009). Além de seu uso pelas indústrias de alimentos na
fabricação de produtos fermentados, também são utilizadas como ferramenta para melhorar a
segurança microbiológica ou para estender sua vida útil de alimentos (LEROY; DE VUYST,
2004). Isso porque inibem micro-organismos deteriorantes e patógenos alimentares por meio da
competição com os mesmos por nutrientes ou pela produção de substâncias com atividade
antimicrobiana como ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, ácidos
graxos de cadeia curta, reuterina, diacetil e bacteriocinas (GÁLVEZ et al., 2007; SHAH;
DAVE, 2002; HOLZAPFEL; GEINSEN; SCHILLINGER, 1995; KLAENMEYER, 1993).
As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos sintetizados ribossomicamente por uma
ampla variedade de bactérias e secretadas por diversas vias. Em muitas espécies, esses
peptídeos se tornam uma primeira linha de defesa e parte da imunidade inata, agindo por
diferentes mecanismos (CLEVELAND et al., 2001; KLAENHAMMER, 1993). O gene para
produção de bacteriocinas normalmente está associado ao gene que codifica a resistência da
bactéria à sua própria bacteriocina, por meio de um mecanismo de proteção ainda pouco
elucidado (NES et al., 1996; PARADA et al., 2007).
Existem diversas propostas para a classificação das bacteriocinas, uma delas leva em
consideração sua estrutura primária e as subdivide em: classe I, composta por peptídeos
modificados chamados lantibióticos; classe II, com peptídeos não modificados e classe III,
composta por bacteriocinas de maior tamanho e com mecanismo de ação pouco estudado
(HÉCHARD; SAHL, 2002).
As bacteriocinas pertencentes à classe I possuem de 19 a mais de 50 aminoácidos e são
caracterizadas por aminoácidos incomuns como a lantionina e metil-lantionina, que formam
estruturas de anéis múltiplos tornando os lantibióticos diferentes dos outros peptídeos
antimicrobianos e contribuindo para a estabilidade contra o calor, alterações de pH e melhora
na tolerância à oxidação (SAHL; JACK; BIERBAUM, 1995). A classe II contém peptídeos
não-modificados, pequenos e estáveis ao calor, com atividade conhecida contra Listeria
(CLEVELAND et al., 2001). Os peptídeos pertencentes à classe III são maiores e sensíveis a
tratamento térmico (60-100ºC por 15 minutos) e seu mecanismo de ação é diferente das demais
classes pois se baseia na lise da parede celular do micro-organismo alvo (COTTER; HILL;
ROSS, 2005).
Além de não serem tóxicas para células eucarióticas, as bacteriocinas possuem
diferentes espectros de ação e diferem da maioria dos antibióticos terapêuticos por serem
agentes proteicos que são rapidamente digeridos pelas proteases no trato digestivo de humanos,
16
tendo papel importante também na redução de incidência de diarreia (ROSSI et al., 2008).
Muito se discute a respeito do mecanismo de ação das bacteriocinas, um dos mecanismos
propostos é a formação de poros transitórios ou canais iônicos na membrana citoplasmática dos
micro-organismos susceptíveis que provoca dissipação total ou parcial da força motriz de
prótons, mecanismo este geralmente inativo contra bactérias Gram-negativas devido à presença
de uma membrana externa impermeável a grande parte das moléculas (ABEE; KROCKEL;
HILL, 1995; ARQUES et al., 2011).
2.5 Aplicação de bactérias ácido láticas e bacteriocinas em produtos lácteos
A inoculação de alimentos com cepas de bactérias selecionadas (ou seus metabólitos),
capazes de inibir o desenvolvimento de micro-organismos indesejáveis, é um procedimento
conhecido como biopreservação (RODGERS, 2001). A biopreservação de alimentos apresenta
benefícios em vários aspectos: na redução do risco de intoxicação alimentar, melhora na vida
útil de produtos com diminuição de perdas econômicas pela deterioração, redução da adição de
conservadores sintéticos, redução da intensidade de tratamentos físicos, atendendo melhor a
demanda de consumidores por produtos com aspecto natural, frescos e prontos para consumo
(MESSAOUDI et al., 2013).
Uma vez que as BAL são consideradas micro-organismos Generally Recognized As
Safe (GRAS), as bacteriocinas por elas produzidas podem ser utilizadas com segurança tanto na
produção quanto na preservação de alimentos, em substituição à utilização de conservadores
sintéticos (BARMAN; GOSH; MANDAL, 2014). O status GRAS indica a segurança e possível
aplicação de um produto na conservação de alimentos ou para uso farmacêutico (NISHIE;
NAGAO; SONOMOTO, 2012). Para que seu uso seja liberado para utilização em alimentos, a
bacteriocina deve atender a alguns requisitos, como amplo espectro de inibição sobre os
principais patógenos alimentares ou ser específica a algum deles, ser termoestável, não implicar
em risco ao consumidor, aumentar a segurança do produto sem afetar sua qualidade nutricional
e sensorial, e possuir status GRAS (HOLZAPFEL; GEINSEN; SCHILLINGER, 1995).
Com grande interesse pela indústria na utilização dessas substâncias tem aumentado a
procura pelo isolamento de novas culturas de BAL com capacidade para produzir bacteriocinas
e outras substâncias inibidoras. Primeiramente são realizadas diluições seriadas da amostra em
solução salina ou água peptonada, seguido pelo plaqueamento em meios de cultura complexos
(ENDO, FUTAGAWA-ENDO, DICKS, 2011). Fatores como pH, temperatura e substrato
17
influenciam o crescimento das BAL em meios de cultura, sendo que o substrato, fonte de
carbono, é um componente muito importante para a proliferação bacteriana. A glicose é um dos
substratos mais comuns para cultura de BAL por ser de mais fácil metabolização (AXELSSON,
2004). Após isolamento são realizados testes para confirmação de BAL por características
como morfologia e metabolismo de glicose. Posteriormente são realizados testes para a
identificação inicial da atividade antagonística os quais normalmente se baseiam na difusão das
substâncias antimicrobianas em meios de culturas e inibição de micro-organismos. Os dois
métodos mais utilizados são spot-on-the-lawn e ensaio well-diffusion (MORAES et al., 2010).
As bacteriocinas podem ser introduzidas de diferentes formas nos alimentos: por meio
da adição de culturas bacterianas starters em alimentos fermentados (produção de bacteriocinas
in situ), como aditivo antimicrobiano purificado ou semi-purificadas aplicadas diretamente ao
alimento (como a nisina – Nisaplin®), através da adição de ingrediente fermentado por BAL
produtoras de bacteriocinas (como o ALTA® 2351, que contém pediocina PA-1) (COTTER;
HILL; ROSS, 2005; MILLS et al., 2011).
É possível também a aplicação de bacteriocinas prontas sob a forma de preparações
imobilizadas, na qual se encontram parcialmente purificadas e ligadas a um transportador que
funciona como um reservatório e difusor das moléculas de bacteriocinas para o alimento, de
forma a garantir um fornecimento contínuo e dependente do gradiente de bacteriocina. O
transportador pode também oferecer proteção à bacteriocina contra a inativação enzimática ou
por interação com componentes do alimento (BALCIUNAS et al., 2013).
A nisina, um lantibiótico (classe I), produzida por Lactococcus lactis subp. lactis é a
bacteriocina mais bem estudada. Seu uso como aditivo alimentar é aprovado há mais de 50
anos em vários países do mundo (NASCIMENTO; MORENO; KUYAE, 2008) inclusive no
Brasil, sendo usada particularmente no processamento de queijos, produtos lácteos e enlatados
(DELVES-BROUGHTON, 1990). Após ser estudada minuciosamente, recebeu o status de
GRAS pelo Food and Drug Administration (FDA) (CLEVELAND et al., 2001) e também foi
aprovada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para uso como conservador sendo
comercializada como concentrado seco em pó (SOBRINO-LÓPEZ; MARTÍN-BELLOSO,
2008).
O uso de culturas starter produtoras de nisina tem se mostrado viável para incorporação
e manutenção da bacteriocina durante o processamento de queijos. A nisina é completamente
estável em solução com pH 2.0 e pode ser armazenada por longo tempo entre 2-7ºC, enquanto
em pH 7.0 a inativação ocorre em temperatura ambiente (DELVES-BROUGHTON, 1990).
Estudos toxicológicos mostraram que essa bacteriocina não causa efeitos tóxicos em humanos e
18
sua dose letal (DL50) é de cerca de 6950 mg/kg, por via oral (JOZALA et al., 2007). Cepas de
Lc. lactis subsp. lactis e cepas mutantes têm sido testadas como culturas starter em queijos
feitos a partir de leite cru ou leite pasteurizado, fornecendo proteção contra contaminação de
leite ou requeijão por Staphylococcus aureus (RODRÍGUEZ et al., 2000).
A pediocina, produzida por Pediococcus spp., é uma bacteriocina de uso também
autorizado como conservador alimentar (SIMHA et al., 2012). Pertence à classe II e, não é
muito efetiva contra esporos, mas inibe de forma efetiva Listeria monocytogenes (GREEN et
al., 1997) e também tem demonstrado efeito antagonístico sobre S. aureus e Clostridium
perfringens (LOESSNER et al., 2003). Com representantes em mais de uma classe de
bacteriocinas, as enterocinas, produzidas por Enterococcus faecium (PARENTE; HILL, 1992)
são bacteriocinas termoestáveis (121ºC/15min) e resistentes à liofilização e armazenamento a -
20ºC por longos períodos, que também apresentam atividade contra bactérias patogênicas como
S. aureus e especialmente espécies do gênero Listeria (BALCIUNAS et al., 2013).
19
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Isolar, a partir de Queijo Minas Frescal (QMF), Bactérias Ácido Láticas (BAL)
produtoras de bacteriocinas com atividade inibitória frente a patógenos alimentares com
potencial para utilização em sistemas de bioconservação de produtos lácteos.
3.2 Objetivos Específicos
• Isolar, a partir de QMF, BAL com atividade inibitória frente a L. monocytogenes e S.
aureus;
• Caracterizar o tipo de inibição das BAL isoladas, selecionando aquelas produtoras de
bacteriocina (s);
• Verificar a ação bioconservadora de uma das cepas de BAL selecionadas frente a L.
monocytogenes e S. aureus em experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado
mantido sob refrigeração .
20
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Isolamento das Bactérias Ácido Láticas (BAL) a partir de queijo Minas frescal
Os queijos Minas frescal (QMF) utilizados no isolamento das Bactérias Ácido Láticas
(BAL) foram proveniente de duas fábricas de queijos de médio porte localizadas na região
metropolitana de Goiânia. Os QMF eram produzidos a partir de leite pasteurizado e com
utilização de fermento químico, e não de bactérias starter para a fermentação dos queijos. Eles
eram coletados no dia de sua fabricação e transportado em caixa isotérmica com gelo reciclável
até o Laboratório de Pesquisa em Controle de Qualidade de Alimentos e Medicamentos
(LPCQAM) da Faculdade de Farmácia (FF) da Universidade Federal de Goiás (UFG).
Para aumentar as chances de isolamento de linhagens produtoras de bacteriocinas,
amostras de QMF foram analisadas no início e no final da vida útil do produto (43 dias)
armazenado a 5°C em refrigerador com temperatura monitorada por termômetro de mercúrio.
Ao final da vida útil do produto era verificada a aparência externa do mesmo, observando, por
exemplo, a ausência de expansão da embalagem. Inicialmente, foram retiradas, assepticamente,
porções de várias partes do QMF, de forma a obter uma amostra representativa de 25 g. À
porção de 25 g foram adicionados 225 mL de água peptonada 0,1% (p/v), homogeneizando-se
por dois minutos em Stomacher (Ethik Technology, Brasil). Foram preparadas diluições
seriadas a partir da primeira diluição (10-1) até obtenção da diluição 10-6. Um volume de 0,1
mL de cada diluição foi semeado, em triplicata, em superfície de ágar De Man Rogosa e Sharpe
(MRS). As placas foram incubadas a 25°C por até 72 horas em condições de anaerobiose,
obtidas através do uso de jarra de anaerobiose (Permution) contendo envelope de Anaerogen
compatível com o volume da jarra. As placas que contiveram até 102 Unidades Formadoras de
Colônias (UFC) foram selecionadas para o ensaio de antagonismo em ágar: uma das placas da
triplicata foi armazenada sob refrigeração (placa-mãe) e as demais placas receberam uma
sobrecamada de ágar Brain Heart Infusion (BHI) semissólido (1,0% ágar bacteriológico)
contendo 105-106 UFC/mL de organismo indicador de atividade inibitória (L. monocytogenes
ATCC 7644 ou S. aureus ATCC 25923). Após incubação a 25°C por 24 horas em anaerobiose,
as placas foram observadas quanto à presença de halo de inibição (DE MARTINIS et al.,
2001).
As placas onde se observou a presença de halo de inibição foram replicadas, a partir da
placa-mãe armazenada sob refrigeração a 5°C, para três placas de Ágar Tripticase Soja com
21
Extrato de Levedura (TSAYE) e uma placa de ágar MRS. As réplicas foram feitas com auxílio
de uma espécie de carimbo, constituído por um utensílio de madeira com o diâmetro de uma
placa de petri envolvido por um tecido de veludo esterilizado. As placa-mães eram
primeiramente marcadas em um ponto específico para determinar a posição exata da
replicagem. Esse método é denominado replica plating. As placas foram incubadas a 25°C por
72 horas em anaerobiose. A placa de ágar MRS e uma placa de TSAYE foram armazenadas
sobre refrigeração, nas outras duas inoculou-se sobrecamada de BHI semissólido (1% ágar)
contendo 105-106 UFC/mL de micro-organismo indicador de atividade inibitória (L.
monocytogenes ATCC 7644 ou S. aureus ATCC 25923). Foram então incubadas
anaerobicamente por 24 horas a 35°C. As colônias que produziram halo de inibição para ambos
micro-organismos foram selecionadas a partir da placa-mãe armazenada sob refrigeração,
repicadas para caldo MRS e incubadas a 25°C por 24 horas (DE MARTINIS et al., 2001). Em
seguida, foram submetidas à coloração de Gram, ao teste de oxidase e à verificação de
produção de catalase.
Para o teste da oxidase, fez-se um esfregaço da cultura a ser testada em papel filtro.
Sobre o esfregaço foi vertida uma gota de reativo de oxidase (Becton Dickinson). O
aparecimento de coloração púrpura ou azul é indicativo de reação positiva para oxidase. Para
verificação da produção de catalase, uma gota do micro-organismo em caldo MRS foi colocada
em uma lâmina de vidro contendo uma gota de solução de peróxido de hidrogênio 3% (v/v). A
liberação de gás com formação de bolhas indica reação positiva para catalase (BRASIL, 2003).
As culturas selecionadas nessa etapa foram armazenadas a -20°C em caldo MRS
adicionado de glicerol (Sigma) a 20% (v/v), para estudos posteriores.
As cepas Lactobacillus sakei ATCC 15521 e L. sakei 1, doadas pelo Laboratório de
Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, foram utilizadas como controle negativo e positivo,
respectivamente, para produção de bacteriocinas.
Todos os meios de cultura utilizados nos experimentos foram da marca Oxoid, salvo
indicação em contrário.
4.2 Teste Spot-on-the-lawn
O ensaio spot-on-the-lawn foi realizado conforme Lewus e Montville (1991) e através
dele é possível verificar a inibição de micro-organismos suscetíveis às BAL e suas substâncias
22
através de halos de inibição. Para tanto, preparou-se placas de TSAYE que foram perfuradas
com ponteiras cortadas e esterilizadas, de forma a permitir a formação de orifícios com
capacidade para acomodar volumes de 2 µL. Os orifícios foram feitos com cerca de 3 cm de
distância e preenchidos com 2 µL de caldo MRS contendo crescimento de 24 horas de cada
cultura de BAL teste e das cepas controle (L. sakei ATCC 15521 e L. sakei 1). As placas foram
incubadas anaerobicamente por 24 horas a 25°C. Após incubação, receberam uma sobrecamada
de BHI semissólido contendo o micro-organismo indicador e novamente foram incubadas por
24 horas a 25°C. Finda a incubação, os halos de inibição foram verificados e medidos.
4.3 Verificação da inibição por bacteriófagos
A verificação de inibição por bacteriófagos foi realizada de acordo com Lewus, Kaiser e
Montville (1991). Se trata de um dos testes utilizados para caracterizar o tipo de inibição
ocorrido, descartando-se a inibição bacteriana por ação de bacteriófagos. Uma porção da zona
clara da área de inibição foi cortada a partir da placa do ensaio de Spot-on-the-lawn. A porção
de ágar cortada foi adicionada a 3 mL de caldo BHI e macerada com auxílio de um bastão de
vidro esterilizado. A mistura foi mantida à temperatura ambiente por 1 hora e então 100 µL
dessa suspensão e 100µL do micro-organismo indicador (crescimento overnight em caldo BHI
a 35°C) foram adicionadas a 4 mL de ágar BHI semissólido. A suspensão no ágar semissólido
foi vertida por completo sobre uma placa com ágar BHI e incubada por 24 horas a 35°C. A
formação de placas de lise foi indicativa de atividade de fagos.
4.4 Teste do metabolismo da glicose
A verificação da fermentação da glicose foi realizada em tubos com caldo preparado
segundo Hugh e Leifson (1953). O meio foi preparado com a seguinte composição por litro de
água: Peptona 2,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; Fosfato dipotássico 0,3 g; Glicose 10,0 g; Azul de
bromotimol 0,03 g e Ágar 3 g. Cada cultura de BAL a ser testada, selecionadas nos ensaios
anteriores, foi inoculada em dois tubos contendo caldo Hugh e Leifson. Um dos tubos recebeu
uma camada de óleo de parafina esterilizado para verificar a fermentação em ambiente
anaeróbio. Os tubos foram incubados por cinco dias a 25°C e o aparecimento de coloração
amarela foi indicativo de reação positiva.
23
4.5 Verificação da natureza proteica das substâncias antagonísticas
A natureza proteica das substâncias antagonísticas foi confirmada por meio do método
descrito De Martinis e Franco (1998) verificando sua sensibilidade a proteases. As
bacteriocinas são substâncias de natureza proteica, portanto a sensibilidade a enzimas
proteolíticas indica a natureza protéica das substâncias antagonísticas. Para tanto, fez-se uma
cultura overnight das BAL a serem testadas em caldo MRS, a 25°C. Um volume de 2 µL das
mesmas foi inoculado em pequenos orifícios previamente feitos em placas de TSAYE, as quais
foram incubadas anaerobicamente, overnight a 25°C. Preparou-se uma solução aquosa na
concentração de 20 mg/mL das enzimas a serem testadas: Protease de Streptomyces griseus e
Proteinase K de Tritirachium album (ambas da marca Sigma-Aldrich). As soluções foram
esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 µm (Merck). Um volume de 20 µL da enzima
(20 mg/mL) foi transferido para uma pequena cavidade feita adjacente ao inóculo da cultura de
BAL. As placas foram mantidas a 30°C por duas horas, para que ocorresse a difusão da enzima
pelo meio e então foram recobertas com cerca de 8 mL de BHI semissólido contendo cerca de
104 do micro-organismo indicador. Água destilada foi usada como controle negativo e a
ausência de zona de inibição na região em que foi aplicada a protease indicou a natureza
proteica do inibidor.
4.6 Ensaio de difusão em poços (Well diffusion assay)
O ensaio de difusão em poços foi realizado de acordo com Alves et al. (2005). Neste
ensaio, é avaliada a atividade dos sobrenadantes livre de células, o inóculo bacteriano
centrifugado, descartando-se possível inibição por competição bacteriana. Foram utilizados
como micro-organismos indicadores, além daqueles já utilizados: L. monocytogenes ATCC
7644, S. aureus ATCC 25923, L. sakei 1 e L. sakei ATCC 15521, testou-se também um micro-
organismo Gram-negativo (Escherichia coli), uma BAL isolada dos ensaios e potencial
produtora de bacteriocinas, e cepas isoladas de alimentos no Laboratório de Pesquisa em
Controle de Qualidade Microbiológico de Alimentos, da Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal de Goiás (LPCQAM): L. monocytogenes isolada de queijo muçarela, S. aureus e L.
innocua isolados de QMF.
As culturas de BAL a serem testadas foram inoculadas em caldo BHI e incubadas a
25°C por 24 horas. Os micro-organismos indicadores foram cultivados em caldo BHI overnight
24
a 35°C e diluídos, também em caldo BHI, até obtenção de densidade ótica (DO) de 0,8 a 600
nm. Após isso, 1mL dessa diluição foi adicionado a 9 mL de solução salina peptonada
esterilizada (0,1% peptona bacteriológica e 0,85% de cloreto de sódio – Sigma Aldrich, p/v).
Adicionou-se 0,5 mL desta suspensão juntamente com 0,5 mL de uma solução aquosa de
Tween 80 a 10% (v/v) a 50 mL de BHI semi-sólido fundido (em torno de 45°C). O conteúdo
foi semeado em placas de Petri e aguardou-se a solidificação, em condições assépticas. Após a
solidificação do BHI semi-sólido, foram feitos orifícios com cerca de 6 mm no mesmo para
cada sobrenadante a ser testado. Enquanto isso, os caldos de cultura contendo as BAL foram
centrifugadas sob refrigeração (Eppendorf 5403, 10000g/10minutos). Os sobrenadantes foram
coletados e esterilizados por filtração (membrana com poro de 0,22 µm de diâmetro - Merck).
Um volume de 50 µL dos sobrenadantes esterilizados foi adicionado nos orifícios feitos no BHI
semi-sólido contendo os micro-organismos indicadores. As placas foram incubadas sob
refrigeração (5°C/24 horas) e então incubadas a 25°C por 18 horas. Verificou-se a presença de
halos de inibição e, quando presentes, os mesmos foram medidos. O ensaio de difusão foi
realizado uma segunda vez na qual os sobrenadantes foram neutralizados com solução de
NaOH 0,1 N para pH 6,5 – 7,0 antes de serem submetidos à esterilização por filtração.
As culturas que apresentaram os melhores resultados pelo teste well-diffusion foram
inoculadas em tubos contendo caldo MRS e incubadas a 8ºC durante sete dias para a realização
de novo teste spot-on-the-lawn, conforme descrito no item 4.2.
4.7 Identificação das Bactérias Ácido Láticas (BAL)
Para sequenciamento do gene 16s rRNA, as BAL selecionadas a partir dos
experimentos anteriores foram cultivadas em caldo MRS a 25°C por 24 horas e um mL do
caldo foi utilizado para a extração de DNA genômico, utilizando-se o kit Illustra Bacteria
Genomic Prep Mini Spin (GE Life Sciences, Suécia), de acordo com as instruções do
fabricante. A quantificação do DNA foi realizada com o equipamento Nanodrop 2000c
(Thermo Fisher Scientific, EUA) para leituras de DO a 260 nm.
A sequência alvo para amplificação genética pela técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR) foi o gene 16s do rRNA, por ser uma região altamente preservada, sendo
adequada para estudos filogenéticos (SILVA; DOMINGUES, 2015).
25
A PCR foi realizada com 84 µL de TaqPlatinum Blue (Invitrogen), 30 pmol do primer
27F (Invitrogen), 30 pmol do primer 1492R (Invitrogen) e 300 ng de DNA total, para um
volume final de 100 µL (McCANN et al., 2015).
A amplificação foi realizada com o termociclador My Gene -Peltier series (Long Gene
MG96+, China), com uma etapa de desnaturação inicial a 94°C (1 minuto), seguida por
anelamento a 55°C (1 minuto) e extensão a 72°C (2 minutos), um total de 30 ciclos. Os
produtos foram purificados usando o Kit Gel Band Purification (GE Life Sciences) e então
enviados à para o sequenciamento do DNA pelo método Sanger usando o 3500 Genetic
Analyzer (Life Technologies).
Os resultados do sequenciamento do DNA foram avaliados usando o programa
Chromas 2.4.4 (Technelysium, Austrália), combinadas com o Programa de Sequenciamento
PRABI-Doua (Pôle Rhône-Alpes de Bioinformatique Site Doua, França). As sequências de
DNA foram comparadas às sequências disponíveis no GenBank, com o programa de busca
BLASTN.
As etapas de extração, PCR (Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia de
Polimerase) e análise de sequenciamento foram feitas no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP) e o
sequenciamento foi realizado no Centro de Sequenciamento de Ácidos Nucleicos da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto.
4.8 Experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado
O leite cru refrigerado, utilizado nos experimentos de co-inoculação, foi coletado em
equipamento refrigerador na Fazenda Escola da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG,
logo após a realização da ordenha mecânica. O mesmo foi armazenado em frascos de vidro de
tampa rosqueável previamente esterilizados e transportados imediatamente em caixa isotérmica
com gelo reciclável, até o Laboratório Físico-Químico da Escola de Agronomia da
Universidade Federal de Goiás. Alíquotas de 100 mL de leite foram distribuídas em frascos de
vidro esterilizados com tampa rosqueável, que foram submetidas ao processo de pasteurização
lenta, 63°C durante 30 minutos (BRASIL, 1952), em equipamento banho maria Dubnoff
(Marconi MA 093, Brasil). O monitoramento da temperatura de pasteurização foi realizado em
um frasco contendo o mesmo volume de leite (100 mL) utilizando-se termômetro de mercúrio
que foi inserido no frasco por meio de orifício na tampa. Após o processo de pasteurização, os
26
frascos foram imediatamente resfriados em banho de gelo e transportados ao LPCQAM, para a
realização dos experimentos de co-inoculação.
Uma cepa de BAL produtora de bacteriocina (BAL bac+), dentre as isoladas e
selecionadas, com atividade antagonística frente aos micro-organismos indicadores avaliados
foi selecionada, de acordo com os resultados dos experimentos descritos nos itens anteriores,
para estudos de bioconservação em leite pasteurizado. A cepa L. sakei ATCC 15521 foi
utilizada como controle negativo para produção de bacteriocinas (BAL bac-). Para os
experimentos de co-inoculação, amostras de 100 mL de leite bovino pasteurizado conforme
descrito acima, foram inoculados com as populações bacterianas de L. monocytogenes ATCC
7644, S. aureus ATCC 25923, L. sakei ATCC 15521 e BAL bac+, conforme condições
experimentais descritas na Tabela 1.
No momento do inóculo foram preparadas diluições decimais seriadas em solução de
NaCl 0,85% (p/v) de modo a serem alcançadas populações aproximadas de 102 UFC/mL de L.
monocytogenes e S. aureus e 106 de BAL bac- e BAL bac+. Após o inóculo das populações
bacterianas, os frascos contendo leite pasteurizado foram armazenados a 8ºC por até 10 dias e
analisados com 0, 24, 48, 72, 96, 144 e 192 e 240 horas de incubação, dias 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 e
10, respectivamente. As populações bacterianas foram enumeradas por meio de semeadura em
superfície em ágar Oxford, ágar Baird Parker e ágar MRS, respectivamente para L.
monocytogenes, S. aureus e BAL. Uma amostra de leite pasteurizado, sem inóculo foi utilizada
para enumeração de microbiota acompanhante, presença de S. aureus e L. monocytogenes, no
decorrer do experimento (controle).
Tabela 1: Condições experimentais empregadas no estudo de co-inoculação em leite pasteurizado armazenado a 8°C durante 10 dias
Condição Nível de inóculo desejado (UFC/mL)
BAL L. monocytogenes S. aureus
Controle negativo - - -
BAL bac+ 106 - -
Lactobacillus sakei ATCC 15521 (BAL bac-) 106 - -
Listeria monocytogenes - 102 -
Staphylococcus aureus - - 102
BAL bac++ L. monocytogenes 106 102 -
BAL bac++ S. aureus 106 - 102
BAL bac++ L. monocytogenes + S. aureus 106 102 102
BAL bac-+ L. monocytogenes 106 102 -
BAL bac-+ S. aureus 106 - 102
BAL bac-+ L. monocytogenes + S. aureus 106 102 102
27
A figura 1 representa a sequência das análises realizadas neste estudo.
Queijo Minas Frescal
Teste de antagonismo
Isolamento e purificação em ágar MRS
Exclusão de inibição por produção de H2O2
Exclusão de inibição por produção de ácidos orgânicos
Coloração de Gram, Prova da oxidase, Prova da catalase
Teste spot-on-the-lawn
Metabolismo da glicose
Exclusão da inibição por bacteriófagos Sensibilidade a enzimas proteolíticas
Ensaio de difusão em poços
Experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado
Extração de DNA, amplificação genética e sequenciamento
Figura 1: Experimentos empregados para isolamento, identificação, caracterização da atividade inibitória de BAL para utilização em estudo de co-inoculação em leite pasteurizado
28
4.9 Análises estatísticas
Os experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado foram realizados segundo o
delineamento de blocos ao acaso com duas repetições, dez tratamentos (Tabela 1) e oito
contagens (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 10 dias), totalizando em dois blocos com 80 ensaios. Os dados
das contagens em placas (UFC/mL) foram transformados para escala logarítmica na base 10
(log UFC/mL), e foram então submetidos à análise de variância (ANOVA).
As análises estatísticas foram executadas no aplicativo computacional R (R
Development Core Team, 2016). Verificou-se pelo teste F a significância dos quadrados
médios das fontes de variação: tratamento, blocos e tempo no efeito multiplicação de L.
monocytogenes, Staphylococcus aureus e BAL bac+. Para comparação entre médias utilizou-se
o teste de Scott-Knott, ao nível de significância de 5%.
29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Isolamento das Bactérias Ácido Láticas (BAL) a partir de queijo Minas frescal
Seis queijos Minas frescal (QMF) de duas fábricas de médio porte foram analisados no
início (três QMF) e no final (três QMF) da vida útil dos mesmos (43 dias). Após o ensaio de
antagonismo em ágar (Figura 2), 18 Bactérias Ácido Láticas (BAL) com atividade
antagonística contra os micro-organismos indicadores utilizados foram selecionadas, todas elas
no final da vida útil dos queijos.
Figura 2: Ensaio de antagonismo em ágar MRS para seleção de bactérias ácido láticas, utilizando Staphylococcus aureus ATCC 25923 como micro-organismo indicador
O meio de cultura tipo ágar ou caldo MRS é capaz de viabilizar o crescimento de várias
espécies de bactérias láticas e por isso é bastante utilizado para o isolamento e manutenção das
mesmas (CARR; CHILL; MAIDA, 2002). O Ágar Tripticase Soja com Extrato de Levedura
(TSAYE) é um meio de cultura isento de açúcar fermentáveis e seu uso minimiza a
possibilidade de inibição devido à produção de ácidos orgânicos (LEWUS; KAISER;
MONTVILLE, 1991). Produzido por BAL, o peróxido de hidrogênio também possui potencial
antimicrobiano e pode interferir na identificação de atividade antimicrobiana de bacteriocinas.
Para reduzir esse efeito realiza-se a incubação das BAL em anaerobiose, a fim de inibir a
produção de peróxido de hidrogênio pelas mesmas (DE MARTINIS et al., 2001; LEWUS;
MONTVILLE, 1991).
30
Todas as culturas selecionadas através do teste de antagonismo em ágar apresentaram-
se como cocos ou bacilos Gram-positivos (Figura 3), catalase e oxidase negativas (Figura 4),
características típicas de bactérias ácido láticas (AXELSSON, 2004).
Figura 3: Morfologia de bactérias ácido láticas isoladas de queijo Minas frescal, exibindo bacilos Gram-positivos
Figura 4: Imagem da prova da oxidase realizada para a caracterização das bactérias ácido láticas isoladas de queijo Minas frescal
5.2 Teste Spot-on-the-lawn
Após o ensaio spot-on-the-lawn, nove das dezoito BAL inicialmente selecionadas
mostraram-se capazes de inibir os dois micro-organismos indicadores utilizados, apresentando
31
halos de inibição de diâmetro entre 6 e 26 mm (Figura 4 e Tabela 2). Sendo assim, estas BAL
foram selecionadas para os testes subsequentes. Ao contrário dos testes de sensibilidade a
antimicrobianos, para os testes de sensibilidade a bacteriocinas e substâncias semelhantes a
bacteriocinas não existem pesquisas que apontam diâmetros padrões para inibição a serem
encontrados.
Figura 4: Halo de inibição formado no ensaio spot-on-the-lawn por uma bactéria ácido lática, em placa de TSAYE, utilizando como indicador Listeria monocytogenes ATCC 7644 Tabela 2: Diâmetro (em mm) dos halos de inibição produzidos por bactérias ácido láticas (BAL) no ensaio spot-on-the-lawn para verificação de atividade antimicrobiana
Bactéria ácido lática
Indicadores
Listeria monocytogenes
ATCC 7644
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
QMF 2 14 6
QMF 4 26 9
QMF 6 25 9
QMF 8 24 9
QMF 9 18 6
QMF 11 25 8
QMF 13 26 9
QMF 15 24 9
QMF 18 25 9
Lactobacillus sakei 1 30 5
L. sakei ATCC 15521 0 0
32
A pesquisa por BAL com atividade bacteriocinogênica têm acontecido em diversos
países e os produtos lácteos são amplamente investigados tanto para o isolamento quanto para a
aplicação, sendo que muitos estudos se baseiam em produtos típicos de determinada região
(ARQUÉS et al., 2011; COSENTINO et al., 2012; IRANMANESH et al., 2013; RIBEIRO et
al.; 2013; SIP et al., 2012).
Apesar de apenas nove das dezoito BAL selecionadas terem apresentado inibição frente
aos micro-organismos testados é possível observar que as zonas de inibição obtidas,
principalmente em relação a L. monocytogenes ATCC 7644, são de diâmetro
consideravelmente maior que os obtidos em outros trabalhos pelo mesmo método. Em um
estudo com queijos tipo golka típicos da Polônia, feitos a partir de leite de vaca não-
pasteurizado, BAL isoladas por Sip et al. (2012) geraram halos de inibição de no máximo 22
mm de diâmetro contra L. monocytogenes. Os halos em relação à S. aureus, no entanto, foram
de diâmetro menores, contudo maiores do que àquele obtido pela cepa produtora de
bacteriocina L. sakei 1. A atividade anti-estafilocócica tem se mostrado ser de mais difícil
obtenção, apresentando-se, algumas vezes, com halos de diâmetro inferior aos de outros micro-
organismos, assim como neste trabalho. Algumas vezes a atividade anti-estafilocócica nem é
obtida (ELEGADO et al., 2004). Leite et al. (2015), avaliando BAL isoladas de grãos de kefir,
encontraram um número reduzido de BAL com atividade anti-estafilocócica, e os halos obtidos
para este micro-organismo (1-2 mm) foram todos menores que encontrados para atividade L.
monocytogenes (2-5 mm).
5.3 Verificação da inibição por bacteriófagos
Não foram detectadas formação de placas indicativas de lise causada por bacteriófagos
(Figura 5).
Figura 5: Crescimento originado do teste de verificação da inibição por bacteriófagos evidenciando a ausência de placas de lise
33
Bacteriófagos são vírus que infectam unicamente bactérias. Eles se unem às células
bacterianas e injetam seu material genético dentro das mesmas, onde novos bacteriófagos vão
sendo formados (LEE; CHUN; PARK, 2014) e continuam infectando células vizinhas, por
difusão, o que resulta em uma área clara no meio de cultura, denominada placa, onde se
encontra a partícula de fago infecciosa (O’BRIEN, 2011). Os bacteriófagos têm sido
considerados antimicrobianos naturais já que infectam e lisam seu hospedeiro, são encontrados
na natureza, em alimentos, considerados seguros e também vêm sendo estudados como
potencial bioconservadores (HUDSON et al., 2005).
5.4 Teste do metabolismo da glicose
Segundo Hugh e Leifson (1953), as bactérias podem metabolizar carboidratos por dois
mecanismos: fermentação e oxidação. Pela fermentação, a molécula de glicose é fosforilada e
então dividida em duas moléculas de triose que passarão por outras alterações, esse processo é
independente da presença de oxigênio. Pela oxidação, a glicose não é dividida em duas trioses,
o grupo aldeído é oxidado a grupo carboxil formando ácido glucônico. O processo de oxidação
é estritamente aeróbico. Micro-organismos fermentadores, como as bactérias ácido láticas,
produzem reações ácidas tanto no tubo com meio coberto por óleo de parafina quanto no tubo
onde há contato com o oxigênio.
As nove culturas testadas foram positivas para o teste de fermentação de glicose em
meio Hugh e Leifson (Figura 6).
Figura 6: Teste do metabolismo da glicose em meio Hugh & Leifson, aplicado a bactérias ácido láticas provenientes de queijo Minas frescal, (a) no início do período de incubação e (b) ao final do período de incubação
a b
34
5.5 Verificação da natureza proteica das substâncias antagonísticas
Os resultados dos ensaios de sensibilidade das substâncias antagonísticas à proteases
estão descritos na Tabela 3. Seis das nove BAL avaliadas foram sensíveis às duas enzimas
utilizadas no teste (Figura 7) sendo que dessas, as cinco com maiores diâmetros de halos foram
selecionadas para os testes subsequentes (BAL QMF 4, 6, 9, 11 e 18). Não foi possível medir o
halo para proteinase K da BAL QMF 4, devido ao crescimento da bactéria na superfície do
meio, mesmo assim à sensibilidade à proteinase pôde ser percebida e a BAL foi utilizada nos
ensaios seguintes.
Figura 7: Ensaio de sensibilidade a proteases, mostrando inibição da atividade antagonística de uma bactéria ácido lática na região de aplicação da protease (seta), usando como indicador Listeria monocytogenes ATCC 7644
35
Tabela 3: Perfil de sensibilidade de bactérias ácido láticas frente à Protease de Streptomyces
griseus e à Proteinase K de Tritirachium álbum e diâmetros dos halos encontrados, em mm, usando como indicador Listeria monocytogenes ATCC 7644
BAL Proteinase K Diâmetro do
halo (mm)
Protease Diâmetro do
halo (mm)
QMF 2 - 0 - 15
QMF 4 + - + 25
QMF 6 + 25 + 25
QMF 8 + 20 + 20
QMF 9 + 24 + 20
QMF 11 + 24 + 28
QMF 13 - 25 - 25
QMF 15 - 0 - 0
QMF 18 + 24 + 24
Lactobacillus sakei 1 + 25 + 25
L. sakei ATCC
15521
- 0 - 0
(+): desaparecimento da zona de inibição, indicando que a substância foi degradada pela enzima proteolítica; (-): nenhuma mudança na zona de inibição, indicando que a substância não foi degradada pela enzima proteolítica.
A inativação dos sobrenadantes de bactérias láticas por enzimas proteolíticas revela a
natureza proteica destas substâncias. Uma completa inativação por enzimas proteolíticas
também leva segurança ao consumidor, visto que as bacteriocinas podem ser completamente
inativadas por enzimas do trato gastrointestinal humano, se tornando inativas contra as
bactérias benéficas da microbiota intestinal (WORAPRAYOTE et al., 2015).
5.6 Ensaio de difusão em poços (Well diffusion assay)
O ensaio de difusão em poços apresenta resultados referentes aos sobrenadantes livres
de células sobre o micro-organismo testado. Além disso, é um método simples, de custo
inferior ao método de difusão em discos e que pode apresentar melhores resultados que este
ensaio devido a uma possível melhor difusão das substâncias testadas inseridas nos poços do
agar do que os discos (MAGALDI et al., 2004; VALGAS et al., 2007). No presente estudo, o
36
ensaio de difusão em poços foi realizado em duas condições: sem neutralização dos
sobrenadantes (Tabela 4) e com neutralização dos sobrenadantes (Tabela 5).
Tabela 4: Diâmetros (mm) dos halos de inibição produzidos pelos sobrenadantes das culturas de bactérias ácido láticas obtidos no ensaio well diffusion, sem a etapa de neutralização, frente a diferentes micro-organismos indicadores Micro-organismos
indicadores
QMF 4 QMF 6 QMF 9 QMF 11 QMF
18
Lactobacillus
sakei 1
L. sakei
ATCC 15521
L. monocytogenes
ATCC 7644
19 18 9 16 17 30 0
Staphylococcus
aureus ATCC 25923
10 9 0 16 17 0 0
L. monocytogenes
QM*
10 11 0 10 12 30 0
S. aureus QMF** 13 13 0 16 17 0 0
L. innocua QMF** 11 11 0 11 13 27 0
Lactobacillus sakei 1 17 16 7 16 16 0 0
L. sakei ATCC 15521 20 20 8 18 20 0 0
QMF 4 0 0 0 0 0 0 0
Escherichia coli
ATCC 8739
0 0 0 0 0 0 0
QM* micro-organismo isolado a partir de queijo muçarela QMF** micro-organismo isolado a partir de queijo Minas frescal
Como não foi observada inibição de E. coli, e devido à menor inibição produzida pela
BAL QMF 9, esses micro-organismos não foram inseridos no ensaio que incluiu a etapa de
neutralização (Tabela 5). A ausência de inibição de E. coli era esperada, visto que os micro-
organismos Gram-negativos são comumente resistentes à substâncias inibidoras como as
bacteriocinas, devido à presença de uma membrana protetora que forma a camada mais externa
do envelope celular, uma barreira a macromoléculas e solutos hidrofóbicos. A presença
concomitante de substâncias que alterem a permeabilidade do envelope celular é objeto de
pesquisas como uma das alternativas para o uso de bacteriocinas contra bactérias Gram-
negativas (HELANDER; VON WRIGHT; MATTILA-SANDHOLM, 1997).
37
Tabela 5: Diâmetros (mm) dos halos de inibição produzidos pelos sobrenadantes das culturas de bactérias ácido láticas obtidos no ensaio well diffusion, com a etapa de neutralização dos sobrenadantes, frente a diferentes micro-organismos indicadores
Micro-organismos
indicadores
QMF 4 QMF 6 QMF 11 QMF 18 L. sakei 1 L. sakei
ATCC 15521
Listeria monocytogenes
ATCC 7644
14 17 16 17 28 0
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
6 9 9 9 0 0
L. monocytogenes QM* 0 0 7 0 25 0
S. aureus QMF** 6 12 15 15 0 0
L. innocua QMF** 7 7 7 8 21 0
Lactobacillus sakei 1 11 14 16 15 0 0
L. sakei ATCC 15521 18 20 18 18 7 0
QMF 4 0 0 0 9 0 0
QMF 18 0 11 11 10 0 0
QM* micro-organismo isolado a partir de queijo muçarela QMF** micro-organismo isolado a partir de queijo Minas frescal
Procedeu-se à incubação das BAL sob refrigeração e novo ensaio spot-on-the-lawn foi
realizado. Os resultados estão descritos na Tabela 6, onde é possível observar que as bactérias
foram capazes de produzir substâncias inibitórias mesmo após incubação sob refrigeração,
indicando a possibilidade de emprego das mesmas em alimentos refrigerados.
Tabela 6: Diâmetro (em mm) dos halos de inibição produzidos por bactérias ácido láticas (BAL) no ensaio spot-on-the-lawn realizado após incubação das bactérias ácido láticas a 8°C durante 7 dias
BAL
Indicadores
Listeria monocytogenes
ATCC 7644
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
QMF 4 19 8
QMF 6 18 6
QMF 11 21 9
QMF 18 21 9
Lactobacillus sakei 1 23 0
L. sakei ATCC 15521 0 0
38
Os sobrenadantes das quatro BAL produziram halos de inibição de diâmetros variáveis
frente à maioria dos micro-organismos indicadores testados (Tabela 5). Por outo lado, L. sakei
1, utilizado como controle positivo para produção de bacteriocinas, não foi capaz de inibir as
cepas de S. aureus. Apenas o sobrenadante referente à BAL QMF 11 foi capaz de inibir L.
monocytogenes, proveniente de queijo muçarela, apresentando halos de inibição também
referente aos outros micro-organismos patogênicos testados, mesmo após incubação sob
refrigeração. Sendo assim, foi selecionada para os experimentos de co-inoculação em leite
pasteurizado.
BAL isoladas de produtos lácteos com efeito inibidor sobre micro-organismos
patogênicos podem ser usadas para fabricação de diversos produtos lácteos fermentados
saudáveis e, quando isoladas a partir de leite ou produtos lácteos, são provavelmente os
melhores candidatos para melhorar a segurança microbiológica destes produtos por já estarem
adaptadas às condições do substrato (COSENTINO et al., 2012).
Ao et al. (2011) encontraram isolados de BAL com atividade anti-estafilocócica a partir
de Xueo (fermentado semelhante a iogurte feito de leite de iaque) e através do ensaio well-
difusion com neutralização dos sobrenadantes. Os halos obtidos possuíam entre 5-10 mm de
diâmetro, diâmetro semelhante aos encontrados neste trabalho.
Os resultados obtidos nos ensaios de difusão em poços corroboram com os obtidos por
Alegría et al. (2010) e Iranmanesh et al. (2013), que evidenciaram a importância da
neutralização dos sobrenadantes para caracterização da atividade inibitória da cultura
antagonística, uma vez que a neutralização permite descartar um possível efeito inibidor dos
ácidos orgânicos produzidos pela cultura teste frente aos micro-organismos indicadores. Os
autores observaram diferenças na produção de halos de inibição provocadas por BAL isoladas
de diferentes produtos lácteos frente a S. aureus e L. monocytogenes antes e após a etapa de
neutralização. Os resultados mostraram que a atividade inibitória das bactérias em que não
houve inibição após neutralização dos sobrenadantes, possivelmente, ocorria devido à produção
de ácidos.
39
5.7 Identificação das Bactérias Ácido Láticas (BAL)
Após sequenciamento do gene 16s do RNA, as BAL 4, 6, 11 e 18 foram identificadas
como Lc. lactis. Para estudos de co-inoculação em leite pasteurizado, a cepa de BAL produtora
de bacteriocina Lc. lactis QMF 11, foi selecionada, com base nos experimentos descritos
anteriormente.
Estirpes pertencentes à espécie Lc. lactis são comumente isoladas a partir de leite e
derivados. Terzic-Vidojevic et al. (2014) pesquisando queijos e outros produtos lácteos típicos
da Bósnia e Herzegovina, observaram que das BAL presentes nos produtos analisados, grande
parte era pertencente ao gênero Lactococcus e em sua maioria da mesma espécie encontrada
neste trabalho.
O principal habitat para os lactococos são os produtos lácteos e Lc. lactis e suas
subespécies figuram entre as mais importantes BAL usadas comercialmente (SAMARZIJA;
ANTUNAC; HAVRANEK, 2001). Essas BAL são de uso tradicional e generalizado na
indústria de laticínios como culturas starter, sendo um importante componente de fórmulas
comerciais usadas para produção de queijos e leites fermentados (LEROY; DE VUYST, 2004).
Além disso, muitas cepas de lactococos são reconhecidamente produtoras de bacteriocinas. A
nisina, produzida por cepas de Lc. lactis subsp. lactis, é a bacteriocina mais importante até o
momento e seu uso foi aprovado em mais de 50 países, sendo muito usada em queijos
processados e outros produtos lácteos e em alimentos enlatados (DELVES-BROUGHTON,
1990). Possui espectro de atividade relativamente amplo, inclusive contra bactérias Gram-
positivas produtoras de esporos, incluindo Clostridium botulinum (STILES; HOLZAPEFEL,
1997). Bactérias láticas, no entanto, são capazes de produzir outras bacteriocinas da classe dos
lantibióticos, além da nisina, e também dos não-lantibióticos, como algumas lactococinas
(ALEGRÍA et al., 2010; DE VUYST; LEROY, 2007).
Além das já conhecidas aplicações como cultura starter em alimentos fermentados
resultando em diversos produtos, pesquisas têm mostrado outros benefícios relacionados à
utilização de Lc. lactis: adição em alimentos como um veículo carreador de compostos
bioativos ao trato gastrointestinal de humanos e animais, protegendo-os do ambiente ácido;
liberação de enzimas capazes de atuar na maturação de queijos (STENTZ, et al. 2010);
fortificação de alimentos devido à produção de vitaminas como a riboflavina (BURGESS, et al.
2004) e ácido fólico (GANGADHARAN; NAMPOOTHIRI, 2011).
40
5.8 Experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado
Como se pode observar na Tabela 7, a pasteurização lenta (63°C durante 30 minutos)
resultou em um leite com contagens baixas de micro-organismos, e sem micro-organismos que
pudessem interferir nas contagens dos micro-organismos patogênicos. Não foi detectada
presença dos patógenos estudados no leite utilizado como controle, ao longo de todo período de
incubação, a 8°C. Houve um considerável aumento, ao final do período de incubação, nas
Contagens de Mesófilos Totais, de forma que, no 10º dia, o leite deixou de atender ao
parâmetro estabelecido pela Instrução Normativa nº 62 de 29 de dezembro de 2011 para
contagem de Mesófilos Totais: máximo 4,0 x 104 (BRASIL, 2011), razão pela qual as análises
foram interrompidas após 10 dias de incubação.
Tabela 7: Contagem das populações microbianas (UFC/mL) em leite de vaca pasteurizado (63°C durante 30 minutos), no tempo zero e após dez dias de incubação a 8°C
Micro-organismos 1º dia (UFC/mL) 10º dia (UFC/mL)
Mesófilos totais < 1,0 5,8 x 104
L. monocytogenes < 10 < 10
S. aureus < 10 < 10
Bactérias Ácido Láticas < 1,0 2,4 x 102
O armazenamento de alimentos em temperaturas superiores a 5°C caracteriza situação
de abuso por permitir que mais micro-organismos se multipliquem, prejudicando a segurança
do alimento (JOL et al., 2006) e representando um desafio a ser superado por países tropicais
como o Brasil. A escolha da temperatura de incubação (a 8°C) foi feita com o objetivo de
simular uma situação de abuso de temperatura.
As cepas de BAL Lc. lactis QMF 11 e L. sakei ATCC 15521 utilizadas nos ensaios de
co-inoculação, multiplicaram-se de forma lenta, porém constante, no leite pasteurizado ao
longo do período de armazenamento (Figuras 8 e 9, Tabelas 8 e 9).
41
Figura 8: Médias das populações Lactococcus lactis QMF 11 submetidas a diferentes condições de tratamento e mantidas a 8°C por 10 dias.
Tabela 8: Médias das populações de Lactococcus lactis QMF 11 (log UFC/mL) nos experimentos realizados em leite pasteurizado mantido a 8°C por 10 dias
Tempo
(dias) Lc. lactis QMF 11
Lc. lactis QMF 11 +
L. monocytogenes
Lc. lactis QMF 11 +
S. aureus
Lc. lactis QMF 11 +
L. monocytogenes +
S. aureus
0 6,02 ± 0,90ns 6,01±1,18 ns 5,97 ±0,97 ns 6,09 ±0,96 ns
1 5,95 ±1,02 ns 5,96 ±1,04 ns 5,85 ±1,15 ns 5,94 ±1,13 ns
2 6,14 ±0,98 ns 6,33 ±0,46 ns 6,06 ±0,94 ns 6,25 ±0,62 ns
3 6,48 ±0,61 ns 6,84 ±0,22 ns 6,01 ±0,97 ns 6,62 ±0,45 ns
4 6,75 ±0,03 ns 6,68 ±0,67 ns 6,42 ±0,54 ns 6,85±0,03 ns
6 6,90 ±0,02 ns 6,98 ±0,75 ns 6,63 ±0,12 ns 7,08 ±0,39 ns
8 6,86 ±0,14 ns 7,17 ±0,49 ns 6,76 ±0,29 ns 7,08 ±0,37 ns
10 6,78 ±0,22 ns 7,18 ±0,20 ns 6,96 ±0,05 ns 7,54 ±0,05 ns ns Não houve diferença significativa entre os tratamentos e entre os tempos de contagem em qualquer tempo de contagem pelo teste Scott-Knott a 5% de significância.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10 12
Lc. lactis QMF 11
S. aureus ATCC 25923 + Lc. lactis
QMF 11
L. monocytogenes ATCC 7644 +
Lc. lactis QMF 11
S. aureus ATCC 25923 + L.
monocytogenes ATCC 7644 + Lc.
lactis QMF 11
Tempo (dias)
Log
(UF
C/m
L)
42
Figura 9:Médias das populações de Lactobacillus sakei ATCC 15521 submetidas a diferentes condições de tratamento e mantidas a 8°C por 10 dias.
Tabela 9: Médias das populações de Lactobacillus sakei ATCC 15521 (log UFC/mL) nos experimentos realizados em leite pasteurizado mantido a 8°C por 10 dias
Tempo
(dias) L. sakei
L. sakei + L.
monocytogenes L. sakei + S. aureus
L. sakei + L.
monocytogenes + S.
aureus
0 6,23±0,21b1 6,26 ±0,25c 6,23±0,12d 6,28 ±0,24ns
1 6,22 ±0,25b 6,27±0,27c 6,29± 0,16d 6,28 ±0,28ns
2 6,27±0,22b 6,37 ±0,17c 6,37±0,10d 6,44 ±0,13 ns
3 6,45±0,18b 6,54 ±0,10b 6,53±0,09c 6,42±0,17 ns
4 6,86±0,03a 6,53±0,16b 6,65± 0,03b 6,62 ±0,04ns
6 6,90±0,01a 6,56±0,16b 6,89±0,02a 6,73 ±0,03ns
8 6,92±0,10a 6,89±0,01a 6,89 ±0,04a 7,15 ±0,27ns
10 6,76±0,19a 6,80±0,05a 7,01±0,04a 6,81±0,21 ns ns Não significativo; 1Não houve diferença significativa entre os tratamentos em qualquer tempo de contagem. a,b,c,dLetras minúsculas diferentes indicam diferença significativa pelo teste Scott-Knott à 5% de significância entre os tempos de contagem.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12
L. sakei ATCC 15521
S. aureus ATCC 25923 + L. sakei
ATCC 15521
L. monocytogenes ATCC 7644 +
L. sakei ATCC 15521
S. aureus ATCC 25923 + L.
monocytogenes ATCC 7644 + L.
sakei ATCC 15521
Log
(UF
C/m
L)
Tempo (dias)
43
Ambas BAL mostraram uma multiplicação maior a partir do 2º dia de incubação, sendo
que, em todos os tratamentos, obteve-se uma contagem inicial (dia 0) de Lc. lactis QMF 11
próxima a 6,0 log UFC/mL e no último dia de incubação, as maiores contagens foram na
presença de S. aureus ATCC 25923 e L. monocytogenes ATCC 7644 (7,54 log UFC/mL),
seguida pelo tratamento apenas com L. monocytogenes ATCC 7644 (7,18 log UFC/mL) e por
último o tratamento com S. aureus ATCC 25923 (6,96 log UFC/mL). Lc. lactis QMF 11
inoculado sozinho, ao final do período de incubação, resultou em menor contagem dentre os
quatro tratamentos: 6,86 log UFC/mL.
Para L. sakei ATCC 15521 a contagem inicial partiu de cerca de 6,2 log UFC/mL,
finalizando em torno de 6,8 log UFC/mL para todos os tratamentos, com exceção do tratamento
com S. aureus ATCC 25923, onde a contagem final foi de 7,01 log UFG/g (Figura 9). Contudo,
como se pode observar na Tabela 9, apesar do número aumentado não houve diferença
estatística, entre os tempos de contagem em qualquer tratamento, o mesmo ocorreu para Lc.
lactis QMF 11 (Tabela 8) onde também não houve diferença estatística entre os tratamentos. A
não ocorrência de diferença significativa entre os tratamentos, nos sugere que os patógenos
inoculados com Lc. lactis QMF 11 não influenciaram a multiplicação dessa bactéria lática nem
mesmo quando inoculados os três ao mesmo tempo. O padrão de multiplicação de BAL
também não foi influenciado pelos micro-organismos patogênicos nos estudos de co-inoculação
em produtos lácteos de Alomar et al. (2008) e Perin et al. (2013), com S. aureus e L.
monocytogenes, respectivamente.
A manutenção de contagens de BAL ao longo do período de incubação acima de 6,0 log
UFC/mL é um resultado importante, não somente para a produção de bacteriocinas e inibição
dos patógenos, mas também quando a intenção é um possível uso como probióticos, pois para
que haja efeitos benéficos no organismo sugere-se um nível de 106 UFC/g do micro-organismo
no alimento (ROBINSON, 1987). Essa concentração elevada se justifica para compensar uma
possível redução na contagem destes micro-organismos após a passagem pelo trato
gastrointestinal (SHAH, 2000).
As contagens iniciais de S. aureus ATCC 25923 partiram de cerca de 2,4 log UFC/mL
em todos tratamentos e no terceiro dia de incubação o número de células viáveis de S. aureus
ATCC 25923 ultrapassou 4 log UFC/mL em todos os tratamentos (Figura 10 e Tabela 10).
Após dez dias de incubação a 8°C o tratamento com L. sakei ATCC 15521 e L. monocytogenes
ATCC 7644 proporcionou um aumento de 4,38 log UFC/mL na população de S. aureus, que foi
maior inclusive que o patógeno quando inoculado sozinho (aumento de 2,94 log UFC/mL). A
média da contagem de S. aureus inoculado com Lc. lactis QMF 11 foi a menor encontrada
44
(4,70 log UFC/mL), mostrando que a bactéria lática foi mais eficiente que L. sakei,
provavelmente devido à produção de bacteriocinas, visto que ambas BAL apresentaram
desenvolvimento semelhante em todos os tratamentos.
Figura 10: Médias das populações de Staphylococcus aureus ATCC 25923 em experimentos de co-inoculação em leite pasteurizado mantido a 8°C por 10 dias. Tabela 10: Médias das populações de Staphylococus aureus ATCC 25923 (log UFC/mL) nos experimentos realizados em leite pasteurizado mantido a 8°C por 10 dias
Tempo
(dias)
Lc. lactis QMF
11 + S. aureus
Lc. lactis QMF 11 +
L. monocytogenes +
S. aureus
L. sakei + S.
aureus
L. sakei + L.
monocytogenes + S.
aureus
S. aureus
0 2,36 ±0,12dA 2,48± 0,02cA 2,43 ± 0,02dA 2,42±0,06cA 2,44 ±0,11dA
1 2,65 ±0,03dA 3,10± 0,18bA 3,17±0,38cA 3,16±0,31cA 2,62±0,12dA
2 3,30± 0,18cA 4,08 ± 0,31aA 3,44± 0,27cA 3,97±0,89cA 3,80 ±0,23cA
3 4,06±0,12bA 4,59± 0,55aA 4,17±0,55bA 4,95±1,02bA 4,07±0,15cA
4 4,66 ±0,08aA 4,32± 0,40aA 4,20 ±0,39bA 5,39±0,80bA 4,30±0,21cA
6 5,16 ±0,26aA 4,45 ±0,10aA 4,27 ±0,33bA 6,10±0,64aA 4,86±0,12bA
8 4,91± 0,02aC 4,82±0,02aC 4,71±0,07aC 6,28±0,03aA 5,26±0,08aB
10 4,70±0,13aD 5,48±0,14aB 5,00±0,01aC 6,80±0,12aA 5,38±0,29aB
1Médias seguidas por letras diferentes diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott p<0,05, em que as minúsculas comparam os dias de observação e as maiúsculas comparam os tratamentos.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 2 4 6 8 10 12
S. aureus ATCC 25923
S. aureus ATCC 25923 + Lc.
lactis QMF 11
S. aureus ATCC 25923 + L.
sakei ATCC 15521
S. aureus ATCC 25923 + L.
monocytogenes ATCC 7644 +
Lc. lactis QMF 11S. aureus ATCC 25923 + L.
monocytogenes ATCC 7644 + L.
sakei ATCC 15521
Tempo (dias)
Log
(UF
C/m
L)
45
As maiores contagens finais de S. aureus foram obtidas nos tratamentos em que o
patógeno foi inoculado juntamente com L. monocytogenes. Uma possível explicação para este
fato seria o processo de Quorum sensing, um mecanismo de percepção através do qual é
regulado o comportamento de micro-organismos unicelulares em determinado meio através da
liberação de sinais químicos capazes de induzir alterações como a regulação da expressão de
genes, controle do crescimento, atividades bioquímicas para sobrevivência, diferenciação das
espécies e até mesmo relacionamento com simbiontes e concorrentes (KELLER; SURETTE,
2006; ROCHA-ESTRADA et al., 2010).
Existem diferentes meios pelos quais bactérias são capazes de se comunicar com outras
bactérias ou com células eucarióticas. Algumas possuem um sistema de sinalização capaz de
monitorar a presença de outras bactérias, pelo reconhecimento de moléculas sinalizadoras
denominadas autoindutores. Estas moléculas são detectadas por mecanismos de sinalização que
permitem que os micro-organismos passem a atuar como único organismo multicelular, que
produz respostas favoráveis à sobrevivência da população (AMMOR; MICHAELIDIS;
NYCHAS, 2008; FUQUA; PARSEK; GREENBERG, 2001). Análises da sequência genômica
de L. monocytegenes tem revelado a presença de um sistema de QS com alta similaridade ao
sistema utilizado por S. aureus, denominado agr-system (AUTRET et al., 2003). Dessa forma,
é possível que a co-inoculação dos patógenos tenha influenciado de modo positivo o
desenvolvimento das populações de S. aureus.
O inóculo inicial de L. monocytogenes ATCC 7644 também partiu de cerca de 2,20 log
UFC/mL em média para todos os tratamentos (Figura e Tabela 11). Ao terceiro dia de
incubação as populações de L. monocytogenes ATCC 7644 aumentaram em cerca de 2 log
UFC/mL em todos os tratamentos, exceto naquele onde foi inoculada juntamente com Lc. lactis
QMF 11, onde o aumento não chegou a 1 log UFC/mL. Ao final do período de incubação,
obteve-se maior contagem do patógeno no tratamento em que foi inoculado em monocultura
(8,04 log UFC/mL), seguidos pelos tratamentos com S. aureus e L. sakei e pelo tratamento
apenas com a L. sakei ATCC 15521 nos quais o aumento da população de L. monocytogenes
foi de 5,38 e 5,13 log UFC/mL respectivamente. Na presença de Lc. lactis QMF 11 foram
obtidas as menores contagens para o patógeno até mesmo na presença de S. aureus (2,42 log
UFC/mL). A diferença superou 5 log UFC/mL em relação à menor e maior contagens do
último dia de incubação, sendo que a menor média foi obtida na co-cultura de Lc. lactis e L.
monocytogenes: 2,27 log UFC/mL. O melhor controle por Lc. lactis QMF11 foi ainda mais
evidente para L. monocytogenes do que para S. aureus. Em relação às contagens do 8º dia de
46
incubação, não foi possível estabelecer comparações estatísticas porque os dados de um bloco
(uma repetição) foram perdidos.
Figura 11: Médias das populações de Listeria monocytogenes ATCC 7644 submetidas a diferentes condições de tratamento e mantidas a 8°C por 10 dias.
Tabela 11: Médias das populações de Listeria monocytogenes ATCC 7644 (log UFC/mL) nos experimentos realizados em leite pasteurizado mantido a 8°C por 10 dias
Tempo
(dias)
Lc. lactis QMF 11 +
L. monocytogenes
Lc. lactis QMF 11 +
L. monocytogenes +
S. aureus
L. sakei + L.
monocytogenes
L. sakei + L.
monocytogenes
+ S. aureus
L.
monocytogenes
0 2,24± 0,05aA 2,20 ±0,04aA 2,20 ±0,12dA 2,10± 0,02dA 2,27±0,10eA
1 2,08 ± 0,05aB 2,88 ± 0,14aA 2,94±0,41dA 3,05±0,14dA 2,83± 0,07eA
2 2,78 ± 0,47aB 3,85 ± 0,49aA 4,13± 0,95cA 3,86± 0,45cA 3,77±0,39dA
3 3,07 ±0,67aA 4,08 ±1,47aA 4,30±0,06cA 4,65±0,66cA 4,17±0,27dA
4 2,90 ±0,08aA 4,06 ± 1,62aA 5,66±0,40bA 5,19±1,26cA 4,95±0,63cA
6 2,74 ±0,69aB 3,49 ±0,58aB 6,08±0,64bA 6,20± 0,80bA 5,87±0,38bA
82 3,58 2,85 7,17 6,91 6,23
10 2,27 ±0,38aB 2,42 ±0,26aB 7,33±0,41aA 7,48±0,31aA 8,04±0,30aA
1Médias seguidas por letras diferentes diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott p<0,05, em que as minúsculas comparam os dias de observação (tempo) e as maiúsculas comparam os tratamentos; 2 O desvio padrão para a o oitavo dia de incubação não foi apresentado devido perda experimental de uma repetição, havendo apenas uma contagem.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12
L. monocytogenes ATCC 7644
L. monocytogenes ATCC 7644
+ Lc. lactis QMF 11
L. monocytogenes ATCC 7644
+ L. sakei ATCC 15521
L. monocytogenes ATCC 7644
+ S. aureus ATCC 25923 + Lc.
lactis QMF 11
L. monocytogenes ATCC 7644
+ S. aureus ATCC 25923 + L.
sakei ATCC 15521
Tempo (dias)
Log
(UF
C/m
L)
47
Os resultados encontrados indicam que a capacidade inibitória das BAL produtoras de
bacteriocinas frente a micro-organismos alvo é dependente não apenas da linhagem produtora e
da bacteriocina produzida, mas também dos micro-organismos que se pretende inibir e do tipo
de alimento avaliado.
Dimitrieva-Moats e Ünlü (2012) pesquisaram o efeito antilisterial e antiestafilocócico
de Lc. lactis em queijo Cheddar incubado a 4°C por 48 horas e obtiveram redução de cerca de 6
Log (UFC/mL) na multiplicação tanto de L. monocytogenes quanto de S. aureus. Alomar et al.
(2008) por sua vez, obtiveram redução entre 3-4 log UFC/mL após 24 horas em co-culturas de
bactérias ácido láticas com S. aureus em leite microfiltrado. A redução de S. aureus encontrada
neste trabalho se aproximou mais dos resultados encontrados por Felicio et al. (2015) que
obtiveram redução de cerca de 1 log UFC/g na multiplicação de S. aureus na presença de nisina
em queijo Minas frescal após 30 dias a 4°C.
Em relação à atividade antilisterial, autores como Coelho et al. (2014) e Dal Bello et al.
(2012) obtiveram uma redução de 2 log UFC/g no crescimento de L. monocytogenes co-
inoculados com Lc. lactis em queijo fresco e em queijo Cottage, respectivamente, armazenados
durante sete dias a 4°C. Perim et al. (2013) após 96 hs de incubação de leite desnatado co-
inoculado com L. monocytogenes e BAL bacteriocinogênica obtiveram redução de apenas 1 log
UFC/mL a 7°C, mas já quando incubados a 25°C a redução passou a 3 log UFC/ mL. Uma
redução de apenas 1 log UFC/mL foi obtida por Cosentino et al. (2012) após 24 horas de
incubação de leite desnatado a 30°C co-inoculado com Lc. lactis subsp. lactis.
A utilização direta da bacteriocina pode também ser mais efetiva do que a co-inoculação
das cepas bacteriocinogênicas. Foi o observado por Furtado et al. (2015) que obtiveram
redução de mais de 6 log UFC/mL nas contagens de L. monocytogenes ao adicioná-la
juntamente com nisina em queijo tipo Minas frescal de leite de cabra por 10 dias, a 8-10°C. Já
no tratamento com Lc. lactis ocorreu controle da multiplicação do patógeno em pouco mais de
2 UFC/mL. Arqués et al. (2011) verificaram a atividade antilisterial e antiestafilocócica de
nisina e reuterina (produzida por Lactobacillus reuteri) em leite desnatado pasteurizado por
Ultra High Temperature (UHT) e armazenado em duas temperaturas: 4°C e 8°C. Após 12 dias
de incubação a 8°C, a contagem de L. monocytogenes foi cerca de 1,5 log (UFC/mL) menor
que o controle sem bacteriocinas na presença de nisina e cerca de 4 log UFC/mL na presença
de reuterina e quando combinados, o micro-organismo foi inibido até o limite de detecção do
método (1 UFC/mL). No caso do S. aureus, na presença de nisina a inibição foi de cerca de 0,7
log (UFC/mL), na presença de reuterina cerca de 4 log (UFC/mL) e quando combinadas a
inibição também chegou até o limite de detecção do método (1 UFC/mL).
48
Alguns pesquisadores testaram a atividade de BAL isoladas de matrizes lácteas em
produtos de outras origens, como no trabalho de Barman, Gosh e Mandal (2014) que isolaram
Lc. lactis subsp. lactis a partir de leite fermentado e verificaram a atividade antilisterial do
sobrenadante sobre matriz cárnea. Após dez dias de incubação a 4°C eles obtiveram redução de
cerca de 3 log (UFC/mL) de L. monocytogenes que se manteve praticamente a mesma até o 25º
dia de incubação.
Classificado como generally recognized as safe (GRAS) (RIBEIRO et al., 2013), Lc.
lactis também foi considerado adequado ao status de Qualified Presumption of Safety (QPS)
pelo European Scientific Committee (European Food Safety Agency - EFSA, 2007). Perante a
comprovada segurança, possibilidade de melhorar a qualidade e a variedade de produtos
alimentícios, várias pesquisas têm buscado avaliar a possibilidade de utilização de bactérias
láticas como Lc. lactis como probióticos.
Para que um micro-organismo seja de uso aprovado como probiótico é preciso que o
mesmo seja objeto de ensaios in vitro e in vivo. Dentre as avaliações a serem feitas, é preciso
averiguar a capacidade da cepa em sobreviver à acidez estomacal e aos ácidos biliares para que
possam chegar até o intestino e levar benefícios à saúde intestinal (LIU et al., 2013).
Outro critério para que uma cepa seja candidata ao uso como probiótico é se manter
viável durante todo o período de armazenamento do produto (VASILJEVIC; SHAH, 2008). É
preciso também verificar a produção de substâncias antimicrobianas e a resistência a
antibióticos para evitar que genes de resistência sejam transferidos a bactérias patogênicas
(VERDENELLI et al., 2009; VIZOSO-PINTO et al., 2006). Neste sentido, Monteagudo-Mera
et al. (2012) realizaram vários testes para verificar a segurança e o potencial probiótico de
cepas isoladas a partir de produtos lácteos, incluindo Lc. lactis. Não foi observada resistência
de Lc. lactis aos antibióticos testados, e as mesmas mostraram boa resistência à acidez. Em
relação à atividade antimicrobiana, foram capazes de inibir patógenos como Bacillus cereus, L.
innocua, L. monocytogenes e S. aureus. Estes resultados e os demais encontrados indicaram
que as cepas de Lc. lactis apresentam propriedades que possibilitam a utilização no
desenvolvimento de novos alimentos probióticos.
Para que uma BAL seja usada em bioconservação, é preciso também avaliar a presença
de fatores de virulência para determinar os potenciais riscos envolvidos na utilização da
mesma. Um fator preocupante é a produção pelas BAL de aminas biogênicas, que pode ocorrer
durante o processo de fermentação de alimentos e bebidas por descarboxilação de aminoácidos
(COSENTINO et al., 2012) e se ingeridas em grande quantidade, podem gerar quadros
toxicológicos graves (BODMER; IMARK; KNEUBÜHL; 1999)
49
Algumas bactérias láticas, por exemplo os enterococos, têm sido associadas a infecções
em humanos o que inviabiliza sua aplicação em alimentos, mesmo possuindo atividade
bacteriocinogênica. Devido à reconhecida segurança, bactérias ácido láticas como Lc. lactis
têm sido objeto de pesquisa para expressão heteróloga de bacteriocinas produzidas por outras
bactérias, como as enterocinas, e resultados importantes na inibição de patógenos têm sido
obtidos (LIU et al., 2008).
Durante a produção e armazenamento de produtos lácteos, grandes perdas acontecem
devido contaminação microbiana. A seleção de BAL com boas propriedades antimicrobianas e
fermentativas pode reduzir problemas com contaminação microbiana e atender à demanda
crescente por alimentos sem conservantes químicos (CLEVELAND et al., 2001).
Vários fatores podem influenciar o uso de bactérias fermentadoras em alimentos na
eliminação ou inibição do crescimento de bactérias deteriorantes ou patogênicas. Substâncias
presentes no produto ou produzidas pela microbiota endógena ou até mesmo interações com
componentes específicos do alimento podem levar à inativação de compostos antagonísticos.
Por outro lado, alguns compostos específicos de um produto podem também favorecer o
desenvolvimento de BAL (HARTMAN; WILKE; ERDMANN, 2011). Têm-se observado
inclusive que a eficácia das bacteriocinas tende a ser menor em alimentos em comparação a
meios de cultura (GÄNZLE; WEBER; HAMMES, 1999; SCHILLINGER; GEISEN;
HOLZAPFEL, 1996) e isto pode se justificar por diversos fatores como: inativação química ou
enzimática, baixa solubilidade, adsorção da bacteriocina ao alimento, ou até mesmo
distribuição não uniforme na matriz alimentar (GÁLVEZ et al., 2007).
A aplicação de BAL em produtos fluidos como o leite possibilita uma boa solubilidade
e distribuição das mesmas e de suas bacteriocinas. Uma pasteurização adequada antes da adição
das BAL ou de bacteriocinas permite uma redução importante da microbiota endógena que
poderia influenciar na atividade das mesmas. Como cada bacteriocina possui propriedades
bioquímicas individuais, o nível de inativação será diferente em cada sistema alimentar. Uma
bactéria pode, portanto, apresentar maior resistência ou estar mais protegida da atividade de
bacteriocinas devido a alterações metabólicas ou de membrana pelo ambiente do leite. Com
isso, a efetividade das bacteriocinas deve ser verificada em cada alimento para micro-
organismos alvo e não-alvo. Além disso, o uso de bacteriocinas não deve ser o único método de
conservação usado em um produto, mas ser uma parte de um sistema com múltiplos princípios
de conservação chamados obstáculos (HARTMAN; WILKE; ERDMANN, 2011).
50
CONCLUSÕES
Concluiu-se que:
1. Foi possível isolar, a partir de QMF culturas produtoras de bacteriocinas com atividade
inibitória frente a Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus.
2. As quatro BAL com melhor atividade inibitória frente aos patógenos avaliados (QMF
4, QMF 6, QMF 11 e QMF 18), foram identificadas através de sequenciamento do gene
16s rRNA como Lactococcus lactis.
3. A cepa selecionada para os testes de co-inoculação em leite pasteurizado (8°C por 10
dias), QMF 11, inibiu a multiplicação de Listeria monocytogenes já a partir do 4º dia de
incubação (Listeria monocytogenes + BAL QMF11), enquanto a inibição de
Staphylococcus aureus ocorreu apenas a partir do 6º dia de incubação (S. aureus + BAL
QMF11).
4. Apesar de inibir significativamente a multiplicação de Staphylococcus aureus,
Lactococcus lactis QMF 11 foi mais eficiente em inibir Listeria monocytogenes.
5. Lactococcus lactis QMF 11, produtor de bacteriocinas, apresenta potencial para
utilização em sistemas de bioconservação de produtos lácteos.
51
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