Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento

ÍTALO RIGOTTI PEREIRA TINI

CITOTOXICIDADE DE EXTRATOS DE CEBOLA ROXA (Allium cepa) E FLAVONOIDE QUERCETINA ASSOCIADOS À TERAPIA FOTODINÂMICA NA

LINHAGEM TUMORAL HEp-2

São José dos Campos, SP 2016

ÍTALO RIGOTTI PEREIRA TINI

CITOTOXICIDADE DE EXTRATOS DE CEBOLA ROXA (Allium cepa) E FLAVONOIDE QUERCETINA ASSOCIADOS À TERAPIA FOTODINÂMICA NA

LINHAGEM TUMORAL HEp-2

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade do Vale do Paraíba como complementação dos créditos necessários para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Newton Soares da Silva

São José dos Campos, SP 2016

ÍTALO RIGOTTI PEREIRA TINI

CITOTOXICIDADE DE EXTRATOS DE CEBOLA ROXA (Allium cepa) E FLAVONOIDE QUERCETINA ASSOCIADOS À TERAPIA FOTODINÂMICA NA

LINHAGEM TUMORAL HEp-2 Banca Examinadora: Prof. Dr. Newton Soares da Silva (orientador) Prof. Dra. Luciane Dias de Oliveira (UNESP) Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares (UNIVAP) Profa. Dra. Flávia Vilaça Morais (suplente) Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa Diretora do IP&D - UNIVAP São José dos Campos, 17 de Fevereiro de 2016. (Data defesa)

DEDICATÓRIA

À Deus por estar comigo em todos os momentos, bons e ruins, e ter me dado a

oportunidade de cumprir com meus objetivos e avançar mais um passo importante

na minha vida.

Aos meus familiares, professores (Newton Soares da Silva e Cristina Pacheco Soares) e amigos, por estarem sempre presentes e dispostos e me ajudar.

“Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não temerei mal nenhum, porque tu estás comigo” (Salmo 23.4)

AGRADECIMENTOS

Agradeço intensamente os meus pais, Marisa Ribeiro Pereira e Maurízio Ângelo Maria Tini, irmão, Daniel Rigotti Pereira Pinto e demais familiares por

estarem sempre presentes e acreditarem na concretização de meus sonhos.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Newton Soares da Silva, pelos incontáveis

ensinamentos e confiança depositada em mim, no qual, sem ele, não teria realizado

o curso de mestrado.

À minha co-orientadora Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares, pela paciência

e pelo carinho, estando sempre disposta a ajudar a todos.

À Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior –

CAPES, pela bolsa de estudos concedida, necessária para minha dedicação

exclusiva no curso de mestrado.

À Universidade do Vale do Paraíba e todos seus professores, pela

oportunidade de ensino e aprendizado.

À banca examinadora da qualificação, pelas sugestões e críticas que

contribuíram para o enriquecimento do trabalho.

Aos amigos e colegas de mestrado e laboratório, Rafael Rodrigues, Bárbara Rosa Penha, Geisa Salles, Fernanda dos Santos, Roberta Kelly, Bruno Godoi, Aline Magraf, Carlos Priante, Paloma Gonçalves, Janaina Guarino, Isabel Chaves, Carlos Dailton, Mateus Moroti, Andréa Pires, Chaynne Marçal, Valeria Moraes e Antonieta que me ajudaram em vários momentos durante o curso de

mestrado.

Resumo A cebola roxa (Allium cepa) é um vegetal que constitui uma das principais fontes de quercetina na dieta humana, contribuindo com cerca de 30% dos flavonoides consumidos, os quais agem como anticarcinogênico, antineoplásico, antibacteriano, antiviral, antialérgico e antimutagênico, exibindo também, atividades no sistema cardiovascular. A Terapia Fotodinâmica consiste em uma reação fotoquímica utilizada com o objetivo de causar destruição seletiva de um tecido. Com base nessas evidências, o presente estudo visou avaliar a influência dos extratos de cebola roxa e QCT (padrão), sem e com a presença da Terapia Fotodinâmica (TFD), realizada com o fotossensibilizante AlPcS4, sobre células de carcinoma de laringe humana (HEp-2). Para as extrações com cebola roxa foram utilizados diferentes solventes (Clorofórmio, Metanol 70% e Etanol 70%), empregando o extrator Soxhlet. Amostras foram submetidas aos testes de cromatografia gasosa (CG), avaliação de atividade metabólica mitocondrial (MTT) - sem e com a presença da TFD - e microscopia de fluorescência (Mitocôndrias e núcleo). De acordo com as analises realizadas através do teste de CG, pode ser observado picos específicos que caracterizam os extratos como flavonoide quercetina. Os resultados obtidos a partir do teste de MTT, sem a presença da TFD, demonstraram que na concentração de 5 μm, de extratos e QCT não houve perda da atividade mitocondrial, enquan to que nas concentrações de 50 e 100 μM houve uma redução significativa da atividade mitocondrial. No teste de MTT, na presença da TFD, houve uma redução apenas na concentração de 100 μM nos extratos Clorofórmio e Etanol 70%. Além disso, observou-se diminuição no potencial de membrana mitocondrial, alterações morfológicas no núcleo e características de apoptose precoce, tardia, necrose ou células totalmente mortas. Com base nos resultados, os extratos e QCT em concentrações de 50 e 100 μM, sem a presença de TFD, induzem, significativamente, a citotoxicidade das células HEp-2, causando diminuição da viabilidade celular por apoptose e/ou necrose. Palavras-chave: Extrato. Allium cepa. Quercetina. Cultura de células.

Abstract The red onion (Allium cepa) is a vegetable that is a major source of quercetin in the human diet, contributing around 30% of consumed flavonoids, which act as anticarcinogenic, anticancer, antibacterial, antiviral, anti-allergic and antimutagenic, displaying also, activities on the cardiovascular system. Photodynamic therapy consists of a photochemical reaction used in order to cause selective destruction of tissue. Based on this evidence, this study aimed to evaluate the influence of red onion extracts and QCT (standard), with and without the presence of Photodynamic Therapy (PDT), carried out with the photosensitizer AlPcS4, on human laryngeal carcinoma cells (Hep-2). Different solvents were used for red onions extractions, (chloroform, 70% methanol and 70% ethanol) using a Soxhlet extractor. Samples were subjected to gas chromatography test (GC), evaluation of mitochondrial metabolic activity (MTT) - with and without the presence of GT - and fluorescence microscopy (mitochondria and nucleus). According to the analysis carried out by the GC test, specific peaks that characterize the extracts as flavonoid quercetin can be observed. The results obtained from the MTT assay without PDT showed that at a concentration of 5 μm extracts and QCT there is no loss of mitochondrial activity), while at concentrations of 50 and 100 μM there was a significant reduction in mitochondrial activity. In the MTT assay, in the presence of PDT, there was only a reduction in the concentration of 100 μM in Chloroform extracts and 70% ethanol. Furthermore, a decrease in mitochondrial membrane potential, morphological changes in the nucleus characteristic of apoptosis, and early, late, necrosis or completely dead cells were observed.”). Based on the results, the extracts QCT at concentrations of 50 and 100 uM, without PDT, significantly induces cytotoxicity of HEp-2 cells, causing decreased cell viability by apoptosis and / or necrosis.

Key-words: Extract. Allium cepa. Quercetin. Cell Culture.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Cebola roxa (Allium cepa). ................................................................................... 19 Figura 2 – Cebola roxa (Allium cepa) utilizada para experimentação. .................................. 19 Figura 3 - Estrutura química dos flavonoides com indicação da numeração dos carbonos. . 20 Figura 4 - Estrutura química da quercetina com indicação da numeração dos carbonos. .... 22 Figura 5 - Estrutura química da rutina. .................................................................................. 23 Figura 6 - Princípio básico da Terapia Fotodinâmica (TFD). ................................................. 26 Figura 7 - Extrator Soxhlet utilizado na técnica de extração. A) Equipamento completo. B) Detalhe do sistema de refluxo do solvente. ........................................................................... 31 Figura 8 – Processo de rotaevaporação do solvente. ........................................................... 32 Figura 9 – Rotaevaporador (Buchi modelo R-114) utilizado para a evaporação do solvente. ............................................................................................................................................... 32 Figura 10 - Fotomicrografia de campo claro da linhagem celular HEp-2 utilizada para os experimentos. Ampliação original, 1000x. ............................................................................. 33 Figura 11 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Clorofórmio), QCT + Solvente (Clorofórmio) e Extrato + Solvente (Clorofórmio). ................................................................. 39 Figura 12 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Metanol 70%), QCT + Solvente (Metanol 70%) e Extrato + Solvente (Metanol 70%). ........................................................................... 40 Figura 13 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Etanol 70%), QCT + Solvente (Etanol 70%) e Extrato + Solvente (Etanol 70%). .............................................................................. 40 Figura 14 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Metanol 70%). ..................................................................................................................................... 41 Figura 15 - Teste MTT com diferentes concentrações 0, 5, 50 e 100 μ M) de extrato (Clorofórmio). ......................................................................................................................... 41 Figura 16 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de QCT. ............ 41 Figura 17 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Etanol 70%). ..................................................................................................................................... 41 Figura 18 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Metanol 70%) + TFD. .......................................................................................................................... 42 Figura 19 - este MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Clorofórmio) + TFD. .............................................................................................................. 42 Figura 20 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de QCT + TFD. . 42 Figura 21 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Etanol 70%) + TFD. .......................................................................................................................... 42 Figura 22 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Clorofórmio). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Clorofórmio). ......................................................................................................................... 43 Figura 23 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Metanol 70%). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Metanol 70%). ...................................................................................................................... 44 Figura 24 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Etanol 70%). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Etanol 70%). ..................................................................................................................................... 44 Figura 25 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de QCT.. ............................................................................................ 45 Figura 26 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo controle. A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência.. 46 Figura 27 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 5 µM de extrato (Clorofórmio).. ................................................................ 46

Figura 28 - Detecção de morte celular. Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 50 µM de extrato (Clorofórmio). A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência.. ............................. 47 Figura 29 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 100 µM de extrato (Clorofórmio).............................................................. 47

Lista de figuras e tabelas

Tabela 1 - Tabela 1. Principais subclasses dos flavonoides e exemplos. ............................. 21 Tabela 2 - Valores dos parâmetros de irradiação utilizados na TFD. .................................... 36

Lista de abreviaturas e siglas

AlPcS4 – Alumínio Ftalocianina Tetrasulfonada ALA - Ácido 5-aminolevulínico ANOVA - Análise de variância BSTFA - N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide CG – Cromatografia Gasosa CO2 – Dióxido de Carbono DA - Daidizeína DAPI – 4’6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride DMEM – Meio de Eagle Modificado por Dulbecco DMSO – Dimetilsulfóxido DNA – Ácido Desoxirribonucléico EROs – Espécies Reativas de Oxigênio FC - Ftalocianina FS - Fotossensibilizante HEp-2 – Carcinoma de laringe humana HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana HL60 – Células de Leucemia Humana HPLC – Cromatografia Líquida de Alto Desempenho InGaAlP – Fosfeto de índio-gálio-alumínio MAL - Metilaminolevulinato MTT - 3-[(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] NF-Κb – Fator Nuclear Kappa B PARP – Poly (ADP-ribose) Polimerase PBS – Salina Tamponada com Fosfato PI – Iodeto de Propídeo QCT - Quercetina rpm – rotações por minuto SFB – Soro Fetal Bovino TFD – Terapia Fotodinâmica TNF-α – Fator de Necrose Tumoral

Sumário 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 14 2 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................ 16 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 16 3 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 17 3.1 EXTRAÇÕES ................................................................................................................... 17 3.2 Allium cepa ....................................................................................................................... 18 3.3 FLAVONOIDES ............................................................................................................... 20 3.4 QUERCETINA ................................................................................................................. 21 3.4.1 Principais ações e efeitos da QCT ............................................................................ 23 3.5 TERAPIA FOTODINÂMICA (TFD) ............................................................................... 25 4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 31 4.1 PROCESSOS DE EXTRAÇÃO E ROTAEVAPORAÇÃO ........................................ 31 4.2 ANÁLISE DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) .................................................... 32 4.3 LINHAGEM CELULAR E MEIO DE CULTURA ......................................................... 33 4.4 CRESCIMENTO, MANUTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS PARA EXPERIMENTAÇÃO ............................................................................................................. 34 4.5 CONCENTRAÇÕES DOS EXTRATOS E QCT NAS CÉLULAS ............................ 34 4.6 PLAQUEAMENTO E ADIÇÃO DOS EXTRATOS E QCT ........................................ 35 4.7 TFD COMPLEMENTADA COM EXTRATOS E QCT ................................................ 35 4.8 ENSAIO DE ATIVIDADE METABÓLICA MITOCONDRIAL ..................................... 36 4.9 MARCAÇÕES FLUORESCENTES - MITOCÔNDRIAS E NÚCLEO ..................... 37 4.10 MARCAÇÕES FLUORESCENTES – APOPTOSE/NECROSE ............................ 37 4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 38 5 RESULTADOS .................................................................................................................... 39 5.1 ANÁLISE DAS AMOSTRAS (EXTRATOS, QCT E SOLVENTES) ATRAVÉS DO TESTE DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) .............................................................. 39 5.2 AÇÃO DOS EXTRATOS E QCT SOBRE CÉLULAS HEp-2 NA AUSÊNCIA DE TERAPIA FOTODINÂMICA ................................................................................................. 41 5.4 AÇÃO DOS EXTRATOS E QCT NO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL E NÚCLEO .............................................................................................. 43 5.5 AÇÃO DO EXTRATO (CLOROFÓRMIO) NA DETECÇÃO DE MORTE CELULAR .................................................................................................................................................. 46 6 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 48 7 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 52 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 53

14

1 INTRODUÇÃO

A cebola roxa (Allium cepa) é um vegetal que constitui uma das principais

fontes de quercetina na dieta humana, contribuindo com cerca de 30% dos

flavonoides consumidos (HERTOG; HOLLMAN; KATAN, 1992). A extração de

quercetina neste vegetal envolve técnicas de separação freqüentemente usadas em

laboratório de química analítica para isolar um ou mais de seus componentes. O

aperfeiçoamento da técnica de extração de quercetina neste vegetal é fundamental

visto que, poucos detalhes podem resultar em efeitos que comprometem a

confiabilidade dos resultados. Para atingir esta meta com o mínimo de experimentos,

planejamentos fatoriais completos permitem aperfeiçoar metodologias, avaliando

seus efeitos e possíveis interações de fatores nas respostas desejadas (MORAIS et

al., 2001; GARDA-BUFFON; BADIALE-FURLONG, 2008; apud SOUZA et al., 2009).

Os flavonoides são substâncias resultantes dos metabólitos secundários das

plantas, constituindo o maior e mais importante grupo de compostos polifenólicos

encontrados, amplamente, no reino vegetal (NIJVELDT et al., 2001; BEECHER,

2003). São substâncias encontradas em produtos naturais, como nas ervas

medicinais, maçã, cebola e vinho, sendo bastante estudadas devido as suas

propriedades antioxidantes, que irão interagir com os radicais livres protegendo o

DNA contra danos oxidativos, (VELIOGLU et al., 1998; CALLISTE et al., 2003). Além

disso, agem como anticarcinogênico, antibacteriano, antiviral, antialérgico,

antimutagênico, exibem atividades no sistema cardiovascular e causam aumento na

permeabilidade capilar e migração de leucócitos (PELZER et al., 1998).

A quercetina (3,5,7,3’,4’–pentahidroxiflavone) é um integrante da subclasse

dos flavonóis, onde seu consumo, em maior quantidade dentre os flavonoides, é

cerca de 26 mg a 1 g/dia (HERTOG; HOLLMAN; KATAN, 1992; SESSO et al.,

2003). Vários estudos vêm demonstrando que a quercetina pode ser eficiente no

tratamento de câncer, devido a redução da viabilidade celular em diferentes

linhagens de células tumorais, tais como, câncer de mama (DUO et al., 2012),

próstata (VIJAYABABU et al., 2005), pulmão (ROBASZKIEWICZ; BALCERCZYK;

BARTOSZ, 2007) e fígado (GRANADO-SERRANO et al., 2006), além de apresentar

benefícios na inibição da agregação plaquetária (TZENG; KO; KO, 1991), na

detoxicação de diversas enzimas (UDA et al.,1997) e capacidade de induzir a

apoptose (WEN-FU et al., 2003).

15

Uma pesquisa recentemente, conduzida por Rodrigues et al. (2014),

demonstrou que a quercetina em baixas concentrações não apresenta

citotoxicidade, ao passo que, em altas concentrações reduz, significativamente, a

viabilidade da linhagem celular HEp-2 (Carcinoma de laringe humano) após a

complementação da TFD, gerando uma intensa redução do padrão de atividade

mitocondrial.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é definida como uma reação fotoquímica

utilizada com o objetivo de causar destruição seletiva de um tecido. É uma técnica

terapêutica de duas etapas, na qual a utilização de uma droga sensibilizante, tópica

ou sistêmica, é seguida da irradiação de uma luz visível (KURWA; BARLOW, 1999).

Essa técnica pode ser utilizada como terapia complementar no tratamento do câncer

combinada, antes ou após, à quimioterapia, radioterapia ou cirurgia, sem

comprometer essas modalidades terapêuticas (AGOSTINIS et al., 2011).

Clinicamente, a TFD já vem sendo empregada no tratamento de câncer de intestino,

bexiga, pulmão, pele (primário e metastático do seio) e trato digestivo superior

(SCHUITMAKER et al., 1996).

Estudos realizados por Zhang et al. (2012) exploraram os efeitos da

daidizeína (DA) e isoflavonas na aplicação do fotossensibilizante ácido-5-

aminolevulínico mediada por TFD em células leucêmicas, sendo constatado que a

daidizeína (DA) não afeta a eficiência do tratamento, ao passo que as isoflavonas

aumentam a citotoxicidade induzida pela Terapia Fotodinâmica.

16

2 OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência dos diferentes extratos de cebola roxa (Allium cepa) e

quercetina (QCT) padrão, associados ou não a Terapia Fotodinâmica (TFD) em

células de carcinoma de laringe humana (HEp-2).

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar extrações de cebola roxa (Allium cepa) utilizando os diferentes

solventes: Clorofórmio, Metanol 70% e Etanol 70%;

Avaliar possível presença do flavonoide quercetina nos extratos, utilizando o

teste de Cromatografia Gasosa (CG);

Avaliar a influência de diferentes concentrações dos extratos e QCT (0, 5, 50

e 100 μM) em células HEp-2, com e sem a aplicação da Terapia Fotodinâmica

(TFD), pelo ensaio de atividade metabólica mitocondrial – MTT;

Analisar a influência dos extratos e QCT em células HEp-2, avaliando o

potencial de membrana mitocondrial e morfologia do núcleo, por meio de

microscopia de fluorescência;

Investigar a indução de morte celular (apoptose e/ou necrose), causada pelas

diferentes concentrações dos extratos e QCT em células HEp-2, por microscopia de

fluorescência.

17

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 EXTRAÇÕES

Atualmente, existem diversas técnicas para a obtenção de extratos vegetais,

principalmente quando se trata de compostos antioxidantes, também conhecidos

como substâncias bioativas. Dentre essas técnicas, podem ser citadas as

tradicionais hidrodestilação, podendo ser realizado por arraste a vapor ou coobação

(recirculação de águas condensadas); supercrítica, que mediante mudanças na

pressão e na temperatura transforma o dióxido de carbono (CO2) em fluido

supercrítico para a extração; e destilação a vapor, utilizando o Soxhlet, melhor forma

de extração continua utilizando um solvente quente (LEAL et al., 2003; REHMAN;

HABIB; SHAH, 2004). Devido à influência de diversos fatores que esses compostos

bioativos podem sofrer durante a extração (como o tempo, temperatura, natureza do

vegetal e solvente empregado na extração), não há como selecionar a metodologia

mais eficiente sob o ponto de vista químico (SHAIDI; NACZK, 1995).

Os agentes antioxidantes estão presentes nos alimentos tanto na forma

natural como intencional, na qual possui como uma das principais características o

retardo do aparecimento dos fenômenos que induzem a oxidação, mantendo

intactas suas características sensoriais. Os antioxidantes presentes ou adicionados

nos alimentos não devem causar efeitos fisiológicos negativos, produzir cores,

odores nem sabores anômalos. Devem ser resistentes aos tratamentos no qual será

submetido, serem lipossolúveis e ativos em baixas temperaturas e econômicos

(ORDÓÑEZ et al., 2005).

Estudos realizados por Andreo e Jorge (2006) indicam que a extração de

substâncias antioxidantes com solventes orgânicos pode ser eficiente para alguns

casos, onde é exigido um controle rigoroso de fatores como, a polaridade do

solvente utilizado, o tempo e a temperatura de extração, pois pode ocorrer perda ou

destruição dos compostos antioxidantes.

Para a obtenção de um melhor processo de extração e conservação dos

antioxidantes, algumas medidas devem ser realizadas antecipadamente, visto que

essas substâncias são sensíveis à ação da luz, calor e oxigênio (AZIZAH;

RUSLAWATTI; TEE, 1998). Para uma extração mais eficiente, os vegetais devem

ser desidratados, liofilizados ou congelados, e ainda moídos ou peneirados antes do

18

processo de extração. Assim, os substratos atingem maior superfície de contato com

o solvente de extração. (JUNTACHOTE; BERGHOFER, 2005).

Os solventes metanol e etanol têm apresentado um rendimento alto na

extração de óleos vegetais, além de apresentarem um menor grau de toxicidade e

serem oriundos de fontes renováveis de energia (ISSARIYAKUL et al., 2007;

HOTZA; DINIZ DA COSTA, 2008; CUEVAS; RODRIGUES; MEIRELLES et al.,

2009).

Uma das vantagens apresentadas pelas técnicas baseadas na mistura entre

clorofórmio e metanol é a alta capacidade de extraírem, eficientemente, tanto lipídios

polares quanto lipídios neutros. Estudos vêm demonstrando que, a influência nos

resultados finais depende, diretamente, da escolha do método de extração e tipo de

tecido que será analisado (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1998). Underland et al.

(1998) confirmaram a eficiência desse sistema (clorofórmio-metanol-água) na

extração dos lipídios polares do arenque (Clu pea harengus), onde foram realizadas

análises de separação e quantificação das classes lipídicas, na qual os lipídios

apolares foram facilmente extraídos dos tecidos devido ao arranjo de bicamadas das

membranas nas quais eles estão situados.

3.2 Allium cepa A cebola (Allium cepa) é a hortaliça condimentar mais difundida no mundo,

sendo empregada pelo seu papel de conferir características organolépticas a

alimentos, como cor, brilho, odor, textura e sabor, além do seu poder preventivo e

curativo de diversas doenças crônico-degenerativas (CHEN et al., 1998). Além dos

compostos organossulfurados, muitas dessas propriedades estão relacionadas aos

flavonoides presentes, destacando-se a quercetina pela sua ação antioxidante e

coloração perspicaz (BOTREL; OLIVEIRA, 2012). Estudos etnobotânicos realizados

por Bearison, Minian e Granowetter (2002) em uma comunidade hispânica,

demonstraram que essa espécie estava presente em 40% das preparações para

terapia da asma. Dados do IBGE (2011) afirmam que o Brasil é um dos maiores

produtores de cebola do mundo, com safras de índices positivos que em 2010

alcançaram uma produção de 1.556 mil toneladas, sendo o estado de Santa

Catarina o maior produtor brasileiro, com uma produção bruta de 537,5 mil

19

toneladas, área de cultivo de 22.224 hectares e um rendimento médio de

24.187Kg.ha (SCHIMITT, 2011).

Estudos sobre antocianinas, realizados por Brandwein (1965), Fuleki (1971) e

Du, Wang e Francis (1974), mostraram que o pigmento mais importante em cebolas

roxas foi a cianidina 3-glucósido, com quantidades menores de cianidina 3-

laminaribioside, peonidina e glicosídeos pelargonidina. Terahara, Yamaguchi e

Honda (1994) determinaram que o cultivo japonês 'Kurenai' continha as antocianinas

cianidina 3-glicosídeo, cianidina 3-laminaribioside e seus derivados malonil-CoA

(coenzima derivada do ácido malónico).

Allium cepa também tem sido relatada por promover uma diminuição das

taxas de aterosclerose e doenças trombóticas (decorrentes do processo de

trombogênese e agregação plaquetária) em populações com maior ingestão de

cebola (KENDLER, 1987). Estes efeitos benéficos da cebola têm sido atribuídos à

sua capacidade de inibir a agregação plaquetária e formação de tromboxano

(SRIVASTAVA, 1986). Estudos realizados por Shon et al. (2004) demonstram que

os extratos de cebola são antioxidantes nutricionais úteis e sua suplementação

anula o estresse oxidativo, além de servir como receptores de elétrons. Seus

resultados também apontam que o modelo gastrintestinal “in vitro” pode ser aplicado

em estudos sobre os mecanismos de antimutagenicidade em alimentos e em

pesquisas sobre o desenvolvimento e eficácia dos produtos alimentares. No entanto,

há poucas informações quimiopreventivas sobre os efeitos dos extratos de cebola.

Esta pesquisa é necessária para investigar os efeitos dos componentes encontrados

na cebola roxa (Figuras 1 e 2).

Figura 2 – Cebola roxa (Allium cepa) utilizada para experimentação.

Figura 1 – Cebola roxa (Allium cepa).

20

3.3 FLAVONOIDES

Estudos envolvendo flavonoides tiveram início por volta de 1930, quando se

descobriu, a partir das laranjas, uma substância na qual se acreditava tratar de um

membro de uma nova classe de vitaminas, sendo denominada vitamina P. Quando

foi descoberto que a substância tratava-se de um flavonoide, deram-se início á

diversas pesquisas na tentativa de isolar, individualmente, os diferentes flavonoides

e compreender seus mecanismos de ação (NIJVELDT et al., 2001).

O termo flavonoide é dado aos pigmentos de plantas derivados da benzo-γ-

pirona19 (HAVSTEEN, 2002). Como ilustrado na figura 3, os flavonoides são

formados de um esqueleto de difenil propano (C6C3C6) contendo dois anéis

benzênicos ligados a um anel pirano, compostos por 15 átomos de carbono,

possuindo grupos hidroxila fenólicos que lhes conferem uma ação antioxidante com

potencial terapêutico (PLUMB; PRICE; WILLIAMSON, 1999).

Figura 3 - Estrutura química dos flavonoides com indicação da numeração dos carbonos.

Fonte: Castro (2007).

Os flavonoides são divididos em diversas subclasses e mais de seis mil

desses compostos já foram descritos (MARCHAND, 2002). Dentro de cada

subclasse, as diferenças estão relacionadas com o grau de metilação e glicosilação,

processos que podem ocorrer na estrutura comum dos flavonoides, e a variação no

número e posição dos grupamentos hidroxila (DUGAS et al., 2000). Alguns

exemplos de flavonoides das principais subclasses estão representados na tabela 1.

21

Tabela 1 - Tabela 1. Principais subclasses dos flavonoides e exemplos.

Fonte: Kelly (2011).

Estudos envolvendo flavonoides têm sido de grande interesse devido aos

seus efeitos biológicos observados in vitro, tais como a inibição da proliferação

celular, a eliminação de radicais livres e a modulação da atividade enzimática, bem

como na sua utilidade potencial, como agentes anti-inflamatório, antialérgico,

antibacteriano, antidiarreico e antiúlcera (BRAVO, 1998). Evidências in vitro também

indicam que os flavonoides podem ter efeitos pró-oxidantes com o aumento de

espécies reativas de oxigênio em certas condições, como altas concentrações deste

composto, pH elevado, presença de O2 e metais de transição (YOSHINO et al.,

1999; YEN et al., 2003).

Em nível molecular, os efeitos de flavonoides em enzimas, proteínas de

transporte e estruturais têm sido intensamente avaliados. Estudos realizados por

Bohl et al. (2007) dão evidência de que os flavonoides podem afetar profundamente

a fisiologia celular. A determinação do teor dos flavonoides é de grande relevância e

deve ser amplamente estudada, uma vez que a quantidade de substâncias ativas

pode variar de acordo com diversos fatores (POZZI, 2007).

3.4 QUERCETINA

A quercetina, (3,5,7,3’,4’–pentahidroxiflavone) é um integrante pertencente a

subclasse dos flavonóis, onde seu consumo é realizado em maior quantidade dentre

os flavonoides (Cerca de 26 mg a 1 g/dia) (SESSO et al., 2003). Sua nomenclatura

significa que esse composto possui cinco hidroxilas (OH), estando localizadas nas

posições 3, 5, 7, 3´ e 4´, como ilustrado na figura 4. O flavonoide quercetina está

22

entre os antioxidantes mais eficientes, pois quanto maior o número de grupos OH,

maior a capacidade antioxidante (CAO; SOFIC; PRIOR, 1997).

Figura 4 - Estrutura química da quercetina com indicação da numeração dos carbonos.

Fonte: Dugas et al. (2000).

O flavonoide quercetina, na natureza, pode ser encontrado tanto na forma

glicosilada, quanto na forma aglicona, sendo a glicosilada encontrada em maior

quantidade nos alimentos. Entre as 180 diferentes quercetina glicosídeas existentes

na natureza, a mais comum é a quercetina-3-rutinosídeo, mais conhecida como

rutina (Figura 5). Essa glicosilação é bem conhecida por influenciar a eficiência de

sua absorção, pois é mais rapidamente assimilada pelo organismo humano,

independentemente da posição do açúcar (TEIXEIRA, 2011). A quercetina aglicona

possui maior capacidade antioxidante do que em suas formas glicosiladas,

sugerindo que a glicosilação enfraquece os efeitos antioxidantes desse composto

(NOROOZI; ANGERSON; LEAN, 1998).

23

Figura 5 - Estrutura química da rutina.

Fonte: Braga (2013).

A distribuição do flavonoide quercetina nos vegetais depende de diversos

fatores, dentre eles a variação de cada espécie vegetal. Em diversas situações, os

flavonoides presentes nas folhas podem não ser os mesmos flavonoides e nem

apresentarem características semelhantes aos flavonoides encontrados nas flores,

frutos, galhos e raízes. O mesmo composto ainda pode apresentar diferentes

concentrações, que irá depender do órgão vegetal em que se encontra. Com poucos

estudos em algas, alguns representantes foram identificados em briófitas e

pteridófitas, existindo apenas um relato de ocorrência em fungos. Entretanto, estão

presentes em abundância nas plantas angiospermas, apresentando, nesse grupo,

enorme diversidade estrutural (ZUANAZZI; MONTANHA, 2003).

3.4.1 Principais ações e efeitos da QCT

A quercetina exerce diversos efeitos benéficos à saúde, incluindo a proteção

contra várias doenças, como doenças cardiovasculares e pulmonares, osteoporose

e alguns tipos de câncer, assim como no retardamento do envelhecimento, pelo fato

dessa substância ser antioxidante, tendo a capacidade de eliminar espécies

altamente reativas de oxigênio (EROs) (BOOTS; HAENEN; BAST, 2008). Estudos

relatam que a quercetina reprime o crescimento de tumores in vitro, demonstrando

seu benefício na inibição da agregação plaquetária (TZENG; KO; KO, 1991) e na

24

detoxicação de diversas enzimas (UDA et al.,1997), e in vivo, devido a sua ação

citostática e capacidade de induzir a apoptose (WEN-FU et al., 2003).

Ramos et al. (2008) reportaram, in vitro, o potencial do efeito

anticarcinogênico da quercetina devido a suas atividades antiproliferativas e

antigenotóxicas sobre células, as quais podem estar relacionadas aos vários efeitos

como, a capacidade de reparação do DNA, a eliminação de radicais livres, a

quelação de metais e a biomodulação de respostas antioxidantes celulares. A

quercetina exibe ação antiproliferativa em células leucêmicas humanas por meio de,

pelo menos, dois diferentes mecanismos, pela indução da morte celular apoptótica

caspase-dependente e quando a progressão do ciclo celular é inibida na transição

da fase G2/M. (LEE et al., 2006).

Estudos realizados com a atividade da quercetina no organismo humano

também comprovam que a substância reduz reações alérgicas em caso de asma e

rinite, bem como ajudando a prevenir cataratas, minimizando a origem de alguns

cânceres e aumentando a absorção de vitamina C pelo organismo, demonstrando

também, ser significativamente ativas contra algumas espécies de bactérias gram-

positivas e de leveduras, bem como inibindo o vírus HIV, sendo que esta última ação

parece estar condicionada à liberação da hidroxila na posição C-3 (GATTO et al.,

2002).

Estudos recentes avaliaram a quercetina na capacidade de inibição da

degranulação de basófilos, onde foi evidenciada a possibilidade de sua aplicação em

humanos para o tratamento de alergias (CHIMRIBOLO et al., 2009). A quercetina

também apresenta atividade inibitória de ativação da cascata inflamatória e bloqueia

a produção TNF-α, a ativação de NF -κB e a síntese de citocinas. Possui ainda, a

capacidade de inibir a degranulação de neutrófilos e a liberação de ânions

superóxido, sendo também, capaz de modular a ativação de mastócito (XAGORARI

et al., 2000; MIN et al., 2007).

Em relação á toxicidade, a quercetina é reconhecida como tolerável e segura

para humanos, podendo ser consumida em doses orais de até 1000 mg/dia, ou em

uma dosagem de 756 mg/dia, via intravenoso (HARWOOD et al., 2007). Quanto à

distribuição nos tecidos, estudos observaram concentrações de quercetina nos

pulmões, testículos, rins, timo, coração, fígado, sendo sua excreção por via urinária

e pela respiração e, uma parte substancial dos metabólitos, podendo ser excretada

na bile (MUROTA; TERAO, 2003).

25

A quercetina possui propriedades antioxidantes estando também, envolvidas

na síntese de eicosanóides, a partir do oxigênio singleto, ácido araquidônico e

radicais hidroxilas, prevenindo a peroxidação lipídica (FORMICA; REGELSON,

1995). Segundo Morel et al. (1993) a quercetina pode impedir a catalisação de

reações formadoras de radicais livres, na qual irá atuar como agente quelador de

íons dos metais de transição, como o cobre e ferro. Segundo Formica e Regelson

(1995), a quercetina possui propriedades além do seu potencial antioxidante, como a

capacidade de modular enzimas envolvidas na transdução de sinais, capacidade de

atuar no crescimento celular, além de possuir demais efeitos biológicos, motivos

pelas quais pode servir como material de partida para os programas de

desenvolvimento de drogas farmacêuticas.

Além de seus efeitos antioxidantes já relatados, estudos evidenciam que a

quercetina pode atuar como pró-oxidante em concentrações elevadas

(ROBASZKIEWICZ; BALCERCZYK; BARTOSZ, 2007; DUO et al., 2012), o que pode

vir a ser um indicativo de suas propriedades horméticas, nas quais são descritas

como uma resposta dose-dependente, como efeitos benéficos em baixas doses e

tóxicos em doses elevadas (VARGAS; BURD, 2010; SERRA, 2011). Estudos

realizados por Rodrigues et al. (2014) relatam que a capacidade da quercetina em

prevenir e/ou retardar a progressão tumoral pode ser devido ao resultado da

modulação de várias vias relacionadas com o crescimento e a proliferação celular, o

que é altamente desejável na otimização da terapia antitumoral.

3.5 TERAPIA FOTODINÂMICA (TFD)

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica terapêutica fotoquímica utilizada

com o principal objetivo de causar destruição seletiva de um tecido, a qual envolve a

utilização de uma droga sensibilizante seguida da irradiação de uma luz visível. Os

fotossensibilizantes são ativados pela luz, transferindo energia ao oxigênio

molecular, onde irá gerar espécies reativas de oxigênio, induzindo a morte celular

(KURWA; BARLOW, 1999; KALKA; MERK; MUKHTAR, 2000). Esta técnica é uma

modalidade no tratamento de câncer, o qual vem sendo tratado com terapias

tradicionais, como a radioterapia, quimioterapia e cirurgia (SIMPLICIO; MAIONCHI;

HIOKA, 2002). Uma das principais vantagens desta técnica está no fato de o

26

fármaco não apresentar citotoxicidade, exceto quando submetido à irradiação. O

mecanismo de ação da TFD está ilustrado na figura 6.

Figura 6 - Princípio básico da Terapia Fotodinâmica (TFD).

Fonte: Dougherty et al, (1998).

O estudo envolvendo a TFD iniciou-se em Munique (1900), quando Oscar

Raab e seu professor Herman von Tappeiner observaram os efeitos

fotossensibilizantes num protozoário (Paramecium caudatum) após sua exposição a

luz na presença do corante acridina. A presença da luz teve como função modificar a

ação do corante, permitindo a identificação de um fotossensibilizante. Após essa

descoberta, von Tappeiner ampliou as descobertas com outros experimentos,

descobrindo a necessidade da presença do oxigênio para a reação, criando o termo

TFD (RAAB, 1900 apud SIMPLICIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002). Apesar da Terapia

Fotodinâmica (TFD) ser um termo consideravelmente novo, o princípio básico desse

tratamento faz parte da história milenar. Há cerca de 4 mil anos atrás, os egípcios

usavam a combinação de plantas ingeridas via oral e luz solar para o tratamento de

vitiligo, uma doença cutânea que causa a perda gradativa da pigmentação da pele

(EDELSON, 1988, p.21 apud STERNBERG; DOLPHIN, 1998).

Na década de 1960, a TFD ganhou ainda mais forças com estudos realizados

por Lipson e Schwartz, os quais observaram que injeções de hematoporfirinas

levavam a fluorescência de lesões neoplásicas, podendo ser observadas durante as

cirurgias (SIBATA et al., 2000). Entretanto, na década de 1970, Dougherty,

conhecido como “o pai da TFD”, acidentalmente redescobriu a TFD. Ele foi

responsável por criar um composto fotossensibilizante comercial adequado, com

fonte de luz confiável e ensaios clínicos adequados para provar o valor da TFD para

a comunidade oncológica (ALLISON; MOGHISSI, 2013).

27

A utilização da TFD como tratamento já está aprovado para uso clínico nos

Estados Unidos, Japão, Rússia, Canadá, e alguns países da União Européia,

entretanto, no Brasil, esta terapia está liberada apenas para utilização em regime de

pesquisa clínica. Entre 1990 e 2006, mais de 1500 casos relatados de tumores de

cabeça e pescoço foram tratados utilizando a terapia fotodinâmica com os fármacos

fotossensibilizantes Photofrin®, ALA e Foscan® (BIEL, 2007).

A Terapia Fotodinâmica tem-se mostrado uma promissora modalidade clínica

para o tratamento do câncer, oferecendo a possibilidade de remissão ou mesmo

ação paliativa em certos casos de câncer. Estudos realizados por Machado (2000)

demonstraram que a TFD foi aplicável em um número considerável de outras

moléstias, assim como na descontaminação de sangue e, em alguns casos, quando

as moléstias se tornam refratárias às terapias existentes, a TFD tem-se mostrado

uma alternativa viável de tratamento.

Estudos desenvolvidos por Biel (2007), mostraram que a terapia fotodinâmica

é uma excelente modalidade para o tratamento de carcinomas superficiais iniciais e

primários recorrentes da cavidade oral e da laringe, porém, o desenvolvimento de

novos agentes fotossensibilizadores mais específicos de tumores, além de mais

estudos padronizados, são necessários a fim de avaliar adicionalmente a eficácia

desta terapia em diversas áreas do corpo.

Os primeiros estudos com TFD no esôfago foram realizados como tratamento

paliativo para os tumores obstrutivos (McCAUGHAN Jr. et al., 1984), onde estudos

posteriores confirmaram a eficácia do tratamento para esses tumores

(SCHWEITZER; BOLOGNA; BATRA, 1993; MOGHISSI, et al., 2000). Apesar da

eficácia da TFD para câncer de esôfago, os efeitos colaterais do tratamento deste

órgão de paredes finas podem ser graves, pois além da fotossensibilidade transiente

da pele, estenose, fístulas, e perfurações têm sido relatadas em até 57% dos

pacientes tratados com TFD usando luz vermelha (SCHWEITZER; BOLOGNA;

BATRA, 1993; GROSJEAN et al., 1996).

Na odontologia, a TFD vem demonstrando eficácia na morte de bactérias

relacionadas ao desenvolvimento das lesões de cárie e doença periodontal em

humanos. Zanin et al. (2002) observaram que, quando um pool de saliva humana

era submetido à TFD, ocorria um efeito bactericida total sobre estreptococos do

grupo mutans e efeito bactericida parcial sobre estreptococos totais presentes na

28

saliva humana. A importância desse estudo está na eliminação das espécies mais

patogênicas.

Clinicamente, o tratamento com a TFD tem se mostrado efetivo,

principalmente em alguns casos de câncer e tumores iniciais, porém, alguns efeitos

colaterais foram observados durante o tratamento, os quais estão principalmente

relacionados a diferentes padrões de fototoxicidade de pele (TSOUKAS et al., 1997).

Segundo Issa (2010), o efeito colateral mais observado durante o tratamento com a

TFD é a dor durante a exposição à luz, a qual é relatada pelos pacientes como

queimação ou sensação de ardência no local.

As pesquisas com o tratamento com TFD tem-se voltado para o

desenvolvimento de novos sintetizadores com características melhoradas, como por

exemplo, maior capacidade de absorção molar, de modo a permitir uma maior

efetividade do tratamento, e maior seletividade frente às células e/ou tecido-alvo.

3.5.1 Fotossensibilizantes (FS)

Em 1990, tornou-se disponível a nova técnica de aplicação tópica de

fotossensibilizantes. Um método eficaz foi adotado, utilizando como

fotossensibilizante o Metilaminolevulinato (MAL) e Ácido 5-aminolevulínico (ALA),

seguido da irradiação de luz vermelha de amplo espectro. Na mesma época, foram

desenvolvidas, a partir de ftalocianinas, porficenos, benzoporfirinas e clorinas,

algumas novas drogas sintéticas sensibilizantes de segunda geração (CALZAVARA-

PINTON; VENTURINI; SALA, 2007).

As propriedades físico-químicas dos Fotossensibilizantes (FS) são

importantes para a eficácia da fotossensibilização do tecido tumoral. Entre as

características ideais de um FS estão: a pureza química, o pequeno intervalo do

acúmulo do tumor com a administração da droga, a capacidade de localização

especifica em tecido neoplásico, a rápida eliminação do tecido normal, a penetração

no tecido alvo através da ativação de comprimentos de onda e a capacidade de

produzir grande quantidade de produtos citotóxicos (KALKA; MERK; MUKHTAR,

2000). Geralmente, as células captam esses agentes sensibilizantes (lipofílicos),

onde serão penetrados diretamente em sua membrana plasmática. Em

contrapartida, quando esses agentes sensibilizantes apresentam propriedades

29

hidrossolúveis, são captados pelas células por pinocitose (CALZAVARA-PINTON;

VENTURINI; SALA, 2007).

Devido às propriedades fotoquímicas e fotofísicas avançadas, os

fotossensibilizantes ftalocianinas (FC) são profundamente atrativos para a Terapia

Fotodinâmica (TFD), onde são preparados juntamente com grupos de ácido

sulfônico e átomos de metais para exercer uma melhor solubilização em água

(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). Estudos realizados por Ferreira et al.

(2004) indicaram que o FS Alumínio Ftalocianina Tetrasulfonada (AIPcS4) causou

uma série de danos ás mitocôndrias, além de possuir demanda alvo para os

filamentos de actina do citoesqueleto e retículo endoplasmático.

3.5.2 Morte celular na TFD

A TFD pode induzir a morte celular tanto por necrose (não programada),

quanto por apoptose (programada), nos quais diversos fatores como, o estresse

oxidativo e a indução da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), irão

levar a sua morte celular (OLEINICK; EVANS, 1998; FABRIS et al., 2001). O local

inicial dos danos relacionados à TFD pode determinar a via de morte celular

inicialmente ativada e suas respostas podem variar tanto devido ao tipo celular e seu

potencial genético e metabólico, quanto o seu protocolo de incubação, como a

variação de doses de luz e diferentes concentrações e tipos de fotossensibilizantes

utilizados (MROZ et al., 2011). Mroz et al. (2011) também concluiram que, a TFD,

em sua dose mais elevada, também pode conduzir a necrose, assim como as

proteínas envolvidas no processo de autofagia e apoptose podem ser imediatamente

destruídas, rompendo a integridade da célula.

Existem fotossensibilizantes empregados na TFD que possuem capacidade

de causar danos mitocondriais, induzindo rapidamente a apoptose por meio da

ativação da via intrínseca (mitocondrial). Esse processo inclui a liberação de

citocromo c, a ativação de caspases, a clivagem da Poli (ADP-ribose) polimerase

(PARP), a condensação da cromatina e, por fim, a fragmentação do DNA (CHIU et

al., 2003).

A morte celular via apoptose é controlada por membros da família Bcl-2, a

qual promove ou inibe esse processo. A mudança de equilíbrio entre os membros

antiapoptóticos e pró-apoptóticos da família Bcl-2 a favor de proteínas pró-

30

apoptóticas (Bid, Bak, Bad e Bax) são essenciais para a liberação do citocromo c,

que decide a susceptibilidade das células a apoptose, mediada por TFD. Portanto,

danos a Bcl-2 e proteínas relacionadas podem resultar na liberação dessas

proteínas pró-apoptóticas, dando início a apoptose (SRIVASTAVA et al., 2001;

KESSEL; ARROYO, 2007).

Múltiplas vias estão envolvidas no mecanismo de morte celular, porém muitos

estudos relacionados à TFD são necessários a fim de aumentar a sua eficácia

terapêutica e entender esses mecanismos por completo (SRIVASTAVA et al., 2001).

31

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 PROCESSOS DE EXTRAÇÃO E ROTAEVAPORAÇÃO

Para a obtenção dos extratos de cebola roxa (Allium cepa), no Laboratório de

Síntese Orgânica - IP&D - UNIVAP, foi empregado o extrator Soxhlet (Figura 7), no

qual foi acrescentado o material sólido (15 g do bulbo de cebola) envolto de papel

filtro. Para cada extração foram acrescentados 150 ml de cada um dos diferentes

solventes (Clorofórmio, Etanol 70% e Metanol 70%) no balão, sendo aquecido por

uma manta elétrica. Cada processo de extração durou 2 horas, onde foram

realizados três ciclos.

Figura 7 - Extrator Soxhlet utilizado na técnica de extração. A) Equipamento completo. B) Detalhe do sistema de refluxo do solvente.

Após o processo de extração, foi utilizado um rotaevaporador (Buchi modelo

R-114) a 60 °C para evaporação dos solventes (Figuras 8 e 9). Os extratos obtidos

foram diluídos com Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Canada) e

mantidos em um freezer a -80 °C até análise.

A

B

32

4.2 ANÁLISE DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)

Para as análises realizadas com os extratos de cebola, QCT e solventes

(Clorofórmio, Metanol 70% e Etanol 70%) foi utilizado um sistema de Cromatografia

Gasosa (PerkinElmer Precisely Clarus 600) na Central Analítica – IP&D – UNIVAP,

sendo utilizadas as seguintes condições: Coluna Elite 1 fundida com coluna capilar

de sílica composto de dimetil siloxano poli. Os gases hidrogênio, nitrogênio e ar

sintético foram utilizados como gases portadores a uma taxa de fluido constante de

1,5 mL/min, onde a razão de separação foi de 1:80, o volume de injeção de 1 μL,

sendo empregue a razão de divisão de 1:10 e temperatura do injetor de 300 °C,

sendo a do detector (fonte de íons) de 280 °C.

As amostras foram diluídas nos respectivos solventes a qual foram extraídas

e conduzidas em tubos Eppendorf, onde foi acrescentado o derivatizador N,O-

Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Canada). A

etapa de derivatização consiste em promover uma reação de silanização dos grupos

fenólicos com trimetil silício, convertendo os compostos fenólicos em substâncias

mais voláteis.

Após esse processo, as amostras foram conduzidas ao cromatógrafo a uma

temperatura inicial do forno programada a 60 °C (isotérmica durante 2 min), com um

aumento de 10°C/min, até atingir 150 °C (mantendo por 1 minuto), por fim,

aumentou-se 30°C/min até atingir uma temperatura isotérmica final de 210°C, onde

Figura 9 – Rotaevaporador (Buchi modelo R-114) utilizado para a evaporação do solvente.

Figura 8 – Processo de rotaevaporação do solvente.

33

foi mantido por mais 1 min. O tempo total de arraste de cada amostra foi de 15

minutos.

4.3 LINHAGEM CELULAR E MEIO DE CULTURA

Para os experimentos realizados foi utilizada a linhagem celular HEp-2

(carcinoma de laringe humana) (Figura 10), adquiridas do Banco de Células (BCRJ,

Rio de Janeiro, BR) e cultivadas no laboratório de Dinâmica e Compartimentos

Celulares - IP&D - UNIVAP.

As células foram cultivadas com Meio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s

Médium) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), onde sua formulação é

composta por um sistema de tamponamento com bicarbonato e concentrações

modificadas de aminoácidos e vitaminas, necessário para o estímulo do crescimento

celular. O meio DMEM foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB)

(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), necessário por apresentar fatores de

crescimento em sua composição que aceleram o crescimento celular, e 1% de

antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Figura 10 - Fotomicrografia de campo claro da linhagem celular HEp-2 utilizada para os experimentos. Ampliação original, 1000x.

34

4.4 CRESCIMENTO, MANUTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS PARA EXPERIMENTAÇÃO

Inicialmente, as células foram descongeladas, centrifugadas por 5 minutos a

2.500 rpm, e cultivadas em garrafas de cultura (Corning®, New York, USA) de 25

cm² em uma estufa incubadora (Forma Scientific) com controle automático de

temperatura 37°C e atmosfera com 5% de CO2. O crescimento celular foi

acompanhado por meio de observação em um microscópio invertido (Olympus

CK40).

Quando ocorria o crescimento confluente das células, incompatível com o

espaço de adesão, era utilizado o processo de tripsinização para redistribuição em

novas garrafas de cultura. Nesse processo, a tripsina (Sigma-Aldrich, Saint Louis,

Canada) foi acrescentada, durante 2 minutos, para o desprendimento das células.

Após esse procedimento, as células foram transferidas para um tubo (Corning®,

New York, USA) de 15 ml, sendo adicionado 1ml de meio DMEM e centrifugadas por

5 minutos a 2500 rpm. Por fim o sobrenadante era descartado e o precipitado

(células) ressuspenso em meio DMEM, sendo redistribuídos em novas garrafas de

cultura celular.

Para a realização dos experimentos, as células foram transferidas das

garrafas de cultura a placas de cultura (TPP Techno Plastic Products, Trasadigen,

Switzerland) de 96 poços. Nessa transferência houve os processos de tripsinização,

centrifugação (5 minutos a 2500 rpm), descarte do sobrenadante, ressuspensão do

precipitado de células e contagem na câmera de Neubauer, onde foi utilizado, para o

plaqueamento, um volume de 5.104 de células por poço, sendo complementado com

meio DMEM (89%), soro fetal bovino (10%) e Antibiótico-antimicótico (1%),

apresentando um volume final de 200 μl por poço . Após plaqueadas, as células

permaneceram incubadas em estufa a uma temperatura de 37°C e atmosfera de 5%

de CO2 por 24 horas para aderência.

4.5 CONCENTRAÇÕES DOS EXTRATOS E QCT NAS CÉLULAS

Para determinação dos ensaios in vitro, os extratos e QCT foram preparados

com DMSO em uma concentração de 1 mM, sendo armazenados, sob proteção de

luz, em uma temperatura de -80°C. As amostras (extratos e QCT) foram

35

determinadas nas concentrações de 5, 50 e 100 μM para todos os ensaios in vitro

realizados neste estudo.

4.6 PLAQUEAMENTO E ADIÇÃO DOS EXTRATOS E QCT

As diferentes concentrações dos extratos e QCT foram adicionadas em poços

de placa de cultura após 24 horas do processo de plaqueamento. Para os ensaios

de atividade metabólica mitocondrial, sem e com a presença da TFD, e microscopias

de fluorescência, as células tratadas com as amostras (extratos e QCT) foram

incubadas durante 4 horas. Para o ensaio de atividade metabólica mitocondrial,

realizado após 4 horas da TFD, as células foram tratadas com os extratos e QCT e

incubadas por 40 minutos antes da irradiação.

4.7 TFD COMPLEMENTADA COM EXTRATOS E QCT

4.7.1 Incubação das células com alumínio ftalocianina tetrasulfonada (AlPcS4),

extratos e QCT

O Fotossensibilizante Alumínio Ftalocianina Tetrasulfonada (AlPcS4)

(Porphyrin Products, Logan, USA) foi dissolvido em salina tamponada com fosfato

(PBS) em uma concentração de 1 mM, esterilizada por meio de filtragem com filtro

de milipore (MillexTM, Billerica, USA) com 0,22 μm e estocado em refrigerador a

10°C, sobre proteção de luz. A solução estoque em concentração de 1 mM foi

diluída a 10 μM para incubação direta nas células antes dos ensaios in vitro.

Após o período de incubação das células com as diferentes concentrações de

extratos e QCT, o meio foi descartado e as células lavadas com PBS. O

fotossensibilizante AlPcS4, diluído em uma concentração de 10 μM, foi acrescentado

em cada poço, exceto no grupo controle e, em seguida, incubou-se por 60 minutos

sobre proteção de luz. Em seguida, o fotossensibilizante foi descartado, as células

lavadas novamente com PBS e as soluções estoque de 1 mM dos extratos e QCT

diluídos nas concentrações de 5, 50 e 100 μM diretamente nos poços , sendo

incubadas por 40 minutos antes da irradiação.

36

4.7.2 Irradiação

Um aparelho clínico portátil diodo laser semicondutor (Thera Lase – DMC

Equipamentos Ltda, São Carlos, SP, Brasil) com meio ativo de fosfeto de índio-gálio-

alumínio (InGaAlP), operando em modo contínuo, foi utilizado para irradiação das

células HEp-2. Para evitar o espalhamento de luz para os demais poços durante

irradiação, as células foram irradiadas no escuro com barreira preta contendo um

orifício do diâmetro do poço. Os valores dos parâmetros utilizados para a irradiação

foram pré-determinados em estudos anteriores (Tabela 2).

Tabela 2 - Valores dos parâmetros de irradiação utilizados na TFD. Parâmetros Valores

Comprimento de Onda 685 nm

Densidade de Energia 4.5 J/cm2

Potência 35 mW

Área 0.5 cm2

Tempo 65s Fonte: Tamietti et al. (2007).

Após o processo de irradiação, as células foram incubadas durante um

período de 4 horas nas mesmas condições da manutenção celular.

4.8 ENSAIO DE ATIVIDADE METABÓLICA MITOCONDRIAL

O ensaio de atividade metabólica mitocondrial, realizados com o MTT (3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, Saint Louis,

Canada), foi realizado em duas circunstâncias: (1) 4 horas após o tratamento das

células incubadas com as diferentes concentrações dos extratos e QCT, sem o

tratamento da TFD e; (2) 4 horas após o tratamento das células incubadas com as

diferentes concentrações dos extratos de QCT, com o tratamento da TFD.

Após o período determinado de incubação, as células foram submetidas ao

tratamento com o MTT em uma concentração de 5 mg/ml. O meio de cultura foi

removido e, em seguida, acrescentado o MTT em cada poço, deixando-as

incubadas em estufa por 1 hora, sobre a proteção de luz. Após esta etapa, o MTT foi

37

retirado e acrescentado o solvente orgânico DMSO nos poços. A placa foi mantida

em agitação durante 15 minutos para a solubilização dos cristais de formazana. A

leitura das placas foi realizada por um espectrofotômetro (Spectracount, Packard,

USA) a um comprimento de onda de 570 nm.

4.9 MARCAÇÕES FLUORESCENTES - MITOCÔNDRIAS E NÚCLEO

Para realização das marcações fluorescentes, as células foram incubadas por

um período de 4 horas com os extratos e QCT, o meio de cultura descartado e os

poços lavados com PBS. Para marcação das mitocôndrias, foi adicionado o

marcador MitoTracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) numa concentração

de 79 nM aos poços, onde foram incubados por um período de 45 minutos sob

proteção de luz. Em seguida a solução dos poços foi descartada e as células

lavadas com PBS.

Para a marcação do núcleo, foi acrescentado, aos poços, o marcador DAPI

(4’6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Canada)

diluído em PBS numa concentração de 300 nM, sendo incubado por 10 minutos a

temperatura ambiente sob proteção de luz. Em seguida, a solução foi descartada

dos poços e as células lavadas com PBS. Todas as amostras foram plaqueadas em

triplicata.

As observações foram realizadas por um microscópio de fluorescência

invertida (Leica DMLB) com imagens capturadas via câmera de vídeo digital (Leica

DFC 300FX) e analisadas por um programa (Leica Application Suite V3).

4.10 MARCAÇÕES FLUORESCENTES – APOPTOSE/NECROSE

Para análise quantitativa e qualitativa das células apoptóticas/necróticas, foi

utilizado o kit Alexa Fluor 488 Anexina V-FITC e Iodeto de Propídio (PI) (Thermo

Fisher Scientific, Waltham, USA) para marcação fluorescente. Após o período de 4

horas de incubação, com adição das diferentes concentrações de extrato (0, 5, 50 e

100 μM) obtido com o solvente clorofórmio, o meio de cultura dos poços foi

descartado e as células lavadas com PBS. Em seguida, foi adicionado aos poços,

uma solução contendo PBS (94%), Anexina V-FITC (5%) e Iodeto de Propídeo (PI)

(1%) e, após 15 minutos de incubação a temperatura ambiente, a solução foi

38

descartada e os poços lavados com solução de tampão de ligação e água

deionizada.

Observações foram realizadas em microscópio de fluorescência Leica DMLB

com imagens capturadas via câmera de vídeo digital (Leica DFC 300FX) e

analisadas por um programa (Leica Application Suite V3). As amostras foram

plaqueadas em duplicata e os procedimentos realizados ao abrigo de luz.

4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise e interpretação dos dados do ensaio de avaliação da atividade

metabólica mitocondrial, utilizou-se o software Origin 9.0 SRO (Origin Lab

Corporation). Para avaliação da significância estatística foram utilizados os testes de

Bonferroni e ANOVA, onde foi considerado significativo se p<0.05 em relação ao

grupo controle.

39

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE DAS AMOSTRAS (EXTRATOS, QCT E SOLVENTES) ATRAVÉS DO TESTE DE CROMATOGRAFIA GASOSA (CG) De acordo com os resultados obtidos a partir do teste de CG, os extratos

realizados com os solventes: Clorofórmio, Metanol (70%) e Etanol (70%),

demonstraram picos específicos do flavonoide quercetina, apresentados pelos

tempos de retenção de 6,9 min, 2,5 min e 2,6 min, respectivamente (Figuras 11, 12 e

13). A quercetina comercial e os solventes utilizados na extração foram analisados

como padrão.

Cromatografia gasosa – Clorofórmio Figura 11 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Clorofórmio), QCT + Solvente (Clorofórmio) e Extrato + Solvente (Clorofórmio).

40

Cromatografia gasosa – Metanol 70% Figura 12 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Metanol 70%), QCT + Solvente (Metanol 70%) e Extrato + Solvente (Metanol 70%).

Figura 13 - Teste CG: Comparação entre Solvente (Etanol 70%), QCT + Solvente (Etanol 70%) e Extrato + Solvente (Etanol 70%).

41

5.2 AÇÃO DOS EXTRATOS E QCT SOBRE CÉLULAS HEp-2 NA AUSÊNCIA DE TERAPIA FOTODINÂMICA

O tratamento com a concentração de 5 μM de extratos e QCT não

apresentaram diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo

controle, em contrapartida, o tratamento com as concentrações de 50 e 100 μM

diminuíram significativamente a atividade metabólica mitocondrial das células

quando comparadas ao grupo controle (Figuras 14, 15, 16 e 17).

Ctrl Clorof 5uM Clorof 50uM Clorof 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Clorofórmio

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns

**

***

Ctrl Metanol 5uM Metanol 50uM Metanol 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Metanol 70%

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns

**

***

Ctrl Etanol 5uM Etanol 50uM Etanol 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Etanol 70%

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns

**

***

Nota: *p <0,05, **p <0,001 e *** p <0,0001 em relação ao Controle (ANOVA e teste de Bonferroni).

Ctrl Qct 5uM Qct 50uM Qct 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Quercetina Padrão

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns

**

***

Figura 15 - Teste MTT com diferentes concentrações 0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Clorofórmio).

Figura 14 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Metanol 70%).

Figura 17 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Etanol 70%).

Figura 16 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de QCT.

42

5.3 AÇÃO DOS EXTRATOS E QCT SOBRE CÉLULAS HEp-2 NA PRESENÇA DE TERAPIA FOTODINÂMICA

Em comparação com o grupo controle, houve uma diminuição significativa da

atividade metabólica mitocondrial apenas na concentração de 100 μM dos extratos

obtidos com os solventes: Clorofórmio e Etanol 70%. Os grupos com a concentração

de 5 μM de todos os extratos e QCT e os grupos com a concentração de 50 μM do

extrato obtido com o solvente: Metanol (70%), e QCT apresentaram um aumento

significativo da atividade metabólica mitocondrial das células tumorais (Figuras 18,

19, 20 e 21).

Ctrl Laser Clorof 5uM Clorof 50uM Clorof 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

***

Clorofórmio + TFD

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns***

ns

Ctrl Laser Met 5uM Met 50uM Met 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Metanol 70% + TFD

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns** *

ns

Ctrl Laser Et 5uM Et 50uM Et 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Etanol 70% + TFD

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns***

**

ns

Ctrl Laser Qct 5uM Qct 50uM Qct 100uM0,000

0,048

0,096

0,144

0,192

0,240

0

20

40

60

80

100

Quercetina Padrão + TFD

Via

bilid

ade

Cel

ular

(%)

Abs

orbâ

ncia

ns**

*

ns

Nota: *p <0,05, **p <0,001 e *** p <0,0001 em relação ao Controle (ANOVA e teste de Bonferroni).

Figura 19 - este MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Clorofórmio) + TFD.

Figura 18 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Metanol 70%) + TFD.

Figura 21 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de extrato (Etanol 70%) + TFD.

Figura 20 - Teste MTT com diferentes concentrações (0, 5, 50 e 100 μM) de QCT + TFD.

43

5.4 AÇÃO DOS EXTRATOS E QCT NO POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL E NÚCLEO

O teste de microscopia de fluorescência foi realizado para avaliar

qualitativamente o potencial de membrana mitocondrial e alterações morfológicas do

núcleo. Os resultados foram avaliados 4 horas após o tratamento dos extratos e

QCT em comparação com o grupo sem tratamento (controle). As células presentes

no grupo controle apresentaram uma distribuição homogênea das mitocôndrias por

todo citoplasma, caracterizando o potencial de membrana mitocondrial normal. Já no

tratamento com as concentrações de 5, 50 e 100 μM dos diferentes extratos e QCT,

as marcações revelaram que, quanto maior a concentração aplicada, mais intensa a

redução do padrão de atividade metabólica mitocondrial, ocorrendo também,

retração citoplasmática, acúmulo das mitocôndrias na região perinuclear e

alterações morfológicas dos núcleos nos grupos analisados (Figuras 22, 23, 24 e

25).

Figura 22 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Clorofórmio). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Clorofórmio). D) Tratamento com 100 µM de extrato (Clorofórmio). Setas indicam alterações (diminuições) morfológicas nas mitocôndrias e núcleos. Ampliação original, 1000x.

44

Figura 23 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Metanol 70%). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Metanol 70%). D) Tratamento com 100 µM de extrato (Metanol 70%). Setas indicam alterações (Diminuições) morfológicas nas mitocôndrias e núcleos. Ampliação original, 1000x.

Figura 24 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de extrato (Etanol 70%). C) Tratamento com 50 µM de extrato (Etanol 70%). D) Tratamento com 100 µM de extrato (Etanol 70%). Setas indicam alterações (Diminuições) morfológicas nas mitocôndrias e núcleos. Ampliação original, 1000x.

45

Figura 25 - Microscopia de Fluorescência. A imagem destaca os núcleos em azul (DAPI) e mitocôndrias em vermelho (Mito Tracker) da linhagem HEp-2. A) Grupo Controle. B) Tratamento com 5 µM de QCT. C) Tratamento com 50 µM de QCT. D) Tratamento com 100 µM de QCT. Setas indicam alterações (Diminuições) morfológicas nas mitocôndrias e núcleos. Ampliação original, 1000x.

46

5.5 AÇÃO DO EXTRATO (CLOROFÓRMIO) NA DETECÇÃO DE MORTE CELULAR

Após a realização das marcações , as análises demonstraram que, em

comparação com as células do grupo controle (Figura 26) as células submetidas ao

tratamento com 5 μM de extrato não apresentaram aumento nas marcações com

Anexina V-FITC ou PI, como demonstrado na figura 27. O grupo de células

submetidas ao tratamento de 50 μM de extrato (Figura 28) apresentaram

características de apoptose precoce, devido à intensa ligação positiva de Anexina V-

FITC, e apoptose tardia, necrose ou células totalmente mortas, devido à aderência

positiva de PI. As células tratadas com 100 μM de extrato apresentaram intensa

ligação positiva de PI, caracterizando em apoptose tardia, necrose ou células

totalmente mortas, como mostra na figura 29.

Figura 26 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo controle. A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência. Ampliação original, 1000x.

Figura 27 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 5 µM de extrato (Clorofórmio). A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência. Ampliação original, 1000x.

47

Figura 28 - Detecção de morte celular. Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 50 µM de extrato (Clorofórmio). A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência. Setas indicam positivo para IP. Setas tracejadas indicam positivo para Anexina V-FITC. Ampliação original, 1000x.

Figura 29 - Detecção de morte celular. As imagens destacam detecção de morte celular no grupo tratado com 100 µM de extrato (Clorofórmio). A) Microscopia Óptica de Campo Claro. B) Microscopia de Fluorescência. Setas indicam positivo para IP. Ampliação original, 1000x.

48

6 DISCUSSÃO

A quercetina é um integrante pertencente à subclasse dos flavonóis, onde seu

consumo é realizado em maior quantidade dentre os flavonoides (SESSO et al.,

2003). Sua distribuição nos vegetais depende de diversos fatores, que vão de

acordo com a variação de cada espécie vegetal. Em diversas situações, os

flavonoides presentes nas folhas podem não ser os mesmos flavonoides e nem

apresentarem características semelhantes aos flavonoides encontrados em outras

partes da planta. O mesmo composto ainda pode apresentar diferentes

concentrações, que irá depender do órgão vegetal em que se encontra (ZUANAZZI;

MONTANHA, 2003). Estudos realizados por Albuquerque (2013), a fim de avaliar a

eficiência da utilização dos chás (Camellia sinensis) e infusão da casca de cebola

(Allium cepa) como corante natural e analisar o teor de flavonoides totais em

quercetina, mostraram que a maior concentração de quercetina está na infusão da

casca de cebola com relação aos corantes, estando de acordo com os estudos

abordados que designa a mesma como o flavonoide principal da constituição da

casca de cebola, responsável pela sua coloração amarelo dourado. Nos nossos

extratos, obtidos através das extrações com Clorofórmio, Metanol 70% e Etanol

70%, observou-se a presença do flavonoide quercetina através do teste de

cromatografia gasosa, onde também foi observada uma coloração amarelo dourado

em todos os extratos obtidos, sendo caracterizado pela sua cor, conforme na

literatura, como quercetina.

No estudo presente foi realizado o teste de Cromatografia Gasosa com os

extratos obtidos dos solventes: Clorofórmio, Metanol (70%) e Etanol (70%), os quais

apresentaram picos específicos do flavonoide quercetina no tempo de retenção de

6,9 min, 2,5 min e 2,6 min respectivamente. Dias (2010) realizou o teste de

Cromatografia Líquida (HPLC) a fim de caracterizar uma possível presença de ácido

gálico, quercetina, resveratrol, catequina, e maldivina em vinhos brasileiros, no qual

incluiu uma etapa de extração líquido-líquido da amostra assistida por ultrasom para

a preconcentração de compostos fenólicos em vinhos elaborados no Vale do Sião.

Após suas análises, foi observado que quercetina apresentou um tempo de retenção

de 5,7 min.

No presente estudo os efeitos dos extratos obtidos de cebola roxa (Allium

cepa) e QCT (padrão) demonstraram serem citotóxicos para as células de carcinoma

49

de laringe humano (HEp-2), confirmando os estudos realizados por Bianchi e

Antunes (1999), que demonstraram que o uso elevado e/ou prolongado do

flavonoide quercetina pode interferir nos mecanismos celulares, causando danos.

Além da quercetina, estão entre os principais metabólitos de plantas que podem

causar danos ao organismo, os glicosídeos cianogênicos, rutina, ricina, alcaloides

como a coniina, alcaloides de vinca como a vincristina e a vimblastina, o taxol e

terpenóides como as lactonas sesquiterpênicas (MENGUE; MENTZ; SCHENKEL,

2001).

Estudos realizados por Beutler et al. (1998) avaliaram as atividades

citotóxicas de 79 flavonas e suas ações no processo de polimerização dos

microtúbulos celulares. Este estudo revelou que os compostos com o grupamento 3-

metoxi são inibidores da polimerização da tubulina. Assim como nos experimentos

de Sonoda et al. (2004), onde foram testados 17 flavonoides em células de leucemia

humana (HL60), nos quais 10 apresentaram um grau de citotoxidade.

O ensaio de MTT é um dos mais utilizados para se determinar a citotoxicidade

de materiais de diversas naturezas sobre células em cultura, podendo estar também

relacionado às moléculas que, ao serem liberadas a partir de um estímulo, podem

causar danos aos tecidos (VITRAL, et al., 2008). Este ensaio quantifica a atividade

metabólica mitocondrial por meio da análise baseada na formação de cristais de

formazana (corantes artificiais) pela redução do sal de tetrazólio. Esse sal é

altamente solúvel em água, sendo reduzido pelas atividades de desidrogenase em

células para obter-se um corante de formazana. A quantidade do corante é

diretamente proporcional ao número de células vivas.

De acordo com nossos resultados foi possível observar, após a aplicação dos

extratos e QCT, uma considerável diminuição da atividade mitocondrial, realizada

pelo teste de MTT na linhagem celular HEp-2, nas concentrações de 50 e 100 μM,

no período de incubação de 4 horas. Essa considerável diminuição da atividade

mitocondrial só ocorreu na concentração de 100 μM nos grupos com os extratos

obtidos com os solventes: Clorofórmio e Etanol (70%) quando complementada a

TFD com o fotossensibilizante AlPcS4, em relação ao grupo controle, ocorrendo

ainda um aumento significativo da atividade metabólica mitocondrial na

concentração de 5 μM em todos os extratos e QCT, e 50 μM no extrato obtido com o

solvente Metanol (70%) e QCT.

50

No estudo presente, foram realizadas marcações de mitocôndrias e núcleo a

fim de verificar se a ação citotóxica dos extratos e QCT geraram alterações

morfológicas nessas estruturas. As marcações revelaram que, quanto maior a

concentração dos extratos e QCT aplicados, menor o padrão de atividade

mitocondrial, ocorrendo também, acúmulo das mitocôndrias na região perinuclear e

alterações morfológicas dos núcleos. Os efeitos implicados com as mitocôndrias

podem ser explicados pela possível presença de alcaloides ou grandes quantidades

de carboidratos, além da presença dos flavonoides. Estudos indicam a presença

destas substâncias, porém não apontam à presença de derivados citotóxicos destes

compostos (LORENZI; MATOS, 2002). Em um recente estudo realizado por

Rodrigues et al. (2014), foi utilizada analise por microscopia de fluorescência para

medição de potencial de membrana mitocondrial e alterações morfológicas no

núcleo, sendo realizado após 24 h de TFD complementada com QCT. As

mitocôndrias das células do grupo controle foram distribuídas de forma homogênea

por todo o citoplasma, enquanto células tratadas com TFD e TFD suplementadas

com 5 μM de QCT obtiveram marcação heterogênea no citoplasma e região

perinuclear. Já os grupos de células tratadas com TFD suplementadas com 50 e 100

μM de QCT obtiveram severamente uma redução da atividade mitocondrial, acúmulo

de mitocôndrias na região perinuclear, e provavelmente retração citoplasmática, não

ocorrendo alterações morfológicas significativas de núcleo nos grupos analisados.

A Anexina V-FITC se liga a células em apoptose precoce, a qual permanece

ligada durante o processo de morte celular emitindo, assim, uma fluorescência

verde. Por outro lado, o Iodeto de Propídeo (PI) é utilizado para avaliar a integridade

da membrana plasmática marcando as células necróticas, tardiamente apoptóticas

ou completamente mortas, emitindo, assim, uma fluorescência vermelha (MARTIN et

al., 1995). Rodrigues et al. (2014) examinou a indução de apoptose e/ou necrose em

células HEp-2 marcadas com uma combinação de Anexina V-FITC - PI e verificadas

por microscopia de fluorescência 24 horas após TFD complementada com QCT.

Seus estudos demonstraram que, em comparação com as células do grupo controle

(não tratadas), as células submetidas à TFD apresentavam características de

apoptose inicial, sendo marcadas positivamente com Anexina V-FITC e

negativamente com PI. Também foi observadas células em apoptose no grupo que

tratado com TFD + com 5 μM de QCT mostrando, também, características de

apoptose tardia devido a rotulagem positiva com o PI. Os grupos de células tratadas

51

com TFD + 50 e 100 μM de QCT mostraram características de apoptose tardia e/ou

necrose devido à marcação positiva de anexina V-FITC e PI, concluindo a eficiência

desse tratamento nessas concentrações. Nossos resultados, realizados com o

extrato obtido do solvente clorofórmio, demonstraram que, as células (HEp-2)

submetidas ao tratamento com 5 μM de extrato não apresentaram aume nto nas

marcações com Anexina V-FITC ou PI em relação ao grupo controle, em

contrapartida as células submetidas ao tratamento de 50 μ M de extrato

apresentaram características de apoptose precoce, devido à intensa ligação positiva

de Anexina V-FITC, e apoptose tardia, necrose ou células totalmente mortas, devido

à aderência positiva de PI. O grupo de células tratado com 100 μM de extrato

apresentou intensa ligação positiva de PI, caracterizando em apoptose tardia,

necrose ou células totalmente mortas.

52

7 CONCLUSÃO Após a realização dos experimentos com as diferentes concentrações de

extratos de cebola roxa e QCT na linhagem celular HEp-2, as análises dos

resultados permitiram concluir que:

• Foi constatada presença do flavonoide quercetina nos extratos de cebola roxa

realizados com os solventes: Clorofórmio, Metanol (70%), Etanol (70%).

• Os extratos de cebola roxa e QCT, em baixa concentração, não apresentam

citotoxicidade, ao passo que, em concentrações igual ou superior a 50 μM, reduz em

a atividade metabólica mitocondrial em células tumorais HEp-2, sendo o resultado

mais significativo a utilização do extrato obtido do solvente clorofórmio.

• A complementação da TFD para este teste não potencializou o efeito dos

extratos e QCT sobre a linhagem tumoral.

• A TFD demonstrou haver aumento da atividade metabólica mitocondrial nas

concentrações de 5 μM de todas as amostras e 50 μM (Metanol 70% e QCT) em

relação ao grupo controle.

• As marcações fluorescentes demonstraram, qualitativamente, intensa redução

do padrão de atividade mitocondrial, constatando também, acúmulo das

mitocôndrias na região perinuclear e alterações morfológicas dos núcleos em doses

mais elevadas.

• Características de apoptose e/ou necrose são evidentes após o tratamento

com concentrações elevadas de extrato (clorofórmio).

• A avaliação de possíveis danos acarretados a partir de altas dosagens de

extratos in vivo deve ser amplamente estudada e considerada para que haja uma

melhor segurança na sua utilização.

53

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