Elisa Beatriz Prestes

IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica 05/02/2013

Clonagem

• Isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas

• Origem do termo: cada colônia bacteriana é um clone

• Tecnologia do DNA recombinante

Produção de proteínas em larga escala

Construção de bibliotecas genômicas e de cDNA

Clonagem molecular

Duas etapas principais

1. Ligação do fragmento de DNA em um plasmídeo DNA

recombinante

2. Introdução do DNA recombinante numa célula hospedeira compatível: transformação

INSERTO VETOR

Enzimas de restrição

• Capacidade de clivar DNA em regiões específicas

• Palindrômicas

• 1973 enzimas com extremidades coesivas

Ligação do inserto no vetor

Digestão e ligação

Vetor de clonagem

Clivagem com endonuclease de restrição

Ligação pela ligase

Fragmento de DNA a ser clonado

DNA recombinante

Ligação do inserto no vetor

Vetor de clonagem – Plasmídeo

Todo plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve ter:

• Origem de replicação (Ori)

• Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)

• Resistência a antibiótico (Amp, Kan, etc.)

*Extra: gene da β-galactosidase (lacZ)

Ligação do inserto no vetor

Bactéria

DNA recombinante

Transformação em células competentes

Células competentes

• Células bacterianas quimicamente modificadas para receberem o DNA recombinante

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

Ca2+ competentes Eletrocompetentes

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

Transformação

Seleção de colônias

Resistência a antibiótico

Expressão de β-galactosidase

• Fragmento de DNA é inserido no meio do gene lacZ

Ampicilina

Amp + X-gal + IPTG

β-gal: degrada polissacarídeos

X-gal: substrato cromogênico forma

precipitado azul quando há atividade de β-gal

IPTG: indutor da atividade de β-gal

X

Transformação

Toothpick e “PCR de colônia”

Técnicas de screening

Toothpick tamanho do inserto

PCR de colônia “identidade” do inserto

Transformação

Inserto Primer F

Primer R

~500pb

~1kb

Toothpick e “PCR de colônia”

Transformação

Transformação X Transfecção

Vetores de clonagem

Por que não transformar DNA linear?

TIPOS DE VETORES MAIS POPULARES

• Plasmídeos (mais comuns) – até 20kb

• Fago lambda – até 25kb

• Cosmídeos – 35 a 45kb

Plasmídeos

• Plasmídeos presentes em grande número de cópias

• Regiões:

- Origem (ColE1, f1)

- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)

- Gene de resistência a antibiótico

Fago λ

• Empacotamento in vitro eficiência 10% sítio cos

• Infecção E. coli eficiência 100%

Genes da lisogenia

DNA de interesse

Vetores de substituição

Vetores de inserção

Cosmídeos

• Plasmídeos com um fragmento de DNA do fago λ sítio cos

• Utilizam sistema de empacotamento in vitro do fago λ

• Tornam-se circulares na célula hospedeira

• Permitem clonagem de genes maiores – 35 a 45kb

Vetores de expressão

• Plasmídeo cujo inserto deverá ser expresso numa proteína

• Amplamente utilizados na pesquisa e em terapias atuais

http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o

Obrigada!