Jeison Barros Rios - UFC · R453e Rios, Jeison Barros Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do gênero

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGANICA E INORGANICA

Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) Baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do

gênero Anthurium através de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas

Jeison Barros Rios

Fortaleza – CE 2011

Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) Baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do gênero

Anthurium através de Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas.

Jeison Barros Rios

Dissertação submetida à coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química, como requisito para obtenção do grau de mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Salles Trevisan

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

Fortaleza, 2011

R453e Rios, Jeison Barros Estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (pohl) baill; identificação de compostos fenólicos em quatro espécies do gênero Anthurium através de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas / Jeison Barros Rios. – 2011.

79 f. : il. color., enc.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa Salles Trevisan Área de concentração: Química Orgânica Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências. Depto. de Química Orgânica e Inorgânica, Fortaleza, 2011.

1. Plantas - Análise 2. Jatropha - Química 3.Química vegetal I. Mazzetto, Selma Elaine (Orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Programa de Pós-Graduação em Química III. Título

CDD 547

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ter me dado a vida, saúde e força para alcançar mais esse objetivo. Aos meus Pais Geraldo e Adazila e meus irmãos Paulo e Joab pelo amor e incentivo a continuar sempre estudando. Ao meu amor Edilane, pela companhia, carinho e atenção nos momentos bons e difíceis da vida e no desenvolvimento desse trabalho. À profesora Maria Teresa Salles Trevisan, pelos ensinamentos, apoio e confiança para a realização desta dissertação. Aos meus amigos de Laboratório Leandro, Ricardo, Ricardo Farias, Francisco Thiago, Thiago, Jack, Edângelo, Mikaelly, Natália, Katarina e Isabel por tornar o ambiente de trabalho mais alegre e produtivo. À todos os amigos de curso pelo carinho e apoio. À Universidade Federal do Ceará, pelo espaço e apoio na minha formação. À CAPES, pelo apoio financeiro durante a realização desse trabalho.

SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS iii LISTA DE TABELAS v LISTA DE FLUXOGRAMAS vi LISTA DE ESQUEMAS vii LISTA DE ABREVIATURAS viii RESUMO ix ABSTRACT x CAPÍTULO 1 1. INTRODUÇÃO 1 CAPÍTULO 2 – CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1 O gênero Jatropha 3 2.2 Jatropha mollissima (Pohl) Baill 3 2.3 O gênero Anthurium 5 CAPITULO 3- LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO 3.1 Levantamento Bibliográfico de Diterpenos do Gênero Jatropha 6 CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Determinação Estrutural de EHJM-DA1 17 4.2 Determinação Estrutural EHJM-DB(2-3)2 21 4.3 Determinação Estrutural de EHJM-DC3 26 4.5 Inibição da enzima acetilcolinesterase 32 CAPÍTULO 5 – PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 5.1 Material Vegetal 33 5.2 Métodos Cromatográficos 33 5.3 Métodos Físicos 34 5.3.1 Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV) 34 5.3.2 Ponto de Fusão 34 5.3.3 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 34 5.4 Estudo dos constituintes químicos de Jatropha mollissima (Pohl) Baill 35 5.4.1 Preparação dos extratos de J. mollissima 35 5.4.2 Fracionamento cromatográfico de EHJM 36 5.4.3 Fracionamento cromatográfico de EHJM-D e isolamento de EHJM-DA1

36

5.4.4 Fracionamento cromatográfico de EHJM-DB e isolamento de EHJM-DB (2-3)2

37

5.4.5 Fracionamento cromatográfico de EHJM-DC e isolamento de EHJM-DC3

38

i

5.5 Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos 40 CAPÍTULO 6 – CLAE-EM 6.1 Introdução 42 6.2 Espectrômetro de massas 42 6.3 Ionização por electrospray (IES) 42 6.4 Análise por CLAE-IES-EM dos extratos metanólicos de quatro espécies do gênero Anthurium

43

6.4.1 Preparação dos extratos 43 6.4.2 Materiais Químicos 43 6.4.3 Preparo das amostras 44 6.4.4 Condições de injeção CLAE-DAD-IES-EM 44 6.4.5 Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM 45 6.4.6 Propostas de fragmentos de massas observados nos espectros dos compostos 1-6.

51

CAPÍTULO 7 - CONCLUSÃO 7. Conclusão 57 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58

ii

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fotografias da Espécie Jatropha mollissima 4

Figura 2: Diterpenóides isolados de espécies do gênero Jatropha. 11

Figura 3: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DA1 (KBr). 17

Figura 4: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1 18

Figura 5: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1 19

Figura 6: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DA1. 19

Figura 7: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DB(2-3)2 (KBr) 21

Figura 8: Espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 22

Figura 9: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2. 23

Figura 10: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2

23

Figura 11: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DC3 (KBr) 26

Figura 12: Espectro de RMN 13C-BB (125MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3. 27

Figura 13: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DC3 28

Figura 14: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3 29

Figura 15: Mecanismo para a reação enzimática do teste de Ellman 40

Figura 16: Etapas da metodologia modificada por Rhee 41

Figura 17: Estrutura do padrão Eserina.

41

Figura 18: Cromatogramas CLAE dos extratos metanólicos de (a) A. lindmanianum, (b) A. andraeanum, (c) A. bonplandii, (d) A. plowmanii

45

Figura 19: Espectro UV/Vis do composto 1 46


Figura 21: Espectro UV/Vis do composto 3

46



iii

Figura 24: Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM nos extratos metanólicos de quatro espécies de Anthurium

48

Figura 25: Compostos identificados no extrato metanólico de A. bonplandii. 50

Figura 26: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 1. 51

Figura 27: Espectro de massas IES (modo positivo) do composto 2.

52


53

Figura 29: Espectro de massas IES (modo negativo) do composto 4.

54


55


56

iv

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Diterpenos de Jatropha e suas atividades biológicas 6

Tabela 2: Deslocamentos químicos de RMN 13C (C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 em comparação com dados da literatura.

25

Tabela 3: Padrão de hidrogênio de EHJM-DC3 determinado através de análise dos espectros de RMN 1H,13C-HSQC.

28

Tabela 4: Deslocamentos químicos de RMN 13C e 1H (CDCl3) de EHJM-DC3 em comparação com dados da literatura.

31

Tabela 5: Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de J. mollissima e de quatro espécies do gênero Anthurium.

32

Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento preliminar do extrato hexânico bruto das raízes de J. mollissima.

36

Tabela 7: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico da fração EHJM-D.

37

Tabela 8: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DB.

37

Tabela 9: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DC.

38

Tabela 10: Dados LC-DAD-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados parcialmente.

49

Tabela 11: Dados LC-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados obtidos da literatura.

49

v

LISTA DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1 – Esquema da obtenção dos extratos hexânico e etanólico das raízes de J. mollissima

35

Fluxograma 2 – Rota esquemática do isolamento dos constituintes químicos EHJM-DA, EHJM-DB(2-3)2 e EHJM-DC3 a partir do extrato hexânico das raízes de J. mollissima.

39

vi

LISTA DE ESQUEMAS Esquema 1: Propostas de fragmentos de massas para o composto 1

51

Esquema 2: Propostas de fragmentos de massas para o composto 2

52


53


54


55


56

vii

LISTA DE ABREVIATURAS AChE Enzima acetilcolinesterase AcOEt Acetato de etila C5D5N Piridina deterada CC Cromatografia em coluna CCD Cromatografia em camada delgada CD3OD Metanol deuterado CDCl3 Clorofórmio deuterado CH2Cl2 Dicloro metano CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – Espectrometria de Massas D Dupleto Dd Duplo dupleto DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum coherence Hz Hertz IES-EM Ionização por Electronspray – Espectrometria de Massas IV Infravermelho J Constante de Acoplamento KBr Brometo de potássio M Multipleto m/z Razão massa/carga MeOH Metanol MHz Mega Hertz Ppm Partes por milhão RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono -13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 S Singleto Sl Singleto largo T Tripleto UV-VIS Ultravioleta – visível Deslocamento químico máx Absorção máxima

viii

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo o estudo químico da raiz de Jatropha

mollissima (Euphorbiaceae), planta nativa do nordeste brasileiro. Nesse estudo

utilizaram-se técnicas cromatográficas na tentativa de isolamento dos constituintes

químicos dos extratos hexânico e etanólico da raiz. O tratamento cromatográfico do

extrato hexânico possibilitou o isolamento de um álcool de cadeia alifática longa

denominado triacontanol, uma mistura dos esteroides -sitosterol e estigmasterol e um

terpeno de esqueleto latirano denominado jatrogrossidiona. Ainda nesse trabalho,

investigou-se a composição de compostos fenólicos presentes nos extratos metanólicos

das folhas de quatro espécies do gênero Anthurium através de CLAE-EM onde foi

possível a identificação de oito compostos fenólicos: 6-C-arabinosil-8-C-glicosil-

apigenina nas folhas de A. lindmanianum; 8-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina e 7-

O-[6-O-acetilglicosil(1-2)]ramnosil-(1-6)-glicosil-acacetina nas folhas de A.

andraeanum; ácido 5-cafeoilquínico, vitexina, isovitexina e orientina nas folhas de A.

bonplandii e 6-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina nas folhas de A. plowmanii. Os

resultados para o teste de inibição da enzima acetilcolinesterase mostraram que apenas

os extratos hexanico de J. mollissima e metanólico das folhas de A. andraeanum

apresentaram atividade anticolinesterásica.

ix

ABSTRACT This work aimed to study the chemical from the root of Jatropha mollissima

(Euphorbiaceae), a plant native to northeastern Brazil. In this study we used

chromatographic techniques in an attempt to isolate the chemical constituents of hexane

and ethanol extracts of the root. Chromatographic treatment of extract allowed the

isolation of a long aliphatic chain alcohol called triacontanol, a mixture of the steroids

-sitosterol and stigmasterol and a terpene latirano skeleton called jatrogrossidiona.

Also in this work, we investigated the composition of phenolic compounds present in

methanol extracts of leaves of four species of the genus Anthurium using HPLC - MS in

which it was possible to identify eight phenolic compounds: 6- C- arabinosyl -8- C-

glycosyl - apigenin in the leaves of A. lindmanianum; 8-O-ramnosyl-( 1-3)-C-glycosyl -

acacetin and 7-O-[6-O-acetylglicosyl(1-2)]ramnosyl-( 1-6 )-glycosyl - acacetin in the

leaves of A. andraeanum, 5- caffeoylquinic acid, vitexin, isovitexin and Orientin in the

leaves of A. bonplandii and 6- O-ramnosyl-( 1-3)-C-glycosyl-acacetin in the leaves of

A. plowmanii. The results for the inhibition of acetylcholinesterase enzyme showed that

only the hexane extract of J. mollissima and methanol extract from the leaves of A.

andraeanum showed anticholinesterase activity.

x

1. INTRODUÇÃO

A utilização de plantas medicinais pelo homem, como fonte de medicamento é

secular. Registros mostram que antigas civilizações, em especial, a Chinesa, Egípcia e

Romana, lançavam mão das ervas para os mais diversos fins, incluindo para o

tratamento ou prevenção de doenças. Estas práticas têm sido transmitidas de geração em

geração, ao longo dos séculos, perpetuando assim o conhecimento.

Este conhecimento de plantas medicinais é importante para o desenvolvimento

de produtos à base de plantas que podem contribuir grandemente para a prevenção e a

erradicação de muitas doenças (DA SILVEIRA et al., 2003). Portanto, as plantas podem

ser consideradas a base para a descoberta de novos fármacos. De fato, a cada dia as

plantas vêm sendo reconhecidas pela sua capacidade de produzir metabólitos

secundários, muitas vezes, com alto potencial biológico e/ou farmacológico

(FARNSWORTH et al., 1985).

Nas ultimas décadas, os produtos naturais têm desempenhado um importante

papel na descoberta de novos fármacos, quer seja na sua forma original ou modificado

estruturalmente (ROCHA et al., 2006). Uma análise da origem de drogas desenvolvidas

no período entre 1981 a 2002 mostrou que os produtos naturais, ou drogas derivadas

destes, compreendem cerca de 28% de todas as entidades químicas lançadas no mercado

de medicamentos (CHIN et al., 2006).

As plantas medicinais permaneceram como forma alternativa de tratamento em

várias partes do mundo. De acordo com a WHO (World Health Organization), devido à

pobreza e pouco acesso à medicina moderna, cerca de 65 a 80% da população mundial

dependem essencialmente das plantas como forma primária de cuidar da saúde

(CALIXTO et al., 2005). É nesse contexto social que as plantas medicinais e os

fitoterápicos adquirem importância como agentes terapêuticos.

Plantas de Jatropha, especialmente de J. curcas, têm sido cultivadas na África

para aproveitamento do óleo das sementes em velas para iluminação, sabonetes e

também na medicina popular (WATT & BREYER-BRANDWIJK, 1962).

1

Do ponto de vista químico, Jatropha caracteriza-se pela presença de substâncias

pertencentes a vários grupos químicos, tais como flavonoides, ligninas e cianógenos

(WEBSTER, 1994), além de ésteres de forbol e seus derivados, com atividades

biológicas comprovadas (ADOLF et al., 1984; HIROTA et al., 1988).

No Nordeste do Brasil, as espécies de Jatropha, especialmente J. molissima

(Pohl) Baill. são reconhecidas por suas propriedades medicinais (AGRA et al., 1996).

Espécies do gênero jatropha (Euphorbiacae) são uma rica fonte de diterpenoides

macrocíclicos. Alguns desses constituintes possuem atividades biológicas incluindo

propriedades antibactericida e anticâncer (DAS et al., 2009). Este trabalho teve como

objetivo o estudo químico da raiz de Jatropha mollissima (Pohl) Baill, identificação de

compostos fenólicos por CLAE-EM presentes nas folhas de quatro espécies do gênero

Anthurium e avaliação da inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos.

2

2. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 2.1 - O Gênero Jatropha

Jatropha (Euphorbiaceae) é um gênero de cerca de 175 plantas suculentas,

arbustos e árvores (algumas são caducifólias, como Jatropha curcas L.).

Espécies do gênero Jatropha são conhecidas por serem muito tóxicas e pela

atividade purgativa do óleo de suas sementes. Jatropha é um grupo de grande

importância econômica, principalmente pela presença de várias espécies referidas por

seus usos medicinais e/ou ornamentais, também empregadas como cercas-vivas, em

várias partes do mundo, especialmente na África, como J. gossypiifolia L., J. curcas L.

e J. multifida L., por exemplo (WATT & BREYER-BRANDWIJK, 1962).

2.2 - Jatropha mollissima (Pohl) Baill

Jatropha mollissima é encontrada como arbusto e é conhecida popularmente

como Pinhão-bravo e Pinhão-de-purga (LEAL & AGRA, 2005). O látex “in natura” é

empregado na medicina popular como antiofídico; as sementes são comercializadas para

extração do óleo fixo, que é utilizado como purgativo, para uso veterinário (AGRA et

al., 1996).

3

Leal C.K.A. & Agram. de F. (2005) descrevem J. mollissima como:

Arbusto com látex avermelhado, 2,0-3,0 m de comprimento; ramos

cilíndricos, glabros, suculentos, estriados; estípulas caulinares, 2,0-4,0 mm,

espinhosas, lignificadas, persistentes. Folhas peltadas; pecíolo 4,0-10,0 cm,

cilíndrico, puberulento, tricomas simples unisseriados; lâmina 3,0-15,0 x 4,0-

10,0 cm, orbicular, 5-palmatilobada, subcrassas; lobos elípticos, puberulentos,

tricomas simples, unisseriados, denteados, glandular-estipitados, base aguda,

ápice glandular-acuminado, broquidródroma. Pedúnculo cilíndrico, 4,0-2,0 cm,

puberulento. Inflorescências em corimbos, terminais, bracteados; 2 flores

pistiladas circundadas por 4 flores estaminadas; pedicelos 0,4-1,5 cm,

cilíndricos, glabrescentes. Flores estaminadas e pistiladas pentâmeras, cálice

0,5-1,5 cm, sépalas soldadas no 1/4 basal, lobos ovalelípticos, estipitados,

glabros; corola até 2,0 cm, pétalas livres, 0,5-1,0 cm, oblongas, face externa

avermelhada e a interna amarela, glabra. Fruto capsular, 1,5-3,0 cm, trilocular,

glauco, com deiscência explosiva; sementes-3, oblongas, 0,8-1,0 cm, glabras,

carúncula evidente, ca. de 1/5 do tamanho da semente; testa lisa, brilhante,

marrom-ferrugínea.

Figura 1: Fotografias da Espécie Jatropha mollissima

4

2.3 - O Gênero Anthurium

Anthurium é um membro da família Araceae (monocotiledôneas), que inclui

mais de 100 gêneros e cerca de 1500 espécies, principalmente a partir dos trópicos

(HIGAKI et al., 1994).

Algumas espécies de Anthurium são utilizadas na medicina popular tradicional

nas regiões tropicais das Américas e das Antilhas para o tratamento de diferentes

doenças (JOLY et al., 1987; ZAMORA-MARTÍNEZ e POLA, 1992), alguns deles

associados com atividade imunoestimulante (DI CARLO et al., 1964).

As flores de várias espécies de Anthurium são cultivadas intensivamente para

fins ornamentais, e as folhas têm usos tradicionais como agente antiinflamatório

(DeFRANK, 1989). Até agora, somente estudos sobre a atividade antiinflamatória de

extratos A. cerrocampanense e no isolamento de antocianinas das flores (SEGURA et

al., 1998) e folhas de algumas espécies de Anthurium (AQUINO et al., 2001) foram

relatados.

5

3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

3.1 - Levantamento Bibliográfico de Diterpenos do Gênero Jatropha

Neste capítulo serão registradas as estruturas e atividades biológicas de todos os

diterpenóides isolados das espécies do gênero Jatropha. A busca foi realizada no

programa computacional Scifinder scholar utilizando o termo “Jatropha diterpenoids”.

Este levantamento teve como objetivo atualizar uma revisão publicada recentemente

(DEVAPPA et. al., 2011) que trata de todos os diterpenoides isolados do gênero

Jatropha (1976-2010) e suas atividades biológicas.

Jatropha é uma das mais ricas fontes de fitoquímicos tais como alcalóides,

lignanas e terpenos (DEVAPPA, 2010).

Os terpenos e diterpenos de Jatropha possuem diversas atividades biológicas

como antitumoral, citotóxica, antiinflamatório, moluscicida, inseticida, propriedades

fungicida dentre outras (Tabela 1).

Tabela 1: Diterpenos de Jatropha e suas atividades biológicas. No Diterpenos Espécies Atividades

Biológicas Referências

1 Jatrophona J. gossypifolia J. elliptica

Antitumoral Citotoxica Moluscicida Leishmanicida Gastroprotetor

Devappa et. A.l, 2010 Pertino et. al., 2007 Taylor et. al., 1983 Santos et. al, 1999

2 2α-OH Jatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983

3 2β-OH jatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983

4 2β-OH-5,6-isojatrophona J. gossypifolia Citotóxica Taylor et al, 1983

5 9β, 13α-diidroxiisabelliona J. isabelli Citotóxica Pertino et al, 2007

6 Japodagrina J. podagrica Bactericida Aiyelaagbe et al, 2007

7 Japodagrona J. podagrica Bactericida Aiyelaagbe et al, 2007

8 15-O-acetil japodagrona J. multifida NA Das et al, 2009

6

No Diterpenos Espécies Atividades Biológicas

Referências

9 Jatrophatriona J. macrorhiza Antitumoral Torrance et al, 1976

10 Jatrofenona J. gossypifolia Bactericida Ravindranath et al, 1982

11 Riolozatriona J. dioica Bactericida Watson et al, 1982

12 Jatrowediona J. weddelliana NA Brum et al, 1998

13 Integerrimeno J. integerrima NA Sutthivaiyakit et al, 2003

14 Citlalitriona J. dioica J. integerrima J. gossypifolia

NA Villarreal et al, 1988 Das et al, 2008 Yang et al, 2003

15 Caniojano J. grossidentata J. integerrima J. curcas

Antiplasmodial Citotóxica

Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009

16 1,11-bisepicaniojano J. integerrima

Antiplasmodial Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009

17 2-epicaniojano J. integerrima

NA Sutthivaiyakit et al, 2003 Sutthivaiyakit et al, 2009

18 Spruceanol J. divaricata Citotóxica Antitumoral

Denton et al, 2001 Krebs et al, 2004

19 Cleistanthol J. divaricata Antitumoral Denton et al, 2001 Sutthivaiyakit et al, 2003 Krebs et al, 2004

20 ent-3β, 14α-hidroxipimara- 7,9(11),15-trieno-12-ona

J. divaricata NA Denton et al, 2001

21 ent-15(13 - 8)abeo-8β(etil) pimarano

J. divaricata NA Denton et al, 2001

22 Jatrogrossidiona J. grossidentata

Leishmanicida Tripanocida

Schmeda-Hirschmann et al, 1992

23 Isojatrogrossidiona J. grossidentata

NA Das et al, 2008 Schmeda-Hirschmann et al, 1992

7


Referências

24 2-epi-isojatrogrossidiona J. grossidentata

NA Schmeda-Hirschmann et al, 1992

25 2-epi-jatrogrossidiona J. gaumeri Antimicrobiana Can-Ake´ et al, 2004

26 2-hidroxiisojatrogrossidiona J. grossidentata J. wedelliana J. podagrica

Bactericida Fungicida

Schmeda-Hirschmann et al, 1992

27 2-epi-hidroxiisojatrogrossidiona J. grossidentata J. wedelliana J. podagrica


Schmeda-Hirschmannn et al, 1992

28 Acetato de (4E)-jatrogrossidentadiona

J. multifida NA Das et al, 2008 Schmeda-Hirschmann et al, 1992

29 (4E)-jatrogrossidentadiona J. multifida NA Das et al, 2008

30 15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona J. grossidentata J. gaumeri

NA Can-Ake´ et al, 2004 Schmeda-Hirschmann et al, 1992

31 15-O-acetil-15-epi-(4E)-jatrogrossidentadiona

J. curcas NA Ravindranath et al, 2004

32 (14E)-14-O-acetil-5,6-epoxijatrogrossidentadiona


33 3β-acetoxi-12-metoxi-13-metil-podocarpa-8,11,13- trien-7-ona


34 3β,12-dihidroxi-13- metilpodocarpane-8,10,13-trieno


35 Jatropholona A J. isabelli Gastroprotetor Citotóxico Moluscicida Antiplasmodial

Pertino et al, 2007 Schmeda-Hirschmann et al, 1996 Sutthivaiyakit et al, 2009

36 Jatropholona B J. isabelli Gastroprotetor moluscicida

Pertino et al, 2007

37 2α-Hidroxijatropholona J. integerrima Bactericida Antiplasmodial

Sutthivaiyakit et al, 2009

8


Referências

38 2β-Hidroxijatropholona J. integerrima Bactericida Citotóxico

Sutthivaiyakit et al, 2009

39 Curcasona A J. curcas Efeito Anti-invasivo em células tumorais

Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006

40 Curcasona B J. curcas Efeito Anti-invasivo em células tumorais

Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et. al, 2006

41 Curcasona C J. curcas Citotóxica Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006

42 Curcasona D J. curcas Citotóxica Naengchomnong et al, 1986 Thippornwong et al., 2006

43 Jatropherol J. curcas Inseticida Rodenticida

Jing, 2005 Jing et. al., 2005

44 Japodagrol J. podagrica Antitumoral Sanni et al, 1988

45 Curculatirano A J. curcas NA Naengchomnong et al, 1986

46 Curculatirano B J. curcas NA Naengchomnong et al, 1986

47 (+) Jatrophol J. curcas NA Naengchomnong et al, 1994

48 Multifolona J. multifida NA Das et al, 2008

49 Multifidona J. multifida Citotóxica Das et al, 2009

50

Multidiona J. multifida NA Das et al, 2009

9


Referências

51 Jatropha fator C1 J. curcas






Citotóxico

Moluscicida,

Rodenticida

Goel et al, 2007

Devappa et al, 2010

Haas et al, 2002

Li et al, 2010

57 Heudolotinona J. curcas NA Kimbu et al, 1991 Ravindranath, 2003

58 Jatrophalactam J. curcas Citotóxico Wang et al, 2009

59 Favelino J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991

60 Deoxofavelino J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991

61 Favelino metil éter J. phyllacantha Citotóxico Endo et al, 1991

62 Filacantona J. phyllacantha NA Lemos et al, 1991

63 Palmarumicina CP1 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004

64 Palmarumicina JC1 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004

65 Palmarumicina JC2 J. curcas Bactericida Ravindranath et al, 2004

10


Referências

67 (4Z)- 15-

Epijatrogrossidentadiona J. grossidentata J.wedelliana J. podagrica


Aiyelaagbe et al, 2007 Schmeda-Hirschmann et al, 1992

68 Jaherina J. Zeyheri Bactericida Dekker et al, 1987

69

Spirocurcasona J. curcas NA Giuseppina et al, 2011

70

Curcasona E

J. curcas

NA

Giuseppina et al, 2011

71

Acetoxijatropholona

J. curcas

NA

Giuseppina et al, 2011

NA = não aplicável

Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha.

1

O

O

O

O

O

O

HO

2

O

O

O

HO

3

O

O

HO

O

4

O

O

O

H OH

5

O

O

OHO

OH

6

O

O

O

HO

7

O

O

O

AcO

8

O

O

O

H

9

11


O

H

OAcHO

O

10

O

O

O

H H

H

11

O

O

O

H

H

H

HH

H

12

O

OAcO

H

13

O

O

O

H

HH

OH

14

O

O

OO

OHH

H

H H

H

15, 16-(15 COM 1,11-bisepi)

O

O

OO

OHH

H H H

H

17

H

OH

HO

H

18

H

OH

HO

H

HO

19

20

H

O

HO

HOH

21

H

O

HO

HO

O

OH

HO

22

O

O

O

(23, 2 - H) (24, 2 - H)

O

O

HOH

H

25

O

O

O

HO

(26, 2 -OH) (27, 2 - OH)

12


O

O

OCOCH3

HO

28

O

O

OH

HO

29, 30 - (29) com - OH

O

O

OH

H3COCO

31

O

H3COCO

OH

32

H

OCH3

H3COCO O

33

OH

O

35

OH

O

36

HO

OH

O

37

H

OH

HO

34

HO

OH

O

38

O

O

R1R2 R1 R2

39 Me H40 H Me41 Me OH42 OH Me

O OH

OH

OHOH

43

O

O

HO

HO

44

O

O

OH

HO

45

13

Figura 2: Diterpenoides isolados de espécies do gênero Jatropha

O

O

O

HO

46

OH

O

OH

47

OOH

HOOH

48

O

O

O

49

O

O

HO

50

O HOOH

OH

H

H H

O

O

O

O

51

OHO

OH

HO

H

H H

O

O

O

O

52

53, 54

OHO

OH

HO

H

HH

O

O

O

O

14

56

O

O

O HO

OH

HO

H

H H

O


O

O

O HO

OH

HO

H

H H

O

55

OH

OH

57

HN

O

H

O

HO

58

HO

OH

59

HO

H

60 H3CO

OH

61H3CO

OH

62

O O

O OH

63

O O

OH OH

O

64

O O

O OH

HO

65

15


66

OOH

HOO

67

OOH

HOO

68

OHO

H H

O

O

O HH

69

O

OHO

H

H H

70

OH

O OO

H

H

71

16

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 - Determinação Estrutural de EHJM-DA1

O fracionamento cromatográfico da fração diclorometano do extrato hexânico

das raízes de J. mollissima (EHJM-D) resultaram no isolamento de um precipitado

branco amorfo denominado EHJM-DA1 com ponto de fusão na faixa de 82,4 – 83,7º C.

O espectro de absorção na região do infravermelho de EHJM-DA1 (Figura 3)

apresentou uma banda larga em máx 3408 cm-1 característica de vibração de

deformação axial da ligação O-H; absorções em máx 2944 e 2859 cm-1 referentes a

vibrações de deformação axial de ligações C-H; absorção em máx 722 cm-1

característico de deformação angular de ligação C-H para compostos de cadeia longa.

4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 03 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

Tran

smitâ

ncia

%

c m -1

Figura 3: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DA1 (KBr).

No espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) (Figura 4, p. 18) de

EHJM-DA1 observou-se sinais à H 0,74 (3H, t), 1,12 (52H, s), 1,40 (2H, t) e 3,43 (2H,

t) que podem ser atribuídos a hidrogênios de hidrocarboneto alifático. O sinal em H

3,43 pode ser atribuído a hidrogênio de carbono oxigenado.

17

Figura 4: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1

O espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) (Figura 5, p. 19)

apresentou 7 linhas sendo que o sinal C 62,3 foi atribuído a carbono oxigenado.

A análise do espectro de RMN 1H,13C-HSQC (Figura 6, p. 19) possibilitou a

identificação de um carbono metílico em C 13,9 que correlacionou com o hidrogênio

H 0,74 (3H, t); houve também correlação entre o sinal C 13,9 como o sinal H 1,12

(52H, s) caracterizando carbonos metilênicos em cadeia longa.

O sinal C 62,3 correlacionou-se com o sinal H 3,43 (2H, t) sugerindo a

presença de um carbono metilênico oxigenado.

18

Figura 5: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DA1.

Figura 6: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DA1.

19

Através dos dados apresentados pode-se concluir que EHJM-DA1 trata-se de um

álcool de cadeia longa denominado triacontanol.

Este composto já foi isolado de outras espécies do gênero Jatropha, bem como

de plantas de outros gêneros como Corchorus capsularis L. (GUTIÉRREZ, 2009) e

Ginkgo biloba (MONTORO & BEEKA, 2009).

OH26

triacontanol

20

4.2 - Determinação Estrutural EHJM-DB(2-3)2

Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração EHJM-D levou ao

isolamento de cristais incolores na forma de agulhas denominado EHJM-DB(2-3)2,

solúvel em clorofórmio que apresentou faixa de fusão de 130,4-132,8º C.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 7) mostrou uma

banda larga em máx 3420 cm-1 referente a deformação axial de ligação O-H; absorções

em máx 2937 e 2863 cm-1 caracteriscas de deformação axial de ligação C-H; bandas de

absorção em máx 1057 e 963 cm-1 referentes a deformação angular da ligação C-H de

alcenos.

4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

Tran

smitâ

ncia

%

c m - 1

Figura 7: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DB(2-3)2 (KBr).

O espectro de RMN 1H (Figura 8, p. 22) obtido com C5D5N a 300 MHz

mostrou a presença de sinais H 0,69 (t), 0,88 (s), 1,07 (s) e 1,02 (6H, t) característicos

de grupos metila (CH3); dois sinais em H 5,86 (s) e 5,43 (d) característicos de

hidrogênio olefínico; um sinal em H 3,8 (d) característico de hidrogênio ligado a

carbono oxigenado.

21

Figura 8: Espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2

A comparação do espectro de RMN 13C-BB (Figura 9, p. 23) com o espectro de

RMN 13C-DEPT 135º (Figura 10, p. 23) possibilitou a identificação de três carbonos

não-oxigenados (C), onze carbonos metínicos (CH), onze carbonos metilênico (CH2) e

seis carbonos metílicos (CH3).

22

Figura 9: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2.

Figura 10: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz,C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2.

23

A análise do espectro de RMN 13C-BB mostrou a presença de quatro sinais para

carbono olefínico: C 121,59; 129,86; 139,18 e 142,35. Para sinais observados em H

3,8 e C 71,65 pode-se constatar a presença de um grupo hidroxila na molécula.

A comparação dos dados de RMN 13C-BB de EHJM-DB(2-3)2 com os dados

encontrados na literatura (Tabela 2, p. 25) possibilitou a identificação de uma mistura

de esteróides muito comum em plantas, -sitosterol e estigmasterol.

HO

H H

H

H

-sitosterol

HO

H H

H

H

estigmasterol

24

Tabela 2: Deslocamentos químicos de RMN 13C (C5D5N) de EHJM-DB(2-3)2 em comparação com dados da literatura. C C C -sitosterol

(literatura*) C C estigmasterol

(literatura*) 1 37,28 37,21 36,78 37,21 2 32,55 31,62 32,55 31,62 3 71,65 71,80 71,00 71,80 4 42,90 42,18 43,20 42,29 5 142,35 140,72 142,35 140,72 6 121,59 121,71 121,59 121,71 7 32,60 31,87 32,60 31,87 8 32,60 31,87 32,60 31,87 9 50,88 50,08 50,88 50,08 10 36,78 36,48 36,78 36,48 11 21,65 21,07 21,65 21,07 12 40,29 39,73 40,29 39,73 13 42,77 42,29 42,77 42,29 14 56,68 56,73 56,82 53,83 15 24,91 24,28 24,91 24,34 16 28,92 28,23 29,87 28,92 17 57,31 56,00 56,68 55,90 18 12,53 11,84 12,38 12,03 19 19,40 19,38 19,40 19,38 20 36,15 36,12 40,69 40,50 21 19,30 18,75 21,65 21,05 22 34,61 33,90 139,18 138,32 23 26,83 25,99 129,86 129,22 24 45,59 45,78 51,80 51,21 25 29,54 29,08 37,89 31,87 26 19,98 19,81 20,34 21,20 27 19,40 19,00 19,30 18,95 28 23,78 23,02 26,05 25,40 29 12,88 11,96 12,65 12,25 *Kongduang et al, 2008

25

4.3 - Derteminação Estrutural de EHJM-DC3

Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração diclorometânica do extrato

hexânico das raízes de J. mollissima (EHJM-D) resultaram na obtenção de um

precipitado denominado EHJM-DC3 com ponto de fusão na faixa de 201,0 -204,4º C.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Figura 11) de EHJM-DC3

apresentou uma banda larga em máx 3415 cm-1 característica de vibração de

deformação axial de ligação O-H; absorções em máx 2944 e 2859 cm-1 referentes a

vibrações de deformação axial de ligações C-H; bandas intensas em máx 1708 e 1685

cm-1 associadas a deformação axial de ligações C=O; além de bandas na faixa de 1245 a

1030 cm-1 condizentes com deformação axial de ligação C-O (SILVERSTEIN, 2007).

4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

Tran

smitâ

ncia

%

c m -1

Figura 11: Espectro na região do infravermelho de EHJM-DC3 (KBr)

O espectro de RMN 13C-BB (Figura 12, p. 27) revelou a presença de 20 sinais

espectrais. Dos sinais observados, dois sinais apresentam deslocamentos químicos

compatíveis com grupos carbonila. O sinal em C 204,1 (C-3) foi atribuído à carbonila

de cetona conjugada, enquanto que o sinal em C 214,4 (C-14) foi atribuído a carbonila

de cetona não conjugada. Dois sinais também foram observados para carbonos

olefínicos [C 153,13 (C-1) e 143,08 (C-2)]. Três sinais na faixa de carbono oxigenado

[C 86,5 (C-15), 62,5 (C-5), 59,2 (C-6)]. Através de uma análise dos espectros de RMN

26

1H,13C-HSQC (Figura 13, p. 28 ) foi possível identificar seis carbonos metínicos [C

153,1; 62,5; 58,3 (C-4), 37,8 (C-13), 29,3 (C-9) e 18,9 (C-11)], três carbonos

metilênicos [C 41,1 (C-7), 24,5 (C-12) e 18,5 (C-8)] e cinco carbonos metílicos [(C 9,9

(C-16), 18,1 (C-17), 18,2 (C-18), 15,4 (C-19) e 14,5 (C-20)] (Tabela 3, p. 28 ).

Figura 12: Espectro de RMN 13C-BB (125MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3.

27

Figura 13: Espectro de RMN 2D 1H,13C-HSQC de EHJM-DC3.

Tabela 3: Padrão de hidrogênio de EHJM-DC3 determinado através de análise dos

espectros de RMN 1H,13C-HSQC.

C CH CH2 CH3

214,5 153,1 41,1 18,2

204,2 62,5 24,5 18,1

143,1 58,3 18,5 15,4

86,5 37,8 14,5

59,3 29,3 9,9

16,7 18,9

6C 6CH 3CH2 5CH3

28

O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:MeOD) mostrou um sinal singleto

em H 6,7 característico de hidrogênio ligado a carbono sp2; um sinal multipleto em H

3,77 referente a hidrogênio ligado a carbono oxigenado; sinais em H 1,7; 1,4; 0,95;

0,83; 0,62 foram atribuídos a carbonos metílicos.

Figura 14: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3:CD3OD) de EHJM-DC3

29

A comparação dos dados de RMN 13C de EHJM-DC3 com os dados encontrados na

literatura (Tabela 4, p. 31), revelou que essa substancia se tratava da

Jatrogrossidiona um diterpeno de esqueleto latirano que foi isolado de Jatropha

grossidentata (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al, 1992), mas inédita na espécie J.

mollissima.

O

O

OH

HO

Jatrogrossidiona

12

3 45

6 7

8 9 10

11

1213

14

1516

17

18

19

20

30

Tabela 4: Deslocamentos químicos de RMN 13C e 1H (CDCl3) de EHJM-DC3 em

comparação com dados da literatura.

C C H C (literatura*)

1 153,1 6,6 (s) 152,7

2 143,1 142,7

3 204,2 203,4

4 62,5 2,2 (d, J = 8,6) 62,4

5 58,3 2,7 (d, J = 8,6) 57,7

6 59,3 58,6

7 41,1 2,09 (dd)/0,9 (dd) 41,0

8 18,5 1,6 (dd)/0,8 (dd) 18,4

9 29,3 0,01 (t) 29,1

10 16,7 16,5

11 18,9 0,37 (m) 18,7

12 24,5 1,5 (dq)/1,38 (dq) 24,3

13 37,8 3,76 (m) 37,6

14 214,5 214,0

15 86,5 86,4

16 9,9 1,69 (d, J = 0,9) 10,2

17 18,1 1,24 (s) 18,3

18 28,2 0,84 (s) 28,2

19 15,4 0,63 (s) 15,4

20 14,5 0,95 (d, J = 6,85) 14,6

*Brum et al., 1998

31

4.5 - Inibição da enzima acetilcolinesterase

O objetivo desse ensaio é encontrar extratos e/ou substancias que apresentem a

propriedade de inibir a enzima acetilcolinesterase, inibição essa que esta diretamente

ligada ao tratamento da doença de Alzheimer (RHEE et al., 2001). Atualmente, a

literatura revela atividade relativamente intensa na busca de novos inibidores em

extratos de plantas, verificando-se expressivo interesse no isolamento e na identificação

e novos inibidores da AChE (GUPTA et al.,1997).

Na Tabela 5 estão contidos os resultados para o teste de inibição da enzima

acetilcolinesterase dos extratos hexânico e etanólico das raízes de J. mollissima, extratos

metanólicos das folhas de quatro espécies do gênero Anthurium.

Tabela 5: Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de J. mollissima e de quatro espécies do gênero Anthurium.

De acordo com os resultados obtidos, apenas os extratos hexânico das raízes de

J. mollissima e metanólico das folhas de A. andraeanum apresentaram-se

potencialmente ativos contra a enzima acetilcolinesterase.

Extratos Atividade Anticolinesterásica

J. mollissima (hexânico) Positivo

J. mollissima (etanólico) Negativo

A. lindmanianum (metanólico) Negativo

A. andraeanum (metanólico) Positivo

A. bonplandii (metanólico) Negativo

A.plowmanii (metanólico) Negativo

Controle positivo (Eserina) Positivo

32

5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 5.1 - Material Vegetal

A realização deste trabalho baseou-se no estudo fitoquimico das raízes de

Jatropha mollissima e estudo dos compostos fenólicos das folhas de quatro espécies do

gênero Anthurium.

As raízes de J. mollissima foram coletadas na cidade de Beberibe – Ceará em

Setembro de 2009 pela Prof. Luquesio Petrola de Melo Jorge

As folhas de A. lindmanianum, A. andraeanum, A. bonplandii e A. plowmanii

foram fornecidas pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)

através da Dra. Ana Cecília Castro.

5.2 - Métodos Cromatográficos

As cromatografias de adsorção foram executadas empregando-se gel de sílica 60

(70-230 mesh) da marca Vetec (CC gravitacional). O diâmetro e o comprimento das

colunas variaram de acordo com a alíquota da amostra a ser cromatografada e a

quantidade de sílica utilizada em cada experimento.

Nas cromatografias em camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas

de gel de sílica 60, 5-40m, em suporte de alumínio com indicador de fluorescência na

faixa de 254 nm (Merck).

As substâncias foram reveladas nas cromatoplacas analíticas através da

exposição destas à radiação ultravioleta (UV) no comprimento de onda 254 nm e por

solução vanilina/ácido perclórico/etanol seguida de aquecimento em chapas

aquecedoras.

Os solventes utilizados nas eluições foram n-hexano, diclorometano, acetato de

etila e metanol puros ou em misturas binárias.

33

5.3 - Métodos Físicos

5.3.1 - Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV)

Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos em espectrômetro

Perkin-Elmer, modelo FT-IR SPECTRUM 1000, utilizando pastilhas de brometo de

potássio (KBr).

5.3.2 - Ponto de Fusão

Os pontos de fusão das substancias isoladas foram obtidos em equipamento MQAPF-

301 da Microquimica a uma taxa de aquecimento de 5º C/min.

5.3.3 - Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e

carbono 13 (RMN 13C), uni- e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro da

Bruker, modelo DPX-300 operando na freqüência de 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C e DRX-500 operando na freqüência de 500 MHZ para 1H e 125 MHz para 13C.

Na dissolução das amostras para obtenção dos espectros foram utilizados

solventes deuterados: metanol (CD3OD), clorofórmio (CDCl3) e piridina (C5D5N)

Os deslocamentos químicos (δforam expressos em parte por milhão (ppm) e

referenciados nos espectros RMN 1H pelo pico do hidrogênio pertencente a fração não

deuterada dos solventes: metanol (cloroformio (e piridina

(e para os espectros de RMN 13C pelos picos de carbonos –13 dos

solventes: metanol (cloroformio (e piridina (123,87; 135,91 e

150,35).

34

5.4 - Estudo dos constituintes químicos de Jatropha mollissima (Pohl)

Baill

5.4.1 - Preparação dos extratos de J. mollissima

4,620 Kg das raízes secas e trituradas de J. mollissima foram submetidas à

extração com n-hexano (3 x 9L) e em seguida com EtOH (3 x 9L) a frio. A solução

resultante foi concentrada à pressão reduzida em evaporador rotativo fornecendo os

extratos denominados EHJM (42 g) e EEJM (70 g) (Fluxograma 1).

Fluxograma 1 – Esquema da obtenção dos extratos hexânico e etanólico das raízes de

J. mollissima.

Material botânico

Extrato hexânico (EHJM)

Torta

Extrato etanólico (EEJM)

Resíduo

Extração com n-hexano

Evaporação sob pressão reduzida

Evaporação sob pressão reduzida

Extração com etanol

5.4.2 - Fracionamento cromatográfico de EHJM

O extrato bruto EHJM (42 g) foi adsorvido em 45,3 g de gel de sílica,

pulverizados em gral de porcelana e acondicionados em 40g de gel de sílica utilizando

como suporte um funil de separação de 2000 mL. Após sucessivas eluições com os

solventes éter de petróleo, hexano, CH2Cl2, AcOEt e MeOH puros, foram obtidas três

frações (Tabela 6).

Tabela 6: Dados referentes ao fracionamento preliminar do extrato hexânico bruto das raízes de J. mollissima. Solvente Fração Massa (g)

Éter de petróleo - -

Hexano - -

CH2Cl2 EHJM-D 22,2

AcOEt EHJM-A 9,5

MeOH EHJM-M 11,3

Total 43,0

5.4.3 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-D e isolamento de EHJM-DA1

A Fração EHJM-D (22,2 g) foi adsorvida em 21,3 g de gel de sílica,

pulverizados em gral de porcelana e acondicionados sobre 15 g de gel de sílica em uma

coluna de vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano, CH2Cl2 e AcOEt em

concentrações variadas (Tabela 7, p. 37).

35

36

Tabela 7: Descrição do gradiente de eluição do tratamento cromatográfico da fração

EHJM-D.

Eluentes Fração Massa (g)

Hexano EHJM-DA 0,479

Hexano/ CH2Cl2 50% EHJM-DB 12,354

CH2Cl2 EHJM-DC 6,770

CH2Cl2/AcOEt 50% EHJM-DD 0,748

Total 20,351

A fração EHJM-DA (0,479 g) apresentou um sólido branco amorfo. Essa fração

foi filtrada e o material obtido foi lavado com n-hexano exaustivamente para render um

sólido branco amorfo (25 mg) solúvel em piridina que foi denominado EHJM-DA1.

5.4.4 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-DB e isolamento de

EHJM-DB (2-3) 2

Uma alíquota de 1,2 g da Fração EHJM-DB (12,354 g) foi adsorvida em 2 g de

gel de sílica, pulverizados em gral de porcelana e acondicionados sobre 10 g de gel de

sílica em uma coluna de vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano e AcOEt em

concentrações variadas (Tabela 8).

Tabela 8: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DB.

Eluentes Fr. coletadas Fr. reunidas Massa (g)

Hexano 1 EHJM-DB (1) -

Hexano/AcOEt20% 2-10 EHJM-DB (2-3) 0,568



Total 0,903

37

A fração EHJM-DB (2-3) foi submetida a sucessivas CC onde foi possível isolar

um sólido branco (15 mg) solúvel em clorofórmio. Esse precipitado foi denominado

como EHJM-DB (2-3) 2.

5.4.5 - Fracionamento cromatográfico de EHJM-DC e isolamento de

EHJM-DC 3

A Fração EHJM-DC (6,77 g) foi adsorvida em 6 g de gel de sílica, pulverizados

em gral de porcelana e acondicionados sobre 40 g de gel de sílica em uma coluna de

vidro. Os solventes utilizados foram n-hexano e AcOEt em concentrações variadas

(Tabela 9).

Foram obtidas 198 frações que, após analise em CCD, foram reunidas de acordo

com suas semelhanças. As frações 127-154 após serem reunidas apresentou um

precipitado (cristais em forma de agulhas). Após a filtração e sucessivas lavagens com

MeOH o precipitado foi denominado EHJM-DC3 (16 mg).

Tabela 9: Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da fração EHJM-DC.

Eluentes Fr. reunidas Massa (g)

Hexano/AcOEt 10% EHJM-DC (1-51) 0,155




Hexano/AcOEt 50%

Total 6,646

38

Fluxograma 2 – Rota esquemática do isolamento dos constituintes químicos EHJM-

DA, EHJM-DB(2-3)2 e EHJM-DC3 a partir do extrato hexânico das raízes de J.

mollissima.

Ext. hexânico (42 g)

1. Fracionamento cromatográfico 2. Destilação do solvente

EHJM-D (22,2 g)

EHJM-A (9,5 g)

EHJM-M (11,3 g)

Fracionamento cromatográfico

EHJM-DA (25 mg)

EHJM-DB (12,35 g)

EHJM-DC (6,77 g)

EHJM-DD (0,75 g)

C. cromatográfica

EHJM-DB(2-3)2 (15 mg)

C.cromatográfica

EHJM-DC3 (16 mg)

39

5.5 - Ensaio para inibição da enzima acetilcolinesterase dos extratos

Este ensaio é baseado segundo Ellman et al. (1961), adaptado para CCD por

Rhee et al. (2001). É um método rápido e sensível para a seleção de amostras com ação

anticolinesterásica. As reações que estão envolvidas nesse método estão apresentadas na

Figura 15.

SN(CH3)3 I

OAChE

O

O

+ SN(CH3)3

+ 2H

+SN(CH3)3 S

S

HO2C

O2NNO2

CO2H

S

HO2C

O2NS N(CH3)3

S NO2

CO2H

+

Figura 15: Mecanismo para a reação enzimática do teste de Ellman.

A metodologia utiliza uma alíquota de 5 L dos extratos (10mg/mL) aplicados

em uma cromatoplaca. Após a evaporação dos solventes, pulverizou-se uma mistura

(1:1) de iodeto de acetiltiocolina (ATCI) 1mmol.L-1 com o reagente de Ellman (ácido

5,5’ – Ditiobis-(2-nitrobenzóico, DTNB, 1 mmol.L-1), deixando em repouso por 3 min

para a secagem da placa. Em seguida, borrifou-se a enzima acetilcolinesterase 3 U/mL.

Após um período de 10 minutos, ocorre o surgimento de uma coloração amarela na

placa, porém onde houve inibição da enzima, observou-se um halo branco em torno dos

“spots” onde foram aplicadas as amostras. Em 20 - 30 min a coloração desapareceu.

Como controle positivo foi utilizado solução do padrão sal de Eserina (2 mg/mL)

(Figura 17) e solventes utilizados como controle negativo. Na figura 16 estão

apresentados as etapas desse método.

40

Figura 16: Etapas da metodologia modificada por Rhee.

N

NOHN

O

CH3

CH3

CH3

H3C

H

Figura 17: Estrutura do padrão Eserina.

1 – Aplicação das amostras 2 – Evaporação do solvente 3 – Pulverização da solução (1:1) de ATCI + DTNB

Cromatoplaca

4 – Borrifou-se a enzima acetilcolinesterase (3U/mL)

41

6. CLAE-EM 6.1 - Introdução

A espectrometria de massas se tornou nos últimos anos uma das técnicas mais

utilizadas com diversas aplicações nas áreas de química, biologia, ciências médicas e

tecnológicas, isto devido aos avanços na instrumentação e de técnicas de ionização que

a revitalizaram. O número de artigos publicados para esta técnica tem aumentado

mostrando a grande importância desta técnica, seja para simples determinação de massa

molar de substâncias puras, ou na identificação e quantificação de substâncias de

interesse em extratos brutos (CROTTI et al., 2006). O acoplamento da cromatografia

líquida à espectrometria de massas com ionização por electrospray (CL-EM-IES)

tornou-se uma importante técnica para análise qualitativa e quantitativa das mais

variadas fontes de produtos naturais (MORAIS et al., 2007).

6.2 - Espectrômetro de massas

O espectrômetro de massas é um instrumento utilizado para separar espécies

carregadas de acordo com suas razões massa/carga (m/z) e determinar suas intensidades

relacionando-as. Dessa forma, um espectrômetro de massas típico é constituído pelas

seguintes partes: Fonte de ionização, analisador de massas, detector e sistema de

processamento de dados (GATES et al., 2006). Neste estudo, o acoplamento CLAE-EM

é focalizado nos principais aspectos instrumentais e práticos das aplicações para análise

de frações complexas.

6.3 - Ionização por electrospray (IES)

A ionização por electrospray é basicamente uma técnica de transferência dos

analitos da fase líquida pra a fase gasosa. Ela é bastante amena e geralmente é bem

sucedida para moléculas de polaridade mediana. Adicionalmente, a técnica IES produz

com frequência íons com múltiplas cargas para moléculas grandes como proteínas e

peptídeos. Nos últimos anos a ionização por electrospray tem se tornado uma das mais

42

importantes técnicas de ionização em uso. Seus mecanismos permanecem em constante

estudo por ainda não serem bem compreendidos, porém, alguns autores tentam explica

os fenômenos que ocorrem na fonte de ionização.

A IES pode ser dividida em três etapas principais: a nebulização da solução da

amostra em gotículas carregadas produzidas pela aplicação direta de voltagem no

capilar, a liberação dos íons a partir das gotículas e o transporte dos íons da região de

pressão atmosférica da fonte para a região de alto vácuo do analisador (CHAPMAN,

1993). Uma diferença de potencial (2-4 kV) é aplicada ao capilar por onde o liquido

contendo a amostra flui em direção a um contra-eletrodo, o que causa a separação dos

íons com carga positiva e negativa formando uma dupla camada elétrica. A atração

eletrostática dos íons em excesso na camada exterior do liquido, em direção ao contra-

eletrodo, causa uma distorção da sua superfície no formato de um cone conhecido como

“cone de Taylor”. Através do auxilio de um fluxo de gás aquecido, geralmente N2, as

gotículas carregadas com várias unidades de carga sofrem evaporação do solvente

restando apenas os íons da amostra.

6.4 - Análise por CLAE-IES-EM dos extratos metanólicos de quatro

espécies do gênero Anthurium

6.4.1 - Preparação dos Extratos

As folhas secas de A. bonplandii (13g), A. lindmanianum (20g), A. plowmanii

(14g) e A. andraeanum (10g) foram extraídas com hexano (500 mL) e metanol (500

mL) em sistema Soxhlet. Os extratos foram destilados em evaporador rotativo e

armazenados à 4ºC. Apenas os extratos metanólicos foram analisados.

6.4.2 - Materiais Químicos

Acetonitrila e metanol grau HPLC foram adquiridos de Tedia Company Inc.

(Fairfield, OH). Água grau HPLC foi preparada com água destilada usando um sistema

Milli-Q (Millipore Lab., Bedford, MA).

43

6.4.3 - Preparo das amostras

Foram pesados 10mg de cada extrato metanólico das folhas, dissolvidos em

10mL de MeOH : H2O (6:4). As soluções foram mantidas durante 30 minutos em

aparelho Ultra-som e, em seguida, diluídas a uma concentração de 250 ppm, filtradas

em filtros de 20 μm e mantidas à 4º C até serem analisadas.

6.4.4 - Condições cromatográficas CLAE-DAD-IES-EM

O instrumento consistiu de um LC-DAD-ESI/MS 250 Varian HPLC (Varian,

CA), acoplado com um detector de arranjo de diodos (DAD) e um 500-MS IT

espectrômetro de massas (Varian). A coluna C18 Zorbax (Agilent) (5 µM, 150 x 2 mm)

foi utilizada a uma vazão de 0,4 mL/min. A temperatura do forno da coluna foi fixada

em 30ºC.

A fase móvel consistiu de uma combinação de A (0,1% de ácido fórmico em

água) e B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). O gradiente variou linearmente de

10% para 26% B (v / v) em 40 min, a B 65% em 70 min e, finalmente, a B 100% em 71

min e mantida a B 100% para 75 min.

O DAD foi fixado em 350, 270 e 520 nm de tempo real de leitura para fora e espectros

UV / VIS, 190-650 nm, foram continuamente coletados. Os espectros de massas foram

simultaneamente adquiridos utilizando ionização por electrospray no modo positivo e

negativo de ionização (IP e IN), tensão de fragmentação de 80 V para a faixa de massa

de 100-2000 amu. A pressão do gás de secagem de 35 psi, pressão de gás de

nebulização de 40 psi, a temperatura do gás de secagem de 370º C, as tensões capilares

de 3500 V para IP e 3500 V para o IN, e tensões spray protetor de 600 V foram

utilizados. O sistema de cromatografia líquida foi acoplado diretamente à EM sem

divisão de fluxo. A identificação de compostos foi baseada principalmente em dados de

espectrometria de massas de íons moleculares e íons produto EM-EM e em observações

publicadas para compostos fenólicos.

44

6.4.5 - Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM

Estudo através de CLAE-UV/Vis-EM dos extratos de quatro espécies de

Anthurium (Figura 18) indicou a presença de compostos fenólicos e seus glicosídeos.

Foram identificados seis compostos fenólicos diferentes caracterizados através das

fragmentações obtidas em comparação com dados da literatura.

As estruturas propostas para todos os compostos fenólicos identificados neste

trabalho (1-6) com suas respectivas massas podem ser observadas na Figura 24, p. 48.

As propostas de fragmentação encontram-se nos Esquemas 1-6, p. 51-56.

(a)

(b)

(c)

(d)

Figura 18: Cromatogramas CLAE dos extratos metanólicos de (a) A. lindmanianum, (b)

A. andraeanum, (c) A. bonplandii, (d) A. plowmanii.

45

Figura 19: Espectro UV/Vis do composto 1.


Figura 21: Espectro UV/Vi do composto 3.

46


Figura 23: Espectro de UV/Vis do composto 6.

47

O

O

HO

OH

OH

O

HO

HO

HOHO

4C21H20O10

432.38432.105647

Figura 24: Compostos fenólicos identificados por CLAE-EM nos extratos metanólicos de quatro espécies de Anthurium.

O

OH

OCH3

O

HOOHO

O

OH

OHO

HOHO

HO

6C28H32O14

592.55592.179206

O

OH

OCH3

O

HO

OHOO

OH

OHO

HOHO

HO

2C28H32O14

592.55592.179206

O

HO

O

O

OH

OHOH

OH

OH

5C16H18O9

354.31354.095082

OHO

OH

OHO

O

OH

HOHO

OH

OH

HOHO

O

1C26H30O14

566.52566.163556

O O

O H

O C H 3

O

O H O H O

O

O O

H O H O O H

O O H

H O H O

O O

3 C 3 6 H 4 4 O 2 0

7 9 6 . 7 3 7 9 6 . 2 4 2 5 9 4

48

Tabela 10: Dados LC-DAD-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados parcialmente. Composto tR (min) UV máx (nm) Íon (m/z) EM-EM

1 22,469 344, 271 565 + 529, 475, 427 2 28,367 336, 271 593 + 447, 429, 327 3 55,321 344, 271 797 + 651, 443, 285 4 28,454 334, 344sh, 270 355 + 337, 163, 135 5 35,164 - 431 - 341, 311 6 29,843 334, 268 593 + 447, 327, 285 Tabela 11: Dados LC-IES-EM em modo positivo e negativo dos compostos fenólicos identificados obtidos da literatura. Composto UV máx (nm) Íon (m/z) EM-EM Referência

1 335, 270 565 + 529, 475, 427 2 329, 273 591 - 445, 429 Aquino et al.,

2001 3 333, 268 797 + 651, 447, 285 Marin et al., 2001 4 334, 344sh, 270 431 - 341, 323, 311,

283, 269 da Silveira et al.

2010 5 - 355 + 377, 355, 163 Termentzi et al.,

2008 6 331, 270 591 - 447, 327, 285 Aquino et al.,

2001

49

A identificação dos compostos 1-6 foi confirmada através da comparação direta com padrões no German Cancer Research Center (DKFZ) pelo Prof. Dr. Robert Wyn Owen e, ainda, foi possível identificar no extrato metanólico de A. bonplandii a presença de isovitexina e orientina. Figura 25: Compostos identificados no extrato metanólico de A. bonplandii.

O

OH

OH

O

HO

OHO

OH

OH

HO

isovitexina

O

OH

OH

O

HO

OHO

OH

OH

HO

OH

orientina

50

6.4.6 - Propostas de fragmentos de massas observados nos espectros dos compostos 1-6.

Esquema 1: Propostas de fragmentos de massas para o composto 1.


OHO

OH

OHO

O

OH

HOHO

OH

OH

HOHO

O

OO

OH

OH

O

OH

HOHO

O

O

OHHO

HO

H2O

H

m/z 565

H

OO

OH

OH

O

OH

HOHO

O

HO OH OHO

m/z 427

H

OO

OH

O

O

OHHO

HO

OO

HO OH

H

2H2O

m/z 529OHO

OH

OHO

OH

HOHO

OH

OOH

HO OH

H2C O

H

m/z 475

51



H

2

m/z 593

O

OH

OCH3

O

HO

OHO

OH

OH

HO

O

HOHO

HO

O

OH

OCH3

O

HO

OHOO

OH

OH

O

HOHO

HO

H

m/z 447

O

OH

OCH3

O

HO

OO

OH

OH

H2O

H

m/z 429

O

OH

OCH3

O

HO

OH

O

OH

HO OH

H

m/z 327

52



H

OO

OH

OCH3

O

OHOHO

O

OO

HO HO

OH

O

OH

HOHO

OO

3

m/z 797

OHO

OH

OCH3

O

H

OHOHO

O

OO

HO HO

OH

O

OH

HOHO

OO

m/z 285

OO

OH

OCH3

O

OHOHO

O

HO

O

OH

HOHO

OO

O

HO HO

OH

m/z 651

H

O

OH

HOHO

OO

H

OO

OH

OCH3

O

OHOHO

OH

HO

m/z 447

53


Figura 29: Espectro de massas IES (modo negativo) do composto 4.

5

m/z 431

O

OH

OH

O

O

OH

O

O

OH

OH

O

HO

OH

m/z 341m/z 311

O

OH

OH

O

HOOHO

OH

OH

HO

HO

H2O

OHHO

O

OH

54

H

4

O

HO

O

O

OHOH

OH

OH

H

HO

O

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

H2O

m/z 355 m/z 337

m/z 135

m/z 163

m/z 175



55



6

H

m/z 593

O

OH

OCH3

O

HOOHO

OH

OH

HO

O

HOHO

HO

O

O

OH

OCH3

O

HOOHO

OH

OH

O

HOHO

HO

HOHO

OH

OH

HOO

OH

OCH3

O

HO

H

m/z 447m/z 285

56

7. CONCLUSÃO

A investigação química do extrato hexânico das raízes de J. mollissima resultou

no isolamento e caracterização de um álcool de cadeia longa denominado triacontanol,

uma mistura de sitosterol e estigmasterol e um diterpeno de esqueleto latirano

denominado jatrogrossidiona, inédito na espécie.

O estudo cromatográfico do extrato etanólico das raízes de J. mollissima

possibilitou o isolamento de uma substancia que até o momento ainda se encontra em

processo de elucidação estrutural.

Até o momento foram identificados oito compostos por CLAE-EM: 6-C-

arabinosil-8-C-glicosil-apigenina nas folhas de A. lindmanianum; 8-O-ramnosil-(1-3)-

C-glicosil-acacetina e 7-O-[6-O-acetilglicosil(1-2)]ramnosil-(1-6)-glicosil-acacetina nas

folhas de A. andraeanum; ácido 5-cafeoilquínico, vitexina, isovitexina e orientina nas

folhas de A. bonplandii e 6-O-ramnosil-(1-3)-C-glicosil-acacetina nas folhas de A.

plowmanii.

Os resultados para o teste de inibição da enzima acetilcolinesterase mostraram

que apenas os extratos hexanico de J. mollissima e metanólico das folhas de A.

andraeanum apresentaram atividade anticolinesterásica.

57

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