Joana Beatriz A. S. P. Sousa - Repositório Aberto · Tukey's t-test (p ≤0.05, values statistically different). The results show that the compounds, THPPE, ETHPPE and E 2THPPE,

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto

para prestação de provas de

Mestrado em Controlo de Qualidade

(Especialização em Água e Alimentos)

Trabalho realizado sob a orientação da Professora Carmen Diniz

e co-orientação da Professora Paula Fresco

Joana Beatriz A. S. P. Sousa Dezembro 2008

i

Agradecimentos À Prof. Doutora Carmen Diniz pela orientação do mestrado, pelo seu apoio e

disponibilidade em todos os momentos, ao longo destes dois anos.

À Prof. Doutora Paula Fresco pela atenção, preocupação e amabilidade de sempre.

À Ana e à Carolina pelos momentos de “partilha” mas sobretudo pelas suas amizades.

Aos membros do serviço de Farmacologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do

Porto, por me terem recebido com simpatia e pelo auxilio que me prestaram sempre que

precisei para a realização deste trabalho.

Ao Serviço de Química Orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto,

especialmente à Prof. Doutora Fernanda Borges pela cedência dos compostos fenólicos.

À minha família, de modo especial aos meus pais e irmãos, pelo apoio e incentivo em

todos os momentos da minha vida e ao Pedro por ter estado sempre presente com um

apoio incondicional e por me ter ajudado a seguir em frente nos momentos mais difíceis.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Resumo

ii

Resumo

Os compostos fenólicos, nomeadamente os ácidos fenólicos, são compostos

bioactivos que se acredita estarem envolvidos no processo de defesa contra danos

oxidativos, pelo menos em parte, devido à sua capacidade antioxidante. A xantina

oxidase serve como uma fonte de radicais livres (EROs) derivados do oxigénio havendo

diferentes mecanismos conhecidos que conduzem a um aumento da formação de

superóxido por parte desta enzima. Nos processos inflamatórios e em determinadas

situações patológicas como o cancro, doenças cardiovasculares e doenças

neurodegenerativas, observa-se uma elevação na formação de EROs, com consequente

aumento dos danos atribuídos a estes radicais livres. Nos últimos anos, têm sido

desenvolvidos estudos de novos inibidores que, ao contrário do alopurinol (inibidor

padrão), apresentem efeitos adversos menos relevantes. Actualmente o interesse reside

em compostos estruturalmente diferentes das purinas/pirimidinas (cuja estrutura se

acredita ser causa dos efeitos adversos mais relevantes) como, por exemplo, os ácidos

fenólicos. Os ácidos fenólicos exibem, para além de actividade antioxidante, actividade

inibitória para as ciclooxigenases (COXs), enzimas que conduzem à formação de

prostaglandinas. Há ainda evidência na literatura de que alguns ácidos fenólicos podem

apresentar actividade quimiopreventiva, relacionada com a sua actividade

antioxidante/anti-inflamatória ou ainda relacionada com a sua capacidade em intervir nas

vias de transdução de sinal das células neoplásicas.

Neste trabalho estudou-se a actividade inibitória exibida sobre a xantina oxidase e

a COX do tipo 1 e 2, por três compostos derivados do ácido cafeico (um ácido fenólico

hidroxicinâmico), sintetizados no Laboratório de Quimica Orgânica da Faculdade de

Farmácia da Universidade do Porto: ácido trans-3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenóico

(THPPE) e dos respectivos ésteres, trans-etil-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenoato

(ETHPPE) e dietil-2-(3,4,5-trihidroxifenilmetileno) malonato (E2THPPE). Para o efeito, os

compostos foram submetidos a ensaios experimentais utilizando kits enzimáticos de

elevada sensibilidade tendo os valores de inibição obtidos sido calculados como média ±

desvio padrão (DvP) de n experiências. Calculou-se ainda o valor de concentração capaz

de inibir 50% da actividade enzimática (IC50). Para a análise do significado estatístico

entre os diversos grupos de tratamentos utilizou-se ANOVA “one way” análise de

variância seguido pelo teste t-Tukey´s (p ≤ 0,05, valores estatisticamente diferentes).

Os resultados obtidos demonstram que os compostos THPPE, ETHPPE e

E2THPPE são capazes de inibir a actividade da enzima xantina oxidase, confirmando

dados da literatura que atribuem a outros ácidos fenólicos propriedades antioxidantes por

inibirem esta enzima. O E2THPPE revelou-se o composto mais promissor em estudo,

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Resumo

iii

apresentando IC50 E2THPPE=IC50 alopurinol. A diferença estrutural do E2THPPE

relativamente às estruturas de ETHPPE e THPPE consiste na existência de grupos etilo

substituintes do grupo carboxilo, a qual poderá explicar a ocorrência de um maior número

de interacções (ligações de hidrogénio e/ou interacções electrostáticas) com os resíduos

de aminoácidos da enzima conduzindo, desta forma, a uma maior estabilização da

ligação enzima-inibidor. Como estes grupos etilo são mais volumosos do que os

substituintes do grupo carboxílico presentes no ETHPPE e THPPE, esta poderá constituir

uma explicação para a ordem de eficiência de inibição obtida (alopurinol = E2THPPE>

ETHPPE> THPPE). O E2THPPE revelou-se como um inibidor reversível do tipo misto

com valores de Vmáx e de Km que diminuem na sua presença. Estes compostos

mostraram-se igualmente eficazes na inibição da COX-1 e COX-2, requerendo

concentrações mais elevadas do que o composto de referência, a indometacina (ordem

de eficiência de inibição obtida, COX-1: Indometacina> E2THPPE= THPPE> ETHPPE e

COX-2: Indometacina> E2THPPE> THPPE= ETHPPE). O E2THPPE exibe uma inibição

mais relevante sobre a COX-2 relativamente aos outros compostos em estudo e até

mesmo relativamente à isoforma COX-1. O índice de especificidade relativa entre as

isoformas da COX (IC50 para COX-2/COX-1) permite comparar a potência dos fármacos:

as razões de IC50 COX-2/COX-1 encontradas para os compostos E2THPPE, ETHPPE e

THPPE são da mesma ordem de grandeza, 0,33; 0,59 e 0,94, respectivamente. Contudo

o E2THPPE parece ser o inibidor que pode causar efeitos adversos menos intensos (IC50

COX-2/COX-1=0,33). Este efeito mais promissor do composto E2THPPE poderá ser

explicado pelo facto de a COX-2 ser capaz de “acomodar” melhor os inibidores mais

volumosos no seu local activo resultando numa maior inibição desta. Este facto deve-se a

variações estruturais relacionadas com alterações nos resíduos de aminoácidos,

tamanho e o ambiente químico do local de ligação à COX-2 (COX-2 tem um local activo

maior (em cerca de 17%) do que o da COX-1) em que a diferença de tamanho pode

beneficiar uma ligação mais forte dos ácidos gordos e inibidores ao local activo da COX-

2, e aumentar o acesso ou permitir uma ligação mais rápida de inibidores não acídicos à

COX-2.

Os compostos em estudo exibiram uma promissora actividade antioxidante por

inibirem a xantina oxidase e anti-inflamatória, pois actuam como inibidores da

ciclooxigenase. Assim, perspectiva-se que este tipo de inibidores, após os devidos

ensaios farmacológicos de fase I, II e III, possam ter novas aplicações terapêuticas e ser

usados em quimioprevenção e no tratamento de patologias que apresentem danos por

elevados níveis de EROs.

Palavras chave: ácidos hidroxicinâmicos, actividade antioxidante, actividade anti-inflamatória,

xantina oxidase, ciclooxigenase 1-2

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Abstract

iv

Abstract

Phenolic compounds, including phenolic acids, are bioactive compounds that

are believed to be involved in protection against oxidative damage, at least in part, due

to its antioxidant capacity. Xanthine oxidase is used as a source of free radicals (ROS)

derived from oxygen and different mechanisms are known to lead to increased

formation of superoxide by this enzyme. In inflammatory processes and in certain

pathological conditions such as cancer, cardiovascular disease and neurodegenerative

diseases, there is an increase in the formation of ROS, with consequent increase of the

damage attributed to these free radicals. In recent years, studies have been developed

for new inhibitors that, contrary to allopurinol (inhibitor default), have less relevant

adverse effects. Currently the interest is to structurally different compounds of

purine/pyrimidine (whose structure is believed to be the cause of the most relevant

adverse effects), such as phenolic acids. In addition to antioxidant activity, phenolic

acids exhibit inhibitory activity for the cyclooxygenase (COXs), enzymes that lead to

the formation of prostaglandins. There is evidence in the literature that some phenolic

acids may have quimiopreventive activity, related to its antioxidant/anti-inflammatory

activity or related to their ability to intervene in the process of signal transduction of

neoplastic cells.

In this work is displayed inhibitory activity on xanthine oxidase and COX type 1

and 2, of three derivatives of caffeic acid (an hydroxycinnamic phenolic acid),

synthesized in the Laboratory of Organic Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of

Porto: acid, trans-3-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2-propenoic (THPPE) and their esters,

trans-ethyl-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2-propenoate (ETHPPE) and diethyl - 2 - (3,4,5-

trihydroxyphenylmethylene) malonate (E2THPPE). For this purpose, the compounds

were subjected to experimental testing using enzymatic kits of high sensitivity and the

values of inhibition obtained were calculated as mean ± standard deviation (DVP) of n

experiments. It has also been calculated the value of concentration able to inhibit 50%

of enzyme activity (IC50). For the analysis of statistical significance between different

treatment groups ANOVA was used, "one way" analysis of variance, followed by

Tukey's t-test (p ≤0.05, values statistically different).

The results show that the compounds, THPPE, ETHPPE and E2THPPE, are

able to inhibit the activity of the enzyme xanthine oxidase, confirming data from other

studies that attribute the antioxidant properties of phenolic acids by inhibiting this

enzyme. The E2THPPE was the most promising compound under study, showing IC50

E2THPPE = IC50 allopurinol. The structural difference of E2THPPE for structures of

ETHPPE and THPPE is the existence of ethyl groups of the carboxy group

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Abstract

v

substituents, which may explain the occurrence of a greater number of interactions

(hydrogen binding and / or electrostatic interactions) with the amino acid residues of

the enzyme leading thus to greater stabilization of the enzyme-inhibitor binding. As

these ethyl groups are more bulky as the substituents of the carboxylic group present

in ETHPPE and THPPE, this could be an explanation for the order of inhibition

efficiency obtained (allopurinol = E2THPPE> ETHPPE> THPPE). E2THPPE proved to

be a reversible inhibitor of mixed type, with values of Vmax and Km reducing in its

presence. These compounds were shown to be equally effective in inhibiting COX-1

and COX-2, requiring higher concentrations than the reference compound, the

indomethacin (order of inhibition efficiency obtained, COX-1: Indomethacin> E2THPPE

= THPPE> ETHPPE and COX-2: Indomethacin> E2THPPE> THPPE = ETHPPE).

E2THPPE displays a more significant inhibition on COX-2 than the other compounds

under study and even on the COX-1 isoform. The index of relative specificity between

COX isoforms (IC50 for COX-2/COX-1) compares the power of drugs: the reasons of

IC50 COX-2/COX-1 found for compounds E2THPPE, ETHPPE and THPPE are of the

same magnitude, 0,33, 0,59 and 0,94, respectively. However, E2THPPE seems to be

the inhibitor that can cause adverse effects less intense (IC50 COX-2/COX-1 = 0.33).

This effect of the most promising compound E2THPPE may be explained by the fact

that COX-2 be able to better "accommodate" inhibitors in its larger active site resulting

in its increased inhibition. This is due to structural variations related with changes in

amino acid residues, size and chemical environment of the binding site of COX-2

(COX-2 has a larger active site (around 17%) than COX - 1) where the difference in

size can benefit a stronger binding of fatty acids and inhibitors to the active site of

COX-2, and increase access or allow a faster binding of the non-acidic inhibitors to

COX-2.

The compounds under study showed a promising antioxidant activity with the

inhibition of xanthine oxidase and an anti-inflammatory activity, acting as

cyclooxygenase inhibitors. Thus, perspective is that this type of inhibitors, after the

proper pharmacological trials of phase I, II and III, may have further therapeutic

applications and be used in chemoprevention and treatment of diseases that have high

levels of damage by ROS.

Key words: hydroxycinnamic acids, antioxidant activity, anti-inflamatory activity, xanthine oxidase,

cyclooxygenase

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Índice

vi

ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

1.1 Radicais livres e substâncias com actividade antioxidante ...................................... 1

1.1.1 Antioxidantes naturais e sintéticos .................................................................... 4

1.1.2 Antioxidantes na dieta....................................................................................... 6

1.2 Actividade antioxidante – Xantina Oxidase .............................................................. 8

1.3 Actividade anti-inflamatória e anti-neoplásica – COX-1/ COX-2 ............................. 11

1.4 Ácidos fenólicos..................................................................................................... 17

1.4.1 Ácidos hidroxicinâmicos .................................................................................. 19

1.5 Biossíntese dos ácidos fenólicos na natureza ....................................................... 20

2. OBJECTIVOS ............................................................................................................. 22

3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 24

3.1 Reagentes e compostos testados .......................................................................... 24

3.2 Preparação das soluções ...................................................................................... 24

3.2 Ensaios de inibição ................................................................................................ 25

3.2.1 Medição da Actividade da Xantina Oxidase .................................................... 25

3.2.2 Medição da Actividade da Ciclooxigenase ...................................................... 26

3.3 Ensaios de cinética enzimática com a Xantina Oxidase ........................................ 28

3.4 Cálculo e Tratamento Estatístico dos Resultados .................................................. 28

4. RESULTADOS ............................................................................................................ 29

4.1 Ensaios de inibição com a Xantina Oxidase .......................................................... 29

4.1.1 Ensaios de Cinética Enzimática com a Xantina Oxidase do composto

E2THPPE ................................................................................................................. 31

4.2 Ensaios de inibição com a Ciclooxigenase 1 e 2 ................................................... 34

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 39

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS .......................................................... 56

7. REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 57

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Abreviaturas

vii

Abreviaturas

AChE Acetilcolinesterase

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADP Adenosina difosfato

AMP Adenosina monofosfato

ARA Ácido araquidónico

Arg Arginina

ATP Adenosina trifosfato

BHA Butil-hidroxianisol

BHT Butil- hidroxitolueno

CAPE Cafeic Acid Phenil Ester

COX-1 Ciclooxigenase 1

COX-2 Ciclooxigenase 2

DGLA ácido di-homo--linoleico

DMSO Dimetilsulfóxido

EPA ácido eicosapentaenóico

ERO Espécie Reactiva de Oxigénio

ETHPPE trans-etil 3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenoato

E2THPPE dietil 2-(3,4,5-trihidroxifenilmetileno) malonato

FBS Fetal bovine serum (Soro fetal bovino)

FTIR Fourier-Transformed Infrared Spectroscopy (Espectroscopia de

Infravermelho com Transformadas de Fourier)

GMP Guanosina monofosfato

Hist Histidina

HRP horseradish de rabano picante

IC50 Concentração a 50% de Inibição

IMP Inosina Monofosfato

Iso Isoleucina

Km Constante de Michaelis

MAPK MAP cinase

PBS Phosfate Buffer Saline (Tampão Fosfato Salino)

PG Prostaglandina

PGG2 Prostaglandina G2

PGH2 Prostaglandina H2

PGD Prostaglandina desidrogenase

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Abreviaturas

viii

PKC Proteína cinase C

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RF Ressonância de Fermi

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RPMI Roswell Park Memorial Institute

REA´S Relações Estrutura-Actividade

ROS Reactive Oxigen Species

Ser Serina

TBHQ 2-terc-butil-hidroquinona

THPPE Ácido trans-3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenóico

UV Ultra Violeta

Val Valina

Vmáx Velocidade máxima

XDH Xantina desidrogenase

XO Xantina oxigenase

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Introduç ão

1

1. INTRODUÇÃO

Os fitoquimicos das plantas são dádivas da natureza (Wattenberg et al, 1985). Os

compostos fenólicos são um exemplo destas dádivas e representam a classe mais

abundante de produtos naturais vegetais existindo já uma longa história de investigação

científica sobre estas. Para além das suas funções biológicas em plantas, os compostos

fenólicos, estão presentes em grande abundância em produtos alimentares e em

matérias agrícolas e florestais (Boudet, 2007).

Os compostos fenólicos, incluindo ácidos fenólicos, apresentam múltiplas

actividades biológicas tais como propriedades antitumoral, anti-mutagénica, anti-

inflamatória, antibacteriana e antioxidante (Shui & Leong, 2002), por poderem proteger as

células, contra danos oxidativos. Além destes efeitos, foram ainda atribuídas

propriedades pró-inflamatórias e actividade moduladora carcinogénica aos compostos

fenólicos pois alguns deles têm capacidade pró-oxidante podendo induzir, em algumas

situações, danos oxidativos no ADN, proteínas e lípidos celulares (Bhandari & Kawabata,

2004).

A actividade de sistemas fenólicos, relacionada com as suas propriedades

antioxidantes/anti-inflamatórias, é influenciada pelas características estruturais (Esteves

et al, 2008). Por outro lado, a natureza do alvo biológico, as condições ambientais e a

dosagem aplicada, juntamente com a biodisponibilidade dos compostos fenólicos são, do

mesmo modo, factores que influenciam a eficácia deste tipo de compostos.

1.1 Radicais livres e substâncias com actividade an tioxidante

O organismo utiliza cerca de 98 a 99% do oxigénio que consome para produzir

energia. A pequena parcela que sobra (1 a 2%) não participa do processo, formando as

espécies tóxicas reactivas de oxigénio (ERO´s) – os radicais livres (Fig. 1).

A maioria dos danos causados pelos radicais livres pode ser restaurada por sistemas

de reparação internos (Ruffin & Rock, 2001) contudo há radicais que permanecem no

organismo por este não ter forma de eliminá-los.


2

Figura 1. Esquema representativo dos principais factores que dão origem aos radicais livres e o seu

efeito a nível celular.

Os radicais livres correspondem a átomos ou grupos de átomos com um electrão não

emparelhado na sua órbita mais externa, sendo, portanto, muito reactivos, pois, para

recuperar o equilíbrio, precisam «doar» o electrão desemparelhado. Os radicais livres

têm vida média de milésimos de segundo, mas eventualmente podem tornar-se estáveis,

produzindo reacções biológicas lesivas (http://www.geocities.com).

O oxigénio molecular (O2) é um birradical de 16 electrões que, embora apresente um

electrão não-emparelhado na última camada de cada átomo, é estável porque este

electrão gravita na mesma direcção, impedindo o O2 de agir como radical livre. Esta

condição confere-lhe características de potente oxidante, ou seja, receptor de electrões

de outras moléculas. Se ocorrer a entrada de energia, os electrões não emparelhados

tomam direcções opostas, formando então uma molécula extremamente reactiva, o

radical livre de oxigénio (são exemplos, o superóxido O2•- e o peróxido de hidrogénio

H2O2). A água oxigenada (H2O2) diferentemente dos outros radicais livres, tem um

número par de electrões, podendo "navegar" por células e, assim, aumentar o risco de

interagir com átomos de ferro (Fe2+ e Fe3+) e dessa forma adquirir mais um electrão,

formando o terceiro e mais destruidor dos radicais, o hidroxilo (OH-), que tem a

capacidade de reagir instantaneamente com moléculas presentes na célula.

Um desequilíbrio no estado de oxidação-redução num sistema vivo conduz a uma

desregulação celular, que poderá, eventualmente, conduzir ao surgimento de várias

patologias incluindo cancro, degeneração neurológica, artrite, doenças cardiovasculares,

inflamação ou no envelhecimento precoce. De facto, muitas destas doenças são iniciadas

por ERO´s e moléculas de sinalização oxigenadas (Gebhardt et al, 2007; Naito et al,

2005; Griffiths et al, 2000). Como factores de risco que facilitam a actividade dos radicais

livres, podemos citar o tabagismo, a poluição do ar, fármacos (que tenham alguns


3

oxidantes), radiações ionizantes e solares, maior consumo de gorduras e choques

térmicos.

As reacções químicas com intervenção de radicais podem ser inibidas pela presença

de certas substâncias, denominadas de antioxidantes, capazes de reagir com esses

radicais formando outros radicais muito menos reactivos que os anteriores. Halliwell

define o termo antioxidante como sendo aplicável a qualquer substância que, quando

presente em baixas concentrações em comparação com as de um substrato oxidável,

atrasa ou inibe significativamente a oxidação desse substrato (Halliwell & Gutteridge,

1995).

Os antioxidantes podem inibir a oxidação de diversos substratos, desde moléculas

simples a polímeros e biossistemas complexos inibindo a formação de radicais livres,

promovendo a eliminação de radicais pela doação de átomos de hidrogénio (Soares,

2002; Namiki, 1990, Simic & Jovanovic, 1994), sequestro de radicais e, algumas vezes,

através da quelatação de metais. Por exemplo, a actividade antioxidante dos compostos

fenólicos conduz à formação de produtos intermediários relativamente estáveis devido à

ressonância do anel aromático presente na estrutura destes compostos. Por outro lado, a

sua natureza aromática faz deles alvos potenciais dos oxidantes pró-inflamatórios

(D’Alessandro et al, 2003).

In vivo, existem sistemas enzimáticos (por exemplo: superóxido dismutase, catalase,

glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa S-transferase) e proteínas

sequestradoras de metais que são capazes de produzir o radical HO˙ (por exemplo:

albumina, ceruloplasmina, metalotioneína e ferritina ou ferrina, incluindo a apoferritina,

fitoferritina, transferrina e lactoferrina). Estas enzimas e proteínas, apesar de não serem

habitualmente incluídas na categoria de antioxidantes, podem exercer actividade

antioxidante (Pardini, 1995).

Um aspecto relevante que deve ser tido em consideração é o facto de uma

substância antioxidante poder, em determinadas circunstâncias, alterar o seu

comportamento de forma a potenciar mais os danos oxidativos do que a inibi-los, ou seja,

exibir uma actividade pró-oxidante. A presença de alguns metais de transição, por

exemplo Fe3+ e Cu2+, em determinadas concentrações podem ocasionar essa alteração

de comportamento dos antioxidantes (Moran, 1997; Toyokuni & Sagripanti, 1993; Hadi et

al, 1998; Ahsan et al, 1999; Khan et al, 2000). Em suma, um antioxidante pode em

determinadas circunstâncias proteger um sistema enquanto que noutras circunstâncias

pode, pelo contrário, não proteger ou pode inclusive causar-lhes danos (Halliwell et al,

1995 b); Gazzani et al, 1998; Podmore et al, 1998 a) e b); Levine et al, 1998; Moran et al,

1997).


4

Alguns compostos fenólicos, particularmente flavonóides polifenólicos tais como a

quercetina, exibem uma elevada capacidade antioxidante que os torna capazes de inibir

os mecanismos que envolvem radicais livres nas células: i) na geração (pela

sequestração do O2˙¯), ii) na peroxidação lipídica (quer pela reacção com os radicais

peroxilos quer com os radicais peroxilos lipídicos) e iii) na formação de radicais HO˙

(provavelmente pela quelatação dos iões ferro) (Metodiewa et al, 1999). Contudo, a

quercetina é um dos compostos antioxidantes que, para além de actividade antioxidante,

pode, sob outras circunstâncias, exibir uma actividade pró-oxidante e actuar directamente

como mutagénico (Metodiewa et al, 1999). Em determinadas condições experimentais, os

compostos fenólicos podem aumentar (efeito pró-oxidante) ou inibir (efeito antioxidante) a

formação de radicais hidroxilo por reacções do tipo Fenton (Puppo, 1992).

1.1.1 Antioxidantes naturais e sintéticos

O oxigénio singuleto é um radical livre que pode ser encontrado nos alimentos como

resultado da fotossensibilização (por exemplo, os fortes raios solares podem alterar o

leite através de reacções químicas que envolvem a riboflavina) (Halliwell et al, 1995 b).

Um outro exemplo da formação de radicais livres em alimentos está descrito em

alimentos que foram irradiados para esterilização ou prevenção da germinaçãona medida

em que o processo de irradiação conduz à formação de radicais HO˙ e possivelmente

HClO (Halliwell et al, 1995 b). Este último, sabe-se que é extremamente reactivo na

presença do radical superóxido originando radicais HO˙ (1).

HClO + O2˙¯ → HO˙ + O2 + Cl¯ (1)

Durante o processamento dos alimentos, especialmente carnes, os iões de ferro

(Fe2+), e possivelmente os iões de cobre (Cu2+), podem ser libertados e catalisar

reacções que originam a produção de radicais hidroxilo (reacção de Fenton) (Halliwell et

al, 1995 b).

Os exemplos atrás descritos reforçam a necessidade de combater os ataques oxidativos

de ERO’s no organismo ou nos alimentos utilizando-se para o efeito, antioxidantes de

origem natural ou de síntese.

Na indústria alimentar é permitido e, por isso frequente, o uso de uma grande

variedade de substâncias com propriedades diversas: conservantes, acidificantes,

emulsionantes, intensificadores de sabor e espessantes e, ainda, os antioxidantes. Na


5

indústria alimentar os antioxidantes mais utilizados são de origem natural

(nomeadamente α-tocoferol, ácido ascórbico e citratos). Contudo são também utilizados

alguns antioxidantes sintéticos tais como Butil-hidroxianisol (BHA); butil-hidroxitolueno

(BHT); galhato de propilo, galhato de octilo, galhato de dodecilo e 2-terc-butil-

hidroquinona (TBHQ) (Tabela 1).

Tabela 1 – Antioxidantes de origem natural e de síntese aprovados pela União Europeia

E 300 Ácido L-ascórbico E 315 Ácido eritórbico

E 304 Palmilato de ascorbilo

E 316 Eritorbato de sódio

E 307 α-Tocoferol E 320 Butil-hidroxianisol (BHA)

E 308 β-Tocoferol E321Butil-hidroxitolueno (BHT)

E 309 δ-Tocoferol E 330 Ácido cítrico

E 310 Galhato de propilo E 331 Citratos de sódio

E 311 Galhato de octilo E 332 Citratos de potássio

E 312 Galhato de dodecilo E 333 Citratos de cálcio

Os compostos antioxidantes derivados de plantas, especialmente fenóis, tais como a

quercetina, carnosol, timol, ácido carnósico, hidroxitirosol, ácido gálhico e seus derivados,

taninos (Rubbo et al, 1994), catequinas, rutina, ácido elágico, eugenol e ácidos


6

rosmarínicos, têm despertado particular interesse na indústria alimentar por constituírem

um suplemento dietético, serem antioxidantes e contribuírem para a preservação dos

alimentos (Halliwell et al, 1995 b). Por exemplo, o licor de cacau (solução aquosa com

polifenois na sua constituição) mostrou ter propriedades antioxidantes pois foi

demonstrado que protege as mucosas gástricas de ratinhos de lesões induzidas pelo

etanol (Osakabe et al, 1998), assim como o hidroxitirosol e a oleuropeina (compostos

polifenólicos do azeite) que mostraram uma actividade antioxidante contra o superóxido e

o ácido hipocloroso (Visioli et al, 1998).

Inicialmente os diversos galhatos foram utilizados para prevenir a rancidez de óleos e

gorduras. Posteriormente, a sua utilização foi alargada para outros fins: o galhato de

propilo, galhato de octilo e o galhato de dodecilo são ácidos fenólicos usados como

antioxidantes na indústria cosmética, nomeadamente em perfumes e cosméticos, mas

também na indústria farmacêutica e alimentar (Wade & Weller, 1994). Actualmente, estes

compostos são permitidos na indústria alimentar em determinados alimentos tais como

produtos cárneos desidratados, frutos secos transformados, temperos e condimentos,

misturas para bolos, cereais pré-cozidos, aperitivos à base de cereais, leite em pó para

máquinas de distribuição automática, sopas e caldos desidratados, molhos, batatas

granuladas desidratadas, gomas de mascar e suplementos dietéticos (Decreto-Lei n.º

363/98). Como os galhatos na presença de Fe3+ e Cu2+ apresentam uma actividade pró-

oxidante, é recomendado o seu uso juntamente com citrato (quelante) (Shahidi & Naczk,

1995). Outro aspecto a ter em consideração na utilização destes ácidos fenólicos é a

existência de efeitos sinergéticos com outros antioxidantes descritos na literatura

nomeadamente com compostos como o butil-hidroxianisol e o butil-hidroxitolueno (Hirose

et al, 1998).

1.1.2 Antioxidantes na dieta

Para além do Zinco, Cobre e Selénio (sais minerais), as vitaminas e também os

compostos fenólicos (presentes em quantidades consideráveis nos frutos e vegetais), são

compostos que fazem parte da dieta habitual dos humanos e que têm actividade

antioxidante (Fig. 2).

Os antioxidantes da dieta podem proteger o organismo humano contra danos no

ADN celular, lípidos e proteínas, infligidos por radicais livres, por terem capacidade de

inibir oxido-reductases. O ião ferroso (Fe2+), habitualmente encontrado nos alimentos, é

conhecido como um pró-oxidante efectivo (Hsu et al, 2003). Os compostos fenólicos


7

podem quelatar iões metálicos pró-oxidantes (como Fe2+/Fe3+ e Cu2+), prevenindo a

formação de radicais livres a partir destes elementos (Kris-Etherton et al, 2002; Bhandari

& Kawabata, 2004). Os bioflavonóides, como a ginkgobilina e a rutina, são exemplos de

fitoquímicos que actuam no equilíbrio e controlo de ferro no organismo, e que impede a

formação de radicais hidroxilos.

Os compostos fenólicos presentes nos frutos e vegetais, e em particular no vinho e

chá, têm sido alvo de diversos estudos devido às suas propriedades antioxidantes

(Sánchez-Moreno et al, 2000; Caccetta et al, 2001; Pearson et al, 1999; Miller et al, 1996;

Cartron et al, 2001; Satué-Gracia et al, 1999; Goldberg et al, 1999; Kähkönen et al, 1999;

Friedman & Jürgens, 2000; Pulido et al, 2000; Chalas et al, 2001). O vinho tinto é uma

bebida que contém vários compostos fenólicos, entre os quais, ácido tánico, olenina e

ácidos fenólicos como o ácido gálhico e, são estes compostos que explicam as

propriedades antioxidantes que são atribuídas ao vinho (Larrauri et al, 1999; Gaulejac et

al, 1999; Burns et al, 2000; Pellegrini et al, 2000).

Figura 2 – Classificação dos antioxidantes. (adaptado de Ratnam et al, 2006)


8

No chá também existem compostos fenólicos como o ácido gálhico, facto que explica

a actividade antioxidante que lhe é atribuída (Lin et al, 2000; Degenhardt et al, 2000).

Prevenir a formação de radicais livres a partir de iões metálicos, constitui uma

estratégia para evitar a actividade pró-oxidante destes iões. Uma outra forma de

prevenção consiste no consumo de compostos fenólicos, na dieta habitual do ser

humano, pois estes compostos são capazes de quelatar estes iões impedindo a formação

de radicais livres.

1.2 Actividade antioxidante – Xantina Oxidase

O stress oxidativo tem sido relacionado com um conjunto de processos

fisiológicos e fisiopatológicos, na medida em que os ERO podem iniciar um grande

número de reacções de oxidação, algumas das quais tóxicas, no organismo (Cuzzocrea

et al, 2001). De facto, os ERO libertados por células inflamatórias (tais como células do

sistema mononuclear fagocitário, como por exemplo os macrófagos) constituem

elementos de ligação entre a inflamação e o cancro. Actualmente considera-se como um

factor determinante do surgimento de muitos efeitos genotóxicos uma formação

excessiva e persistente de ERO por células inflamatórias.

Em 1981 Granger e seus colaboradores sugeriram que em situações de

isquemia-reperfusão, a produção de superóxido e de peróxido de hidrogénio seria devida

à conversão de xantina desidrogenase em xantina oxidase, hipótese que mais tarde foi

confirmada (Rasmussen et al, 2000; Saksela et al, 1999). A xantina oxidase é uma

enzima secretada, formada no fígado, sob a forma de xantina desidrogenase estando

presente em quantidades apreciáveis no fígado de indivíduos saudáveis. Quando o

fígado se torna isquémico ou ocorrem danos hepatocelulares os níveis de mRNA da

xantina desidrogenase e da xantina oxidase ficam sobre-regulados (Saksela et al, 1998)

verificando-se a libertação de xantina oxidase para a corrente sanguínea que,

consequentemente, pode ser transportada para todo o organismo (Sanhueza et al, 1992).

A xantina oxidase serve como uma fonte de radicais livres derivados do oxigénio

que induzem quer danos celulares quer edema, assim como alterações na

permeabilidade vascular uma vez que esta enzima se pode ligar às células endoteliais,

presentes na túnica íntima dos vasos sanguíneos, iniciando a produção de radicais

(Houston el at, 1999). A xantina oxidase é reconhecida pelo seu papel como enzima

reguladora dos ácidos nucleicos, através da qual todas as purinas são canalizadas para o


9

terminal de oxidação. O ATP, bem como as demais purinas, podem sofrer um processo

de degradação sequencial que culmina na formação de hipoxantina, e depois na

conversão desta em xantina (Fig. 3).

Figura 3 – Diagrama esquemático da via de degradação das purinas

(adaptado de Pacher et al, 2006)

A xantina, por acção irreversível da xantina oxidase, transforma-se em ácido úrico

e este em urato de sódio. A velocidade bem como a quantidade de ácido úrico formado a

partir das purinas tem como factor limitante a quantidade de xantina oxidase; quanto

maior for a quantidade desta enzima maior a formação de ácido úrico. Por outro lado, a

xantina oxidase nesta conversão reduz o oxigénio molecular formando-se O2.- e, se estes

radicais não forem neutralizados pelos mecanismos de defesa no organismo, o ião

superóxido na presença do Fe2+ pode conduzir à produção de espécies muito reactivas

como o H2O2 e/ou a radicais hidroxilo e peroxilo, HO2º. Estas espécies reactivas podem


10

perturbar a fisiologia normal das células e conduzir, eventualmente, à morte celular e

falência de vários órgãos (Anup & Balasubramanian, 2000; Papathanassoglou et al,

2000).

A actividade da xantina oxidase aumenta o nível oxidativo do organismo. A

hidroxilação tem lugar no centro de molibdopterina (Mo-pt) através da formação de uma

ligação de hidrogénio entre um oxigénio Mo-OH e um átomo de carbono do substrato, de

tal forma que o átomo de oxigénio deriva de uma molécula de água e não do oxigénio

molecular (Okamoto et al, 2004). A forma activa da xantina oxidase é um homodimero

com um peso molecular de 290 kDa, com cada um dos monómeros a actuar

independentemente durante a catálise. Cada subunidade contém um cofactor

molibdopterina (Fig. 4), dois centros distintos [2Fe-2S] e um cofactor FAD (Olson et al,

1974). Vários resíduos de aminoácidos, como Arg 880, Fen 914, Fen 1009, Thr 1010 e

Glu 1261, são importantes para a formação de ligações de hidrogénio e interacções

electrostáticas.

Figura 4 – Ilustração representativa da estrutura da XO, destacando o centro de molibdopterina.

(adaptado de Bayse, 2009)

Vários estudos têm sido feitos de forma a avaliar os níveis de xantina oxidase em

tecidos neoplásicos tendo-se verificado uma tendência para existirem níveis de xantina

oxidase mais elevados nestes tecidos do que nos tecidos histologicamente normais

(Kökoglu et al, 1990; Kaynar et al, 2005). Como consequência, nos tecidos neoplásicos,

são formados mais EROs derivados da actividade da xantina oxidase sendo, por

consequência, maiores os danos resultantes da sua acção (activação de factores de

indução de hipoxia directamente ou por indução de cascatas de sinalização específicas:

Corinne et al, 2006).


11

1.3 Actividade anti-inflamatória e anti-neoplásica – COX-1/ COX-2

O processo inflamatório constitui uma tentativa do organismo em repor a

homeostasia removendo o estímulo lesivo e iniciando o processo que conduz à

recuperação tecidual. A inflamação local, quer causada por lesão tecidual quer por

infecções ou outro estímulo conduz a uma série de alterações nos níveis plasmáticos das

designadas proteínas de fase aguda, que incluem proteínas envolvidas no complemento

e na coagulação, seus inibidores, etc. Estas alterações constituem sinais clínicos que

permitem a identificação clínica de um processo inflamatório, mesmo que este seja

silencioso (sem manifestação evidente de sintomatologia). A causa subjacente ao

aparecimento destes sinais está directamente relacionada com a resposta inflamatória,

isto é, com a activação de diversos mediadores da inflamação.

De entre os diversos mediadores da inflamação envolvidos na resposta

inflamatória estão os eicosanóides. Os eicosanóides são compostos derivados do ácido

araquidónico. O ácido araquidónico é formado por acção da fosfolipase A sobre os

fosfolípidos da membrana plasmática, podendo, por este motivo, encontrar-se em

diversos tipos de células. O ácido araquidónico, por sua vez, pode ser convertido em

prostaglandinas e tromboxanos por acção da ciclooxigenase (COX) (Fig. 5), ou em

leucotrienos por acção da lipoxigenase.

Figura 5 – Ilustração da formação do ácido araquidónico e sua conversão prostaglandinas e tromboxanos

(adaptado de flipper.diff.org)


12

A COX é, por vezes, mencionada como “prostaglandina sintase” ou

“prostaglandina sintetase”. A COX converte o ácido araquidónico a prostaglandina H2

(PGH2), o percursor dos prostanoides de série 2 (Fig. 6). A enzima contém dois locais

activos: um heme com actividade de peroxidase, responsável pela redução de

hidroperoxi endoperoxido prostaglandina G2 (PGG2) a PGH2, e um local de

ciclooxigenase, onde o ácido araquidónico (ARA) é convertido a PGG2. A reacção

começa com a extracção do hidrogénio do ácido araquidónico por um radical tirosina

gerado pelo local activo da peroxidase. De seguida, duas moléculas de oxigénio reagem

com o radical do ácido araquidónico, formando a PGG2.

Figura 6 – Ilustração da conversão do ácido araquidónico em PGG2 e PGH2, pelas COXs

(adaptado de flipper.diff.org).

As COXs (COX-1 e COX-2) também oxigenam dois outros ácidos gordos

essenciais – ácido di-homo--linoleico (DGLA, ω-6) e ácido eicosapentaenóico (EPA, ω-3)

– para dar origem à série 1 e 3 dos prostanoides, que são menos inflamatórios do que os

da série-2 (Das, 2005). Estes ácidos gordos, DGLA e EPA, são inibidores da COX,

competitivos com o ácido araquidónico (ARA). Esta inibição constitui o mecanismo

habitual de actuação de fontes dietéticas de DGLA e EPA (p.e. óleo de peixe) na redução

da inflamação (Guivernau et al, 1994).

A estrutura das ciclooxigenases consiste em três domínios distintos: um domínio

amino terminal semelhante ao factor de crescimento epidérmico (EGF), seguido por

domínio de ligação da membrana e domínio catalítico carboxílico terminal, que contém os

locais activos de actividade ciclooxigenase e peroxidase. A análise estrutural da COX


13

revela diferenças na região peptídica sinalizante amino-terminal e na cadeia peptídica

carboxílica terminal, mas de importância desconhecida. O local activo com actividade de

ciclooxigenase está localizado num longo canal hidrofóbico formado no centro de α-

hélices associadas à membrana, permitindo que o ácido araquidónico tenha acesso

directamente ao local activo sem deixar a membrana. A função de peroxidase está

localizada do outro lado da enzima, sendo semelhante em ambas as isoformas

enzimáticas (Fig. 7).

Figura 7 – Representação das diferenças estruturais do local activo da COX-1 e COX-2 que

conferem a sua especificidade (adaptado de Moore & Simmnons, 2000).

Actualmente são conhecidas três isoenzimas da COX (COX-1, COX-2 e COX-3).

A COX-3 é uma variante da COX-1 e alguns autores preferem chamá-la COX-1b

(Chandrasekharan et al, 2002). A COX-1 contém uma sequência de 17 aminoácidos na

cadeia peptídica amino-terminal, que não está presente na COX-2, enquanto a COX-2

tem uma inserção adicional de 18 aminoácidos no terminal carboxílico. A sequência

remanescente do núcleo da COX-1 e da COX-2 é idêntica e todos os resíduos

identificados como essenciais para a actividade catalítica são conservados (Needleman

1994; Jouzeau et al, 1997; Cryer & Dubois, 1998).

Diferentes tecidos expressam níveis variáveis de COX-1 e COX-2. A COX-1 é

considerada uma enzima constitutiva, sendo encontrada na maioria das células dos

mamíferos e, que garante a produção normal de PGs tendo, por esse motivo, um papel


14

definido na protecção gástrica e na homeostasia do organismo. A COX-2, por outro lado,

é indetectável na maioria dos tecidos normais. É uma enzima indutível por estímulos pró-

inflamatórios (em locais de inflamação), tornando-se abundante em macrófagos activados

e noutras células (Fig. 8).

Apesar de ambas as enzimas actuarem basicamente da mesma forma, a inibição

selectiva de cada uma pode fazer a diferença em termos de efeitos adversos.

Figura 8 – Representação esquemática das vias metabólicas desencadeadas pela COX-1 e COX-2

por estímulos fisiológicos e estímulos inflamatórios (adaptado de Balasubramaniam).

Embora notáveis diferenças tenham sido observadas na estrutura e regulação dos

genes da COX no ADN e ARN, a estrutura da proteína e a função enzimática são

similares. As isoformas COX-1 e COX-2 são semelhantes no peso molecular (70 e 72

kDa, respectivamente), têm 65% de homologia genética nas regiões codificantes e os

seus genes estão localizados nos cromossomas 9 e 1, respectivamente. A sequência de

aminoácidos e locais catalíticos são quase idênticos. A diferença mais significativa entre

estas isoenzimas é a substituição da isoleucina na posição 523 na COX-1 pela valina na

COX-2, aspecto que parece permitir a inibição selectiva de cada uma delas. Por

conseguinte, o resíduo de valina na COX-2, relativamente mais pequeno que o de

isoleucina na COX-1, permite o acesso a um local hidrofóbico da enzima (Fig. 9). Desta


15

forma, moléculas consideradas como inibidores selectivos da COX-2, estabelecem

ligações a este local alternativo (Nature, 1996 Macmillan Magazines Ltd.).

Figura 9 – Resíduos de isoleucina e valina na COX-1 e COX-2, respectivamente.

(Nature ©1996 Macmillan Magazines Ltd).

O desenvolvimento de inibidores selectivos da COX-2 efectuou-se com a

perspectiva de se excluírem os efeitos adversos gastrointestinais habitualmente

associados aos anti-inflamatórios não-esteróides tradicionais (fármacos cujo mecanismo

de acção envolve a inibição não selectiva das COXs e logo a biossíntese das

prostaglandinas que são importantes mediadores lipídicos da inflamação como já

anteriormente descrito). Porém estudos recentes mostraram que os inibidores selectivos

da COX-2, até hoje disponíveis na clínica, mostraram estar associados a um aumento de

fenómenos tromboembólicos em populações de doentes com doença cardiovascular

(Dundar et al, 2009).

A inibição farmacológica da COX, além de impedir a progressão da inflamação,

pode ainda ter uma acção quimioprotectora podendo ser útil na quimioterapia do cancro e

de doenças neurológicas degenerativas (Shiff & Rigas, 1997; van Gool et al, 2003; Aisen

et al, 2003). O mecanismo subjacente a esta acção quimiopreventiva pensa-se que está

relacionado com a componente peroxidase da COX, que está suprimida por inibição das

prostaglandinas (as quais por sua vez podem agir como co-carcinogénios e promotores

tumorais). Outro mecanismo parece estar relacionado com o facto de, se ter demonstrado

que a COX-1 está sobre-regulada em vários carcinomas e, por conseguinte, assumir um

papel central na carcinogénese.

Estes dados recentes renovam o interesse na investigação referente ao

desenvolvimento de compostos com capacidade de inibir selectivamente a COX-2.


16

Alguns compostos fenólicos foram descritos como apresentando actividade anti-

inflamatória (Fresco et al, 2006) pela sua capacidade em inibir a COX-2, mas também

anticancerígena (Marques et al, 2006). Tendo em consideração o anteriormente exposto,

o uso de anti-inflamatórios (como por exemplo substâncias inibidoras da COX) parecem

constituir uma forma eficaz de combater o cancro.

Estima-se que a exposição aos carcinogénios e a inflamação crónica sejam

condições importantes subjacentes ao desenvolvimento de um cancro, sendo que esta

última é tida como responsável por cerca de 20 por cento dos cancros humanos. Existem

ainda dados da literatura que suportam a existência de uma relação entre a inflamação

crónica e o aparecimento do cancro. Em ratinhos geneticamente modificados que

desenvolveram espontaneamente hepatite e cancro do fígado, verificou-se que à medida

que os sintomas se agravavam, a inflamação desencadeava a activação do factor nuclear

κβ (NF−κβ) e que este, ao ser “desactivado”, evitava o aparecimento do cancro (Surh,

2003). Por outro lado, sabe-se que o NF−κβ é um factor de transcrição nuclear que

regula a expressão de genes que estão relacionados com a inflamação e a

carcinogénese.

O NF−κβ normalmente encontra-se inactivo no citoplasma ligado ao κβ (I-κβ). A

fosforilação deste elemento I-κβ por I-κβ cinases (IKK) conduz à clivagem deste

elemento, libertando o NF−κβ que poderá, subsequentemente, ser translocado para o

núcleo celular e ir activar a expressão de vários genes tais como c-myc, iNOS, bem como

outros genes proliferativos (Kong et al, 2001). Existe ainda uma grande quantidade de

informação na literatura que dá relevância aos compostos fenólicos como agentes

inibidores do crescimento de células neoplásicas, por serem compostos capazes de

interferir com a via de sinalização anteriormente descrita (ex: resveratrol, carnosol,

EGCG) tendo como tal uma actividade quimioprotectora (Fresco et al, 2006). Contudo a

relação entre a actividade anticancerígena e a estrutura química dos compostos fenólicos

está longe de ser esclarecida.

Pelo anteriormente exposto, é compreensível que a avaliação da actividade

antioxidante/antiproliferativa dos derivados fenólicos quer de origem natural quer sintética

seja actualmente, uma área de investigação atractiva estando direccionada ao

desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas anticancerígenas/anti-inflamatórias.

De facto, numerosos estudos têm sido desenvolvidos com o objectivo de encontrar novos

“compostos líder”, favoráveis à obtenção de agentes quimiopreventivos e/ou

quimioterapêuticos do cancro.


17

1.4 Ácidos fenólicos

Os ácidos fenólicos são substâncias abundantes no reino vegetal, possuindo um

ou mais anéis aromáticos com pelo menos um grupo hidroxilo e que estão divididos em

dois grupos, os ácidos benzóicos que possuem sete átomos de carbono (C6-C1) e os

ácidos cinâmicos (Fig. 10), com nove átomos de carbono (C6-C3) que existem

predominantemente na forma hidroxilada (Fresco et al, 2006).

a) b)

Figura 10 – Estrutura química dos a) ácidos benzóicos e b) ácidos cinâmicos (adaptado de Soares, 2002)

Os ácidos fenólicos naturais quer na forma livre quer na forma conjugada a

açúcares ou proteínas (Croft, 1998), normalmente aparecem como ésteres ou amidas

(Fiuza et al, 2004; Gomes et al, 2003). Em geral podem reagir com radicais livres, devido

à facilidade com que o átomo de hidrogénio do grupo hidroxilo pode ser capturado por um

radical livre, resultando numa estrutura de ressonância que suporta a presença de um

electrão desemparelhado. A literatura descreve que compostos fenólicos dihidroxilados

apresentam actividade antioxidante crescente na seguinte ordem: meta < orto < para

(Dziedzzik & Hudson, 1984).

Análises conformacionais deste tipo de compostos revelaram a predominância de

uma geometria planar ou quasi-planar devido ao efeito estabilizador da deslocalização de

electrões-π entre o anel aromático coplanar e a ligação dupla C=C da cadeia de carbono

(Fiuza et al, 2004). Por outro lado, a mesma orientação dos grupos hidroxilo do anel,

minimiza os efeitos repulsivos entre estes grupos, resultando numa estrutura mais estável


18

(Sousa et al, 2006). O conhecimento das preferências conformacionais é de extrema

importância para o entendimento das propriedades biológicas deste tipo de sistemas.

Na Tabela 2 podemos observar a fonte dietética para diversos ácidos fenólicos e

análogos, bem como referência a modelos experimentais que permitiram, até à data,

avaliar alguns dos possíveis efeitos biológicos destes compostos.

Tabela 2 – Ácidos fenólicos e Análogos, efeitos biológicos em diversos modelos experimentais Composto Fenólico

Estrutura Geral Mecani smos quimiopreventivos

Modelo experimental

Fonte dietética

Ácidos hidroxibenzóicos e seus derivados Ácido Gálhico e seus ésteres alquílicos

ÁCIDOS BENZÓICOS

Efeitos antioxidantes Indução de apoptose Interferência no ciclo celular Supressão das vias mediadas pelo GFR Supressão da activação do NF-kβ

Células de cancro humanas: pulmão, estômago, cólon, mama, leucemia, cólo uterino, neoplasma linfóide, epitelial Ratos CD-1

Plantas Vegetais Bebidas Aditivos

Ácidos hidroxicinâmicos e seus derivados Ácido cafeico e derivados (ésteres, nomeadamente fenetil éster do ácido cafeico-CAPE e amidas) Ácido ferúlico Ácido sináptico

ÁCIDOS CINÂMICOS

Efeitos antioxidantes Indução de apoptose Interferência no ciclo celular Efeitos anti-inflamatórios Supressão da activação do NF-kβ Supressão da angiogénse

Células de cancro humanas: leucemia, cólo uterino, células de cancro oral

Plantas Frutos Vegetais Azeite Arroz Aveia Sementes de mostarda Bebidas (café, vinho, chá) Café torrado Propolis (resina do mel de abelha) Cacau

Curcumina e derivados Yakuchinona A Yakuchinona B

ANÁLOGOS

Efeitos antioxidantes Indução de apoptose Interferência no ciclo celular Efeitos anti-inflamatórios Supressão da activação do NF-kβ Supressão de proteínas cinases (inibidor de cinases de serina/treonina, cinases de tirosina) Supressão de angiogénse Supressão das vias mediadas pelo EFR

Células de cancro humanas: cancro de pele, leucemia

Turmerico (rizoma de cúrcuma longa) Curry (Caril)


19

Capsaicina, dihidrocapsaicina e derivados

Efeitos antioxidantes Indução de apoptose

Células de cancro humanas: leucemia

Pimenta

Ácido rosmarinico e derivados

Efeitos antioxidantes Efeitos anti-inflamatórios

Cancro de pele

Plantas Anthocerotophyta

[6]-Gingerol [6]-Paradol e derivados R1=OCH3; R2=OH [6]-Gingerol R1=OCH3; R2=H [6]-Paradol

Efeitos antioxidantes Efeitos anti-inflamatórios Indução de apoptose

Células de cancro humanas: cancro de pele, leucemia, carcinoma oral

Zingiberaceae Raiz de ginger Grãos do paraíso

Tirosol R1=H Hidroxitirosol R1=OH

Efeitos antioxidantes Indução de apoptose

Células de cancro humanas: pulmão, cólon, mama, cancro ovárico

Azeite Óleos comestíveis Vinho

(adaptado de Fresco et al, 2006)

1.4.1 Ácidos hidroxicinâmicos

O maior grupo dos ácidos fenólicos são os ácidos hidroxicinâmicos que são

encontrados em quase todas as plantas. Actualmente, as funções biológicas de ácidos

hidroxicinâmicos foram determinadas como sendo intrinsecamente dependentes do

número e orientação relativa dos substituintes hidroxilo do anel, assim como da presença

de cadeias laterais alquil-éster e da sua natureza química e orientação espacial (Sousa et

al, 2006).


20

Os ácidos hidroxicinâmicos são, normalmente, esterificados a açúcares, ácidos

orgânicos e lípidos sendo o ácido cafeico o maior representante destes ácidos. Na Fig. 11

estão representados os ácidos hidroxicinâmicos e seus derivados mais relevantes.

Figura 11 – Os ácidos p-cumárico, ferúlico, caféico e sináptico são os hidroxicinâmicos mais comuns na

natureza. Estes ácidos existem nas plantas, usualmente na forma de ésteres, a exemplo do ácido clorogénico, éster do ácido quínico, cuja molécula é constituída pelo ácido quínico esterificado ao ácido caféico.

1.5 Biossíntese dos ácidos fenólicos na natureza

Entre os milhares de compostos secundários existentes nas plantas, encontram-

se os ácidos fenólicos, em especial os derivados dos ácidos cinâmico e benzóico, que se

sabe interferirem em muitos processos vitais das plantas apesar do seu mecanismo de

acção ainda ser pouco conhecido. Nas plantas, as funções alteradas por estes

compostos, com maior frequência, são a utilização de água e assimilação de nutrientes, o

crescimento das raízes e expansão de folhas. Para além destes efeitos descritos nas

plantas ou vegetais, os ácidos fenólicos podem ainda interferir com outros processos

biológicos tais como síntese de proteínas, respiração celular, permeabilidade da

membrana celular e com a actividade de algumas enzimas.


21

Figura 12- Esquema representativo da via metabólica que conduz à sintese natural de compostos fenólicos

(adaptado de Taiz & Zeiger, 2004)

Apenas alguns grupos de vegetais são capazes de desenvolver etapas

bioquímicas que, através da desaminação da fenilalanina e da tirosina, possibilitam a

síntese de compostos em C6-C3, os fenilpropanos e os seus polímeros, os polifenóis. Os

ácidos cinâmico e o p-cumárico, obtidos respectivamente da fenilalanina e da tirosina,

constituem o ponto de partida de duas importantes vias de síntese nos vegetais: a dos

polifenóis e a das lenhinas (ver Figs. 12 e 13).

Figura 13 – Etapas que culminam com a formação do ácido cafeico ácido hidroxicinâmico a partir do ácido

xiquimico.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Objectivos

22

2. OBJECTIVOS

Estudos com o ácido cafeico (um ácido hidroxicinâmico natural amplamente

investigado) e respectivos ésteres revelaram existir um papel protector deste tipo de

ácidos fenólicos relativamente a uma grande diversidade de patologias: as suas

propriedades estruturais conferem-lhes capacidade antiradicalar e antioxidante (Lee et al,

2008), antiviral (Fruehauf & Meyskens, 2007), anti-inflamatória (Orban et al, 2000),

antitumoral (Nagaoka et al, 2003), neuroprotectora (Ilhan et al, 2004), and

antiaterosclerótica (Hishikawa et al, 2005).

Figura 14 – Representação dos derivados hidroxicinâmicos estudados, o ácido trans-3-(3,4,5-

trihidroxifenil)-2-propenóico (THPPE) e seus ésteres trans-etil-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenoato (ETHPPE) e dietil-2-(3,4,5-trihidroxifenilmetileno) malonato (E2THPPE).

Tendo em conta o potencial terapêutico desta família de compostos, foram-se

desenvolvendo e sintetizando novos derivados de ácidos hidroxicinâmicos, com diversas

alterações conformacionais, com a expectativa de optimizar as suas propriedades

benéficas para a prevenção e tratamento de várias patologias humanas. Na sequência

deste esforço foram sintetizados, pelo grupo da Professora Doutora Fernanda Borges, no

Departamento de Química Orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do

Porto, três novos derivados do ácido cafeico.

Neste estudo, foi analisado o potencial efeito antioxidante e anti-inflamatório dos

compostos, ácido trans-3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenóico (THPPE) e dos respectivos

ésteres, trans-etil-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenoato (ETHPPE) e dietil-2-(3,4,5-

ETHPPE

E2THPPE

THPPE

C O H

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Objectivos

23

trihidroxifenilmetileno) malonato (E2THPPE) (Fig. 14) avaliando a capacidade que estes

compostos exibem em interferir com a actividade de enzimas como a xantina oxidase e a

ciclooxigenase, enzimas reguladoras chave na formação de radicais livres e moléculas

inflamatórias que, por sua vez, são elementos despoletadores do processo

inflamatório/cancro. Para tal, foi determinado o efeito inibitório que os compostos THPPE,

ETHPPE e E2THPPE têm sobre a actividade enzimática das enzimas xantina oxidase e

ciclooxigenase 1 (COX-1) e ciclooxigenase 2 (COX-2).

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Materiais e Métodos

24

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Reagentes e compostos testados

Os compostos fenólicos (não comerciais) estudados neste trabalho foram

sintetizados pelo grupo da Professora Doutora Fernanda Borges, no Departamento de

Química Orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. A sua

identificação foi levada a cabo por espectroscopia de infravermelho (FTIR), ultravioleta

(UV) e ressonância magnética nuclear (RMN); espectrometria de massa, cromatografia

em camada fina e análise elementar.

Neste estudo, foi analisado o potencial efeito inibidor dos derivados

hidroxicinâmicos do ácido cafeico, o ácido trans-3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenóico

(THPPE) e respectivos ésteres, trans-etil-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenoato (ETHPPE) e

dietil-2-(3,4,5-trihidroxifenilmetileno) malonato (E2THPPE) (Silva et al, 2000) nas enzimas,

xantina oxidase (XO) e ciclooxigenase (COX).

O THPPE e o ETHPPE foram sintetizados como descrito em (Fiuza et al, 2004) e

identificados por ressonância magnética nuclear (RMN) e Ei-MS. O E2THPPE foi

sintetizado de acordo com o processo descrito por Hubner et al (1952) com ligeiras

modificações.

O Alopurinol e a Indometacina (compostos de referência) foram adquiridos à

Sigma-Aldrich Chemical Co. (Sintra).

3.2 Preparação das soluções

Para os ensaios de inibição, foram preparadas soluções stock de THPPE,

ETHPPE e E2THPPE na concentração de 7,68 mM usando como solvente

dimetilsulfóxido (DMSO). Todas as soluções foram armazenadas ao abrigo da luz, a -

18ºC.

As soluções dos compostos THPPE, ETHPPE e E2THPPE utilizadas nos vários

ensaios foram preparadas diáriamente em intervalos de concentração de 8 µM a 512 µM

utilizando como solvente a solução tampão indicada no respectivo Kit.


25

3.3 Ensaios de inibição

3.3.1 Medição da Actividade da Xantina Oxidase

A actividade da xantina oxidase foi determinada com o kit “Amplex® Red

Xanthine/Xanthine Oxidase Assay Kit” da Molecular Probes (Eugene, OR) que fornece

um método ultrasensível para monitorizar a actividade da xantina oxidase. No ensaio, a

xantina oxidase catalisa a oxidação das bases de purina (xantina ou hipoxantina) a ácido

úrico e superóxido (2). Na mistura de reacção, o superóxido degrada-se

espontaneamente a peróxido de hidrogénio (H2O2) que, na presença de peroxidase de

rábano picante (HPR), reage com o Reagente Amplex Red, dando origem a um produto

de oxidação vermelho fluorescente, resorufina (Mohanty et al, 1997)

Xantina/ Xantina Oxidase:

1) hipoxantina ou xantina + O 2 → ácido urico + superóxido (catalisada pela

xantina oxidase)

2) superóxido → H2O2 (degrada-se espontaneamente)

3) H2O2 + Amplex® Red → resorufina (na presença de HRP)

(2)

Este produto tem uma absorção máxima a aproximadamente 560nm (e uma

emissão de fluorescência máxima a aproximadamente 585nm) e como o coeficiente de

extinção molar é elevado (54000 cm−1 M−1), o ensaio pode ser desenvolvido quer

fluorimetricamente quer espectrofotometricamente.

Os inibidores em estudo foram adicionados à solução de trabalho contendo 50 µM

de Xantina, Reagente Amplex Red (0,0101 M), HRP (20 U), Xantina Oxidase (1 U) e

Tampão de Reacção (0,125 M). As reacções foram incubadas a 37ºC durante 30 min. As

leituras foram feitas num espectrofotómetro “PowerWaveXS (Bio-Tek Instruments Inc,

Vermont, EUA)”, em triplicado e em placas de 96 poços. A actividade inibitória da xantina

oxidase foi expressa como percentagem de inibição da xantina oxidase, a qual foi

calculada de acordo com a fórmula (3):


26

% inibição XO= 100 − ( A/B ×100) (3)

Em que (A) e (B) são as absorvâncias com e sem inibidor, respectivamente e XO significa xantina oxidase.

É ainda de acrescentar que foi feita uma curva padrão para cada ensaio de

inibição com a xantina oxidase.

3.3.2 Medição da Actividade da Ciclooxigenase

A actividade das ciclooxigenases, COX-1 e COX-2, foi determinada com o kit

“COX Inhibitor Screening Assay” da Cayman Chemical, de acordo com protocolo do

fabricante.

Resumidamente, o heme e as enzimas (COX-1 e COX-2) foram adicionados a

tubos de ensaio contendo tampão de reacção da COX (0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0,

contendo 5 mM de EDTA e 2 mM de fenol). A mistura foi agitada no vortex e incubada

com tampão de reacção e soro a 37ºC durante 10 min. A solução de ácido araquidónico

foi adicionada para desencadear a reacção da COX. Após uma incubação a 37ºC durante

2 min., foi adicionado ácido hidroclórico (1M) para parar a reacção catalítica da enzima

(4).

heme + COX-1/COX-2 + tampão de reacção + soro + áci do araquidónico + HCl (4)

De seguida, ocorre redução da prostaglandina (PG) PGH2 a PGF2α pela adição de

uma solução de cloreto de estanho saturado à temperatura ambiente durante 5 min (5).

COX COX SnCl ácido araquidónico → PGG2 → PGH2 → PGF2α (5)


27

Os prostanóides obtidos são quantificados através de um ensaio imunoenzimático

(EIE), usando um anticorpo altamente específico que se liga a todos os principais

compostos de prostaglandina (Fig. 15).

Figura 15 – Esquema respresentativo dos passos relativos ao ensaio imunoenzimático efectuado com o kit

utilizado (adaptado do catálogo No. 560131 - “COX Inhibitor Screening Assay” da Cayman Chemical).

Este ensaio é baseado na competição entre as PGs e um conjugado (PG-tracer)

da PG-acetilcolinesterase (AChE) por uma quantidade limitada de antisoro (de coelho).

Como a quantidade de “PG tracer” é constante, enquanto que a quantidade de PGs varia,

a quantidade de PG tracer que se consegue ligar ao antisoro PG será inversamente

proporcional à quantidade de PGs que se encontrar no poço. Este complexo antisoro PG

liga-se ao anticorpo monoclonal anti-coelho que foi previamente fixado ao poço. A placa

é, então, lavada para remoção de todos os reagentes livres e o reagente Elman´s (que

contém o substrato para a AChE) é adicionado a cada poço. O produto desta reacção

enzimática possui uma cor amarela característica e absorve fortemente a 412nm. A

intensidade desta cor, determinada espectrofotometricamente, é proporcional à

quantidade de “PG tracer” ligado a cada poço, que por sua vez é inversamente

proporcional à quantidade de PG´s livres presentes durante o tempo de incubação:

Absorvância ∞ [”PG tracer”] ligado ∞ 1/ [PG]


28

Assim, este ensaio da COX é mais preciso e fiável do que uma análise baseada

na inibição da peroxidase. O kit inclui a COX-1 ovina e a COX-2 recombinante humana

de modo a que seja possível detectar inibidores específicos das isoenzimas.

Da mesma forma que para a XO, também foi feita uma curva padrão para cada um dos

ensaios com a COX-1 e COX-2.

3.4 Ensaios de cinética enzimática com a Xantina Ox idase

Para os ensaios de actividade enzimática foi seleccionado o composto que

produziu uma maior inibição da xantina oxidase e determinado o tipo de cinética de

inibição, tendo sido calculado o respectivo Km e Vmáx. Para tal, utilizou-se o mesmo kit e

monitorizou-se a actividade enzimática com medição da absorção a 560nm a 37 ºC em

intervalos de 2 min., durante 32 min. (a reacção enzimática deve, em condições normais,

decorrer em 30 min.).

3.5 Cálculo e Tratamento Estatístico dos Resultados

Os resultados obtidos foram tratados usando o “Graph-Pad Prism 5”. Foram

determinados os valores de inibição obtidos, calculados como média ± desvio padrão

(DvP) de n experiências. Calculou-se ainda o valor de concentração capaz de inibir 50%

da actividade enzimática (IC50). Em cada experiência e para cada tratamento foram

efectuados duplicados (ensaios para avaliação da actividade da ciclooxigenase) ou

triplicados (ensaios para a avaliação da actividade da xantina oxidase).

Para a análise do significado estatístico entre os diversos grupos de tratamentos

utilizou-se ANOVA “one way” análise de variância seguido pelo teste t-Tukey´s (quando

aplicável). Consideraram-se como estatisticamente significativas as diferenças cujo valor

de p fosse inferior ou igual a 0,05.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Resultados

29

4. RESULTADOS

4.1 Ensaios de inibição com a Xantina Oxidase

A xantina oxidase, cuja actividade se sabe estar aumentada em situações de

stress oxidativo (Adkins and Taylor, 1990; Koyama et al., 1999; Manach et al., 1999),

produz ácido úrico e ião superóxido (tal como anteriomente descrito na secção 1.2 da

introdução). A inibição desta enzima é medida por uma diminuição na produção de ácido

úrico.

Neste trabalho foram avaliados os potenciais efeitos de derivados de ácidos

fenólicos, particularmente compostos derivados dos ácidos hidroxicinâmicos, THPPE e

respectivos ésteres, ETHPPE e E2THPPE, sobre a actividade enzimática da xantina

oxidase. Neste estudo utilizou-se o composto alopurinol como inibidor de referência pois

na literatura o alopurinol é referido como um fármaco que é substrato e inibidor específico

potente da xantina oxidase (Nguyen et al, 2006), sendo amplamente utilizado como

composto inibitório de referência.

Figura 16 – Gráfico representativo das curvas de inibição obtidas para os ensaios enzimáticos com a Xantina

Oxidase na presença dos vários derivados dos ácidos fenólicos estudados e do alopurinol.


30

Na Fig. 16 podemos observar curvas representativas referentes ao perfil de

inibição individual obtido para cada composto. A concentração capaz de inibir 50% da

actividade enzimática (IC50) respeitante a cada composto foi calculada (Tabela 3) de

forma a comparar a capacidade de inibição exibida.

Tabela 3 – Inibição da xantina oxidase por derivados de ácidos fenólicos: três derivados do subgrupo dos ácidos hidroxicinâmicos.

IC50 ± DvP (µM) n (3x)

Alopurinol 6,92 ± 1,43 7

THPPE 784,01 ± 145,01** ++ ## 2

ETHPPE 299,07 ± 108,85 ** ++ 3

E2THPPE 9,29 ± 2,63 5

Alopurinol não é um derivado dos ácidos fenólicos mas é habitualmente utilizado como inibidor de referência da xantina oxidase. n representa o número de experiências efectuadas para cada composto. Resultados são médias ± DvP da concentração capaz de inibir 50% da actividade enzimática (IC50). Diferenças significativas (ANOVA- “one way” análise de variância seguido pelo teste t-Tukey´s) do composto de referência, *p≤0,05 e **p≤0,001; do composto E2THPPE, ++p≤0,001; do composto ETHPPE, ##p≤0,001.

Os resultados obtidos mostram que a inibição da xantina oxidase aumenta

significativamente com a adição dos compostos, alopurinol e E2THPPE. De facto, o perfil

de inibição exibido pelo E2THPPE é muito semelhante ao do alopurinol: o perfil inibitório é

promissor e os valores de IC50 obtidos são semelhantes aos obtidos com o composto de

referência (alopurinol), 9,29 e 6,92, respectivamente. Já para os restantes compostos

estudados (THPPE e ETHPPE), os resultados obtidos revelaram a necessidade de

recorrer a concentrações mais elevadas de forma a ser possível atingir um efeito inibitório

semelhante ao exibido pelo E2THPPE/alopurinol.

Em suma, dos compostos em estudo (THPPE, ETHPPE e E2THPPE) o E2THPPE

foi o composto que mais contribuiu para inibição da xantina oxidase. De facto, a ordem de

eficiência na inibição da xantina oxidase encontrada foi a seguinte:

Alopurinol = E 2THPPE> ETHPPE> THPPE


31

4.1.1 Ensaios de Cinética Enzimática com a Xantina Oxidase do composto E 2THPPE

Efectuaram-se ensaios de cinética enzimática com a xantina oxidase para o

composto E2THPPE. Para o efeito utilizou-se uma concentração constante de E2THPPE

(100 µM) e várias concentrações crescentes de substrato (xantina: 12,5 µM - 100 µM). As

reacções foram efectuadas na presença e ausência de inibidor tendo sido obtidas as

curvas de Michaelis-Menten apresentadas na Fig. 17.

Michaelis-Menten

0 50 1000.000

0.005

0.010com E2THPPE

controlo

[E2THPPE] µµµµM

% In

ibiç

ão X

O

Figura 17 – Ensaios de cinética enzimática para o composto E2THPPE. Gráfico de

Michaelis Menten representativo do perfil cinético da reacção da xantina oxidase na presença e ausência de inibidor, o E2THPPE (100 µM).

Como esperado, a velocidade da reacção vai gradualmente aumentando à medida

que a concentração de substrato (xantina) aumenta. Verifica-se ainda que, a velocidade

da reacção observada é consideravelmente superior na ausência do inibidor.

Os resultados obtidos foram analisados pela representação gráfica Lineweaver-

Burk (Fig. 18), tendo sido determinados os valores de Km e Vmáx (Tabela 4) para ambas

as condições (presença e ausência de E2THPPE).


32

Figura 18 – Ensaios de cinética enzimática para o composto E2THPPE. Gráfico de

Lineweaver-Burk foi construído para a inibição da xantina oxidase pelo composto E2THPPE. O gráfico está expresso como 1/velocidade versus 1/concentração de xantina (µM-1) na presença e ausência de inibidor nas soluções.

Tabela 4 – Ensaios de cinética enzimática para o composto E2THPPE

Km (Média ± DvP)

Vmáx (Média ± DvP)

n

E2THPPE (a) 29,30 ± 4,18 0,00080 ± 0,00004 4

Controlo (b) 60,34 ± 7,29 0,01890 ± 0,00111 4

Os valores apresentados foram calculados para a inibição da xantina oxidase pelo composto E2THPPE: valores de Km, Vmáx, desvios padrão de n experiências. (a) 100 µM de E2THPPE; (b) 0 µM de E2THPPE

A análise do perfil de inibição obtido através da representação gráfica de

Lineweaver-Burk permite avaliar o tipo de inibição do composto em estudo e que pode

indicar uma das seguintes possibilidades: inibição reversível ou inibição irreversível

(Tabela 5). Na inibição reversível o tipo de inibição classifica-se segundo o efeito que

produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax. Este efeito dependerá da união do inibidor

à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. Porém os inibidores

enzimáticos podem ainda unir-se e inactivar uma enzima de forma irreversível,

Lineweaver-Burk

-0.05 0.05 0.10

2000

4000110742820 += xy

20,503336 += xy

1/ [E2THPPE]

1/ V

com E2THPPE

controlo


33

geralmente por meio de modificações covalentes de resíduos do local catalítico da

enzima.

Estas reacções decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis.

Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao

inibidor.

Tabela 5 – Tipos de inibição reversível e respectiv as variações do K m e Vmáx

Tipo de inibição Km

Vmáx

competitiva ↑ ↔

não competitiva ↔ ↓

incompetitiva ↓ ↓

mista ↑,↓ ou ↔ ↓

No estudo de cinética enzimática para o composto E2THPPE verificamos que o

valor de Vmáx obtido é menor na presença do inibidor do que na sua ausência e que o

valor de Km varia (diminui) indicando que o composto E2THPPE exerce uma inibição

reversível mista. Uma inibição incompetitiva por parte do E2THPPE foi excluída, apesar

de os valores de Vmáx e de Km diminuírem na presença do composto, pois na

representação gráfica de Lineweaver-Burk os perfis de inibição obtidos na ausência e

presença de inibidor são compatíveis com o que seria de esperar numa inibição mista

(ver Fig.18) e não com uma inibição incompetitiva (na qual os perfis obtidos com e sem

inibidor deveriam ser paralelos).

Em suma, dos compostos estudados, o E2THPPE revelou ser um potente inibidor

da xantina oxidase na forma mista (IC50 alopurinol= IC50 E2THPPE).


34

4.2 Ensaios de inibição com a Ciclooxigenase 1 e 2

A ciclooxigenase (COXs), que como anteriormente já foi descrito na secção 1.3 da

introdução, se apresenta sob a forma de três isoformas, COX-1, COX-2 e COX-3 ou

COX-1b, previne a biossintese das prostaglandinas (PGs), importantes mediadores do

processo inflamatório, pelo que a sua inibição diminui o processo inflamatório. Um dos

muitos anti-inflamatórios não esteroides habitualmente utiizados na clínica é a

indometacina, cujo mecanismo de acção envolve a inibição das COXs. Por este motivo, a

indometacina foi o composto de referência (Anti-Inflamatório Não Esteróide, AINE)

utilizado para estudar a actividade anti-inflamatória exibida pelos derivados dos ácidos

hidroxicinâmicos THPPE, ETHPPE e E2THPPE.

Foram desenvolvidos ensaios para avaliar a capacidade inibitória dos três

compostos sobre a COX-1 e COX-2. Nas Figs. 19 e 20 podemos observar curvas

representativas referentes ao perfil de inibição individual obtido para cada composto

sobre a actividade da COX-1 e COX-2, respectivamente.

O perfil de inibição obtido para a actividade da COX-1 revela uma diferença

considerável entre a concentração de indometacina necessária para inibir a COX-1

relativamente às concentrações exibidas, para o mesmo efeito, pelos três compostos em

estudo. Entre os compostos THPPE, ETHPPE e E2THPPE, o perfil de inibição da

actividade da COX-1 encontrado é muito semelhante, ficando aquém da inibição

conseguida com a indometacina (Fig. 19).

COX-1

-10 -8 -6 -4 -20

50

100 THPPEE2THPPE

ETHPPEIndometacina

log [Inibidor] µµµµM

% In

ibiç

ão C

OX

-1

A


35

COX-1

-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.00

50

100 THPPEE2THPPEETHPPE


% In

ibiç

ão C

OX

-1

Figura 19 – Gráficos representativos das curvas dose-resposta obtidas para os ensaios enzimáticos com a COX-1 na presença dos vários compostos fenólicos estudados e da indometacina (composto de referência). No painel A compara-se o perfil obtido para a indometacina com os dos restantes compostos derivados dos ácidos hidroxicinâmicos e no painel B apresentam-se apenas os perfis obtidos com os compostos em estudo.

Relativamente ao perfil de inibição obtido para a actividade da COX-2, verificou-se

que a concentração necessária de indometacina para atingir inibição total da COX-2 é

bastante mais baixa do que a concentração necessária dos compostos em estudo para

que estes consigam desencadear o mesmo efeito (Fig. 20). Verificou-se que, de entre os

compostos THPPE, ETHPPE e E2THPPE, os perfis de inibição sobre a COX-2 exibidos

pelo THPPE e pelo E2THPPE são semelhantes. O composto ETHPPE apresenta um

perfil de inibição em que para concentrações mais baixas se consegue atingir um efeito

inibitório mais acentuado, facto que não se verifica para concentrações mais elevadas.

B


36

COX-2

-10 -8 -6 -4 -20

50

100 THPPEE2THPPE

ETHPPE

Indometacina


% In

ibiç

ão C

OX

-2

COX-2

-5.0 -4.5 -4.0 -3.50

50

100 THPPEE2THPPEETHPPE


% In

ibiç

ão C

OX

-2

Figura 20 – Gráficos representativos das curvas dose-resposta obtidas para os ensaios enzimáticos com a COX-2 na presença de cada um dos vários compostos fenólicos estudados e da indometacina (composto de referência). No gráfico A compara-se o perfil obtido para a indometacina com os dos restantes compostos e no gráfico B os compostos em estudo entre si.

Para cada composto foi calculado o respectivo IC50 (Tabela 6) que permite avaliar

a potência de cada composto quanto à sua capacidade em inibir cada isoforma

individualmente, COX-1 e COX-2.

B

A


37

Tabela 6 – Inibição da COXs por derivados de ácidos fenólicos: três derivados do subgrupo dos ácidos hidroxicinâmicos.

Indometacina não é um derivado dos ácidos fenólicos mas é habitualmente utilizado como inibidor de referência da ciclooxigenase. n representa o nº de experiências efectuadas para cada composto. Resultados são médias ± DvP da concentração capaz de inibir 50% da actividade enzimática (IC50). Diferenças significativas (ANOVA- “one way” análise de variância seguido pelo teste t-Tukey´s) do composto de referência, * p≤ 0,05 e **p≤0,001; do composto E2THPPE, +p≤0,05 e ++p≤0,001; do composto ETHPPE, #p≤0,05.

Os resultados obtidos (Tabela 6) mostram que a actividade da COX-1 diminui

significativamente com a adição da indometacina e dos compostos em estudo, THPPE,

ETHPPE e E2THPPE. O composto mais potente na inibição da isoforma do tipo 1 foi o

composto de referência (indometacina). Dos derivados dos ácidos fenólicos em estudo, o

E2THPPE apresentou um perfil de inibição, semelhante ao obtido pelo THPPE, enquanto

o ETHPPE foi menos eficiente em inibir a COX-1.

Por conseguinte, estatisticamente, a ordem de eficiência na inibição da COX-1 é a

seguinte:

Indometacina> E 2THPPE= THPPE> ETHPPE

COX-1 COX-2 COX-2/

COX-1 Composto IC50 (µM) ± DvP n (3x) IC50 (µM) ± DvP n (3x)

Indometacina

0,034 ± 0,12

2

0,10± 0,15

2 2,94

THPPE

43,70± 2,01** #

10

41,05 ± 6,12** ++

8 0,94

ETHPPE

54,50± 8,96** +

8

32,13 ± 15,90* +

12 0,59

E2THPPE

35,22 ± 1,01**

2

11,76 ± 0,61*

2 0,33


38

A actividade da COX-2 fica significativamente diminuida na presença de indometacina e

dos compostos em estudo, THPPE, ETHPPE e E2THPPE. O composto que promove a

inibição da isoforma do tipo 2 com menores concentrações foi, à semelhança do que se

observou com os ensaios de inibição para a COX-1, a indometacina. Da mesma forma

que para a COX-2, dos derivados dos ácidos fenólicos em estudo, o E2THPPE foi o

composto que apresentou melhor perfil de inibição (IC50= 11,76), seguido pelo ETHPPE e

depois pelo THPPE (Tabela 6).

Em resumo, estatisticamente, a ordem de eficiência na inibição da COX-2 é:

Indometacina> E 2THPPE> ETHPPE = THPPE

A razão de IC50 COX-2/COX-1 permite uma comparação dos valores relativos dos

diversos compostos testados relativamente à selectividade exibida para as duas

isoformas: uma baixa razão de IC50 COX-2/COX-1 de um determinado composto indica

uma inibição preferencial da COX-2 (> 50 vezes COX-2 ou COX-2/COX-1 <0,02,

corresponde aos valores atribuídos para inibidores da COX-2 altamente selectivos. Neste

trabalho a razão de IC50 COX-2/COX-1 obtida para o THPPE e ETHPPE é de 0,94 e 0,54

respectivamente enquanto que para o E2THPPE foi menor, de 0,33. A razão de IC50

COX-2/COX-1 para o composto de referência foi de 2,94.

As razões encontradas são da mesma ordem de grandeza, pelo que os

compostos em estudo exibem actividade inibitória equiselectiva para ambas as isoformas.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Discussão

39

5. DISCUSSÃO

A xantina oxidase é reconhecida como uma enzima com um papel importante nas

doenças geradas por radicais. De facto, a conversão de hipoxantina a xantina e de

xantina a ácido úrico por acção catalisadora da xantina oxidase na via de degradação das

purinas (Rundles & Wyngaarden, 1969) serve como uma fonte de radicais livres

derivados do oxigénio, os quais podem iniciar um grande número de reacções de

oxidação, algumas das quais tóxicas no organismo. O alopurinol (1,5-dihidro-4H-

pirazol[3,4-d]pirimidina-4-ona) é um fármaco utilizado como inibidor da xantina oxidase

(Nguyen et al, 2006) que se comporta como substrato e inibidor específico potente da

xantina oxidase. Contudo, a xantina oxidase pode catalisar o alopurinol em oxipurinol

(1H-pirazol [3,4-d] -pirimidina-4,6-diol) que por sua vez permanece ligado firmemente ao

local activo enzimático. Consequentemente, ocorre uma elevação das concentrações de

hipoxantina, enquanto a concentração de ácido úrico diminui (Fig. 21). Assim, a inibição

da enzima xantina oxidase ocorre através de uma competição directa do substrato na

degradação das purinas (Tamta, 2006), por conseguinte, o alopurinol é habitualmente

considerado como um inibidor competitivo da xantina oxidase enquanto o seu metabolito

activo, o oxipurinol, se considera um inibidor não competitivo da xantina oxidase (Fields

et al, 1996; O´Driscoll et al, 1999).

Figura 21 – Esquema representativo das reacções levadas a cabo pela Xantina Oxidase: conversão da

hipoxantina em xantina e desta em ácido úrico e a conversão do alopurinol, em oxipurinol, resultando na sua inibição.


40

O alopurinol é habitualmente utilizado na terapêutica de hiperuricémia primária e

secundária (Rott & Agudelo, 2003; Terkeltaub, 2003; Bieber and Terkeltaub, 2004;

Schlesinger, 2004; Pea, 2005; Wortmann, 2005; Nguyen et al, 2006) tendo-se verificado

que este pode desencadear um conjunto de efeitos adversos sendo os mais frequentes

as erupções cutâneas (que podem ser bastante severas e por vezes fatais: ocorrendo em

2-8% dos pacientes); alterações gastrointestinais, diarreia e náuseas (Rott & Agudelo,

2003; Terkeltaub, 2003; Bieber & Terkeltaub, 2004; Schlesinger, 2004; Pea, 2005); e em

pacientes com reações adversas mais graves: febre, calafrios, artralgias, icterícia

colestática, eosinofilia e leucocitose leve ou leucopenia, reacções de hipersensibilidade

(que podem aparecer meses ou anos após a toma da medicação).

Com base na boa capacidade inibitória do alopurinol têm sido desenvolvidos

estudos com o objectivo de sintetizar novos inibidores da xantina oxidase, dos quais se

destacam derivados sintéticos de purinas e pirimidinas (Tamta et al., 2005), mas que

apresentem efeitos adversos menos relevantes. Contudo, a estrutura de compostos com

base purinica ou pirimidinica, acredita-se ser responsável por alguns dos efeitos adversos

(como as erupções cutâneas), pois estas podem resultar da conversão metabólica dos

fármacos nos nucleótidos correspondentes, através da acção da fosforribosil transferase.

Este facto potenciou a procura de novos inibidores da xantina oxidase que sejam

estruturalmente diferentes das purinas (Borges et al, 2002; Wangun et al, 2006).

Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os ácidos fenólicos,

nomeadamente o ácido trans-3-(3,4,5-trihidroxifenil)-2-propenóico (THPPE), um derivado

do ácido cafeico, e seus respectivos ésteres são capazes de inibir a actividade da enzima

xantina oxidase, confirmando dados da literatura que atribuem a outros ácidos fenólicos

propriedades antioxidantes e acção inibitória sobre a xantina oxidase (Chan et al, 1995;

Lee et al, 2008; Ozyurt et al, 2006; Wang et al, 2009).

O perfil de inibição obtido com os compostos em estudo confirma os dados da

literatura que apontam os acidos trihidroxicinâmicos como tendo uma elevada capacidade

inibitória sobre a xantina oxidase. De facto, têm sido descritas relações estrutura-

actividade (REAs) dos derivados do ácido cafeico (ver Fig.9 na introdução), tendo sido

sugerido que o número e orientação dos grupos OH parecem influenciar a capacidade

antioxidante: os ácidos trihidroxicinâmicos parecem ser agentes antioxidantes mais

potentes do que os ácidos dihidroxicinâmicos (Silva et al, 2001; Siquet et al, 2006). Por

outro lado, as interações dos derivados hidroxicinâmicos com a xantina oxidase têm sido

discutidas (Chan et al, 1995). Também o efeito protector de alguns propenóides C6-C3

contra as EROs e a sua influência na ligação ao local activo da xantina oxidase tem sido

debatido, tendo em conta os vários substituintes e respectivas posições nos

fenilpropanóides e seus derivados (Chang et al, 1997; Chang et al, 1994; Chang et al,


41

2007), os quais constituem um grupo importante de fenólicos de baixo peso molecular

(Bravo, 1998).

Na literatura está descrito como mecanismo de inibição enzimática provável a

ligação dos inibidores ao local activo da xantina oxidase no domínio da molibdopterina,

formando várias ligações de hidrogénio com os resíduos da enzima (Chang et al, 2007).

Sabe-se que a forma activa da xantina oxidase é um homodimero cujos monómeros,

durante a catálise, podem actuar independentemente, existindo para cada subunidade

um cofactor molibdopterina, dois centros distintos [2Fe-2S] e um cofactor FAD (Olson et

al, 1974) e catalizam a hidroxilação oxidativa de uma variedade de compostos

heterocíclicos aromáticos e aldeídos em reacções que envolvem quebra de ligações C-H

(Fig. 22).

Centro Grupo Prostético Estados de oxidação

Fe2S2I

[Fe2S2](S Cis)4

[Fe2S2]+; [Fe2S2]

2+ Fe2S2-II

Moço

Cofactor Molibdénio (Mo·molibdopterina) R = H (enzimas eucarióticas), AMP, CMP, GMP (enzimas procarióticas)

MoIV; MoV; MoVI

[MoSO](Smolibdopterina)2·H2O

(activa)

[MoO2](Smolibdopterina)2·H2O

(inactiva)


42

FAD

Flavina adenina dinucleótido (FAD)

FAD;

FAD· (semiquinona);

FADH2

Figura 22 – As enzimas da família da xantina oxidase contêm um cofactor de Molibdénio, centros [Fe2S2] e e

um cofactor FAD (adaptado de metallo.scripps.edu).

Sabe-se ainda que alguns resíduos de aminoácidos, como Arg 880, Fen 914, Fen

1009, Thr 1010 e Glu 1261, são importantes para a formação de ligações de hidrogénio e

interacções electrostáticas na ligação entre a enzima e o substrato/inibidor.

Por outro lado existem alguns dados que sugerem que a bolsa hidrofóbica do local

activo da xantina oxidase acomoda a fracção hidrofóbica volumosa dos bons inibidores:

os grupos hidroxilo e o grupo carbonilo parecem contribuir favoravelmente para o

estabelecimento de ligações de hidrogénio e interacções hidrofóbicas com os resíduos

Arg 880, Glu 1261 e Thr 1010 da enzima. Da mesma forma, uma bolsa hidrofóbica

rodeada pelos resíduos Fen 649, Fen 1013, Fen 1076, Leu 648, Leu 873 e Leu 1014

parece ser crucial para a estabilização dos substituintes do grupo carbonilo. Assim sendo,

o átomo de oxigénio do grupo hidroxilo da posição para poderá interagir com o grupo

guadinina da Arg 880 enquanto, por outro lado, os grupos OH das posições meta e orto

podem formar ligações de hidrogénio com o resíduo Thr 1010 (Chang et al, 2007).


43

Tabela 7 –Substratos e ou inibidores da xantina oxidase

Composto Estrutura Fórmula Química Peso Molecular

xantina

C5H4N4O2 152.11

hipoxantina

C5H4N4O 136.11

alopurinol

C5H4N4O 136.11

oxipurinol

C5H4N4O2 152.11

E2THPPE

C14H16O7 296,27

ETHPPE

C11H12O5 224,21

THPPE

C9H8O5 196,16

Estruturas, fórmulas químicas e peso molecular dos substratos da xantina oxidase, dos seus inibidores endógenos e actualmente em uso clínico, bem como dos compostos alvo de estudo neste trabalho.


44

Existem ainda dados na literatura que sugerem que o OH em posição meta

poderá formar ligações de hidrogénio com a ligação peptídica entre os resíduos de Thr

1010 e Fen 1009 e que os grupos etilo ligados ao grupo carboxílico poderão estabelecer

interacções hidrofóbicas com vários resíduos hidrofóbicos que rodeiam o local activo (Fen

1076, Fen 649, Leu 648, Leu 873 e Leu 1014) (Chang et al, 2007). Desta forma o

bloqueio do local activo por inibidores previne a entrada do substrato para o centro Mo-pt.

Recentemente Wang e seus colaboradores (2009) fizeram estudos de modulação

molecular com base na estrutura de alguns compostos para entender as características

de ligação de ésteres hidrofílicos e hidrofóbicos do ácido cafeico. Os estudos sobre

modulação molecular efectuados mostraram que o ácido cafeico se liga à região da

molibdopterina do local activo da xantina oxidase que forma várias ligações de hidrogénio

com os resíduos da enzima, promovendo a inibição enzimática. Já o ácido clorogénico

demonstrou ter uma ligação fraca à região molibdopterina da xantina oxidase, ligando-se,

no entanto, mais fortemente à região da flavina adenina do dinucleótido. Estes dados

fornecem uma base para um melhor entendimento das interacções base entre o ácido

cafeico e seus análogos com a xantina oxidase através de vários domínios de ligação

(Wang et al, 2009). Uma vez que os compostos em estudo, E2THPPE, ETHPPE e

THPPE que, como já se referiu, são derivados do ácido cafeico, podem estar sujeitos a

interações deste tipo com a xantina oxidase nos vários dominios de ligação constituindo

uma explicação para a diferença de comportamento inibitório encontrada entre estes

compostos.

O E2THPPE apresentou-se como o mais promissor enquanto inibidor da xantina

oxidase, com um valor de IC50 semelhante ao do alopurinol (Tabela 3, na secção 3.1 dos

resultados). A diferença estrutural do E2THPPE relativamente à estrutura dos restantes

compostos em estudo (ETHPPE e THPPE: ver Tabela 7) é a existência de grupos etilo

substituintes do grupo carboxilo. Esta diferença poderá explicar a ocorrência de um maior

número de interacções, como ligações de hidrogénio e interacções electrostáticas, com

os resíduos de aminoácidos da enzima conduzindo, desta forma, a uma maior

estabilização da ligação Enzima-Inibidor. Por outro lado, comparando a estrutura entre

E2THPPE, ETHPPE e THPPE, a xantina, o alopurinol e o seu metabolito principal, o

oxipurinol, o E2THPPE poderá ter uma maior semelhança conformacional com os

restantes substratos/inibidores pois os efeitos estéreos dos dois grupos etilo ligados ao

grupo carboxílico poderão, teóricamente, provocar efeitos aproximados aos do anel

penteno (presente na estrutura dos restantes substratos/inibidores: Tabela 7). Como

estes grupos etilo são mais volumosos do que os substituintes do grupo carboxílico

presentes no ETHPPE e THPPE, esta poderá constituir uma explicação para a ordem de

potência de inibição obtida (E2THPPE> ETHPPE> THPPE).


45

O E2THPPE foi capaz de travar a actividade da xantina oxidase de forma

semelhante ao alopurinol (ver Tabela 3, na secção 3.1 dos resultados). A inibição

exercida pelo alopurinol, como já referido nesta discussão, é do tipo competitivo (Fields et

al, 1996; O´Driscoll et al, 1999) enquanto o E2THPPE, nos ensaios de cinética enzimática

realizados mostrou ser um inibidor reversível do tipo misto (ver secção 3.1.1 dos

resultados) com valores de Vmáx e de Km que diminuem na sua presença.

Uma inibição reversível mista (Fig. 23) caracteriza-se por i) o inibidor se ligar a

um local específico da enzima que não o local activo, ii) o inibidor se ligar tanto à enzima

livre como ao complexo ES, iii) o inibidor misto não “afectar” a proporção de moléculas de

enzima que se ligam ao substrato, iv) a inibição não ser alterada pelo aumento da

concentração do substrato, v) a velocidade máxima (Vmáx) diminuir e vi) a constante de

Michaelis (Km) poder aumentar, diminuir ou manter-se. Assim, o E2THPPE estaria em

condições de interagir com os domínios da xantina oxidase fora do local de ligação do

substrato, resultando, possivelmente, em efeitos alostéricos que interferem, diminuindo a

actividade enzimática.

Figura 23 – Esquema ilustrativo do tipo de inibição mista. (adaptado de Marioto JR,

“Cinética enzimática”, 2006)

Os resultados de cinética enzimática obtidos para o composto E2THPPE podem ser

comparados com outros estudos publicados: o ácido cafeico e o seu éster fenetil,

mostraram ser inibidores reversíveis competitivos para a xantina oxidase (apresentam

valores de Vmáx constantes e de Km maiores na presença do inibidor). Já o ácido

clorogénico (que resulta de uma combinação entre o ácido cafeico e o ácido quinico:


46

Svilaas et al, 2004) se mostrou como um inibidor reversível misto, à semelhança dos

resultados obtidos com o composto E2THPPE pelo que, o inibidor se pode ligar a locais

diferentes do local activo da enzima (Wang et al, 2009).

A xantina oxidase é reconhecida como uma enzima com um papel importante nas

doenças geradas por radicais pelo que uso de inibidores desta enzima poderá ter uma

expressão terapêutica mais alargada do que o actual uso terapêutico do alopurinol

(tratamento de hiperuricémia primária e secundária). Como anteriormente descrito a

xantina oxidase serve como uma fonte de radicais livres derivados do oxigénio, havendo

diferentes mecanismos conhecidos que conduzem a um aumento da formação de

superóxido por parte desta enzima. O aumento dos níveis de radicais livres pode ser

consequência de um aumento de actividade da enzima xantina oxidase ou ocorrer devido

a um aumento na expressão da enzima com a subsequente elevação dos seus níveis de

expressão (tecidos tumorais: Kökoglu et al, 1990; Kaynar et al, 2005). Assim, uma

formação excessiva e persistente de radicais poderia ser responsável de forma decisiva

para que muitos efeitos genotóxicos possam surgir levando à carcinogénese e a outras

patologias, tais como doenças neurodegenerativas, doença cardiovascular, etc. Nestas

condições, em que o stress oxidativo ocorre (os níveis de xantina oxidase estão

aumentados), inibidores novos e eficientes desta enzima poderão ser muito úteis. Assim,

perspectiva-se que este tipo de inibidores, após os devidos ensaios farmacológicos de

fase I, II e III possam ter novas aplicações terapêuticas, por exemplo no tratamento da

gota (produção excessiva de ácido úrico) bem como na prevenção dos danos causados

em caso de isquemia/reperfusão (Adkins & Taylor, 1990; Hearse et al, 1986; Rose et al,

1998), na inflamação e no cancro (Cuzzocrea et al, 2001), etc.

Para além da xantina oxidase existem muitos outros sistemas enzimáticos que

podem contribuir para o aumento de radicais livres, tais como a fosfolipase e a sintetase

do monóxido de azoto (Adkins & Taylor, 1990; Koyama et al, 1999; Matsumura et al,

1998) que, per si ou no seu conjunto podem desencadear a activação do sistema

imunitário de forma a que o organismo reponha a homeostasia. O processo inflamatório

associado conduz na maioria dos casos à produção de eicosanóides, importantes

mediadores da inflamação, derivados do ácido araquidónico.

Os resultados obtidos com os compostos em estudo neste trabalho demonstraram

que estes para além da actividade antioxidante exibida, por inibirem a xantina oxidase,

têm ainda capacidade em refrear o processo inflamatório pois actuam como inibidores da

ciclooxigenase (Secção 3.2 dos resultados). A ciclooxigenase tem uma importante

actividade inflamatória pois é capaz (como descrito na secção 1.3 da introdução) de

converter o ácido araquidónico em prostaglandinas e tromboxanos promovendo a

inflamação.


47

Figura 24 – Diagrama do dímero da COX-1 ovina (Picot et al, 1994). Ambas as COX-1 e a COX-2 foram

localizadas na superfície do lúmen do retículo endoplasmático e das membranas nucleares, onde estão ancorados a uma única hélice da bicamada lipídica (dourado) composta por quatro hélices anfipáticas. O domínio catalítico está a azul, a Arg120 a verde e o heme a vermelho. (adaptado de DeWitt, 1999)

As COXs têm uma orientação única e invulgar na membrana (Fig. 24). Apesar

destas enzimas serem proteínas integrais de membrana, não contêm sequências

transmembranares. Quatro hélices anfipáticas formam uma superfície hidrofóbica que

flutua ou ancora estas enzimas numa posição vertical relativamente à membrana. Estas

hélices formam a base da molécula e a entrada para o local activo da COX, um local

hidrofóbico projectado interiormente a partir da superfície membranar da enzima. Como

estas hélices estão incorporadas na membrana, os ácidos gordos (substratos) e os anti-

inflamatórios não esteroides têm de atravessar a bicamada lípidica para chegar à entrada

para o local activo da enzima (Carvalho et al, 2004).

Por cristalografia de raios X determinou-se a estrutura tridimensional da COX-1

(Picot et al, 1994), iniciando-se um novo entendimento das acções terapêuticas dos

inibidores da COX, uma vez que o conhecimento das estruturas da COX-1 e da COX-2 e

de seus locais activos, constituem uma base fundamental no desenvolvimento de

inibidores específicos para a COX-2 bem como para a determinação da relação estrutura-

actividade destes produtos. Durante a actividade enzimática, o ácido araquidónico liga-se

a uma arginina na posição 120 (também necessária para a ligação de inibidores) e a uma

serina na posição 530. Por outro lado, uma transferência de electrões da tirosina na

posição 385 para um heme oxidado, que também está ligado dentro da enzima, inicia a

reacção de ciclooxigenase.

Na COX-2 a fracção carboxílica do substrato (ácido araquidónico) forma uma

ligação salina com o grupo guanidina da Arg120. O ácido araquidónico forma uma espécie


48

de gancho entre o carbono 9 (C9) e o carbono 11 (C11) e orienta-se de forma a que a

adição de 2 moléculas de O2 resulte na formação de PGG2. Na COX-2, a Arg120

carregada positivamente, parece ter apenas um papel acessório para a ligação dos anti-

inflamatórios não esteroides. Por um lado, este resíduo de Arg120 parece dificultar a

ligação de inibidores não acídicos à COX-2; por outro lado, os inibidores acídicos

parecem ligar-se à COX-2 auxiliados por interacções iónicas das suas fracções

carboxílicas com a Arg120 (Fig. 25, Kurumbail et al, 1996).

Figura 25 – Representação esquemática da ligação de um inibidor ao local activo da COX-2

(adaptado de Kurumbail et al, 1996)

A actividade da COX-1 é dependente da orientação correcta dos substratos, no

local activo, facilitado pela ligação iónica à Arg120. Contudo, também para esta isoenzima,

a Arg120 parece dificultar a ligação de inibidores não acídicos ao seu local activo.

A COX-2 tem um local activo maior (em cerca de 17%) do que o da COX-1 (Luong

et al, 1996) (Fig. 26). Esta diferença de tamanho pode beneficiar uma ligação mais forte

dos ácidos gordos e inibidores ao local activo da COX-2, reduzindo desta forma, a

importância das interacções iónicas com a Arg120. O maior tamanho do local activo da

COX-2 relativamente à COX-1 pode reduzir a carga e a acumulação estérea da Arg120 à


49

entrada do local activo e, consequentemente, aumentar o acesso ou permitir uma ligação

mais rápida de inibidores não acídicos à COX-2.

Figura 26 – Comparação do volume do local de ligação ao substrato da COX-1 e da COX-2

(adaptado de www.nature.com – Nature Reviews/ Drug Discovery).

Assim sendo, a Arg120 pode contribuir indirectamente para a selectividade do

fármaco, desfavorecendo mais eficazmente a ligação de anti-inflamatórios não esteroides

não acídicos ao local da COX-1 (mais pequeno) relativamente ao da COX-2 (maior).

Os factores estruturais da COX-2 que parecem ser mais importantes por

conferirem sensibilidade à inibição pelos anti-inflamatórios não esteroides selectivos, são

variações dos aminoácidos, o tamanho e o ambiente químico do local de ligação à COX-

2. A troca de um aminoácido entre a COX-1 e a COX-2 altera o ambiente químico do

local de ligação. Existem duas diferenças entre os locais activos da COX-1 e COX-2,

responsáveis e essenciais para a diferença de sensibilidades entre estas duas

isoenzimas:

a) a presença de Valina (a.a. pequeno) na COX-2 em vez da Isoleucina (a.a.

maior) na COX-1, na posição 523, permite o acesso a uma espécie de bolsa

lateral no local activo da COX-2, aumentando o tamanho efectivo deste local e

consequentemente permitindo a ligação de anti-inflamatórios não esteroides


50

mais volumosos à COX-2 do que à COX-1. Para além disso, a presença de

Valina (COX-2) em vez de Isoleucina (COX-1) na posição 434, na 2ª camada

em redor do local de ligação, pode contribuir indirectamente para a

selectividade, por permitir um aumento da mobilidade das cadeias laterais do

local activo (na COX-2) e consequentemente aumentar o tamanho efectivo

deste local.

Um maior local activo, adicionado ao acesso à bolsa lateral, resultam num

local de ligação dos anti-inflamatórios não esteroides cerca de 25% maior na

COX-2 do que na COX-1 (Luong et al, 1996; Gierse et al, 1996; Guo et al,

1996);

b) A presença de Histidina (COX-1) em vez de Arginina (COX-2), na posição 513,

resulta numa maior sensibilidade aos fármacos pela COX-2 (Wong et al,

1997).

Figura 27 – Representação esquemática da estrutura da COX-1 e COX-2, determinada por Cristalografia de

Raios-X (adaptado de Kurumbail et al, 1996)

A selectividade relativa dos inibidores entre as COXs é influenciada pelo facto de

os anti-inflamatórios não esteróides inibirem a COX-2 através de um mecanismo lento,

reversível e dependente do tempo, enquanto que inibem a COX-1 através de um

mecanismo reversível e competitivo. O mecanismo dependente do tempo ocorre quando,

após a ligação ao local activo da enzima, o complexo reversível “inibidor-COX” sofre uma

mudança conformacional para formar complexos fortemente ligados. Dependendo da

concentração e do inibidor pode levar entre vários segundos a minutos para atingir um

equilíbrio entre os complexos enzima-inibidor reversível e pseudo-reversível e para atingir


51

a inibição total. Apesar destes complexos firmemente ligados não serem covalentes, eles

dissociam-se lentamente e acabam por efectivamente inactivar a enzima (Fig. 28).

Figura 28 – A) Os inibidores competitivos simples da COX apenas formam complexos facilmente reversíveis

(EI) com a enzima. O inibidor dependente do tempo pode ainda formar complexos lentamente reversíveis (EI*) firmemente ligados. Este processo parece envolver alterações conformacionais dos AINEs após se ligarem ao local activo das COX. B) Todos os AINEs são inibidores dependentes do tempo da COX-2 mas apenas inibidores competitivos simples da COX-1. Então, em concentrações apropriadas, a incubação com inibidores da COX-2 selectivos podem levar a uma inibição quase-completa da COX-2 sem afectar significativamente a actividade da COX-1. (adaptado de DeWitt, 1999)

O resultado prático deste tipo de inibição misto é que, se a concentração de um

inibidor selectivo no sangue for inferior ao valor de IC50 para a COX-1, então a formação

de complexos “enzima-inibidor” irá apenas resultar numa redução mínima da actividade

da COX-1 mas irá levar à inactivação da maioria ou de todas as COX-2. Todos os

inibidores da COX-2 são inibidores dependentes do tempo mas apenas inibidores

competitivos da COX-1 por isso, em concentrações apropriadas, a incubação com

inibidores selectivos da COX-2 pode levar a uma inibição gradual e quase completa da

COX-2 sem afectar significativamente a actividade da COX-1 (DeWitt, 1999).


52

Tabela 8 – Substratos e ou inibidores da ciclooxigenase

Composto Estrutura Fórmula Química Peso Molecular

Ácido araquidónico

C20H32O2 304.5

Diclofenac

C14H11Cl2NO2 296.14

Ibuprofeno

C13H18O2 206,3

Indometacina

C19H16ClNO4 357.8

E2THPPE

C14H16O7 296,27

ETHPPE

C11H12O5 224,21

THPPE

C9H8O5 196,16

Estruturas, fórmulas químicas e peso molecular dos substratos da ciclooxigenase, dos seus inibidores endógenos e actualmente em uso clínico, bem como dos compostos alvo de estudo neste trabalho.


53

Os compostos em estudo demonstraram ser capazes de inibir quer a isoforma

constitutiva quer a isoforma indutível (por estímulos inflamatórios e citoquinas: Raz et al,

1989) mas requerem o uso de concentrações mais elevadas do que o composto de

referência, a indometacina. A ordem de eficiência de inibição encontrada para a COX-1

(Indometacina> E2THPPE= THPPE> ETHPPE) e para a COX-2 (Indometacina>

E2THPPE> THPPE= ETHPPE) mostra que o E2THPPE (ver Tabela 6 dos resultados),

indicam uma inibição significativamente maior da COX-2 relativamente aos outros

compostos em estudo e até mesmo à isoforma COX-1, facto que poderá ser explicado

por a COX-2 ser capaz de “acomodar” melhor os inibidores mais volumosos no seu local

activo (já descrito anteriormente), resultando numa maior inibição desta.

Vários são os estudos descritos na literatura que avaliaram a capacidade de

compostos de natureza fenólica em inibir as isoformas da ciclooxigenase (Mada et al,

2008), porém poucos compostos foram capazes de exercer actividade inibitória com

valores baixos de natureza micromolar (Laporta et al, 2007). A inibição exercida pelos

compostos em estudo neste trabalho, enquadra-se neste conjunto de dados, pois a

inibição para a COX-1 e COX-2 é conseguida com valores de IC50 entre 12 e 55 µM.

Para a avaliação dos anti-inflamatórios não esteroides é utilizado um índice de

especificidade relativa entre as isoformas da COX, expresso como o índice IC50 para

COX-2/COX-1. De acordo com este critério, quanto menor o valor do quociente relativo

ou razão de IC50 COX-2/COX-1, maior será a selectividade do inibidor sobre a COX-2

(para inibidores selectivos da COX-2 IC50 COX-2/COX-1 <0,002). Estes índices de

proporcionalidade de inibição das duas isoformas são usados para comparar a potência

dos fármacos e teoricamente deveriam também estar correlacionados com a

predisposição clínica aos efeitos adversos gastrintestinais. De facto o valor de IC50 não

reflecte necessariamente a complexidade da interação inibidor-enzima e a quantidade

real de inibição in vivo e, desta forma, não deve ser utilizado como medida da eficácia

clínica. As razões de IC50 COX-2/COX-1 encontradas para os compostos em análise

neste trabalho são da mesma ordem de grandeza (0,33; 0,59 e 0,94 para E2THPPE,

ETHPPE e THPPE, respectivamente) não havendo um composto que se possa destacar

pela sua maior selectividade relativa em relação à inibição da COX-2. Significa que o

E2THPPE, ETHPPE e THPPE apresentam uma quase equiselectividade para as

isoformas COX-1 e COX-2 pelo que os efeitos adversos que potencialmente possam

desencadear serão semelhantes, apesar de provavelmente com o inibidor E2THPPE

esses efeitos possam ser menos intensos (IC50 COX-2/COX-1=0,33).

Os compostos em estudo neste trabalho, THPPE, ETHPPE e E2THPPE, foram

previamente sujeitos a ensaios para determinar a sua actividade citotóxica em diferentes

linhas celulares cancerígenas humanas – adenocarcinoma de glândula mamária (MDA-


54

MB-231), adenocarcinoma de cérvix uterino (HeLa), e epitelioma escamoso de língua

(HSC-3) – assim como em células não neoplásicas – fibroblastos de tecido epitelial (BJ).

Os resultados deste estudo anterior foram obtidos no grupo de Quimica-Física Molecular

do Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de

Coimbra (Tabela 9).

Tabela 9 – Composto e respectivo efeito citotóxico em linhas celulares cancerígenas humanas e reversibilidade do efeito.

Composto

Linha Celular

HeLa

HSC-3

MDA-MB-231

BJ (sã)

THPPE ++ ** ++ * +++ ** ++ **

ETHPPE ++ ** +++ * +++ ** +++ **

E2THPPE + ** +++ * ++ *** + **

efeito citotóxico relativo: + < ++ < +++ reversibilidade relativa do efeito citotóxico: * < ** < ***

Na determinação do efeito citotóxico destes compostos, verificou-se que o

monoéster ETHPPE apresentou actividade relevante para as linhas celulares HeLa, HSC-

3 e MDA-MB-231 e uma reduzida toxicidade para as células não-neoplásicas (BJ), o que

está de acordo com estudos previamente realizados para os ésteres análogos dos ácidos

cafeico e gálhico (Fiuza et al, 2004). A esterificação do THPPE parece aumentar assim a

actividade citotóxica destes derivados hidroxicinâmicos. É possível estabelecer relações

entre as características estruturais dos compostos e a sua actividade anti-tumoral

(relações estrutura-actividade, REA´S), as quais permitem entender melhor a

especificidade de acção e a reversibilidade do efeito da droga.

Para além da capacidade demonstrada dos ácidos fenólicos como inibidores da

xantina oxidase e da ciclooxigenase, isto é, como antioxidantes/anti-inflamatórios,

existem dados na literatura que os descrevem ainda como agentes com uma elevada

capacidade antiproliferativa e citotóxica (Rice - Evans et al, 1996; Esteves et al, 2008;

Teixeira et al, 2005; Fresco et al, 2006, Fiuza et al, 2004; Gomes et al, 2003;Yang et al,

2001). Alguns destes autores consideram que esta capacidade resulta das propriedades

antioxidantes e anti-inflamatórias exibidas pelos compostos e que é fortemente

dependente das suas características estruturais, porém existem ainda autores que


55

demonstraram a participação de ácidos fenólicos em mecanismos intracelulares de

transdução de sinal que regulam a proliferação, sobrevivência e transformação celular

(ver revisão Fresco et al., 2006). Muitas alterações moleculares associadas à

carcinogénese ocorrem em vias de transdução de sinal que regulam a proliferação e

diferenciação. Como exemplos dos constituintes destas vias temos diversas cinases,

PKC, MAPK etc, as quais contribuem para a manutenção da homeostasia do organismo.

Uma activação anormal ou o silenciamento destas cinases ou das suas vias de

sinalização subsequentes poderá conduzir a um crescimento celular descontrolado e, em

última análise, ao cancro. Alguns ácidos fenólicos podem conduzir a alterações

moleculares associadas à carcinogenese via término do ciclo celular, tal como descrito

para o CAPE (células HL-60) ou através da inibição do mecanismo de transdução de

sinal de enzimas tais como a PKC (Lin et al, 1997), a cinase da tirosina (Markovits et al,

1989) etc. Assim, a atribuição de propriedades quimiopreventivas a alguns ácidos

fenólicos tem sido suportada por dados da literatura que descrevem a sua influência na

indução da apoptose, na supressão da activação do NF-KB e da angiogénese e, ainda

por exibirem efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes, como anteriormente referido. O

ácido cafeico e o CAPE são exemplos de ácidos fenólicos que têm esta capacidade

quimiopreventiva.

Pelo exposto, seria interessante desenvolver experiências que permitissem avaliar

o potencial efeito dos compostos THPPE, ETHPPE e E2THPPE sobre as vias de

transdução de sinal de células neoplásicas e, desta forma, estabelecer o mecanismo pelo

qual estes compostos exercem o seu efeito anti-cancerígeno.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Conclusões e Perspectivas Futuras

56

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

Os resultados obtidos nesta dissertação demonstraram que os compostos E2THPPE,

ETHPPE eTHPPE, para além da actividade antioxidante exibida por inibirem a xantina

oxidase (capacidade inibitória E2THPPE> ETHPPE> THPPE), têm ainda capacidade em

refrear o processo inflamatório pois actuam como inibidores da ciclooxigenase

(capacidade inibitória da COX-1: E2THPPE= THPPE> ETHPPE e da COX-2: E2THPPE>

THPPE= ETHPPE). Assim, perspectiva-se que este tipo de inibidores, após os devidos

ensaios farmacológicos de fase I, II e III possam ter novas aplicações terapêuticas, por

exemplo no tratamento da gota (produção excessiva de ácido úrico) bem como na

prevenção dos danos causados em caso de isquemia/reperfusão (Adkins & Taylor, 1990;

Hearse et al, 1986; Rose et al, 1998), na inflamação e no cancro (Cuzzocrea et al, 2001).

A eficácia quimiopreventiva dos constituintes da dieta é actualmente objecto de

intensa investigação. Em virtude do melhor entendimento da segurança da sua ingestão

e do facto de não serem considerados “medicamentos”, os produtos derivados da

alimentação despertam um grande interesse perspectivando a sua utilização como

agentes quimiopreventivos. Os constituintes da dieta com tais propriedades poderão

originar resultados positivos quando consumidos a longo prazo. Os ácidos fenólicos são

responsáveis por cerca de um terço da ingestão diária total de compostos fenólicos

porém é muitas vezes insuficiente para proteger contra agentes mutagénicos (exógenos

ou endógenos) o que leva a pensar na hipótese de proceder a uma suplementação

dietética como abordagem alternativa. Apesar da importância inequívoca dos compostos

fenólicos como agentes quimiopreventivos e, embora a maioria deles sejam considerados

seguros, acredita-se que o seu consumo deva ser precedido de estudos cuidadosos uma

vez que foram já relatados casos de toxicidade no uso deste tipo de compostos. Os

potenciais efeitos tóxicos dos compostos fenólicos estão associados ao equilíbrio entre

as propriedades antioxidantes e pró-oxidantes, fortemente dependentes da sua

concentração e ambiente químico e que devem, portanto, ser esclarecidas antes de se

utilizarem quer como suplementos, na prevenção ou na terapêutica.

Pelo anteriormente exposto, é compreensível que a avaliação da actividade

antioxidante/antiproliferativa dos derivados fenólicos quer de origem natural quer sintética

seja actualmente, uma área de investigação atractiva estando direccionada ao

desenvolvimento de novas e mais eficientes drogas antioxidantes/anti-inflamatórias/anti-

cancerigenas. De facto, numerosos estudos têm sido desenvolvidos com o objectivo de

encontrar novos “compostos líder”, favoráveis à obtenção de agentes quimiopreventivos

e/ou quimioterapêuticos do cancro.

Dissertação do Mestrado em Controlo de Qualidade Referências

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Joana Beatriz A. S. P. Sousa - Repositório Aberto · Tukey's t-test (p ≤0.05, values statistically different). The results show that the compounds, THPPE, ETHPPE and E 2THPPE,