KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA

PELO COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS

NORMOTENSOS E HIPERTENSOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA

PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS

NATURAIS SINTÉTICOS BIOATIVOS

JOÃO PESSOA – PB

2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA

PELO COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS

NORMOTENSOS E HIPERTENSOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernandes Medeiros do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA

Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros

Orientadora: Profa. Dra. Nadja de Azevedo Correia

JOÃO PESSOA – PB

2008

C377a Costa, Karla Veruska Marques Cavalcante da. Avaliação da atividade cardiovascular induzida pelo composto mesoiônico CMMTT em ratos normotensos e hipertensos/ Karla Veruska Marques Cavalcante da Costa. João Pessoa, 2008.

169p. Orientador: Isac Almeida de Medeiros Orientadora: Nadja de Azevedo Correia Tese (doutorado) – UFPB/CCS 1. Farmacologia. 2. Composto Mesoiônico. 3.

Óxido Nítrico. 4. Artéria Mesentérica superior. 5. Hipertensão.

UFPB/BC CDU 615 (043)

KARLA VERUSKA MARQUES CAVALCANTE DA COSTA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOVASCULAR INDUZIDA PELO

COMPOSTO MESOIÔNICO CMMTT EM RATOS NORMOTENSOS E

HIPERTENSOS

TESE APROVADA EM: ____/____/____

COMISSÃO EXAMINADORA:

___________________________________________ Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros

Orientador

____________________________________________ Profa. Dra. Nadja de Azevedo Correia

Orientadora

____________________________________________ Profa. Dra. Katy Lisias Gondim Dias

Examinadora

____________________________________________ Profa. Dra. Simone dos Santos Maciel

Examinadora

____________________________________________ Profa. Dra. Simone Bezerra Alves

Examinadora

____________________________________________ Profa. Dra. Aurigena de Araújo Ferreira

Examinadora

Aos meus pais, ZenioZenioZenioZenio e GraçasGraçasGraçasGraças, , , , por todo o amor,

ensinamentos, dedicação, desprendimento, alegria e por sempre

incentivarem e valorizarem a importância do conhecimento;

Ao meu amado esposo, Joseânderson Joseânderson Joseânderson Joseânderson pelo companheirismo,

paciência, cuidado, incentivo e, sobretudo, pelo amor verdadeiro;

Aos meus queridos irmãos, Kyara, Hallan e Hallana, Kyara, Hallan e Hallana, Kyara, Hallan e Hallana, Kyara, Hallan e Hallana, pelo

apoio e exemplo de força, perseverança e família.

AGRADECIMENTOS

Expresso uma verdadeira estima e gratidão a todos que contribuíram para a realização deste trabalho, em

especial à:

À Deus Deus Deus Deus por ser o meu refúgio, minha fortaleza, meu guia, minha referência de amor e, principalmente,

pela certeza que me conduziu em todos os momentos deste meu projeto de vida;

Ao meu orientador Prof. Isac MedeirosProf. Isac MedeirosProf. Isac MedeirosProf. Isac Medeiros a quem estimo e admiro e sou grata pela oportunidade ,

confiança depositada , incentivo e orientação nesta longa, as vezes árdua, porém gratificante caminhada;

além das contribuições valiosas para a realização deste trabalho;

A minha querida orientadora ProfProfProfProfaaaa Nadja Correia Nadja Correia Nadja Correia Nadja Correia pela sua amizade sincera e profissionalismo

realizado com muita dedicação, seriedade e competência, além de sua imprescindível participação e

contribuição neste trabalho;

Aos professores JosephJosephJosephJoseph Miller,Miller,Miller,Miller, AdersonAdersonAdersonAderson DiasDiasDiasDias e BrunoBrunoBrunoBruno LiraLiraLiraLira pela colaboração e por terem fornecido o

composto para a realização deste estudo;

A José CourJosé CourJosé CourJosé Couras as as as pela cumplicidade na execução deste projeto, por toda a dedicação, rigor, competência e ,

sobretudo, amizade nos momentos difíceis;

As minhas amigas: Katy, Darizy, Islania Katy, Darizy, Islania Katy, Darizy, Islania Katy, Darizy, Islania que durante toda a pós-graduação estiveram comigo nos

melhores e os mais difíceis momentos, dividindo as risadas, as vitórias e lágrimas; construímos uma

história verdadeira, sólida , onde o amor, o respeito e a lealdade é base desta amizade: a vocês um

obrigada todo especial;

Ao meu querido primo Robson VerasRobson VerasRobson VerasRobson Veras pelo exemplo de garra, determinação e pela valiosa contribuição em

vários momentos do doutorado;

Ao extraordinário professor GustavoGustavoGustavoGustavo BalejoBalejoBalejoBalejo por ter sido tão especial na minha formação, pelos

ensinamentos e pelo exemplo de pesquisador, de profissional e de ser humano, com quem tive a honra de

dividir a bancada;

Aos professores Maria Cristina SalgadoMaria Cristina SalgadoMaria Cristina SalgadoMaria Cristina Salgado,,,, Lusiane BeLusiane BeLusiane BeLusiane Bendndndndhhhhackackackack e Mario dos AnjosMario dos AnjosMario dos AnjosMario dos Anjos por terem me recebido em

seus laboratórios e pela contribuição valiosa para a realização deste trabalho;

Aos meus estimados amigos do Laboratório de Cardiovascular, CarminhaCarminhaCarminhaCarminha, Angélica, George, Angélica, George, Angélica, George, Angélica, George, Júnior, Júnior, Júnior, Júnior,

Raline, Aldeídia, Tosin, Raline, Aldeídia, Tosin, Raline, Aldeídia, Tosin, Raline, Aldeídia, Tosin, HoracinaHoracinaHoracinaHoracina , Fabíola, Thiago, Thais Porto, Àpio, Renata, Alessandra, Aurilene, , Fabíola, Thiago, Thais Porto, Àpio, Renata, Alessandra, Aurilene, , Fabíola, Thiago, Thais Porto, Àpio, Renata, Alessandra, Aurilene, , Fabíola, Thiago, Thais Porto, Àpio, Renata, Alessandra, Aurilene,

Márcio, Êurica, Nayara, Mônica, Abraão, Karol, Marília, Camila, Bruna, Márcio, Êurica, Nayara, Mônica, Abraão, Karol, Marília, Camila, Bruna, Márcio, Êurica, Nayara, Mônica, Abraão, Karol, Marília, Camila, Bruna, Márcio, Êurica, Nayara, Mônica, Abraão, Karol, Marília, Camila, Bruna, NatáliaNatáliaNatáliaNatália e Ataídee Ataídee Ataídee Ataíde, por toda

ajuda, pelo companheirismo, pelos momentos de descontração e por terem contribuído direta ou

indiretamente para esta conquista.

A turma turma turma turma de de de de doutorado (2004), doutorado (2004), doutorado (2004), doutorado (2004), em especial o meu amigo FabianoFabianoFabianoFabiano, que foi um companheiro fiel, solidário

e que soube ao longo do nosso convívio, conquistar a minha admiração;

A José Crispim Duarte José Crispim Duarte José Crispim Duarte José Crispim Duarte ,,,, pelo exemplo de profissional, por toda competência, dedicação, atenção; estando

sempre presente e estendendo uma mão amiga quando se precisava de uma ajuda a mais;

A comissãocomissãocomissãocomissão examinadoraexaminadoraexaminadoraexaminadora deste trabalho pela certeza das contribuições, dedicação, empenho e seriedade no

trabalho realizado;

Aos grandes mestresmestresmestresmestres da minha vida, por terem me ensinado algo muito mais além que as letras e

números, eles me ensinaram a ter paixão pelo que se faz, e foram nestes exemplos de profissionais que eu

construí o meu sonho e edifiquei a minha realidade;

A todos os meus alunosalunosalunosalunos pelo prazer imenso que vocês me proporcionaram a cada dia, a cada aula e a

cada aprendizado novo; foi com vocês que eu percebi como é gratificante a arte de aprender e ensinar

mutuamente;

A Tânia AlvesTânia AlvesTânia AlvesTânia Alves, pelo seu estimado trabalho e apoio desempenhado na secretaria do programa de Pós-

graduação;

A seu Luís e Luís e Luís e Luís e AdrianoAdrianoAdrianoAdriano, pelo seu valioso trabalho realizado com dedicação no Biotério do LTF;

À CoordenaçãoCoordenaçãoCoordenaçãoCoordenação e a todos os funcionáriosfuncionáriosfuncionáriosfuncionários do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pela competência,

respeito e dedicação;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPESCAPESCAPESCAPES) pelo suporte financeiro e

técnico científico através do Portal Periódicos;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPqCNPqCNPqCNPq) e a Universidade Federal

da Paraíba (UFPBUFPBUFPBUFPB) por todo apoio que têm empregado para a pesquisa;

Aos grandes amores da minha vida meu esposo JoseândersonJoseândersonJoseândersonJoseânderson, meusmeusmeusmeus pais e pais e pais e pais e irmãosirmãosirmãosirmãos, familiaresfamiliaresfamiliaresfamiliares e amigosamigosamigosamigos

(Brígida)(Brígida)(Brígida)(Brígida), por terem sido tão prestativos, atenciosos, companheiros e por terem dividido comigo os meus

sorrisos e as minhas lágrimas, e participado efetivamente de cada passo desta conquista e de toda a minha

vida ...

... MUITO OBRIBADA!!! MUITO OBRIBADA!!! MUITO OBRIBADA!!! MUITO OBRIBADA!!!

RESUMO

CAVALCANTE, K.V.M. Avaliação da atividade cardiovascular induzida pelo Composto Mesoiônico CMMTT em ratos normotensos e hipertensos. (2008). Tese (Doutorado em Produtos Naturais e Síntéticos Bioativos) – Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby F. de Medeiros, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB, 2008.

O presente estudo tem por objetivo avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos pelo composto mesoiônico – 2 – (4 – clorofenil) – 3 – metil – 4 – ( 4 – metoxifenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 – tiolato (CMMTT) em animais normotensos e hipertensos, utilizando técnicas combinadas in vivo e in vitro. Em ratos não anestesiados normotensos e hipertensos (L-NAME, 2R1C e ratos de Lyon-LH), o CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v., randomicamente) produziu uma hipotensão seguida de uma taquicardia independente de doses. A resposta hipotensora foi significativamente potencializada no modelo de hipertensão L-NAME (PAM (%) = -6,5 ± 0,5; -10,9 ± 2,0; -12,7 ± 0,9; -11,8 ± 2,8; -16,1 ± 2,7; -14,9 ± 2,6 mmHg) quando comparada ao normotenso (PAM (%)= -10,5 ± 2,7; -7,1 ± 0,90; -8,3 ± 2,3; -7 ± 0,90; -8,9 ± 1,3; -5,3 ± 1 mmHg). Em anéis de aorta torácica isolada de rato, com endotélio funcional, CMMTT (10-14 – 10-5 M) induziu pequeno relaxamento sobre as contrações induzidas por fenilefrina (10-6 M) (Emax = 39,6±8,1 %, n = 5) e esse efeito foi significativamente atenuado pela remoção do endotélio vascular (Emáx = 12,9±5,8 %, n = 5), corroborando com os resultados anteriores que demonstram que o mecanismo de ação do CMMTT é dependente do endotélio. Preparações de artéria mesentérica com endotélio funcional preservado, incubadas com caribdotoxina (100 nM) + apamina (100 nM) ou indometacina (10 µM) + atropina (1 nM), o efeito vasorelaxante induzido por CMMTT (10-14 – 10-6 M) não foi modificado significativamente. Em adição, concentrações isoladas do CMMTT em anéis de artéria mesentérica (10-5 e 10-6 M) e em aorta torácica (10-5 M) de rato com endotélio íntegro, induziu um aumento dos níveis de NOx e este efeito foi completamente abolido após a remoção do endotélio vascular, sugerindo que o relaxamento induzido pelo composto mesoiônico é mediado, principalmente, pelo NO. Nos anéis de artéria mesentérica pré-contraída com FEN (10-5 M) e pré-incubados com KCl 20 mM, (Emáx = 29,24±8,40 %; n = 6) ou TEA (1 mM) (26,40±4,02 %, n = 9), ou 4-AP (1mM) (Emax = 12,80±8,94 %, n = 6), ou BaCl2 (30 µM) (Emáx=56,8±7,12%, n=6) o relaxamento foi significativamente atenuado, quando comparados aos anéis com endotélio funcional na ausência dos inibidores (Emax = 80,8 ± 5,8 %, n=17). No entanto, na presença de glibenclamida (10 µM), o efeito vasodilatador foi diminuído apenas nas últimas concentrações (Emax=59,62±6,56 %, n = 6), sugerindo o envolvimento dos canais para K+ na resposta induzida pelo CMMTT. Adicionalmente, o efeito relaxante de CMMTT (10-6) em anéis da artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos (L-NAME), foi significativamente maior quando comparada aos animais normotensos (Emáx=95,63±2,80; 80,8±5,8 respectivamente). Além disso, o CMMTT interferiu na reatividade vascular, potencializando a ação da ACh e prevenido a contração induzida pela FEN em animais hipertensos L-NAME quando o endotélio encontrava-se preservado. Interessantemente, o efeito induzido pelo CMMTT em animais normotenso parece envolver um mecanismo de ativação da eNOS nas células endoteliais independente do aumento da [Ca2+]i. Em conclusão, o presente estudo demonstra uma atividade hipotensora e taquicárdica em ratos normotensos e hipertensos. Em artéria mesentérica o CMMTT aumenta NO de maneira independente do aumento da [Ca2+]i com ativação dos canais para K+ do tipo Kv,Kir, e BKCa

2+, e nas maiores concentrações o KATP, induzindo o relaxamento, além de induzir alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do endotélio em ratos hipertensos L-NAME. Palavras-chave: Composto mesoiônico; oxido nítrico; artéria mesentérica superior; hipertensão.

ABSTRACT

CAVALCANTE, K.V.M. Assessment of cardiovascular activity induced by the compound mesoionic CMMTT in normotensive and hypertensive rats. (2008). Thesis (Ph.D. in Natural Products and Sintetics Bioactivs) - Pharmaceutical Technology Laboratory of Prof. Delby F. of Medeiros, Center for Health Sciences, Federal University of Paraiba, Joao Pessoa - PB, 2008. This study aims to assess the cardiovascular effects induced by mesoionic 2-(4-chlorophenyl) - 3 - methyl - 4 - (4 - methoxyphenyl) - 1; 3 – thiazolium – 5 -thyolate (CMMTT), in normotensive and hypertensive animals, using a combined in vitro and in vivo approach. In non-anesthetized rats normotensive and hypertensive (L-NAME, 2R1C Lyon rats-LH), the CMMTT (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 and 5 mg / kg iv, randomly) produced a hypotension and increase heart rate dose-independent. The hypotensive response was significantly potentiated in the model of hypertension L-NAME (MAP (%) = -6.5 ± 0.5, -10.9 ± 2.0; -12.7 ± 0.9; -11.8 ± 2.8; -16.1 ± 2.7; -14.9 ± 2.6 mm Hg)when compared to normotensive (MAP (%) = -10.5 ± 2.7; -7.1 ± 0 , 90; -8.3 ± 2.3; -7 ± 0.90; -8.9 ± 1.3; -5.3 ± 1 mm Hg). In rings of thoracic aorta isolated from rat, with functional endothelium, CMMTT (10-14 - 10-5 M) induced small relaxation on contractions induced by phenylephrine (10-6 M) (Emax = 39.6 ± 8.1% , n = 5) and this effect was significantly reduced by removal of vascular endothelial (Emax = 12.9 ± 5.8%, n = 5), confirming that the mechanism of action of CMMTT is endothelium dependent. Preparations of mesenteric artery with functional endothelium preserved, incubated with ChTX (100 nM) + apamin (100 nM) M) or by indomethacin (10 µM) + atropine (1 nM), the effect vasorelaxante induced CMMTT (10-14 - 10-6 M) was not significantly changed. In addition, concentrations of isolated CMMTT in rings of mesenteric artery (10-5 and 10-6 M) and thoracic aorta (10-5 M) of rat with intact endothelium, induced an increase in levels of NOx and this effect was completely abolished after the removal of vascular endothelium, suggesting that the relaxation induced by the mesoionic compound is mediated, mainly by NO. In mesenteric artery rings of pre-contracted with PHE (10-5 M) and pre-incubated with KCl 20 mM, (Emáx = 29.24 ± 8.40 %; n = 6) or TEA (1 mM) (26.40 ± 4.02 %, n = 9), or 4-AP (1 mM) (Emax = 12.80 ± 8.94 %, n = 6), or BaCl2 (30 µM) (Emáx = 56.8 ± 7.12%, n=6) relaxation was significantly attenuated when compared vasodilator effect to the rings with functional endothelium in the absence of inhibitors (Emax = 80.8 ± 5,8 %, n=17), the). However, in the presence of glibenclamide was diminished only in the last concentrations, suggesting the involvement of K+ channels in the response induced by CMMTT. Additionally, the relaxing effect on rings of superior mesenteric artery isolated from hypertensive rats (L-NAME) was significantly higher in the concentration of 10-6 M when compared with normal animals (Emáx = 95.63 ± 2.80; 80.8 ± 5.8 respectively). Moreover, the CMMTT interfere in vascular reactivity, powering the action of ACh and prevented the contraction induced by PHE in hypertensive animals L-NAME when the endothelium had been preserved. Interestingly, the effect produced by CMMTT in normotensive animals seem involve a mechanism for activation of eNOS on endothelial cells independent of increased [Ca2 +] i. In conclusion, this study shows a hypotensive activity and taquicárdica in normotensive and hypertensive rats. In the mesenteric artery CMMTT increases NO independent way of increasing the [Ca2 +]i with activation of K+ channels for the type Kv, Kir, and BKCa2+, and the largest concentrations KATP, inducing the relaxation, in addition to induce change in vascular reactivity for PHE and ACh, so dependent on the endothelium in hypertensive rats L-NAME.

Key words: mesoionic compounds; nitric oxide; superior mesenteric artery; hypertension.

LISTA DE ABREVIATURAS

ACh Acetilcolina B12 cianocobalamina BK canais para potássio ativados por cálcio de alta

condutância b.p.m. batimentos por minuto BSA albumina sérica bovina Ca2+ Cálcio CaCl2 cloreto de cálcio ([Ca2+]i) ([Ca2+]c) CaM

concentração de cálcio intracelular concentração de cálcio citosólico calmodulina

CaV

CE50 CEPA

canais para cálcio operados por voltagem concentração de uma substância capaz de produzir 50% do efeito máximo Comitê de Ética em Pesquisa Animal

Chtx Caribdotoxina CMMTT composto mesoiônico – 2 – (4 – trifluorofenil) – 3 – metil

– 4 – ( 4 – metilfenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 – tiolato ºC graus Celsius CO2 dióxido de carbono COX ciclooxigenase do tipo 1 DAG Diacilglicerol DC débito cardíaco DCV doença cardiovascular DMSO dimetil sulfóxido ECA enzima conversora da angiotensina EDHF fator hiperpolarizante derivado do endotélio EDRF fator relaxante derivado do endotélio Emáx efeito máximo e.p.m. erro padrão da média ET1 endotelina-1 FC freqüência cardíaca FEN Fenilefrina FLC fosfolipase C G Gramas Gq Subtipo de proteína G GMPc monofosfato de guanosina ciclíco GTP trifosfato de guanosina HAS hipertensão arterial sistêmica IK canais para potássio ativados por cálcio de condutância

intermediária IP3 trifosfato de inositol i.p. intra-peritoneal

i.v. Intravenoso K2p canais para potássio de dois poros KATP canais para potássio sensíveis ao ATP Kir canais para potássio retificadores de entrada KV canais para potássio sensíveis a voltagem KCl cloreto de potássio Kg Quilograma LC20 cadeia leve da miosina LH LL

rato hipertenso de Lyon rato normotenso de Lyon

L-NAME NG-Nitro-L-arginina metil ester mg Miligramas mL MLC

Mililitros Cadeia leve da miosina

MLCK min.

cinase da cadeia leve da miosina minuto

mmHg milímetro de mercúrio M MM

Molar massa molecular

NaCl cloreto de sódio NO óxido nítrico NO3

- Nitrato NO2

- Nitrito NOS NOx

sintase de óxido nítrico nitro-compostos

NPS nitroprussiato de sódio O2

O2-

oxigênio molecular ânion superóxido

ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo-[4,3-a]quinoxalin-1-one PA pressão arterial PAD pressão arterial diastólica PAM pressão arterial média PAS pD2

PE PGH2 PGI2

pressão arterial sistólica (-log EC50) polietileno prostaciclina prostaciclina

PKB proteína cinase B PKG proteína cinase G PLC fosfolipase C RVPT resistência vascular periférica total SHAM rato normotenso controle do 2R1C SHR SHRSP SK

ratos espontaneamente hipertensos rato SHR susceptível a acidente vascular cerebral canais para potássio ativados por cálcio de baixa condutância

SNC sistema nervoso central

SNS SRA

sistema nervoso simpático sistema renina angiotensina

TEA Tetraetilamônio TXA2

UV VES Vm

tromboxano A2

ultravioleta volume de ejeção sistólica potencial de membrana

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1: Aspectos químicos que caracterizam o composto mesoiônico CMMTT ..............................................................................

49

Tabela 1: Drogas utilizadas durante a realização dos protocolos experimentais in vivo e in vitro ............................................................... Tabela 2: Relação dos sais para preparação das soluções fisiológicas utilizadas nos experimentos in vivo e in vitro ......................................... Tabela 3: Composição da solução de Tyrode (pH=7,4) ........................ Tabela 4: Composição da solução de Tyrode despolarizante com KCl à 20mM (pH=7,4) .................................................................................... Tabela 5: Composição da solução de Krebs Henseleit (pH=7,4) .......... Tabela 6: Composição da solução de KCl 80 mM (pH=7,4) .................. Tabela 7: Composição da solução de Hanks (pH=7,4) ......................... Tabela 8: Alterações comportamentais induzido pelo tratamento agudo da CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) em camundongos machos e fêmeas (n = 6 por grupo) ...................................................... Tabela 9: Percentagem de mortes dos camundongos tratados com CMMTT (n = 6 por grupo) ....................................................................... Tabela 10: Peso dos órgãos vitais corrigido pelo peso de camundongos (peso do órgão/peso do animal) machos e fêmeas tratados com CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) (n = 6 por grupo)

56 58 58 59 59 60 60 118 119 120

LISTA DE FIGURA

Figura 1: Representação esquemática de um composto mesoiônico............................................................................................... Figura 2: Ratos Wistar (Rattus norvegicus) (A) e Ratos Sprague Dawley (B) .............................................................................................. Figura 3: Pletismógrafo de cauda para medida indireta da pressão arterial em ratos ..................................................................................... Figura 4: Sistema de aquisição de dados de pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos ................................................................. Figura 5: Sistema de aquisição de dados para órgão isolado ...............

Figura 6: Aparato utilizado para medida de cálcio intracelular .............

Figura 7: Aparato utilizado para medida de NOx (NOA, 280i) ..............

Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da presença (A) ou ausencia (B) do endotélio funcional em anéis de aorta torácica de rato ...............................................................

Figura 9: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da presença (A) ou ausência (B) do endotélio funcional em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato ............................

Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação do EDHF na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato ....................................................................................................

Figura 11: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos metabólitos derivados da via da COX e receptores muscarínicos na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato..........................................................................................................

45 55 65 67 70 73 75 76 78 79 80

Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato ..........................................................................

Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos subtipos de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato ..................................................... Figura 14: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da reatividade vascular aguda para a FEN em anéis de artéria mesentérica superior, com (A) e sem (B) endotélio funcional, de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT ................................................................................................... Figura 15: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da reatividade vascular aguda para a ACh em anéis de artéria mesentérica superior com endotélio funcional (A) e para o NPS em anéis sem endotélio funcional (B), de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT ....................

Figura 16: Representação esquemática do protocolo experimental após a administração de CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.) para avaliação da atividade comportamental (A) e da letalidade e toxicidade dos órgãos vitais (B) em camundongos machos e fêmeas ...........................

Figura 17: Representação esquemática do protocolo experimental para registro da pressão arterial média (PAM) e frequencia cardíaca (FC) em rato normotensos e hipertensos acordados, não-anestesiados e com livre movimentação ......................................................................

81 83 84 86 89 91

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria de aorta torácica isolada de ratos com endotélio intacto (�) ou endotélio ausente (�), pré-contraídos com FEN (10 µM). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 05 experimentos. *p<0,05 vs endotélio intacto ..................................................................................... Gráfico 2: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (10 µM) de ratos normotensos (controle) (�) e hipertensos (L-NAME) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. * p<0,05 vs normotensos ..........................................................................

Gráfico 3: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com do endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de ChTX (100 nM) mais apamina (100 nM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 04 experimentos, respectivamente ................................. Gráfico 4: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença indometacina (10 µM) mais atropina (1 nM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente .................................

Gráfico 5: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (controle) (�) ou na presença de [K+]e = 20 mM (�).Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto ..........

Gráfico 6: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de TEA (1 mM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 09 experimentos,

95 96 97

98 99

respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto .................................

Gráfico 7: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de 4-aminopiridina (1 mM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. *** p<0,001 vs endotélio intacto ..........

Gráfico 8: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de glibenclamida (10 µM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. * p<0,05 vs endotélio intacto ..............

Gráfico 9: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de BaCl2 (30 µM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. ** p<0,005 vs endotélio intacto ...........

Gráfico 10: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da � de contração dos valores absolutos de 05 experimentos. * p<0,05 vs controle ..............................

Gráfico 11: Curvas concentração-resposta para a ACh (3x10-10 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. * p<0,05, ** p< 0,001 e *** p<0,0001 vs controle ............................................................

Gráfico 12: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da � de contração dos valores absolutos de 05 experimentos ................................................................

100 101 102 103 105 107 109

Gráfico 13: Curvas concentração-resposta para o NPS (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos ..............................

Gráfico 14: Efeito do CMMTT (10-6 M) e ACh (10-5 M) sobre a mobilização de Ca2+ intracelular em cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica isolada de rato, após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 M) (n=4). * p<0,05 vs linha de base ........................................................................................................

Gráfico 15: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com DMSO, ACh (10-5 M), ou CMMTT [10-6 e 10-5 M] na presença do endotélio (após 30 minutos de incubação) ou após a remoção do endotélio (n=4). ** p<0,001 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN; +++ p<0,0001 vs Linha de Base e ### p<0,0001 vs endotélio removido ......

Gráfico 16: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em anéis de aorta torácica isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 e 10-5 M), após 30 (A) e 60 minutos (B) ou após a remoção do endotélio (C) (n=4). * p<0,05 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN, + p<0,05 vs Linha de Base e # p< 0,05 vs FEN + Ach ou FEN+CMMTT ....................................................................................

Gráfico 17: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 e ** p<0,01 vs controle....................................................................................................

Gráfico 18: Valores médios percentuais da pressão arterial sistólica pela medida de pressão caudal em animais em ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 14 animais por grupo. *** p<0,0001 vs SHAM ..........

111 112 114 116 122 123

Gráfico 19: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs SHAM ..........................

Gráfico 20: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (LL) e hipertensos (LH). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs LL...............................................

125 127

1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento e implementações de estudos científicos efetivos sobre o

sistema cardiovascular baseiam-se na relevância entre função, disfunção e

incapacidade, bem como na busca, identificação e resolução de problemas no âmbito

terapêutico, contribuindo para a promoção da saúde e prevenção de doenças.

O sistema cardiovascular além de fornecer um fluxo de sangue para tecidos e

órgãos periféricos, suprindo suas demandas metabólicas, é o principal responsável pela

regulação, controle e manutenção da pressão arterial (PA), uma das funções

fisiológicas mais complexas do sistema biológico (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA,

2001, INOUE et al., 2006).

A PA é diretamente influenciada pelo produto do débito cardíaco (DC) pela

resistência vascular periférica total (RVPT), onde o DC é determinado pelo produto

entre o volume de ejeção sistólico (VES) e freqüência cardíaca (FC) (OASTES, apud

HARDMAN et al., 1996). Além destes fatores determinantes da manutenção da PA

outros sistemas também exercem influência no controle e regulação da PA, como o

sistema neural, renal, endócrino e cardiovascular (CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA,

2001).

O sistema neural representado pelos barorreceptores, quimioreceptores e

receptores cardiopulmonares que respondem rapidamente às modificações na pressão

arterial, sendo responsável pelo controle a curto prazo (HEYMANS; NEIL, 1958); o

sistema renal, um importante mecanismo de controle que pode ser representado pelo

controle hemodinâmico que regula a PA a longo prazo e é determinada pelo balanço

hídrico dos fluidos corporais (INOUE et al., 2006), e o controle hormonal, representado

pelo sistema renina-angiotensina (CONTRERAS et al., 2003); o sistema endócrino

exerce uma importante participação com ativação e liberação de hormônios que vão

interferir sistemicamente na modulação da PA, como por exemplo o sistema simpático

(adrenalina e noradrenalina) (LI et al., 2008) e o hormônio antidiurético (RUSSELL,

2007); e os mecanismos intrínsecos do sistema cardiovascular, onde se destacam

substâncias vasoativas produzidas localmente pelo endotélio (ação autócrinas e

parácrinas) que contribui com a homeostase vascular por produzirem alterações na

RVPT e modular a PA (EVORA et al., 1995, GROSS; AIRD, 2000).

Muitas substâncias derivadas do endotélio parecem estar envolvidas na

modulação fisiológica do controle local do tônus e do fluxo vascular. Estas substâncias,

que são, em alguns casos, produzidas continuamente pelas células endoteliais em

pequenas quantidades, podem ser liberadas em quantidades bem maiores por

estímulos de agonistas ou alterações no fluxo sanguíneo, exercendo função essencial

na regulação e modificações tensionais no músculo liso vascular, alterando as taxa de

fluxo sanguíneo local e, consequentemente, interferindo no controle da PA

(FURCHGOTT et al., 1980; REES et al., 1989, BEVAN; HENRION, 1994, EVORA et al.,

1995, GROSS; AIRD, 2000).

O músculo liso vascular consiste principalmente de células musculares lisas e

matriz extracelular que forma a camada média da parede dos vasos sanguíneos. A

musculatura lisa vascular apresenta importância fisiológica determinante,

desempenhando um importante papel nos vasos sanguíneos, devido as suas

propriedades contráteis, o mesmo tem capacidade de regular de maneira dinâmica o

volume luminal e, consequentemente, a resistência ao fluxo sanguíneo do sistema

vascular (JACKSON, 2000).

Em relação ao músculo liso vascular, artéria de grande condutância, como a

aorta, contém múltiplas camadas de células musculares lisas alternadas por lâmina

elástica conferindo uma maior força para estes vasos resistirem às pressões

hemodinâmicas sanguíneas, que saem do coração. Já as artérias de resistência

apresentam camada de células musculares de densidade variada e são responsáveis

pelo controle da pressão sanguínea (CRIBBS, 2006).

A regulação do tônus das células musculares lisas vasculares é dependente de

uma complexa interação de substâncias vasoativas como: estímulos de hormônios

circulantes, neurotransmissores, fatores derivado do endotélio e da pressão arterial,

que integrados, resulta em um diâmetro vascular e resistência dos vasos sanguíneos.

(JACKSON, 2000; CRIBBS, 2006).

Disfunções que desencadeiam alterações no controle da pressão arterial podem

vir a repercutir no desequilíbrio da relação vasodilatação vs vasoconstrição, alterando o

tônus basal dos vasos e, portanto, promovendo um desequilíbrio sobre RVPT e sobre a

complacência venosa (TAKESHITA; MARK, 1979), que por um período prolongado

acometerá a instalação de um quadro hipertensivo (PAGE, 1987).

A regulação da resposta contrátil do músculo liso é dependente do aumento da

[Ca2+]i, enquanto o relaxamento, como anteriormente mencionado, é devido à

diminuição deste íon livre nas células do músculo liso vascular.

Os estímulos que desencadeiam o aumento deste mensageiro secundário, no

processo de contração do músculo liso vascular, envolvem dois tipos de acoplamento: o

eletromecânico, quando a contração envolve a mudança no potencial de membrana

(Vm) e o fármaco-mecânico, quando a contração é evocada por um agonista ligado a

um receptor sinalizando uma resposta final (REMBOLD, 1996).

O controle do potencial de membrana é crítico para determinar a contração do

músculo liso vascular, uma vez que alterações no potencial de membrana das células

levam a ativação dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem que representam o

principal mecanismo de influxo de Ca2+ no músculo liso vascular (HUGHES, 1995). O

mecanismo que promove o aumento da [Ca2+]i através do acoplamento fármaco-

mecânico envolve a formação de segundos mensageiros como o inositol trifosfato (IP3)

e diacilglicerol (DAG), a partir da ligação do agonista ao receptor promovendo a

ativação da proteína Gq-Fosfolipase C (FLC). O IP3 pelo seu caráter hidrofílico, difunde-

se pelo citoplasma liga-se a um receptor específico no retículo sarcoplasmático

aumentando a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares (GRIDER; MAKHLOUF,

1988; IINO, 1990; UREÑA et al., 2007). O próprio cálcio também age como mensageiro

secundário, induzindo a liberação de mais Ca2+ ligando-se aos receptores de rianodina,

também localizados no retículo sarcoplasmático (KOMORI et al, 1995).

O aumento da [Ca2+]i é um sinal essencial para iniciar a resposta contrátil do

músculo liso vascular que ocorre como resultado da liberação de Ca2+ de estoque

intracelulares, influxo de Ca2+ extracelular, ou ambos (SOMLYO; SOMLYO, 1994)

facilitando a interação do complexo (Ca2+)4-CaM (Calmodulina), que ao sofrer uma

alteração conformacional, ativa a quinase da cadeia leve da miosina (MLCK), e, esta

por sua vez, irá fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC20), favorecendo o

deslizamento dos filamentos de actina sobre os de miosina e gerando

conseqüentemente a força de contração do músculo liso (JOHNSON; SNYDER, 1995).

A [Ca2+]i nas células do músculo liso vascular depende de mecanismos que

mobilizam e regulam os seus níveis, promovendo aumento ou diminuição da

concentração deste íon livre no citoplasma. Alterações neste mecanismo tem sido

associadas ao aumento da reatividade vascular e da [Ca2+]i em modelos experimentais

de hipertensão (BOHR; WEBB, 1984; KWAN, 1985). A [Ca2+]i em células do músculo

liso de ratos hipertensos em condições basais tem sido demonstrada estarem elevadas

(SUGIYAMA et al., 1986; BENDHACK et al.,1992; CORTES et al.,1997).

Revestindo internamente as camadas do músculo liso e em contato direto com o

fluxo sanguíneo encontra-se o endotélio vascular que é uma única camada de células

que não constitui simplesmente uma membrana de diálise, mas possui intensa

atividade metabólica. O endotélio intacto está envolvido na síntese e/ou no metabolismo

de diversos mediadores endógenos que induzem vasoconstrição, tais como: endotelina-

1 (ET1), PGH2, tromboxano A2 (TX A2) e ânions superóxido (O2-), e compostos que

induzem vasodilatação, como o óxido nítrico (NO), fator hiperpolarizante derivado do

endotélio (EDHF), prostaciclina (PGI2) (BATLOUNI, 2001; FURCHGOTT et al, 1980;

BEVAN; HENRION, 1994).

Em condições fisiológicas, existe uma liberação balanceada de fatores

relaxantes e contracturantes responsável pelo controle do tônus de repouso, e a

integridade do endotélio é essencial à regulação do tônus vascular, do fluxo sanguíneo,

da perfusão tissular e na proteção contra espasmo, trombose e a aterogênese

(BATLOUNI, 2001), e alterações decorrentes de doenças cardiovasculares como a

hipertensão, contribui para uma futura progressão do dano vascular e dos órgãos

nobres (BRUNNER et al., 2005).

Relatos na literatura têm mostrado a participação do endotélio vascular no

relaxamento induzido por uma variedade de substâncias químicas endógenas e

exógenas (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; COHEN; VANHOUTTE, 1995; CHAUHAN

et al., 2003; DIAS et al., 2007) e uma especial atenção está voltada para o óxido nítrico

(NO) que têm sido implicadas no relaxamento dependente do endotélio (MONCADA;

VANE, 1979; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 1988).

Em 1980, Furchgott e Zawadzki observaram o relaxamento induzido pela

acetilcolina, em resposta à ativação dos receptores muscarínicos, nas preparações

isoladas de aorta torácica de coelho mediado por um fator dependente do endotélio. A

importância deste Fator Relaxante Derivado do Endotélio (EDRF) foi intensificada

quando em 1987, se demonstrou que o EDRF era um gás extremamente lábil e reativo

com propriedades químicas e biológicas semelhantes às do óxido nítrico (NO)

(PALMER et al., 1987).

Posteriormente, foi observado que as células endoteliais eram capazes de

produzir NO a partir da oxidação de um dos átomos de nitrogênio guanidino terminais

do aminoácido L-arginina por uma oxigenase cálcio-calmodulina dependente: a sintase

de óxido nítrico (eNOS) (PALMER et al., 1988).

O NO sintetizado no endotélio vascular se difunde para o músculo liso e ativa a

ciclase de guanil solúvel, levando a um aumento nos níveis intracelulares de GMPc

(IGNARRO et al., 1986), induzindo relaxamento do músculo liso vascular através de um

mecanismo mediado por proteínas quinases dependentes de GMPc (PKG). Um dos

alvos da PKG é a fosfatase de da cadeia leve da miosina que quando ativa resulta em

desfosforilação da cadeia leve da miosina (MLC), promovendo assim, o relaxamento do

músculo liso vascular (SURKS et al., 1999). Outros alvos da PKG é a bomba de Ca2+

presente na membrana plasmática e na membrana do retículo endoplasmático,

denominada SERCA, que após sua fosforilação vai diminui a concentração intracelular

de cálcio ([Ca2+]i). Esta proteína cinase ativa promove também, a abertura de canais

para potássio (K+) na membrana plasmática hiperpolarizando as células muscular lisa e

indiretamente inibe os canais para Ca2+ dependentes de voltagem, do tipo L; e

finalmente, ativa o trocador Na+/Ca2+ (BLAUSTEIN, 1989).

Bolotina et al. (1994) propuseram que o NO poderia ativar diretamente canais

para K+ presentes na membrana plasmática do músculo liso vascular, levando a uma

hiperpolarização e relaxamento das células musculares lisas.

Os canais para K+ são reguladores importantes do tônus arterial e com isso, do

diâmetro dos vasos sanguíneos. A abertura dos canais para K+ nas células musculares

lisas leva ao aumento no efluxo de K+, causando repolarização ou hiperpolarização do

potencial de membrana. Estes eventos culminam com o fechamento dos canais para

Ca2+ sensíveis a voltagem, podendo levar a vasodilatação (NELSON; QUAYLE, 1995;

THORNELOE; NELSON, 2005).

Segundo as normas de nomenclatura da União Internacional de Farmacologia,

os canais para K+ são classificados em quatro subgrupos: Canais sensíveis a voltagem

(Kv), canais ativados por Ca2+ (Kca), canais retificadores de entrada (Kir) e canais para

dois poros (K2p). Estes canais estão distribuídos em vários tecidos, incluindo o músculo

liso vascular (WEI et al., 2005; GUTMAN et al., 2005; KUBO et al., 2005).

Ao longo dos anos, estudos vêem sendo realizados para elucidar as

modificações envolvidas na redução do relaxamento dependente do endotélio vascular

observado na hipertensão. A resposta relaxante induzida por ACh pode variar em

diferentes modelos de hipertensão. Esse efeito foi inicialmente observado por Konishi e

Su em 1983, onde foi identificada uma resposta relaxante diminuída induzida por

acetilcolina em aortas de ratos espontaneamente hipertensos (SHR). A partir destes

estudos, outros autores também observaram que resposta a acetilcolina esta diminuída

em artérias isoladas de ratos hipertensos renais 1-rim – 1-clip (1R-1C), na hipertensão

induzida por desoxicorticosterona (Doca-sal), SHR e SHR susceptível a acidente

vascular cerebral (SHRSP) (BELL; BOHR, 1991; CRESPO et al.,1996; KÄHÖNEN et

al., 1994; WU et al., 1996; TESFAMARIAM; HALPERN, 1988; SUNANO et al., 1999;

CHAMIOT-CLERC et al., 2001).

A menor resposta relaxante, induzida por acetilcolina, em artérias de animais

hipertensos tem sido atribuída à diminuição da liberação de NO e EDHF (MANTELLI et

al., 1995; RESS et al., 1990; NISHIDA et al., 1998; SUNANO et al., 1999; MILLETTE et

al., 2000). No entanto, a redução ou o aumento da reatividade a um agente vasoativo

(vasodilatadores e vasoconstrictores) varia entre os diferentes modelos de hipertensão,

bem como, durante as diferentes fases de desenvolvimento do processo hipertensivo,

ou ainda, entre os diferentes leitos vasculares (BOHR et al., 1991; TOSTES et al.,

1997).

A hipertensão arterial sistêmica é caracterizada por um complexo contexto, com

alterações hemodinâmicas, tróficas e metabólicas, entre as quais se menciona a própria

elevação dos níveis tensionais, a atividade aumentada dos fatores de coagulação,

inflamação, estresse oxidativo, a redução da complacência arterial e a hipertrofia com

alteração da função diastólica do ventrículo esquerdo, que implicam em uma condição

patológica grave (JULIUS, 2007).

O desenvolvimento de hipertensão depende da interação entre predisposição

genética e/ou fatores ambientais. A hipertensão arterial pode apresentar-se de duas

formas, primária ou essencial e secundária ou adquirida. A hipertensão essencial

caracteriza-se por uma elevação da pressão sangüínea sem causa aparente, e está

associada a vários fatores de risco como: uma predisposição genética, obesidade,

consumo elevado de álcool, de cigarro e inatividade física. No segundo caso, quando a

causa é identificável, a hipertensão é denominada secundária. Nesse caso, algumas

situações são passíveis de cura pela remoção do fator que a motivou, geralmente, tem-

se elevação da pressão sangüínea por ativação do sistema renina-angiotensina-

aldosterona (PAGE et. al., 1999).

Para melhor compreender os mecanismos envolvidos nestas disfunções,

modelos de hipertensão desenvolvidos em ratos, que exibem características em comum

com a hipertensão humana, são desenvolvidos e bastante utilizados (DOGGRELL;

BROWN, 1998). Existem dois tipos de modelos de hipertensão experimental, o modelo

de hipertensão primária, que corresponde a alterações genéticas e o modelo de

hipertensão secundária, induzida por manipulações farmacológicas ou cirúrgicas

(FREITAS, 2003).

Dentre os vários modelos de ratos geneticamente hipertensos, a linhagem de

ratos espontaneamente hipertensos (SHR), selecionada por Okamoto e Aoki (1963) a

partir da espécie Wistar Kyoto, é sem dúvida a espécie mais estudada. Outro modelo de

ratos geneticamente hipertensos são os ratos hipertensos de Lyon (LH) que

apresentam origem da espécie Sprague Dawley e foram obtidos por cruzamento

consaguíneo entre ratos apresentando diferentes níveis de pressão arterial (DUPONT

et al., 1973).

É relatado que a hipertensão essencial humana é um complexo de doenças que

resulta da interação de diversos genes com fatores ambientais (HARRAP et al., 1994) e os

animais hipertensos de Lyon se enquadram neste modelo de hipertensão essencial, sendo

caracterizado por níveis baixos de renina e elevada sensibilidade renal para angiotensina II

(SASSARD; MING; KIAO-LING, 2003).

A linhagem LH apresenta um modelo de hipertensão moderada caracterizado por

peso corporal elevado em comparação a linhagem de ratos normotensos de Lyon (LL)

(SASSOLAS et al., 1981). Além disso, foi relatada a existência de alterações na função

endotelial em aorta e artéria mesentérica (ramo de 2º e 3º ordem) destes animais e para

os ratos LH, uma maior reatividade a agonistas vasoconstritores com uma sensibilização

aumentada ao Ca2+ (FREITAS et al., 2003).

Diante da variedade de modelos de hipertensão secundária, um modelo bastante

estudado é o modelo da hipertensão renovascular dois rins e um clip (2R1C) descrita

inicialmente por Goldblatt et al., 1934 e adaptada por Shaffenburg (1959) para animais

de pequeno porte que não apresenta componentes genéticos para a elevação da

pressão arterial sistêmica. Este modelo de hipertensão é induzido cirurgicamente pela

constrição da artéria renal esquerda, induzindo a isquemia renal e, consequentemente,

ativando um dos sistemas vasoconstrictores muito potente do organismo, que é o

sistema renina-angiotensina-aldosterona (PRIETO-CARRASQUERO et al., 2008).

Ainda neste modelo, são considerados três estágios temporais no

desenvolvimento e manutenção da hipertensão. A primeira fase consiste de um período

de aproximadamente quatro semanas após a indução cirúrgica da hipertensão e nesta

fase é observado um aumento da atividade do sistema renina-angiotensina (SRA)

plasmática e tecidual (aorta, mesentérica e pulmão). Na segunda fase, que se estende

da quarta a oitava semana, a atividade do SRA esta normalizada tanto para o plasma

quanto para os tecidos. A terceira e última fase, que é computada a partir da nona

semana da indução, observa-se novamente aumento da atividade da enzima

conversora da angiotensina (ECA) (OKAMURA et al., 1986; MARTINEZ-MALDONADO,

1991).

O sistema renina-angiotensina é ativado pela sensibilização das células

justaglomerulares renais. A isquemia renal é um dos principais estímulos para a

liberação da renina que irá atuar na conversão do angiotensinogênio, um substrato

plasmático, em um polipeptídeo, a angiotensina I. Este polipeptídeo apresenta

características bastante instáveis, sendo rapidamente convertido por ação da ECA em

angiotensina II, principalmente no endotélio dos capilares pulmonares. Sabe-se que a

vida média da angiotensina II é muito breve, sendo degradada em outros peptídeo de

menor peso molecular; porém, enquanto ativa, exerce um potente efeito vasoconstrictor

na circulação sistêmica e renal (CONTRERAS et al, 2003).

No modelo de hipertensão 2R1C foi observado em vários trabalhos a redução da

resposta relaxante dependente do endotélio em anéis de artérias aorta e mesentérica,

estudos estes, realizados até a quarta semana ou a partir da décima semana após a

indução da hipertensão (CAUVIN; PEGRAM, 1983; DOHI et al., 1991).

Outro modelo que também simula a hipertensão secundária, é a hipertensão NO-

deficiente, induzida pela inibição crônica da biossíntese do NO pela administração de

um inibidor da eNOS, como por exemplo o NG-nitro-L-arginina methyl ester (L-NAME),

por exemplo (MOORE et al., 1990; REES et. al., 1990). Esta hipertensão é iniciado por

uma redução da vasodilatação NO-dependente, sendo mantida a participação do SRA

e o sistema nervoso simpático (SNS) (CUNHA et al., 1993; SANDER et al., 1995;

ZANCHI et al., 1995; SANDER; VICTOR, 1999) resultando em alterações metabólicas,

hipertensão e hipertrofia do miocárdio (BERNÁTOVÁ et al. 1999b, KUNEŠ et al. 2004).

O aumento na pressão arterial é acompanhado por um aumento na resistência vascular

e diminuição no fluxo sangüíneo em vários leitos vasculares (leito vascular renal e

mesentérico), e depressão do débito cardíaco (GARDINER et. al., 1990).

Vários autores observaram neste modelo de hipertensão uma elevação de

vasoconstrição e atenuação de vasorelaxamento em diferentes leitos vasculares,

aumento da atividade simpática e alterações no sistema renina-angiotensina em ratos

tratados L-NAME (JOVER et al. 2001, BERNÁTOVÁ et al. 2002, KUNEŠ et al . 2004,

ROSSONI et al. 2007).

O fator comum aos diferentes modelos de hipertensão estudados, bem como a

hipertensão arterial em humanos é que se trata de uma patologia cardiovascular

crônica, não transmissível, com características multifatorial, multicausal e assintomática

(DREXLER; HORNIG, 1999).

O desencadeamento de doenças cardiovasculares, ressaltando a hipertensão

arterial, adquiriu uma maior importância durante o século XX, com o aumento da

expectativa de vida da população, e tem despertado interesse científico especial por

atingirem grandes contingentes populacionais (SIMÃO et al., 2002).

Com o avanço da síntese orgânica, os produtos sintéticos começaram a se

destacar em diversidade e em competitividade comparado aos produtos naturais em

diversos setores industriais. No setor farmacêutico, por exemplo, predomina atualmente

o uso de insumos sintéticos enquanto que o uso de produtos naturais predominou na

primeira metade do século passado (FERREIRA et al., 1997).

Atualmente, a síntese orgânica é uma área de interface entre a química e a

biologia, dando origem a novas áreas, nomeada química medicinal.

Diante dos avanços científico-tecnológicos observados em diversas áreas como

a biologia estrutural, molecular e a química computacional, por exemplo, o

planejamento racional de novos fármacos tornou-se uma realidade, cujos fármacos de

origem sintética representam significativa parcela do mercado farmacêutico, e a síntese

destes fármacos pode ser considerada uma aplicação nobre, por permitir o acesso a

substâncias terapeuticamente úteis, com níveis de complexidade variáveis. Sua

aplicação na busca de novos protótipos de fármacos representa uma grande parcela

dos medicamentos disponíveis para uso clínico e movimenta cifras elevadas dentro do

mercado mundial (BARREIRO, 2002; LIMA, 2007).

De fato, entre os principais alvos escolhidos pelos químicos orgânicos sintéticos

ao longo dos anos, encontravam-se os produtos de cuja complexidade estrutural,

potência e diversificadas atividades biológicas/farmacológicas despertassem um grande

interesse científico e medicinal, como os esteróides, prostaglandinas, anti-hipertensivos,

substâncias macrocíclicas com ação antibiótica e anti-câncer, dentre outros que

propiciam o desenvolvimento de novos medicamentos, defensivos agrícolas, produtos

de aplicabilidade médica, eletroeletrônica, magnética (CORREIA et al., 2002).

A química medicinal engloba o planejamento racional de novas substâncias

bioativas, envolvendo a síntese ou a modificação molecular de substâncias; o

isolamento ou modificações de princípios ativos naturais (plantas, animais, minerais); a

identificação ou elucidação da estrutura; a descrição das moléculas desde a sua

constituição atômica até as suas características estruturais quando da interação dos

diferentes sistemas biológicos; a compreensão em nível molecular de processos

bioquímicos/farmacológicos, toxicológicos e farmacocinéticos. E, finalmente,

proposições e validações de modelos matemáticos através dos estudos de relação

entre a estrutura química e a atividade farmacológica e/ou toxicológica, permitindo

então a proposição de novas entidades de interesse. Esta área de conhecimento,

utilizando diferentes estratégias metodológicas complementares, é tradicional e

reconhecidamente usada no planejamento de fármacos visando sua aplicabilidade na

terapêutica (AMARAL; MONTANARI, 2002).

Algumas doenças que são reconhecidamente como uma entidade de prevalência

elevada, como a hipertensão, podem ser bem controlada pela utilização de drogas

capazes de diminuir a pressão arterial, no entanto seu tratamento continua

insatisfatório, devido a ineficácia das drogas atuais reduzirem os riscos das doenças

cardiovasculares e danos nos órgãos afetados.

Este fato tem levado a busca de novas classes de medicamentos que possam

modificar tanto o aumento da pressão sanguínea como as anormalidades funcionais e

estruturais relacionadas principalmente ao coração e aos vasos sanguíneos (ZAMAN et

al., 2002).

Centenas de compostos farmacologicamente importantes são estruturalmente

derivados de heterocíclicos (POZHARSKÜ et al.,1997). A síntese de compostos

heterocíclicos medicinais levou a diminuição da mortalidade causada por várias

doenças sendo, portanto, de suma importância o estudo destes compostos. Neste

contexto, uma classe de compostos heterocíclicos que têm recebido muita atenção é a

dos compostos mesoiônicos (NEWTON; RAMSDEN, 1982).

Em 1882, Ficher e Besthorn foram os primeiros a descrever a síntese de um

composto mesoiônico seguindo esta linha de pesquisa, Max Busch, durante o período

de 1895-1905, descreveu a preparação e as propriedades químicas de vários

mesoiônicos heterocíclicos (NEWTON; RAMSDEN, 1982). Porém, somente em 1946

Simpson utilizou o termo “mesoiônico” para descrever um tipo de molécula que não

poderia ser representada por uma estrutura covalente, com características

mesoméricas e iônicas (KIER; ROCHE, 1967, NEWTON; RAMSDEN, 1982). Alguns

anos depois Baker e Ollis (1955) complementaram a definição sugerindo que um

composto pode ser chamado de mesoiônico se apresentar uma estrutura heterocíclica

com cinco ou seis membros, que não pode ser satisfatoriamente representada por uma

estrutura polar ou covalente. Deve possuir também, um sexteto de elétrons π em

associação com todos os átomos que constituem o anel. Este deve apresentar ainda,

carga positiva ou negativa e um átomo ou grupo de átomos ligados ao anel deve ter

carga oposta.

Estes compostos foram ao longo dos tempos sendo definido por diferentes

autores que visavam diferentes aspectos estruturais da molécula, e Joseph Miller

(1996) atribuiu uma definição referente aos aspectos químicos:

Compostos mesoiônicos são betaínas heterocíclicas planas de cinco membros

com, pelo menos, uma cadeia lateral, cujo átomo α também esta no mesmo

plano do anel [...] Os elétrons estão deslocalizados sobre duas regiões

separadas por duas ligações essencialmente singelas. Uma região, que inclui o

átomo “a”, na cadeia lateral, está associada com o HOMO e uma carga π

negativa enquanto a outra esta associada com o LUMO e uma carga π positiva.

(LIRA et al, 2002, p. 02).

Os compostos mesoiônicos podem ser representados esquematicamente pela

estrutura mostrada na figura 1, onde as letras de “a” até “f” representam átomos como:

carbono, nitrogênio, oxigênio e enxofre seguidos de seus respectivos substituintes,

específicos para cada tipo de composto (OLLIS; RAMSDEN, 1976, NEWTON;

RAMSDEN,1982).

Figura 1. Representação esquemática de um composto mesoiônico Fonte: OLLIS; RAMSDEN, 1976, NEWTON; RAMSDEN,1982.

Até o ano de 1982, foram relatados mais de sessenta compostos mesoiônicos,

na qual se classifica os diferentes sistemas em: oxazóis, dioxóis, diazóis, tiazóis, ditióis,

oxadiazóis, oxatiazóis, triazóis, tiadiazóis, oxatriazóis, tetrazóis, tiatriazóis, oxatióis,

selenazois e ditiadiazóisoxazóis, diazóis, tiazóis, ditióis, tiadiazóis e tetrazóis (OLLIS;

RAMSDEN, 1976, NEWTON; RAMSDEN, 1982).

Em relação à atividade biológica, quatro classes de compostos mesoiônicos têm

sido destacadas na literatura: sidnonas (1,2,3-oxadiazólio-5-olatos), primeira classe de

compostos mesoiônicos sintetizada e também a mais estudada até a atualidade (EARL;

MACKNEY, 1935); sidnoniminas (1,2,3-oxadiazólio-5-aminidas) e os oxatriazóis,

ambas, embora menos estudada que as sidnonas, incluem derivados que exercem

efeitos biológicos importantes, principalmente no sistema cardiovascular com

propriedades doadora de NO devido à fácil clivagem da ligação (= N-NO) de suas

estruturas (ELMEDAL; MULVANY; SIMONSEN, 2005, REHSE et al., 1993 a, b, c); e os

1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos (KIER; ROCHE, 1967). Estes compostos apresentam

características em comum que podem justificar sua aplicação terapêutica, como uma

estrutura relativamente pequena e caráter aromático planar que permitem melhor

interação com macromoléculas biológicas (KIER; ROCHE, 1967).

A variação da densidade eletrônica em torno do anel e a presença de regiões

distintamente carregadas, as quais conferem à estrutura um alto momento de dipolo,

possibilitam interações eletrostáticas com biomoléculas como o DNA e proteínas. Outro

aspecto físico-químico importante para sua função é o caráter global neutro destas

estruturas o que permite que estes compostos atravessem membranas biológicas

(KIER; ROCHE, 1967; OLLIS; RAMSDEN, 1976; NEWTON; RAMSDEN, 1982).

Substâncias químicas pertencentes aos compostos derivados do sistema

mesoiônico, são reportado na literatura, como sendo estruturas químicas sintéticas que

apresentam uma variedade de propriedades químicas e atividade biológica

comprovada, a depender da natureza dos substituintes do anel, o que levou, em alguns

casos, ao registro de patente (OLLIS; RAMSDEN, 1976).

Estes compostos heterocíclicos destacam-se por serem mencionados na

literatura científica com propiedades antitumoral, antifúngica, antimalárica (HILL, 1957),

além de derivados do 1,3,4 – tiadiazólio – 2 tiolato com atividade antibactericida (gram-

positivas e gram-negativas) (BARBOSA, 1979), das sidnonas e das classes 3 –

(dietilaminoetil) – 4 – metil 1,2,3 – oxadiazólio – 5 olato com atividade analgésica

(WAGNER, HILL , 1974 ; BRUZZESE, 1965 ; YASHUSKII; KHOLODOV, 1980), os

derivados da 3 – (2 – ariltio) – etil – 1,2,3 – oxadiazólio – 5 – olato com atividade

antiinflamatória (HILL, 1957 ; WAGNER, HILL, 1974), o cloridrato do mesoionico 3 –

(fenilisopropil) – 1,2,3 – oxadiazólio – 5 – imideto anticonvulsivante e antidepressiva

(WAGNER, HILL, 1974 ; BRUZZESE et al., 1965 a); o 3-(p-metoxibenzil)-sidnona

possuia atividade contra carcinoma 755 em camundongos (GRECO et al., 1962) e

outros autores sintetizaram quatorze derivados do 3-aminoalquil-sidnona e dentre estes

alguns compostos apresentaram ação analgésica, antiinflamatória e hipoglicemiante,

além de agirem sobre o sistema nervoso central de forma excitante ou depressiva

(BRUZZESE et al., 1965 b). Um derivado das sidnoniminas destacada atividade

biológica do molsidomina (N-etoxicarbonil)-3-morfolinosidnonimina, utilizada no

tratamento de pacientes com Angina de Peito (MAJID et al., 1980), o 3-arilalquil-N-X-5-

sidnoniminas apresenta efeito antitrombótico e vasodilatador (REHSE et al., 1993 d),

derivados oxatriazóis denominados compostos GEA (derivados 3-aril substituídos

oxatriazóis-5-imina) mostraram-se como potentes agentes anti-agregante plaquetário,

fibrinolítico, trombolítico e broncolítico, in vivo e in vitro, os autores classificaram estes

compostos como “doadores de NO” (CORELL et al.,1994) e o mesoiônico 1,4 – difenil –

5 – (5 – nitro – 2 furanil) – 1,3,4 – tiazólio – 2 – tiol, revelou possuir potente ação

espasmolítica em musculatura lisa, tanto na traquéia de cobaia como em útero de rata

(ATHAYDE-FILHO, 1999).

Em estudos realizados anteriormente no Laboratório de Tecnologia

Farmacêutica-LTF por Cavalcante et al. (2004) foi observado que o composto

mesoiônico – 2 – (4 – clorofenil) – 3 – metil – 4 – ( 4 – metoxifenil) – 1 ; 3 – tiazólio – 5 –

tiolato (CMMTT) (Quadro 1), utilizando estudos in vivo, promoveu efeito hipotensor e

taquicárdico em ratos normotensos, enquanto em estudos in vitro CMMTT induziu uma

potente atividade relaxante concentração-dependente em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato (pD2=10,26±0,05; Emax=80,8±5,8 %), pré-contraídos com FEN

com endotélio intacto e este efeito foi significativamente atenuado (p<0,01), na

presença do L-NAME (inibidor da sintase do NO), do ODQ (inibidor do monofosfato de

guanosina cíclico - GMPc solúvel), da hidroxocobalamina (seqüestrador do NO) e na

ausência do endotélio funcional, sem nenhuma diferença significativa entre eles. Estes

resultados sugerem que o efeito induzido pelo composto mesoiônico CMMTT é

decorrente de um aumento dos níveis NO no endotélio vascular com consequente

ativação da ciclase de guanilil solúvel e aumento nos níveis do nucleotídeo cíclico

(GMPc) intracelulares no músculo liso vascular para promover o seu potente efeito

vasorelaxante.

Diante as considerações apresentadas, o trabalho fundamenta-se nos estudos

prévios realizados, tendo em vista que a literatura disponível, não aborda trabalhos

efetivamente direcionados aos mecanismos moleculares ou às atividades

farmacológicas sobre o sistema cardiovascular, atribuídas ao composto mesoiônico em

estudo.

Portanto, a proposta de estudo enfoca aprofundar as investigações do seu

mecanismo de ação sobre o efeito relaxante atribuído ao CMMTT, além de estudar a

atividade hipotensora/anti-hipertensiva e reatividade vascular para diferentes agentes

vasoativos (vasoconstrictores e vasodilatadores), através de uma análise comparativa

em diferentes modelos de animais normotensos e hipertensos.

ASPECTOS QUÍMICOS

Nome: COMPOSTO MESOIÔNICO 2-(4-CLOROFENIL)-3-METIL-4-(4-

METOXIFENIL)-1; 3-TIAZÓLIO-5-TIOLATO

Nome simplificado: Composto Mesoiônico CMMTT

Fórmula Molecular: C17 H14 Cl N O S2

Estrutura Molecular:

Massa Molecular: 347,8

Aspecto: pó cristalino vermelho

Quadro 1: Aspectos químicos que caracterizam o composto mesoiônico CMMTT

N+

S

CH3

Cl

O

CH3

SHS -

1

2 3

4

5

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos por CMMTT em animais

normotensos e hipertensos, procurando elucidar o possível mecanismo de ação

implicado nas respostas biológicas observadas, utilizando para este fim uma

abordagem in vivo e in vitro.

2.2 Específicos

� Caracterizar o efeito relaxante de CMMTT em aorta torácica isolada de rato

normotensos, através de medidas de tensão isométrica;

� Investigar o envolvimento das prostaciclinas e dos receptores muscarínicos na

resposta relaxante induzida pelo CMMTT em artéria mesentérica superior isolada

de ratos normotensos;

� Identificar a participação dos EDHF na resposta relaxante atribuída ao CMMTT

em artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso;

� Avaliar a participação dos canais para K+ no efeito relaxante em artéria

mesentérica superior isolada de rato normotenso, induzido pelo CMMTT;

� Registrar o efeito relaxante de CMMTT em artéria mesentérica isolada de ratos

hipertensos;

� Demonstrar o efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para FEN,

NPS e ACh em animais normotensos e hipertensos L-NAME;

� Estudar o efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica

superior isolada de rato através de medidas de quimioluminescência;

� Inferir sobre a influência do CMMTT na mobilização do Ca2+ em células primárias

endoteliais de artéria mesentérica de rato, utilizando técnica bioquímica com

sonda de fluorecência FURA-2/AM;

� Analisar a toxicidade aguda de CMMTT em camundongos;

� Investigar os efeitos de CMMTT sobre a pressão arterial (PA) e freqüência

cardíaca (FC) em ratos normotensos (LL, SHAM) e hipertensos (LH, 2R1C e L-

NAME) não-anestesiados.

3 MATERIAL

3.1 Animais

Para a realização do presente estudo foram utilizados ratos Wistar (Rattus

norvegicus) (Figura 2A), ratos Sprague Dawley de Lyon (geneticamente modificados)

(Figura 2B), sendo todos machos, com idade entre 10-14 semanas, pesando entre 250-

300 gramas e camundongo (Mus musculus) machos e fêmeas, com idade de 10-12

semanas, pesando aproximadamente 25-35 gramas. Os animais foram provenientes do

Biotério Prof. Thomas George do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby

Fernandes Medeiros da Universidade Federal da Paraíba (LTF/UFPB). Para os estudos

bioquímicos foram utilizados apenas ratos Wistar (Rattus norvegicus), sendo estes

provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo (USP). Todos os animais foram mantidos sob condições

controladas de temperatura (21 ± 1ºC) e submetidos a um ciclo claro-escuro de 12

horas (fase clara de 6 - 18 horas), tendo livre acesso à alimentação (ração Purina) e

água.

Figura 2: Ratos Wistar (Rattus norvegicus) (A) e Ratos Sprague Dawley (B) Fonte: Próprio autor (A) e (www.scanbur.eu/images/products/Lab_animals_sp, 25/12/2007) (B).

3.2 Preparação da solução-estoque de CMMTT

O CMMTT (Quadro1) é uma substância de MM = 347,88, que foi sintetizada e

disponibilizada pelos professores Dr. Bruno Farias Lira e Dr. Petrônio Athayde-Filho,

ambos do Laboratório de Química pertencente ao Laboratório de Tecnologia

Farmacêutica Prof. Delby Fernandes Medeiros da Universidade Federal da Paraíba

(LTF/UFPB).

O composto mesoiônico foi solubilizado em cremofor (0,5%) e diluído em água

destilada até a concentração de 10–1 M (solução-estoque) e conservado em

temperatura controlada e ao abrigo da luz. Imediatamente antes da realização de cada

protocolo experimental, o composto era diluído em água destilada, para experimentos in

vitro, ou em solução salina, para experimentos in vivo, até as concentrações desejadas.

A B

3.3 Drogas utilizadas

Durante a realização dos experimentos, foram utilizadas as drogas que estão

elencadas na tabela 1:

Tabela 1: Drogas utilizadas durante a realização dos protocolos experimentais in vivo e in vitro

SUBSTÂNCIA

LABORATÓRIO

Tiopental sódico

Sal sódico de heparina

Oxitetraciclina

Nitroprussiato de sódico (NPS)

Cloridrato de L (-) fenilefrina (FEN)

Cloridrato de acetilcolina (ACh)

NG-nitro-L-arginina-metil éster (L-NAME)

Sulfato de atropina

Indometacina (Indo)

Apamina

Caribdotoxina (ChTX)

Brometo de tetraetilamônio (TEA)

4-aminopiridina (4-AP)

glibenclamida

Dimetil sulfoxido (DMSO)

Cremofor

Albumina sérica bovina (BSA)

Poli-L-lisina

Fura-2/AM

Cristália

Roche

Bayer

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

RBI

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Sigma

Para a preparação das soluções estoques, a indometacina foi dissolvida

juntamente com bicarbonato de sódio (NaHCO3) a 5% em água destilada e as demais

drogas foram dissolvidas somente em água destilada. Todas as soluções foram

mantidas a 0ºC. Para a preparação das concentrações desejadas, as drogas foram

diluídas em água destilada, para os experimentos in vitro, ou em solução salina a 0,9%

para os experimentos in vivo. O cremofor, DMSO ou NaHCO3 nas concentrações

utilizadas neste estudo, não apresentaram efeito sobre as preparações utilizadas

(dados não mostrados).

3.4 Soluções Fisiológicas

Cada protocolo experimental foi realizado na presença de soluções fisiológicas

específica para cada órgão ou condição experimental estudada. As tabelas mostram

detalhadamente os sais utilizados (Tabela 2), bem como a composição das soluções

utilizadas nas preparações de anéis da artéria mesentérica superior (Tabela 3 e 4) ou

aorta isolada de rato (Tabela 5) e nas preparações de células endoteliais de artéria

mesentérica superior ou aorta isolada de rato (Tabela 6).

Tabela 2: Relação dos sais para a preparação das soluções fisiológicas utilizadas nos experimentos in vivo e in vitro

SUBSTÂNCIA

LABORATÓRIO

Cloreto de sódio (NaCl),

Cloreto de potássio (KCl),

Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2.2H2O),

Sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO4.7H2O),

Cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O),

Glicose (C6H12O6),

Bicarbonato de sódio (NaHCO3),

Fosfato de sódio mono-hidratado (NaH2PO4.H2O)

Fosfato de potássio (KH2PO4)

Cloreto de bário (BaCl2)

EDTA

HEPES

MERCK

MERCK

MERCK

MERCK

MERCK

MERCK

VETEC

VETEC

VETEC

Sigma

Sigma

USB corporation

Tabela 3: Composição da solução de Tyrode (pH=7,4)

SUBSTÂNCIA CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 158,3

KCl 4,0

CaCl2 2,0

MgCl2 1,05

NaHCO3 10,0

NaH2PO4 0,42

Glicose 5,6

Fonte: TANAKA et al., 1999.

Tabela 4: Composição da solução de Tyrode despolarizante com KCl à 20mM (pH=7,4)

SUBSTÂNCIA CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 142,3

KCl 20,0

CaCl2 2,0

MgCl2 1,05

NaHCO3 10,0

NaH2PO4 0,42

Glicose 5,6

Fonte: Adaptado de TANAKA et al., 1999.

Tabela 5: Composição da solução de Krebs Henseleit (pH=7,4)

SUBSTÂNCIA CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 188

KCl 4,55

CaCl2 5,7

MgCl2 1,10

NaHCO3 25,0

NaH2PO4 2,52

Glicose 11

Fonte: OLIVEIRA et al., 1996.

Tabela 6: Composição da solução de Krebs despolarizante com KCl à 80mM (pH=7,4)

SUBSTÂNCIA CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 112,1

KCl 80,0

CaCl2 5,7

MgCl2 1,10

NaHCO3 25,0

KH2PO4 2,52

Glicose 11

Fonte: Adaptado de OLIVEIRA et al., 1996.

Tabela 7: Composição da solução de Hanks (pH=7,4)

SUBSTÂNCIA CONCENTRAÇÃO (mM)

NaCl 140

KCl 5,4

CaCl2 1,6

KH2PO4

NaH2PO4

EDTA

HEPES

0,44

0,42

0,03

5,0

NaHCO3 4,17

Glicose 5,5

Fonte: DIAS et al., 2007.

4 METODOLOGIA

Para o desenvolvimento deste estudo foram empregadas abordagens in vivo e in

vitro. Nos ensaios farmacológicos in vivo, foram usados animais não anestesiados

normotensos e hipertensos. Os modelos de hipertensão utilizados foram: a hipertensão

renovascular (2R1C), a induzida pela administração crônica de L-NAME e os animais

hipertensos geneticamente modificados de Lyon. Nos ensaios farmacológicos in vitro,

utilizou-se órgãos isolados e cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica

e aorta de rato. Os ensaios bioquímicos de medida da concentração do oxido nítrico

(NOx), bem como a medida de cálcio intracelular foram realizadas em colaboração com

a Universidade de São Paulo – Faculdade de Farmácia e Medicina de Ribeirão Preto.

Este trabalho foi executado de acordo com padrões éticos seguidos e aprovado

pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do LTF/UFPB, parecer NO. 0211/06.

4.1 Ensaios Farmacológicos in vivo

4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e toxicidade aguda do CMMTT em

camundongos

Nesta triagem, foram estabelecidos critérios comparativos para uma variedade

de comportamentos tipicamente animais. Por se tratar de uma observação comparativa

(grupo controle vs o grupo que recebe tratamento), a ocorrência de possíveis alterações

comportamentais em decorrência de tratamentos é possível inferir uma relação com

atividade no sistema nervoso central (SNC) (ALMEIDA et al., 1999).

A triagem farmacológica experimental foi realizada de forma preliminar, para

investigar se a administração de doses elevadas do CMMTT exerceria efeito lesivo e/ou

letal sobre os animais, permitindo a realização de estudos cardiovasculares in vivo com

doses mais seguras, bem como avaliar a influência do composto mesoiônico sobre

alguns comportamentos característicos exibido pelos animais e consequentemente sua

ação central.

Para a realização dos experimentos grupos de camundongos, machos e fêmeas,

em igual proporção, foram colocados em número de 03 por caixa (n=6 para cada grupo

estudado) e administrada na veia caudal (via i.v.) as doses de 50 e 100 mg/Kg do

CMMTT, separadamente para os animais experimentais e para o grupo controle o

veículo utilizado nas preparações. Os animais ficaram sob observação durante 4 horas

no primeiro dia e possíveis alterações ocorridas foram registradas de acordo com a

metodologia descrita por Almeida et al., (1999) e durante 48 horas subseqüente ao

teste, verificava-se a cada 12 horas as possíveis mortes. Passado um período de 14

dias da data do experimento, os animais foram eutanasiados para retirada e avaliação

da toxicidade aguda dos principais órgãos vitais.

4.1.2 Indução da hipertensão renovascular - 2R1C

Para obtenção de ratos com hipertensão renovascular do tipo dois rins e um clip

(2R-1C), foi utilizada a técnica descrita por Goldblatt et al., 1934 e adaptada por

Shaffenburg (1959) para animais de pequeno porte. Um grupo com 06 animais,

pesando aproximadamente 150 g, foi anestesiado com tiopental sódico (45 mg/Kg i.p.),

em seguida foi feita uma laparotomia mediana longitudinal para a exposição do

pedículo renal esquerdo, dessecação e colocação de um clip de prata (2x5 mm) com

0,2 mm de abertura, em torno da artéria renal esquerda. Em seguida, foi realizada uma

sutura da cavidade abdominal e o clip era mantido por um período de quatro semanas.

Outro grupo de animais, também passou pelo mesmo procedimento cirúrgico,

com o objetivo de submeter o animal ao mesmo estresse cirúrgico, no entanto, não era

inserido o clip de prata na artéria renal. Este grupo funciona como o grupo controle e

são denominados animais SHAM.

Todos os animais receberam um tratamento com antibiótico, para diminuir o risco

de infecção, numa dose única de 0,1 mL/100 g de peso do animal da suspensão de

Oxitetraciclina (Bayer) por via intramuscular para animais de pequeno porte.

A instalação da hipertensão era acompanhada semanalmente pelo registro da

pressão arterial caudal dos animais pelo método indireto de plestimografia de cauda

(Figura 3), em ratos acordados e imobilizados, por um período de quatro semanas. Os

ratos SHAM apresentaram uma pressão arterial média variando entre 110 – 120 mmHg

e os animais 2R1C foram considerados hipertensos quando os valores da pressão

arterial média foram superiores a 150 mmHg. Após a 4º semana de registro indireto da

pressão arterial, os animais em estudo foram submetidos a um novo procedimento

cirúrgico para implantação de cateteres e medida direta da pressão arterial.

Figura 3: Pletismógrafo de cauda para medida indireta da pressão arterial em ratos.

4.1.3 Indução da hipertensão L-NAME - 7 dias

Este modelo de hipertensão foi produzido com administração sub-crônica de um

inibidor da sintase do oxido nítrico, enzima esta, que catalisa a produção de um

importante mediador intracelular, o óxido nítrico (NO). Ratos pesando aproximadamente

250 g foram tratados com NG-Nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME), diluído em água

(0,5 mg/mL) ao longo de 7 dias, com livre acesso a comida e controlando-se

rigorosamente a ingesta da água + L-NAME, substituindo a preparação a cada dois dias

(VASQUEZ; ARAUJO, 1995), tempo suficiente para produção da hipertensão arterial

que foi monitorada com o método indireto de plestimografia de cauda (Figura 3). O

registro da PAS foi realizada em ratos acordados porém imobilizados. O peso dos

animais foi medido, a cada 2 dias. Após o 6º dia de tratamento sub-crônico com L-

NAME e registro indireto da pressão arterial, os animais em estudo foram submetidos a

um procedimento cirúrgico para medida direta da pressão arterial.

4.1.4 Medida direta da pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) em ratos

normotensos e hipertensos.

Todos os animais (normotensos e hipertensos) foram anestesiados com tiopental

sódico (45 mg/kg, i.p.), e cateteres de polietileno (PE), um segmento de PE-10

(diâmetro interno e externo de 0,28 e 0,61 mm, respectivamente), soldado a um

segmento de PE-50 (diâmetro interno e externo de 0,58 e 0,96 mm, respectivamente),

foram implantados na aorta abdominal e na veia cava inferior, via artéria e veia femoral

esquerdas, respectivamente. Após a inserção e fixação, os cateteres foram tunelizados

subcutaneamente e exteriorizados através de uma incisão na região cervical posterior

do animal (scapulae) (OLIVEIRA et al., 1996).

A pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) foram medidas 24 h após o

procedimento cirúrgico pela conexão do cateter arterial a um transdutor de pressão pré-

calibrado (Statham P23 ID; Gould, Cleveland, OH, EUA) acoplado a um amplificador

(Modelo TBM-4M, WPI, Sarasota, FL, EUA) e conectado a um micro-computador

equipado com placa conversora analógico-digital (CIO-DAS16/JR, Computer Boards,

Inc., Mansfield, MA, EUA) e com o programa CVMS (WPI, Sarasota, FL, EUA) (Figura

4). A freqüência escolhida para amostragem dos dados foi de 500 Hz. Para cada ciclo

cardíaco, o computador calculava a pressão arterial sistólica, diastólica e média, e o

intervalo de pulso (referido como freqüência cardíaca). O cateter venoso foi implantado

para a administração das drogas.

Como a anestesia modifica os níveis de PA e FC e altera o funcionamento dos

principais sistemas envolvidos na regulação da PA (FLUCKIGER et, al., 1985;

DORWARD et al., 1985; KORNER et, al., 1968; WHITE; MCRITCHIE, 1973; ZIMPFER

et al., 1982), foi utilizada a metodologia de medida da PA, 24h após a administração da

anestesia, em animais acordados, com livre movimentação e sem influência do estresse

cirúrgico nos parâmetros cardiovasculares (SMITH; HUTCHINS, 1980; FLUCKIGER et

al., 1985).

Figura 4: Sistema de aquisição de dados de pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos

4.2 Ensaios Farmacológicos in vitro

4.2.1 Preparações de anéis de aorta torácica isolada de rato

Os ratos após serem eutanasiados, foi realizada uma incisão na caixa torácica

do animal para retirada da aorta torácica (OLIVEIRA et al., 1996). Anéis aórticos (3-4

mm) eram cuidadosamente dissecados dos tecidos conectivos e adiposos. Os anéis

eram mantidos em cubas de vidro contendo 10 mL de solução de Kreb’s Henseleit, a

37º C e gaseificada com uma mistura carbogênica de 95 % de O2 e 5 % de CO2. Os

anéis eram suspensos por meio de duas hastes de platina inseridas no lúmen da aorta

e fixadas ao transdutor de força isométrica (UGO BASILE, 7004, Itália) (Figura 5). Cada

anel foi submetido a uma tensão inicial constante de 2 g por um período de 60 minutos

de estabilização. Durante este tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos

para prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Após o período de estabilização era induzida uma contração com a solução

despolarizante de KCl 80 mM e após a lavagem uma segunda contração tônica era

induzida pela administração de FEN 1 µM, para verificação da presença do endotélio

funcional. A presença de endotélio funcional foi verificada pelo relaxamento dos anéis

após adição de 10 µM de ACh. Foram considerados com endotélio, os anéis com

relaxamento superior a 70 % sobre a pré-contração com FEN. Já os anéis com

relaxamentos inferiores a 10 %, foram considerados sem endotélio (FURCHGOTT;

ZAWADZKI, 1980). Anéis com relaxamentos entre 10 e 70 % foram desprezados dos

protocolos experimentais. Uma terceira contração era induzida e o CMMTT (10-14 a 10-5

M) era adicionado cumulativamente. A porcentagem de relaxamento foi determinada

considerando que a contração induzida por FEN corresponde a 100 % e que a tensão

de repouso é igual a 0 %.

4.2.2 Preparações de anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato

Os ratos foram eutanasiados por deslocamento cervical seguida por secção dos

vasos cervicais. Através de uma incisão no abdome do animal, retirava-se a artéria

mesentérica superior. Anéis do primeiro segmento da artéria (1 - 2 mm) foram obtidos

livres de tecido conectivo e adiposo. Os anéis eram mantidos em cubas de vidro

contendo 10 mL de solução de Tyrode, a 37º C e gaseificada com uma mistura

carbogênica de 95 % de O2 e 5 % de CO2. Os anéis eram suspensos por linhas de

algodão fixadas a um transdutor de força acoplado a um sistema de aquisição (Miobath-

4, WPI, Sarasota, EUA) para o registro das tensões isométricas (Figura 5). Cada anel

foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de 60 minutos de

estabilização. Durante este tempo, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos para

prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Duas contrações tônicas submáximas a felinefrina (FEN) 10 µM, as quais se

estabilizam em torno de 25 minutos, foram registradas. A presença de endotélio

funcional foi verificada pelo relaxamento dos anéis após adição de 10 µM de acetilcolina

(ACh). Foram considerados com endotélio (E+), os anéis com relaxamento superior a

80 % sobre a pré-contração com FEN (adaptado devido a significativa dependência do

endotélio vascular para a resposta induzida pelo CMMTT). Já os anéis com

relaxamentos inferiores a 10 %, foram considerados sem endotélio (E-) e a remoção do

mesmo era obtido pelo leve atrito mecânico entre as paredes internas do vaso com uma

haste de metal (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Anéis com relaxamentos entre 10 e

70 % foram desprezados dos protocolos experimentais.

Uma terceira contração era induzida e o CMMTT (10-14 a 10-6 M) era adicionado

cumulativamente. A porcentagem de relaxamento foi determinada considerando que a

contração induzida por FEN corresponde a 100 % e que a tensão de repouso é igual a

0 %.

Figura 5: Sistema de aquisição de dados para órgão isolado.

4.2.3 Experimentos Bioquímicos

4.2.3.1 Preparação e carregamento de células endoteliais de artéria mesentérica

superior isolada de rato

4.2.3.1.1 Preparação das lamínulas

Em fluxo laminar, as lamínulas foram higienizadas com álcool 70% e expostas à

luz UV por 20 minutos. Em seguida foram adicionados 100 µL da solução (1/10) de poli-

L-lisina sobre as lamínulas, para adesão celular. Após 10 minutos o excesso foi

aspirado e as lamínulas permaneceram em fluxo laminar até a completa secagem.

4.2.3.1.2 Isolamento e cultura de células endoteliais de artéria mesentérica

superior torácica de rato

Os isolamentos das células endoteliais de mesentérica de rato foram realizados

de acordo com o método descrito por Hirano et al., (1993). Os ratos foram eutanasiados

por concussão cerebral seguida por secção dos vasos cervicais. Através de uma

incisão no abdome do animal, as artérias mesentérica superior foi retirada e isolada,

conforme descrito no item 4.2.1. Segmentos da artéria mesentérica de ratos foram

mantidos em solução de Hanks. Em seguida, foi seccionado ao meio, e seu interior foi

atritado mecanicamente com instrumento plástico semelhante a um pequeno “rodo”. As

células endoteliais ficaram dispersas no meio nutritivo de Hanks que foi centrifugado

por 5 minutos a 2000 rpm (Figura 6). O sobrenadante foi descartado e as células foram

cultivadas em lamínulas de 32 mm de diâmetro acondicionadas em placas de Petri. No

centro de cada lamínula foi semeado 200 µL da suspensão de células e mantidas em

estufa com atmosfera de CO2 5 % a 37 ºC, durante 4 horas para sedimentação e

adesão das células endoteliais antes de realizar o experimento.

4.2.3.2 Carregamento das células com a sonda de fluorescência Fura-2/AM

A medida da concentração citoplasmática de cálcio ([Ca+2]c) foi efetuada com o

indicador fluorescente de Ca+2, Fura-2, na forma acetoximetil éster (Fura-2/AM). Fura-2/AM é

um derivado do Fura-2, que tem 5 grupos acetoximetil éster ligados aos grupos COO- da

molécula de Fura-2, por ligações éster. Esta molécula é bastante hidrofóbica passando

facilmente através da membrana plasmática. Uma vez dentro das células, esterases

citoplasmáticas clivam os grupamentos acetoximetil da molécula de Fura-2, resultando em

um componente que é altamente carregado e que não pode cruzar outras membranas de

organelas intracelulares, ficando assim retida no citoplasma ligada com uma alta e específica

afinidade aos íons Ca+2 (GRYNKIEWICZ et al. 1985).

A solução estoque de Fura-2/AM 10 mM (dissolvida em dimetilsufóxido) foi diluída (1

µL) em 25 µL de BSA (albumina sérica bovina) 25 % em solução aquosa e sonicado por 2

minutos. A seguir, a solução contendo Fura-2/AM foi adicionada à solução de Hanks

contendo uma concentração suficiente de Ca2+ 1,6 mM e BSA (Fração V) 0,1 %, em

quantidade suficiente para 1 mL, resultando numa concentração final de 5 µM, sonicada por

mais 3 minutos. Este procedimento favorece a incorporação da sonda quando em contato

com a membrana citoplasmática.

As células aderidas em lamínulas foram então incubadas com 1 mL de solução de

Fura-2/AM (5 µM) em estufa com atmosfera de 5 % CO2 e temperatura de 37 ºC durante 40

minutos, sob proteção da luz, para o carregamento das células com a sonda fluorescente.

Após o período de carregamento, a lamínula foi montada em câmara aquecida à 37

ºC e as células foram imersas com solução de Hanks.

A câmara contendo as células estava acoplada a um microscópio invertido, Nikon

Diaphot D104B, equipado para epifluorescência e focalizadas com objetiva de fluorescência

e imersão a óleo com aumento de 40 vezes (Nikon Flúor) (Figura 6). Foram utilizadas células

que apresentaram intensidade de fluorescência acima de 4x105 contagens.

Figura 6: Aparato utilizado para medida de cálcio intracelular.

4.2.3.3 Determinação das concentrações de NOx

Inicialmente, todo material utilizado foi higienizado com álcool 70 %, colocado na

câmara de fluxo laminar e exposto à luz UV por 20 minutos. Em seguida, a artéria

mesentérica superior e a aorta torácica isolada de rato foram removidas como acima

mencionados, seccionada em anéis e colocadas em placas de 12 poços contendo

solução de Tyrode com volume de 0,7 ml/poço, e colocada na estufa de CO2 a 37 ºC

por um período de estabilização de 40 minutos. Após período de incubação com as

respectivas drogas, o meio de cada poço foi coletado e usado para determinação de

NOx.

Os níveis totais de NOx no meio foi determinada usando o sistema Sievers

Instrumentes, modelo NOA 280i (Figura 7). A solução saturada de cloreto de vanadium

(VCl3) em 1 M HCl foi adicionada à cuba e borbulhado ozônio a uma temperatura de 90

ºC. O sistema foi refrigerado com água através de um condensador. Vapores de HCl

foram neutralizados pelo borbulhamento de 1 M NaOH. A taxa de fluxo gasoso dentro

do aparelho foi controlada por uma válvula de pressão ajustada quando necessária e a

uma pressão constante 6 torr. Em seguida, foram injetados dentro da cuba os

reagentes (VCl3 e HCl), que converteram NOxs a NO, o qual foi detectado pela

quimioluminescência induzida por ozônio. Concentrações de NOx foram calculadas a

partir de uma curva-padrão para o nitrato de sódio. Ao final de cada experimento, os

anéis foram pesados.

Figura 7: Aparato utilizado para medida de NOx (NOA, 280i)

4.3 Protocolos experimentais in vitro

4.3.1 Curva concentração-resposta para o composto mesoiônico CMMTT em

anéis de aorta torácica isolada de rato normotenso

Após um período de estabilização de 60 minutos, foi induzida uma contração

com KCl 80 mM com intuito de ativar a maquinaria contrátil do órgão. Após a lavagem e

retorno dos valores basais, foi induzida uma nova contração com FEN e

sequencialmente adicionada a ACh (10µM) para verificar a presença do endotélio

vascular. Uma nova contração de magnitude similar foi induzida, e sobre a fase tônica e

estável (25 minutos) desta contração, concentrações crescentes do CMMTT (10-14 a 10-

6M) foram adicionadas a cuba de maneira cumulativa, tanto em anéis com endotélio

intacto (controle) como na ausência do endotélio (Figura 8).

A

B

Figura 8: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da presença (A) ou ausencia (B) do endotélio funcional em anéis de aorta torácica de rato.

Lavagem

ACh (10 µµµµM)

FEN (1 µµµµM) FEN (1 µµµµM)

Anéis com endotélio (E+)

CMMTT (10-14 – 10-6 M)

?

Lavagem

KCl 80 mM

Anéis sem endotélio (E-)

Lavagem

ACh (10 µµµµM)

FEN (1 µµµµM) FEN ( 1 µµµµM)

CMMTT (10-14 – 10-6 M)

?

Lavagem

KCl 80 mM

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

4.3.2 Curva concentração-resposta para o composto mesoiônico CMMTT em

anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso e hipertenso (L-

NAME)

Após um período de estabilização de 60 minutos, foram induzidas três

contrações similares com FEN (10 µM). A presença do endotélio vascular foi verificada

pela contração induzida por 10 µM de FEN seguida da administração de ACh 10µM.

Uma nova contração de magnitude similar foi induzida, e sobre a fase tônica e estável

(25 minutos) desta contração concentrações crescentes do composto mesoiônico

CMMTT (10-14 a 10-6 M) foram adicionadas a cuba de maneira cumulativa, tanto em

anéis com endotélio intacto (controle) como na ausência do endotélio (Figura 9). Os

antogonistas ou bloqueadores foram administrados para realização dos protocolos

experimentais, antes de induzir a última contração, aguardando um período necessário

para a atividade dos mesmos (30 minutos). É importante salientar que não houve

diferença significante (p<0,05) entre as amplitudes de contração com FEN (10 µM) para

os anéis com endotélio funcional e para os anéis sem endotélio funcional, bem como na

presença dos bloqueadores (dados não mostrados, para p<0,05). Os valores de Emax e

pD2 foram obtidos, quando necessário, como descrito no item 4.6.

Em todos os experimentos foi mantido um anel controle para observar se o órgão

relaxava espontaneamente, fato que não foi evidenciado, visto que todos os anéis

permaneceram contraídos por todo período experimental.

A

B

Figura 9: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da presença (A) ou ausência (B) do endotélio funcional em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

4.3.3 Avaliação da participação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio

funcional (EDHF) na resposta relaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria

mesentérica superior isolada de rato normotenso

Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio,

como descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas com caribdotoxina (ChTX

– 100 nM), um bloqueador dos canais para potássio ativados por cálcio de alta (BKCa2+)

e intermediaria (IKCa2+) condutância, e apamina (100 nM), um bloqueador dos canais

FEN (10 µµµµM)

?

FEN (10 µµµµM)

Lavagem

ACh (10 µµµµM)

FEN ( 10 µµµµM)

CMMTT (10-14 – 10-6 M)

Anéis sem endotélio

(E-)

Lavagem

?

FEN (10 µµµµM)

Anéis com endotélio

(E+)

ACh (10 µµµµM)

FEN ( 10 µµµµM)

Lavagem

CMMTT (10-14 – 10-6 M)

FEN (10 µµµµM)

Lavagem

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SKCa2+), ambos na mesma

preparação são capazes de inibir a resposta vascular atribuída ao EDHF (GHISDAL;

MOREL, 2001; ANSELM et al., 2007). Após 30 minutos, foi induzida uma nova

contração tônica com FEN (10 µM) e em seguida, uma curva concentração-resposta

para o CMMTT foi obtida (Figura 10).

A resposta obtida após a adição dos inibidores foi comparada com a resposta

obtida na ausência dos mesmos. O valor de Emáx foi obtido como descrito no item 4.6.

Figura 10: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação do EDHF na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

FEN (10 µµµµM)

ACh (10 µµµµM)

Anéis com endotélio vascular

(E+) ?

FEN (10 µµµµM)

CMMTT (10 -14 -10 6 M)

Lavagem

ChTX + apamina

30 min. Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

4.3.4 Verificação da participação dos metabólitos da via da ciclooxigenase e

receptores muscarínicos na resposta relaxante induzida pelo CMMTT em anéis de

artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso

Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio,

como descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas com indometacina (1

µM), um inibidor não-seletivo da ciclooxigenase (COX) (CLARK; FUCHS, 1997), e

atropina (1 nM) (SHIRAKI et al., 2001), um antagonista não-seletivo dos receptores

muscarínicos. Após 30 minutos, foi induzida uma nova contração tônica com FEN (10

µM) e em seguida, uma curva concentração-resposta para CMMTT foi obtida (Figura

11). A resposta obtida após a adição de indometacina e atropina foi comparada com a

resposta obtida na ausência do bloqueador (controle). O valor de Emáx foi obtido como

descrito no item 4.6.

Figura 11: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos metabólitos derivados da via da COX e receptores muscarínicos na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

FEN (10 µµµµM)

ACh (10 µµµµM)

Anéis com endotélio vascular

(E+) ?

FEN (10 µµµµM)

CMMTT (10 -14 -10 6 M)

Lavagem

Indometacina + atropina 30 min.

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

4.3.5 Verificação da participação de canais para K+ na resposta relaxante induzida

por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso

Após o período de estabilização e a verificação da integridade do endotélio como

descrito no item 4.3.2, a solução de Tyrode da cuba foi trocada pela solução

despolarizante de KCl 20 mM (Tabela 3) e as preparações permaneciam nesta solução

até o final do experimento. Este procedimento impede parcialmente o efluxo de K+ e

atenua relaxamentos mediados por abertura de canais para K+ (CAMPBELL; HARDER,

1999; CLARK; FUCHS, 1997). Decorridos 30 min da troca, foi induzida uma nova

contração tônica com FEN (10 µM) e, em seguida, uma curva concentração-resposta

para o CMMTT foi obtida (Figura 12). A resposta para o CMMTT observada na

presença de KCl 20 mM foi comparada com a resposta obtida na ausência do mesmo

(controle). O valore de Emax (efeito máximo) foi obtido, como descrito no item 4.6.

Figura 12: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

FEN (10 µµµµM)

ACh (10 µµµµM)

Anéis com endotélio vascular

(E+) ?

FEN (10 µµµµM)

CMMTT (10 -14 -10 6 M)

Lavagem

Troca do líquido por

KCl 20 mM 30 min.

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

4.3.6 Avaliação da participação dos diferentes canais para K+ na resposta

relaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada

de rato normotenso

Após o período de estabilização e a verificação da presença do endotélio, como

descrito no item 4.3.2, as preparações foram incubadas separadamente com

tetraetilamônio (TEA – 1 mM), bloqueador seletivo dos canais para K+ sensíveis ao Ca2+

de grande condutância (BKCa2+) (COX et. al., 2002), glibenclamida (GLIB – 10 µM), um

bloqueador seletivo de canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) (WANG et al., 2007), 4-

aminopiridina 1 mM, bloqueador seletivo dos canais para K sensível a voltagem (Kv)

(GHISDAL; MOREL, 2001) e BaCl2 (30 µM), bloqueador dos canais para K+ retificador

de entrada (EDWARDS et al., 1998; KAWABATA et al., 2004), permanecendo até o

final do experimento. Após 30 min, foi induzida uma nova contração tônica com FEN

(10 µM) e, em seguida, uma curva concentração-resposta para o CMMTT foi obtida

(Figura 13). As respostas obtidas após a adição dos bloqueadores foram comparadas

com a resposta obtida na ausência do mesmo (controle). Os valores de Emax (efeito

máximo) e/ou a pD2 foram obtidos, quando necessário, como descrito no item 4.6.

Figura 13: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos subtipos de canais para K+ na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.

4.3.7 Investigação do efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a

FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso e

hipertenso (L-NAME)

Após um período de 60 minutos de estabilização das preparações, e verificação

da presença ou ausência do endotélio funcional, como descrito no item 4.3.2, foi

induzida uma contração cumulativa com FEN (10-9 a 10-5 M) (Figura 8) e o efeito

vasoconstrictor foi avaliado tanto para animais normotensos quanto em animais

hipertensos (TASATARGIL et al., 2004). Após a lavagem e retorno dos níveis basais, os

anéis foram incubados por CMMTT (10-6 M). Decorrido 30 minutos da incubação, foi

induzida uma nova curva concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) para se

investigar a influência do CMMTT sobre a resposta vasoconstrictora em anéis com o

endotélio funcional intacto e com o endotélio removido (Figura 14). Após a obtenção

FEN (10 µµµµM)

ACh (10 µµµµM)

Anéis com endotélio vascular

(E+) ?

FEN (10 µµµµM)

CMMTT (10 -14 -10 6 M)

Lavagem

TEA ou BaCl2 ou 4-AP ou

glibenclamida 30 min.

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

das curvas concentração-resposta, foram analisados os valores de Emax das curvas

individuais na presença e na ausência do CMMTT, como descrito no item 4.6.

A

B

Figura 14: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da reatividade vascular aguda para a FEN em anéis de artéria mesentérica superior, com (A) e sem (B) endotélio funcional, de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT.

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

ACh (10 µµµµM)

FEN (10µµµµM) FEN (10-9 – 10-5 M)

Lavagem

Anéis com endotélio

(E+) ? ?

FEN (10 -9 – 10-5 M)

Lavagem

CMMTT (10-6 M)

FEN (10 µµµµM)

?

Lavagem

Anéis sem endotélio

(E-)

ACh (10 µµµµM)

FEN (10 -9 – 10-5 M)

?

FEN (10 -9 – 10-5 M)

Lavagem

CMMTT (10-6 M)

4.3.8 Investigação do efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para

diferentes agentes vasodilatadoras (ACh e NPS), em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato normotenso e hipertenso (L-NAME)

Após um período de 60 minutos de estabilização das preparações, e verificação

da presença ou ausência do endotélio funcional como descrito no item 4.3.2, foi

induzida uma contração cumulativa com FEN (10-9 a 10-5 M) (Figura 8) e após o período

de estabilização (25 minutos) o efeito relaxante foi avaliado tanto para animais

normotensos como em animais hipertensos L-NAME. Concentrações crescentes de

ACh (3 x 10-10 – 10-5 M) foram adicionadas cumulativamente aos anéis de artéria

mesentérica pré-contraídos com endotélio funcional íntegro, e para os anéis com o

endotélio funcional removido, o agente vasodilatador utilizado foi o NPS (10-9 – 10-4 M)

(TASATARGIL et al., 2004). Após a lavagem e retorno dos níveis basais, os anéis foram

incubados com CMMTT (10-6 M) e decorridos 30 minutos da incubação, foi induzida

uma nova contração cumulativa para a FEN (10-9 a 10-5 M) e as contrações foram

ajustadas para obtenção de contrações de magnitude semelhante as anteriores. Na

presença do CMMTT e nos anéis pré-contraídos com FEN uma nova curva

concentração-resposta para a ACh ou NPS foi induzida (Figura 15). Após a obtenção

das curvas concentração-resposta, quando necessário foram analisados os valores de

pD2 e Emax das curvas individuais na presença e na ausência do CMMTT, como descrito

no item 4.6.

A

B

Figura 15: Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da reatividade vascular aguda para a ACh em anéis de artéria mesentérica superior com endotélio funcional (A) e para o NPS em anéis sem endotélio funcional (B), de rato normotenso e hipertenso (L-NAME) na presença e ausência do CMMTT.

Anéis sem endotélio vascular

(E-)

FEN (10 µµµµM)

Lavagem

ACh (10 µµµµM)

FEN (10 -9 – 10-5 M)

NPS (10-9 – 10-4 M)

?

FEN (10 -9 – 10-5 M)

CMMTT (10-6 M)

NPS (10-9 – 10-4 M)

?

Ten

são (g

)

Tempo (s)

Ten

são (g

)

Tempo (s)

CMMTT (10-6 M)

ACh (10 µµµµM)

FEN (10µµµµM) FEN (10-9 – 10-5 M)

Lavagem

Anéis com endotélio vascular

(E+) ?

ACh (3x10-10 – 10-5 M)

ACh (3x10-10 – 10-5 M)

?

FEN (10 -9 – 10-5 M)

4.4 Protocolos experimentais bioquímicos

4.4.1 Avaliação do aumento de cálcio intracelular na resposta induzida pelo

CMMTT em cultura primária de células endoteliais de artéria mesentérica e aorta

torácica isolada de rato

Após o carregamento, a célula foi selecionada e os valores basais foram obtidos

por 5 minutos. Em seguida, CMMTT (10-6 M) foi adicionada por 10 minutos, e a

fluorescência foi registrada por todo o período experimental. O mesmo protocolo

experimental foi realizado usando acetilcolina (10-5 M) como controle positivo e DMSO,

como controle negativo.

4.4.2 Avaliação da liberação de NOx induzida pelo CMMTT em anéis de artéria

mesentérica e aorta torácica superior isoladas de rato normotenso

Após o período de estabilização de 40 minutos na estufa de CO2 a 37 ºC, os

anéis de artéria mesentérica superior e aorta torácica isoladas de rato, contidos na

placa de 12 poços, foram incubados com DMSO, como controle negativo, em alguns

poços e CMMTT em outros poços, ambos por 30 minutos. Em seguida, o meio de cada

poço foi coletado e usado para determinação de NOx como descrito acima. Este mesmo

procedimento também foi realizado induzindo-se uma pré-contração com a FEN (10

µM) e decorrido 20 minutos foi administrado ACh (10 µM), como controle positivo,

DMSO, como controle negativo e o CMMTT, substância teste, sendo todas estas

substâncias adicionadas em diferentes poços e permaneceram por 30 minutos. Em

seguida, o meio de cada poço foi coletado e usado para determinação de NOx como

descrito anteriormente. O mesmo protocolo experimental foi realizado após remoção do

endotélio funcional.

4.5 Protocolos experimentais in vivo

4.5.1 Procedimento experimental para triagem comportamental e avaliação da

toxicidade aguda do CMMTT em camundongos

Para a realização dos experimentos foram formados grupos com 03 animais por

caixa, sendo separados por gênero. Tanto os machos quanto as fêmeas (total de 06 por

grupo) receberam o CMMTT na veia caudal (via i.v.) nas doses de 50 e 100 mg/Kg.

Estes animais foram comparados com animais do grupo controle que receberem salina

+ cremofor, veículo utilizado para dissolução do CMMTT utilizado nas preparações. Os

camundongos permaneceram por um período de observação de 4 horas de duração

sob a observação de dois avaliadores e as alterações ocorridas foram registradas de

acordo com a metodologia descrita por Almeida et al., (1999).

Após o período das 4 horas (0, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos) de observação,

os animais voltavam a receber água e comida e durante as 48 horas subseqüente ao

teste, verificava-se a cada 12 horas as possíveis mortes. Passado um período de 14

dias da data do experimento, os animais eram eutanasiados por deslocamento cervical

seguida por secção dos vasos cervicais e os principais órgãos vitais (coração, rins,

fígado e pulmão) dos animais eram removidos para avaliação macroscópica

morfométrica e pesados (Figura 16). O peso dos órgãos era corrigido pelo peso do

animal para se observar possíveis alterações em relação ao grupo controle.

Figura 16: Representação esquemática do protocolo experimental após a administração de CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.) para avaliação da atividade comportamental (A) e da letalidade e toxicidade dos órgãos vitais (B) em camundongos machos e fêmeas.

4.5.2 Efeito de CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca

(FC) em ratos normotensos (LL, SHAM) e hipertensos (LH, 2R1C e L-NAME)

Após transcorrido o período para se alcançar as condições ideais do estudo, ou

seja 4 semanas para os 2R1C e SHAM, e 7 dias para os L-NAME (como descrito nos

itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente) e 24 horas após a realizado o procedimento de

implantação dos cateteres para medida da PAM (item 4.1.4), os animais normotensos e

hipertensos foram mantidos em aclimatação por no mínimo 30 minutos para

estabilização dos parâmetros hemodinâmicos. Em seguida, foi administrado

nitroprussiato de sódio (NPS) (10 µg/Kg, i.v.) para verificar a eficácia da implantação do

cateter. Após 15 minutos, doses crescentes de CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1; e 5

mg/Kg, i.v.) foram administradas randomicamente com intervalos de tempo suficiente

para que a PAM e FC retornassem aos seus valores basais (Figura 17). Os valores de

PAM e FC foram computados antes (valores da linha de base) e imediatamente após a

administração do composto mesoiônico em estudo.

Figura 17: Representação esquemática do protocolo experimental para registro da pressão arterial média (PAM) e frequencia cardíaca (FC) em rato normotensos e hipertensos acordados, não-anestesiados e com livre movimentação.

4.6 Análise Estatística

Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.). Para

análise estatística foram utilizados os testes t de Student e análise de variância “one-

way” (ANOVA) seguido de teste de Bonferroni, onde os valores de p < 0,05 foram

considerados significantes.

Para estudar o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT os parâmetros

farmacológicos foram analisados: o Emáx (resposta máximo induzida pela substância)

e/ou pD2 (-log CE50). Os valores de pD2 foram obtidos através de regressão não-linear

das curvas individuais traçadas a partir dos valores percentuais das respostas induzidas

por CMMTT para cada experimento, enquanto que os valores de resposta máxima

(Emax), para cada protocolo experimental, estão expressos como percentagem do

relaxamento máximo do tônus induzido por FEN (100 %) ou em � da contração

induzida pela FEN. Para todos estes procedimentos foi utilizado o programa estatístico

GraphPad Prism versão 3.04.

5 RESULTADOS

Durante a triagem farmacológica, foi evidenciado que o tempo necessário para

que fossem obtidas as respostas máximas nas preparações funcionais de artéria

mesentérica superior e aorta torácica, para cada concentração de CMMTT, variou entre

8 a 10 minutos No final dos experimentos, a reversão do relaxamento produzido por

CMMTT foi conseguido após 20 minutos de sua retirada das cubas por meio da troca de

solução fisiológica respectiva e verificação da reposta do tecido a FEN (10 µM) que

induziu contrações de magnitude similar às induzidas antes da adição do composto

mesoiônico estudado. A reversibilidade foi sistematicamente observada, para assegurar

que o relaxamento não foi devido a alterações na contractilidade e responsividade do

tecido. A adição de CMMTT não foi capaz de modificar, de maneira significativa, o tônus

basal em anéis com endotélio funcional intacto (dados não mostrados).

Adicionalmente, nas mesmas condições experimentais, foi adicionado o veículo

(cremofor ou DMSO) nas mesmas proporções utilizadas para solubilizar o composto

mesoiônico CMMTT e não foi constatada atividade estatisticamente significante destes

veículos (dados não mostrados).

5.1 Efeitos do CMMTT em anéis de aorta torácica isolada de rato

A administração cumulativa de CMMTT (10-14 – 10-5 M) em anéis de aorta

torácica isolada de ratos, com endotélio funcional íntegro e pré-contraídos com FEN (1

µM), induziu um discreto efeito relaxante com Emax = 39,6 ± 8,1 %. A remoção do

endotélio vascular atenuou significativamente, a resposta relaxante induzida por

CMMTT (Emax = 12,9 ± 5,8 %) (Gráfico 1).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio preservado

Endotélio ausente

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 1: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria de aorta torácica isolada de ratos com endotélio intacto (�) ou endotélio ausente (�), pré-contraídos com FEN (10 µM). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 05 experimentos. *p<0,05 vs endotélio ausente.

*

5.2 Efeito do CMMTT em anéis de artéria mesentérica isolada de rato hipertenso

(L-NAME)

A administração cumulativa de CMMTT (10-14 – 10-6 M) em anéis da artéria

mesentérica superior isolada de ratos hipertensos (L-NAME), com endotélio funcional

íntegro e pré-contraídos com FEN (10 µM), induziu um relaxamento dependente de

concentração com mesma potência famacológica (pD2 = 10,21 ± 0,11, n=6 e 10,26 ±

0,05; n=17, respectivamente), no entanto a magnitude de efeito máximo dos animais

hipertensos foi significativamente maior na concentração de 10 -6 M quando comparada

aos animais normotensos (Emáx = 95,63 ± 2,80 e 80,8 ± 5,8 respectivamente) (Gráfico

2).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Hipertenso (L-Name)

Normotenso

*

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 2: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (10 µM) de ratos normotensos (controle) (�) e hipertensos (L-NAME) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. * p<0,05 vs normotensos.

5.3 Avaliação da participação do EDHF sobre a resposta relaxante induzida pelo

CMMTT em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato

Na presença de caribdotoxina (ChTX) (100 nM) mais apamina (100 nM), a curva

concentração resposta para o CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato com endotélio funcional preservado e pré-contraídos com FEN

(10-6 M) não foi alterada quando comparada a curva na ausência dos mesmos (Gráfico

3).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

CTX (100 nM)+ Apamina (100 nM)

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 3: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com do endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de ChTX (100 nM) mais apamina (100 nM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 04 experimentos, respectivamente.

5.4 Investigação da participação da via da COX e dos receptores muscarínicos

sobre a resposta relaxante induzida pelo CMMTT em anéis de artéria mesentérica

superior isolada de rato

Como mostra o gráfico 4, na presença de indometacina (10 µM) mais atropina (1

nM), concentrações crescentes do CMMTT (10-14 a 10-6 M) foram capazes de induzir

relaxamento dependente de concentração em anéis de artéria mesentérica com

endotélio funcional e pré-contraídas com FEN (10-6 M), cuja potência (pD2 = 10,62 ±

0,35, n = 5) e eficácia (Emax = 73,8 ± 7,8 %) não foi modificado quando comparada a

curva na ausência dos inibidores ou antagonistas (pD2 = 10,26 ± 0,05, n = 17 e Emax =

80,8 ± 4,7) (Gráfico 4).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

Indometacina (10 µµµµM)+ atropina (1 nM)

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 4: Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença indometacina (10 µM) mais atropina (1 nM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente.

5.5 Influência dos canais para K+ na resposta relaxante induzida por CMMTT em

anéis da artéria mesentérica superior de ratos

A incubação das preparações com KCl 20 mM não alterou significantemente o

tônus basal (dados não mostrados). Nesta condição experimental, a curva

concentração resposta para o CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis da artéria mesentérica

superior isolada de rato, na presença do endotélio funcional e pré-contraídos com FEN

(10 µM), foi significativamente deslocada para direita com redução do efeito máximo

(Emáx = 29,24 ± 8,40 %; n = 6) quando comparada a curva controle (Emax = 80,8 ± 5,8 %;

n = 17, p<0,0001) (Gráfico 5).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

KCL 20

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 5: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (controle) (�) ou na presença de [K+]e = 20 mM (�).Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.

*** ***

***

*** *** *** *** *** ***

5.6 Avaliação da participação dos canais BKCa2+ na resposta relaxante induzida

por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos

Na presença de 1mM de TEA, a curva concentração resposta para o CMMTT

(10-14 a 10-6 M), em anéis da artéria mesentérica superior isolada de rato, na presença

do endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µM), foi significativamente

atenuado com alterações significativas nos valores de Emax (26,40 ± 4,02 %, n = 9),

quando comparada a curva na ausência do bloqueador (Emax = 80,8 ± 5,8 %; n = 17,

p<0,0001) (Gráfico 6).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

TEA (1mM)

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 6: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de TEA (1 mM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 09 experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.

*** *** *** *** *** ***

*** ***

***

5.7 Influência dos canais para K+ sensíveis a voltagem na resposta relaxante

induzida por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos

Como mostra o gráfico 7, na presença de 4-aminopiridina (1 mM), o efeito

relaxante induzidos por CMMTT (10-14 a 10-6 M), foi significativamente atenuado, com

alterações significativas nos valores de efeito máximo (Emax = 12,80 ± 8,94 %, n = 6),

quando comparados aos anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional e pré-

contraídos com FEN (10 µM) (Emax = 80,8 ± 5,8 %; n = 17, p<0,0001) (Gráfico 7).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

4 AP (1 mM)

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 7: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de 4-aminopiridina (1 mM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. *** p<0,0001 vs endotélio intacto.

*** *** *** *** *** *** *** *** ***

5.8 Influência dos canais para K+ sensíveis a ATP na resposta relaxante induzida

por CMMTT em anéis mesentéricos de ratos

Na presença de glibenclamida (10 µM), a curva concentração resposta para o

CMMTT (10-14 a 10-6 M), em anéis da artéria mesentérica superior isolada de rato, na

presença do endotélio funcional e pré-contraídos com FEN (10 µM), foi

significativamente deslocada para a direita com redução do efeito máximo (Emax = 59,62

± 6,56 %, n = 6) e da potência farmacológica (pD2 = 10,93 ± 0,22), quando comparada a

curva na ausência do bloqueador (pD2 = 10,26 ± 0,05, Emax = 80,8 ± 5,8 %, n = 17, p<

0,05) (Gráfico 8).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

Glibenclamida 10 µµµµM

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 8: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de glibenclamida (10 µM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. * p<0,05 vs endotélio intacto.

* *

5.9 Investigação da influência dos canais KIr na resposta relaxante induzida por

CMMTT em anéis mesentéricos de ratos

Na presença de BaCl2 30µM, o efeito relaxante induzido por CMMTT (10-14 a 10-6

M), foi significativamente deslocado para direita com alterações significativas nos

valores de pD2 (pD2 = 9,13 ± 0,18, p<0,0001), e efeito máximo (Emáx = 56,8 ± 7,12%

p<0,05), quando comparada a curva na ausência do bloqueador (Emax = 80,8 ± 5,8 % e

pD2 = 10,26 ± 0,05; n = 17) (Gráfico 9).

-15 -13 -11 -9 -7 -5

0

25

50

75

100

Endotélio intacto

Ba Cl2 (30µµµµM)

Log [CMMTT] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 9: Curvas concentração-resposta para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT (10-14 a 10-6 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (10 µM) na ausência (�) ou na presença de BaCl2 (30 µM) (�). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 17 e 06 experimentos, respectivamente. ** p<0,005 vs endotélio intacto.

**

**

**

**

**

**

**

**

**

5.10 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a FEN, dependente

do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de ratos

normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)

Em ratos normotensos com o endotélio funcional preservado o efeito

vasocontracturante induzido pela FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 49 ± 6,24 ) foi

significativamente atenuado na presença do composto mesoiônico CMMTT (10-6 M)

(Emáx = 32,5 ± 8,5), como mostra o gráfico 10 A. Resultados similares foram obtidos

com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT também foi capaz de atenuar o

efeito vasoconstrictor induzido por contrações crescentes de FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx =

57,5 ± 6,5), quando comparado ao efeito contrátil da FEN na ausência do CMMTT (Emáx

= 91,7 ± 10,7) (Gráfico 10 B). É importante ressaltar que a resposta contrátil induzida

pela FEN apresenta uma maior sensibilidade em animais hipertensos L-NAME (Emáx =

91,7 ± 10,7) quando comparado aos animais normotensos (Emáx = 49 ± 6,24 ).

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100FEN

FEN + CMMTT

Log [FEN] M

∆∆ ∆∆ C

on

traç

ão (

mg

)

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100 FEN

FEN + CMMTT

Log [FEN] M

∆∆ ∆∆ C

on

traç

ão (

mg

)

Gráfico 10: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da � de contração dos valores absolutos de 05 experimentos. * p<0,05 vs controle.

A

B

*

*

*

*

*

5.11 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a acetilcolina,

dependente do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de

ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)

Em anéis de artéria mesentérica, com o endotélio funcional preservado, pré-

contraída com FEN (10-9 – 10-5 M) de ratos normotensos, o efeito relaxante induzida

pela ACh (3x10-10 – 10-5 M) (Emáx = 100 ± 5,44 ) manteve-se inalterado quando

comparada ao efeito da ACh na presença do composto mesoiônico CMMTT (10-6 M)

(Emáx = 100 ± 2,89), como mostra o gráfico 11 A. No entanto, nas preparações de

animais hipertensos L-NAME, o efeito relaxante na presença do CMMTT foi deslocado

para a esquerda, com alterações significativas na potência (pD2 = 6,65 ± 0,07) e

eficácia (Emàx = 99,3 ± 4,6 %), quando comparado ao efeito vascular da ACh na

ausência do composto (Emáx = 66,7 ± 10% e pD2 = 5,99 ± 0,03) (Gráfico 11 B). Um fator

interessante nestas condições experimentais é que a ACh demonstra um efeito

relaxante significativamente menor em animais hipertensos L-NAME comparado aos

animais normotensos, na ausência do composto, e este efeito e revertido após a pré-

incubação com o CMMTT.

-10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100

125

AChpD2= 5,71 ±±±± 0,34Emax= 100 ±±±± 5,44

CMMTT + AChpD2 = 6,67 ±±±± 0,09Emax= 100 ±±±± 2,89

Log [ACh] M

% R

elax

amen

to

-10 -9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100

125

AChpD2= 5,99 ±±±± 0,03Emax = 66,7±±±± 10

CMMTT + AChpD2= 6,65 ±±±± 0,06Emax = 99,3 ±±±± 4,6

Log [ACh] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 11: Curvas concentração-resposta para a ACh (3x10-10 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior com endotélio intacto de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos. * p<0,05, ** p< 0,001 e *** p<0,0001 vs controle.

A

B ***

***

** ** *** ***

***

***

*** ***

*** ***

5.12 Efeito agudo do CMMTT sobre a reatividade vascular para a fenilefrina (FEN),

independente do endotélio funcional, em anéis de artéria mesentérica superior de

ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)

Em ratos normotensos sem o endotélio funcional o efeito contracturante induzido

pela FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 39,8 ± 4,5) não foi modificado quando na presença do

composto mesoiônico CMMTT (10-6 M) (Emáx = 37,0 ± 7,2), como mostra o gráfico 12 A.

Resultados similares foram obtidos com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT

também não foi capaz de alterar o efeito vasoconstrictor induzido por contrações

crescentes de FEN (10-9 – 10-5 M) (Emáx = 62,0 ± 6,1) quando comparado ao efeito

contrátil da FEN na ausência do CMMTT (Emáx = 70,7 ± 5,8) (Gráfico 12 B). Além destes

dados, é importante ressaltar que a resposta contrátil induzida pela FEN apresenta uma

maior sensibilidade, em animais hipertensos L-NAME (Emáx = 70,7 ± 5,8), quando

comparado aos animais normotensos (Emáx = 39,8 ± 4,5 ).

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100 FEN

FEN + CMMTT

Log [FEN] M

∆∆ ∆∆ C

on

traç

ão (

mg

)

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100 FEN

FEN + CMMTT

Log [FEN] M

∆∆ ∆∆ C

on

traç

ão (

mg

)

Gráfico 12: Curvas concentração-resposta para a FEN (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. da � de contração dos valores absolutos de 05 experimentos.

A

B

5.13 Efeito da reatividade vascular para o nitroprussiato de sódio independente

do endotélio funcional em anéis de artéria mesentérica superior de ratos

normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME)

Em anéis de artéria mesentérica, sem o endotélio funcional, pré-contraída com

FEN (10-9 – 10-5 M) de ratos normotensos, o efeito relaxante induzida pelo NPS (10-9 –

10-6 M) manteve-se inalterados quando comparada ao efeito do NPS na presença do

composto mesoiônico CMMTT (10-6 M) atingindo ambos 100% de ralaxamento em

todos os experimentos (Gráfico 13 A). Resultados similares foram observados nas

mesmas condições experimentais, com animais hipertensos L-NAME, onde o CMMTT

também não foi capaz de alterar o efeito relaxante induzido por contrações crescentes

de NPS, como mostra o gráfico 13 B.

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100

125

NPS

CMMTT + NPS

Log [NPS] M

% R

elax

amen

to

-9 -8 -7 -6 -5

0

25

50

75

100

125

NPS

CMMTT + NPS

Log [NPS] M

% R

elax

amen

to

Gráfico 13: Curvas concentração-resposta para o NPS (10-9 a 10-5 M) em anéis da artéria mesentérica superior sem endotélio funcional de ratos normotensos (A) e hipertensos (L-NAME) (B). Os valores estão expressos com média ± e.p.m. de 06 experimentos.

B

A

5.14 Efeito do CMMTT sobre a mobilização de Ca2+ intracelular em cultura

primária de célula endotelial de artéria mesentérica superior

CMMTT (10-6 M) não foi capaz de promover aumento na concentração

intracelular de Ca2+ em cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica

superior de rato quando comparado ao DMSO, usado como controle negativo para

solubilizar o CMMTT. Entretanto, foi observado aumento da concentração intracelular

de Ca2+ promovido pela ACh (10-5 M), nas mesmas condições experimentais, usada

como controle positivo (Gráfico 14).

0.000

0.025

0.050

0.075Linha de BaseDMSOCMMTT 10-6 MACh 10-5 M

*

∆∆ ∆∆ F

luo

resc

ênci

a(c

on

tag

ens

x10

5 )

Gráfico 14: Efeito do CMMTT (10-6 M) e ACh (10-5 M) sobre a mobilização de Ca2+

intracelular em cultura primária de célula endotelial de artéria mesentérica isolada de rato, após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 M) (n=4). * p<0,05 vs linha de base.

5.15 Efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica superior

isolada de rato normotenso

Em anéis de artéria mesentérica, com o endotélio funcional preservado, e sem

pré-contração com FEN (10-5 M) de ratos normotensos, CMMTT (10-6 M) não foi capaz

de promover um aumento na concentração de NOx quando comparado ao DMSO,

usado como controle negativo (dados não mostrados). No entanto, nas condições

experimentais, que os anéis foram pré-contraídos com FEN (10-5 M), CMMTT e (10-6 e

10-5 M) foi capaz de promover um aumento significante na concentração de NOx em

anéis de artéria mesentérica superior com endotélio funcional, quando comparada aos

valores basais e ao DMSO, usado como controle negativo para solubilizar o CMMTT

(Gráfico 15 B). Este efeito foi completamente abolido após a remoção do endotélio

funcional. Resultados similares foram obtidos com a ACh (10 µM), usada como controle

positivo (Gráfico 15).

0

2

4

6

8

10

12

Linha de BaseDMSO + FEN 10-5 MFEN + ACh 10-5 MFEN + CMMTT 10-6 M

Endotéliopreservado

Endotélioremovido

***

+++

###

### FEN + CMMTT 10-5 M**###

[NO

x] p

mo

les/

pes

o ú

mid

o (

mg

)

Gráfico 15: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em artéria mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com DMSO, ACh (10-5 M), ou CMMTT [10-6 e 10-5 M] na presença do endotélio (após 30 minutos de incubação) ou após a remoção do endotélio (n=4). ** p<0,001 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN; +++ p<0,0001 vs Linha de Base e ### p<0,0001 vs endotélio removido.

5.16 Efeito do CMMTT sobre a liberação de NOx em aorta torácica isolada de rato

Em anéis de aorta torácica, com o endotélio funcional preservado, e pré-

contração com FEN (10-5 M) de ratos normotensos, CMMTT (10-6 M) não foi capaz de

promover um aumento significativo nas concentrações de NOx durante os dois tempos

estudados (30 e 60 minutos), quando comparada aos valores basais e ao DMSO,

usado como controle negativo para solubilizar o CMMTT (Gráfico 16 A). No entanto, nas

mesmas condições experimentais, a concentração de 10-5 M do CMMTT foi capaz de

aumentar significativamente os níveis de NOx em anéis de aorta torácica nos dois

tempos estudados (Gráfico 16 A e B). Este efeito foi completamente abolido após a

remoção do endotélio funcional (Gráfico 16 C). Resultados obtidos com a ACh (10 µM -

usada como controle positivo), também demonstrou um aumento significativo para os

anéis com endotélio funcional e abolido na ausência do mesmo (Gráfico 16).

0

1

2

Após 30 min.

*

FEN + ACh 10-5 MDMSO + FEN 10-5 MLinha de Base

FEN + CMMTT 10-6 MFEN + CMMTT 10-5 M

+

[NO

x] p

mo

les/

pes

o ú

mid

o (

mg

)

0

1

2

***

Linha de BaseDMSO + FEN 10-5 MFEN + ACh 10-5 MFEN + CMMTT 10-6 MFEN + CMMTT 10-5 M

+

Após 60 min.[N

Ox]

pm

ole

s/p

eso

úm

ido

(m

g)

0.0

0.5

1.0

Linha de baseDMSO + FEN (10-5 M)

FEN + CMMTT (10-6 M)FEN + ACh (10-5 M)FEN + CMMTT (10-6 M)

# #

Endotéliopreservado

Endotélioremovido

+ FEN + ACh (10-5 M)

Após 60 minutos

[NO

x] p

mo

les/

pes

o ú

mid

o (

mg

)

Gráfico 16: Efeito do CMMTT (10-6 e 10-5 M) sobre a liberação de NOx em anéis de aorta torácica isolada de rato, pré-contraídos com FEN (10-5 M) antes (valores basais) e após incubação com DMSO, ACh (10-5 M) ou CMMTT (10-6 e 10-5 M), após 30 (A) e 60 minutos (B) ou após a remoção do endotélio (C) (n=4). * p<0,05 e *** p<0,0001 vs DMSO + FEN, + p<0,05 vs Linha de Base e # p< 0,05 vs FEN + Ach ou FEN+CMMTT.

C

B A

5.17 Triagem farmacológica comportamental em camundongos tratados com

CMMTT

A tabela 8 elenca as alterações comportamentais apresentadas pelos

camundongos (machos e fêmeas), tratados com CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg

i.v.), em relação ao grupo controle. Na dose de 50 mg/Kg os sintomas apresentados

pelos machos, ao longo das 4 horas de observação foram: tremores, ptose, analgesia,

diminuição da ambulação, respiração forçada e constipação, nesta mesma dose as

fêmeas apresentaram ptose, diminuição da ambulação, constipação, respiração

forçada. Enquanto que, na dose de 100mg/Kg os camundongos machos apresentaram

tremores, catatonia, analgesia, diminuição da ambulação, respiração forçada e

constipação e as fêmeas tremores, ptose e diminuição da ambulação.

Interessantemente, a respiração forçada foi o sintoma mais intenso para a dose de

50mg/Kg, durante a primeira hora de observação em ambos os sexos, e para a dose de

100mg/Kg permaneceu alterada durante as quatro horas, apenas para os machos,

apesar do maior índice de letalidade ser entre as fêmeas.

Tabela 8: Alterações comportamentais induzido pelo tratamento agudo da CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) em camundongos machos e fêmeas (n = 6 por grupo)

Principais efeitos observados

Tre

mor

Cat

aton

ia

Ana

lges

ia

Am

bula

ção

Con

stip

ação

Res

pira

ção

forç

ada

Pto

se

Sexo (dose)

Tempo (minutos)

0

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

30 + Ø Ø - ++ ++ + 60 Ø Ø + - + ++ + 120 Ø Ø Ø - + Ø + 180 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Fêmea (50mg/Kg)

240 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

0

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

30 Ø Ø Ø - ++ ++ Ø 60 Ø Ø Ø - ++ + Ø 120 Ø Ø Ø - ++ + Ø 180 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Macho (50mg/Kg)

240 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

0

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

30 + + + - + ++ Ø 60 Ø + + - + ++ Ø 120 Ø + + - + ++ Ø 180 Ø + + Ø + ++ Ø

Fêmea (100mg/Kg)

240 Ø Ø Ø Ø + ++ Ø

0

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

Ø

30 Ø Ø Ø - ++ ++ Ø 60 + Ø Ø - ++ + Ø 120 + Ø Ø - ++ + Ø 180 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Macho (100mg/Kg)

240

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

(Ø) ausência de efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente e (++) efeito intenso

5.18 Determinação da toxicidade aguda do CMMTT administrado por ia i.v. em

camundongos

Como mostra a tabela 9, o CMMTT na dose de 100 mg/Kg apresentou um maior

índice de letalidade para os camundongos fêmeas (50 %) comparado aos machos (16,6

%). No entanto na dose de 50 mg/Kg não foi observado nenhuma diferença entre os

sexos. É importante salientar que as doses utilizadas para o estudo de toxicidade foram

10 e 20 vezes maior, respectivamente que a dose utilizada nos experimentos in vivo.

Tabela 9: Percentagem de mortes dos camundongos tratados com CMMTT (n = 6 por grupo)

Sexo

Via de administração

Dose

Número de animais

Número de mortes

Macho i.v. 100 mg/Kg n = 06 n = 01 (16,6%)

Fêmea i.v. 100 mg/Kg n = 06 n = 03 (50%)

Macho i.v. 50 mg/Kg n = 06 n = 01 (16,6%)

Fêmea i.v. 50 mg/Kg n = 06 n = 01 (16,6%)

5.19 Determinação da toxicidade pela pesagem e avaliação macroscópica de

órgãos vitais, após 14 dias da administração aguda de CMMTT

Após 14 dias da administração do CMMTT (50 e 100 mg/Kg i.v.), os órgãos

avaliados não apresentaram nenhuma alteração macroscópica de forma, textura e

coloração dos órgãos (dados não mostrados). Conforme mostra a tabela 10, os

camundongos machos e fêmeas que receberam o tratamento com CMMTT (dose única)

tanto na dose de 50 mg/Kg, quanto na dose de 100mg/Kg, não apresentaram

diferenças significativas em relação ao peso dos órgãos do grupo de animais que não

receberam o tratamento (controle).

Tabela 10: Peso dos órgãos vitais corrigido pelo peso de camundongos (peso do órgão/peso do animal) machos e fêmeas tratados com CMMTT (doses de 50 e 100 mg/Kg i.v.) (n = 6 por grupo)

50 mg/Kg 100 mg/Kg

Fêmea Macho Fêmea Macho

Coração (mg)

Controle

4,5± 0,3

CMMTT

4,4± 0,1

Controle

6 ± 0,4

CMMTT

5,7 ± 8

Controle

6,6 ± 1

CMMTT

6,4 ± 1

Controle

4,2± 0,2

CMMTT

4,9 ± 9

Fígado (mg)

67 ± 0,3

50 ± 3

59 ± 2

55 ± 2

66 ± 6

72 ± 5

64 ± 5

59 ± 4

Rins (mg)

13 ± 1

10 ± 2

18 ± 4

18 ± 1

14 ± 2

14 ± 3

14 ± 6

13 ± 5

5.20 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca

(FC) de ratos normotensos e hipertensos (L-NAME)

A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais

normotensos induziu uma resposta transiente, independente de dose, caracterizada por

hipotensão (PAM (%)= -10,5 ± 2,7; -7,1 ± 0,90; -8,3 ± 2,3; -7 ± 0,90; -8,9 ± 1,3; -5,3 ± 1

mmHg) associada a uma taquicardia (FC (%)= 6,5 ± 4,5; 10 ± 2,5; 10,2 ± 3,10; 12,5 ±

2,9; 8,5 ± 1,3; 10,3 ± 2 bpm). Efeitos similares foram observados nos animais

hipertensos L-NAME (PAM (%) = -6,5 ± 0,5; -10,9 ± 2,0; -12,7 ± 0,9; -11,8 ± 2,8; -16,1 ±

2,7; -14,9 ± 2,6 mmHg) e (FC (%) = 6,5 ± 4,2; 10,0 ± 2,5; 10,2 ± 3,1; 12,5 ± 2,9; 8,5 ±

1,3; 10,3 ± 2,0; 15,9 ± 3,6 bpm). Os valores de PAM dos animais hipertensos foi

potencializada nas concentrações de 1 e 5 mg/Kg, quando comparada com seus

respectivos controles, enquanto que para a FC observou-se uma potencialização do

efeito taquicárdico nas doses de 0,5 e 5mg/Kg (n=6) (Gráfico 17).

Gráfico 17: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (controle) e hipertensos (L-NAME). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 e ** p<0,01 vs controle.

5.21 Acompanhamento da instalação da hipertensão pelo registro da Pressão

Arterial Sistólica (PAS) semanal dos animais normotensos (SHAM) e com

hipertensos renovascular (2R-1C)

Os valores da PAS dos animais normotensos (SHAM) e com hipertesão

renovascular (2R-1C) foi acompanhada semanalmente pelo método indireto de

plestimografia de cauda. Os valores médios para os animais SHAM vs 2R1C foram:

PAS = 111,0 ± 0,71 vs 110,6 ± 0,54, para a primeira semana, PAS = 118,1 ± 0,65 vs

146,6 ± 1,0, para a segunda semana, PAS = 124,1 ± 1 vs 183,9 ± 2,1 para a terceira

semana e PAS = 127,4 ± 0,9 vs 203,4 ± 0,78, para a quarta semana. Os valores de

pressão apresentaram diferenças significativas a partir da segunda semana da indução

da hipertensão (n=6) (Gráfico 12).

0 1 2 3 4

100

130

160

190

220

2R1C

SHAM

***

***

***

Semanas

Pre

ssão

Art

eria

l S

istó

lica

(m

mH

g)

Gráfico 18: Valores médios percentuais da pressão arterial sistólica pela medida de pressão caudal em animais em ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 14 animais por grupo. *** p<0,0001 vs SHAM.

5.22 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca

(FC) de ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C)

A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais

normotensos SHAM induziu uma resposta transiente, independente de dose,

caracterizada por hipotensão (PAM (%) = -8,4 ± 1,5; -6,3 ± 1,1; -8,6 ± 1,7; -7,7 ± 1,3; -

12,4 ± 2,2; -5,5 ± 1,3 mmHg) associada a uma taquicardia (FC (%) = 5,4 ± 1,6; 5,0 ±

1,4; 5,3 ± 1,0; 7,1 ± 2,4; 7,0 ± 2,9; 6,2 ± 1,7 bpm) (FC (%). Efeitos similares foram

observados nos animais hipertensos 2R1C (PAM (%) = -9,3 ± 0,8; -8,1 ± 1,0; -9,5 ± 1,5;

-9,2 ± 1,1; -15,9 ± 2,4; -7,9 ± 1,6 mmHg) e (FC (%) = 12,4 ± 2,0; 10,5 ± 2,1; 16,3 ± 2,7;

10,9 ± 2,6; 17,4 ± 2,7; 5,4 ± 0,7 bpm). Os valores de PAM dos animais 2R1C

permaneceram inalterados quando comparada com seus respectivos controles,

enquanto que para a FC observou-se uma potencialização do efeito taquicárdico nas

doses isoladas de 0,01; 0,1 e 1mg/Kg (n=6) (Gráfico 19).

Gráfico 19: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (SHAM) e hipertensos (2R1C). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs SHAM.

5.23 Efeito do CMMTT sobre a pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca

(FC) de ratos de Lyon normotensos (LL) e hipertensos (LH)

A administração do CMMTT (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/kg i.v.) em animais LL

induziu uma resposta transiente, independente de dose, caracterizada por hipotensão

(PAM (%)= -6,1 ± 1,6; -6,6 ± 2,2; -7,9 ± 2,1; -7,2 ± 2,4; -4,6 ± 1,0; -5,4 ± 2,1 mmHg)

associada a uma taquicardia (FC (%)= 10,3 ± 2,8; 5,5 ± 2,1; 5,4 ± 1,6; 4,9 ± 1,8; 7,5 ±

3,1; 11,3 ± 2,9 bpm). Efeitos similares foram observados nos animais hipertensos L-

NAME (PAM (%) = -8,0 ± 1,1; -6,9 ± 1,7; -7,8 ± 1,7; -9,5 ± 1,4; -12,4 ± 2,5; -7,8 ± 1,1

mmHg) e (FC (%) = 4 ± 3,1; 5,4 ± 1,4; 6,8 ± 2,1; 5,5 ± 1,4; 8,2 ± 2,1; 8,5 ± 2,8 bpm). Os

valores de PAM dos animais LH foi potencializada na dose de 1 mg/Kg, quando

comparada com seus respectivos controles, enquanto que para a FC permaneceu

inalterada (n=6) (Gráfico 20).

Gráfico 20: Valores médios percentuais do efeito da administração aguda de doses crescentes do composto mesoiônico CMMTT (0,05; 0,01; 0,5; 0,1; 1 e 5 mg/kg, i.v., randomicamente) sobre a pressão arterial média (A) e freqüência cardíaca (B) em ratos normotensos (LL) e hipertensos (LH). Os valores estão expressos como média ± e.p.m. de 6 experimentos. * p<0,05 vs LL.

DISCUSSAO

6 DISCUSSÃO

Diante dos resultados apresentados, foi constatado que a atividade vasorelaxante

do CMMTT apresentou maior potência farmacológica, em artéria mesentérica superior

isolada de rato, quando comparada a aorta de rato. Este efeito é mediado, provavelmente,

pela ativação da enzima eNOS de maneira independente do aumento da [Ca2+]i,

aumentando a liberação de NO e culminando na ativação de canais para K+ e inativação

dos canais para Ca2+ sensíveis a voltagem na membrana plasmática da célula muscular lisa

de artéria mesentérica, induzindo o relaxamento. Além disso, contatou-se a atividade

hipotensora e taquicárdica em ratos normotensos e hipertensos, sendo responsável por

induzir alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do

endotélio funcional em animais hipertensos L-NAME.

Os compostos mesoiônicos é uma classe de compostos sintéticos largamente

estudados e reportados na literatura como sendo estruturas químicas que apresentam

uma variedade de atividade biológica comprovada, em diferentes sistemas biológicos,

incluindo o sistema cardiovascular (CORELL et al.,1994). Estudos anteriores realizado

com o CMMTT em ratos normotensos foram constatadas atividades hipotensora e

taquicárdica de maneira independente de dose em ratos normotensos, decorrente de

uma provável diminuição da resistência vascular periférica. E em anéis de artéria

mesentérica o CMMTT mostrou uma potente atividade vasorelaxante dependente do

endotélio vascular, envolvendo a participação da via L-arginina- NO- GMPc (CAVALCANTE

et al., 2004). No entanto, até o momento, nenhum registro de estudos investigando o efeito

de CMMTT em outro tecido vascular ou em modelos de hipertensão foi evidenciado, fato que

proporcionou aumento no interesse de continuar nas investigações farmacológicas deste

composto inédito.

Furchgott e Zawadzki (1980), foi quem primeiro demonstrou o vasorelaxamento

dependente do endotélio vascular em aorta de coelho, em resposta a ACh.

Posteriormente outros trabalhos na literatura relataram através de estudos in vitro, que

em vasos de grande condutância como a aorta, a ACh é capaz de promover um efeito

vasorelaxante predominantemente mediado pelo NO (FREITAS et al., 2003; NAGAO et

al.,1992; SHIMOKAWA et al., 1996). Baseado neste dados, passou-se a caracterizar o

efeito vasorelaxante do CMMTT em anéis de aorta torácica de rato, visto que o

mecanismo sugerido para o efeito vasorelaxante induzido pelo CMMTT em anéis de

artéria mesentérica foi, majoritariamente, pela ativação da via L-arginina-NO-cGMP

(CAVALCANTE et al., 2004).

Em estudos preliminares foi observado que CMMTT, nas concentrações utilizadas,

induziu um vasorelaxamento discreto em anéis aorta torácica de ratos normotensos, com

endotélio intacto, pré-contraídos com FEN, um agonista α1-adrenérgico, porém o

relaxamento, na ausência do endotélio funcional, foi significativamente abolido. Estes

resultados reforçaram as premissas da necessidade do endotélio funcional integro para que

o CMMTT exerça o seu efeito vasodilatador. Entretanto, o efeito no vaso de condutância

apresentou menor potência farmacológica quando comparados aos resultados anteriormente

obtidos, realizados em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato (CAVALCANTE

et al., 2004).

É importante salientar que as respostas farmacológicas obtidas após administração

de determinadas substâncias podem variar devido a vários fatores, como por exemplo, com

a especificidade desta por determinado sítio de ação, com a densidade da molécula – alvo

sobre a qual age a substância, como também o tecido que a molécula – alvo se encontra.

Em relação às diferenças entre tecidos, os leitos vasculares são diferentes no que diz

respeito à fisiologia, a densidade e tipo de receptores que expressam, bem como a maneira

que responde as várias substâncias (VANHEEL et al., 2000; GURNEY, 1994; COX, 2002;

BYLUND, 1994; INSEL, 1996). Diante destas premissas, foram utilizadas neste estudo,

artérias mesentéricas de rato, como o órgão isolado para investigar o mecanismo de ação do

CMMTT.

O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na regulação

do tônus vascular e pressão sangüínea (VANHEEL et al., 2000). Vários trabalhos na

literatura têm mostrado o importante papel desempenhado pelo endotélio nos relaxamentos

induzidos por uma variedade de substâncias químicas, endógenas e exógenas

(FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; COHEN; VANHOUTTE, 1995; CHAUHAN et al, 2003).

As células endoteliais, em resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos (bradicinina,

acetilcolina, histamina, substância P, estresse de cisalhamento), liberam substâncias ativas

com propriedades vasodilatadoras (VANHEEL et al., 2000).

A vasodilatação regulada pelo endotélio é determinada por três componentes

principais; o NO, as prostaciclinas e o EDHF (MONCADA; VANE, 1979; FÉLÉTOU;

VANHOUTTE, 1988). Dentre estes fatores o NO, sintetizado pela enzima sintase do NO

(NOS), é o principal fator relaxante na maioria dos leitos vasculares (MAYER et al.,

1999) e seu envolvimento no vasorelaxamento induzido pelo CMMTT, nos estudos

prévios, é sugerido como o mecanismo de ação principal, porém faz-se necessário

avaliar a participação de outros EDRFs nesta resposta relaxante dependente de

endotélio (CAVALCANTE, et al., 2004).

Além do NO, outros EDRFs têm sido extensamente estudados (CHAUHAN et

al.,2003). Algumas evidências demonstram que o EDHF apresenta uma pequena

participação no vasorelaxamento dependente do endotélio em vasos de condutância,

sendo responsável por um maior efeito nos vasos de resistência (HWA et al., 1994;

CHAUHAN et al., 2003). Entretanto, sua identidade ainda é bastante controversa.

Alguns trabalhos sugerem alguns candidatos como o íon potássio (EDWARDS et al.,

1998), o ácido epoxieicosatrienóico (EET), um metabólito do ácido araquidônico e

derivado da via do citocromo P450 (GEREMEDHIN et al., 1992; CAMPBELL et al., 1996;

CAMPBELL; HARDER, 1999) e o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma forma não-

radicalar de espécies reativa de oxigênio, que pode se produzido pelo endotélio e

células musculares lisas (GRIENDLING et al., 2000).

No entanto, sabe-se que ao ser liberado do endotélio, o EDHF difunde-se para

as células da musculatura lisa (CHEN et al., 1991), ativa canais para K+ aumentando o

efluxo de K+ da célula e hiperpolariza a membrana (CHEN; SUZUKI, 1989), reduzindo o

influxo de Ca2+ através do bloqueio dos canais para Ca+2 sensíveis à voltagem

(GOLDFRAIND; GOVONI, 1995) e diminuindo, portanto, a [Ca+2]i e a fosforilação da

MLC, promovendo assim o relaxamento (REMBOLD, 1996).

Alguns canais para K+ estão implicados neste efeito para diferentes leitos

vasculares, e uma especial atenção está voltada para os canais para K+ ativados por

Ca++, visto que a modulação do fluxo para K+ pela alteração da concentração de K+

extracelular (CHEN, SUZUKI, 1989) ou inibição específica de canais para K+, são

capazes de inibir a resposta atribuída ao EDHF. Os canais SK e IK parecem participar

da resposta vasodilatadora induzida pelo EDHF. A combinação da ChTX e apamina foi

capaz de inibir a vasodilatação endotelial de leitos arteriais induzida por acetilcolina,

substância P, mediada pelo EDHF (BURNHAM et al., 2002; BYCHKOV et al., 2002;

EDWARDS et al., 1999).

Diante destas considerações, foi investigado a influência do EDHF derivado do

endotélio, na resposta vasorelaxante induzida por CMMTT. Para tanto, foram realizados

experimentos com preparações pré-contraídas com FEN 10 µM, na presença de

caribdotoxina (ChTX) (100 nM) mais apamina (100 nM), inibidores da resposta vascular

atribuída ao EDHF (GHISDAL; MOREL, 2001) e nestas condições experimentais os

bloqueadores não foram capazes de alterar a resposta induzida pelo CMMTT,

sugerindo que o EDHF parece não participar no efeito vasodilatador induzido pelo

CMMTT.

Por fim, outro potente vasodilatador tanto dependente quanto independente de

endotélio é a PGI2, (SCHULZ; TRIGGLE, 1994) que participa ativamente no controle

local do tônus vascular. Nos vasos, a PGI2 é formada em células endoteliais vasculares

a partir de um aumento na [Ca2+]i que ativa uma seqüência de reações enzimáticas

iniciada pela fosfolipase A2 (PLA2). Esta enzima degrada fosfolipídeos de membrana, a

fosfatidilcolina, formando o ácido araquidônico (AA), que por sua vez sofre a ação da

ciclooxigenase do tipo 1 (COX1) para formar a PGI2 (SMITH, 1992). Somado a isto, é

conhecido que em muitos leitos vasculares, a estimulação dos receptores muscarínicos

endoteliais produz vasorelaxameto em aorta de coelho e rato via liberação de fatores

relaxantes derivados do endotélio (CHOO et al., 1996; EGLEN et al., 1985). Para

avaliar a hipótese se os metabólitos do ácido araquidônico derivados a partir da via da

ciclooxigenase e a ativação dos receptores muscarínicos poderiam participar do efeito

relaxante induzido por CMMTT, foi utilizada a indometacina (10 µM), inibidor da

ciclooxigenase (COX1) (CLARK; FUCHS, 1997), associada atropina (1 nM), antagonista

dos receptores muscarínicos não-seletivo (100 nM) (SHIRAKI, 2001) e foi evidenciado

que nem os receptores muscarínicos, nem a via da COX1 participa do efeito atribuído

ao CMMTT. Todos estes resultados que investigam da participação da via da COX1,

dos receptores muscarínicos e do EDHF, nos permite sugerir que o NO é o principal

agente vasoativo responsável pelo efeito relaxante mediado pelo composto mesoiônico

CMMTT em artéria mesentérica.

A biossíntese do NO é catalisada pela NOS que é responsável pela oxidação da

L-arginina (L-Arg) a L-citrulina (L-Cit) com geração de NO. Primeiramente, a L-Arg é

hidroxilada ao intermediário L-NG-hidroxiarginina (NOH-L-Arg; também pode agir como

substrato para NOS), através de uma oxidação análoga àquelas catalisadas pelo

citocromo P450 (GRIFFITH et al., 1995; MARLETTA, 1993; ABU-SOUD et al.,1997).

Em seguida, o NOH-L-Arg é convertido em L-Citrulina e NO, envolvendo oxidação pela

perda de um único elétron do NADPH (HEMMENS et al. 1998; LOPEZ-RAMOS et. al.,

2005). Após sua formação pelas células endoteliais (eNOS), o NO difunde-se para o

músculo liso adjacente, devido a suas características lipossolúveis, ativa a ciclase de

guanilil solúvel, levando a um aumento nos níveis intracelulares de GMPc e

conseqüente relaxamento do músculo liso vascular através de um mecanismo mediado

por proteínas cinases dependentes de GMPc (PKG) (IGNARRO et al., 1986).

A meia-vida do NO é muito curta, nitrato, nitrito e outros compostos nitrosilados

(NOxs), que são metabólitos estáveis do NO, são usualmente medidos para determinar

a produção de NO (LÓPEZ-RAMOS et al., 2005).

Para reforçar as evidências funcionais que CMMTT promoveria realmente um

aumento na síntese de NO para induzir seus efeitos relaxantes sobre o sistema

cardiovascular, foi realizado experimentos em anéis de artéria mesentérica superior e

aorta torácica isolada de rato, e mensurado os níveis de NOx como um indício da

produção de NO antes e após a administração do composto mesoiônico, comparado a

resposta obtida após administração da ACh, usada como controle positivo.

Em anéis de artéria mesentérica superior pré contraídos com FEN (10-6 M), o

CMMTT foi capaz de aumentar, de maneira dependente de concentração, os níveis de

NOx,. Interessantemente, na concentração que atingiu o efeito máximo (10-6 M) nos

experimentos funcionais, foi similar à ACh. Estes efeitos foram completamente abolidos

após remoção do endotélio funcional, sugerindo que o aumento dos níveis de NOx

induzidos pela CMMTT e pela ACh são completamente dependentes da presença do

endotélio vascular. Em anéis de aorta torácica foi observado aumento nos níveis de

NOx para a ACh e para o CMMTT na concentração de 10-5 M, nos tempos de 30 e 60

min., porém mesmo nesta concentração o valor da [NOx] pmoles é inferior aos

observados na artéria mesentérica, o aumento nos níveis de NO observados foram

abolidos na ausência do endotélio funcional. Os resultados apresentados corroboram

com os resultados funcionais obtidos para cada vaso especificamente, demonstrando

que o CMMTT, nas concentrações utilizadas, parece exercer uma resposta

farmacológica diferenciada para os diferentes tipos de vasos.

Vários autores têm apresentado evidências acerca do envolvimento direto e

indireto dos canais para K+ na via de sinalização responsável pelo vasorelaxamento

induzido pelo NO (BOLOTINA et al.; 1994; HOMER e WANSTALL, 2000). Para verificar

se os canais para K+ estão sendo ativados pelo NO liberado mediante indução do

CMMTT, experimentos foram realizados na presença de KCl 20 mM, condição esta que

promove um bloqueio parcial do efluxo de K+ por deslocar o potencial de equilíbrio do

K+ (em torno de - 84 mV para - 52 mV) para valores mais próximos do potencial de

repouso dos miócitos (em torno -60 a -40 mV) e atenuando desta forma relaxamentos

mediados pela abertura de canais para K+ (GURNEY, 1994; CLARK e FUCHS, 1997).

O aumento do K+ extracelular de 4 para 20 mM alterou significativamente o

vasorelaxamento dependente de concentração induzido pelo CMMTT, com atenuação

de seu Emax, sugerindo que a resposta relaxante induzida pelo composto mesoiônico

estudado parece envolver a ativação de canais para K+.

Vários subtipos de canais para K+ já foram caracterizados na musculatura lisa

vascular, no entanto, apenas quatro deles parecem estar envolvidos na regulação do

tônus vascular: os sensíveis ao ATP (KATP), os sensíveis ao Ca2+ de grande

condutância (BKCa2+) e de pequena condutância (SKCa

2+), e os dependentes de

voltagem (Kv) (ADEAGBO, 1999). Além destes, os canais Kir são canais ativados por

potenciais de membrana e por alteração na concentração do K+ extracelular (QUAYLE,

1993).

Dentre os diferentes tipos de canais, maior ênfase esta voltada para os canais Kv,

alguns membros desta família de canais são chamados também de canais para K+

retificadores de saída, são ativados por despolarização de membrana plasmática e estão

presentes em todas as células musculares lisas. Estes canais são muito importantes na fase

de repolarização do potencial de ação (HILLE, 1992); os BKca são canais ativados por influxo

de Ca2+ (ZHANG et al., 2005), e são ricamente expressos nos miócitos vasculares da

microcirculação (ASANO, MASUZAWA-ITO E MATSUDA, 1993). São ativados por

despolarização do potencial de membrana e por Ca2+ intracelular (FARACI; SOBEY, 1998;

CAI et al., 2007).

Devido à existência destes vários tipos de canais para K+ nas células musculares lisas

e da necessidade de identificar qual subtipo de canal para potássio poderia estar

participando da resposta vasorelaxante, induzida pelo CMMTT. Foram realizados

experimentos para obtenção de curvas concentração-resposta para o composto mesoiônico

após a incubação com 4-AP (1mM), bloqueador dos canais para KV (GHISDAL;

MOREL, 2001), glibenclamida (10 µM), um bloqueador seletivo para KATP (WANG et al,

2007), TEA (1mM), bloqueadores seletivos para BKCa2+ (COX et. al., 2002) e BaCl2, um

bloqueador dos canais retificadores de entrada (EDWARDS et al., 1998; KAWABATA et al.,

2004), separadamente.

Nestes experimentos, a curva concentração-resposta do CMMTT foi deslocada

significativamente para direita apenas na presença do BaCl2 (pD2 = 9,13 ± 0,18), enquanto

que a presença do TEA e 4 AP, separadamente, foi capaz de atenuar significativamente

os relaxamentos induzidos pelo CMMTT com diminuição significativa do efeito máximo

(Emax = 26,40 ± 4,02 e 12,8 ± 8,9, respectivamente) e foi observada nas curvas

concentração-resposta obtidas na presença de glibenclamida, alterações significativas,

apenas nas últimas concentrações. Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação do

CMMTT para induzir relaxamento em artéria mesentérica, parece envolver uma via de

sinalização celular que altera a atividade de canais para K+, principalmente canais KV, KIR e

BKCa2+, aumentando o efluxo de K+, resultando em repolarização das células musculares

lisas, fechamento dos canais para Ca2+ sensíveis a voltagem e ativação do trocador

Na+/Ca2+ na membrana. Todos estes eventos levam a uma redução da [Ca2+]i e

vasodilatação.

É importante ressaltar que o NO não apenas pode ser formado nas células

endoteliais, mas também nas células musculares lisas vasculares (SCHINI;

VANHOUTTE et al, 1991) e no Sistema Nervoso Central, assim como no Sistema

Nervoso Autônomo (KLIMASCHEWISKI, et. al., 1992). Embora o papel fisiológico do

NO nestes sítios não esteja completamente elucidado, o NO endógeno pode estar

envolvido na regulação da função do barorreflexo através do seu efeito nos

componentes aferente central ou eferente do arco baroreflexo, sua importância

fisiológica deve-se ao fato do NO poder atuar como um importante segundo -

mensageiro, ativando ou inibindo diversas moléculas-alvo envolvidas em processos tão

diversos quanto à regulação do tônus vascular, controle imunológico e

neurotransmissão (KUMAGAI, et. al., 1993).

Baseado nestas influências do NO, principalmente sobre a PA e sobre o sistema

nervoso foi realizado um estudo preliminar comportamental, com doses elevadas do

CMMTT, primeiro para caracterizar a toxicidade aguda e segundo para observar de

modo geral as alterações comportamentais provenientes do tratamento do composto

mesoiônico e sua influência central. Neste estudo, nas doses investigadas, foram

observados efeitos sugestivos de uma possível atividade depressora do SNC e com

ação sobre o SNA, principalmente após os 120 minutos seguintes a administração,

devido à apresentação de sintomas como ptose (fechamento da pálpebra do animal),

catatonia, analgesia, diminuição da ambulação, respiração forçada e constipação. Estes

dados sugerem que os camundongos tratados com CMMTT apresentam alterações

comportamentais, sugestivas de atividades, predominantemente, sobre o sistema

autônomo e depressoras do SNC.

Adicionalmente, é necessário ressaltar, que CMMTT possui efeito tóxico

diferente entre camundongos machos e fêmeas, sendo as fêmeas mais sensíveis na

dose de 100mg/Kg e similar entre os sexos na dose de 50 mg/Kg do composto

estudado. Após 14 dias da administração de uma dose de 50 e 100 mg/Kg i.v.. O

CMMTT não causou nenhuma alteração macroscópica nos órgãos vitais estudados e,

devido aos estudos serem realizados em animais macho, é possível inferir que a dose

máxima utilizada nos experimento in vivo (5 mg/Kg), não apresenta risco de toxicidade

para o estudo.

Sequencialmente, iniciou-se a avaliação da atividade anti-hipertensiva do

CMMTT em diferentes modelos de hipertensão tais como: hipertensão L-NAME,

hipertensão renovascular 2R1C e nos ratos hipertensos de Lyon.

A pressão arterial sistólica (PAS) reflete diretamente na proporção das alterações

do débito cardíaco e a pressão arterial diastólica sobre a eficiência do mecanismo

vasodilatador local dos músculos em atividade, que é tanto maior quanto maior for a

densidade capilar local (BARROS NETO et al., 1999). Nos três modelos de hipertensão

e seus respectivos controles o CMMTT promoveu um efeito hipotensor e taquicárdico,

de maneira independente de doses. A atividade anti-hipertensiva foi observada para os

modelos de hipertensão L-NAME, nas últimas doses.

Estudos anteriores utilizando metodologia in vitro mostram que o CMMTT

apresenta um efeito relaxante em artéria mesentérica de ratos (CAVALCANTE et al,

2004), com base nestes dados e com os achados deste trabalho é possível sugerir que

a resposta hipotensora induzida pelo CMMTT nos três modelo experimental, são

similares e parece ser mediada por um efeito vascular, com diminuição da resistência

vascular periférica e consequente diminuição da PA.

Baseados nos resultados obtidos nos ensaios in vitro com artéria mesentérica

superior isolada de rato, caracterizando o envolvimento do NO na resposta

vasorelaxante, foi investigado a suposição de mudanças do efeito vasodilatador do

CMMTT em artérias mesentéricas de ratos com hipertensão NO deficiente (L-NAME),

devido ao efeito potencializado nas últimas doses. E foi observado que, em anéis

mesentéricos com endotélio funcional íntegro e pré-contraídos com FEN (10 µM), o

CMMTT induziu um vasorelaxamento dependente de concentração e com magnitude

de efeito máximo significativamente maior (Emax = 95,63 ± 2,8%). Estes resultados

demonstraram que o CMMTT apresenta, neste modelo de hipertensão, um perfil

farmacológico diferenciado, em concentrações mais elevadas, com maior eficácia

farmacológica em relação aos efeitos apresentados em normotensos, além disso, os

efeitos observados in vivo corroboram positivamente com esta hipótese.

Dados da literatura indicam que a inibição ou a produção deficiente de óxido

nítrico no organismo pode ser responsável por uma série de transformações que atuam

em sinergia com outros fatores de risco cardiovasculares (RAMOS et al, 2006). A

hipertensão L-NAME devido ao efeito prolongado na deficiência contínua da produção

do óxido nítrico pelo endotélio vascular (RIBEIRO et al., 1992), interfere em outros

sistemas como no aumento do tônus simpático (CUNHA et al, 1993), aumento da

atividade do sistema renina-angiotensa (RIBEIRO et al., 1992), aumento das

responsividade vascular a agonistas adrenérgicos (MACLEID, 1982), aumento na

sensibilidade dos canais para cálcio (ABEBE et al., 1990) e aumento do estresse

oxidativo devido ao aumento produção de radicais livres e a diminuição dos sistemas

antioxidante (BAGNES, 1992).

Diante destas constatações e dos resultados anteriormente mencionados,

passou-se a investigar a reatividade vascular sobre o efeito vasopressor da FEN e o

vasorelaxante do ACh e NPS, dependente e independente do endotélio,

respectivamente, em anéis de artéria mesentérica isolada de ratos normotensos e

hipertensos L-NAME, usando para estes estudos a concentração do CMMTT (10-6 M)

que foi capaz de causar alteração na resposta vasorelaxante dos anéis mesentéricos

dos animais hipertensos estudados.

Os resultados apresentados mostraram um aumento significante do efeito

vasopressor da FEN dependente e independente do endotélio em animais hipertensos

em anéis de artéria mesentérica. Estes resultados iniciais estão de acordo com estudos

que demonstram que o aumento dos níveis da pressão sanguínea está associado ao

aumento da reatividade para os α-adrenoceptores, vista em algumas preparações

vasculares como anéis de aorta (OBIEFUNA et al., 1991 a,b) e preparações de leito

mesentérico (SOFOLA et al., 2002). A inibição da NOS, talvez seja suficiente para

modular a resposta contrátil da FEN, visto que o NO é uma substância que modula

negativamente a atividade dos agentes contracturantes (MARIN; SANCHEZ-FERRER,

1990; LUSCHER; TANNER, 1993). Interessantemente, quando as preparações foram

pré-incubadas com o CMMTT o aumento a responsividade vascular para o efeito

vasopressor induzido pela fenilefrina nos animais hipertensos foi atenuado nos anéis

com endotélio intacto, sugerindo que o CMMTT interferi na resposta contrátil induzida

pela FEN nas células do músculo liso vascular.

A importância do endotélio na regulação do tônus e das respostas contráteis do

músculo liso vascular pela liberação de fatores endoteliais em condições basais ou em

resposta a estímulo já é bastante conhecida (FURCHGOTT e VANHOUTTE, 1980;

REES et al., 1989). Diante destas considerações, e adicionado aos dados da

importância do endotélio sobre os efeitos do CMMTT, foi avaliada a influência do

endotélio sobre a resposta contrátil da FEN na presença e ausência do CMMTT, e os

resultados desse estudo demonstraram que em anéis de artéria mesentérica cujo

endotélio funcional foi mecanicamente removido a resposta induzida pela fenilefrina não

mostrou diferença significativa na presença nem na ausência do CMMTT dos animais

normotensos (Emax = 37 ± 7,2 e 39,8 ± 4,5, respectivamente) e hipertensos (Emax = 62 ±

6,1 e 70,7 ± 5,8, respectivamente), reforçando os achados que sugerem que o CMMTT

precisa da integridade endotelial para exercer seus efeitos (CAVALCANTE et al., 2004).

Um resultado interessante é que a sensibilidade de contração para a fenilefrina

dos animais hipertensos em anéis com o endotélio funcional mostra-se maior

comparado aos anéis sem endotélio funcional. Estes resultados estão de acordo com

alguns relatos na literatura que apontam que a liberação de fatores vasoconstrictores

derivados do endotélio pela via da ciclooxigenase, com o envolvimento dos

prostanóides (TXA2, PGH2) no efeito causado pela inibição do NO (ZIYAT et al, 1996),

também são responsáveis pelo desenvolvimento e manutenção da hipertensão e

disfunção vascular (LUSCHER; VANHOUTTE, 1986; Carvalho 1999).

É bem descrito na literatura que doenças cardiovasculares, como a hipertensão,

desencadeiam mudanças estruturais e funcionais nos vasos sanguíneos (COHUET;

STRUIJKER-BOUDIER, 2006) e a integridade das células endoteliais é essencial para o

relaxamento induzido pela acetilcolina (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). No estudo da

reatividade para a ACh, os resultados demonstram que o relaxamento dependente do

endotélio vascular foi reduzido em ratos hipertensos (Emax = 66,7 ± 10,3) quando

comparados aos ratos normotensos (Emax = 100 ± 2,8). O efeito vasorelaxante

dependente do endotélio induzido pela ACh foi significantemente potencializado após à

incubação do CMMTT nos anéis mesentéricos dos animais hipertensos com valores

similares observados nos anéis de artéria mesentérica de animais normotensos (Emax =

99,22 ± 4,6) (dados não mostrados), porém, a pré-incubação com o CMMTT não afeta o

efeito relaxante induzido pela ACh em anéis de artéria mesentérica de ratos

normotensos. Sugerindo que o CMMTT parece modular positivamente o efeito induzido

pela ACh neste modelo de hipertensão. É importante ressaltar que o aumento na

produção do NO ou uma diminuição na degradação do mesmo contribui beneficamente

para este efeito, porém outros estudos são necessário para sugerir o mecanismo pelo

qual o CMMTT exerce este efeito.

Está claro que neste modelo de hipertensão a produção e liberação do NO

parece estar reduzida. Outros estudos reportam que o tratamento crônico de L-NAME

induz um modelo de doença hipertensiva, cuja diminuição da atividade da NOS resulta

na diminuição crônica nos níveis de GMPc nas artérias.(ARNAL et al., 1992). É relatado

também que o tratamento crônico com o L-NAME diminui os níveis de GMPc aórticos,

porém não afeta a habilidade dos vasos em produzir GMPc na estimulação por um

doador do NO (ARNAL, 1992) e os resultados deste trabalho corroboram com estes

dados, visto que o efeito vasorrelaxante independente do endotélio induzido pelo NPS,

um doador de NO que exerce seu efeito pela ativação da guanilato ciclase solúvel e

formação do GMPc, não foi alterado na presença e ausência do CMMTT, apresentando

um perfil semelhante nos animais normotensos e hipertensos. Sugerindo que o CMMTT

não interfere no efeito relaxante induzido pelo NPS, visto que a atividade relaxante do

composto só é observada na presença do endotélio funcional.

Por outro lado, a administração de CMMTT em anéis de artéria mesentérica

superior na ausência de FEN de animais normotensos não foi capaz de aumentar os

níveis de NOx, corroborando com os resultados funcionais, onde foi verificado que

CMMTT (10-6 M) não modifica o tônus basal nestas artérias (dados não mostrados),

como também não potencializa a resposta vasorelaxante induzida pela ACh de animais

normotensos. É relatado na literatura que a liberação de NO no basal é dependente do

nível de tônus vascular (ADEAGBO et. al., 1994).

As células endoteliais são capazes de produzir NO a partir da oxidação de um

dos átomos de nitrogênio guanidinico terminais do aminoácido L-arginina por uma

oxigenase cálcio-calmodulina dependente, a sintase do óxido nítrico endotelial (eNOS)

(PALMER et al., 1988).

A fim de avaliar a hipótese do aumento da [Ca2+]i ser necessária para a ativação

da eNOS na resposta induzida pelo CMMTT foi realizado experimentos bioquímicos

para medida de [Ca2+]i utilizando a sonda de fluorescência Fura-2 AM em cultura

primária de célula endotelial de artéria mesentérica superior de rato, onde pode-se

verificar que o CMMTT não foi capaz de aumentar a concentração de Ca2+ intracelular

de, e que este efeito foi observado pela ACh utilizada como controle positivo. Estes

resultados nos permite propor como possível hipótese para a ativação da eNOS como

passo necessário para observar o efeito induzido pelo CMMTT, uma via independente

do cálcio.

Relatos na literatura afirmam que a eNOS necessita do aumento do cálcio

intracelular para exercer o seu efeito (PALMER et al., 1988; COLLEEN et al.,2000),

entretanto é descrita uma via de sinalização para ativação da eNOS em baixos níveis

de cálcio, que é mediada pela Akt (PKB) que pode fosforilar a eNOS (Ser 1179), por

um mecanismo dependente de PI3 quinase, independente da liberação do cálcio

intracelular, resultando em aumento dos níveis do NO (DAVID et al., 1999; ERIC et al.,

2007). No entanto estudos adicionais são necessários para melhor caracterizar o efeito

do CMMTT sobre a ativação da eNOS e da resposta vasomotora em anéis de artéria

mesentérica de rato.

Por fim, estes resultados em conjunto sugerem que o CMMTT apresenta um

melhor efeito relaxante em anéis de artéria mesentérica de rato de maneira dependente

do endotélio funcional, que envolve liberação de NO, independente do cálcio, e ativação

de canais para K+ (Kv,Kir, KATP e BKCa ). Além disso, o CMMTT parece interferir

significativamente sobre a reatividade vascular, dependente do endotélio em animais

normotensos e hipertensos L-NAME. Este composto apresenta ainda um efeito

hipotensor e taquicárdico, independente de doses, em diferentes modelos de animais

normotensos e hipertensão. No entanto, estudos posteriores serão necessários para

elucidar claramente o mecanismo de ativação da eNOS.

7 CONCLUSÃO

O presente estudo, constatou atividade hipotensora e taquicárdica em diferentes

modelos de animais normotensos e hipertensos, e atividade anti-hipertensiva nos

animais hipertensos L-NAME. Foi demonstrado também, maior potência farmacológica

em artéria mesentérica superior isolada de rato, quando comparada a aorta de rato. Este

efeito na artéria mesentérica foi mediado, provavelmente, pela ativação da enzima eNOS

de maneira independente do aumento da [Ca2+]i, aumentando a liberação de NO e

ativação dos canais para K+ do tipo Kv,Kir, e BKCa2+, e nas maiores concentrações o

KATP, induzindo o relaxamento. Além disso, o CMMTT também foi responsável por induzir

alteração na reatividade vascular para a FEN e ACh, de maneira dependente do

endotélio funcional em animais hipertensos L-NAME.

8 PERSPECTIVAS

1) Investigar o mecanismo molecular de ativação da eNOS induzido pelo CMMTT em

anéis de artéria mesentérica superior de rato normotenso;

2) Avaliar a participação da via akt/eNOS na resposta vasorelaxante induzida pelo

CMMTT em artéria mesentérica superior isolada de rato normotenso;

3) Caracterizar, o mecanismo de ação do efeito vasorelaxante do CMMTT em

animais hipertensos L-NAME;

4) Analisar a influência do CMMTT sobre a atividade da enzima eNOS em artéria

mesentérica de ratos normotensos e hipertensos L-NAME;

5) Investigar o mecanismo molecular envolvido nos efeitos cardiovasculares

induzidos por CMMTT em animais hipertensos;

6) Estudar o efeito crônico do CMMTT em diferentes fases e modelos da hipertensão

arterial;

7) Complementar os estudos farmacológicos de toxicidade e pré-clínicos para melhor

caracterizar os efeitos cardiovasculares.

REFERÊNCIAS

ABU-SOUD, H. M.; PRESTA, A.; MAYER, B., et al. Analyses of neuronal NO synthase under single-turnover conditions: conversion of Nω-hydroxyarginine to nitric oxide and citrulline. Biochemistry; 36: 10811-10816, 1997.

ADEAGBO, A. S. O. 1-Ethyl-2-benzimidazolinone stimulates endothelial KCa channels and nitric oxide formation in rat mesenteric vessels. Eur. Journal Pharmacol.; 379: 151-159, 1999.

ALMEIDA, R. N.; HIRUMA, C. A.; BARBOSA-FILHO, J. M. Analgesic effect of rotundifolone in rodents. Fitoterapia; 67: 334-338, 1996.

ALTURA, B. M.; ALTURA, B. T. Differential effects of substrate depletion on drug-induced contractions of rabbit aorta. Am. J. Physiol.; 219: 1698-1705, 1970.

AMARAL, A. T.; MONTANARI, C. A. Química Medicinal: 25 anos de planejamento de fármacos. Química Nova; 25, 2002.

ANSELM, E.; CHATAIGNEAU, M.; NDIAYE, M., et al. Grape juice causes endothelium-dependent relaxation via a redox-sensitive Src- and Akt-dependent activation of eNOS. Cardiovascular Res.; 73: 404-413, 2007.

ARNAL, J. F.; WARIN, L.; MICHEL, J. B. Determination of aortic cyclic guanosine monophosphate in hypertension induced by chronic inhibition of nitric oxide synthase. The Journal of Clinical Investigation; 90: 647-52, 1992.

ASANO, M.; MASUZAWA-ITO, K.; MATSUDA, T. Charybdotoxin-sensitive K+ channels regulate the myogenic tone in the resting state of arteries from spontaneously hypertensive rats. Br. J. Pharmacol.; 108: 214–222, 1993.

ATHAYDE-FILHO, P. F. Compostos Mesoiônicos – Perspectivas para polímeros não convencionais conversores moleculares de luz, dispositivos para ópticas não linear e fármacos. Recife: UFPE, 1999.

BAKER, W.; OLLIS, W. D. Meso-ionic Compounds. Chemistry and Industry.; 910-911, 1955.

BARBOSA, J. M., Dissertação de Mestrado – UFRJ, 1979.

BARREIRO, E. J. Estratégia de Simplificação Molecular no Planejamento Racional de Fármacos. A Descoberta de Novo Agente Cardioativo. Quim. Nova; 25: 1172-1180, 2002.

BARROS NETO, T. L.; CÉSAR, M. C.; TEBEXRENI, A. S. Fisiologia do exercício. In: GHORAYEB, N.; BARROS, T. L., editores. O exercício. Preparação fisiológica, avaliação médica, aspectos especiais e preventivos. Atheneu; 3-13, 1993.

BATLOUNI, M. Endotélio e hipertensão arterial. Revista Brasileira de Hipertensão; 8: 328-38, 2001.

BELL, D. B.; BOHR, D. F. Endothelium in functional aortic changes of coarctation hypertension. Am. J. Physiological; 260: H1187-H1193, 1991.

BENDHACK, L. M.; SHARMA, R. V.; BHALLA, R. C. Altered signal transduction in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats. Hypertension; 19: II142-II148, 1992.

BERNÁTOVÁ, I.; PECHÁŇOVÁ, O.; BABÁL, P., et al. Wine polyphenols improve cardiovascular remodeling and vascular function in NO-deficient hypertension. Am. J. Physiol.; 282: H942-H948, 2002.

BERNÁTOVÁ, I.;PECHÁŇOVÁ, O.; ŠIMKO, F. Effect of captopril in L-NAME-induced hypertension on the rat myocardium, aorta, brain and kidney. Exp. Physiol.; 84: 1095-1105, 1999b.

BEVAN, J.A.; HENRION, D. Pharmacological implications of the flow-dependence of vascular smooth muscle tone. Annu Rev. Pharmacol. Toxicol; 34: 173-190, 1994.

BLAUSTEIN, M. P. Sodium/Calcium exchange in cardiac, smooth and skeletal muscles: key to the control of contractility. Current Topics in Membranes and Transport; 34: 289-330, 1989.

BOHR, D. F.; DOMINICZAK, A. F.; WEBB, R.C. Pathophysiology of the vasculature in hypertension. Hypertension; 18: 69-75, 1991.

BOHR, D. F.; WEBB, R. C. Vascular smooth muscle function and its changes in hypertension. Am. J. Medicine; 77: 3-16, 1984.

BOLOTINA, V. M.; NAJIBI, S.; PALACINO, J. J., et al. Nitric oxide directly activates calcium dependent potassium channels in vascular smooth muscle. Nature; 368: 850-853, 1994.

BRUNNER, H.; COCKCROFT, J. R.; DEANFIELD, J., et al. Endothelial function and dysfunction. Part II: Association with cardiovascular risk factors and diseases. A statement by the working group on endothelins and endothelial factors of the European Society of Hypertension. Journal of Hypertension; 23: 233-246, 2005.

BRUZZESE, T., J. Pharm. Sci.; 51: 1042, 1965 a.

BRUZZESE, T.; CASADIO, S.; MARAZZI-EBERT, E., et al. Synthesis and pharmacological screening of aminoalkyl-hydrazines. J. Pharm. Sci.; 54: 1056-1057, 1965 b.

BRUZZESE, T.; CASADIO, S.; MARAZZI-EBERT, E., et al. Synthesis and pharmacological screening of 3-aminoalkyl-sydnones. J. Pharm. Sci.; 54: 1041-1044, 1965 a.

BURNHAM, M. P.; BYCHKOV, R.; FELETOU, M., et al. Characterization of an apamin-sensitive smallconductance Ca(2+)-activated K(+) channel in porcine coronary artery endothelium: relevance to EDHF. Br. J. Pharmacol.; 135: 1133-1143, 2002.

BYCHKOV, R.; BURNHAM, M. P.; RICHARDS, G. R., et al. Characterization of a charybdotoxin-sensitive intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel in porcine coronary endothelium: relevance to EDHF. Br. J. Pharmacol.; 137: 1346-1354, 2002.

CAI, B.; GONG, D.; PAN, Z., et. al. Large-conductance Ca2+-activated K+ currents blocked and impaired by homocysteine in human and rat mesenteric artery smooth muscle cells. Life Sci.; 80: 2060-2066, 2007.

CAMPAGNOLE-SANTOS, M. J.; HAIBARA, A. S. Reflexos cardiovasculares e hipertensão arterial. Rev. Bras. Hipertens.; 8: 30-40, 2001.

CAMPBELL, W. B.; HARDER, D. R. Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factors and Vascular Cytochrome P450 Metabolites of Arachidonic Acid in the Regulation Tone. Circ. Res.; 84: 484-488, 1999.

CAMPBELL, W. B.; GEBREMEDHIN, D.; PRAIT, P. F., et al. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res.; 78: 415-423, 1996.

CAUVIN, C.; PEGRAM, B. Decreased relation of isolated mesenteric resistance vessels from two kidney, one clip Goldblatt hypertensive rats. Clin. Exp. Hypertens.; 5: 383-400, 1983.

CAVALCANTE, K.V.M.; CORREIA, N.A.C.; MEDEIROS, I.A. Estudo das atividades biológicas induzidas pelo composto mesoionico CMMTT em músculo liso – abordagem in vivo e in vitro. 2004. 80 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2004.

CHAMIOT-CLERE, P.; RENAUD, J. F.; SAFAR, M. E. Pulse pressure, aortic reactivity, and endothelium dysfunction in old hypertensive rats. Hypertension; 37: 313-321, 2001.

CHAUHAN, S.; RAHMAN, A.; NILSSON, H., et al. NO contributes to EDHF-like responses in rat small arteries: a role for NO stores. Cardiovascular Research; 57: 207-216, 2003.

CHEN, G.; SUZUKI, H. Some electrical properties of the endothelium-dependent hyperpolarization recorded from rat arterial smooth muscle cells. J. Physiol.; 410: 91-106, 1989.

CHEN, G.; YAMAMOTO, Y.; MIWA, K., et al. Hyperpolarization of arterial smooth muscle induced by endothelial substances. Am. J. Physiol.; 260: 1888-1892, 1991.

CHOO, L. K.; MALTA, E.; MITCHELSON, F. The affinity of some selective muscarinc receptor antagonists for the muscarinic receptor mediating endothelial-dependent relation of the rabbit and rat thoracic aorta. J. Pharm. Pharmac.; 38: 843-845,1996.

CLARK, S. G.; FUCHS, L. C. Role of Nitric Oxide and Ca++-Dependent K+ Channels in Mediating Heterogeneous Microvascular Responses to Acetylcholine in Different Vascular Beds. J. Pharmacol. Exper. Ther.; 282: 1473-1479, 1997.

COHEN, R. A.; VANHOUTTE, P. M., Endothelium-Dependent Hyperpolarization: Beyond Nitric Oxide andd Cyclic GMP. Circulation; 92: 3337-3349, 1995.

COHUET, G.; STRUIJKER-BOUDIER, H. Mechanisms of target organ damage caused by hypertension. Pharmacology & Therapeutics; 111: 81-98, 2006.

CONTRERAS, F.; DE LA PARTE, M.A.; CABRERA, J., et al. Role of Angiotensin II AT1 Receptor Blockers in the Treatment of Arterial Hypertension. Am. J. Ther.; 10: 401-408, 2003.

CORELL, T.; PEDERSEN, S. B. ; LISSAU, B., et al. Pharmacology of mesoionic

oxatriazole derivatives in blood, cardiovascular and respiratory systems. Polish Journal

of Pharmacology; 46: 553-566, 1994.

CORREIA, C. R. D.; COSTA, P. R. R.; FERREIRA, V. F., Vinte e cinco anos de reações, estratégicas e metodologias em química orgânica. Química Nova; 25, 2002.

CÔRTES, S. F.; LEMOS, V. S.; STOCLET, J. C. Alteration in calcium stores in aortic myocytes from spontaneously hypertensive rats. Hypertension; 29: 1322-1328, 1997.

COX, D. H.; ALDRICH, R. W. Role of the beta1 subunit in large-conductance Ca2+ - activated K+ channel gating energetics. Mechanisms of enhanced Ca2+ sensitivity. J. Gen. Physiol; 116: 411-432, 2000.

COX, R. H. Changes in the expression and function of arterial potassium channels during hypertension. Vascul. Pharmacol.; 38: 13- 23, 2002.

CRESPO, M. J.; ESCOBALES, N; RODRIGUEZ-SARGENT, C. Endothrlial dysfunction in the San Juan hypertensive rat: possible role of the nitric oxide synthase. J. Cardiovasc. Pharmacologic; 27: 802-808, 1996.

CRIBBS, L. L. T-type Ca2+ channels in vascular smooth muscle: Multiple functions. Cell Calcium; 40: 221-230, 2006.

CUNHA, R. S.; CABRAL, A. M.; VASQUEZ, E.C. Evidence that the autonomic nervous system plays a major role in the L-NAMEinduced hypertension in conscious rats. Am. J. Hypertens.; 6: 806-809, 1993. DIAS, K. L.; CORREIA, N. A.; PEREIRA, K.K., et al.Mechanisms involved in the vasodilator effect induced by diosgenin in rat superior mesenteric artery. Eur J Pharmacol.; 28: 172-178, 2007.

DOGGRELL, S. A.; BROWN, L. Rat model of hypertension cardiac hypertetrophy and failure. Cardiovasc. Res.; 39: 89-105, 1998.

DOHI, Y.; CRISCIONE, L.; LÜSCHER, T. F. Renovascular hypertension impairs formation of endothelium-derived relaxing factors and sensitivity to endothelin-1 in resistance arteries. Br. J. Pharmacol.; 104: 349-354, 1991.

DORWARD, P. K.; RIEDEL, W.; BURKE,S. L., et al. The renal sympathetic baroreflex in the rabbit. Arterial and cardiac baroreceptor influences, resetting, and effects of anesthesia. Circ. Res.; 57: 618-633, 1985.

DREXLER, H; HORNIG, B. Endothelial Dysfunction in Human Disease. Journal Molecular Cell Cardiology; 31: 51-60, 1999.

DUPONT, J.; DUPONT, J. C.; FROMENT, A., et al. Selection of three strains of rats with spontaneously different levels of blood pressure. Biomedicine; 19: 36-41, 1973.

EARL, J. C.; MACKNEY, A. W. The action of acetic anhydride on Nitrosophenylglycine and some of its derivates. J. Chem. Soc.; 899 - 900, 1935.

EDWARDS, G.; GARDENER, M. J.; FELETOU, M., et al. Further investigation of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) in rat hepatic artery: studies using 1-EBIO and ouabain. Br. J. Pharmacol.; 128: 1064-1070, 1999.

EDWARDS, G.; DORA, K. A.; GARDENER, M. J., et al. K+ is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in rat arteries. Nature; 396: 269-272, 1998.

EGLEN, R. M.; WHITING, R. Determination of the muscarinc receptor subtype mediating vasodilatation. Br. J. Pharmacol.; 84: 3-5, 1985.

EVORA, P. R. B.; PEARSON, P. J.; DISCIGIL, B., et al. Endotélio e óxido nítrico: História, fisiologia e as primeiras observações relacionadas com a hipertensão arterial. Hiper. Ativo; 2: 1-20, 1995.

FARACI, F. M.; SOBEY, C. G. Role of potassium channels in regulation of cerebral vascular tone. J Cereb Blood Flow Metab; 18: 1047-1063, 1998.

FÉLÉTOU, M.; VANHOUTTE, P.M. Endothelium-dependent hyperpolarization of canine coronary smooth muscle. Br. J. Pharmacol.; 93: 515-524, 1988.

FERREIRA, V. F.; BARREIRO, E. J.; COSTA, P. R. R. Quimica Nova; 20: 647, 1997.

FLUCKIGER, J. P.; SONNAY, M.; BOILLAT, N., et al. J. Attenuation of baroreceptor reflex by general anesthetic agent in the normotensive rat. Eur. J. Pharmacol.; 109: 105-109, 1985.

FREITAS, M. R.; SCHOTTA, C.; CORRIUA, C., et al. Heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in conductance and resistance arteries from Lyon normotensive and hypertensive rats. Journal of Hypertension; 21: 1505-1512, 2003.

FREITAS, M. R. DE. Mecanismes de la vasomotricite dans les arteres de rats hypertendus de souche lyonnaise: role de l’endothelium, du calcium et des phosphorylations. 2003. 183 f. Tese (Pharmacologie Moleculaire et Cellulaire) – Universite Louis Pasteur de Strasbourg, França.

FURCHGOTT, R. F. Role of the endothelium in responses of vascular smoth muscles. Circ. Res.; 53: 557-573, 1983.

FURCHGOTT, R. F.; ZAWADZKI, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature; 288: 373-376, 1980.

GARDINER, S. M.; COMPTON, A. M.; KEMP, P. A., et al. Regional and cardiac haemodynamic effects of NG-nitro-L-arginine methyl ester in conscious, long evans rats. Br. J. Pharmacol.; 101: 625-631, 1990.

GAZIANO, T. A. Cardiovascular disease in the developing wrold and its cost-effective management. Circulation; 112: 3547-3553, 2006.

GEREMEDHIN, D.; KALDUNSKI, M.; JACOBS, E. R., et al. Coexistence of two types of Ca2+ activated K+ channels in rat renal arterioles. Am. J. Physiol.; 263: H519-H525, 1992.

GHISDAL, P.; MOREL, N. Cellular target of voltage and calcium-dependent K+ channel blockers involved in EDHF-mediated responses in rat superior mesenteric artery. Br. J. Pharmacol.; 134: 1021-1028, 2001.

GOLDBLATT, H.; LYNCH, J.; HAMZAL, R. F., et al. Studies on experimental hypertension . I. The production of persistent elevation of systolic blood pressure by means of renal ischemia. J. Exp. Med.; 59: 347-379, 1934.

GOLDFRAIND, T.; GOVONI, S. Recent advances in the pharmacology of Ca2+ and K+ channels. Trends Pharmacol. Sci.; 16: 1-4, 1995.

GRECO, C. V; NYBERG, W. H; CHENG, C. C. Synthesis of sydnone and sydnone imines. J. Med. Pharm. Chem.; 5: 861-865, 1962.

GRIDER, J. R.; MAKHLOUF, G. M. Contraction mediated by Ca2+ release in circular and Ca2+ influx in longitudinal intestinal muscle cells. J. Pharmacol. Exp. Ther.; 244: 432-437, 1988.

GRIENDLING, K. K.; SORESCU, D.; USHIO-FUKAI, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circ. Res.; 86: 494-501, 2000.

GRIFFITH, O.W.; STUEHR, D.J. Nitric oxide synthases: Properties and catalytic mechanism. Annu Rev. Physiol.; 57: 707-736, 1995.

GROSS, P. L; AIRD, W. C. The endothelium and thrombosis. Sem Thromb Hemost; 26: 463-477, 2000.

GRYNKIEWICZ ,G.; POENIE, M.; TSIEN, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. Mar.; 25: 3440-3450, 1985.

GURNEY, A. M. Mechanisms of drug-induced vasodilatation. J. Pharm. Pharmacol.; 46: 242-251, 1994.

GUTMAN, G. A.; CHANDY, K. G.; STEPHAN, G. S.; et al. Nomenclature and Molecular Relationships of Voltage-Gated Potassium. Channels Pharmacol. Rev.; 57: 473-508, 2005.

HARRAP, S. B. Hypertension: genes versus environment. Lancet; 344: 169-171, 1994.

HEMMENS, B.; MAYER, B. Enzimology of nitric oxide synthases. In: Titheradge M., editor, Methods in molecular biology. Nitric oxide protocols, 1st ed, Totowa, N.J.: Humana Press, 1-32, 1998.

HEYMANS, C.; NEIL, E. Reflexogenic aneas of the cardiovascular system London: Churchi, (apud BEST & TAYLOR), 170, 1958.

HILL, J. B.; J. Med Chem.; 18: 50, 1957.

HUGHES, A. D. Calcium channel in vascular smooth muscle cells. J. Vasc. Res.; 32: 353-370, 1995.

HWA, J. J.; GHIBAUDI, L.; WILLIAMS, P., et al. Comparison of acetylcholine-dependent relation in large and small arteries of rat mesenteric vascular bed. Am. J. Physiol.; 266: H952-H958, 1994.

IGNARRO, L. J.; HARBISON, R. G.; WOOD, K. S., et al. Activation of purified soluble guanylate cyclase by endothelium-derived relaxing factor from intrapulmonary artery and vein: stimulation by acetylcholine, bradykinin and arachidonic acid. J. Pharmacol. Exp. Ther.; 237: 893-900, 1986.

IINO, M. Calcium release mechanisms in smoth muscle. J. Pharmacol.; 54: 345-354, 1990.

INOUE, M.; ISENBERG, J. Acetylcholine activates nonselective cation channels in guinea pig ileum through a G protein. Am. J. Physiol.; 258: 1173-1178, 1990.

INOUE, R.; JENSEN, L. J.; SHI, J., et al. Transient receptor potential channels in cardiovascular function and disease. Circ. Res.; 99: 119-131, 2006.

JACKSON, W. F. Ion channel and vascular tone. Hypertension; 35: 173-178, 2000.

JOHNSON, J. D.; SNYDER, C. H. Calcium regulation of smooth muscle contractile proteins. In: LIPPINCOTT-RAVEN PUBL. Advances in Second Messenger and Phosphoprotein Research; 30: 153-174, 1995.

JOVER, B.; HERIZI, A.; CASELLAS, D., et al. Influence of irbesartan and enalapril on changes of renal function associated with the established phase of l-NAME hypertension. J. Hypertens.; 19: 2039-2046, 2001.

JULIUS, S. Blood Pressure Lowering Only or More? Has the Jury Reached Its Verdict? Am. J. Cardiol.; 100: 32, 2007.

KÄHÖNEN, M.; ARVOLA, P.; WU, X., et al. Arterial contractions induced by cumulative addition of calcium in hypertensive and normotensive rats : influence of endothelium. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol.; 349: 627-636, 1994.

KANNEL, W.B. Hypertensives risk assessment: cardiovascular risk factors and hypertension. Journal of Clinical Hypertension; 3: 393-399, 2004.

KAWABATA, A.; KUBOA, S.; NAKAYAA, Y., et. al. Distinct roles for protease-activated receptors 1 and 2 in vasomotor modulation in rat superior mesenteric artery. Cardiovasc.Res.; 61: 683-692, 2004.

KIER, L. B.; ROCHE, E. B. Medicinal chemistry of the mesoionic compounds. J. Pharm.

Sci.; 56: 148-169, 1967.

KLIMASCHEWSKI, L.; KUMMER, W.; MAYER, B., et al. Nitric oxide synthase in cardiac nerve fibers and neurons of rat and guinea pig heart. Circ. Res.; 71: 1533-1537, 1992.

KOMORI, S.; ITAKAKI, M.; UNNO, T., et al. Caffeine and carbachol act on common Ca2+ stores to release Ca2+ in guinea-pig ileal smooth muscle. European Journal of Pharmacology; 277: 173-180, 1995.

KONISHI, M.; SU, C. Role of endothelium in dilator responses of spontaneously hypertensive rat arteries. Hypertension; 5: 881-886, 1983.

KORNER, P. I.; LANGSFORD, G.; STARR, D., et al. The effects of chloralose-urethane and sodium pentobarbitone anesthesia on the local and autonomic components of the circulatory response to arterial hypoxia. J. Physiol.; 199: 283-302, 1968.

KUBO, Y.; ADELMAN, J. P.; CLAPHAM, D. E., et al. Nomenclature and Molecular Relationships of Inwardly Rectifying Potassium Channels. Pharmacol. Rev.; 57: 509-526, 2005.

KUMAGAI, H.; AVERILL, D. B.; KOHSLA, C. M., et al. Role of nitric oxide and angiotensin II in the regulation of sympathetic nerve activity in spontaneoustly hypertensive rats. Hypertension; 21: 476-484, 1993.

KUNEŠ, J.; HOJNÁ, S.; KADLECOVÁ, M., et al. Altered balance of vasoactive systems in experimental hypertension: the role of relative NO deficiency. Physiol. Res.; 53: S23-S34, 2004.

KWAN, C.Y. Dysfunction of calcium handling by smooth muscle in hypertension. Can. J. Physiol. Pharmacol.; 63: 366-374, 1985.

LI Z, Y. C.; HAN, Y.; REN, H., et al. Inhibitory Effect of D1-like and D3 Dopamine Receptors on Norepinephrine-induced Proliferation in Vascular Smooth Muscle Cells. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 2008.

LIMA, L. M. Química Medicinal Moderna: Desafios e Contribuição Brasileira. Quim. Nova; 30: 1456-1468, 2007.

LIRA, B.F.; ATHAYDE-FILHO, P. F.; MILLER, J., et al. Synthesis and Characterization of some New Mesoionic 1,3-Thiazolium-5-Thiolates via Cyclodehydration and in situ 1,3-Dipolar Cycloaddition/Cycloreversion. Molecules; 7: 791-800, 2002.

LÓPEZ-RAMOS, J. C.; MARTÍNEZ-ROMERO, R.; MOLINA, F., et al. Evidence of a decrease in nitric oxide-storage molecules following acute hypoxia and/or hypobaria, by means of chemiluminescence analysis. Nitric Oxide; 13: 62-67, 2005.

LÜSCHER, T.; VANHOUTTE, P. M. Endothelium-dependent contraction to acetylcholine in the aorta of the spontaneously hypertensive rats. Hypertension; 8: 344-348, 1986.

MACMAHON, S.; PETO, R.; CUTLER J., et al. Blood pressure, stroke, and coronary heart disease. Prolonged differences in blood pressure. Lancet; 335: 765-774, 1990.

MAJID, P. A.; DEFEYTER, P. J. F.; VAN DER WALL, E. E., et al. Molsidomine in the treatment of patients with angina pectoris. N. Engl. J. Med.; 302: 1-6, 1980.

MANTELLI, L.; AMERINI, S.; LEDDA, F. Ageing anda hypetension-induced changes in the mechanisms involved in the vasorelaxant effect of acetychilne: Roles of EDHF and EDRF. Pharmacological Research; 31: 47, 1995.

MARLETTA, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J. Biol. Chem.; 268: 12231-12234, 1993.

MARTINEZ-MALDONADO, M. Pathophysiology of renovascular hypertension. Hypertension; 17: 707-719, 1991.

MAYER, B.; LEBER, A.; EMMENS, B., et al. Characterization of Recombinant Human Endothelial Nitric-oxide Synthase Purified from the Yeast Pichia pastoris. The Journal Of Biological Chemistry; 274: 37658–37664, 1999.

MILLER, J.; OLIVEIRA, M. B.; PEREIRA, A. B., et al. Phosporus, Súlfur and Silicon; 108: 75, 1996.

MILLETTE, E.; CHAMPLAIN, J.; LAMONTAGNE, D. Altered coronary dilation in deoxycorticosterone acetate-salt hypertension. J. Hypertension; 18: 1783-1793, 2000.

MINISTÉRIO da Saúde, 2006. Disponível em: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/2artigo_hipertensao_arterial.pdf.>Acesso em: 02 maio 2007, 12:40:30 h.

MONCADA, S.; VANE, J. R. Pharmacology and endogenous roles of prostaglandins endoperoxydes, throboxane A2 and prostacyclin. Pharmacol. Rev.; 30: 293-331, 1979.

MOORE, P. K.; AL-SWAYEH, O. A.; CHONG, N. W. S., et al. L-NG-nitro arginine (L-arginine-reversible inhibitor of endothelium-dependent vasodilatation in vivo. Br. J. Pharmacol.; 99: 408-412, 1990.

NAGAO, T.; ILLIANO, S.; VANHOUTTE, P. M. Heterogeneous distribution of endothelium-dependent relaxations resistant to NG-nitro-L-arginine in rats. Am. J. Physiol.; 263: H1090-H1094, 1992.

NELSON, M.T.; STANDEN, N. B.; BRAYDEN, J. E., et al. Noradrenaline contracts arteries by activating voltage – dependent calcium channels. Nature; 336: 382-385, 1988.

NELSON, M. T.; QUAYLE, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial muscle. Am. J. Physiol.; 268: C799-C822, 1995.

NEWTON, C.G; RAMSDEN, C.A. Meso-ionic heterocycles. Tetrahedron, Kidlington; 38: 2965-3011, 1982.

NISHIDA, Y.; DING, J.; ZHOU, M., et al. Role of nitric oxide in vascular hyperresponsiveness to norepinephrine in hypertensive Dahl rats. Journal of hypertension; 16: 1611-1618, 1998.

NSEL, P. A. Adrenergic receptors – evolving concepts and clinical implications. N. Engl. J. Med.; 334: 580-585, 1996.

OATES, J. A. Antihypertensive agents and the drug therapy of hypertension. In: HARDMAN, J. G.; GILMAN, A. G.; LIMBRIND L. E., et al. The pharmacolgogical basis of therapeutics; 781, 1996.

OBIEFUNA, P. C.; EBEIGHE, A. B.; SOFOLA, O.A., et al. Altered responses of aortic smooth muscle from Sprangue-Dawley rats with salt-induced hypertension. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology; 18: 813-818, 1991.

OBIEFUNA, P. C.; SOFOLA, O. A.; EBEIGHE, A. B. Dietary salt loading attenuates endothelium-depedent relaxation in response in histamine but not to acetylcholine in rat aortic rings. Experimental Physiology; 76: 135-138, 1991.

OKAMOTO, K.; AOKI, K. Development of a strain of spontaneously hypertensive rats. Jpn. Circ. J.; 27: 282-293, 1963.

OKAMURA, T.; MIYAZAKI, M.; INAGAMI, T., et al. Vascular renin-angiotensin system in two-kidney, one clip hypertensive rats. Hypertension; 8: 560-565, 1986.

OLIVEIRA, E. J.; MEDEIROS, I. A.; MUKEIERJEE, R. Hypotensive and spasmolytic effects of normacusine B from Strychnos atlantica root. Phytomedicine; 3: 45-49, 1996.

OLLIS, W.D.; RAMSDEN, C.A. Meso-ionic compounds. Adv. Heterocycl. Chem.; 19: 1-121, 1976.

PAGE, C. P.; CURTIS, M. J. C.; SUTTIER, M.C., et al. As drogas e o sistema cardiovascular. Farmacologia Integrada; 153-193, 1999.

PAGE, I. H. Hypertensive mechanisms. Grune Stratton, 1987.

PALMER, R. M. J.; FERIGE, A. G.; MONCADA, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature; 327: 524-526, 1987.

PALMER, R. M. J.; ASHTON, D. S.; MONCADA, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature; 333: 664-666, 1988.

POZHARSKÜ, A. F.; SOLDATENKOV, A. T.; KATRITZKY, A.R. Heterocycles in life and society. Chichester: John Wiley & Sons; 301,1997.

PRIETO-CARRASQUERO, M. C.; BOTROS, F. T.; PAGAN, J., et al. Collecting Duct Renin Is Upregulated in Both Kidneys of 2-Kidney, 1-Clip Goldblatt Hypertensive Rats. Hypertension; 2008.

RAMOS, L.; LABAT, R.; AIMBIRE, S. F., et al. Efeito da administração oral de arginina sobre a pressão arterial e parâmetros cardíacos em ratos submetidos ao bloqueio crônico da síntese de óxido nítrico. Revista Brassileira de Medicina e Esporte; 12, 2006.

REES, D. D.; PALMER, R. M. J.; MONCADA, S. Role of endothelium derived nitric oxide in the regulation of blood pressure. Poc. Natl. Acad. Sci.; 86: 3375-3378, 1989.

REHSE, K.; CIBORSKI, T.; MÜLLER, B. Platelet aggregation inhibiting and

anticoagulant effect of oligoamines. XXVII: inhibition of leucocyte adherence to

endothelium by oligoamine RE 1492C and the NO-donor RE 2047. Arch Pharm.;328:

125-126, 1995.

REHSE, K.; MARTENS, A. Platelet aggregation inhibiting and anticoagulants effects of oligoamines, XXI – 4, 4´-Alkylene-bis-sydnone imines. Archives Der Pharmazie; 326: 307-311, 1993 a.

REHSE, K.; SCHLEIFER, K.; CIBORSKI, T., et al. New NO-donors with antithrombotic and vasodilating activities, II: 3-alkyl-N-nitroso-5-sydnone imines. Arch. Pharm.; 326: 791-797, 1993 b.

REHSE, K; SCHLEIFER, K. New NO-donors with antithrombotic and vasodilating activities, III: 3,4 disubstituted N-nitroso-5-sydnone imines. Arch. Pharm.; 326: 929-939, 1993 c.

REHSE, K; KÄMPFE, M; SCHLEIFER, K. New NO-donors with antithrombotic and vasodilating activities, I: 3-arylalkyl-N-nitroso-5-sydnone imines. Arch. Pharm.; 326: 483-487, 1993 d.

REMBOLD, C. M. Electromechanical and pharmacomechanical coupling. In: Bárány, M. Biochemistry of smooth contraction, San Diego. Academic Press; 227-239, 1996.

RESS, D. D.; PALMER, R. M. J.; SCHULZ, R., et al. Characterisation of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Br. J. Pharmacol.; 101: 746-752, 1990.

RIBEIRO, M. O.; ANTUNES, G.; ZATZ, R. Chronic inhibition of nitric oxide synthesis. A new model of arterial hypertension. Hypertension; 20: 298-303, 1992.

ROSSONI, G.; MANFREDI B. G. C. V.; BERTI, M., et al. Sildenafil reduces L-NAME-induced severe hypertension and worsening of myocardial ischaemia-reperfusion damage in the rat. Br. J. Pharmacol.; 150: 567-576, 2007.

RUDOLPH, W.; DERSCHINGER, J. Clinical comparation of nitrates and sydnonimines. Eur Heart J.; 12: 33-41, 1991.

SANDER, M.; HANSEN, P. G.; VICTOR, R. G. Sympathetically mediated hypertension caused by chronic inhibition nitric oxide. Hypertension 26: 691-695, 1995.

SANDER, M.; VICTOR, R. G. Neural mechanisms in nitric-oxide−deficient hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens; 8: 61-73, 1999.

SASSARD, J.; LO, M.; LIU, K. L. Lyon genetically hypertensive rats: na animal model of “low renin hypertension”. Acta pharmacol. Sin.; 24: 1-6, 2003.

SCHINI, V.B., VANHOUTTE, P.M. L-Arginine evokes both endothelium-dependent and independent relaxations in L-arginine-depleted aortas of the rat. Circ Res. 68: 209-216, 1991.

SCHULZ, R.; TRIGGLE, C. R. Role of NO in vascular smooth muscle and cardiac muscle function. Trends Pharmacol. Sci.; 15: 255-259, 1994.

SHAFFEMBURG, C. A. Device to control constriction of main renal artery for production of hypertension in small animal. Proc. Soc. Biol. Med.; 101: 676-677, 1959.

SHIMOKAWA, H.; YASUTAKE, H.; FUJII, K., et al. The importance of the hyperpolarizing mechanism increases as the vessel size decreases in endothelium-dependent relaxations in rat mesenteric circulation. J. Cardiovasc. Pharmacol.; 28: 703-711, 1996.

SHIRAKI, H.; KAWASAKI, H.; TEZUKA, S., et al. Adrenergic nervs mediate acetylcholine-induced endothelium-independent vasodilation in the rat mesenteric resistance artery. Europ. J. of Pharmacol.; 419: 231- 242, 2001.

SMITH, T. L.; HUTCHINS, P. M. Anesthetic effects on hemodynamics of spontaneously hypertensive and Wistar-Kyoto rats. Am. J. Physiol.; 238: H539-H544, 1980.

SMITH, W. L. Prostanoid biosynthesys and mechanism of action. Am. J. Physiol.; 268: F181-F191, 1992. SOFOLA, O. A.; KNILL, A.; HAINSWORTH, R., et al. Change in endothelial fuction in mesenteric arteries of Sprangue-Dawley rats fed a high salt diet. Journal of Physiology; 543: 255-260.

SOMLYO, A. P.; SOMLYO, A. V. Signal Transduction and regulation in smooth muscle. Nature; 372: 231-236, 1994.

SUGIYAMA, T.; YOSHIZUMI, M.; TAKAKU, F., et al. The elevation of the cytoplasmic calcium ions in vascular smooth muscle cells in SHR- measurement of free calcium ions in single living cells by laser microfluorospectrometry. Biochemical and Biophysical Research Communications; 141: 340-345, 1986.

SUNANO, S.; WATANABE, H.; TANAKA, S., et al. Endothelium-devived relaxing, contracting and hyperpolarizing factors of mesenteric arteries of hyperpolarizing factors of mesenteric arteries of hypertensive and normotensive rats. Br. J. Pharmacol.; 126: 709-716, 1999.

SURKS, H.K.; MOCHIZUKI, N.; KASAI, Y.; et al. Regulation of myosin phosphatase by a specific interaction with cGMP- dependent protein kinase Ialpha. Science; 19:1583-1587, 1999.

TAKESHITA, A.; MARK, A. L. Decreased venous distensibility in boderline hypertension. Hypertension; 1: 202-206, 1979.

TANAKA, Y.; MOCHIZUKI, Y.; TANAKA, H., et al. Signicant role of neuronal non-N-type calcium channels in the sympathetic neurogenic contraction of rat mesenteric. Br. J. Pharmacol.; 128: 1602-1608, 1999.

TASATARGIL, A.; SADAN, G.; GOLBASI, I., et al.Effects of short-term exposure to homocysteine on vascular responsiveness of human internal mammary artery. J Cardiovasc Pharmacol., 43:692-697, 2004.

TESFAMARIAM, B.; HALPERN, W. Endothelium-dependent and endothelium-independent vasodilation in resistance arteries from hypertensive rats. Hypertension; 11: 440-444, 1988.

THORNELOE, K. S.; NELSON, M. T. Ion channels in smooth muscle: regulators of intracellular calcium and contractility. Can J. Physiol. Pharmacol.; 83: 215-242, 2005.

TOSTES, R. C. A.; WILDE, D. W.; BENDHACK, L. M., et al. Calcium handling by vascular myocytes in hypertension. Br. J. Med. Bioll. Res.; 30: 315-323, 1997.

UREÑA, J.; DEL VALLE-RODRÍGUEZ, A.; LÓPEZ-BARNEO J. Metabotropic Ca2+ channel-induced calcium release in vascular smooth muscle. Cell Calcium.; 42:513-520, 2007.

V Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial Sistêmica 2006.

VANHEEL, B.; VAN de VOORDE, J. EDHF and residual NO: different factors. Cardiovascular Research.; 46: 370-375, 2000.

WAGNER, H.; HILL, J. B., Med Chem.; 17: 1337, 1974.

WANG, S. P.; ZANG, W. J.; KONG, S. S., et al. Vasorelaxant effect of isopropyl 3-(3, 4-dihydroxyphenyl)-2- hydroxypropanoate, a novel metabolite from Salvia miltiorrhiza, on isolated rat mesenteric artery. Eur. J. Pharmacol.; 579: 283-288, 2007.

WEI, A. D.; GUTMAN, G. A.; ALDRICH, R., et al. International Union of Pharmacology. LII. Nomenclature and Molecular Relationships of Calcium-Activated Potassium Channels. Pharmacol. Rev,; 57: 463-472, 2005.

WHITE, S. W.; MCRITCHIE, R. J. Nasopharyngeal reflexes : Integrative analysis of evoked respiratory and cardiovascular effects. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.; 51: 17-31, 1973.

WU, X.; MÄKYNEN, H.; KAHÖNEN, M., et al. Mesenteric arterial function in vitro in three models of experimental hypertension. J. Hypertens.; 14: 365-372, 1996.

YASHUSKII, V. G. ; KHOLODOV, L. B., Russian Chem. Rev.; 49: 28, 1980.

ZAMAN, M. A.; OPARIL, S.; CALHOUN, D. A. Drugs targeting the renin-angiotensin-aldosterone-system. Nature Reviews; 1: 621-636, 2002.

ZANCHI, A.; SCHAAD, N. C.; OSTERHELD, M. C., et al: Effects of chronic NO synthase inhibition in rats on renin-angiotensin system and sympathetic nervous system. Am. J. Physiol.; 268: H2267-H2273, 1995.

ZHANG, J. D.; XU, Z.; CAO, Y. B., et al. Antifungal activities and action mechanisms of compounds from Tribulus terrestris L. Ethnopharmacol; 2005. ZIMPFER, M.; MANDERS, W. T.; BARGER, A. C., et al. Pentobarbital alters compensatory neural and humoral mechanisms in response to hemorrage. Am. J. Physiol.; 243: H713-H721, 1982.

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo