KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE …laboratório para que eu pudesse terminar as análises, quando pensei que não pudesse mais ... superiores aos controles positivos (quercetina,

- '

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE PESCA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE PESCA

KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS M ARINHAS

DO LITORAL CEARENSE

FORTALEZA

2012

2


AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS MARINHAS DO

LITORAL CEARENSE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Engenharia de Pesca. Área de concentração: Biotecnologia de Recursos Aquáticos.

Orientadora: Profa Silvana Saker Sampaio.

FORTALEZA

2012


AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MACROALGAS MARINHAS DO

LITORAL CEARENSE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Engenharia de Pesca. Área de concentração: Biotecnologia de Recursos Aquáticos.

Aprovada em: 05/10/2012

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________ Profa Silvana Saker Sampaio, Ph.D. (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

______________________________________ Prof. Alexandre Holanda Sampaio, Ph.D.


______________________________________ Prof. Francisco Arnaldo Viana, D.Sc.

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN)

______________________________________ Prof. Paulo Henrique Machado de Sousa, D.Sc.


______________________________________ Profa Valéria Laneuville Teixeira, D.Sc.

Universidade Federal Fluminense (UFF)

2

Ao meu marido, Cleber, pelo amor, apoio e

cumplicidade.

Aos meus pais, Ocelo e Maria José, por me

amarem incondicionalmente e pelo incentivo e

apoio em todas as etapas de minha vida.

Às minhas irmãs, Kelly e Kelry pela amizade e

carinho.

Dedico este trabalho.

3

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me deu o dom da vida, e por sua presença constante em todos os

momentos de minha vida.

Ao meu marido, Cleber Pereira Cavalcante, pois sempre que eu quis fraquejar me

encorajou a continuar, pelo amor e carinho demonstrados nesses últimos anos e pelos

domingos que abriu mão para me ajudar em minhas pesquisas.

Aos meus pais, José Ocelo Pires e Maria José dos Santos Pires, as minhas irmãs,

Kelly Christine Pires e Kelry Nayara Pires e ao meu tio Aderson Maximiano pelo incentivo,

motivação, compreensão e por estarem sempre presentes em minha vida.

Aos meus sogros Francisco Rodrigues Cavalcante e Maria Raimunda Pereira

Cavalcante e aos meus cunhados Dejane Cavalcante de Oliveira e George Luís de Oliveira

pelo apoio, motivação e torcida nessa nova conquista.

A Profa Dra Silvana Saker Sampaio por ter acreditado em meu potencial, pela

valiosa orientação e conhecimentos passados durante a execução deste trabalho, pelo carinho

e amizade, confiança e principalmente pelos exemplos de ser humano e profissionalismo.

Ao Prof. Dr. Alexandre Holanda Sampaio, pelo apoio durante a realização deste

experimento, sempre procurando proporcionar boas condições de trabalho e pelas valiosas

sugestões.

Aos membros da banca, Prof. Dr. Francisco Arnaldo Viana, Prof. Dr. Paulo

Henrique Machado de Sousa e Profa Dra Valéria Laneuville Teixeira, por terem tão

gentilmente aceito o convite e por suas valiosas sugestões.

Ao Prof. Dr. Celso Shiniti Nagano, Coordenador do Programa de Pós-Graduação

em Engenharia de Pesca, pela troca de experiência, empréstimo de equipamentos e pelas

palavras de incentivo durante a execução do trabalho.

Aos Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada e Profa Dra Kyria Santiago Nascimento, do

Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL), por terem aberto as portas do

laboratório para que eu pudesse terminar as análises, quando pensei que não pudesse mais

concluí-las.

Ao Prof. Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias do Laboratório de Bioquímica

Marinha (BIOMAR) por ter sido muito prestativo sempre que o solicitei.

Ao amigo Daniel Barroso de Alencar pela amizade e companheirismo, pelo

incentivo, pelo apoio incondicional desde a época do Mestrado, por escutar meus desabafos e

me fazer acreditar na minha capacidade.

4

À amiga Márcia Barbosa de Sousa pelos seus ensinamentos de vida, por sempre

me mostrar que podemos ser um ser humano melhor.

Às minhas queridas amigas de laboratório Mirela Gouveia e Rebeca Larangeira de

Lima pela ajuda na execução dos experimentos.

Ao meu amigo do laboratório BIOMAR José de Sousa Júnior por ter sempre me

ajudado nas instalações e consertos de equipamentos, pela ajuda nas coletas e pelos valiosos

momentos de descontração.

Aos amigos do BIOMOL, Rafael Simões e Suzete Roberta, pelo suporte e ajuda

durante minha estada no laboratório, em um momento crucial da minha pesquisa e ao

Jefferson Pablo de Sousa Saboya pela ajuda na parte de informática, pelo apoio e amizade.

A minha ex-professora do Curso de Graduação e hoje amiga de doutorado

Alessandra Cristina da Silva pelas experiências trocadas, pelas palavras de incentivo e pela

análise estatística do meu trabalho.

Ao Sr. Antônio Ferreira de Lima pelo suprimento diário de água destilada e pelo

carinho.

À minha amiga Durvânia Andrade por se preocupar sempre com meu bem estar e

pela compreensão por minha ausência.

À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP) e à Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por terem concedido a bolsa de

doutorado.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pelo financiamento do projeto de pesquisa.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação que contribuíram para a

minha formação profissional.

À secretária do Programa de Pós-Graduação, Rogéria Setúbal que sempre prestou

seus serviços com zelo.

A todos, os meus sinceros agradecimentos.

5

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,

mas lutei para que o melhor fosse feito. Não

sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não

sou o que era antes”.

(Marthin Luther King)

6

RESUMO

As macroalgas marinhas são fontes de compostos com atividade antioxidante como

compostos fenólicos, pigmentos carotenóides e vitamina E. O objetivo deste trabalho foi

avaliar a atividade antioxidante in vitro de extratos metanólicos (50%) de macroalgas

cearenses, através da capacidade de sequestrar o DPPH, habilidade de quelação do íon ferroso

(FIC), poder de redução do ferro (FRAP) e degradação do β-caroteno. Além disso, também

foi determinado o conteúdo de compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteu, seguido

de uma prospecção fitoquímica para indicar possivelmente as principais classes de compostos.

Os teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δ-tocoferol foram quantificados por cromatografia

líquida de alta eficiência. De um modo geral, capacidade de sequestrar o DPPH, FRAP e

conteúdo de compostos fenólicos foram maiores nos extratos das algas pardas, seguidos dos

das algas verdes e vermelhas. FIC mais elevada foi observada nos extratos das algas

vermelhas, seguidas das pardas e verdes. No sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico as

maiores atividades foram determinadas nas clorófitas e rodófitas, tendo variado de 64,8% a

95,3%, nas ocrófitas, inferiores a 40,5%, com exceção de Padina gymnospora com cerca de

92%. Os extratos algáceos analisados apresentaram atividades antioxidantes semelhantes ou

superiores aos controles positivos (quercetina, BHA, BHT, ácido ascórbico, α-tocoferol, β-

caroteno e EDTA). Fenóis foram detectados apenas em algas pardas; antocianinas,

antocianidinas, chaconas, auronas e leucoantocianidinas foram observadas apenas em algumas

espécies do Filo Rhodophyta; as demais classes de compostos fenólicos investigadas foram

observadas em pelo menos uma espécie dentro de cada Filo, com exceção de flavanonóis que

não foram encontrados nos extratos de algas verdes. O conteúdo de compostos fenólicos foi o

principal responsável pelas atividades de sequestro do DPPH, FRAP e FIC nas algas verdes e

vermelhas. Nas pardas esses compostos só influenciaram no FRAP. β-Caroteno e luteína

foram quantificados em todos os extratos de algas verdes, vermelhas e pardas, sendo a luteína

o carotenóide majoritário nas clorófitas e rodófitas. Com exceção das algas pardas que

naturalmente não possuem α-caroteno, apenas os extratos de cinco espécies de clorófitas e

rodófitas não apresentaram esse composto. Todos os extratos analisados apresentaram α-

tocoferol, menos Ulva fasciata e U. lactuca. Extratos de onze espécies apresentaram δ-

tocoferol. As atividades antioxidantes e os teores de compostos detectados nos extratos

algáceos foram distintos, mas todos eles apresentaram potencial antioxidante.

Palavras-chave: Macroalgas. Atividade antioxidante. Compostos fenólicos. Carotenóides.

Vitamina E.

7

ABSTRACT

Seaweeds are sources of a wide variety of beneficial compounds for human. Many of these

compounds have antioxidant activity, such as phenolic compounds, carotenoids, and vitamin

E. The aim of this research was to evaluate the in vitro antioxidant activity of 50% methanolic

extracts from seaweed collected in the coastline of Ceará State, Brazil. The methods used

were: DPPH radical scavenging, ferrous ion chelation (FIC), ferric reducing antioxidant

power (FRAP), and β-carotene bleaching. In addition to in vitro antioxidant activity, the total

phenolic content (TPC) was measured by the Folin-Ciocalteu method, followed by a

phytochemical prospecting to point out which are the main classes of compounds present in

the algal extracts. The quantification of carotenoids (α- and β-carotene, and lutein) and

vitamin E (α- and δ-tocopherol) was carried out by HPLC. In general, the extracts of brown

algae showed the highest ability to scavenger the DPPH radical, the largest FRAP and the

highest TPC, followed by extracts of green and red algae. The greatest FIC was observed in

red alga extracts, followed by brown and green alga extracts. The high antioxidant activity in

β-carotene/linoleic acid model system of green and red alga extracts ranged from 65% to

95%, however it represented less than 40% in brown alga extracts, exception to Padina

gymnospora extract which presented activity up to 92%. The majority of the algal extracts

analyzed in this study presented activity similar to or even greater than those observed in

positive controls (quercetin, BHA, BHT, ascorbic acid, α-tocopherol, β-carotene and EDTA).

Fenols were detected in brown algae only; anthocyanins, anthocyanidins, chacons, aurons and

leucoanthocyanins were observed in some species of Rhodophyta Phylum. All the other

classes of phenolic compounds were found in at least one species within each Phylum,

exception to flavononols which have not been detected in green alga extracts. TPC was the

main responsible for the ability to scavenger the DPPH radical, FIC and FRAP in green and

red algae. On the other hand, in brown algae TCP was influenced only by FRAP. All extracts

of green, red and brown algae exhibited the presence of β-carotene and lutein. The latter was

the major carotenoid within Chlorophyta and Rhodophyta. Naturally absent in brown algae, α-

carotene was not detected in five species of Chlorophyta and Rhodophyta algae. α-Tocopherol

was determined in all species, except Ulva fasciata and U. lactuca extracts. The isomer δ-

tocopherol was quantified in eleven out of twenty-three alga species. Antioxidant activity and

levels of compounds in the algal extracts were different, but all of them showed antioxidant

potential.

Keywords: Seaweeds. Antioxidant activity. Phenolic compounds. Carotenoids. Vitamin E.

8

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Estruturas fenólicas dos antioxidantes sintéticos............................................ 23

Figura 2 - Estrutura genérica de uma molécula de flavonóide........................................ 28

Figura 3 - Estrutura química dos principais ácidos benzóicos......................................... 28

Figura 4 - Estrutura química dos principais ácidos cinâmicos........................................ 28

Figura 5 - Ciclização do ácido o-cumárico em cumarina................................................ 28

Figura 6 - Estruturas químicas dos carotenóides de ocorrência mais comum nas algas. 32

Figura 7 - Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis........................................... 34

Figura 8 - Capacidade de sequestrar o radical livre DPPH. (A) Chlorophyta, (B)

Rhodophyta e (C) Ochrophyta........................................................................ 50

Figura 9 - Habilidade de quelação do íon ferroso. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta

e (C) Ochrophyta........................................................................................... 57

Figura 10 - Poder de redução do ferro. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C)

Ochrophyta.................................................................................................... 62

Figura 11 - Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico. (A)

Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.......................................... 69

Figura 12 - Curva padrão de ácido gálico, com concentração de 1 a 250 mg L-1............ 74

Figura 13 - Conteúdo fenólico total nos extratos algáceos. (A) Chlorophyta, (B)

Rhodophyta e (C) Ochrophyta...................................................................... 75

Figura 14 - Curvas padrão de carotenóides submetidos à saponificação e partição. (A)

β-caroteno e (B) luteína................................................................................. 85

Figura 15 - Curvas padrão de tocoferóis submetidos à saponificação e partição. (A) α-

tocoferol e (B) δ-tocoferol............................................................................. 86

Figura 16 - Cromatograma típico de β-caroteno (Sigma) e luteína (Duane Reade)

submetidos à saponificação e partição.......................................................... 87

Figura 17 - Teores de carotenóides nos extratos de Chrolorophyta. (A) α-caroteno, (B)

β-caroteno e (C) luteína................................................................................. 89

Figura 18 - Teores de carotenóides nos extratos de Rhodophyta. (A) α-caroteno, (B)

β-caroteno e (C) luteína................................................................................. 91

Figura 19 - Teores de carotenóides nos extratos de Ochrohyta. (A) β-caroteno e (B)

luteína............................................................................................................ 95

9

Figura 20 - Cromatograma típico de α- e δ-tocoferol (Sigma) submetidos à

saponificação e partição................................................................................

97

Figura 21 - Teores de tocoferóis nos extratos de Chlorophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-

tocoferol........................................................................................................ 99

Figura 22 - Teores de tocoferóis nos extratos de Rhodophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-

tocoferol........................................................................................................ 101

Figura 23 - Teores de tocoferóis nos extratos de Ochrophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-

tocoferol........................................................................................................ 102

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Provas fitoquímicas das classes de antocianinas, antocianidinas e

flavonóides....................................................................................................... 44

Tabela 2 - Provas fitoquímicas das classes de leucoantocianidinas, catequinas e

flavonas............................................................................................................ 44

Tabela 3 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta para

sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...................... 51

Tabela 4 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta para


Tabela 5 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta para


Tabela 6 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Chlorophyta quanto à

habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).................................................... 59

Tabela 7 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Rhodophyta quanto à


Tabela 8 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Ochrophyta quanto à


Tabela 9 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta

quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).................................................. 63

Tabela 10 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta


Tabela 11 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta


Tabela 12 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta

quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido

linoléico............................................................................................................ 70

Tabela 13 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta


linoléico............................................................................................................ 71

Tabela 14 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta


linoléico............................................................................................................ 73

11

Tabela 15 - Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos

presentes nos extratos algáceos........................................................................

78

Tabela 16 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) para o conteúdo fenólico total

(CFT) e ensaios antioxidantes in vitro............................................................. 82

12

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 16

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................................................. 19

2.1 Radicais livres............................................................................................................. 19

2.2 Antioxidantes.............................................................................................................. 21

2.3 Potencial antioxidante das macroalgas marinhas.................................................... 24

2.3.1 Compostos fenólicos.................................................................................................... 27

2.3.2 Carotenóides................................................................................................................ 30

2.3.3 Tocoferóis..................................................................................................................... 33

2.4 Ensaios antioxidantes in vitro..................................................................................... 35

2.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)....... 36

2.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).............................................................. 37

2.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP).............................................................................. 37

2.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico...................... 37

2.4.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)......................................................... 38

3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 39

3.1 Coleta das macroalgas e Preparação do material................................................... 39

3.2 Reagentes..................................................................................................................... 39

3.3 Preparação dos extratos para os ensaios antioxidantes in vitro............................. 40

3.4 Ensaios antioxidantes in vitro.................................................................................... 40

3.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)...... 41



3.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico..................... 42

3.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)..................................................... 42

3.6 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos................. 43

3.6.1 Teste para fenóis e taninos.......................................................................................... 43

3.6.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides............................................. 43

3.6.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas............................................. 44

3.6.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavanonóis e xantonas........................................ 44

3.6.5 Teste para confirmação de catequinas....................................................................... 44

13

3.7 Extração, Identificação e Quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e

luteína) e tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)........................................................................

45

3.7.1 Preparação dos extratos, Saponificação e Partição.................................................... 45

3.7.2 Soluções-padrão de β-caroteno, luteína, α- e δδδδ-tocoferol........................................... 45

3.7.3 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa......................................... 46

3.7.4 Cálculo dos teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δδδδ-tocoferol............................... 46

3.8 Análises estatísticas..................................................................................................... 47

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................... 48

4.1 Ensaios antioxidantes in vitro.................................................................................... 48

4.1.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)..... 48



4.1.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico..................... 68

4.2 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)...................................................... 74

4.3 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos................. 77

4.4 Correlação entre o conteúdo fenólico total (CFT) e os ensaios antioxidantes in

vitro................................................................................................................................ 81

4.5 Extração, identificação e quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e

luteína) e tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)........................................................................ 84

4.5.1 Curvas padrão de carotenóides e tocoferóis................................................................ 84

4.5.2 Carotenóides (α- e β-caroteno e luteína)..................................................................... 86

4.5.3 Tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)......................................................................................... 97

5 CONCLUSÃO............................................................................................................. 106

REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 107

16

1 INTRODUÇÃO

As algas pertencem a um diversificado grupo de organismos fotossintéticos

abrangendo desde células únicas e microscópicas a estruturas complexas, como as macroalgas

marinhas que podem atingir muitos metros de comprimento. Crescem tanto em água doce

como em ambiente marinho, sendo encontradas também em ambientes terrestres úmidos.

Como organismos fotossintéticos, são os maiores produtores de oxigênio e matéria orgânica

nos ambientes aquáticos, sendo responsáveis por 30% a 50% da fotossíntese da Terra (EL

GAMAL, 2010; SZE, 1997; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).

As macroalgas marinhas bentônicas são encontradas ao longo dos costões

rochosos e dos recifes de maré, onde estão distribuídas em faixas bem definidas, visíveis em

relação aos níveis de marés. A complexidade estrutural das macroalgas reflete sua capacidade

de sobrevivência na zona de marés, onde duas vezes por dia estão sujeitas a flutuações

expressivas de umidade, temperatura, salinidade e luz.

As macroalgas são classificadas em quatro filos: Cyanobacteria (algas azuis),

Chlorophyta (algas verdes), Rhodophyta (algas vermelhas) e Ochrophyta (algas pardas), com

base em uma grande variedade de aspectos como captação de luz para a fotossíntese,

polissacarídeos de reserva, organização celular, filogenia molecular, ciclo de vida, morfologia

e ecologia (ALGAEBASE, 2012; SZE, 1997; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).

As macroalgas marinhas são fontes de uma grande variedade de compostos

benéficos para o homem, apresentando diversas aplicações em nutrição (CORNISH;

GARBARY, 2010), na agricultura (MOREIRA et al., 2011), na indústria de alimentos e em

outras áreas biotecnológicas (DELATTRE; FENORADOSOA; MICHAUD, 2011).

Na alimentação humana, elas têm sido usadas por vários séculos principalmente

nos países da Ásia como China, Japão, Coreia e Filipinas. Mais de 10% da dieta dos

japoneses é composta por algas marinhas, razão pela qual são considerados os principais

consumidores mundiais, cujo consumo anual per capita equivale a 5,5 kg de alga seca. Na

China e no Japão, além de serem utilizadas como alimento, elas são empregadas no

tratamento da deficiência de iodo (bócio e hipertireoidismo), em desordens intestinais e

também como agente hipocolesterolêmico e hipoglicêmico (CORNISH; GARBARY, 2010;

EL GAMAL, 2010; MCHUGH, 2003; PANGESTUTI; KIM, 2011). Do ponto de vista

nutricional, as algas são fontes de proteínas, carboidratos, fibras, vitaminas, minerais, além de

possuírem baixo conteúdo de lipídios (GUPTA; ABU-GHANNAM, 2011; MOHAMED;

HASHIM; RAHMAN, 2012).

17

Nos países ocidentais, elas são utilizadas principalmente como matéria-prima para

a obtenção de ficocolóides como alginato, extraído de algas pardas, ágar e carragenana,

ambos extraídos de algas vermelhas (KADAM; PRABHASANKAR, 2010; PLAZA;

CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008).

As macroalgas marinhas, assim como os outros vegetais fotossintetizantes,

permanecem expostas a uma combinação de luz e oxigênio que conduz à formação de radicais

livres e outros agentes oxidantes. Entretanto, é possível que a ausência de danos oxidativos

dos componentes estruturais das algas esteja associada a algum sistema de defesa capaz de

proteger suas células, uma vez que a sobrevivência das algas depende de uma resposta

eficiente aos estresses oxidativos. Muitos compostos encontrados nestes organismos possuem

atividade antioxidante (PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008; ROCHA et al., 2007), dentre

os quais se destacam os compostos fenólicos, os carotenóides e a vitamina E (tococromanóis)

(MATANJUN et al., 2008; PIRES-CAVALCANTE et al., 2011; SOUSA et al., 2008).

Os antioxidantes possuem um efeito benéfico na saúde humana, pois protegem o

organismo contra as espécies reativas que atacam macromoléculas, por exemplo, lipídios das

membranas celulares, proteínas e DNA, desencadeando patologias como diabetes, câncer e

doenças degenerativas e inflamatórias (NGO et al., 2011).

Nas últimas décadas, a comunidade científica tem demonstrado interesse

crescente pelo estudo de compostos antioxidantes naturais, como carotenóides, vitaminas

lipossolúveis e hidrossolúveis e compostos fenólicos, que podem estar associados à prevenção

e/ou redução de doenças cardiovasculares e degenerativas (ALOTHMAN; BHAT; KARIM,

2009; CORNISH; GARBARY, 2010; MOHAMED; HASHIM; RAHMAN, 2012).

Embora a região costeira brasileira compreendida entre o Ceará e o norte do Rio

de Janeiro abrigue uma flora algal com muitos táxons, as informações sobre o potencial

antioxidante das algas brasileiras são ainda escassas. A investigação de novos compostos com

atividade biológica pode resultar em importantes descobertas, tendo em vista a existência

dessa grande diversidade taxonômica das algas (PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008;

ROCHA et al., 2007; VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004).

Diante de tudo que foi exposto e da riqueza algal do litoral cearense a seguinte

hipótese foi formulada: “As macroalgas marinhas do litoral cearense possuem atividade

antioxidante”.

Para nortear as discussões e buscar elementos que possibilitem comprovar a

hipótese levantada, o objetivo geral da pesquisa foi avaliar o potencial antioxidante in vitro de

extratos metanólicos (50%) de macroalgas marinhas do litoral cearense.

18

A partir do objetivo principal, os objetivos específicos listados a seguir foram

propostos para a avaliação desse potencial: determinação da capacidade de sequestrar o

radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila; determinação da habilidade de quelação do íon ferroso;

determinação do poder de redução do ferro; determinação da degradação do β-caroteno;

determinação do conteúdo fenólico total; prospecção fitoquímica das principais classes de

compostos fenólicos; correlação do CFT com as atividades antioxidantes in vitro; e extração e

quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e tocoferóis (α- e δ-tocoferol).

19

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Radicais livres

O termo radical livre é utilizado para definir átomos e moléculas (orgânicas e

inorgânicas) que apresentam um ou mais elétrons desemparelhados, ou seja, que possuem

número ímpar de elétrons na última camada eletrônica. Esta configuração lhes confere

elevada instabilidade fazendo com que eles se tornem altamente reativos. Estes radicais são

resultantes de reações de óxido-redução, isto é, ou se oxidam por cederem o elétron livre, ou

se reduzem por receberem outro elétron. Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma,

nas mitocôndrias ou nas membranas celulares e desempenham importante papel em processos

fisiopatológicos afetando inúmeras moléculas biológicas como lipídios, proteínas,

carboidratos e DNA, dependendo do seu sítio de formação (CAVALCANTE; BRUIN, 2009,

JENSEN, 2003; LEITE; SARNI, 2003; STAVRIDIS, 2008).

Entretanto, o termo radical livre não é adequado para designar todos os agentes

reativos patológicos, tendo em vista que alguns desses agentes não apresentam configuração

com elétrons desemparelhados na última camada eletrônica, como o peróxido de hidrogênio

( 22OH ) e o oxigênio singlete ( 21O ), designados como espécies reativas de oxigênio (EROs).

Dessa forma, o termo EROs é utilizado para todos os agentes reativos patológicos

provenientes do metabolismo do oxigênio molecular, os quais são: radical hidroxil ( •OH ),

radical superóxido ( −2O ), radical hidroperoxil ( •

2HO ), peróxido de hidrogênio ( 22OH ) e

oxigênio singlete ( 21O ) (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI; ANTUNES,

1999; CAVALCANTE; BRUIN, 2009; FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

Apesar de poderem ser mediadoras de patologias, a formação de EROs nem

sempre é prejudicial. Por exemplo, o radical superóxido é vital para as células de defesa e sem

ele o organismo está desprotegido contra infecções causadas por vírus, bactéria e fungos. Na

defesa contra infecção, a bactéria estimula os neutrófilos a produzirem EROs com a finalidade

de destruir o micro-organismo. O radical superóxido, capaz de inativar proteínas ferro-

sulfurosas das bactérias, é considerado um bactericida fraco. Entretanto, sua formação

propicia o aparecimento de alguns produtos com forte atividade antimicrobiana, como ácido

hipocloroso, peróxido de hidrogênio e peroxinitrito, principais responsáveis pelo combate a

corpos estranhos (BALCH, 2006; BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; STAVRIDIS,

2008).

20

Todos os compostos celulares são suscetíveis à ação de EROs, porém a membrana

celular é um dos sítios mais atingidos devido à lipoperoxidação, que consiste na incorporação

de oxigênio molecular a um ácido graxo, resultando na degradação oxidativa e alteração na

estrutura e permeabilidade, o que interfere nos transportes ativo e passivo normais. A

oxidação dos lipídios no sangue agride as paredes das artérias e veias, facilitando o acúmulo

desses lipídios, com consequente arteriosclerose, podendo causar trombose, infarto e acidente

vascular cerebral (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; CAVALCANTE; BRUIN, 2009;

NOTA; KOUTROUBAKIS; KOUROUMALIS, 2006).

Além de EROs, é importante salientar a existência das espécies reativas de

nitrogênio (ERNs), que são originadas quando o elétron desemparelhado se encontra centrado

no átomo de nitrogênio. As principais ERNs são: óxido nítrico ( •NO ), óxido nitroso ( 32ON ),

ácido nitroso ( 2HNO ), nitritos ( −2NO ), nitratos ( −

3NO ) e peroxinitritos ( −ONOO )

(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; CAVALCANTE; BRUIN, 2009).

EROs e ERNs são naturalmente formadas nos tecidos celulares como resultado de

processos metabólicos, mas também podem surgir como resultado de processos patológicos

devido a alguma disfunção biológica. A formação destas espécies reativas é propiciada por

fatores endógenos, como respiração aeróbica, inflamações, peroxissomos e enzimas do

citocromo P450, e pela exposição a fatores exógenos, como ozônio, radiações gama e

ultravioleta, medicamentos, dieta e cigarro (ARUOMA, 1999; BARREIROS; DAVID;

DAVID, 2006; BIANCHI; ANTUNES, 1999).

No organismo, EROs e ERNs encontram-se envolvidas na produção de energia,

fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias

biológicas importantes, como hormônios e enzimas. Porém, a produção excessiva de EROs e

ERNs acarreta efeito deletério às células e aos tecidos pela sua relação com o envelhecimento

e inúmeras patologias como artrite, aterosclerose, diabetes, catarata, esclerose múltipla,

inflamações crônicas, disfunção cognitiva, cardiopatias, choque hemorrágico, enfisema,

câncer e doenças do sistema imune (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI;

ANTUNES, 1999; CAVALCANTE; BRUIN, 2009).

Os danos causados por radicais livres ao DNA parecem ter importância no

processo inicial da carcinogênese. O radical hidroxil altera as bases do DNA celular iniciando

o desenvolvimento do tumor. Algumas hipóteses propõem que a oxidação das lipoproteínas

de baixa densidade (LDL) consiste em fator preponderante nos processos arterioscleróticos.

21

Há suposições também sobre a lipoperoxidação atuando como fator na degeneração da

mielina em certas doenças neurológicas (GÁLVEZ, 2010; JACOB, 1995).

Além dos danos que estas espécies reativas podem causar aos componentes

celulares, elas também causam a degradação de óleos e gorduras presentes nos alimentos. Esta

alteração é responsável pelo aparecimento de odores e sabores próprios de ranço, implicando

no decréscimo da qualidade e segurança nutricionais, causado pela formação de produtos

secundários, potencialmente tóxicos (ANDREO; JORGE, 2006; OLIVEIRA et al., 2009).

No organismo, o excesso de EROs e ERNs é combatido por antioxidantes

produzidos pelo próprio organismo ou absorvidos através da dieta. Na indústria alimentícia, o

principal mecanismo de proteção contra a ação de radicais livres é a utilização de

antioxidantes sintéticos ou naturais (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; BIANCHI;

ANTUNES, 1999; CHORILLI; LEONARDI; SALGADO, 2007; YOSHIHARA;

FUJIWARA; SUZUKI, 2010).

2.2 Antioxidantes

O termo antioxidante tem natureza multiconceitual, sendo utilizado em diversas

áreas biotecnológicas, porém difícil de ser claramente definido. Por exemplo, para a indústria

alimentícia, antioxidante é qualquer substância capaz de inibir a peroxidação dos lipídios e

consequentemente a rancificação das gorduras dos alimentos (HALLIWELL; GUTTERIDGE,

2006; OLIVEIRA et al., 2009; RAMALHO; JORGE, 2006).

Uma definição mais ampla desse termo é: “qualquer substância que mesmo

estando presente em concentrações relativamente baixas quando comparada àquela do

substrato oxidável, o qual inclui quase todas as moléculas encontradas in vivo, atrasa ou inibe

a oxidação desse substrato de maneira eficaz” (HALLIWELL et al., 1995; OLIVEIRA et al.,

2009; SIES; STHAL, 1995). Entretanto, devido aos diversos usos e a aplicabilidade do termo

antioxidante, Halliwell e Gutteridge (2006) resolveram simplificá-lo para: “qualquer

substância que retarda, previne ou remove os danos oxidativos das células alvo”.

Uma ampla variedade de compostos de origem endógena e exógena compõe o

mecanismo antioxidante do organismo humano (JACOB, 1995; YOSHIHARA; FUJIWARA;

SUZUKI, 2010). Entretanto, existem antioxidantes apropriados para cada tipo de radical livre

e a atuação desses compostos depende da espécie reativa gerada, como e onde foi gerada e

qual o alvo do dano. Dessa forma, é perfeitamente possível que um antioxidante proteja um

sistema, mas falhe na proteção ou até mesmos cause danos em outros sistemas. Por exemplo,

22

um antioxidante inibidor da peroxidação lipídica pode não proteger outros alvos tais como

proteínas e DNA, que é o caso do butil-hidroxianisol (BHA), um poderoso inibidor da

peroxidação lipídica, utilizado na conservação de alimentos, mas que pode induzir o câncer.

Este fato está relacionado com os possíveis danos oxidativos que este composto pode causar à

molécula de DNA (BIANCHI; ANTUNES, 1999; CHORILLI; LEONARDI; SALGADO,

2007; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010; HALLIWELL et al., 1995).

Os antioxidantes sintetizados endogenamente na célula ou no líquido extracelular

agem tanto enzimaticamente, a exemplo da superóxido dismutase, catalase e glutationa

peroxidase, quanto não enzimaticamente, a exemplo da glutationa reduzida, transferrina e

ferritina (proteínas ligadas ao ferro). Nos alimentos, principalmente naqueles de origem

vegetal, uma grande variedade de compostos antioxidantes é encontrada, por exemplo, α-

tocoferol, β-caroteno, ácido ascórbico e flavonóides (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;

BIANCHI; ANTUNES, 1999; GÁLVEZ, 2010).

Além dos antioxidantes naturais encontrados nos alimentos, antioxidantes

sintéticos como BHA, butil-hidroxitolueno (BHT), terc-butil hidroquinona (TBHQ) e propil

galato (PG) (Figura 1) têm importante papel na indústria alimentícia e podem ser adicionados

intencionalmente para retardar o aparecimento dos fenômenos de oxidação, mantendo intactas

as características sensoriais do alimento. Esses antioxidantes não devem causar efeitos

fisiológicos negativos ou produzir cores, odores e/ou sabores indesejáveis. Eles devem ser

lipossolúveis, resistentes aos tratamentos a que o alimento seja submetido, ativos em baixas

temperaturas e viáveis economicamente (ANDREO; JORGE, 2006; CHORILLI;

LEONARDI; SALGADO, 2007; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010).

Os compostos com atividade antioxidante podem atuar de diferentes maneiras

para a proteção do organismo contra os radicais livres. Um dos mecanismos de defesa

consiste em impedir a sua formação, principalmente pela inibição das reações em cadeia com

ferro e cobre. Outro é baseado na interceptação dos radicais livres gerados pelo metabolismo

celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre as células alvo. Mais um

mecanismo, relacionado com a capacidade de reparar lesões causadas por esses radicais

através da remoção de danos na molécula de DNA e da reconstituição das membranas

celulares danificadas, tem sido relatado. O aumento da síntese de enzimas antioxidantes em

resposta a geração de radicais livres também é um mecanismo de defesa do organismo

(BIANCHI; ANTUNES, 1999; GÁLVEZ, 2010; HALLIWELL et al., 1995).

23 Figura 1 - Estruturas fenólicas dos antioxidantes sintéticos.

OH

C(CH3)3

OCH3

OH

C(CH3)3

CH3

(CH3)3C

OH

OH

COOC3H7

HO

OH

C(CH3)3

OH

Butil-hidroxianisol (BHA) Butil-hidroxitolueno (BHT)

Propil galato (PG) Terc-butil hidroquinona (TBHQ) Fonte: RAMALHO; JORGE (2006).

De acordo com a revisão realizada por Ramalho e Jorge (2006), os antioxidantes

podem ser classificados em primários, sinergistas, removedores de oxigênio, biológicos,

agentes quelantes e mistos.

Os antioxidantes primários incluem aqueles compostos que promovem a remoção

ou inativação dos radicais livres formados durante o processo de iniciação, através da doação

de átomos de hidrogênio a estas moléculas, interrompendo a reação em cadeia. O átomo de

hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos radicais livres com maior facilidade que os

hidrogênios alílicos das moléculas insaturadas. Os principais antioxidantes primários são os

sintéticos, BHA, BHT, PG e TBHQ, e os naturais, tocoferóis.

Os antioxidantes sinergistas são substâncias com pouca ou nenhuma atividade

antioxidante, que podem aumentar a atividade dos antioxidantes primários quando usados em

combinação adequada com eles. Os removedores de oxigênio, como ácido ascórbico, seus

isômeros e derivados, são compostos que atuam capturando-o, por estar presente no meio,

através de reações químicas estáveis tornando-o indisponível para atuar como propagador da

auto-oxidação. Na classe dos antioxidantes biológicos estão incluídas várias enzimas, dentre

elas superóxido dismutase e catalase. Os agentes quelantes, como ácido cítrico e seus

derivados, são compostos que complexam íons metálicos, principalmente cobre e ferro, os

quais catalisam a oxidação lipídica. A presença de um par de elétrons não compartilhado na

24

estrutura molecular desses compostos é o que determina sua atuação como agente quelante.

Finalmente, a classe dos antioxidantes mistos compreende compostos de origem vegetal e

animal, por exemplo, várias proteínas hidrolisadas, flavonóides e derivados de ácido cinâmico

(ácido caféico), que têm sido amplamente estudados como antioxidante em alimentos.

Os antioxidantes sintéticos, BHA, BHT, TBHQ e PG, apresentam uma estrutura

fenólica que permite a doação de hidrogênio a um radical livre, regenerando a molécula de

acilglicerol e interrompendo o mecanismo de oxidação por radicais livres. Entretanto, os

derivados fenólicos transformam-se em radicais livres podendo se estabilizar ou promover

reações de oxidação. Dessa forma, tais compostos representam riscos à saúde, normalmente

associados ao seu consumo excessivo. Estudos toxicológicos com cobaias têm demonstrado a

possibilidade de esses compostos apresentarem efeito carcinogênico. Por exemplo, o TBHQ

pode provocar a redução do nível de hemoglobina e a hiperplasia de células basais, e o BHA

pode induzir a hiperplasia gastrintestinal e a formação de papiloma e carcinoma (ANDREO;

JORGE, 2006; DOLATABADI; KASHANIAN, 2010; RAMALHO; JORGE, 2006).

A utilização de antioxidantes sintéticos é limitada. Nos últimos anos, o Joint

Expert Committee on Food Additives (JECFA) da Organização das Nações Unidas para a

Agricultura e a Alimentação (FAO) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) modificaram a

ingestão diária aceitável destes compostos. O uso de TBHQ é proibido no Canadá e na

Comunidade Econômica Europeia (SOARES, 2002; RAMALHO; JORGE, 2006). No Brasil,

o uso de antioxidantes é regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) que dispõe de resoluções e/ou portarias sobre limites máximos permitidos de

acordo com a categoria do alimento. De um modo geral, os teores máximos de BHT ou PG

são 0,01% e de BHA ou TBHQ, 0,02%, calculados sobre o teor de gordura (ANVISA, 2012).

Devido aos efeitos tóxicos e carcinogênicos causados pelos compostos sintéticos,

na última década, a busca por antioxidantes naturais ganhou considerável atenção. As

pesquisas têm explorado os organismos marinhos por serem fontes promissoras de compostos

bioativos com valioso potencial nutracêutico e farmacêutico, incluindo as algas que consistem

em uma das fontes mais ricas de antioxidantes naturais (DOLATABADI; KASHANIAN,

2010; NGO et al., 2011; RAMALHO; JORGE, 2006).

2.3 Potencial antioxidante das macroalgas marinhas

Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície da Terra, e as espécies marinhas

representam aproximadamente metade da biodiversidade do globo. Dentre os organismos

25

marinhos se destacam as macroalgas que ainda são consideradas um recurso subexplorado,

embora sejam utilizadas há muito tempo na dieta e na medicina tradicional oriental

(PANGESTUTI; KIM, 2011).

As algas compreendem um grupo com aproximadamente 34.500 espécies de

organismos fotossintetizantes, das quais aproximadamente 3.300 pertencem ao Império

Procarionte, Reino Bacteria (classificadas junto com as eubactérias). Cerca de 90% (30.174

espécies) pertencem ao Império Eucarionte, distribuídas em quatro reinos Plantae, Chromista,

Fungi e Protozoa. São capazes de habitar os mais variados ambientes da superfície terrestre

desde que haja luz suficiente para que ocorra a fotossíntese. Nestes habitats, as algas são

submetidas a condições extremas com mudanças acentuadas de salinidade, temperatura,

nutrientes e luminosidade e, para sobreviverem, precisam se adaptar rapidamente às novas

condições ambientais, produzindo assim uma grande variedade de metabólitos secundários,

alguns exclusivos das algas, que muitas vezes não são encontrados em outros organismos

(ALGAEBASE, 2012; EL GAMAL, 2010; PLAZA; CIFUENTES; IBÁÑEZ, 2008;).

Estes compostos produzidos pelas algas durante o processo adaptativo podem

expressar diversas atividades em outros sistemas com potencial antibacteriano, antifúngico,

antiviral, antienvelhecimento, anti-inflamatório, anticoagulante, antimutagênico, antitumoral,

anticancerígeno e antioxidante (CORNISH; GARBARY, 2010; EL GAMAL, 2010).

De acordo com Rocha et al. (2007), o interesse inicial pelo estudo de substâncias

antioxidantes em algas surgiu no Japão em 1980 com o trabalho de Fujimoto e Kaneda, que

buscavam novos aditivos alimentares em substituição àqueles antioxidantes sintéticos (BHA e

BHT). Nestas três décadas, apesar de o mecanismo de ação dos antioxidantes das algas

marinhas ainda não estar inteiramente compreendido, já foram publicados trabalhos que

abordam a atividade antioxidante das macroalgas marinhas.

Duan et al. (2006) compararam as propriedades antioxidantes dos extratos e

frações obtidos da rodofícea Polysiphonia urceolata com os antioxidantes sintéticos BHT,

ácido gálico e ácido ascórbico. Todas as concentrações testadas (0,4 – 50 µg mL-1) do extrato

bruto e da fração solúvel em acetato de etila apresentaram maior poder de sequestro do radical

DPPH do que o BHT. Já no ensaio com o sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, o

extrato bruto e a fração solúvel em acetato de etila apresentaram atividade semelhante ou, na

maioria dos casos, maior que aquela obtida para os ácidos gálico e ascórbico nas

concentrações de 10 a 200 µg mL-1.

Matanjun et al. (2008) estudaram a atividade antioxidante de oito espécies de

algas marinhas e constataram que as algas verdes Caulerpa lentillifera e C. racemosa e a

26

parda Sargassum polycystum são fontes potenciais de antioxidantes naturais devido ao seu

elevado poder de sequestrar radicais livres e teor de compostos fenólicos.

Devi et al. (2008) estudaram a atividade antioxidante de dez espécies de algas

marinhas da Índia, tendo encontrado que os extratos da rodófita Gelidiella acerosa

apresentaram elevada atividade antioxidante, útil na prevenção e retardamento de várias

desordens relacionadas ao estresse oxidativo. Testes in vitro da atividade antioxidante dos

extratos e das frações semipurificadas de outra alga vermelha, Rhodomela confervoides,

revelaram que ela pode ser utilizada no tratamento de doenças relacionadas com o estresse

oxidativo (WANG et al., 2009).

O extrato metanólico da rodófita Polysiphonia morrowii exibiu elevada atividade

antioxidante com relação ao sequestro dos radicais DPPH, hidroxil e peróxido de hidrogênio,

ao poder de redução e à quelação do íon ferroso. A atividade desse extrato se mostrou similar

e/ou superior àquela determinada para os antioxidantes sintéticos BHA e BHT. Além disso, o

extrato também apresentou habilidade para inibir danos oxidativos no DNA (JE et al., 2009).

El-Baky, El-Baz e El-Baroty (2009) estudaram a atividade antioxidante da

macroalga marinha verde Ulva lactuca. Neste estudo foram determinados 34 diferentes

compostos com predominância de clorofilas, carotenóides e compostos fenólicos nesta ordem.

O extrato algáceo apresentou atividade antioxidante de sequestro de DPPH comparável aos

antioxidantes sintéticos α-tocoferol, BHA e BHT.

Muitos compostos isolados de algas marinhas desempenham atividade

antioxidante. Dentre eles estão: fucoxantina, pirofeofitina a (um metabólito da clorofila a),

meroditerpenos (compostos análogos aos tocoferóis), florotaninos, fosfolipídios

(fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositíseo), clorofila a e seus metabólitos, tocoferóis,

polissacarídeos hidrossolúveis (alginato, sulfato de alginato, sulfato de

propilenoglucolalginato, sulfato de propilenoglucolmanuronato, oligossacarídeos de

quitosana, N,O-carboximetilquitosana e hidropropilquitosano), polissacarídeos lipossolúveis

(hexanoilquitosano e N-benzoilhexanoilquitosana), tetrapreniltoluquinóis, ácidos fenólicos

(trans-cinâmico, p-cumárico e ferúlico) e polissacarídeos sulfatados de baixo peso molecular

(NGO et al., 2011; ROCHA et al., 2007; STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011). Boa parte

desses compostos está distribuída em três grandes categorias: compostos fenólicos,

carotenóides e tocoferóis.

27

2.3.1 Compostos fenólicos

Nos vegetais, os compostos fenólicos são metabólitos secundários provenientes

das vias pentoses fosfato, chiquimato e fenilpropanóides, podendo ser encontrados na forma

livre ou ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas. Constituem um dos grupos de

fitoquímicos de maior ocorrência, abrangendo desde moléculas simples até outras de alto grau

de polimerização. Possuem considerável importância fisiológica e morfológica,

desempenhando um importante papel no crescimento e reprodução, além de prover proteção

contra patógenos e predadores. Nas frutas e legumes, estes compostos são responsáveis por

características sensoriais como cor, sabor (adstringência) e aroma (BALASUNDRAM;

SUNDRAM; SAMMAN, 2006; BERNAL et al., 2011; SOARES, 2002).

Do ponto de vista estrutural, os compostos fenólicos são constituídos de pelo

menos um anel aromático ligado a um ou mais substituintes hidroxila, estando divididos em

dois grupos majoritários: flavonóides e não flavonóides (BERNAL et al., 20011; IGNAT;

VOLF; POPA, 2011). Os flavonóides correspondem a mais da metade dos oito mil compostos

fenólicos naturais encontrados nos vegetais e apresentam estrutura química C6−C3−C6

(diarilpropano) (BERNAL et al., 20011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004; IGNAT;

VOLF; POPA, 2011; SOARES, 2002). Essa estrutura, ilustrada na Figura 2, consiste em dois

anéis aromáticos (A e B) unidos por uma ponte de três carbonos na forma de um anel

heterocíclico (C). Variações no anel C resultam em flavonóis, flavonas, flavononas, flavanóis

(catequinas), isoflavonas, flavanonóis e antocianidinas. Alterações como oxigenação,

alquilação, glicosilação e sulfatação nos anéis A e B geram diferentes compostos dentro de

cada grupo de flavonóides (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006; IGNAT;

VOLF; POPA, 2011). Eles atuam como antioxidantes tanto no compartimento celular

lipofílico quanto no hidrofílico (BIANCHI; ANTUNES, 1999), e esta atividade é resultante

dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila adjacentes localizados em várias posições dos

anéis A, B e C, das duplas ligações dos anéis benzênicos e da dupla ligação da função oxo

(−C=O) de alguns flavonóides (SILVA et al., 2010).

Os compostos fenólicos não flavonóides são formados principalmente pelos

ácidos fenólicos e taninos. Os ácidos fenólicos se dividem em dois grupos. O primeiro,

derivado da estrutura C6−C1, é constituído pelos ácidos benzóicos, por exemplo, ácido

hidroxibenzóico, ácido gálico e ácido elágico, que são os mais simples encontrados na

natureza (Figura 3). O segundo grupo é formado pelos ácidos cinâmicos, por exemplo, ácido

caféico e ácido p-cumárico, derivados da estrutura C6−C3 (Figura 4). A ciclização da cadeia

28

lateral do ácido o-cumárico forma as cumarinas que são fenólicos simples derivados do ácido

cinâmico (Figura 5) (BERNAL et al., 2011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004;

SOARES, 2002).

Figura 2 - Estrutura genérica de uma molécula de flavonóide.

O

A

B

C

3'4'

5'

2'

6'1'

23

45

6

78

Fonte: BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN (2006).

Figura 3 - Estrutura química dos principais ácidos benzóicos.

R1 = OH � ácido salicílico R1 = R4 = OH � ácido gentísico R3 = OH � ácido p-hidroxibenzóico R2 = R3 = OH � ácido protocatequínico R2 = OCH3, R3 = OH � ácido vanílico R2 = R3 = R4 = OH � ácido gálico R2 = R4 = OCH3, R3 = OH � ácido siríngico

Fonte: SOARES (2002).

Figura 4 - Estrutura química dos principais ácidos cinâmicos.

R1 = R2 = R 3 = R 4= H � ácido cinâmico R1 = OH � ácido o-cumárico R2 = OH � ácido m-cumárico R3 = OH � ácido p-cumárico R2 = R3 = OH � ácido caféico R2 = OCH3, R3 = OH � ácido ferúlico R2 = R4 = OCH3, R3 = OH � ácido sinápico

Fonte: SOARES (2002).

Figura 5 – Ciclização do ácido o-cumárico em cumarina.

OH

CH CH COOH CH

CH

CO

O

Ácido o-cumárico Cumarina Fonte: SOARES (2002).

COOHR3

R4

R1R2

R3

R4

R1R2

CH CH COOH

29

Os taninos constituem o terceiro grupo de compostos fenólicos mais importantes,

podendo ser subdivididos em taninos hidrolisáveis, condensados (proantocianidinas) ou

florotaninos. Os taninos hidrolisáveis são derivados do ácido gálico, o qual é esterificado e/ou

oxidado para formar as complexas moléculas de tanino hidrolisáveis. Os taninos condensados

são poliméricos de flavonóides, mas as etapas de condensação e polimerização envolvidas em

sua formação ainda não foram completamente elucidadas. Os florotaninos são compostos

fenólicos altamente hidrofílicos formados pela polimerização do floroglucinol, que têm sido

isolados de vários gêneros de algas pardas (IGNAT; VOLF; POPA, 2011; NGO et al., 2011).

A atividade antioxidante dos compostos fenólicos não flavonóides está associada

com a posição das hidroxilas e com a proximidade do grupo carboxila (–COOH) em relação

ao grupo fenil. Quanto mais próximo o –COOH estiver do fenil maior será a capacidade

antioxidante do grupo hidroxila na posição meta (SILVA et al., 2010).

Além da atividade antioxidante, os compostos fenólicos apresentam outros efeitos

bioquímicos e farmacológicos, dentre os quais se destacam a capacidade de reduzir o açúcar

do sangue, emagrecimento e as ações anti-inflamatória, antimicrobiana, antiplaquetária,

antialergênica e antitrombótica (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006;

BERNAL et al., 2011; DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004).

Os antioxidantes fenólicos atuam como sequestradores de radicais livres, doadores

de átomos de hidrogênio ou elétrons e, algumas vezes, como quelantes de metais, agindo nas

etapas de iniciação e propagação do processo oxidativo. Devido à ressonância do anel

aromático presente nos antioxidantes fenólicos naturais, os produtos intermediários formados

pela ação desses antioxidantes são relativamente estáveis ao contrário daqueles produzidos

pela ação de compostos fenólicos sintéticos (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN,

2006; BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; SOARES, 2002).

Os compostos fenólicos estão presentes em praticamente todos os grupos de algas.

Os bromofenóis são detectados principalmente em algas vermelhas pertencentes às ordens

Ceramiales (Laurencia spp.), Gelidiales e Corallineales, mas também ocorrem nas algas

verdes e pardas. Nas algas pardas, os principais compostos fenólicos são os florotaninos,

como fucóis, floretóis, eckóis e carmalóis, que, aliás, são encontrados unicamente nas feófitas.

Na ordem Fucales, por exemplo, eles podem representar mais de 20% do peso úmido

(STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011).

Queirós, Lage-Yusty e López-Hernández (2010) reportaram a ocorrência de

catequina na macroalga vermelha Porphyra spp. e de ácido gálico nas algas pardas Undaria

pinnatifida, Himanthalia elongata e na vermelha Palmaria spp.

30

Na macroalga vermelha Bryothamnion triquetrum, os ácidos fenólicos p-cumárico,

furúlico e trans-cinâmico foram capazes de inibir a lipoperoxidação espontânea (NOVOA et

al., 2001). A atividade neuroprotetora contra os efeitos oxidativos deletérios do peróxido de

hidrogênio e do cloreto de metilmercúrio foi relacionada com elevada concentração de

substâncias fenólicas nesta espécie (FALLARERO et al., 2003).

2.3.2 Carotenóides

Outra importante classe de antioxidantes encontrada nos vegetais consiste nos

carotenóides, um grupo de pigmentos naturais com mais de setecentos diferentes compostos já

caracterizados (HORNERO-MÉNDEZ; BRITTON, 2002; TAKAICHI, 2011), dos quais entre

cinquenta e sessenta têm atividade de vitamina A, sendo o β-caroteno o de maior destaque

(MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO; HEREDIA, 2004; OLSON; KRINSKY, 1995).

São compostos terpenóides responsáveis pela coloração vermelha, laranja e

amarela das folhas, frutas e flores das plantas, de alguns insetos, pássaros, peixes e crustáceos,

que os incorporam através de suas dietas, tendo em vista que somente as plantas superiores,

bactérias, fungos e algas são capazes de sintetizar os pigmentos carotenóides (BERNAL et al.,

2011; BHOSALE; BERNSTEIN, 2007; NGO et al., 2011; RAO; RAO, 2007; TAKAICHI,

2011). São produzidos predominantemente nos tecidos fotossintéticos de plantas superiores e

algas (BRITTON; LIAAEN-JENSEN; PFANDER, 1995; SILVA et al., 2010).

Nos vegetais, os carotenóides são encontrados nos plastídios formando um

complexo pigmento-proteína e atuam como pigmentos acessórios da fotossíntese e na

proteção contra a foto-oxidação (PANGESTUTI; KIM, 2011; SILVA et al., 2010;

TAKAICHI, 2011; TANAKA; SASAKI; OHMIYA, 2008).

Os terpenóides são formados pela condensação de oito unidades de isopreno

(BARTLEY; SCOLNIK, 1995) e originam um esqueleto carbônico constituído de quarenta

átomos que é sintetizado pela ligação cauda-a-cauda de duas moléculas de geranil que

possuem vinte átomos de carbono cada. As extremidades das moléculas dos carotenóides

podem ser lineares ou apresentar grupamentos cíclicos, como ciclohexanos ou ciclopentanos

(OLIVER; PALOU, 2000; SILVA et al., 2010). Quando a cadeia central apresenta um

grupamento final cíclico, este pode ser substituído por grupos funcionais contendo oxigênio

(BHOSALE; BERNSTEIN, 2007; SILVA et al., 2010; STAHL; SIES, 2005; TAPIERO;

TOWNSEND; TEW, 2004). Estão divididos em duas classes: carotenos, compostos apenas de

carbono e hidrogênio, sendo o α-caroteno, β-caroteno e licopeno os principais constituintes

31

deste grupo; e xantofilas, derivados oxigenados dos carotenos que contêm pelo menos uma

função hidroxi, ceto, epóxi, metoxi ou ácido carboxílico, sendo zeaxantina, luteína, α-

criptoxantina, β-criptoxantina e cantaxantina, as mais importantes (BERNAL et al., 2011;

SILVA et al., 2010; STAHL; SIES, 2005).

A estrutura básica da molécula dos carotenóides inclui um sistema de duplas

ligações conjugadas (polieno), ilustrada na Figura 6, que influencia suas propriedades

químicas, físicas e bioquímicas, conferindo à molécula capacidade de absorver luz no

espectro visível (400 a 700 nm), grande susceptibilidade à degradação oxidativa e

isomerização geométrica ocasionada pela luz, calor e ácidos (AMBRÓSIO; CAMPOS;

FARO, 2006; BRITTON; LIAAEN-JENSEN; PFANDER, 1995; SILVA et al., 2010).

A estrutura única dos carotenóides propicia um notável potencial biológico

antioxidante na proteção dos tecidos contra os danos oxidativos e foto-oxidativos através da

extinção de radicais livres e EROs, que são resultantes de processos metabólicos e

patológicos, e essa atividade depende principalmente do número de duplas ligações

conjugadas, do grupo terminal e da natureza dos substituintes em carotenóides que possuem

grupos terminais cíclicos (BRITTON, 1995; DEMBINSKA-KIEC, 2005; NGO et al., 2011).

São benéficos à saúde humana, particularmente contra os males relacionados ao

envelhecimento, algumas doenças degenerativas, certos tipos de câncer, doenças

cardiovasculares e catarata (BERNAL et al., 2011; MELÉNDEZ-MARTÍNEZ; VICARIO;

HEREDIA, 2004).

Os carotenóides possuem atividade anticancerígena específica, por exemplo,

luteína, zeaxantina e β-caroteno atuam contra o câncer de mama; criptoxantina e α-caroteno,

contra câncer cervical, e o licopeno combate o câncer de próstata, do trato digestivo e de

estômago. Entretanto, independentemente dessa atividade, todos os carotenóides exibem

atividade antioxidante (STENGEL; CONNAN; POPPER, 2011). Além de atuar como

anticancerígeno e antioxidante, a luteína, juntamente com a zeaxantina, são os dois pigmentos

majoritários da retina, os quais inibem a degeneração macular relacionada com a idade e

reduzem a formação de catarata (TANAKA; SHNIMIZU; MORIWAKI, 2012).

Os carotenóides, agindo como antioxidantes, reduzem os produtos de oxidação de

modo mais eficiente em meios onde os níveis de oxigênio são baixos; níveis elevados causam

sua destruição. Na maioria dos tecidos biológicos, o nível de oxigênio é baixo, de modo que

os carotenóides adquirem importância como antioxidante (BARREIROS; DAVID; DAVID,

2006; SILVA et al., 2010). In vivo, os carotenóides agem como desativadores do 21O .

32 Figura 6 - Estruturas químicas dos carotenóides de ocorrência mais comum nas algas.

β-caroteno

α-caroteno

HO

OH

luteína

OCOCH3HO

fucoxantina

O

HO

O

OH

astaxantina

HO

OH

zeaxantina

O

OC

Fonte: TAKAICHI (2011).

Este processo pode ocorrer de duas formas: 95% através da transferência física de

energia de excitação do 21O para o carotenóide e apenas 5% pela reação química do

carotenóide com o 21O . Além de agirem como desativadores, os carotenóides atuam como

sequestradores de radicais peroxil, os quais se adicionam à dupla ligação 5−6, 5’−6’ ou

33

15−15’ da molécula do caroteno (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; FERREIRA;

MATSUBARA, 1997; SILVA et al., 2010).

Os carotenóides totais e os ésteres de astaxantina extraídos da microalga verde

Haematococcus pluvialis foram administrados em ratos por via oral e apresentaram efeitos

gastroprotetores (KAMATH et al., 2008). A elevada atividade antioxidante exibida pelo

extrato da macroalga parda Cystoseira hakodatensis em vários ensaios foi atribuída, em parte,

ao conteúdo de fucoxantina presente nessa espécie (AIRANTHI; HOSOKAWA;

MIYASHITA, 2011).

2.3.3 Tocoferóis

Outro composto com atividade antioxidante encontrado na natureza é a vitamina

E, que consiste em um termo genérico que engloba um grupo de oito substâncias com

diferentes graus de atividade vitamínica, pertencentes a duas séries: tocoferóis e tocotrienóis,

cada uma com quatro formas diferentes (α-, β-, δ- e γ-). Ambas as séries são conhecidas pela

atividade antioxidante. Os tocoferóis são encontrados nas folhas e sementes da maioria dos

vegetais, enquanto os tocotrienóis, menos abundantes, estão presentes principalmente em óleo

de palma e grãos de arroz. Todavia, dentre todas as isoformas, o α-tocoferol é mais facilmente

encontrado em fontes naturais (BERNAL et al., 2011; LING et al., 2012; MACHLIN, 1991).

A vitamina E é sintetizada apenas pelos vegetais e outros organismos

fotossintetizantes, incluindo as algas (BRAMLEY et al., 2000; DELLAPENNA, 2005;

DELLAPENNA; POGSON, 2006; MAEDA; DELLAPENNA, 2007). Nos vegetais, sua

função é proteger o aparato fotossintético contra a toxicidade do oxigênio e a peroxidação dos

lipídios (BRAMLEY et al., 2000; MUNNÉ-BOSCH; ALEGRE, 2002).

Ela é encontrada predominantemente na bicamada lipídica das membranas

celulares e na monocamada lipídica das lipoproteínas plasmáticas (ATKINSON; EPAND;

EPAND, 2008; MARZZOCO; TORRES, 2007), sendo vital para a manutenção da integridade

das membranas e para o funcionamento dos plastídios (DELLAPENNA, 2005; MUNNÉ-

BOSCH; ALEGRE, 2002).

A vitamina E também desempenha importante papel na imunocompetência,

estando associada à inibição da carcinogênese (BRAMLEY et al., 2000; RIGOTTI, 2007;

SILUK et al., 2007; SILVA; NAVES, 2001; TRABER; ATKINSON, 2007). O α-tocoferol é

também a forma mais amplamente distribuída nos tecidos e plasma, ajudando o organismo a

34

CH3

R1

R2

OCH3

HO

CH3 CH3

CH3

CH3

Tocoferol

CH3

R1

R2

OCH3

HO

CH3 CH3

CH3

CH3

Tocotrienol

1

23

4567

8

1

23

4567

8

3'4'

5'6'

7'8'

9'10'

11'2'

1'

3'4'

5'6'

7'8'

9'10'

11'2'

1'

9

9

manter sua defesa normal contra doenças e injúrias ambientais, por proteger as membranas

celulares contra os danos causados por radicais livres.

Todos os compostos com atividade de vitamina E têm em sua estrutura um anel

6-cromanol e uma cadeia lateral (LING et al., 2012; MACHLIN, 1991; REITER; JIANG;

CHRISTEN, 2007). O anel cromanol possui um radical hidroxil, importante para a função

biológica desempenhada pela vitamina (LING et al., 2012; SALDEEN; SALDEEN, 2005).

Os tocoferóis têm uma cadeia lateral saturada, enquanto os tocotrienóis têm uma estrutura

similar, entretanto insaturada, com duplas ligações nas posições 3’, 7’ e 11’ da cadeia lateral

(MACHLIN, 1991; SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010). Todos os isômeros tocóis

(tocoferóis e tocotrienóis) são diferenciados pelo número e posição do grupo metil no anel

cromanol (Figura 7) (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; SEPPANEN; SONG;

CSALLANY, 2010).

Figura 7 - Estruturas químicas dos tocoferóis e tocotrienóis.

Tocoferol / tocotrienol R1 R2 α- CH3 CH3 β- H CH3 γ- CH3 H δ- H H

Fonte: CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO (2007).

As atividades antioxidantes dos tocoferóis e tocotrienóis são decorrentes da

capacidade que essas moléculas têm de doar o hidrogênio do grupo hidroxil do anel cromanol.

Entretanto, a diferença estrutural no anel cromanol pode ser responsável pela diferença na

capacidade antioxidante de cada tococromanol. As isoformas α- são trimetiladas nas posições

5, 7 e 8 do anel cromanol, já as β- e γ- são dimetiladas nas posições 5 e 8 e 7 e 8 do anel

cromanol, respectivamente, enquanto que as δ- são monometiladas na posição 8 do anel

cromonol. As posições orto (5 e 7) do grupo metil no anel cromanol aumentam a capacidade

antioxidante dos tococromanóis. Assim, espera-se que o α-tocoferol com dois grupos orto-

35

metil tenha maior capacidade de doador hidrogênio do que β- e γ-tocoferol que possuem um

grupo orto-metil e do que o δ-tocoferol que não possui grupamento orto-metil (AGGARWAL

et al., 2010; SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010; SMOLAREK; SUH, 2011).

Assim, acreditava-se, originalmente, que a habilidade dos tococromanóis de doar

hidrogênio apresentava uma gradação: α- > β- ≅ γ- > δ-, entretanto, atualmente essa afirmativa

é controversa devido aos diferentes sistemas lipídicos usados como modelo, variações nas

condições oxidativas e inúmeros métodos de determinação da atividade antioxidante relativa

de todos os isômeros de tocoferóis e tocotrienóis (SEPPANEN; SONG; CSALLANY, 2010).

Além da capacidade de doar hidrogênio, o que interrompe a propagação da reação

em cadeia da lipoperoxidação, a vitamina E atua como quelante dos oxidantes produzidos

durante a lipoperoxidação. A vitamina E, ao contrário do β-caroteno, se mostra mais eficiente

quando as tensões de oxigênio no meio são elevadas (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;

FERREIRA; MATSUBARA, 1997; RAMALHO; JORGE, 2006).

Os tocoferóis têm sido extraídos e quantificados em diversas espécies de

macroalgas marinhas (LE TUTOUR et al., 1998; MIYASHITA; TAKAGI, 1987; PIRES-

CAVALCANTE et al., 2011; SÁNCHEZ-MACHADO; LÓPEZ-HERNANDÉZ; PASEIRO-

LOSADA, 2002). Algumas vezes, o conteúdo de α-tocoferol nas macroalgas é tão elevado

que uma porção de apenas 11 g da clorófita Caulerpa sertularioides pode fornecer metade da

quantidade de vitamina E recomendada diariamente para um homem adulto (PIRES-

CAVALCANTE et al., 2011).

2.4 Ensaios antioxidantes in vitro

Para a extração de compostos bioativos de macroalgas marinhas existem

diferentes protocolos que utilizam solventes com graus de polaridade variados, isoladamente

ou a mistura desses, e que podem ou não incluir o uso de calor (GANESAN; KUMAR; RAO,

2011; KUMAR et al., 2011b; ZUBIA et al., 2009). Algumas metodologias são mais

vantajosas que outras, mas a maioria dos trabalhos reporta uma relação direta entre o

rendimento de extração e a maior polaridade do solvente. Isso decorre do fato de que os

solventes polares extraem eficientemente uma série de compostos polares como polifenóis

ligados a açúcares ou proteínas, taninos, sais, saponinas, glicosídeos e ácidos orgânicos (CHO

et al., 2007). Por exemplo, Matanjun et al. (2008) observaram que a extração com metanol

apresentou rendimento até oito vezes superior ao daquela realizada com éter dietílico.

36

A maioria das pesquisas relacionadas com a determinação de atividade

antioxidante em organismos marinhos utiliza o extrato bruto, sem isolar ou quantificar os

componentes responsáveis por essa atividade. Somente poucos pesquisadores purificaram e

caracterizaram tais compostos (NGO et al., 2011). De fato a atividade biológica pode ser

resultante da presença, mesmo que em quantidades traço, de compostos com elevado

potencial antioxidante. Entretanto, de acordo com Stengel, Connan e Popper (2011), algumas

vezes essa atividade é derivada do efeito sinérgico entre diferentes compostos presentes no

extrato bruto podendo ser perdida durante os processos de separação e purificação.

A atividade antioxidante é sistema-dependente e está sujeita ao método de análise

adotado e aos sistemas-modelo (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008). Diversos testes são

usados para avaliar a atividade antioxidante in vitro de substâncias biologicamente ativas,

abrangendo desde ensaios químicos simples até métodos mais complexos que envolvem

diferentes técnicas instrumentais. Esses testes têm se tornado ferramentas usuais e relevantes

na seleção de espécies biológicas de onde se possam extrair substâncias com potencial

farmacológico. Tendo em vista os diferentes tipos de radicais livres e as variadas formas de

atuação nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual

a atividade antioxidante possa ser precisamente mensurada (ALVES et al., 2010).

Os ensaios mais utilizados são determinação da capacidade de sequestrar o radical

livre DPPH, habilidade de quelação do íon ferroso, poder de redução do ferro e degradação do

β-caroteno. Outra metodologia de análise muito empregada consiste na determinação do

conteúdo fenólico total.

2.4.1 Capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH)

O ensaio do sequestro do radical DPPH tem sido amplamente utilizado na

investigação da atividade antioxidante, pois além de ser um método fácil, preciso e com

resultados altamente reproduzíveis, viabiliza a análise de muitas amostras em pouco tempo e é

suficientemente sensível para detectar a atividade de compostos em baixas concentrações

(GANESAN; KUMAR; RAO, 2011; SÁNCHEZ-MORENO, 2002).

O DPPH é um radical livre estável devido ao deslocamento do elétron

desemparelhado por toda a molécula. Esta conformação estrutural lhe confere em solução

alcoólica uma coloração violeta intensa cuja absorbância máxima ocorre em torno de 520 nm.

Quando misturada com compostos capazes de doar átomos de hidrogênio, o DPPH é reduzido

a hidrazina. Esta reação provoca uma diminuição na absorbância do radical DPPH,

37

visivelmente percebida pela mudança de cor de violeta para amarelo (ALVES et al., 2010;

GANESAN; KUMAR; RAO, 2011; MOLYNEUX, 2004; SÁNCHEZ-MORENO, 2002).

2.4.2 Habilidade de quelação do íon ferroso (FIC)

A capacidade de quelar metais é muito importante uma vez que os metais de

transição catalisam a peroxidação dos lipídios formando assim compostos indesejáveis que

atacam vários tipos de molécula (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008).

A ligação de compostos antioxidantes com íons metálicos pode ser avaliada

através do ensaio de quelação do íon ferroso. Um extrato com elevada habilidade de ligação

com íons metálicos poderá prevenir ou inibir várias reações capazes de produzir radicais

hidroxil reativos (CHEW et al., 2008).

A ferrozine, usada nesta metodologia, é um composto que reage com o ferro

divalente para formar um complexo estável de coloração róseo que possui máxima

absorbância em 562 nm. Na presença de amostras que possuem atividade de quelação a

formação do complexo é interrompida, de modo que, medindo-se a taxa de descoloração,

pode-se estimar o poder de quelação da amostra (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011;

STOOKEY, 1970; VINAYAK; SUDHA; CHATTERJI, 2011).

2.4.3 Poder de redução do ferro (FRAP)

No ensaio do poder de redução do ferro, a atividade antioxidante é determinada

com base na habilidade dos compostos antioxidantes, presentes nas amostras, reduzirem ferro

férrico (III) a ferro ferroso (II), em uma reação colorimétrica de oxirredução que envolve

simplesmente a transferência de elétrons (CHEW et al., 2008). A presença de agentes

redutores em solução causa a redução do complexo Fe3+/ferrocianeto à forma ferrosa (Fe2+)

que pode ser mensurada na absorbância de 700 nm (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011).

Quanto maior a absorbância da mistura, maior a atividade antioxidante de redução do ferro

(KUMAR et al., 2011a; SOLTANI et al., 2011).

2.4.4 Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico

A oxidação dos ácidos graxos insaturados presentes nas membranas biológicas

conduz à formação de radicais livres lipídicos e destruição da membrana lipídica. Os

38

antioxidantes podem interromper a reação em cadeia através da doação de átomos de

hidrogênio (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007).

Nos últimos 30 anos a comunidade científica tem reportado que o β-caroteno

exibe alta reatividade com eletrófilos e oxidantes. Desta forma, muitos estudos têm

demonstrado que ele inibe a auto-oxidação lipídica em tecidos biológicos e produtos

alimentícios (ALVES et al., 2010).

Dentre as técnicas utilizadas para avaliar a atividade antioxidante in vitro destaca-

se o sistema de co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico. Este método é simples e sensível e

possibilita a avaliação da capacidade de uma determinada substância neutralizar o radical

livre gerado durante a oxidação do ácido linoléico, prevenindo assim a degradação do β-

caroteno. Por não utilizar temperaturas elevadas, é possível determinar substâncias sensíveis

ao calor (ALVES et al., 2010; CHEW et al., 2008).

2.4.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)

De um modo geral, o CFT pode ser determinado pelo método espectrofotométrico

de Folin-Ciocalteu que se baseia na reação de oxirredução dos compostos fenólicos com íons

metálicos. Nesse método, em meio alcalino, os fenóis reduzem o ânion fosfomolibdato-

fosfotungstato de coloração amarela a molibdênio de cor azul. Para a quantificação de CFT é

necessária a utilização de uma curva de calibração em que o ácido gálico é o padrão mais

utilizado. Os resultados são expressos em miligrama de ácido gálico equivalente (AGE) por

grama de amostra ou extrato (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006; SILVA et al., 2010).

39

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta das macroalgas e Preparação do material

Vinte e três espécies de macroalgas marinhas, seleciondas pela abundância,

pertencentes aos filos Chlorophyta (Caulerpa cupressoides, C. prolifera, C. sertularioides, C.

racemosa, Codium isthmocladum, Ulva fasciata e U. lactuca), Rhodophyta (Amansia

multifida, Botryocladia occidentalis, Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum, Cryptonemia

crenulata, C. luxurians, Gracilaria domingensis, G. ferox, Hypnea musciformis e Pterocladia

americana) e Ochrophyta (Dictyota dichotoma, D. mertensii, Lobophora variegata, Padina

gymnospora, Sargassum vulgare e Spatoglossum schroederi) foram coletadas em fevereiro de

2010, durante a maré baixa na Praia de Paracuru, São Gonçalo do Amarante-CE, com a

permissão do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Nacionais Renováveis

(SISBIO no 33913-1).

As algas coletadas foram lavadas em água destilada para remoção de impurezas e

epífitas macroscópicas sendo, em seguida, colocadas sobre papel absorvente para drenar o

excesso de água e congeladas a –24ºC para, então, serem liofilizadas. O material liofilizado

foi armazenado em recipientes hermeticamente fechados e protegidos da luz até o momento

da preparação dos extratos.

As espécies foram identificadas pelo Prof. Dr. Alexandre Holanda Sampaio, do

Departamento de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Ceará (UFC), as exsicatas

de cada amostra coletada foram depositadas no Herbário Professor Prisco Bezerra (UFC), sob

os números 51056 a 51078.

3.2 Reagentes

Os reagentes, metanol, ácido linoléico, cloreto de ferro III, ferrocianeto de

potássio, carbonato de sódio anidro, ácido tricloroacético, clorofórmio, fosfato de potássio

monobásico anidro e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), utilizados na determinação

da atividade antioxidante, assim como o éter de petróleo utilizado nas análises

cromatográficas foram grau P.A. e adquiridos da Vetec, Brasil. Ácido gálico (G7384), cloreto

de ferro II (37,287-0), o reagente fenólico Folin-Ciocalteu (F9252), o emulsificante Tween 40

(P1504), o indicador de ferro ferrozine (P9762), o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

(D913-2), os antioxidantes sintéticos butil-hidroxianisol (B1253) e butil-hidroxitolueno

40

(47168), bem como os padrões comerciais, L-ácido ascórbico aproximadamente 99%

(A5960), quercetina hidratada aproximadamente 95% (33,795-1), β-caroteno tipo I

aproximadamente 95% (C-9750), (±)-α-tocoferol aproximadamente 95% (T3251) e (+)-δ-

tocoferol aproximadamente 90% (T2028) foram obtidos da Sigma, Estados Unidos.

Devido ao elevado custo da luteína comercial produzida pela Sigma, a luteína da

marca Duane Reade, Nova York, comercializada como suplemento alimentar em cápsulas de

20 mg, foi utilizada como padrão.

Metanol, n-hexano e tetrahidrofurano, usados nas análises cromatográficas, foram

grau HPLC, obtidos da J. T. Baker, Estados Unidos, e o hidróxido de potássio foi obtido da

Merck, Alemanha.

Todas as soluções foram preparadas utilizando-se água ultrapura, obtida através

do sistema Milli-Q (Millipore, Estados Unidos).

3.3 Preparação dos extratos para os ensaios antioxidantes in vitro

Os extratos foram preparados de acordo com Chew et al. (2008). O material

liofilizado foi macerado em um triturador doméstico (Cadence, modelo MDR301) até a

obtenção de um pó fino. Porções de 1 g desse pó foram suspensas em 50 mL de metanol

(50%) e homogeneizadas continuamente em um agitador orbital (Cientec, modelo CT-712),

por 1 h a 25°C, protegidas da luz. Após este período, os extratos foram filtrados em papel de

60 µm e, os resíduos submetidos a mais duas re-extrações. Os extratos, preparados em

triplicata, foram armazenados em frasco âmbar a –24°C até o momento das análises.


Os ensaios antioxidantes in vitro foram realizados, em triplicata, nos extratos

metanólicos (50%), a partir da determinação da capacidade de sequestrar o radical livre 2,2-

difenil-1-picril-hidrazila, da quelação do íon ferroso, do poder de redução e da degradação do

β-caroteno no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.

Quercetina, butil-hidroxianisol (BHA), butil-hidroxitolueno (BHT), ácido

ascórbico, α–tocoferol e β-caroteno foram utilizados como controle positivo em todas as

metodologias, com exceção da determinação da habilidade de quelação do íon ferroso na qual

foi utilizado apenas EDTA. Os controles positivos, nas concentrações de 5, 10 e 20 µg mL-1,

41

foram submetidos aos mesmos procedimentos dos extratos. Todas as determinações foram

realizadas em espectrofotômetro Amersham Biosciences, modelo Ultrospec 2100 pro.


A capacidade de sequestrar o radical livre DPPH foi determinada de acordo com

Duan et al. (2006). Em tubos de ensaio, denominados amostra, branco e controle, foram

colocados, respectivamente, 2 mL de extrato + 2 mL da solução de DPPH 0,16 mM, 4 mL de

extrato e 4 mL de DPPH 0,16 mM. Os tubos foram agitados em vortex e incubados no escuro

por 30 min à temperatura ambiente. Decorrido este tempo, a absorbância foi lida em 517 nm.

A fórmula abaixo foi utilizada para calcular o percentual de sequestro do DPPH:

( )%100

AbsAbsAbs

1(%)DPPHradicaldosequestrodeCapacidadecontrole

brancoamostra ×

−−=


Na determinação da habilidade de quelação do íon ferroso, uma alíquota de 1 mL

do extrato foi misturada a 1,35 mL de água destilada, 50 µL de cloreto de ferro II (2 mM) e

100 µL de ferrozine (5 mM). A mistura foi agitada e incubada por 10 min à temperatura

ambiente. Após a incubação, sua absorbância foi lida em 562 nm. Volumes de 1 mL e 100 µL

de água destilada foram utilizados em substituição ao extrato e ao ferrozine, respectivamente,

na preparação do controle e do branco (WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009). As

determinações foram feitas em triplicata, e os resultados expressos em percentual de

habilidade de quelação, usando a seguinte fórmula:

( )[ ]100%

AbsAbsAbsAbs

(%)ferrosoíondoquelaçãodeHabilidadecontrole

brancoamostracontole ×−−

=


O poder de redução foi determinado, em triplicata, de acordo com a metodologia

descrita por Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008).

42

Uma alíquota de 1 mL do extrato foi misturada com 2,5 mL de tampão fosfato a

0,2 M (pH 6,6) e 2,5 mL de ferrocianeto de potássio a 1%. A mistura foi incubada por 20 min

em banho-maria (Thermomix BM, modelo 18 BU, B. Braun Biotech International) a 50ºC.

Após a incubação, foram adicionados 2,5 mL ácido tricloroacético a 10%. Desta mistura foi

tomada uma alíquota de 2,5 mL e adicionada a 2,5 mL de água destilada e 0,5 mL de cloreto

de ferro III a 0,1%. Em seguida, a absorbância foi lida em 700 nm. Quanto maior a

absorbância, maior o poder de redução das amostras.


O teste de degradação do β-caroteno foi realizado de acordo com Chew et al.

(2008). Neste ensaio, 3 mL de solução de β-caroteno em clorofórmio (100 µg mL-1) foram

adicionados a 40 mg de ácido linoléico e 400 mg do emulsificante Tween 40. O clorofórmio

da mistura foi evaporado em evaporador rotativo (Fisaton) a 55ºC e, ao resíduo foram

adicionados 100 mL de água ultrapura saturada de oxigênio.

A emulsão β-caroteno/ácido linoléico foi vigorosamente agitada, e uma alíquota

de 3 mL dessa emulsão foi adicionada a 1 mL de extrato. A absorbância foi lida em 470 nm.

Após a leitura, a mistura foi incubada por 1 h em banho-maria a 50ºC. Decorrido este tempo,

a absorbância foi novamente lida em 470 nm, e a atividade antioxidante foi calculada pela

fórmula:

100%Abs

Abs(%)teantioxidanAtividade

inicial

h 1 ×

=

3.5 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)

O conteúdo fenólico total (CFT) no extrato metanólico (50%) foi determinado, em

triplicata, de acordo com Kumar, Ganesan e Rao (2008).

Em um tubo de ensaio, foram adicionados 1 mL de extrato, 7 mL de água destilada,

0,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu e 1,5 mL de carbonato de sódio a 20%. A mistura foi

agitada e incubada no escuro por 30 min à temperatura ambiente. Decorrido este tempo, a

absorbância foi lida em 760 nm. Um tubo branco, no qual água destilada foi utilizada em

substituição ao extrato, também foi preparado.

43

O CFT dos extratos foi calculado com base na curva padrão de ácido gálico, e os

resultados expressos em µg de ácido gálico equivalente (AGE) g-1 alga seca. Para a

elaboração da curva, em tubos de ensaio contendo 1 mL de ácido gálico, com concentrações

variando de 1 mg L-1 a 250 mg L-1, foram adicionados 7 mL de água destilada, 0,5 mL do

reagente de Folin e 1,5 mL de carbonato de sódio a 20%. Os tubos foram agitados e

incubados, no escuro, por 30 min à temperatura ambiente, e a absorbância lida em 760 nm.

3.6 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos

As metodologias empregadas na prospecção química dos extratos metanólicos

(50%) das algas foram aquelas recomendadas por Matos (2009), que estão descritas nos itens

subsequentes.

3.6.1 Teste para fenóis e taninos

Em uma alíquota de 3 mL do extrato foram adicionadas três gotas de solução

alcoólica de cloreto de ferro III. Após agitação vigorosa, observou-se qualquer variação de cor

e/ou formação de precipitado escuro e abundante, comparando-se com um branco preparado

com água destilada em vez de extrato. A presença de fenóis foi indicada pelo aparecimento de

coloração entre o azul e o vermelho. A formação de precipitado escuro revelava a presença de

taninos. Precipitado de tonalidade azul indicava a presença de taninos pirogálicos

(hidrolisáveis) e de verde, a presença de taninos flobabênicos (condensados ou catéquicos).

3.6.2 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides

Três alíquotas de 3 mL do extrato foram transferidas para diferentes tubos de

ensaio. No primeiro o meio foi acidificado para pH 3, enquanto nos outros dois, eles foram

alcalinizados para pH 8,5 e 11. As presenças de antocianinas, antocianidinas e flavonóides

foram determinadas de acordo com o aparecimento de colorações, que variavam com o pH,

como indicado na Tabela 1.

44 Tabela 1 – Provas fitoquímicas das classes de antocianinas, antocianidinas e flavonóides.

Constituintes Coloração em pH

3,0 8,5 11,0 Antocianinas e antocianidinas Vermelha Lilás Azul-púrpura Flavonas, flavonóis e xantonas - - Amarela Chaconas e auronas Vermelha - Vermelho-púrpura Flavonóis - - Vermelho-laranja

3.6.3 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas

Duas alíquotas de 3 mL do extrato foram transferidas para dois tubos de ensaio. O

primeiro foi acidificado por adição de ácido clorídrico até pH 3, e o segundo foi alcalinizado a

pH 11 com hidróxido de sódio. Os tubos foram aquecidos em banho-maria por 10 min a 60ºC.

As alterações na coloração do extrato foram observadas quanto à presença de

leucoantocianidinas, catequinas e flavonas de acordo com a Tabela 2.

Tabela 2 – Provas fitoquímicas das classes de leucoantocianidinas, catequinas e flavonas.

Constituintes Coloração em pH

3,0 11,0 Leucoantocianidinas Vermelha - Catequinas Pardo-amarelada - Flavononas - Vermelho-laranja

3.6.4 Teste para flavonóis, flavononas, flavanonóis e xantonas

A um tubo contendo 3 mL do extrato foram adicionados alguns centigramas de

magnésio granulado e 0,5 mL de ácido clorídrico concentrado. Após o término da reação,

indicada pelo fim da efervescência, observou-se a mudança da coloração. O aparecimento ou

intensificação da cor vermelha era indicativo da presença de flavonóis, flavononas,

flavanonóis e/ou xantonas, livres ou seus heterosídeos.

3.6.5 Teste para confirmação de catequinas

Um palito de madeira foi introduzido em um tubo contendo o extrato algáceo,

retirado e deixado secar. Uma das faces do palito foi umedecida com ácido clorídrico

concentrado e, em seguida, o palito foi aquecido em uma chama de álcool por 3 min. O

45

aparecimento de cor vermelha ou pardo-avermelhada na face acidificada confirmava a

presença de catequinas, previamente identificadas através do teste descrito no item 3.6.3.

3.7 Extração, Identificação e Quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e

tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)

3.7.1 Preparação dos extratos, Saponificação e Partição

Os extratos foram preparados em triplicata a partir de três porções de 0,5 g de alga

liofilizada em 10 mL de metanol (90%) contendo 5% de hidróxido de potássio e

saponificados por 30 min em banho-maria a 70°C.

Depois de resfriados à temperatura ambiente, os extratos foram centrifugados por

5 min a 2.000 x g. Após a centrifugação, 5 mL dos extratos saponificados, 3 mL de água

Milli-Q e 5 mL de n-hexano:éter de petróleo (2:3, v/v) foram transferidos para tubos Pyrex de

tampa rosqueada, os quais foram misturados em uma plataforma misturadora por 10 min. Este

procedimento, a partição, permitiu a migração dos carotenóides não saponificáveis e dos

tocoferóis presentes no extrato algáceo do metanol para o n-hexano:éter de petróleo.

A separação das fases, metanol-hexano:éter de petróleo, foi facilitada pela

centrifugação por 5 min a 2.000 x g. Um volume correspondente a 2 mL da fase hexano:éter

de petróleo foi transferido para tubos de ensaio e evaporado completamente. O resíduo foi

então suspenso em 1 mL da fase móvel e filtrado em membrana de 0,45 µm no momento da

análise por cromatografia líquida de alta eficiência.

3.7.2 Soluções-padrão de β-caroteno, luteína, α- e δδδδ-tocoferol

Diariamente, soluções-padrão de β-caroteno e luteína em tetrahidrofurano (1 mg

mL-1) foram preparadas e diluídas com metanol para 10 µg mL-1 de modo que 0,2 µg de β-

caroteno e luteína fossem injetados na coluna. As concentrações das soluções-padrão de β-

caroteno e de luteína foram determinadas a partir de sua absorbância em 450 nm e 444 nm,

respectivamente, sendo a capacidade de absorção de luz do β-caroteno igual a 0,2245 µg-1

mL-1 e a da luteína igual a 0,2629 µg-1 mL-1 (CRAFT; SOARES-JR, 1992). Da mesma forma,

soluções-padrão de α- e δ-tocoferol (1 mg mL-1) foram preparadas diariamente e diluídas em

metanol, de modo que 2 µg de α- e δ-tocoferol fossem injetados na coluna.

46

Uma solução-padrão de trabalho composta por β-caroteno e luteína na

concentração de 10 µg mL-1 e por α- e δ-tocoferol na concentração de 100 µg mL-1 foi

saponificada e submetida à partição separadamente e em combinação com 0,5 g de alga

liofilizada. Este procedimento assegurou a detecção dos compostos supracitados onde eles

foram adicionados intencionalmente.

3.7.3 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa

O sistema cromatográfico consistiu em uma coluna Atlantis Waters Spherisorb S5

ODS 2 (4,6 x 250 mm) e uma fase móvel constituída de metanol:tetrahidrofurano (90:10,

v/v), com fluxo de 1,5 mL min-1, usando uma bomba (AKTAbasic 10, modelo P-900,

Amersham). Alíquotas de 100 µL do resíduo suspenso na fase móvel foram injetadas

manualmente usando um injetor de amostras Rheodyne 7210 (Hamilton Co.). O monitor

(AKTAbasic UV-900) foi ajustado em 450 nm para a detecção de α- e β-caroteno, em 444 nm

para a detecção de luteína e em 292 nm para a detecção de α- e δ-tocoferol. Os

cromatogramas foram registrados através do sistema de controle UnicornTM, versão 5.0.

3.7.4 Cálculo dos teores de α- e β-caroteno, luteína e α- e δδδδ-tocoferol

As concentrações de α- e β-caroteno e luteína nos extratos algáceos foram

calculadas com base nos padrões de 10 µg de β-caroteno e de luteína submetidos à

saponificação e à partição. Os cálculos foram procedidos usando-se a área dos picos obtidos

para as soluções-padrão de β-caroteno e luteína e as áreas dos picos referentes ao α-caroteno,

β-caroteno e luteína nos extratos de alga. O uso do β-caroteno como padrão para a

quantificação de α-caroteno foi considerado válido porque as áreas dos picos correspondentes

a 10 µg de α-caroteno e a 10 µg β-caroteno não apresentaram diferença estatisticamente

significativa (p ≥ 0,05) (SAKER-SAMPAIO, 1997).

As concentrações de α- e δ-tocoferol nos extratos de alga foi calculadas com base

nos padrões de 100 µg de α- e δ-tocoferol processados. Os cálculos foram procedidos usando-

se as áreas dos picos obtidos para as soluções-padrão de tocoferóis e as áreas dos picos

referentes ao α- e δ-tocoferol presentes nos extratos algáceos.

A fórmula abaixo foi utilizada para os cálculos dos teores de α- e β-caroteno,

luteína e α- e δ-tocoferol nos extratos de alga liofilizada.

47

algag

g1colunanapadrãoµg

padrãoárea

amostraáreagµg 1 ××=−

3.8 Análises estatísticas

Todos os resultados referentes às atividades antioxidantes e os teores de

compostos fenólicos totais (CFT), carotenóides e tocoferóis foram organizados em matrizes

considerando as espécies como tratamentos e o número de extrações como repetições.

Os dados da capacidade de sequestro do radical DPPH, da quelação do íon ferroso

(FIC) e no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, expressos em valores percentuais

(proporções), foram inicialmente transformados através da equação: proporçãoarcsenX = .

Os dados do poder de redução do ferro (FRAP), CFT, α-caroteno, β-caroteno, luteína, α-

tocoferol e δ-tocoferol foram quantificados em escala contínua.

Os resultados de DPPH, FIC, degradação do β-caroteno e FRAP foram analisados

através da análise de variância (α = 0,05). Em caso de rejeição da hipótese de nulidade (p <

0,05), as comparações das médias entre as espécies de cada Filo (Chlorophyta, Rhodophyta e

Ochrophyta) foram realizadas pelo teste de Tukey, e entre cada espécie de alga e cada

controle positivo, pelo teste de Dunnet.

Por sua vez, os teores de CFT, α-caroteno, β-caroteno, luteína, α-tocoferol e

δ-tocoferol nas espécies de algas verdes, vermelhas e pardas, não comparados com os

controles positivos, foram submetidos à análise de variância (α = 0,05), seguida pelo teste de

Tukey para comparação das médias, em caso de rejeição da hipótese de nulidade (p < 0,05).

Os pressupostos da análise de variância foram avaliados, através de gráficos de

probabilidade normal para diagnosticar se a distribuição dos dados observados era semelhante

a uma distribuição normal (normalidade) e pelo teste de Cochran para verificar a

homogeneidade das variâncias (homocedasticidade). Os resultados indicaram que os dados

não violaram nenhum desses pressupostos.

Para investigar a existência de correlação entre CFT e as atividades antioxidantes

dos extratos algáceos foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson, em que o CFT foi

considerado a variável independente (x) e cada metodologia antioxidante in vitro, a

dependente (y).

48

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO


No presente estudo, o processo de extração foi conduzido de forma a extrair

principalmente compostos fenólicos, embora, provavelmente, uma grande variedade de outros

componentes polares estivesse presente nos extratos. Todos os ensaios antioxidantes in vitro

foram realizados no extrato bruto preparado com metanol (50%). A escolha desta

concentração foi baseada no trabalho de Chew et al. (2008), que testaram a eficiência de

extração em diferentes concentrações e constataram que este era o melhor resultado.


Todos os extratos das 23 espécies de macroalgas analisadas no presente trabalho

exibiram capacidade de sequetrar o radical DPPH. De um modo geral, a maior atividade foi

observada em Ochrophyta, seguida de Chlorophyta e, mais baixa, em Rhodophyta (Figura 8).

Este mesmo padrão foi encontrado por Wang, Jónsdóttir e Ólafsdóttir (2009), mas não por

Kumar et al. (2011b), que verificaram nas espécies de algas verdes uma atividade maior ou

igual à das pardas que, por sua vez, foi superior àquela das vermelhas. Esta divergência pode

estar relacionada aos diferentes métodos de extração utilizados nos trabalhos supracitados.

Dentre as sete espécies de Chlorophyta, as maiores capacidades de sequestro do

DPPH foram observadas nos extratos das algas pertencentes aos gêneros Caulerpa e Codium

que variaram de 69,7 ± 2,1% a 95,1 ± 0,6%. No primeiro gênero, destaque para Caulerpa

sertularioides (95,1 ± 0,6%) e C. racemosa (91,6 ± 1,8%), que apresentaram as maiores

atividades, enquanto nos extratos das duas espécies de Ulva foram observadas as menores, em

torno de 54% (Figura 8A).

Das algas verdes analisadas por Kumar et al. (2011b), o extrato metanólico de C.

racemosa exibiu a maior atividade de sequestro do radical DPPH (77%), inferior aos

resultados encontrados no gênero Caulerpa, com exceção de C. prolifera, cuja atividade foi

menor (71,7%), mas superior aos observados no gênero Ulva.

Na comparação com os controles positivos, a capacidade de sequestro do radical

DPPH dos extratos de C. sertularioides e C. racemosa foi superior àquelas exibidas pela

quercetina (5 µg mL-1), BHA, ácido ascórbico e β-caroteno (5 e 10 µg mL-1) e BHT e α-

tocoferol (5, 10 e 20 µg mL-1). No extrato de C. cupressoides a atividade foi superior à de

49

BHT e α-tocoferol (5 e 10 µg mL-1) e ácido ascórbico e β-caroteno (5 µg mL-1). No caso dos

extratos de C. prolifera e Codium isthmocladum as atividades também foram superiores às de

BHT e α-tocoferol, porém apenas na concentração 5 µg mL-1. Os extratos das duas espécies

de Ulva apresentaram capacidades de sequestrar o DPPH inferiores às exibidas pelos padrões

comerciais nas três concentrações testadas, com exceção de BHT e α-tocoferol (5 µg mL-1),

que foram semelhantes (Tabela 3).

Kumar et al. (2011a), analisando somente algas do gênero Caulerpa, encontraram

elevadas atividades de sequestro do DPPH em C. racemosa (87%), C. scalpelliformis (67%) e

C. veravelensis (66%), semelhantes ou superiores às observadas com os padrões comerciais,

BHA (67%) e BHT (78%), da mesma forma que os resultados obtidos no presente trabalho.

As atividades de Caulerpa sertularioides e C. racemosa foram maiores que a do

extrato etanólico de C. lentillifera que apresentou baixa capacidade para sequestrar o radical

DPPH, inclusive nas concentrações mais elevadas (80 e 100 ppm), cujos valores não

ultrapassaram 20%. Estas atividades foram mais de quatro vezes inferiores àquelas exibidas

pelo ácido ascórbico nas mesmas concentrações (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011).

Os extratos de C. sertularioides e C. racemosa exibiram atividade semelhante à

observada na fração clorofórmica do extrato etanólico da clorófita Enteromorpha prolifera

(0,25 e 0,5 mg mL-1) analisada por Cho et al. (2011), que por sua vez apresentou atividade

comparável àquela exibida pelo BHA, nas mesmas concentrações. No presente estudo o

percentual sequestrante das duas espécies foi superior ao do BHA (5 e 10 µg mL-1).

Assim como no presente trabalho, dentre as cinco clorófitas analisadas por

Vinayak, Sudha e Chatterji (2011), os extratos (1 mg mL-1) das espécies pertencentes ao

gênero Caulerpa foram as que apresentaram a maior capacidade para sequestrar o DPPH.

Entretanto, essa atividade foi inferior a 50%, enquanto que a do ácido ascórbico foi próxima a

100%. No presente estudo, o percentual sequestrante de C. sertularioides e C. racemosa foi

superior ao do ácido ascórbico na concentração de até 10 µg mL-1.

Os extratos de Caulerpa e Codium apresentaram atividade de sequestro do DPPH

mais elevadas que as exibidas pelos extratos metanólicos de três espécies de clorófitas do

gênero Enteromorpha analisadas por Ganesan, Kumar e Rao (2011), cujos valores variaram

de 46% a 62%. E. linza e E. tubulosa (nas concentrações de 0,5 a 3,0 mg mL-1) exibiram

percentuais próximos a 46%, sendo inferiores aos extratos Ulva do presente trabalho. Dentre

todos os solventes de extração avaliados (metanol, acetato de etila, propanol, acetona e água),

o extrato metanólico foi o que demonstrou maior atividade sequestrante.

50 Figura 8 - Capacidade de sequestrar o radical livre DPPH. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.

--

--

--

--

--

--

--

0 20 40 60 80 100

54,0 d

54,3 d

69,7 c

71,7 c

80,0 b

91,6 a

95,1 a

U. lactuca

U. fasciata

C. isthmocladum

C. prolifera

C. cupressoides

C. racemosa

C. sertularioides

% de sequestro do radical DPPH

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

0 20 40 60 80 100

34,5 g

34,7 fg

36,5 ef

37,0 e

38,0 e

40,6 d

40,7 d

46,6 c

50,2 b

75,4 a

C. crenulata

G. ferox

G. domingensis

C. luxurians

P. americana

B. occidentalis

H. musciformis

B. triquetrum

B. seaforthii

A. multifida


--

--

--

--

--

--

0 20 40 60 80 100

97,7 b

100,0 a

100,0 a

100,0 a

100,0 a

100,0 a

S. schroederi

S. vulgare

P. gymnospora

L. variegata

D. mertensii

D. dichotoma


Letras minúsculas iguais em cada Filo � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada Filo � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).

(A)

(B)

(C)

51 Tabela 3 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).

FCaulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva

(%) cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca

Quercetina 5 µg mL-1 121,8 86,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 161,9 97,5 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 161,7 97,1 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

BHA 5 µg mL-1 120,6 83,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 142,7 93,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 162,4 96,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

BHT 5 µg mL-1 131,8 58,1 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 122,3 65,2 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 116,5 75,9 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 120,8 66,8 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 115,2 82,4 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 171,3 97,7 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

α-tocoferol 5 µg mL-1 132,6 57,5 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 120,2 67,8 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 123,2 85,6 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

β-caroteno 5 µg mL-1 124,6 63,3 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

10 µg mL-1 117,9 79,4 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

20 µg mL-1 226,8 100,0 80,0 71,7 91,6 95,1 69,7 54,3 54,0

DPPH (%) nas espéciesControle positivo

p < 0,01ACP*

*ACP = atividade antioxidante dos controles positivos.

Extrato algal com atividade igual à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade superior à exibida pelos controles positivos. Extrato algal com atividade inferior à exibida pelos controles positivos.

51

52

Valentão et al. (2010) verificaram que capacidade de sequestro no extrato de

Codium tomentosum foi inferior a 15% em todas as concentrações testadas. Estes resultados

foram considerados surpreendentes para os autores, uma vez que esta espécie habita áreas do

litoral sujeitas a condições de estresse em função das elevadas radiação, temperatura e

dessecação, causadas pela variação das marés. O percentual de sequestro em Codium

isthmocladum encontrado no presente trabalho foi pelo menos cinco vezes superior.

A capacidade de sequestro do DPPH da Ulva lactuca (74%) cultivada sob

diferentes condições por El-Baky, El-Baz e El-Batory (2009) foi superior à apresentada pela

U. lactuca analisada no presente trabalho (54%). Assim como no presente trabalho, os

controles positivos BHA, BHT e α-tocoferol também apresentaram atividades superiores.

As dez espécies de Rhodophyta analisadas no presente trabalho apresentaram as

menores capacidades para sequestrar o radical DPPH. Os extratos de Amansia multifida,

Bryothamnion seaforthii e B. triquetrum exibiram as maiores atividades, respectivamente,

75,4 ± 0,1%, 50,2 ± 1,1% e 46,6 ± 0,3%. Nos extratos das demais espécies os valores

permaneceram aproximadamente entre 35% e 40% (Figura 8B).

De acordo com os resultados da Tabela 4, todos os extratos das rodófitas

apresentaram percentuais de sequestro inferiores aos observados nos controles positivos em

todas as concentrações testadas, exceção feita ao de A. multifida, cuja atividade foi

semelhante a da quercetina (5 µg mL-1) e do BHT (20 µg mL-1), mas superior a do BHT e α-

tocoferol (5 e 10 µg mL-1) e a do ácido ascórbico e β-caroteno apenas na menor concentração.

Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008) observaram que a atividade de sequestro do

DPPH dos extratos metanólicos das algas vermelhas Eucheuma kappaphycus, Gracilaria

edulis e Acanthophora spicifera foi menor que a do α-tocoferol (1 mg). Outra referência com

resultados semelhantes foi feita ao extrato bruto e demais frações, exceto a de acetato de etila,

de Rhodomela confervoides na concentração 50 µg mL-1 que exibiram baixas atividades (18%

a 40%) muito inferiores àquelas determinadas para BHT, ácido gálico e ácido ascórbico que

ficaram entre 63% e 97% (WANG et al., 2009).

Com exceção de A. multifida analisada neste trabalho, os extratos metanólicos

(100 µg mL-1) de praticamente todas as rodófitas estudadas por Devi et al. (2008)

apresentaram capacidades de sequestro do DPPH inferiores a 50%. Estas atividades foram

menores que as exibidas pelo controle positivo BHT, em concentrações variando de 20 a 100

µg mL-1. O extrato de Gelidiella acerosa (72,5%) apresentou atividade ligeiramente superior

a do BHT (70%).

53 Tabela 4 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).

FAmansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia

(%) multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana

Quercetina 5 µg mL-1 1.563,9 86,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 2.162,1 97,5 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 2.578,2 97,1 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

BHA 5 µg mL-1 1.906,7 83,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 2.587,1 93,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 3.399,2 96,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

BHT 5 µg mL-1 1.028,6 58,1 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 1.133,4 65,2 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 1.446,7 75,9 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 1.172,2 66,8 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 1.204,6 82,4 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 3.503,1 97,7 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

α-tocoferol 5 µg mL-1 1.000,4 57,5 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 1.222,8 67,8 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 1.981,0 85,6 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

β-caroteno 5 µg mL-1 1.107,5 63,3 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

10 µg mL-1 1.704,3 79,4 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

20 µg mL-1 4.991,2 100,0 75,4 40,6 50,2 46,6 34,5 37,0 36,5 34,7 40,7 38,0

Controle positivop < 0,01

DPPH (%) nas espéciesACP*



53

54

Os dados de capacidade de sequestro do DPPH nos extratos metanólicos a 50%

das rodófitas analisadas no presente trabalho foram superiores aos dos extratos brutos de

Polysiphonia urceolata, preparados em metanol:clorofórmio nas concentrações de 0,4 a 10 µg

mL-1, cujas atividades não alcançaram 25% (DUAN et al., 2006). Je et al. (2009) encontraram

em outra espécie do mesmo gênero P. morrowii que as capacidades de sequestro dos extratos

metanólicos a 80% e a 90% foram iguais a 47,5% e 92%, respectivamente.

A atividade de sequestro de DPPH nos extratos metanólicos de Kappaphycus

alvarezii foi inferior a 20% nas concentrações mais baixas (0,5 a 2,5 mg mL-1) e não chegou a

60% nas mais elevadas (3 a 5 mg mL-1) (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008). No presente

trabalho, as atividades foram superiores àquelas reportadas nas menores concentrações e, da

mesma forma, as atividades nos extratos algáceos foram mais baixas do que as exibidas pelos

antioxidantes sintéticos, com exceção de A. multifida.

Ainda com relação às macroalgas vermelhas analisadas no presente trabalho, os

percentuais de sequestro do DPPH foram de seis a quatorze vezes superiores aos relatados por

Ganesan, Kumar e Bhaskar (2008) para os extratos metanólicos (100 µg mL-1), com nenhuma

espécie apresentando resultado semelhante ao do α-tocoferol.

Os extratos metanólicos e etanólicos de Gracilaria birdiae e G. cornea (0,5 mg

mL-1) investigados por Souza et al. (2011) apresentaram atividades de sequestro do DPPH

entre 30% e 40%, semelhantes às observadas na maioria dos extratos de ródofitas analisadas

no presente trabalho (34% a 46%). Embora as atividades dos extratos algáceos tenham sido

inferiores a do BHT (50%), os autores as consideraram expressivas por serem derivadas de

uma fonte natural. Com base na consideração acima, a maioria dos extratos analisados no

presente trabalho apresentou atividade análoga, mesmo quando elas foram inferiores às

determinadas com os antioxidantes sintéticos usados como controles positivos.

Dentre todas as espécies analisadas no presente trabalho, o melhor potencial para

sequestrar o DPPH foi observado no Filo Ochrophyta. Todos os extratos exibiram atividade

igual a 100%, com exceção de Spatoglossum schroederi, que foi 97,7 ± 0,4% (Figura 8C).

Todas essas atividades foram superiores às exibidas pelos controles positivos em

todas as concentrações testadas, com exceção de quercetina (10 µg mL-1) e de ácido ascórbico

e β-caroteno (20 µg mL-1), que apresentaram a mesma atividade de S. schroederi (Tabela 5).

55 Tabela 5 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta para sequestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH).

FDictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum

(%) dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare

Quercetina 5 µg mL-1 1.148,3 86,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 230,1 97,5 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 366,4 97,1 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

BHA 5 µg mL-1 3.023,5 83,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 1.045,0 93,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 849,4 96,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

BHT 5 µg mL-1 8.636,1 58,1 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 6.177,0 65,2 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 3.795,1 75,9 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 5.829,9 66,8 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 1.201,2 82,4 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 602,4 97,7 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

α-tocoferol 5 µg mL-1 8.315,3 57,5 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 5.943,0 67,8 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 2.290,5 85,6 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

β-caroteno 5 µg mL-1 6.936,2 63,3 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

10 µg mL-1 3.851,6 79,4 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

20 µg mL-1 418,7 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 97,7 100,0

p < 0,01

DPPH (%) nas espéciesControle positivo

ACP*



55

56

O’Sullivan et al. (2011) avaliaram a capacidade de sequestrar o DPPH nos

extratos de cinco espécies de algas pardas e na concentração de 5 mg mL-1 a atividade

antioxidante variou de 5,5% a 25,6%. Os extratos metanólicos (1 mg mL-1) das algas pardas

analisadas por Chandini, Ganesan e Bhaskar (2008) apresentaram poder de sequestrar o

DPPH de 11% em Sargassum marginatum, 14,78% em Padina tetrastomatica e 17,23% em

Turbinaria conoides. Em ambos os trabalhos, os resultados foram muito inferiores aos

determinados neste estudo.

Ao contrário dos dados obtidos no presente trabalho, os extratos metanólicos (100

µg mL-1) de Dictyota dichotoma, Padina gymnospora, Sargassum wightii e T. conoides

exibiram atividade sequestrante inferior a 40%, menor do que a do BHT nas concentrações 20

e 100 µg mL-1 (DEVI et al., 2008). Entretanto, a atividade reportada por Kuda et al. (2005) no

extrato metanólico (10 mg mL-1) da alga parda Scytosiphon lomentaria foi superior a 80%,

semelhante à apresentada pelos controles positivos, catequina e ácido ascórbico, na

concentração 1 mg mL-1.

Atividades parecidas com as exibidas pelos extratos de algas pardas do presente

trabalho (100%) também foram reportadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011), mas

unicamente nos extratos testados na maior concentração que foi 2 mg mL-1. Nas demais

concentrações as atividades variaram de aproximadamente 5% a quase 80%, inferiores àquela

observada com o ácido ascórbico.


No presente trabalho, com exceção do extrato da alga parda Spatoglossum

schroederi, todos os das demais espécies analisadas apresentaram habilidade de quelação do

íon ferroso. De um modo geral, as atividades exibidas pelos extratos das espécies vermelhas

foram maiores ou iguais as das pardas, que por sua vez, foram maiores que as das verdes

(Figura 9). Resultados semelhantes foram encontrados por Chew et al. (2008) em extratos

algáceos também preparados com metanol 50%, em que o percentual de quelação do íon

ferroso determinado em Padina gymnospora (parda) foi maior que em Caulerpa racemosa

(verde) que, por sua vez, exibiu atividade mais elevada do que Kappaphycus alvarezzi

(vermelha). A atividade de quelação dos extratos depende claramente da presença de

compostos quelantes nos extratos algáceos que podem variar entre espécies. Toth e Pavia

(2000) se referem aos florotaninos comumente presentes nas algas pardas como fortes

queladores de metais.

57 Figura 9 - Habilidade de quelação do íon ferroso. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.

U. fasciata

U. lactuca

C. cupressoides

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

0 20 40 60 80 100

7,6 e

8,2 e

12,1 d

12,5 d

20,3 c

31,8 b

43,1 a

U. fasciata

U. lactuca

C. cupressoides

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

Habilidade de quelação (%)

C. crenulata

G.domingensis

G. ferox

P. americana

C. luxurians

B. occidentalis

H. musciformis

A. multifida

B. seaforthii

B. triquetrum

--

0 20 40 60 80 100

12,8 g

13,4 fg

16,2 efg

17,0 efg

18,3 ef

20,2 e

30,2 d

37,2 c

45,2 b

C. crenulata

G. domingensis

G. ferox

P. americana

C. luxurians

B. occidentalis

H. musciformis

A. multifida

B. seaforthii

B. triquetrum 62,7 a


L. variegata

D. mertensii

S. vulgare

D. dichotoma

P. gymnospora

0 20 40 60 80 100

15,5 e

22,4 d

29,0 c

43,5 b

49,6 a

L. variegata

D. mertensii

S. vulgare

D. dichotoma

P. gymnospora



(A)

(B)

(C)

58

Dentre as algas verdes, os extratos de Caulerpa sertularioides, C. prolifera e C.

racemosa apresentaram maior habilidade de quelação do íon ferroso com valores iguais a,

respectivamente, 43,1 ± 3,5%, 31,8 ± 2,4% e 20,3 ± 1,5%. Nas demais espécies, os

percentuais ficaram entre 7,6 ± 0,7% e 12,5 ± 0,8% (Figura 9A).

Especificamente neste ensaio de determinação da habilidade de quelação do íon

ferroso, apenas o EDTA foi utilizado como controle positivo, por ser reconhecidamente um

potente agente quelante.

A habilidade de quelação do íon ferroso do EDTA foi superior a quase todos os

extratos das algas verdes em todas as concentrações testadas, com exceção de C. prolifera e

C. sertularioides que apresentaram atividade superior a do EDTA na concentração 5 µg mL-1

e de C. racemosa e C. sertularioides cujas atividades foram semelhantes a do controle

positivo nas concentrações 5 e 10 µg mL-1, respectivamente (Tabela 6).

No presente estudo, os resultados de quelação do íon ferroso dos extratos de

praticamente todas as espécies do gênero Caulerpa foram mais elevados do que o encontrado

em extrato similar de C. racemosa, em todas as concentrações testadas, que foi inferior a 20%

(CHEW et al., 2008). Na comparação com Ganesan, Kumar e Rao (2011), a atividade de

quelação dos extratos de Caulerpa, aproximadamente 30% a 40%, foi semelhante à exibida

pelos extratos metanólicos (1 mg mL-1) das clorófitas do gênero Enteromorpha, porém

inferior a do EDTA (58,38%).

Ainda com respeito às atividades de quelação dos extratos de Caulerpa analisados

no presente trabalho, elas foram superiores a exibida pelo extrato de C. lentillifera que não

atingiu 10% (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011), mas semelhantes às determinadas nos extratos

de Caulerpa estudados por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011). Assim como nesta pesquisa,

em ambos os trabalhos supracitados, as atividades foram mais baixas do que aquelas

determinadas com o controle positivo (EDTA). O mesmo comportamento foi verificado com

o extrato da alga verde Cladophora glomerata cuja capacidade de quelação do ferro foi 54

vezes inferior à exibida pelo EDTA (SOLTANI et al., 2011).

Dentre as algas vermelhas, os extratos de Bryothamnion triquetrum e B. seaforthii

apresentaram as maiores habilidades para quelar o ferro, respectivamente, 62,7 ± 2,6% e

45,2 ± 1,2%. Nos extratos das outras espécies de rodófitas, estes valores variaram de

12,8 ± 1,1% a 37,2 ± 3,7% (Figura 9B).

59 Tabela 6 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Chlorophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).



EDTA 5 µg mL-1 194,9 20,1 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2

10 µg mL-1 268,1 39,7 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2

20 µg mL-1 486,4 66,3 12,1 38,1 20,3 43,1 12,5 7,6 8,2

p < 0,01Controle positivo

FIC (%) nas espéciesACP*

Tabela 7 - Comparação entre o controle positivo e os extratos de Rhodophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).



EDTA 5 µg mL-1

167,7 20,1 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0

10 µg mL-1

178,8 39,7 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0

20 µg mL-1 255,6 66,3 37,2 20,2 45,2 62,7 12,8 18,3 13,4 16,2 30,2 17,0


FIC (%) nas espéciesACP*

Tabela 8 - Comparação entre o controlespositivo e os extratos de Ochrophyta quanto à habilidade de quelação do íon ferroso (FIC).



EDTA 5 µg mL-1 561,4 20,1 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0

10 µg mL-1 671,8 39,7 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0

20 µg mL-1 829,8 66,3 43,5 22,4 15,5 49,6 0,0 29,0

FIC (%) nas espécies


ACP*

*ACP = atividade antioxidante do controle positivo.


59

60

As comparações entre as habilidades de quelação do EDTA e dos extratos de

algas vermelhas estão apresentadas na Tabela 7. Os extratos de Amansia multifida,

Bryothamnion triquetrum, B. seaforthii, Hypnea musciformis, Botryocladia occidentalis,

Cryptomenia luxurians e Gracilaria ferox apresentaram habilidade de quelação superior

(quatro primeiras) ou semelhante (três últimas) à exibida pelo EDTA 5 µg mL-1. Na

comparação com o controle positivo na concentração 10 µg mL-1, o extrato de B. triquetrum

apresentou habilidade quase duas vezes superior, ao passo que nos de A. multifida e B.

seaforthii, as habilidades foram similares, assim como para o extrato de B. triquetrum ao ser

comparado com EDTA 20 µg mL-1.

O extrato metanólico (50%) da alga vermelha Kappaphycus alvarezii apresentou

habilidade de quelação inferior a 10% em todas as concentrações testadas (CHEW et al.,

2008), menor do que a encontrada no presente estudo (12,8%-62,7%). No extrato metanólico

(0,5-2,5 mg mL-1) da mesma espécie, Kumar, Ganesan e Rao (2008) determinaram atividade

inferior a 40%, tendo sido mais baixa que a determinada para o ácido ascórbico. Yuan, Bone e

Carrington (2005) não detectaram atividade de quelação de metais de transição no extrato da

alga vermelha Palmaria palmata.

Quanto às algas pardas, valores máximos da habilidade de quelação foram

verificados nos extratos de Padina gymnospora (49,6 ± 3,1%) e Dictyota dichotoma (43,5 ±

1,9%). Em Sargassum vulgare, Dictyota mertensii e Lobophora variegata, as atividades de

quelação foram de 29,0 ± 2,3%, 22,4 ± 1,1% e 15,5 ± 0,9%, respectivamente. Nenhuma

atividade foi perceptível em Spatoglossum schroederi (Figura 9C).

Habilidades de quelação superiores à do EDTA foram observadas nos extratos de

P. gymnospora nas concentrações 5 e 10 µg mL-1 e de D. dichotoma em 5 µg mL-1. Valores

semelhantes foram verificados nos extratos de S. vulgare e D. mertensii, considerando as duas

concentrações (Tabela 8).

Segundo Kuda et al. (2005), a atividade do extrato metanólico (10 mg mL-1) da

alga parda Scytosiphon lomentaria foi de 80%, inferior a encontrada com o EDTA (100%) em

concentração cem vezes menor (0,1 mg mL-1). No extrato aquoso de Petalonia binghamiae, a

habilidade de quelação foi de 40% (KUDA; HISHI; MAEKAWA, 2006), semelhante às

determinadas nos extratos de P. gymnospora e D. dichotoma analisadas no presente trabalho.

Em todos os extratos das algas pardas analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011), a

habilidade de quelação do íon ferroso foi inferior a 50% e, semelhantemente ao presente

trabalho, menor do que a do EDTA (100%), com exceção do extrato de Dictyopteris

delicatula na concentração 1 mg mL-1. Extratos de Sargassum siliquastrum apresentaram

61

habilidade abaixo de 30% (etanólico e aquoso) e 69% (clorofórmico), todas menores que a do

EDTA (100%) (CHO et al., 2007).


O poder de redução do ferro nos extratos das algas verdes, vermelhas e pardas,

está apresentado na Figura 10, em que a observação simultânea dos três grupos permite

visualizar que a redução exibida pelos extratos de algas pardas foi mais efetiva que a das

verdes, os quais foram mais ou igualmente efetivos aos das vermelhas.

De acordo com Kelman et al. (2012) e Kumar et al. (2011b), o poder de redução

do ferro dos extratos metanólicos das espécies de algas pardas foi maior ou igual ao das

verdes, que também foi superior ao das vermelhas. No entanto, Matanjun et al. (2008)

observaram poder de redução dos extratos metanólicos, em ordem decrescente, nas algas

verdes, pardas e vermelhas.

Os extratos das quatro espécies de Caulerpa apresentaram maior poder para

reduzir Fe3+ a Fe2+ com absorbâncias ou densidades ópticas (DO) variando de 0,118 ± 0,003

(C. cupressoides) a 0,275 ± 0,019 (C. sertularioides). As menores DO foram observadas nos

extratos de Ulva lactuca (0,065 ± 0,011) e U. fasciata (0,057 ± 0,006) (Figura 10A).

As comparações do poder de redução entre os controles positivos e os extratos de

algas verdes estão apresentadas na Tabela 9. Com exceção do extrato de U. fasciata que

apresentou poder de redução semelhante à do β-caroteno na concentração 20 µg mL-1, todos

os demais extratos de algas verdes apresentaram atividade superior àquela observada com α-

tocoferol, até 39 vezes, e β-caroteno, até 27 vezes, em todas as concentrações testadas. Os

extratos de C. prolifera e C. sertularioides apresentaram poder de redução superior a

observada para quercetina, BHA, BHT e ácido ascórbico nas concentrações 5 e 10 µg mL-1.

C. sertularioides também apresentou atividade superior ao ácido ascórbico em 20 µg mL-1.

Os valores de DO dos extratos de Caulerpa sertularioides, C. prolifera e C.

racemosa foram superiores ao do extrato etanólico (95%) de C. lentillifera na concentração

100 ppm (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011), cujo valor foi aproximadamente 0,15, abaixo do

da vitamina C (cerca de 0,7), na mesma concentração. Entretanto, a atividade dos extratos

dessas espécies foi semelhante a dos extratos metanólicos (0,1 e 0,5 mg mL-1) das espécies do

gênero Caulerpa analisadas por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011), cujas DO ficaram em

torno de 0,2, sendo bem inferiores à observada no BHT que correspondeu a 1,2.

62 Figura 10 - Poder de redução do ferro. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.

U. fasciata

U. lactuca

C. isthmocladum

C. cupressoides

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0,057 e

0,065 e

0,096 d

0,118 d

0,169 c

0,205 b

0,275 a

U. fasciata

U. lactuca

C. isthmocladum

C. cupressoides

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

Atividade de redução (Abs700nm

)

C. crenulata

C. luxurians

P. americana

G. ferox

H. musciformis

G. domingensis

B. occidentalis

B. seaforthii

B. triquetrum

A. multifida

--

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0,055 d

0,059 cd

0,060 cd

0,061 cd

0,067 cd

0,070 c

0,071 c

0,089 b

0,089 b

0,119 a

C. crenulata

C. luxurians

P. americana

G. ferox

H. musciformis

G. domingensis

B. occidentalis

B. seaforthii

B. triquetrum

A. multifida


)

D. dichotoma

P. gymnospora

L. variegata

D. mertensii

S. shoroederii

S.vulgare

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

0,269 e

0,366 d

0,411 c

0,442 c

0,563 b

1,128 a

D. dichotoma

P. gymnospora

L. variegata

D. mertensii

S. schroederi

S. vulgare


)


(A)

(B)

(C)

63 Tabela 9 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).

F

Caulerpa Caulerpa Caulerpa Caulerpa Codium Ulva Ulva

Abs700nm cupressoides prolifera racemosa sertularioides isthmocladum fasciata lactuca

Quercetina 5 µg mL-1 174,5 0,108 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

10 µg mL-1 171,9 0,169 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 252,6 0,287 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

BHA 5 µg mL-1 172,0 0,108 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

10 µg mL-1 168,7 0,171 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 249,0 0,283 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

BHT 5 µg mL-1 170,2 0,121 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

10 µg mL-1 172,5 0,182 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 275,1 0,306 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065


10 µg mL-1 168,7 0,139 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 215,7 0,251 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

α-tocoferol 5 µg mL-1 227,1 0,007 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

10 µg mL-1 222,8 0,008 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 239,8 0,007 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

β-caroteno 5 µg mL-1 237,2 0,010 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

10 µg mL-1 230,9 0,015 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065

20 µg mL-1 197,9 0,039 0,118 0,205 0,169 0,275 0,096 0,057 0,065


FRAP (Abs700nm) das espéciesACP*



63

64

Resultados semelhantes também foram observados por Kumar et al. (2011a) nos

extratos metanólicos de C. veravelensis, C. scalpelliformis e C. racemosa (0,5 e 1 mg mL-1)

que apresentaram atividade de redução superior a do BHA e BHT. Diferentemente do que foi

obtido neste trabalho, os extratos de Avrainvillea longicaulis (0,1 e 0,5 mg mL-1)

apresentaram poder de redução inferior aos exibidos pelo ácido ascórbico, BHA, BHT e

α-tocoferol (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007). O extrato metanólico de

Enteromorpha compressa também apresentou DO (0,05-0,15) menor que a do BHT (0,05-

2,50) (GANESAN; KUMAR; RAO, 2011).

Dentre as algas vermelhas analisadas, o extrato de Amansia multifida apresentou o

maior poder de redução, ou seja, DO máxima de 0,119 ± 0,005, seguido dos extratos de

Bryothamnion triquetrum (0,089 ± 0,004) e B. seaforthii (0,089 ± 0,005). Nas demais espécies

de rodófitas os valores de DO ficaram entre 0,055 e 0,071 (Figura 10B).

Similarmente às clorófitas, todas as rodófitas apresentaram poder de redução do

ferro maior que os de α-tocoferol e β-caroteno nas concentrações 5, 10 e 20 µg mL-1. A

diferença entre a atividade dos controles positivos e dos extratos algáceos foi de até dezessete

vezes para o primeiro e doze vezez para o segundo. Comparados aos controles positivos na

concentração 5 µg mL-1, o extrato de A. multifida apresentou atividade superior a do ácido

ascórbico e semelhante a da quercetina, BHA e BHT. Os extratos de B. seaforthii e B.

triquetrum apresentaram atividade similar a do ácido ascórbico (Tabela 10).

O extrato metanólico da alga vermelha Kappaphycus alvarezii (0,5 e 1 mg mL-1)

exibiu DO abaixo de 0,1 (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008), compatível com a maioria dos

extratos das rodófitas do presente trabalho, sendo inferior à atividade do BHT nas mesmas

concentrações. Com exceção do extrato de Gelidiella acerosa, os demais extratos de rodófitas

analisados por Devi et al. (2008) apresentaram poder de redução do ferro muito inferior ao do

BHT. O mesmo foi observado com o extrato de Chondria baileyana para BHT, BHA, ácido

ascórbico e α-tocoferol (ZUBIA; ROBLEDO; FREILE-PELEGRIN, 2007), e com a fração

metanólica (90%) de Polysiphonia morrowii (25 e 50 µg mL-1) para BHA e BHT, nas mesmas

concentrações (JE et al., 2009).

Com relação às algas pardas estudadas neste trabalho, o extrato de Sargassum

vulgare foi o que apresentou máxima DO (1,128 ± 0,036), conferindo-lhe pronunciado poder

de redução do ferro, duas a quatro vezes superior aos observados nas demais espécies, que

variaram de 0,269 ± 0,023 em Dictyota dichotoma a 0,563 ± 0,010 em Spatoglossum

schroederi (Figura 10C). Estes valores não foram muito diferentes dos observados nos

extratos metanólicos das ocrófitas (1 mg mL-1) analisadas por Kumar et al. (2011b).

65 Tabela 10 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).

F

Amansia Botryocladia Bryothamnion Bryothamnion Cryptonemia Cryptonemia Gracilaria Gracilaria Hypnea Pterocladia

Abs700nm multifida occidentalis seaforthii triquetrum crenulata luxurians domingensis ferox musciformis americana

Quercetina 5 µg mL-1 60,5 0,108 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 152,2 0,169 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 591,4 0,287 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

BHA 5 µg mL-1 58,2 0,108 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 146,6 0,171 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 575,8 0,283 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

BHT 5 µg mL-1 71,9 0,121 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 175,1 0,182 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 687,6 0,306 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 49,9 0,090 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 95,8 0,139 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 415,8 0,251 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

α-tocoferol 5 µg mL-1 86,0 0,007 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 81,2 0,008 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 101,0 0,007 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

β-caroteno 5 µg mL-1 96,9 0,010 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

10 µg mL-1 87,7 0,015 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060

20 µg mL-1 51,3 0,039 0,119 0,071 0,089 0,089 0,055 0,059 0,070 0,061 0,067 0,060


FRAP (Abs700nm) das espéciesACP*



65

66

Ainda com referência às algas pardas analisadas por Chandini, Ganesan e Bhaskar

(2008), os extratos metanólicos (0,1 a 1 mg mL-1) apresentaram DO inferior a 1,0. Para Je et

al. (2009), extratos com DO abaixo de 0,2 apresentam fraca atividade de redução.

Considerando-se esta afirmação, os extratos de algas pardas analisadas no presente trabalho

apresentaram elevado poder de redução do ferro, ao passo que, as análises de Kuda, Hishi e

Maekawa (2006), com Petalonia binghamiae, mostraram DO inferior a 0,2 no extrato

etanólico, mas 0,8 no extrato aquoso. Os extratos das algas pardas (0,1 a 2 mg mL-1)

analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011) apresentaram DO variando de 0,2 a

aproximadamente 0,8.

Todos os extratos das algas pardas analisadas neste trabalho apresentaram poder

de redução superior aos controles positivos testados em todas as concentrações, com exceção

do extrato de S. schroederi que exibiu atividade semelhante às de quercetina, BHT e ácido

ascórbico na concentração 20 µg mL-1. As diferenças entre os extratos algáceos e os controles

positivos foram muito elevadas, chegando a 160 vezes (Tabela 11).

Ao contrário do presente trabalho, os extratos de algas pardas (0,1 a 2 mg mL-1)

analisadas por Vinayak, Sabu e Chatterji (2011) apresentaram valores de DO inferiores ao

observado com o BHT.

Nos extratos de dez espécies de algas pardas analisadas por Zubia et al. (2009), o

poder de redução do ferro foi menor que o dos controles positivos BHA, BHT, ácido

ascórbico e α-tocoferol em todas as concentrações testadas, com exceção de Fucus serratus

(500 mg L-1), que apresentou atividade semelhante, e de Halidrys siliquosa (100 mg L-1), cuja

atividade foi semelhante a do α-tocoferol, na mesma concentração. Resultados parecidos

foram encontrados por Zubia, Robledo e Freile-Pelegrin (2007) com o extrato de Lobophora

variegata, que apresentou atividade de redução do ferro também inferior ao BHA, BHT, ácido

ascórbico e α-tocoferol. Cho et al. (2007) também relataram menor atividade de redução do

ferro nos extratos de Sargassum siliquastrum do que a exibida pelo ácido ascórbico.

A atividade de redução dos extratos das algas Turbinaria conoides (todas as

concentrações) e Padina tetrastomatica (500 µg mL-1), comparada com a do α-tocoferol,

mostrou-se superior (CHANDINI; GANESAN; BHASKAR, 2008).

67 Tabela 11 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta quanto ao poder de redução do ferro (FRAP).

F

Dictyota Dictyota Lobophora Padina Spatoglossum Sargassum

Abs700nm dichotoma mertensii variegata gymnospora schroederi vulgare

Quercetina 5 µg mL-1 1.000,2 0,108 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 931,9 0,169 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 837,2 0,287 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

BHA 5 µg mL-1 995,0 0,108 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 923,5 0,171 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 840,2 0,283 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

BHT 5 µg mL-1 981,6 0,121 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 913,6 0,182 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 823,9 0,306 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 1.021,8 0,090 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 962,1 0,139 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 861,2 0,251 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

α-tocoferol 5 µg mL-1 1.108,1 0,007 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 1.100,8 0,008 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 1.129,7 0,007 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

β-caroteno 5 µg mL-1 1.126,1 0,010 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

10 µg mL-1 1.116,9 0,015 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563

20 µg mL-1 1.061,9 0,039 0,366 0,411 1,128 0,442 0,268 0,563


ACP*FRAP (Abs700nm) das espécies



67

68


Os valores da atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico das

Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta analisadas no presente trabalho após 1 h de

incubação estão apresentados na Figura 11. De um modo geral as maiores atividades foram

observadas nos extratos das clorófitas seguidas das rodófitas e ocrófitas.

Nas clorófitas as maiores atividades foram observadas em Caulerpa racemosa

(95,3 ± 0,8%), C. cupressoides (92,7 ± 0,3%) e Codium isthmocladum (91,6 ± 0,2%); nas

demais espécies a variação ficou entre 70,3% em C. sertularioides e 86,0% em U. lactuca

(Figura 11A).

Em relação à comparação com os controles positivos, as atividades de todos os

extratos foram superiores a do ácido ascórbico nas três concentrações e a da quercetina com

exceção de C. sertularioides. C. racemosa apresentou atividade maior que BHA e α-tocoferol

nas concentrações 5 e 10 µg mL-1, enquanto C. sertularioides e C. isthmocladum apenas para

o último na menor concentração (Tabela 12).

No presente estudo, a atividade antioxidante do extrato de C. racemosa foi três

vezes mais eficaz do que a observada por Chew et al. (2008) no mesmo tipo de extrato e com

a mesma espécie, que permaneceu em torno de 30% na maior concentração testada,

praticamente a metade da exibida pela quercetina (60%). A atividade nos extratos de Ulva

determinada no presente trabalho foi superior a de U. lactuca observada por El-Baky, El-Baz

e El-Baroty (2009) após 2 h de incubação que, por sua vez, foi inferior a dos controles

positivos BHA e BHT. De acordo com Shanab, Shalaby e El-Fayoumy (2011), o extrato

etanólico de Enteromorpha compressa nas concentrações 100 e 200 µg mL-1 apresentaram

atividades antioxidantes de 65% e 67%, respectivamente, semelhantes à exibida pelo BHT,

nas mesmas concentrações (66% e 68%, respectivamente).

Os extratos de Rhodophyta apresentaram atividade antioxidante variando entre

64,8 ± 2,4% (Bryothamnion seaforthii) e 79,1 ± 3,6% (Hypnea musciformis) (Figura 11B).

Estes valores foram mais elevados do que os observados nos extratos de Gracilaria birdiae e

G. cornea, que variaram de 10% a 40%, em todas as concentrações (SOUZA et al., 2011).

Com exceção da atividade antioxidante exibida pelo extrato de H. musciformis

que foi superior a observada com a quercetina nas concentrações 5 e 10 µg mL-1 (68,1% e

66,3%), os demais extratos de algas vermelhas apresentaram atividade entre 64,8% e 72,3%.

Os extratos das rodófitas apresentaram atividade antioxidante superior à exibida pelo ácido

ascórbico nas três concentrações (35,2% a 44,7%) (Tabela 13).

69 Figura 11 - Atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico. (A) Chlorophyta, (B)

Rhodophyta e (C) Ochrophyta.

C. sertularioides

U. fasciata

C. prolifera

U. lactuca

C. isthmocladum

C. cupressoides

C. racemosa

0 20 40 60 80 100

70,3 d

83,7 c

84,1 c

86,0 c

91,6 b

92,7 ab

95,3 a

C. sertularioides

U. fasciata

C. prolifera

U. lactuca

C. isthmocladum

C. cupressoides

C. racemosa

Atividade antioxidante (%)

B. seaforthii

B. triquetrum

G. domingensis

G. ferox

C. crenulata

P. americana

C. luxurians

A. multifida

B. occidentalis

H. musciformis

--

0 20 40 60 80 100

64,8 c

67,1 bc

67,3 bc

68,8 bc

69,6 bc

70,2 bc

70,5 bc

71,0 bc

72,3 b

79,1 a

B. seaforthii

B. triquetrum

G. domingensis

G. ferox

C. crenulata

P. americana

C. luxurians

A. multifida

B. occidentalis

H. musciformis


L. variegata

D. mertensii

S. shoroederii

S.vulgare

D. dichotoma

P. gymnospora

0 20 40 60 80 100

34,3 d

37,9 bc

36,1 cd

37,9 bc

40,5 bc

91,9 a

L. variegata

D. mertensii

S. schroederi

S. vulgare

D. dichotoma

P. gymnospora



(A)

(B)

(C)

70 Tabela 12 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Chlorophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.



Quercetina 5 µg mL-1 109,7 68,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

10 µg mL-1 81,2 66,3 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

20 µg mL-1 91,8 73,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

BHA 5 µg mL-1 57,8 92,2 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

10 µg mL-1 86,9 92,3 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

20 µg mL-1 86,6 93,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

BHT 5 µg mL-1 87,0 94,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

10 µg mL-1 87,0 95,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

20 µg mL-1 96,3 95,9 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0


10 µg mL-1 221,2 35,2 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

20 µg mL-1 315,8 35,6 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

α-tocoferol 5 µg mL-1 81,7 88,6 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

10 µg mL-1 79,7 90,1 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0

20 µg mL-1 64,2 94,4 92,7 84,1 95,3 70,3 91,6 83,7 86,0


Atividade antioxidante (%) das espéciesACP*



70

71 Tabela 13 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Rhodophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.



Quercetina 5 µg mL-1

7,0 68,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

10 µg mL-1 6,1 66,3 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

20 µg mL-1 7,4 73,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

BHA 5 µg mL-1 33,3 92,2 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

10 µg mL-1 41,4 92,3 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

20 µg mL-1 47,4 93,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

BHT 5 µg mL-1 48,5 94,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

10 µg mL-1 52,7 95,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

20 µg mL-1 59,5 95,9 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 31,7 44,7 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

10 µg mL-1 44,7 35,2 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

20 µg mL-1 53,3 35,6 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

α-tocoferol 5 µg mL-1 28,4 88,6 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

10 µg mL-1 32,5 90,1 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2

20 µg mL-1 42,7 94,4 71,0 72,3 64,8 67,1 69,6 70,5 67,3 68,8 79,1 70,2


Atividade antioxidante (%) das espéciesACP*



71

72

Os extratos brutos (metanol:clorofórmio) das algas vermelhas Polysiphonia

urceolata (DUAN et al., 2006) e Rhodomela confervoides (WANG et al., 2009), nas

concentrações 10 e 50 µg mL-1, exibiram atividades antioxidantes iguais a 20,3% e 61,7% e a

10,3% e 38,1%, respectivamente. Estes resultados foram inferiores aos observados nos

extratos das rodófitas do presente estudo. Porém na comparação com a atividade do BHT,

essas duas espécies foram menos ativas, semelhantemente ao encontrado no presente trabalho.

O extrato metanólico a 50% da alga vermelha Kappaphycus alvarezzi (CHEW et

al., 2008) apresentou em todas as concentrações testadas atividade antioxidante inferior (30%-

50%) às observadas nos extratos de rodófitas do presente estudo, e diferentemente desta

pesquisa, o extrato de K. alvarezii exibiu menor atividade do que a quercetina.

Com exceção do extrato de Padina gymnospora, com atividade antioxidante igual

a 91,9 ± 0,4%, todos os extratos de algas pardas mostraram baixa atividade, entre 34,3 ± 0,1%

(Lobophora variegata) e 40,5 ± 0,8% (Dictyota dichotoma) (Figura 11C).

As atividades antioxidantes dos extratos das algas pardas foram menores que as

dos controles positivos, com exceção daquelas referentes aos extratos de P. gymnospora e D.

dichotoma. O primeiro apresentou atividade superior a da quercetina e do ácido ascórbico nas

três concentrações e a do α-tocoferol (5 e 10 µg mL-1), mas semelhante a do BHA (5 e 10 µg

mL-1); e o segundo, a do ácido ascórbico (10 e 20 µg mL-1) (Tabela 14).

Assim como no presente estudo, os extratos das algas pardas (50 mg L-1)

analisados por Zubia et al. (2009), com exceção de Halidrys siliquosa (75,17%), também

apresentaram baixa atividade antioxidante, entre 5,62% e 24,63%. Alguns extratos, por

exemplo, de D. dichotoma e de Desmarestia ligulata apresentaram ação pró-oxidante. Todos

exibiram atividade inferior ao BHA (82,40%), BHT (80,44%) e α-tocoferol (77,02%).

Os extratos metanólicos (60%) das algas pardas (10 mg mL-1) analisadas por

O’Sullivan et al. (2011) apresentaram atividade antioxidante superior a 50%, sendo

semelhante ou ligeiramente inferior à observada com Trolox na concentração 0,53 mg mL-1. É

importante ressaltar que essa concentração era quase dezenove vezes inferior à do extrato.

O extrato de Padina antillarum apresentou atividade antioxidante (30%-50%) em

todas as concentrações testadas por Chew et al. (2008), bem inferior à observada em P.

gymnospora do presente estudo (91,9%). Diferentemente do presente trabalho, essa atividade

foi menor do que a da quercetina.

73 Tabela 14 - Comparação entre os controles positivos e os extratos de Ochrophyta quanto à atividade antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico.



Quercetina 5 µg mL-1 1.025,2 68,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

10 µg mL-1 412,5 66,3 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

20 µg mL-1 1.127,7 73,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

BHA 5 µg mL-1 788,4 92,2 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

10 µg mL-1 2.782,2 92,3 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

20 µg mL-1 2.215,9 93,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

BHT 5 µg mL-1 2.176,5 94,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

10 µg mL-1 1.881,5 95,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

20 µg mL-1 2.341,6 95,9 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

Ácido ascórbico 5 µg mL-1 989,0 44,7 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

10 µg mL-1 423,8 35,2 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

20 µg mL-1 1.112,2 35,6 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

α-tocoferol 5 µg mL-1 2.614,9 88,6 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

10 µg mL-1 2.215,0 90,1 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

20 µg mL-1 880,5 94,4 40,5 36,1 34,3 91,9 37,9 37,9

Atividade antioxidante (%) das espéciesControle positivo

p < 0,01ACP*



73

74

4.2 Determinação do conteúdo fenólico total (CFT)

No presente trabalho, os resultados de CFT foram expressos em mg AGE g-1 alga

seca, calculados através da curva padrão de ácido gálico representada na Figura 12

( 9999,0,11,0099,00146,0 ==+−= rnxy ).

Figura 12 - Curva padrão de ácido gálico, com concentração de 1 a 250 mg L-1.

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 2750,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

2,75

y = -0,0146 + 0,0099 x(r = 0,9999, n = 11)

Abs

760

nm

mg ácido gálico L-1

Os extratos das algas pardas apresentaram maior teor de CFT, seguidos pelos

extratos das verdes e vermelhas (Figura 13). Comportamentos semelhantes foram observados

por Kumar et al. (2011b) em extratos metanólicos de 22 espécies de macroalgas marinhas, por

Wang, Jónsdóttir e Ólafsdóttir (2009) em extratos aquoso e acetônico (70%) de doze espécies

e por Chew et al. (2008) em extrato semelhante ao usado no presente trabalho (metanol 50%).

Yuan e Walsh (2006) determinaram CFT na fração butanólica, após extração em metanol,

tendo encontrado que na alga vermelha Palmaria palmata o CFT foi superior ao das pardas

Laminaria setchellii, Macrocystis integrifolia e Nereocystis leutkeana.

Dentre as algas verdes, os extratos de Caulerpa sertulatioides, C. prolifera e C.

racemosa apresentaram os maiores teores, expressos em mg AGE g-1 alga seca,

correspondentes a 2,334 ± 0,015; 1,480 ± 0,073 e 1,279 ± 0,071, respectivamente. Os extratos

de Ulva fasciata e U. lactuca apresentaram os menores, 0,214 ± 0,010 e 0,243 ± 0,008,

respectivamente, os quais foram de cinco a onze vezes inferiores aos observados nos extratos

que exibiram as maiores concentrações (Figura 13A).

75 Figura 13 - Conteúdo fenólico total nos extratos algáceos. (A) Chlorophyta, (B) Rhodophyta e (C) Ochrophyta.

U. fasciata

U. lactuca

C. cupressoides

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

0 1 2 3 4 5

0,214 f

0,243 f

0,572 e

0,783 d

1,279 c

1,480 b

2,334 a

U. fasciata

U. lactuca

C. cupressoides

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. sertularioides

mg AGE g-1 alga seca

P. americana

C. crenulata

C. luxurians

G. domingensis

G. ferox

H. musciformis

B. occidentalis

B. triquetrum

B. seaforthii

A. multifida

--

0 1 2 3 4 5

0,221 f

0,241 ef

0,258 ef

0,292 e

0,300 de

0,359 cd

0,386 c

0,401 bc

0,453 b

0,656 a

P. americana

C. crenulata

C. luxurians

G. domingensis

G. ferox

H. musciformis

B. occidentalis

B. triquetrum

B. seaforthii

A. multifida


S. shoroederii

D. dichotoma

D. mertensii

P. gymnospora

S.vulgare

L. variegata

0 1 2 3 4 5

1,242 f

1,545 e

1,780 d

2,017 c

2,589 b

5,159 a

S. schroederi

D. dichotoma

D. mertensii

P. gymnospora

S. vulgare

L. variegata



(A)

(B)

(C)

76

Todos os extratos de Caulerpa analisados no presente trabalho, com exceção de

C. cupressoides, apresentaram CFT semelhante ou superior àquele do extrato etanólico de C.

lentillifera (NGUYEN; UENG; TSAI, 2011). Os valores de CFT de C. racemosa,

determinados neste trabalho e por Chew et al. (2008), usando o mesmo sistema de extração,

foram semelhantes.

Os CFT determinados nas algas verdes no presente trabalho foram superiores aos

encontrados nos extratos aquoso (0,077 ± 0,001) e etanólico (0,369 ± 0,007) da clorófita

Halimeda macroloba (BOONCHUM et al., 2011), e aquoso (0,025 ± 0,004 e 0,044 ± 0,002) e

metanólico (0,032 ± 0,003 e 0,047 ± 0,001) de Enteromorpha intestinalis e Cladophora

glomerata, respectivamente (AKKÖZ et al., 2011). O extrato etanólico de Codium

tomentosum (CELIKLER et al., 2009) apresentou CFT inferior (0,30 ± 0,05) ao observado em

outra espécie do mesmo gênero (C. isthmocladum) do presente trabalho (0,783 ± 0,04).

Para efeito de comparação com outros trabalhos já publicados, sempre que

possível, os resultados de CFT expressos em unidades diferentes foram convertidos para mg

AGE g-1 alga seca.

Das rodófitas analisadas neste trabalho, o CFT, em mg AGE g-1 peso seco, do

extrato de Amansia multifida foi o que exibiu maior valor (0,656 ± 0,034). Nos demais

extratos, os conteúdos variaram de 0,221 ± 0,003 (Pterocladia americana) a 0,453 ± 0,028

(Bryothamnion seaforthii) (Figura 13B). Estes valores foram muito superiores ao observado

em Amphiroa sp. (0,085 mg AGE g-1 alga seca) (BOONCHUM et al., 2011), relativamente

próximos aos extratos de Gracilaria edulis (4,1 mg AGE g-1 extrato = 0,16 mg g-1 alga) e de

Acanthophora spicifera (3,55 mg AGE g-1 extrato = 0,8 mg g-1 alga) (GANESAN; KUMAR;

BHASKAR, 2008) e inferiores ao encontrado no extrato metanólico (80%) de Polysiphonia

morrowii (23,2 mg AGE g-1 extrato = 5,8 mg AGE g-1 alga) (JE et al., 2009).

Nos extratos das algas pardas o CFT variou de 1,242 ± 0,013 em Spatoglossum

schroederi a 5,159 ± 0,078 em Lobophora variegata. O valor máximo correspondeu a oito

vezes os mais baixos que foram encontrados nas algas verdes e até seis vezes os das

vermelhas. O CFT do extrato de L. variegata foi, por sua vez, até mais de vinte vezes superior

aos observados nos extratos de algas verdes e vermelhas (Figura 13C).

Os resultados de CFT dos extratos de algas pardas analisados neste trabalho foram

semelhantes aos relatados para os extratos metanólicos (60%) de cinco espécies, cujos teores

variaram de 1,5 a 4,5 (O’SULLIVAN et al., 2011) e similares ou, algumas vezes, até mesmo

superiores aos determinados nos extratos butanólicos das algas pardas investigadas por Yuan

e Walsh (2006). Entretanto, os conteúdos reportados por Boonchum et al. (2011) para os

77

extratos aquosos de Sargassum binderi (0,267 ± 0,002) e de Turbinaria conoides (1,116 ±

0,011) foram superiores aos deste trabalho. Kumar et al. (2011b) também detectaram CTF

superiores, por exemplo, 8,5 mg floroglucinol equivalente (PGE) g-1 alga seca em Padina

tetrastromatica, valor quatro vezes mais elevado que o determinado em outra espécie deste

gênero, P. gymnospora.

Chandini, Ganesan e Bhaskar (2008) consideraram os CFT dos extratos

metanólicos das algas pardas elevados de 0,6 a 1,7, mas inferiores aos deste trabalho. O

mesmo foi observado na comparação com o CFT dos extratos metanólicos de três espécies de

algas pardas japonesas que variou de 0,718 a 0,868 mg pirocatecol equivalente (PCE) g-1 alga

seca (AIRANTHI; HOSOKAWA; MIYASHITA, 2011).

A variação do CFT nas macroalgas marinhas pode ser influenciada tanto por

fatores extrínsecos como pressão a herbivoria, irradiância, profundidade, salinidade e

nutrientes, quanto por intrínsecos como morfologia da alga, idade e estágio reprodutivo, além

do solvente utilizado no processo de extração (CHEW et al., 2008; GANESAN; KUMAR;

RAO, 2011; LANN et al., 2012).

4.3 Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos

A prospecção fitoquímica é um ensaio qualitativo com o objetivo de averiguar a

presença dos principais grupos de compostos (terpenos, esteróides, saponinas, alcalóides,

fenólicos, dentre outros) em extratos vegetais, frequentemente envolvendo reações de

precipitação e mudança de coloração (BAI, 2010).

No presente trabalho a marcha fitoquímica foi realizada nos extratos algáceos com

a intenção de elucidar apenas a ocorrência de possíveis classes de compostos fenólicos, uma

vez que estes foram quantificados.

As principais classes de compostos fenólicos presentes nos extratos de

Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta analisadas no presente trabalho estão apresentadas na

Tabela 15. Estes resultados não são conclusivos, sendo insuficientes para confirmar a

ocorrência dessas classes de compostos, pois um único teste pode ser positivo para duas ou

mais classes. Desse modo a positividade é apenas um indicativo da presença das possíveis

classes de metabólitos, cuja comprovação requer uma investigação mais minuciosa com testes

mais específicos, tendo em vista que é comum observar falsos positivos.

78 Tabela 15 - Prospecção fitoquímica das principais classes de compostos fenólicos presentes nos extratos algáceos.

Classes de metabólitos

Chlorophyta Rhodophyta Ochrophyta

Cau

lerp

a cu

pres

soid

es

Cau

lerp

a pr

olif

era

Cau

lerp

a ra

cem

osa

Cau

lerp

a se

rtul

ario

ides

Cod

ium

isth

moc

ladu

m

Ulv

a fa

scia

ta

Ulv

a la

ctuc

a

Am

ansi

a m

ulti

fida

Bot

ryoc

ladi

a oc

cide

ntal

is

Bry

otha

mni

on s

eafo

rthi

i

Bry

otha

mni

on tr

ique

trum

Cry

pton

emia

cre

nula

ta

Cry

pton

emia

luxu

rian

s

Gra

cila

ria

dom

inge

nsis

Gra

cila

ria

fero

x

Hyp

nea

mus

cifo

rmis

Pte

rocl

adia

am

eric

ana

Dic

tyot

a di

chot

oma

Dic

tyot

a m

erte

nsii

Lob

opho

ra v

arie

gata

Pad

ina

gym

nosp

ora

Sarg

assu

m v

ulga

re

Spat

oglo

ssum

sch

roed

eri

Fenóis - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + +

Taninos - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + +

Antocianinas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -

Antocianidinas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -

Flavonas - + - + + - - + + + + + + - + + + - - - - - +

Flavonóis - + - + + - - + + + + + + - + + + + + - - + +

Xantonas - + - + + - - + + + + + + - + + + + + - - - +

Chaconas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -

Auronas - - - - - - - - + - - - + - - - - - - - - - -

Leucoantocianidinas - - - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -

Catequinas + + - + - - - - - - - - + - + - + - - - - + -

Flavanonas - + - + - - - - - - - - + - - - - + + - - + -

Flavanonóis - - - - - - - - - - - - + - - - - + + - - - -

(+) presença da substância analisada (-) ausência da substância analisada

78

79

Fenóis, antocianinas, antocianidinas, chaconas, auronas, leucoantocianidinas e

flavanonóis não foram detectados nos extratos das algas verdes. Taninos provavelmente estão

presentes em todos os extratos de clorófitas com exceção do de Caulerpa cupressoides. O

indicativo da presença de flavonas, flavonóis, xantonas, catequinas e flavanonas foi observado

em C. prolifera e C. sertularioides. Os três primeiros compostos possivelmente também

ocorreram em C. isthmocladum e o quarto em C. cupressoides.

Em análises fitoquímicas Alencar (2010), Srivastava et al. (2010) e Premalatha,

Dhasarathan e Theriappan (2011) reportaram a possível presença de tanino em Ulva fasciata,

de flavonóides em C. racemosa, e de fenóis, taninos e flavonóides em U. fasciata e

Chaetomorpha antennina, respectivamente.

A presença de uma grande variedade de outros metabólitos secundários tem sido

relatada em diversos estudos com macroalgas.

Ácido caféico, catequina e epicatequina foram encontrados em Acetabularia

ryukyensis, enquanto rutina foi detectada em A. ryukyensis, Monostroma nitidum e Caulerpa

serrulata, onde também foram identificadas catequina e epigalocatequina (YOSHIE et al.,

2000). Outros isômeros de catequina como galocatequina, epicatequina e catequina galato

foram encontrados em C. sertularioides por Santoso, Yoshie e Suziki (2002) e quantidades

traço de epigalato catequina e epicatequina galato em Monostroma nitidum por Santoso,

Yoshie e Suzuki (2004), que observaram também a presença dos flavonóides rutina, catecol,

hesperidina e morina. Os três últimos foram detectados em A. ryukyensis, M. nitidum, C.

serrulata, C. racemosa, Tydemaniz expeditions e Valonia macrophysa por Yoshie-Stark,

Hsieh e Suzuki (2003).

Yoshie et al. (2002) extraíram compostos fenólicos e polifenólicos de duas

espécies do gênero Halimeda (H. macroloba e H. opuntia) e detectaram a ocorrência de

catequina, epicatequina, epigalocatequina, catequina galato, epicatequina galato,

epigalocatequina galato, rutina, quercetina, hesperidina, miricetina, morina, luteolina,

apigenina, kaempferol, baicalina, ácido caféico e catecol. Entretanto, a distribuição e a

composição destes metabólitos nas duas espécies foram diferenciadas. Por exemplo, ácido

caféico e hesperidina foram detectados apenas em H. macroloba, e a concentração de catecol

foi cinco vezes maior em H. opuntia. Novoa et al. (2011) quantificaram os ácidos salicílico

(cinâmico) e ferúlico na fração hidrofílica de H. incrassata.

Nas algas vermelhas com exceção de Gracilaria domingensis foram encontrados

resultados positivos para taninos, flavonas, flavonóis e xantonas na marcha fitoquímica. A

ocorrência de antocianinas, antocianidinas, chaconas e auronas foi registrada nos extratos de

80

Botryocladia occidentalis e Cryptonemia luxurians, que, aliás, foi a única espécie de rodófita

a apresentar leucoantocianidinas, flavanonas e flavononóis. Catequina só foi detectada nos

extratos de C. luxurians, Gracilaria ferox e Pterocladia americana. Em nenhum extrato foi

observada a presença de fenóis (Tabela 15). Entretanto, um estudo fitoquímico preliminar

realizado por Bai (2010) revelou sua presença no extrato etanólico de Gracilaria fergusonii.

A ocorrência de catequina, epicatequina, epigalocatequina, catequina galato e

epigalocatequina galato foi reportada por Yoshie et al. (2000) em diversas espécies de

macroalgas marinhas vermelhas, porém a distribuição desses metabólitos foi diferenciada

entre as espécies. Em Porphyra yezoensis Santoso, Yoshie e Suzuki (2004) quantificaram

catequina, epigalocatequina galato, ácido caféico, catecol, herperidina e morina. Os três

últimos flavonóides foram identificados em dez espécies de algas vermelhas por Yoshie-

Stark, Hsieh e Suzuki (2003). Além deles outros compostos (miricetina, rutina e ácido

caféico) foram quantificados em algumas das espécies estudadas. Queirós, Lage-Yusty e

López-Hernández (2010) encontraram catequina, catequina galato, epicatequina,

epigalocatequina, epigalocatequina galato e ácido gálico em Palmaria spp. e Porphyra spp.

Concentrações relevantes dos ácidos trans-cinâminos, cumárico e ferúlico foram

encontradas no extrato aquoso de Bryothamnion triquetrum (NOVOA et al., 2001).

Sabina e Aliya (2009) reportaram a presença da flavona escutelareína 4’-metil éter

em Osmundea pinnatifida e Souza et al. (2011) a de apigenina (4’,5,7-trihidroxiflavona) nos

extratos metanólicos de Gracilaria birdiae e G. cornea.

Todos os extratos das algas pardas apresentaram fenóis e taninos. Antocianinas,

antocianidinas, chaconas, auronas e leucoantocianidinas não foram observadas nas ocrófitas.

A ocorrência de flavonóis foi observada em Dictyota dichotoma, D. mertensii, Spatoglossum

schroederi e Sargassum vulgare. Possivelmente os extratos das três primeiras espécies

também possuem xantonas, mas flavonas só foram detectadas em S. schroederi. Flavanonas e

flavanonóis foram observados nos extratos de D. dichotoma e D. mertensii. No extrato de S.

vulgare além de se observar os dois últimos metabólitos citados, foi o único que apresentou

catequina, dentre as algas pardas analisadas (Tabela 15).

No extrato metanólico (50%) de Stypocaulon scoparium foram detectados

quatorze polifenóis, com predominância de ácido gálico, catequina, epicatequina e ácido

gentísico. Protocatéquico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido clorogênico, ácido caféico,

ácido cumárico, ácido ferúlico, rutina, miricetina e quercetina ocorreram em menores

quantidades (LÓPEZ et al., 2011).

81

No trabalho de Li et al. (2009) foram isolados sete florotaninos (floroglucinol,

eckol, fucodifloroetol G, florofucofuroeckol, floro eckol, dieckol e 6,6’-bieckol) do extrato

metanólico de Ecklonia cava. Nos extratos etanólico de E. cava (CHO et al., 2012) e

metanólico de E. stolonifera (KANG et al., 2004) foram encontrados floroglucinol,

eckstolonol, eckol e dieckol.

Catequina e vários de seus isômeros foram observados em doze espécies de algas

pardas analisadas por Yoshie et al. (2000). A ocorrência de epigalocatequina foi reportada em

Sargassum polycystum e Turbinaria conoides. Nesta última também foram encontradas

catequina e epicatequina em quantidades traço, assim como no extrato Padina australis

(SANTOSO; YOSHIE; SUZUKI, 2002).

Santoso, Yoshie e Suzuki (2004) observaram a ocorrência de catequina

epicatequina e epigalocatequina em S. polycystum, T. conoides e Padina australis. Uma

variedade maior de isômeros (catequina, epigalocatequina, epicatequina, epigalocatequina

galato, epicatequina galato, hesperidina e morina) foi detectada em Eisenia bicyclis. Extratos

de Laminaria religiosa e de Hizikia fusiformis apresentaram catecol, morina, catequina e

epigalocatequina.

De acordo com Queirós, Lage-Yusty e López-Hernadez (2010), nas algas pardas

Undaria pinnatifida e Himanthalia elongata foi observada a presença de ácido gálico.

Epigalocatequina também foi encontrada nos extratos de H. elongata e Laminaria ochroleuca,

onde também foram quantificados epicatequina, epigalocatequina galato, epicatequina galato

e catequina galato.

A ocorrência de morina foi observada em onze espécies de algas pardas analisadas

por Yoshie-Stark, Hsieh e Suzuki (2003). Rutina foi detectada em Ecklonia cava, U.

pinnatifida e Ishige okamurae, enquanto ácido caféico, apenas nas duas últimas. A presença

de catecol não foi observada nem em Eisenia bicyclis nem em Padina minor, tampouco a de

hesperidina em U. pinnatifida, E. bicyclis e Padina arborescens. Quercetina, por sua vez, foi

detectada unicamente em U. pinnatifida e P. arborescens.

4.4 Correlação entre o conteúdo fenólico total (CFT) e os ensaios antioxidantes in vitro

Diversos trabalhos correlacionam os resultados do conteúdo de compostos

fenólicos presentes nos extratos algáceos preparados com diferentes solventes orgânicos com

as várias atividades antioxidantes exibidas por eles. Muitas vezes são estes metabólitos os

82

principais responsáveis por essas atividades (CHO et al., 2011; GANESAN; KUMAR;

BHASKAR, 2008; WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009).

Para investigar se as atividades antioxidantes dos extratos algáceos analisados no

presente trabalho foram resultantes do conteúdo de compostos fenólicos, foi estabelecida a

correlação entre o CFT e as atividades antioxidantes in vitro.

Nos extratos das algas verdes analisadas no presente trabalho, foi possível

observar uma forte correlação entre o CFT e a capacidade de sequestrar o DPPH (r = 0,808), o

poder de redução do ferro (r = 0,981) e a habilidade de quelação do íon ferroso (r = 0,969)

(Tabela 16). Possivelmente os compostos fenólicos presentes nos extratos das algas verdes

analisadas foram os principais responsáveis por essas atividades.

Tabela 16 - Coeficientes de correlação de Pearson (r) para o conteúdo fenólico total (CFT) e ensaios antioxidantes in vitro.

CFT

Ensaios antioxidantes in vitro

r Chlorophyta Rhodophyta Ochrophyta

sequestro do radical DPPH 0,808* 0,939* 0,387 poder de redução do ferro (FRAP) 0,981* 0,929* 0,998* quelação do íon ferroso (FIC) 0,969* 0,599* -0,152 atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico

-0,552 -0,003 -0,194

Número de espécies 21 30 18 *p < 0,05

Resultados semelhantes foram relatados por Vinayak, Sudha e Chatterji (2011),

quanto à elevada correlação entre CFT dos extratos de clorófitas e capacidade de sequestro do

DPPH (R2 = 0,88 / r = 0,938) e poder de redução do ferro (R2 = 0,93 / r = 0,964). Entretanto,

diferentemente do presente trabalho, foi observada fraca correlação entre CFT e habilidade de

quelação do íon ferroso (R2 = 0,13 / r = 0,360). Com base nestas informações, os autores

sugeriram que os polifenóis talvez não sejam os principais queladores de metais.

Comportamento distinto foi encontrado no trabalho de Ganesan, Kumar e Rao

(2011) com algas verdes em que os fenóis foram os responsáveis pela atividade de sequestro

do DPPH nos extratos de Enteromorpha linza e E. tubulosa, com R2 iguais a 0,89 (r = 0,943)

e 0,62 (r = 0,787), respectivamente. Outra espécie do mesmo gênero E. compressa apresentou

correlação baixa (R2 = 0,038 / r = 0,195), tendo essa atividade sido atribuída aos carotenóides,

ácidos graxos poli-insaturados e/ou polissacarídeos. Correlação baixa entre o CFT e a

atividade de sequestro do DPPH (R2 = 0,1227 / r = 0,350) e moderada entre o CFT e o poder

83

de redução do ferro (R2 = 0,4780 / r = 0,691) também foram verificadas em E. prolifera (CHO

et al., 2011).

O CFT dos extratos das algas vermelhas analisadas no presente trabalho exibiu

correlação forte com as atividades de sequestro do DPPH (r = 0,939) e poder de redução do

ferro (r = 0,929) e moderada com relação à habilidade de quelação do íon ferroso (r = 0,599)

(Tabela 16). Assim como nas algas verdes é possível que os compostos fenólicos das

rodófitas sejam os principais responsáveis por essas atividades.

Souza et al. (2011) também relataram existência de correlação entre o CFT e o

sequestro do DPPH (R2 = 0,92 / r = 0,959) para os extratos de algas vermelhas.

Nos extratos das algas pardas deste trabalho só foi possível estabelecer correlação

entre CFT e poder de redução do ferro (r = 0,998), a qual não foi encontrada nos extratos

algáceos analisados por Zubia et al. (2009). A correlação entre CFT e capacidade de

sequestrar o DPPH (r = 0,387) não pode ser visualizada, entretanto acredita-se que os

compostos fenólicos encontrados abundantemente nas algas pardas sejam os principais

responsáveis pela atividade sequestrante do DPPH que foi praticamente 100% em todos os

extratos (Tabela 16).

Assim como no presente trabalho, não houve correlção entre CFT e sequetro do

DPPH em algas pardas (AIRANTHI; HOSOKAWA; MIYASHITA, 2011; O’SULLIVAN et

al., 2011; ZUBIA et al., 2009). Estes autores atribuíram a capacidade antioxidante dos

extratos algáceos à presença de fucoxantina, proteínas, peptídeos e/ou polissacarídeos.

No entanto outros autores encontraram correlação significativa entre o CFT e o

sequestro do DPPH (LÓPEZ et al., 2011; WANG; JÓNSDÓTTIR; ÓLAFSDÓTTIR, 2009).

Embora os polifenóis encontrados abundantemente em algas pardas sejam considerados os

principais responsáveis pela atividade antioxidante, a utilização de solventes de baixa

especificidade pode favorecer a extração parcial e simultânea de outros compostos que

desempenham a mesma atividade.

Os extratos algáceos dos três Filos analisados não apresentaram correlação entre o

CFT e a atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoléico (Tabela 16). Embora

Souza et al. (2011) tenham demonstrado a existência de correlação entre ambos, muitos

estudos não lograram êxito no estabelecimento desta correlação (O’SULLIVAN et al., 2011,

ZUBIA et al., 2009).

Nem sempre é possível estabelecer correlação significativa entre CFT e as demais

atividades antioxidantes (FRAP, FIC e no sistema β-caroteno/ácido linoléico) exibidas pelos

extratos algáceos, isso porque as macroalgas marinhas possuem diversos compostos bioativos

84

como vitamina E, carotenóides provitamina A, polissacarídeos sulfatados, proteínas,

peptídeos, fibras alimentares, dentre outros que são considerados excelentes antioxidantes

(PIRES-CAVALCANTE et al., 2011, SOUSA et al., 2008; WANG; JÓNSDÓTTIR;

ÓLAFSDÓTTIR, 2009).

4.5 Extração, identificação e quantificação de carotenóides (α- e β-caroteno e luteína) e

tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)

Experimentos prévios foram elaborados para desenvolver uma metodologia de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando sistema isocrático com coluna de

fase reversa C18, incluindo variações na composição da fase móvel, tipos de coluna e

velocidades de fluxo. A metodologia desenvolvida no presente trabalho com duração inferior

a 20 min foi comprovadamente eficiente para separar simultaneamente α- e β-caroteno,

luteína e α- e δ-tocoferol.

A identificação e a quantificação dos compostos de interesse nas 23 espécies de

algas do litoral cearense foram realizadas, comparando-se os tempos de retenção das soluções

padrões de β-caroteno, luteína e α- e δ-tocoferol com o tempo de retenção dos mesmos

compostos presentes nos extratos de alga e através da co-cromatografia.

A identificação de compostos através da comparação dos tempos de retenção é

uma prática muito utilizada por vários pesquisadores em diversos tipos de amostras, como

algas e vegetais folhosos normalmente consumidos nos países mediterrâneos (PIRES-

CAVALCANTE et al., 2011; SOUSA et al., 2008; ZNIDARCIC; BAN; SIRCELJ, 2011).

4.5.1 Curvas padrão de carotenóides e tocoferóis

A relação entre a área do pico e a quantidade de β-caroteno e luteína aplicados na

coluna foi estabelecida para os padrões de β-caroteno e luteína processados, ou seja,

submetidos ao processo de saponificação e partição. A quantificação desses compostos nos

extratos algáceos foi possível devido à existência de correlação linear entre a área do pico e as

concentrações de β-caroteno (r = 0,9996, p < 0,05) e luteína (r = 0,9993, p < 0,05), ambos

processados, correspondendo a aproximadamente 0,1 a 1,0 µg na coluna (Figura 14).

85 Figura 14 - Curvas padrão de carotenóides submetidos à saponificação e partição. (A) β-caroteno e (B) luteína.

Injeção de 0,1 a 1,0 µg em coluna Atlantis Waters Spherisorb S5 ODS 2 (4,6 x 250 mm) com fase móvel constituída de MeOH:THF (90:10),

fluxo 1,5 mL min-1 e detecção em 450 nm e 444 nm, respectivamente.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00

20

40

60

80

100

120

140

160 y = 1,86602 + 116,93486 x(r = 0,9996, n = 6)

Áre

a d

o p

ico

(m

AU

min

)

µg β-caroteno na coluna

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00

20

40

60

80

100

120

140

160y = - 0,96227 + 150,89738 x(r = 0,9993, n = 7)

Áre

a d

o p

ico

(m

AU

min

)

µg luteína na coluna

De forma idêntica, a relação entre a área do pico e a quantidade de tocoferóis

aplicada na coluna foi estabelecida para os padrões de α- e δ-tocoferol processados. A

existência de correlação linear (r = 0,9994, p < 0,05 para α-tocoferol e r = 0,9999, p < 0,05

para δ-tocoferol) entre a área do pico e a concentração de aproximadamente 1,0 a 10,0 µg

desses tocoferóis processados injetados na coluna (Figura 15) permitiu a quantificação desses

compostos nos extratos algáceos.

(A)

(B)

86 Figura 15 - Curvas padrão de tocoferóis submetidos à saponificação e partição. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.

Injeção de 1 a 10 µg em coluna Atlantis Waters Spherisorb S5 ODS 2 (4,6 x 250 mm) com fase móvel constituída de MeOH:THF (90:10),

fluxo 1,5 mL min-1 e detecção em 292 nm.

0 2 4 6 8 100

10

20

30

40

50

60 y = - 1,20966 + 2,87789 x(r = 0,9994, n = 4)

Áre

a d

o p

ico

(m

AU

min

)

µg α-tocoferol na coluna

0 2 4 6 8 100

10

20

30

40

50

60 y = - 1,38695 + 5,83225 x(r = 0,9999, n = 6)

Áre

a d

o p

ico

(m

AU

min

)

µg δ-tocoferol na coluna

4.5.2 Carotenóides (α- e β-caroteno e luteína)

Com o sistema cromatográfico usado neste trabalho, os tempos de retenção do

padrão de β-caroteno e do composto identificado como β-caroteno presente nos extratos

algáceos foram iguais a 15,07 ± 1,59 min (n = 28) e 15,10 ± 1,51 min (n = 132),

respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05) entre os

(A)

(B)

87

tempos de retenção do β-caroteno padrão e do composto nos extratos de alga, eluído em

aproximadamente 15 min.

A dificuldade de aquisição do padrão comercial de α-caroteno e o uso de sistema

cromatográfico semelhante em que a eluição de α-caroteno acontece imediatamente antes do

β-caroteno (SAKER-SAMPAIO, 1997) fizeram com que, neste trabalho, o composto com

tempo de retenção de 14,82 ± 0,83 min (n = 66) fosse considerado α-caroteno. Esse tempo de

retenção foi comparado com aquele referente ao do β-caroteno através do teste t de Student

não-pareado para dados independentes, havendo diferença estatisticamente significativa entre

eles (p < 0,05).

Com relação à luteína, os tempos de retenção do padrão comercial e do composto

identificado como tal nos extratos algáceos corresponderam respectivamente a 3,53 ± 0,06

min (n = 16) e 3,55 ± 0,13 min (n = 134). Na comparação estatística através do teste t de

Student não-pareado para dados independentes não houve diferença significativa entre ambos

(p ≥ 0,05).

Um cromatograma típico do padrão contendo 0,2 µg de β-caroteno e de luteína

está representado pela Figura 16.

Figura 16 - Cromatograma típico de β-caroteno (Sigma) e luteína (Duane Reade) submetidos à saponificação e partição.

O Filo Chlorophyta é reconhecido por possuir vários pigmentos como clorofila a e

b, luteína, como xantofila majoritária e carotenos, principalmente β-caroteno. Entretanto,

mesmo estando presente em pequena quantidade na maioria das espécies, o α-caroteno pode

88

ser o pigmento mais abundante em algumas delas (HOEK; MANN; JAHNS, 1995;

RAYMUNDO; HORTA; FETT, 2004; TAKAICHI, 2011).

Neste estudo todos os extratos das algas verdes com exceção de Ulva fasciata e U.

lactuca apresentaram α-caroteno, cujo teor máximo (µg g-1 alga seca) foi detectado em

Caulerpa sertularioides (3,341 ± 0,207). Nos extratos das outras espécies, os conteúdos

variaram de 0,452 ± 0,047 (Codium isthmocladum) a 2,474 ± 0,252 (Caulerpa cupressoides)

(Figura 17A). β-Caroteno, por sua vez, foi identificado em todas as clorófitas analisadas,

sendo os maiores conteúdos (µg g-1 alga seca) encontrados em C. cupressoides (3,140 ±

0,346) e C. sertularioides (1,125 ± 0,148) (Figura 17B).

Em todos os extratos das clorófitas em que ambos (α- e β-caroteno) foram

detectados os conteúdos de α-caroteno foram superiores aos de β-caroteno, com exceção de C.

cupressoides, embora a literatura informe que este último predomina sobre o primeiro

(HOEK; MANN; JAHNS, 1995; RAYMUNDO; HORTA; FETT, 2004). Alguns trabalhos

revelaram também que os teores de α-caroteno superaram os de β-caroteno em espécies do

gênero Caulerpa (PIRES, 2007; PIRES et al., 2008; SOUSA et al., 2008).

As concentrações dos carotenos nos extratos das mesmas espécies de Caulerpa

estudadas no presente trabalho foram inferiores àquelas mensuradas mensalmente ao longo de

um ano por Pires (2007). Diferentemente do que foi encontrado por Sousa et al. (2008),

α-caroteno não foi quantificado em Ulva fasciata. A avaliação sazonal de carotenos em

amostras desidratadas de U. fasciata e U. lactuca realizada por Sousa (2011) confirmou a

presença de α-caroteno em todos os meses, com exceção de novembro para U. fasciata e de

outubro e novembro para U. lactuca. Para o autor, estas diferenças podem estar relacionadas

com a época e o local de coleta ou com outros fatores, como idade da planta e radiação solar.

A luteína foi identificada em todos os extratos de algas verdes, sendo o

carotenóide majoritário, com valores até 7 e 43 vezes superiores aos observados para o α- e β-

caroteno, respectivamente. Os maiores teores (µg g-1 alga seca) foram observados nos extratos

de Caulerpa sertularioides (24,545 ± 1,101) e C. cupressoides (17,198 ± 1,656). Os menores

conteúdos, por sua vez, foram determinados em C. racemosa (1,701 ± 0,22) e Codium

isthmocladum (0,612 ± 0,045). Nos extratos das demais espécies, a quantidade ficou entre

12,211 e 14,659, aproximadamente, (Figura 17C). Apesar de a luteína ser um composto

resultante do processo de hidroxilação do α-caroteno (SILVA et al., 2010), nos extratos de U.

lactuca e U. fasciata, embora ele não tenha sido quantificado, a luteína apareceu como

carotenóide majoritário.

89 Figura 17 - Teores de carotenóides nos extratos de Chrolorophyta. (A) α-caroteno, (B) β-caroteno e (C) luteína.

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. cupressoides

C. sertularioides

0 5 10 15 20 25 30

0,452 d

1,268 c

2,410 b

2,474 b

3,341 a

C. isthmocladum

C. racemosa

C. prolifera

C. cupressoides

C. sertularioides

µg α-caroteno g-1 alga seca

C. isthmocladum

C. racemosa

U. fasciata

U. lactuca

C. prolifera

C. sertularioides

C. cupressoides

0 5 10 15 20 25 30

0,127 d

0,169 d

0,285 d

0,647 c

0,864 bc

1,125 b

3,140 a

C. isthmocladum

C. racemosa

U. fasciata

U. lactuca

C. prolifera

C. sertularioides

C. cupressoides

µg β-caroteno g-1 alga seca

C. isthmocladum

C. racemosa

U. fasciata

C. prolifera

U. lactuca

C. cupressoides

C. sertularioides

0 5 10 15 20 25 30

0,612 e

1,701 e

12,232 d

12,211 d

14,659 c

17,198 b

24,545 a

C. isthmocladum

C. racemosa

U. fasciata

C. prolifera

U. lactuca

C. cupressoides

C. sertularioides

µg luteína g-1 alga seca

Letras minúsculas iguais em cada composto � inexistência de diferença estatisticamente significativa (p ≥ 0,05). Letras minúsculas diferentes em cada composto � existência de diferença estatisticamente significativa (p < 0,05).

(A)

(B)

(C)

90

Hegazi et al. (1998) separaram e identificaram clorofilas e carotenóides de

macroalgas marinhas. Na clorófita Caulerpa prolifera foi constatada a presença de dezoito

pigmentos fotossintéticos dentre os quais α- e β-catoteno e luteína. Na possibilidade de haver

ligação entre a síntese de pigmentos e as variações ambientais, Kakinuma, Kuno e Amano

(2004) avaliaram a composição dos pigmentos em resposta ao estresse salino na clorófita

Ulva pertusa. Praticamente em todas as simulações (salinidade / tempo de exposição), os

teores de luteína (48,3 a 79,4 mg 100 g-1 peso seco) foram superiores aos de β-caroteno (21,9

a 80,7 mg 100 g-1 peso seco). Com o mesmo propósito, Bischof et al. (2002) estudaram a

composição de pigmentos fotossintéticos de U. lactuca frente às condições de radiação, tendo

observado que os teores (mg g-1 peso fresco) de luteína e de β-caroteno variaram de 0,10 a

0,22 e de 0,01 a 0,05, respectivamente. Nas espécies de algas verdes, a luteína aparece com

frequência como pigmento majoritário. Por exemplo, Esteban et al. (2009b) e Yoshii et al.

(2004) estudaram a composição dos carotenóides de 27 amostras pertencentes à ordem

Cladophorales e dessas 56% exibiram a luteína como carotenóide majoritário contribuindo

com até 60% dos carotenóides totais. No entanto, há registro de resultados diferentes dos

relatados anteriormente. Ortiz et al. (2009) determinaram o teor de luteína na macroalga verde

Codium fragile (0,7 µg g-1 alga seca) muito inferior ao de β-caroteno (197,9 µg g-1 alga seca).

Alguns pigmentos presentes nas algas vermelhas são clorofila a, carotenos e

xantofilas. Frequentemente a luteína é o principal carotenóide, podendo contribuir com mais

de 50% dos carotenóides totais, entretanto em algumas espécies essa xantofila é substituída

por zeaxantina ou anteraxantina. De um modo geral, os teores de α- e β-caroteno são baixos,

porém eles podem ser majoritários em algumas espécies (HOEK; MANN; JAHNS, 1995;

SCHUBERT; GARCÍA-MENDOZA, 2008; TAKAICHI, 2011).

Todas as espécies de rodófitas analisadas no presente trabalho apresentaram β-

caroteno e luteína, que foi o carotenóide majoritário. α-Caroteno foi quantificado em todas as

espécies com exceção de Bryothamnion seaforthii, Gracilaria domingensis e G. ferox. Os

extratos das rodófitas que apresentaram ambos α- e β-caroteno exibiram concentrações de β-

caroteno superiores as de α-caroteno, com exceção de Cryptonemia crenulata (Figura 18).

α-Caroteno não foi detectado nos extratos de Bryothamnion seaforthii, Gracilaria

domingensis e G. ferox. As concentrações (µg g-1 alga seca) máxima e mínima foram

determinadas em Amansia multifida (1,659 ± 0,131) e Hypnea musciformis (0,042 ± 0,004),

respectivamente. Nos demais extratos os teores variaram de 0,113 ± 0,011 (Bryothamnion

triquetrum) a 0,387 ± 0,025 (Cryptonemia luxurians) (Figura 18A).

91 Figura 18 - Teores de carotenóides nos extratos de Rhodophyta. (A) α-caroteno, (B) β-caroteno e (C) luteína.

H. musciformis

B. triquetrum

C. crenulata

B. occidentalis

P. americana

C. luxurians

A. multifida

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0,042 de

0,113 de

0,185 cde

0,321 bcd

0,348 bc

0,387 b

1,659 a

H. musciformis

B. triquetrum

C. crenulata

B. occidentalis

P. americana

C. luxurians

A. multifida

µg α-caroteno g-1 alga seca

C. crenulata

B. occidentalis

G. ferox

C. luxurians

G. domingensis

P. americana

B. seaforthii

H.musciformis

B. triquetrum

A. multifida

--

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0,738 c

0,042 d

0,122 d

0,193 d

0,596 c

0,834 c

0,845 c

0,855 c

2,435 b

3,798 a

C. crenulata

B. occidentalis

G. ferox

C. luxurians

G. domingensis

P. americana

B. seaforthii

H. musciformis

B. triquetrum

A. multifida


G. ferox

C. crenulata

C. luxurians

G. domingensis

B. occidentalis

H.musciformis

P. americana

B. seaforthii

B. triquetrum

A. multifida

--

0 5 10 15 20 25 30 35 40

1,072 g

1,428 g

2,409 fg

3,771 f

3,398 f

6,731 e

12,926 d

15,127 c

17,728 b

35,363 a

G. ferox

C. crenulata

C. luxurians

G. domingensis

B. occidentalis

H. musciformis

P. americana

B. seaforthii

B. triquetrum

A. multifida



(A)

(B)

(C)

92

Sousa et al. (2008) também não encontraram α-caroteno em B. seaforthii, G.

domingensis, G. ferox nem em outras seis espécies de rodófitas das vinte analisadas. No

trabalho de Pires et al. (2008), α-caroteno não foi detectado nem em B. seaforthii nem em

Enantiocladia duperreyi, entretanto, em B. triquetrum, o teor desse caroteno (0,311 µg g-1

peso seco) foi superior ao encontrado no presente trabalho (0,113 µg g-1 peso seco).

Os maiores conteúdos de β-caroteno (µg g-1 alga seca) nas algas vermelhas foram

detectados em A. multifida (3,798 ± 0,303) e B triquetrum (2,435 ± 0,114). A concentração

mínima foi observada em C. crenulata (0,042 ± 0,002). Nos demais extratos a variação ficou

entre 0,122 ± 0,017 e 0,855 ± 0,079 (Figura 18B).

Os teores de luteína (µg g-1 alga seca) mais elevados foram detectados em A.

multifida (35,363 ± 2,689), B. triquetrum (17,728 ± 1,077), B. seaforthii (15,127 ± 1,304) e

Pterocladia americana (12,926 ± 0,478). Nos outros extratos, os teores variaram entre 1,072

± 0,074 (G. ferox) e 6,731 ± 0,180 (Hypnea musciformis) (Figura 18C).

Palermo, Gros e Seldes (1991) isolaram e caracterizaram oito carotenóides de

algas vermelhas. β-Caroteno foi o carotenóide majoritário, com 18,4 mg 100 g-1 peso seco

(60,8% do total), 12,2 mg 100 g-1 peso seco (74,8% do total) e 20,9 mg 100 g-1 peso seco

(53,3% do total), em Corallina officinallis, C. elongata e Jania sp., respectivamente. Esses

valores foram mais elevados do que os encontrados nas espécies de rodófitas analisadas no

presente trabalho. A presença de α-caroteno ou luteína, entre os carotenóides estudados nessas

espécies, não foi reportada. Ortiz et al. (2009) também encontraram β-caroteno como

pigmento majoritário em Gracilaria chilensis cujo teor correspondeu a 113,7 µg g-1 alga seca,

e a concentração de luteína foi de 2,0 µg g-1 alga seca. Estes resultados foram,

respectivamente, superior e inferior aos determinados nas rodófitas do presente trabalho.

Hegazi et al. (1998) identificaram dezesseis pigmentos fotossintéticos na rodófita Jania

rubens, dentre eles, luteína, α-caroteno e β-caroteno.

Ainda com relação à composição de carotenóides de algas vermelhas, Esteban et

al. (2009a) encontraram luteína em todas as treze espécies, sendo o carotenóide majoritário

em dez delas (77%). β-Caroteno também foi identificado em todas as espécies e, assim como

no presente trabalho, os teores foram superiores aos de α-caroteno, o qual não foi encontrado

nem em Phyllophora sicula nem em Osmundea pinnatifida. Como previamente ressaltado,

nem sempre que a luteína é quantificada, α-caroteno também é detectado, observação feita

com Gracilaria ferox, G. domingensis e Bryothamnion seaforthii.

Andersson, Schubert e Snoeijs (2006) reportaram a existência de uma ampla

variação na distribuição dos pigmentos carotenóides em algas vermelhas que foram divididas

93

em três grupos. O primeiro formado por Gracilaria domingensis e G. birdiae não apresentou

α-caroteno nem luteína, tendo anteraxantina e β-caroteno como pigmentos majoritários. No

segundo grupo, constituído por Gracilaria chilensis, G. tenuistipitada, Graciliopsis sp. e G.

lemaneiformis, a zeaxantina foi o carotenóide predominante (> 25%). No terceiro grupo,

composto por Eucheuma denticulata, Kappaphycus alvarezii, Halimenia floresia e

Cordyclada erecta, os pigmentos principais foram em ordem decrescente luteína (> 25%), β-

caroteno e zeaxantina (5-25%) e α-caroteno (1-5%).

Schubert, García-Mendoza e Pacheco-Ruiz (2006) avaliaram a composição de

carotenóides em 65 espécies de rodófitas, sendo a luteína a xantofila majoritária

representando de 50,7% a 99,7% dos carotenóides totais em 49 das 53 espécies que exibiram

esse pigmento. A distribuição de α- e β-caroteno foi bastante diversificada, com a ocorrência

de ambos ou às vezes de apenas um deles. A presença de α-caroteno não foi observada em dez

das 53 amostras em que a luteína foi detectada. De acordo com os autores, as algas vermelhas

não possuem composição de carotenóides com perfil único, e isso pode ser resultante da

aclimatação de cada espécie à luminosidade.

Contrariamente Marquardt e Hanelt (2004) acreditam que a composição dos

carotenóides nas Rhodophyta segue um padrão definido pela presença de α- e/ou β-caroteno e

uma xantofila majoritária, normalmente luteína ou zeaxantina. A comprovação desta hipótese

foi obtida na investigação em dezesseis espécies de ambientes polar e temperado que exibiram

esse padrão, com exceção de Delesseria lancifolia.

Entretanto para ESTEBAN et al. (2009a) é difícil desenvolver uma hipótese sobre

a presença de grupos de pigmentos em comunidades ficológicas, porque essa composição não

é somente resultado da aclimatação fotossintética, mas também pode ser consequência do

processo evolucionário.

Godínez-Ortega et al. (2008) avaliaram o crescimento e a composição de

pigmentos da alga vermelha Halymenia floresii cultivada sob luz branca, verde, azul e

vermelha. Neste experimento a concentração de luteína permaneceu entre 30 e 50 µg g-1 peso

fresco sendo o carotenóide majoritário. Os teores de α-caroteno foram sempre superiores aos

de β-caroteno, com concentrações (µg g-1 peso fresco), variando de 15 a 30 e de 6 a 9,

respectivamente. Estas quantidades foram fortemente influenciadas pelas diferentes condições

de cultivo.

As algas pardas possuem as clorofilas a e c, fucoxantina, violaxantina e

zeaxantina, como principais xantofilas, quantidades consideráveis de β-caroteno, mas nenhum

α-caroteno. Micro e macroalgas dos filos Cryptophyta, Euglenophyta, Chloraracniophyta e

94

Chlorophyta possuem α-caroteno e seus derivados, como luteína, loraxantina e sifonaxantina,

os quais ocorrem apenas nas macroalgas do Filo Rhodophyta (TAKAICHI, 2011; YOSHII et

al., 2004).

Takaichi et al. (2012) investigaram a ocorrência de α-caroteno e seus derivados

em diversas classes de algas (micro e macro). Os referidos autores não observaram a presença

desses compostos em Glaucophyceae, Chryosophyceae, Raphydopyceae, Bacillariophyceae,

Phaeophyceae, Xanthophyceae, Eustigmatophyceae, Haptophyceae e Dinophyceae, todas

elas, famílias de microalgas pardas, detentoras das clorofilas a e c.

Os teores de β-caroteno (µg g-1 alga seca) foram determinados em todos os

extratos de Ochrophyta, com máximos em Spatoglossum schroederi (1,744 ± 0,177), Padina

gymnospora (1,705 ± 0,239) e Sargassum vulgare (1,690 ± 0,183). Nos demais extratos, os

valores variaram de 0,371 ± 0,034 (Dictyota dichotoma) a 0,995 ±0,123 (D. mertensii)

(Figura 19A). Como era se de esperar, não foi detectada a presença de α-caroteno nos extratos

das algas pardas analisadas no presente trabalho.

Resultados análogos foram relatados em diversos trabalhos sobre a composição de

carotenóides nessas algas. Sousa et al. (2008) quantificaram β-caroteno em P. gymnospora,

D. dichotoma e Lobophora variegata. Hegazi et al. (1998) reportaram a presença de quatorze

pigmentos entre clorofilas e carotenóides, como fucoxantina, violoxantina, β-caroteno, mas

nenhum α-caroteno ou luteína em Padina pavonica. O conteúdo total de carotenóides em

Laminaria cichorioides foi igual a 12,9 g 100 g-1 peso fresco, sendo β-caroteno o carotenóide

minoritário e os pigmentos fucoxantina e violaxantina, os majoritários (VERSHININ;

KAMNEV, 1996).

Os teores de β-caroteno (mg 100 g-1 peso seco) foram 1,30 e 2,99 em Undaria

pinnatifida e Laminaria digitata japonica, respectivamente (KOLB et al., 2004), superiores

aos observados nas espécies de algas pardas do presente trabalho. A quantidade de β-caroteno

em Macrocystis pyrifera (17,4 µg g-1 alga seca) coletada no Chile (ORTIZ et al., 2009) foi de

6 a 56 vezes superior àquelas observadas nas algas pardas do presente trabalho.

Assim como no presente trabalho, Pires et al. (2008) quantificaram β-caroteno em

cinco espécies de algas pardas desidratadas a 40°C por 15 h. O extrato de D. dichotoma que

naquela ocasião apresentou o máximo teor (7,259 µg g-1 peso seco), agora exibiu o menor

conteúdo (0,320 µg g-1 peso seco). Aliás, os teores de β-caroteno em todas as amostras deste

trabalho foram inferiores aos reportados pelos pesquisadores supracitados. Esta diferença

marcante pode estar relacionada com a estação (chuvosa e seca) e/ou o local da coleta

(Paracuru e Pacheco), respectivamente nos dois casos. De acordo com Ursi et al. (2003), a

95

variação intraespecífica na composição dos pigmentos fotossintéticos pode estar associada à

adaptação genética da espécie, ou seja, a população de uma determinada espécie de alga pode

estar mais adaptada às condições ambientais de uma localidade do que de outra.

Figura 19 - Teores de carotenóides nos extratos de Ochrohyta. (A) β-caroteno e (B) luteína.

D. dichotoma

L. variegata

D. mertensii

S. vulgare

P. gymnospora

S. shoroederii

0 1 2 3

0,371 c

0,375 c

0,995 b

1,690 a

1,705 a

1,744 a

D. dichotoma

L. variegata

D. mertensii

S. vulgare

P. gymnospora

S. schroederi


D. dichotoma

D. mertensii

S. vulgare

L. variegata

P. gymnospora

S. shoroederii

0 1 2 3

0,320 d

0,803 c

1,249 b

1,308 b

2,690 a

2,718 a

D. dichotoma

D. mertensii

S. vulgare

L. variegata

P. gymnospora

S. schroederi



Apesar de a luteína ser um pigmento derivado do α-caroteno não encontrado nas

algas pardas, um composto com características cromatográficas de luteína foi detectado e

quantificado em todos os extratos das Ochrophyta. A identificação baseada nos tempos de

retenção do padrão comercial e do composto considerado luteína nos extratos algáceos, os

(A)

(B)

96

quais não apresentaram diferença estatisticamente significativa (p = 0,1659) (item 4.5.2,

página 87), e na co-cromatografia em que uma quantidade de luteína era adicionada ao extrato

algáceo não suscitou dúvida de que o composto existe e, por esse motivo, foi quantificado. As

concentrações de luteína, em µg g-1 alga seca, variaram de 0,320 ± 0,051 (D. dichotoma) a

2,718 ± 0,238 (S. schroederi) (Figura 19B), valores semelhantes ou superiores aos observados

para o β-caroteno. Ao contrário do observado nos extratos das algas verdes e vermelhas, a

luteína não foi o carotenóide majoritário nas pardas.

É importante destacar que a ausência de α-caroteno em amostras nas quais a

luteína foi quantificada não é uma peculiaridade das algas marinhas. Este perfil pode ser

observado em muitos vegetais e grãos (MAMATHA; SANGEETHA; BASKARAN, 2011).

Nas algas pardas a ocorrência de luteína é pouco reportada na literatura. Ortiz et

al. (2009) quantificaram 0,3 µg luteína g-1 da alga Macrocystis pyrifera desidratada, usando

extrato acetônico particionado em éter de petróleo, cromatografado em coluna semelhante,

fase móvel constituída de metanol:acetonitrila:acetato de etila (20:65:15) com fluxo de 1 mL

min-1 e detecção com arranjo de fotodiodo.

A investigação sobre a ocorrência de luteína nas algas pardas deve ser mais

aprofundada, através de coleta da fração de interresse usando coluna cromatográfica

semipreparativa para posterrior análise por espectrometria de massa.

Foi possível observar que a distribuição dos carotenóides foi bastante

diversificada nas 23 espécies de algas analisadas no presente trabalho e que nem sempre essa

distribuição coincidiu com àquela reportada na literatura.

A distribuição e o teor dos carotenóides nos vegetais, incluindo as algas,

dependem da espécie, estágio de maturação da planta, estágio do ciclo de vida, método de

cultivo, presença de metais, salinidade, qualidade e quantidade de luz, efeitos climáticos,

manipulação na colheita e diferentes partes da planta (CHAKRABORTY; SANTRA;

BHATTACHARYA, 2010; COLLÉN et al., 2003; GODÍNEZ-ORTEGA et al., 2008; HART;

SCOTT, 1995, PINTO et al., 2011).

Como a distribuição das algas marinhas no ambiente ocorre em função das marés,

de acordo com Pires et al. (2008) e Roleda et al. (2010) é bastante razoável aceitar que as

clorófitas sintetizem mais carotenóides, que dentre outras funções desempenham o papel de

proteger o aparato fotossintético contra os danos da fotoxidação, por permanecerem expostas

à radiação solar por períodos mais prolongados, pois habitam predominantemente as zonas de

supra e meso litoral. Pinto et al. (2011) destacaram que os teores de clorofila a e de

carotenóides como β-caroteno, luteína, violaxantina e anteraxantina aumentaram de maneira

97

expressiva em Gracilaria tenuistipitata na presença de metais pesados como cádmio (Cd2+) e

cobre (Cu2+). Possivelmente a síntese desses pigmentos é uma resposta da alga aos efeitos

pró-oxidantes desses metais.

4.5.3 Tocoferóis (α- e δδδδ-tocoferol)

Os tempos de retenção dos padrões de α- e δ-tocoferol obtidos pelo sistema

cromatográfico usado neste trabalho foram iguais a 5,81 ± 0,26 min (n = 28) e 4,80 ± 0,17

min (n = 28), respectivamente. Os tempos de retenção dos compostos considerados α- e δ-

tocoferol detectados nos extratos algáceos foram, respectivamente, 5,83 ± 0,37 min (n = 108)

e 4,88 ± 0,34 min (n = 55).

Os tempos de retenção dos padrãos comerciais (α- e δ-tocoferol) e dos compostos

correspondentes presentes nos extratos algáceos não apresentaram diferença estatisticamente

significativa (p ≥ 0,05). Um cromatograma típico do padrão de α- e δ-tocoferol, contendo

2 µg, está apresentado na Figura 20.

Figura 20 - Cromatograma típico de α- e δ-tocoferol (Sigma) submetidos à saponificação e partição.

98

Existem poucos trabalhos sobre composição e distribuição de tocoferóis em algas

marinhas (PIRES-CAVALCANTE et al., 2011) quando se compara com o grande número de

publicações com vegetais superiores.

Nas algas verdes, os teores de α-tocoferol foram muito variados. Ulva fascita e U.

lactuca não apresentaram α-tocoferol, mas nas demais clorófitas os teores (µg g-1 alga seca)

variaram de 5,770 ± 0,860 em Codium isthmocladum a 163,100 ± 7,200 em Caulerpa

prolifera (Figura 21A). O isômero δ-tocoferol não foi detectado em Ulva nem em C.

prolifera. Ao contrário do observado para o α-tocoferol, a variação nos conteúdos deste

isômero não foi muito elevada, sendo o valor máximo registrado em Caulerpa racemosa

(17,926 ± 0,676) e o mínimo em C. isthmocladum (6,443 ± 0,452) (Figura 21B).

Skinner e Sturm (1968) também não identificaram α-tocoferol em Ulva taeniata.

Entretanto, ele e outros isômeros foram detectados em espécies do gênero Ulva. Sousa (2011)

registrou teores de α-tocoferol (2,524 a 9,621 µg g-1 peso seco) e δ-tocoferol (2,913 a 11,291

µg g-1 peso seco) ao longo de um ano em U. lactuca e U. fasciata, valores inferiores aos

observados nas clorófitas do presente trabalho.

As quantidades destes compostos são variáveis, podendo ser muito baixas como

reportado por Ortiz et al. (2006), apenas 9 mg α-tocoferol por quilograma de Ulva lactuca

desidratada, mas aproximadamente 25 mg kg-1 para γ- e δ-tocoferol, que foram majoritários;

ou bastante expressivas (19,7 mg kg-1 peso seco) como observado por Taboada, Millán e

Míguez (2010) em U. rigida.

Jensen (1969) quantificou α-tocoferol em U. lactuca e Enteromorpha intestinalis

35 e 92 mg kg-1 peso seco, respectivamente. Esses valores foram inferiores aos observados em

Caulerpa prolifera e C. sertularioides no presente trabalho.

A presença dos isômeros α-, β-, γ- e δ-tocoferol foi reportada por Miyashita e

Takagi (1987) nas espécies Chaetomorpha moniligera, Enteromorpha prolifera e U. pertusa.

α-Tocoferol foi o composto majoritário contribuindo com até 95% dos tocoferóis totais, com

teores entre 0,06 e 0,14 µg g-1 peso fresco. δ-Tocoferol variou de 0,003 a 0,009 µg g-1 peso

fresco, correspondendo de 2% a 11% do total. Se os resultados referidos acima tivessem sido

expressos em peso seco, os teores de α- e δ-tocoferol seriam muito inferiores aos

quantificados nas clorófitas do presente trabalho.

Pires-Cavalcante et al. (2011) acompanharam a variação sazonal de α-tocoferol

em espécies do gênero Caulerpa. α-Tocoferol não foi detectado em C. racemosa coletada no

mês de março. Os menores conteúdos anuais (22,37 a 138,44 µg g-1 peso seco) foram

semelhantes aos observados nas Caulerpa analisadas no presente trabalho. Mantanjun et al.

99

(2009) investigaram o conteúdo de α-tocoferol em C. lentillifera cujo teor (8,41 mg 100 g-1

peso seco) foi inferior aos determinados em C. prolifera e C. sertularioides do presente

estudo.

Figura 21 - Teores de tocoferóis nos extratos de Chlorophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.

C. isthmocladum

C. racemosa

C. cupressoides

C. sertularioides

C. prolifera

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

5,770 d

6,018 d

20,363 c

100,397 b

163,100 a

C. isthmocladum

C. racemosa

C. cupressoides

C. sertularioides

C. prolifera

µg α-tocoferol g-1 alga seca

C. isthmocladum

C. sertularioides

C. cupressoides

C. racemosa

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

6,443 d

10,714 c

14,140 b

17,926 a

C. isthmocladum

C. sertularioides

C. cupressoides

C. racemosa

µg δ-tocoferol g-1 alga seca


No trabalho de Ortiz et al. (2009) a alga verde Codium fragile apresentou como

tocol majoritário o δ-tocoferol (677,8 µg g-1 lipídio o que equivale a 10,2 µg g-1 alga seca).

Entretanto esse teor foi inferior àqueles observados na maioria das algas verdes do presente

trabalho que apresentaram esse composto. O teor de α-tocoferol (453,5 µg g-1 lipídio = 6,8 µg

(A)

(B)

100

g-1 alga seca) foi inferior aos de Caulerpa prolifera, C. sertularioides e C. cupressoides e

semelhante aos de C. racemosa e Codium isthmocladum do presente estudo. Além de α- e δ-

tocoferol também foram quantificados γ-tocoferol e seu isômero tocotrienol.

Nas algas vermelhas analisadas no presente trabalho a presença de α-tocoferol foi

detectada em todos os extratos. Os maiores teores (µg g-1 alga seca) foram quantificados em

Cryptonemia luxurians (51,985 ± 1,737), Amansia multifida (16,731 ± 1,402) e Hypnea

musciformis (10,812 ± 0,672). Nos demais extratos as concentrações ficaram ente 0,885 ±

0,011 (Pterocladia americana) e 5,718 ± 0,794 (Cryptonemia crenulata) (Figura 22A). Por

sua vez, δ-tocoferol (µg g-1 alga seca) foi detectado em apenas quatro das dez rodófitas

analisadas, com variação de 1,148 ± 0,070 (A. multifida) a 1,832 ± 0,164 (Gracilaria ferox)

(Figura 22B).

Jensen (1969) investigou a ocorrência de tocoferóis em sete espécies de algas

vermelhas. Os teores de α-tocoferol variaram de 17 a 80 mg kg-1, sendo semelhantes ou

inferiores aos das espécies C. luxurians, A. multifida e H. musciformis analisadas no presente

trabalho. Os resultados observados por Wen et al. (2006) em Gracilaria lemaneiformis (1,02

mg 100 g-1 peso seco) e Porphyra yezoensis (1,72 mg 100 g-1 peso seco) foram semelhantes

aos determinados em A. multifida e H. musciformis, porém três e cinco vezes inferiores aos

encontrados em C. luxurians do presente trabalho, que por sua vez, foi similar ao de

Eucheuma cottonii (5,85 mg 100 g-1 peso seco) (MATANJUN et al., 2009).

Nas espécies de algas vermelhas japonesas analisadas por Miyashita e Takagi

(1987), α-tocoferol foi o composto majoritário contribuindo com 66% a 99% dos tocoferóis

totais, com concentrações variando de 0,033 a 2,186 µg g-1 peso fresco. δ-Tocoferol foi

detectado apenas em Carpopeltis flabellata (0,0076 µg g-1 peso fresco) e Neodilsea yendoana

(0,0024 µg g-1 peso fresco), correspondendo, respectivamente, a 15% e 12% dos tocoferóis

totais. Os isômeros β- e γ-tocoferol foram quantificados em praticamente todas as espécies,

entretanto em baixas concentrações (0,4% a 9,7% dos tocoferóis totais). Para efeito de

comparação, se os teores de α- e δ-tocoferol fossem expressos em base seca, eles seriam

muitas vezes inferiores aos observados nas algas vermelhas do presente trabalho.

Skinner e Sturm (1968) não detectaram α-tocoferol nas rodófitas Gigartina

corymbifera e Drionitis lanciolata. A presença desse tocoferol também não foi reportada em

40% das espécies de rodófitas estudadas por Sousa et al. (2008), dentre as quais Botryocladia

occidentalis e H. musciformis, ambas analisadas no presente trabalho que apresentaram

conteúdo considerável. Entretanto, em Gracilaria chilensis α-tocoferol foi o isômero

101

majoritário (86,6 µg g-1 lipídio = 1,12 µg g-1 alga seca), não tendo sido detectada a ocorrência

de δ-tocoferol (ORTIZ et al., 2009).

Figura 22 - Teores de tocoferóis nos extratos de Rhodophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.

P. americana

G. domingensis

G. ferox

B. occidentalis

B. triquetrum

B. seaforthii

C. crenulata

H. musciformis

A. multifida

C. luxurians

--

0 20 40 60

0,885 f

1,825 f

2,667 f

3,987 de

5,005 d

5,085 d

5,718 d

10,812 c

16,731 b

51,985 a

G. ferox

P. americana

G. domingensis

B. occidentalis

B. triquetrum

B. seaforthii

C. crenulata

H. musciformis

A. multifida

C. luxurians


A. multifida

C. crenulata

C. luxurians

G. ferox

0 20 40 60

1,148 c

1,261 bc

1,413 b

1,832 a

A. multifida

C. crenulata

C. luxurians

G. ferox



Os teores de tocoferóis, expressos em µg g-1 alga seca, nos extratos das algas

pardas analisadas no presente trabalho estão apresentados na Figura 23. Todos os extratos

apresentaram α-tocoferol, cujos máximo e mínimo foram detectados em Padina gymnospora

(20,385 ± 3,408) e Lobophora variegata (0,784 ± 0,098), respectivamente. Nos outros

extratos os conteúdos permaneceram entre 4,013 e 5,363 (Figura 23A). δ-Tocoferol foi

(A)

(B)

102

detectado em três espécies: Spatoglossum schroederi (6,608 ± 0,313), Dictyota mertensii

(2,618 ± 0,298) e D. dichotoma (2,453 ± 0,721) (Figura 23B).

Figura 23 - Teores de tocoferóis nos extratos de Ochrophyta. (A) α-tocoferol e (B) δ-tocoferol.

L. variegata

D. dichotoma

D. mertensii

S. shoroederii

S.vulgare

P. gymnospora

0 10 20 30

0,785 c

4,013 bc

4,360 bc

4,501 b

5,363 b

20,385 a

L. variegata

D. dichotoma

D. mertensii

S. schroederi

S. vulgare

P. gymnospora


D. dichotoma

D. mertensii

S. shoroederii

0 10 20 30

2,453 b

2,618 b

6,608 a

D. dichotoma

D. mertensii

S. schroederi



De um modo geral, nas espécies em que ambos os isômeros foram detectados,

houve predominância de α-tocoferol, o que está de acordo com Sánchez-Machado, López-

Hernández e Paseiro-Losada (2002) que afirmaram ser este o principal isômero das algas

pardas. Sousa et al. (2008) também reportaram a ocorrência dele nas ocrófitas inclusive em

espécies que foram também investigadas no presente trabalho como D. dichotoma, L.

(A)

(B)

103

variegata e P. gymnospora. Esta última apresentou a maior concentração, que foi semelhante

à observada na Laminaria japonica (1,72 mg 100 g-1 peso seco) analisada por Wen et al.

(2006), porém superior aos teores de Macrocystis integrifolia (12,2 µg g-1 peso seco) e Fucus

distichus (11,1 µg g-1 peso seco) estudadas por Skinner e Sturm (1968). Todos os outros

extratos de ocrófitas analisados no presente trabalho apresentaram concentrações de

α-tocoferol inferiores às exibidas por M. integrifolia e F. distichus.

MacArtain et al. (2007) determinaram os teores de vitamina E de várias espécies

de algas pardas consumidas na Ásia e expressaram seus resultados em porções de 8 g de alga

desidratada. O teor em Ascophyllum nodosum (0,029 mg) foi inferior a praticamente todas as

ocrófitas analisadas no presente trabalho, entretanto em Laminaria digitata (0,275 mg) e

Undaria pinnatifida (1,392 mg) as concentrações foram muito superiores.

Vários tocóis foram quantificados em Macrocystis pyrifera por Ortiz et al. (2009).

α-Tocoferol foi o composto majoritário, seguido por γ-tocoferol e β- e δ-tocoferol que

apresentaram teores similares. O conteúdo do primeiro foi superior a todos os encontrados nas

algas pardas analisadas no presente trabalho com exceção de P. gymnospora, enquanto o do

último foi inferior.

Assim como observado com relação ao conteúdo de carotenóides das algas, a

variabilidade dos tocoferóis também foi muito marcante e, além de ser uma particularidade da

espécie, depende também de fatores ambientais (DURMAZ et al., 2007; 2009), que se

modificam com a estação do ano. Collén e Davison (2001) avaliaram a sazonalidade dos

tocoferóis em Fucus vesiculosus, tendo identificado todos os isômeros com conteúdos

variados em todas as estações, mas independentemente da estação, o α-tocoferol foi o

composto majoritário.

Da mesma forma α-tocoferol foi predominante em algas pardas japonesas

chegando a representar mais de 90% dos tocoferóis totais. δ-Tocoferol foi identificado em

todas as espécies, com exceção de U. pinnatifida, sendo expressivo em Analipus japonicus e

Pelvetia wrightii contribuindo com mais de 42% dos tocoferóis. Nas espécies A. japonicus e

Hizikia fusiformis, a variação sazonal nos conteúdos de tocoferóis foi avaliada e atribuída às

mudanças ocorridas nos parâmetros ambientais como temperatura da água e luz. Nos meses

em que a temperatura da água e a luminosidade foram mais elevadas foi possível observar os

teores máximos (MIYASHITA; TAKAGI, 1987).

No trabalho de Hernández-Carmona et al. (2009) Eisenia arborea exibiu teores de

α-tocoferol também variáveis ao longo do ano, de 0,9 a 9,6 mg 100 g-1. Apenas o teor mínimo

foi semelhante aos determinados nas algas pardas no presente trabalho. Jensen (1969)

104

observou a ocorrência de α-, β-, γ- e δ-tocoferol nas algas pardas (A. nodosum, Fucus

serratus, F. spiralis, F. vesiculosus e Pelvetia canaliculata). As concentrações de α- e δ-

tocoferol, mg kg-1 peso seco, foram bastante expressivas com teores variando de 80 a 220 e de

110 a 320, respectivamente. Alaria esculenta, Laminaria hyperborea, L. digitata e L.

saccharina apresentaram apenas α-tocoferol e com teores variando de 9 a 30. Esses teores

foram superiores ou semelhantes aos das ocrófitas do presente estudo.

Outros fatores podem ser determinantes quanto à distribuição da vitamina E nas

algas. Por exemplo, os isômeros de tocoferol e tocotrienol em Durvilleae antarctica foram

encontrados em quantidades diferentes dependendo da porção analisada, sendo α-tocoferol

mais abundante na parte basal onde nenhum δ-tocoferol foi detectado. Os teores de α-

tocoferol (179,4 a 258,0) e δ-tocoferol (245,9), ambos expressos em mg kg-1 lipídio em base

seca (ORTIZ et al., 2006) foram superiores aos das algas pardas do presente trabalho.

O processamento adotado também pode influenciar nos teores de vitamina E.

Sánchez-Machado, López-Hernández e Paseiro-Losada (2002) determinaram α-tocoferol,

µg g-1 peso seco, em algas pardas submetidas a diferentes tratamentos térmicos. Himanthalia

elongata e Laminaria ochroleuca desidratadas a 45°C por 24 h e Saccorhiza polychides e H.

elongata enlatadas e aquecidas a 112°C por 40 min apresentaram teores iguais a 33,3 ± 4,2,

8,9 ± 2,1, 5,7 ± 1,3 e 12,0 ± 2,0, respectivamente. A diferença entre as amostras de H.

elongata desidratada a 45°C por 24 h e esterilizada comercialmente a 112°C por 40 min foi

atribuída às condições do processamento, variação sazonal e/ou variação entre os locais de

coleta. De um modo geral, estas quantidades foram semelhantes àquelas mensuradas nas algas

pardas do presente trabalho, com exceção de δ-tocoferol em L. ochroleuca (8,9 µg g-1 peso) e

H. elongata (33,4 µg g-1 peso) que foram superiores.

Le Tutour et al. (1998) também quantificaram os isômeros α-, γ- e δ-tocoferol em

ocrófitas desidratadas, com umidade inferior a 10%, coletadas em diferentes estações do ano.

Laminaria digitata, Himanthalia elongata, Fucus vesiculus, F. serratus e Ascophyllum

nodosum apresentaram predominância de α-tocoferol. Na amostra de L. digitata coletada no

inverno nenhum isômero foi observado, mas naquela do verão foram detectados α- e γ-

tocoferol. O teor de α-tocoferol em L. digitata foi semelhante aos encontrados em todas as

algas pardas analisadas no presente trabalho, enquanto as quantidades de α- e δ-tocoferol em

F. vesiculus, F. serratus e A. nodosum foram várias vezes superiores. Resultados desta

natureza levam à suposição de que a ausência de isômeros de tocoferóis nas algas estudadas

não está necessariamente associada ao fato de elas não serem capazes de sintetizá-los, mas

sim devido a algum fator ambiental que inviabilizou ou não propiciou sua síntese.

105

Burtin (2003) elegeu as algas pardas como as melhores fontes de vitamina E,

observação feita também por Matanjun et al. (2009) e Miyashita e Takagi (1987). Entretanto,

no presente trabalho, assim como no trabalho de Sousa et al. (2008), os teores de α-tocoferol

nas algas verdes foram maiores do que nas vermelhas e pardas.

106

5 CONCLUSÃO

As 23 espécies de macroalgas marinhas do litoral cearense analisadas no presente

trabalho apresentaram expressiva atividade antioxidante, muitas vezes até superior àquelas

exibidas pelos produtos sintéticos. Entretanto, essa atividade foi distinta entre os filos

Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta. As algas verdes apresentaram maior atividade

antioxidante no sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, as vermelhas foram mais efetivas

na quelação do íon ferroso e as pardas exibiram maior capacidade para sequestrar o radical

DPPH, maior poder de redução do ferro e maior conteúdo de compostos fenólicos.

O conteúdo de compostos fenólicos foi o principal responsável pelas atividades de

sequestro do radical DPPH, poder de redução do ferro e quelação de íon ferroso nas algas

verdes e vermelhas. Nas algas pardas esses compostos só influenciaram na redução do ferro;

as demais atividades provavelmente são resultantes da presença de outros compostos como

pigmentos, polissacarídeos e/ou proteínas.

Muitas classes de metabólitos fenólicos com relevante atividade antioxidante

parecem ocorrer nas 23 espécies de macroalgas marinhas analisadas. Os fenóis foram

encontrados apenas nas algas pardas. Antocianinas, antocianidinas, chaconas, auronas e

leucoantocianidinas foram encontradas em algumas espécies de algas vermelhas. Taninos,

flavonas, flavonóis, xantonas, catequinas, flavanonas e flavanonóis foram observados nos

filos Chlorophyta, Rhodophyta e Ochrophyta, com exceção da última classe que não foi

detectada nas algas verdes.

Além dos compostos fenólicos, as macroalgas marinhas foram também boas

fontes de outras moléculas com atividade antioxidante como luteína, α- e β-caroteno, sendo o

primeiro majoritário nas espécies verdes e vermelhas, e vitamina E (α- e δ-tocoferol), sendo o

isômero α-, o mais abundante nas 23 espécies analisadas.

Diante das atividades exibidas pelos extratos algáceos e dos conteúdos dos

compostos fenólicos, carotenóides e vitamina E presentes nas espécies analisadas é possível

afirmar que as macroalgas marinhas do litoral cearense apresentam grande potencial para

exploração de compostos bioativos com atividade antioxidante.

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KELMA MARIA DOS SANTOS PIRES CAVALCANTE …laboratório para que eu pudesse terminar as análises, quando pensei que não pudesse mais ... superiores aos controles positivos (quercetina,