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KÁRIS ESTER DONG CRESTE

ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DA BRADICININA NOS PROCESSOS DE APRENDIZAGEM, CONSOLIDAÇÃO E

EVOCAÇÃO DA MEMÓRIA EM RATOS.

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de Doutora em Ciências da Saúde.

SÃO PAULO 2015

KÁRIS ESTER DONG CRESTE

ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DA BRADICININA NOS PROCESSOS DE APRENDIZAGEM, CONSOLIDAÇÃO E

EVOCAÇÃO DA MEMÓRIA EM RATOS.

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de Doutora em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da

Saúde Orientador: Hudson de Sousa Buck

SÃO PAULO 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Dong-Creste, Káris Ester Estudo do envolvimento da bradicinina nos processos de aprendizagem, consolidação e evocação da memoria em ratos./ Káris Ester Dong-Creste. São Paulo, 2015.

Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Hudson de Sousa Buck 1.Bradicinina 2. Receptor B1 de bradicinina 3. Receptor B2 de

bradicinina 4. Transtornos da memória 5. Transtornos cognitivos BC-FCMSCSP/81-15

DEDICATÓRIA

Dedico esse trabalho a quem olho firmemente, o Autor e Consumador da minha fé, aquele que em troca da alegria que lhe estava proposta, suportou a cruz, não fazendo caso da ignomínia, e está assentado à destra de Deus - Jesus. (Hebreus 12:2)

Aos meus pais, os quais sempre disseram: “Filho meu, atenta para as minhas palavras; aos meus ensinamentos inclina os ouvidos. Não os deixes apartar-se dos teus olhos; guarda-os no mais íntimo do teu coração. Porque são vida para quem os acha e saúde, para o seu corpo”. (Provérbios 4:20-22)

Ao marido, “irmão meu e companheiro na tribulação, no reino e na perseverança, em Jesus”. (Apocalipse 1:9)

PARA REFLETIR

Alegrar-se sempre em Jesus

Para onde olhar? Você já notou que, quando olhamos para qualquer coisa ou lugar, rapidamente chegam a nós pensamentos relacionados àquilo para onde direcionamos nosso olhar? Já notou também que o tipo de pensamento que temos gera uma onda de emoção? Os pensamentos trazem consigo emoções. Então o lugar para onde você está olhando faz toda a diferença.

Quando o povo de Israel estava no deserto, cercado por todos os lados por inimigos, o Senhor o orientou a que colocasse as tropas voltadas para o tarbenáculo, onde estava a presença de Deus. Foi somente quando Abraão tirou os olhos da idosa e estéril Sara, sua esposa, e resolveu olhar para o Deus dos impossíveis, é que ela pôde gerar Isaque, o filho da promessa. Quando Davi deixava de olhar para seus muitos inimigos e elevava os olhos para o monte é quese sentia forte e seguro na batalha.

Para onde você está olhando? Não olhe para o poder de faraó, olhe para Deus; não olhe para o deserto, mas para Canaã; não olhe para os gigantes, mas veja-os como pão; não olhe para o pecado, mas para o sangue do Cordeiro que tira o pecado do mundo; não olhe para as coisas que estão debaixo do sol, olhe para as coisas lá do alto; não olhe para a vaidade, mas para a realidade; não olhe para as ovelhas dispersas, mas olhe para o Pastor; não olhe para o vale de ossos secos, e sim para o Espírito de Deus, que pode dar vida; não olhe para a fornalha ardente ou para a cova cheia de leões, mas olhe para o Altíssimo, que tem domínio sobre o reino dos homens.

Quando o apóstolo Paulo foi preso junto com Silas, em Filipos, em vez de olhar para as cadeias ou para o algoz que o açoitava, resolveu orar e cantar louvores a seu Deus. O resultado é que o Senhor produziu um grande terremoto que fez os alicerces da prisão tremer e as cadeias se romper. Quando, anos mais tarde, Paulo voltou à prisão, dessa vez em Roma, escreveu uma carta que é uma das mais belas, não somente da Bíblia, mas de toda literatura cristã – Filipenses. Se não conhecêssemos o contexto da carta, seríamos levados a imaginar que ele a escreveu no jardim do Éden. Mas, para espanto de todos nós, ele a escreveu de uma prisão.

Vejamos um trecho da carta: “Alegrai-vos sempre no Senhor; outra vez digo: alegrai-vos. Seja a vossa moderação conhecida de todos os homens. Perto está o Senhor. Não andeis ansiosos de coisa alguma; em tudo, porém, sejam conhecidas, diante de Deus, as vossas petições, pela oração e pela súplica, com ações de graças. E a paz de Deus, que excede todo o entendimento, guardará o vosso coração e a vossa mente em Cristo Jesus” (4:4-7).

O segredo de Paulo era simples: não olhava para as circunstâncias nem para os problemas ou para pessoas à volta. O olhar de Paulo era positivo, otimista, cheio de fé e alegre.

Que essa leitura possa ajudar você a ver as coisas por outro ângulo, o que redundará em muita alegria!

Texto extraído do Jornal Árvore da Vida – Ano 26 – Número 276

AGRADECIMENTOS

Agradeço à Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP), na qual fui formada fonoaudióloga.

A Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP).

Ao Departamento de Ciências Fisiológicas, onde pude desenvolver o trabalho.

Agradeço as Instituições de fomento à pesquisa: CAPES, CNPq e FAPESP e FAP- Santa Casa.

Agradeço ao prof. Dr. Hudson de Sousa Buck, atual chefe do Departamento

de Ciências Fisiológicas, orientador que depositou fé em mim desde o primeiro ano de graduação e ainda acredita na minha competência. Muito obrigada!

Agradeço à profa. Dra. Tânia Araújo Viel pelo imenso carinho, por me

ensinar muitas coisas com paciência. Muito obrigada! Agradeço à Célia, secretária do Departamento de Ciências Fisiológicas, pelo

bom divertimento nos dias tumultuosos e por toda assistência. Agradeço ao Sr. Martinho pelo cuidado com os animais.

Agradeço à Secretaria de Pós-Graduação, Mirtes Souza, Sônia Alves, Daniel Gomes, Daniella Rossette e Priscile Foster por todo apoio e cobrança. Agradeço a colaboração e carinho de todos os professores do Departamento de Ciências Fisiológicas e por acompanharem meu amadurecimento desde o primeiro ano da graduação. Agradeço aos animais por se sacrificarem para que esse trabalho pudesse vir a existir. Agradeço à prof. Dra. Kátia de Almeida, Géssi e Mariana por sempre me acolherem durante esse período e sempre me incentivarem.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, “pois Ele falou e tudo se fez; ele ordenou, e tudo passou a existir”. (Salmos 33:9) e “fiel é esta palavra: Se já morremos com ele, também viveremos com ele; se perseveramos com ele reinaremos; se o negamos, ele, por sua vez, nos negará; se somos infiéis, ele permanece fiel, pois de maneira nenhuma pode negar-se a si mesmo” (2 Timóteo 2:11-13) Aos meus pais, André e Maria, “porque conheceis aquele que existe desde o princípio” (1 João 2:13a) e que me disseram: “Guarda o bom depósito, mediante o Espírito Santo que habita em nós” (1 Timóteo 1:14). Com muito amor, eles não perderam a esperança que haviam depositado em mim, mesmo com muita dificuldade escolar, sempre me incentivaram a prosseguir. Não tenho palavras para descrever minha gratidão. Ao marido, Lucas, “sede firme, inabalável e sempre abundante na obra do Senhor, sabendo que, no Senhor, o seu serviço não é vão” (1 Coríntios 15:58). À minha sogra, Damaris, que “tende por todo motivo de toda alegria o passardes por várias provações, sabendo que a provação da vossa fé, uma vez confirmada, produz perseverança”. (Tiago 1:2-3). Ela sabe a importância do seu companheirismo para comigo!

Aos meus irmãos, Timóteo, Sophia, Pâmela, Pedro, Marina, Celso e Lívia; e aos meus sobrinhos, Felipe e Laís “e, assim, habite Cristo no vosso coração, pela fé, estando vós arraigados e alicerçados em amor, a fim de poderdes compreender, com todos os santos, qual é a largura, e o comprimento, e a altura, e a profundidade e conhecer o amor de Cristo, que excede todo entendimento, para que sejais tomados de toda a plenitude de Deus”. (Efésios 3:17-19). Obrigada por todo carinho e divertimento!

Ao Dong Yu Lan, meu querido avô, “servo de Cristo Jesus, o qual se esforça sobremaneira, continuamente, por vós nas orações, para que vos conserveis perfeitos e plenamente convictos em toda a vontade de Deus”. (Colossenses 4:12).

À família Dong, família Eimori, família Stringueta Machado e extensões

(hehe) por todas as orações e carinho. “Porque dele e por meio dele, e para ele são todas as coisas. A ele, pois, a glória eternamente. Amém” (Romanos 11:36).

AGRADECIMENTOS Aos meus queridos amigos-irmãos, Paula, Rafael e João “dou graças ao meu

Deus por tudo que recordo de vós, fazendo sempre, com alegria, súplicas por todos vós, em todas as minhas orações, pela vossa cooperação no evangelho, desde o primeiro dia até agora. Estou plenamente certo de que aquele que começou boa obra em vós há de completa-la até ao Dia de Cristo Jesus” (Filipenses 1:3-6). E “em todo tempo ama o amigo, e na angústia se faz o irmão” (Provérbios 17:17).

Aos meus amados irmãos em Cristo, Leyla, Douglas, Luísa, Pablo, Eliana

B., Henri, Amarita, Américo, Américo Filho, família Caruso, Priscila e Eliza “e tudo quanto pedirdes em oração, crendo, recebereis (Mateus 21:22), “por isso, recebendo nós um reino inabalável, retenhamos a graça, pela qual sirvamos a Deus de modo agradável, com reverência e santo termor” (Hebreus 12:28).

Quero agradecer aos colegas, amigos, companheiros de todos os momentos

excelentes, bons, ruins, engraçados, de traquinagem e de comilança; Ariadiny, pelos papos durante o treinamento de ratos na esteira, pelos papos da bradicinina, dos receptores B1 e B2 que por muito tempo foi um ponto de interrogação na minha mente. Obrigada por todo apoio e amizade. Marielza, amiga-mãe, uma senhora que é mais entendida em tecnologia que eu, obrigada por toda ajuda nos momentos de aflição e por estar sempre disposta. Marília, uma pessoa extremamente querida, uma pseudo-psicóloga que ouve e incentiva, ajuda a enfrentar a dificuldade ao lado de quem precisa, no caso, eu! Obrigada por tudo! Milena, mãe da Giovanna, sempre presente com seu jeito de pensar e também deixando o ambiente ficar mais leve e engraçado. Natália sempre me ajudando com as bases farmacológicas, com as dúvidas incessantes! Uma grande amiga para passar o dia rindo e conversando. Obrigada por todos os momentos! Ticiana, companheira nessa jornada, obrigada pelo apoio nos momentos de alegria e tribulações, e claro, por muitas e muitas vezes deixar de fazer as próprias coisas para me ajudar nos experimentos! Obrigada mesmo! Laura, Nelson e Márcia, se vocês não fizessem parte do grupo não teria sido o mesmo! Obrigada por toda diversão! “Se, porém, algum de vós necessita de sabedoria, peça-a a Deus, que a todos dá liberalmente e nada lhes impropera; e ser-lhe-á concedida. Peça-a, porém, com fé, em nada duvidando; pois o que duvida é semelhante à onda do mar, impelida e agitada pelo vento” (Tiago 1:5-6).

SIGLAS E ABREVIATURAS AC – Adenilato ciclase APP – Proteína precursora amilóide humana AVC – Acidente vascular cerebral Aβ – Peptídeo β-amilóide BK – Bradicinina CA – Cornu Ammonis CEUA – Comitê de Ética na Utilização de Animais DA – Doença de Alzheimer DAG – Diacil glicerol des-Arg10-HOE140 – Antagonista B1 des-Arg9-BK – Agonista B1 DG – Giro denteado EC – Córtex entorrinal ECA – enzima conversora de angiotensina eNOS – Óxido nítrico-sintase endotelial HOE140 – antagonista B2 IL-1β – Interleucina 1β IL-6 – interleucina 6 IP3 – Trifosfato de inositol KD – Calidina koB1 – Animais com deleção gênica do receptor B1 koB2 – Animais com deleção gênica do receptor B2 LCR – Líquido cefalorraquidiano artificial LTP – Potenciação de longa duração MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno MCD – Memória de curta-duração MLD – Memória de longa-duração NG291 – Agonista B2 NO - Óxido nítrico PKA - Proteína quinase dependente de AMPc PKC - Proteína quinase C PLA - Fosfolipase A PLCβ - Fosfolipase Cβ SA – Sessão de aquisição SCC – Sistema calicreína-cininas SNC – Sistema nervoso central ST – Sessão de teste TCE – Traumatismo cranioencefálico TNFα – Fator de necrose tumoral α WT – Animais selvagens

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1

1.1 Sistema calicreína-cinina .................................................................................. 1

1.2 Receptores para cininas e vias de sinalização .................................................. 2

1.3 Sistema calicreína-cininas no Sistema Nervoso Central ................................... 5

1.4. Participação das cininas nos processos de memória ....................................... 7

1.5 Aprendizagem e memória ................................................................................. 9

1.6 Estruturas neurais relacionadas à memória .................................................... 10

1.7 Mecanismos moleculares envolvidos na consolidação da memória ................ 13

1.8 Justificativa ..................................................................................................... 13

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 16

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 17

3.1 Aprovação....................................................................................................... 17

3.2 Animais utilizados ........................................................................................... 17

3.3 Implante das cânulas-guia .............................................................................. 18

3.4 Avaliação da atividade motora dos animais .................................................... 19

3.5 Esquiva inibitória e avaliação dos processos cognitivos ................................. 20

3.6 Agonistas e antagonistas dos receptores B1 e B2 .......................................... 21

3.7 Injeção aguda de agonistas e antagonistas dos receptores B1 e B2 para bradicinina ............................................................................................................ 22

3.8 Imunofluorescência para marcação do receptor B1 ........................................ 23

3.9 Análise estatística ........................................................................................... 25

4. RESULTADOS ..................................................................................................... 26

4.1 Avaliação da atividade motora dos animais .................................................... 26

4.2 Avaliação do efeito da BK na aprendizagem ................................................... 26

4.3 Avaliação do efeito da BK na consolidação da MCD ....................................... 27

4.4 Avaliação do efeito da BK na consolidação da MLD ....................................... 28

4.5 Avaliação do efeito da BK na evocação da memória ...................................... 29

4.6 Avaliação do bloqueio do receptor B1 na consolidação da MCD .................... 30

4.7 Avaliação do bloqueio do receptor B2 na consolidação da MCD .................... 31

4.8 Avaliação do efeito do agonista B2 bioestável NG291 na consolidação da MCD ............................................................................................................................. 32

4.9 Avaliação da resposta dependente de concentração de agonista na consolidação da MCD ........................................................................................... 33

4.10 Avaliação da resposta dependente de concentração de agonista na consolidação da MLD ........................................................................................... 36

4.11 Imunofluorescência para o receptor B1 ......................................................... 38

5. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 42

6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 50

7. ANEXO ................................................................................................................ 51

8. REFERÊNCIAS.................................................................................................... 52

RESUMO ................................................................................................................. 64

ABSTRACT .............................................................................................................. 65

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Sistema calicreína-cinina

O sistema calicreína-cininas (SCC) é composto pelos cininogênios de alto ou

baixo peso molecular, que quando clivados pelas serino-proteases conhecidas como

calicreínas, dão origem às cininas que são peptídeos de cadeia curta contendo de 9

a 11 aminoácidos (Rocha e Silva, 1970 e Regoli & Barabé, 1980). A clivagem do

cininogênio de alto peso molecular (120 kDa) pela calicreína plasmática origina uma

das mais importantes cininas, a bradicinina (BK), que se encontra aumentada em

processos inflamatórios. A calicreína tecidual ativada por lesão, infecção ou

inflamação age sobre o cininogênio de baixo peso molecular (66 kDa), dando origem

a calidina (KD), a partir da qual a BK também pode ser gerada após ação da

arginina aminopeptidase (Bhoola et al., 1992 e Werle et al., 1961). A BK e KD

possuem forte afinidade pelo receptor B2.

As cininas são rapidamente metabolizadas, possuem meia-vida plasmática

curta, de aproximadamente 15 segundos, e as concentrações circulantes são

relativamente baixas (0.2 - 7.1pM) (Marketou & Vardas, 2012). Sua degradação

ocorre por meio das cininases. A cininase I é representada pelas enzimas

carboxipeptidase N (plasma) e carboxipeptidase M (membrana) que removem o

aminoácido arginina da porção C-terminal das moléculas de BK e KD, convertendo-

as nos metabólitos ativos des-Arg9-BK e des-Arg10-KD, respectivamente, que

possuem maior afinidade pelo receptor B1 (Bhoola et al., 1992). A cininase II,

também conhecida como enzima conversora de angiotensina (ECA) (Erdös, 1977),

age sobre as cininas ativas clivando o dipeptídeo da porção C-terminal abolindo

completamente a atividade biológica das cininas (Sheikh & Kaplan, 1986 e Kuoppala

et al., 2000). Age, também, sobre a angiotensina I removendo da mesma maneira o

2

dipeptídio da porção carboxiterminal e convertendo-a em angiotensina II (Erdös &

Skidgel, 1987) (Figura 1).

Figura 1- Representação esquemática da biossíntese e metabolismo das cininas. O cininogênio é clivado pelas calicreínas dando origem às cininas, bradicinina e calidina. Estas, por sua vez, são clivadas pela cininase I e II, originando os metabólitos des-Arg9-BK BK (1-7), des-Arg10-KD e KD (1-8) (Adaptado de Kakoki & Smithies, 2005).

1.2 Receptores para cininas e vias de sinalização

As cininas agem em dois receptores, B1 e B2, acoplados à proteína G. Esses

receptores apresentam 36% de homologia entre si na sequência de aminoácidos,

porém, suas vias de sinalização são muito semelhantes (Liebmann & Böhmer, 2000

e Liebmann, 2001).

O receptor B1 caracteriza-se por apresentar maior afinidade pelos metabólitos

da cininase I (des-Arg9-BK e des-Arg10-KD), e é expresso constitutivamente em

3

densidades muito baixas, na maioria dos tecidos (Prado et al., 2002). A ativação do

receptor B1 pela interação com seu agonista seletivo leva à fosforilação da proteína

G, desencadeando sua via de sinalização. Sua expressão é rapidamente aumentada

em situações de inflamação, lesão, câncer, citocinas e outros. Quando a interação

entre agonista e receptor não ocorre, ou seja, em condições basais, há a

internalização do receptor por endocitose dependente de clatrina. A ligação do

agonista com o receptor B1 inibe o processo de internalização e consequentemente

reduz o grau de reciclagem espontânea do receptor da membrana celular

diminuindo, assim, a sua degradação. (Enquist et al., 2007 e Ehrenfeld et al., 2012).

O receptor B2, por sua maior afinidade pela BK (Regoli et al., 1998), medeia

grande parte das ações das cininas. Esse receptor é estável na ausência de seu

agonista, mas é rapidamente dessensibilizado após a estimulação por seu ligante, o

que acontece pelo mecanismo de internalização e reciclagem (Enquist et al., 2007).

As vias de sinalização dos receptores B1 e B2 ocorrem pela ativação da

proteína G, preferencialmente pelo acoplamento das famílias Gα i e Gαq (Austin et

al., 1997 e Regoli et al., 2001). A ativação da Gαqleva à clivagem da fosfolipase Cβ

(PLCβ) em diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3), que conduzem à ativação

da proteína quinase C (PKC) e ao aumento de cálcio intracelular, (Tropea et al.,

1993, Mathis et al., 1996 e Ehrenfeld et al., 2012). Também ocorre a liberação de

ácido araquidônico pela estimulação da fosfolipase A2 (PLA2), produção de

prostaglandinas, ativação da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e produção de

óxido nítrico (NO) (Leeb-Lundberg et al., 2005 e Ehrenfeld et al., 2012). Pela Gα i, há

a inibição da adenilil ciclase (AC), levando à estimulação de vias das proteínas

quinases ativadas por mitógenos (MAPK) (Leeb-Lundberg, 2004).

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Embora as vias de sinalização sejam aparentemente idênticas, a cinética do

aumento de cálcio intracelular é distinta entre a ativação desses receptores (Tropea

et al., 1993; Marsh & Hill, 1994 e Mathis et al., 1996). O aumento de cálcio

intracelular pela estimulação do receptor B1 depende significativamente do influxo

de cálcio extracelular, que ocorre através de canais catiônicos não seletivos (Zhou et

al., 2000). Além disso, ocorre maior formação de IP3, consequentemente, maior

liberação de cálcio intracelular. Com isso, o aumento da concentração de cálcio

intracelular decorrente da ativação do receptor B1 é maior e mais duradouro que o

decorrente da ativação do receptor B2 (Tropea et al., 1993, Ehrenfeld et al., 2012)

(Figura 2).

Ainda, foram descritos três eventos que indicam a existência de crosstalk

entre os receptores B1 e B2, que podem aumentar a expressão e atividade do

receptor B1. O primeiro evento se caracteriza pela persistente estimulação do

receptor B2; o segundo, pela transdução de sinal ativada pelo receptor B2, que é

capaz de induzir a expressão do receptor B1 e o terceiro, pela utilização de

agonistas dos receptores B1 e B2 que levam à indução da expressão do receptor B1

(Calixto et al., 2004).

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Figura 2. Desenho esquemático da sinalização intracelular decorrente da ativação dos receptores cininérgicos. A estimulação do receptor B2 produz aumento de cálcio intracelular, liberado, principalmente, pelo retículo endoplasmático por hidrólise do fosfatidilinositol. A estimulação do receptor B1 leva a um aumento do cálcio intracelular principalmente por canais catiônicos e também por hidrólise de fosfatidilinositol, de maneira mais duradoura que a desencadeada pelo receptor B2 (Adaptado de Kakoki & Smithies, 2005).

1.3 Sistema calicreína-cininas no Sistema Nervoso Central

No sistema periférico, as cininas têm sido extensivamente estudadas como

peptídeos pró-inflamatórios mediadores de respostas vasculares e de dor em lesões

teciduais envolvidas nos mecanismos de dor, sepse, asma, rinite, edema e câncer

(Leeb-Lundberg et al., 2005). Foi identificada, no sistema nervoso central (SNC), a

presença de cininogênios (Marks et al., 1988; Richoux et al., 1991; Damas et al.,

1992), calicreínas (Snyman et al., 1994; Kizuki et al., 1994), cininas (Kariya et al.,

1985) e seus receptores (Lewis et al., 1985; Cholewinski et al., 1991; Kozlowski et

al., 1988; Fujiwara et al., 1988, 1989; Sharif & Whiting, 1991), que se encontram

amplamente distribuídos, sugerindo sua importância nos mecanismos fisiológicos ou

patológicos do SNC.

6

Foram identificados receptores B2 no tronco cerebral, núcleos da base,

córtex, tálamo, hipotálamo, dura máter, epêndima do terceiro ventrículo e ventrículos

laterais e hipocampo. Os receptores B1 foram identificados no tálamo, medula

espinhal, hipotálamo, córtex e hipocampo (Noda, 2012).

Nas áreas relacionadas à memória, o receptor B2 foi encontrado no núcleo

habenular, trato óptico, núcleo basal de Meynert, cápsula interna, fímbria, corpo

caloso, cíngulo, cápsula externa e regiões Cornu Ammonis (CA) 1 e 3 do

hipocampo.

O receptor B1 foi encontrado na comissura hipocampal, fímbria, regiões CA1

e CA2 do hipocampo, núcleo habenular, trato óptico e cápsula interna (Viel et al.,

2008).

O núcleo habenular encontra-se posteriormente na face dorsomedial do

tálamo, abaixo do epêndima do terceiro ventrículo, com a estria medular do tálamo

acima e lateralmente. O núcleo habenular é uma massa densamente compacta de

neurônios colinérgicos (Susan, 2010 e Jones et al., 2014). O trato óptico contém

projeções retinianas nasais contralaterais e temporais ipsilaterais e os danos podem

vir a causar uma perda de campo homônima contralateral com substancial

incongruência (Alakuijala et al., 2005). O núcleo basal de Meynert, uma estrutura

subcortical, recebe aferências do sistema límbico e envia projeções colinérgicas

para todo o córtex cerebral. É responsável por processos de atenção e de

consolidação da memória (Jones et al., 2014). A cápsula interna é um importante

conjunto de fibras de projeções corticais. A cápsula externa é composta por fibras e

está relacionada ao complexo amigdalóide. O corpo caloso é a estrutura que

conecta os dois hemisférios e tem como função passar as informações entre eles

(Susan, 2010 e Jones et al., 2014). A fímbria é uma área importante entre o

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hipocampo e outras áreas como diencéfalo, estriado e córtex pré-frontal. Está

fortemente relacionada aos processos de aprendizagem e memória (Cassel et al.,

1997). O giro do cíngulo é responsável pela experiência emocional, podendo ser

ativada tanto pelo neocórtex quanto por estruturas inferiores, como o hipotálamo.

Assim, a atividade mental gerada pelo neocórtex é transmitida ao hipocampo e, em

seguida, ao hipotálamo. As áreas CA1 e CA3 fazem parte da área hipocampal, a

qual é importante para processamento das informações. A sub-região CA1 está

relacionada à associação temporal e a sub-região CA3 desempenha um papel

importante na codificação de novas informações espaciais dentro da memória de

curta-duração (Kesner, 2007).

As ações centrais das cininas ainda são controvérsas. Tem-se descrito a

participação das cininas no acidente vascular cerebral (AVC), no traumatismo

cranioencefálico (TCE), doença de Alzheimer (DA), esclerose múltipla (EM) e

epilepsia (Albert-Weissenberger et al., 2014; Dutra et al., 2013; Perosa et al., 2007;

Scarisbrick et al., 2008; Viel & Hudson, 2011).

As cininas são capazes de estimular a produção e liberação de mediadores

inflamatórios como eicosanóides, citocinas, óxido nítrico e radicais livres. Também

podem induzir a liberação de aminoácidos excitatórios levando a um aumento de

cálcio intracelular e induzindo a excitotoxicidade neural. Esses peptídeos estão

envolvidos com a diminuição da barreira hematoencefálica e dilatação das artérias

cerebrais causando edema.

1.4. Participação das cininas nos processos de memória

A avaliação do papel dos receptores para cininas na consolidação da

memória durante o processo de envelhecimento foi realizada em estudo recente, no

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qual, foi utilizado camundongos selvagens (WT) e com deleção gênica para o

receptor B1 (koB1) ou B2 (koB2), com idades de três, seis, 12 e 18 meses. Aos 12

meses de idade, os animais koB2 não apresentaram diferença na consolidação da

memória, avaliada em esquiva ativa, enquanto os animais WT e koB1 mostram

melhora significativa na consolidação da memória (Lemos et al., 2010). Estudo em

que animais transgênicos, que superexpressam a proteína precursora amilóide

humana (APP), foram submetidos ao tratamento com o antagonista B1 por cinco ou

10 semanas e ao teste de labirinto aquático de Morris, mostraram melhora do

aprendizado e memória espacial (Lacoste et al., 2013). Em animais koB1, koB2 e

WT que receberam a infusão crônica do peptídeo β-amilóide 1-40 no ventrículo

lateral, aos 12 meses de idade e foram submetidos ao teste de esquiva ativa sete e

35 dias depois da cirurgia, foi observada uma piora acentuada nos animais WT e

koB2, mas não nos animais koB1, sugerindo que no processo de envelhecimento e

na DA, o receptor B1 pode estar envolvido na neurodegeneração e perda de

memória, enquanto o receptor B2 atua como um fator neuroprotetor (Amaral e al.,

2010).

Em contrapartida, alguns autores relatam que o tratamento com o antagonista

B2, sete ou 30 dias após uma única injeção do peptídeo β-amilóide 1-40, resultou

em redução do déficit da aprendizagem e memória espacial de camundongos em

teste de labirinto aquático de Morris (Prediger et al., 2008). Com a injeção de

antagonista B2 duas horas antes da injeção do peptídeo β-amilóide 1-40, houve

inibição significativa da neuroinflamação, reduzindo os níveis de proteínas pró-

inflamatórias e melhorando o desempenho cognitivo (Bicca et al., 2015). Esses

resultados sugerem que o receptor B2 contribui para a progressão da DA e o seu

bloqueio, na neuroproteção.

9

Nos estudos sobre a EM também não se chegou a um consenso sobre o

papel dos receptores de cininas. Em modelos animais que mimetizam a EM, os

animais koB1 tiveram uma redução na gravidade da doença em comparação ao

controle WT, e o tratamento dos animais WT com inibidor do receptor B1, antes e

depois da doença, foi igualmente efetiva (Göbel et al., 2011), sugerindo que o

receptor B1 participa da doença levando à diminuição do déficit cognitivo (Dutra et

al., 2011). Por outro lado, Schulze-Topphoff e colaboradores (2009), identificaram o

receptor B1 como modulador específico de células imunes e o uso do agonista B1

diminuiu significativamente os sintomas clínicos da doença, enquanto o antagonista

B1 resultou em maior agravamento e aparecimento precoce da EM. Estudos mais

recentes sobre AVC e TCE mostram propriedades neuroprotetoras do antagonismo

do receptor B1. Animais koB1 após o AVC tiveram redução de aproximadamente

50% do tamanho do infarto comparado ao seu controle, WT, e a formação de edema

foi quase nula, sugerindo que não há alteração de função da barreira

hematoencefálica (Austinat et al., 2009). Estudos utilizando diversos modelos de

TCE mostraram que o bloqueio do receptor B1 em camundongos teve uma ação

protetora frente a uma lesão encefálica criogênica, AVC isquêmico e EM, reduzindo

a inflamação e a formação de edema. Animais koB1 submetidos ao TCE fechado

por queda de peso tiveram diminuição do déficit funcional e redução na injúria

axonal, astrogliose e apoptose neuronal, sendo esses dados confirmados com a

administração do antagonista do receptor B1 (R-715) em animais WT 1 hora depois

do TCE (Albert-Weissenberger et al., 2012).

1.5 Aprendizagem e memória

A aprendizagem é a base da memória, é o processo de aquisição das novas

informações que serão retidas na memória. Através dela, tornamo-nos capazes de

10

orientar o comportamento e o pensamento (Johansen et al., 2011). Memória é a

habilidade de reter e utilizar informações adquiridas (Gazzaniga & Heatherton,

2005). Sem a memória, perdemos a capacidade de adquirir e reter habilidades e

conhecimentos úteis, não permitindo que o ser humano utilize da experiência

passada para resolver problemas apresentados no presente (Jaffard, 2006).

Classifica-se a memória, quanto à natureza das informações, em: memória de

procedimento, que diz respeito às habilidades motoras ou sensoriais, e memória

declarativa, relacionadas a fatos, eventos ou conhecimentos, podendo esta ser

subclassificada em memória episódica (registro de eventos que assistimos ou

participamos) e semântica (conhecimentos gerais) (Izquierdo, 2002).

Quanto ao tempo de permanência, pode-se classificar a memória em:

memória de curta-duração (MCD), que permanece por breves períodos de tempo

(segundos, minutos ou horas), pois requerem poucas alterações bioquímicas e

depende da atividade elétrica dos neurônios, não incluindo a ativação de fatores de

transcrição, expressão de genes ou síntese de proteínas e mantendo o indivíduo

capaz de responder através de uma “cópia” da memória principal (Izquierdo, 2002);

e memória de longa-duração (MLD), a qual pode se estender por dias, meses ou

anos, e seu processo metabólico depende de alteração estrutural nas células pré e

pós-sinápticas (Squire & Kandel, 2003 e Johansen et al., 2011).

1.6 Estruturas neurais relacionadas à memória

O processamento das memórias passa pelas seguintes etapas: aquisição,

armazenamento, consolidação e evocação das informações (Izquierdo, 2002, Squire

& Kandel, 2003).

11

As memórias não ficam armazenadas em lugares específicos do cérebro, mas

em várias regiões, que são ligadas por circuitos de memórias (Gazzaniga,

Heatherton, 2005). As estruturas neurais implicadas nos processos de memória

envolvem lobos temporais mediais (hipocampo, amígdala e córtex entorrinal), córtex

pré-frontal, cerebelo, septo medial, entre outras (Gazzaniga & Heatherton, 2005;

Izquierdo, 2002; Lent, 2004).

A formação hipocampal é constituída pelo hipocampo, giro denteado e pelo

subículo. Eferências hipocampais originam-se do subículo e do próprio hipocampo; o

giro denteado projeta somente para parte do hipocampo. Projeções corticais do

hipocampo e do subículo terminam no córtex entorrinal, e a partir daí a informação é

amplamente distribuída em todo córtex cerebral. A formação hipocampal medeia a

formação de memória de longa-duração e é crítica para a consolidação da memória.

O hipocampo apresenta três áreas: como CA1, CA2 e CA3. A organização do

circuito neuronal hipocampal tem sido tradicionalmente caracterizada como vias

trisinápticas excitatórias unidirecionais (Li et al, 2009), em que o córtex entorrinal

(EC) provê grande parte da entrada de informações para o hipocampo, através de

conexões com o giro denteado (DG). As células granulares do DG se projetam para

o CA3, e este para o CA1. O CA1, por sua vez, faz projeções para o subículo e EC

(Li et al, 2009).

Embora o hipocampo exerça um papel essencial na formação das memórias

(O’Keefe & Nadel, 1978; Morris et al., 2003 e Leutgeb et al., 2005), à medida em que

memórias vão se consolidando, tornam-se, em parte ou totalmente, independentes

dessa estrutura (Teng & Squire, 1999 e Rosenbaum et al., 2000). O córtex pré-

frontal tem sido identificado como tendo uma provável importância na expressão de

memórias remotas (Frankland & Bontempi, 2005). O córtex anterior do giro do

12

cíngulo está diretamente relacionado com a formação e recuperação da memória

espacial remota (Teixeira et al, 2006).

Estudos que utilizam a experimentação animal com estímulos aversivos

mostram que a amígdala é essencial para a formação da memória emocional (Davis,

1992). A amígdala possui conexões com estruturas temporais mediais e córtex e

envia projeções para o hipotálamo e para substância cinzenta do tronco encefálico,

além de fazer conexões com os gânglios basais (Kolb & Whishaw. 1998).

O primeiro circuito a ser proposto foi por James Papez, em 1937, motivo pelo

qual ficou conhecido como “circuito de Papez”. Este é constituído pelo giro do

cíngulo, giro hipocampal, hipocampo, fórnice, corpo mamilar e núcleos anteriores do

tálamo. Mais tarde em 1949, MacLean ampliou o circuito de Papez e deu o nome de

“sistema límbico”, o qual compreende o lobo límbico, a formação hippocampal, o

corpo amigdalóide e suas conexões. As aferências hipocampais incluem fibras da

área entorrinal do giro para-hipocampal, fibras colinérgicas da área septal e dos

núcleos basilares do prosencéfalo, fibras dopaminérgicas da área tegmental anterior,

fibras noradrenérgicas do locus ceruleus e fibras serotoninérgicas dos núcleos da

rafe. As fibras eferentes hipocampais entram no circuito de Papez, que inclui o

hipocampo, o fórnix, o corpo mamilar, os núcleos talâmicos anteriores e os giros do

cíngulo e para-hipocampal. As fibras de associação conectam os giros para-

hipocampal e do cíngulo com amplas áreas do neocórtex. A amígdala recebe

influxos provenientes do neocortex temporal e pré-frontal que se projetam para a

formação hipocampal; e envia fibras do núcleo medial dorsal do tálamo ao

hipotálamo e à área septal. A área septal se projeta para os núcleos habenulares,

hipocampo e hipotálamo (Kiernan, 2003).

13

1.7 Mecanismos moleculares envolvidos na consolidação da memória

Os responsáveis pela comunicação entre os neurônios nos processos de

aquisição, consolidação e evocação das informações são os neurotransmissores,

tais como: glutamato, ácido gama-aminobutírico, dopamina, serotonina e acetilcolina

(Gazzaniga & Heatherton, 2005; Izquierdo, 2002).

Estudos comportamentais e celulares sugerem que a aprendizagem e a

memória podem ser moduladas por uma forma de plasticidade sináptica, na qual um

aumento persistente da estimulação de neurônios leva ao aumento da eficácia da

transmissão sináptica, conhecido como potenciação de longa duração (LTP, do

inglês, long-term potentiation) (Squire & Kandel, 2003). A LTP envolve a ativação de

neurônios glutamatérgicos, com consequente aumento da produção de neurotrofinas

e aumento da arborização dendrítica (Hotulaine & Hoogenraad, 2010; Pang & Lu,

2004).

Consolidação é o processo pelo qual as memórias são convertidas de um

estado lábil para memórias estáveis, requerendo o recrutamento de segundos

mensageiros e síntese protéica nos neurônios (Johansen et al., 2011). A ativação

dos receptores de glutamato, ácido gama-aminobutírico, dopamina, serotonina e

acetilcolina, levam ao aumento do cálcio intracelular que ativa a proteína quinase

dependente de AMPc (PKA), PKC e MAPK (Bernabeu et al., 1997; Vianna et al.,

2000 e Cammarota et al., 2000, 2002) enzimas envolvidas na transcrição gênica e

síntese proteica relacionadas à memória de longa-duração (Cammarota et al., 2000).

1.8 Justificativa

Todos os componentes do SCC já foram identificados no tecido cerebral onde

estão amplamente distribuídos, indicando possíveis participações desse sistema em

doenças cerebrais (Costa-Neto et al., 2008). Desta maneira, em trabalhos anteriores

14

do nosso grupo de pesquisa, Iores-Marçal e colaboradores (2006), foi visto o

aumento da concentração de BK no líquido cefalorraquidiano de ratos tratados

cronicamente com o peptídio β-amilóide sugerindo, assim, a sua participação na

neurodegeneração. Viel e colaboradores, 2008, localizaram e quantificaram a

densidade de receptores B1 e B2 para cininas no cérebro de ratos após a infusão

crônica do peptídeo beta-amilóide, no ventrículo cerebral direito, por 35 dias.

Também foi observando uma redução da consolidação da memória nos animais

infundidos com o peptídeo beta-amilóide quando comparados aos animais-controle.

Nesse estudo, ainda, foi identificado o aumento significativo da densidade de

receptores B1 na comissura ventral do hipocampo, fímbria, nas áreas CA1 e CA3 do

hipocampo, núcleo habenular, trato óptico e cápsula interna dos animais com

infusão do peptídeo β-amilóide, assim como aumento significativo da densidade de

receptores B2 no trato óptico, núcleo basal de Meynert, núcleo septal lateral –

porção dorsal e intermediária, cápsula interna e núcleo habenular. Esses dados

sugerem o aumento da ativação do SCC com a DA.

Com a finalidade de verificar a participação dos receptores para cininas no

processo inflamatório, Amaral e colaboradores (2010) avaliaram a memória de

animais koB1 e koB2 depois da infusão crônica do peptídeo β-amilóide 1-40 no

ventrículo lateral. Foi observado que os animais koB1 não apresentaram diferença

na consolidação da memória no 7º ou 35º dia do período da infusão. Na continuação

deste trabalho, foi observado que os animais koB1 infundidos com o peptídeo β-

amilóide 1-40 apresentaram redução na densidade neuronal no hipocampo e

estriado e aumento nas densidades sinápticas e de receptores B2. Esses resultados

sugerem, com maior evidência, o papel neuroprotetor nos processos de

neurodegeneração (Caetano et al., 2015). Lemos e colaboradores (2010), avaliaram

15

o envolvimento dos receptores para cininas na consolidação da memória durante o

processo de envelhecimento com a utilização dos animais koB1, koB2 e WT aos

três, seis, 12 e 18 meses de idade. Neste trabalho observou-se que os animais koB1

tiveram melhor desempenho na consolidação da memória, enquanto os animais

koB2 tiveram uma piora quando comparados ao WT. Esses dados nos levaram a

sugerir que a ausência do receptor B1 diminuiu o déficit cognitivo durante o

envelhecimento e que a ausência do receptor B2 promoveu uma ação oposta,

aumentando o déficit. Foi possível concluir que os receptores das cininas possuem

uma importância fisiológica nas funções cognitivas durante o envelhecimento, e que

o receptor B1 pode ter um papel importante no processo neurodegenerativo e o

receptor B2, na neuroproteção.

Com todo esse panorama, no presente estudo avaliamos se a BK participa

dos processos de memória como aprendizagem, consolidação da memória de curta

e longa-duração e evocação da memória, assim como caracterizamos

farmacologicamente essa resposta. Esse estudo poderá abrir perspectivas para

novas abordagens terapêuticas de doenças neurológicas.

16

2. OBJETIVOS

2.1. Avaliar a influência da bradicinina nos processos de aprendizado,

consolidação da memória de curta e longa duração e evocação da memória em

ratos.

2.2. Determinar qual receptor (B1 ou B2) está envolvido no(s) processo(s).

2.3. Avaliar se a resposta é dependente de concentração de agonista.

2.4. Determinar se o receptor está presente no sítio de injeção e a sua localização

celular.

17

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Aprovação

O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

FCMSCSP sob o número 009/14 (em anexo). Todos os esforços foram feitos para se

utilizar o menor número possível de animais, assim como minimizar o sofrimento dos

mesmos. Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os

"princípios éticos para o uso de animais de laboratório", descritas pela Sociedade

Brasileira de Ciência de Animais de Laboratório (SBCAL, Brasil).

3.2 Animais utilizados

Foram utilizados 221 ratos machos da linhagem Wistar com idade de 3 a 4

meses de peso variável, entre 250 a 350g, mantidos no biotério em ciclo

claro/escuro com ração e água ad libitum, com temperatura ambiente de 24°C a

26°C e a umidade de 55%.

Os animais foram divididos em dois grupos para cada processo cognitivo,

sendo um grupo-controle injetado com o líquido cefalorraquidiano artificial (LCR) e

outro grupo-cinina injetado com cinina (BK, HOE-140, des-Arg10-HOE140, des-

Arg9-BK e NG291).

18

Tabela 1. Separação dos grupos (I e II) pela administração e pelo processo cognitivo. MCD= memória de curta-duração e MLD=memória de longa-duração. PROCESSO COGNITIVO INJEÇÃO DO GRUPO-

CONTROLE (n amostral) INJEÇÃO NO GRUPO-TRATADO

(n amostral) Aprendizagem LCR (10) BK (10)

Consolidação da MCD LCR (7) BK (8)

Consolidação da MCD NG291 (6)

Consolidação da MCD HOE140 + LCR (6) HOE140 + BK (7)

Consolidação da MCD des-Arg10-HOE140 + LCR (7) des-Arg10-HOE140 + BK (7)

Consolidação da MCD LCR (9) des-Arg9-BK (6-12)

Consolidação da MLD LCR (6) BK (8)

Consolidação da MLD LCR (8) des-Arg9-BK (5-8)

Evocação da memória LCR (6) BK (6)

3.3 Implante das cânulas-guia

Os animais foram anestesiados com equitezina (0,4mL/100g, i.p.) cuja

composição é: cloral hidratado a 4,6%, sulfato de magnésio a 2,1%, tiopental sódico

a 6%, propileno glicol a 42,8%, etanol a 10,8% diluídos em água destilada. O nível

de anestesia foi verificado antes e durante a cirurgia avaliando-se o movimento das

vibrissas, tônus da cauda e frequência respiratória.

Para implantação de duas cânulas-guia sobre a área CA1 do hipocampo

(Figura 3a), os animais foram colocados no aparelho estereotáxico (modelo Dual

Lab Standard Stereotaxic Instrument, StoeltingCo. Illinois – Figura 3b), foi feita uma

incisão para exposição do crânio e a perfuração da calota craniana foi realizada com

uma broca de aço carbide de baixa rotação. As coordenadas estereotáxicas para o

CA1 foram: ântero-posterior -2,52mm; lateral 2,5mm; e vertical 2,98mm em relação

ao bregma (Paxinos & Watson, 2007). As cânulas-guia consistiram de uma agulha

hipodérmica de aço inoxidável (0,6x25mm), cortadas na medida de 10mm,

introduzidas no local de estudo e fixados à cabeça do animal com auxílio de

http://www.stoeltingco.com/neuroscience/stereotaxic/rat/stoeltings-dualarm-lab-standard-stereotaxic-instrument-182.html

http://www.stoeltingco.com/neuroscience/stereotaxic/rat/stoeltings-dualarm-lab-standard-stereotaxic-instrument-182.html

19

parafusos de relojoeiro presos na superfície óssea e envolvidos com resina acrílica

auto polimerizante. Após a cirurgia, os animais foram mantidos aquecidos por uma

manta elétrica, e quando acordados receberam 0,01mL de ibuprofeno. Em seguida,

foram separados em gaiolas plásticas individuais com tampa alta, onde

permaneceram por cinco dias até a realização dos experimentos. As injeções de 1µL

em cada cânula foram feitas com a seringa Hamilton de 10µL conectada a um tubo

de polietileno PE50 soldado a outro tubo polietileno PE10 com agulha gengival de

aço (0,30x22mm). A certificação da implantação das cânulas-guia no local correto foi

realizada pela tintura com solução corante Azul de Evans.

a) b)

Figura 3. O painel “a” ilustra as cânulas-guia implantadas sobre a região CA1 do hipocampo; adaptação da figura retirada do atlas Paxinos & Watson, 2007. O painel “b” ilustra o aparelho estereotáxico modelo Dual Lab Standard, StoeltingCo, Illinois, EUA, utilizado para implantação das cânulas.

3.4 Avaliação da atividade motora dos animais

Cinco dias após a cirurgia, o animal foi posicionado no centro da caixa de

acrílico transparente 41x41x33cm com dois sensores laterais para registro de

atividade vertical e horizontal (47420 Activity Cage, Ugo Basile, Itália – Figura 4) a

fim de assegurar que a cirurgia não causou comprometimento da atividade motora

para a avaliação posterior na esquiva inibitória, pois esta exige que o animal

deambule. O registro da atividade de cada animal teve duração de cinco minutos.

20

Figura 4. Caixa de atividade motora, Activity Cage, Ugo Basile, Itália, no qual é feito a medição da atividade motora e exploração vertical dos animais.

3.5 Esquiva inibitória e avaliação dos processos cognitivos

A esquiva inibitória (Ugo Basile, Itália – Figura 5) é um equipamento que

consiste de uma caixa (52x30x35cm) dividida em dois compartimentos iguais, sendo

um claro, provido de uma lâmpada branca de 40 watts, e outro escuro, separados

por uma porta-guilhotina. Para roedores, o teste em esquiva inibitória pode ser

definido como a supressão da preferência inata pelo compartimento escuro do

equipamento devida a um estímulo elétrico nas patas quando há a passagem para o

lado escuro (Ögren & Stiedl, 2010).

Na sessão de aquisição (SA), o animal foi colocado na parte iluminada da

gaiola e em seguida a porta-guilhotina é aberta, e o animal tendenciosamente passa

para o lado escuro da caixa (Ögren & Stiedl, 2010). Então, a porta-guilhotina se

fecha e o animal recebe o estímulo elétrico nas patas (0,5mA por 2 segundos),

deflagrado pelas barras metálicas localizadas no chão desse compartimento. Na

sessão de teste (ST), segue-se o mesmo protocolo, porém, quanto maior a

21

permanência ou latência no lado claro, maior a lembrança do animal com relação

àquele contexto.

A latência foi medida em segundos e para cada sessão seu tempo máximo foi

de 300 segundos.

Figura 5. Esquiva Inibitória Ugo Basile, Itália, equipamento utilizado para avaliação da aprendizagem, consolidação e evocação da memória aversiva.

3.6 Agonistas e antagonistas dos receptores B1 e B2

Para realização desse estudo foi utilizado o agonista seletivo para o receptor

B1, des-Arg9-BK (B4397, Sigma), o seu antagonista des-Arg10-HOE140 (H158,

Sigma), o agonista seletivo para o receptor B2, a bradicinina (B3259, Sigma), NG291

– agonista seletivo ao receptor B2 sintético bioestável produzido no laboratório do

Dr. Fernand Gobeil (Université de Sherbrook, Sherbrook, Qc, Canada) e seu

antagonista seletivo, HOE140 (H157, Sigma). Todas as soluções foram preparadas

com LCR.

22

3.7 Injeção aguda de agonistas e antagonistas dos receptores B1 e B2 para

bradicinina

Após a avaliação da deambulação animal, os grupos foram submetidos ao

teste de esquiva inibitória para avaliação da BK nos processos cognitivos. Para cada

processo houve injeção da BK em momentos diferentes. Para avaliação do efeito da

BK na aprendizagem, foram injetados 300pmol em 1µL de BK ou LCR antes da SA

em cada cânula. Para avaliação do efeito da BK na consolidação da MCD, foi

injetado 300pmol em 1µL de BK ou NG291 ou LCR depois da SA, a ST foi realizada

90 minutos depois da SA. Para avaliação do efeito da BK na consolidação da MLD,

foi injetado 300pmol em 1µL de BK ou LCR depois da SA, a ST foi realizada 24

horas depois da SA. Para avaliação do efeito da BK na evocação da memória, foi

injetado 300pmol em 1µL de BK ou LCR antes da ST. Para determinar qual receptor

(B1 ou B2) estaria envolvido consolidação da MCD, o protocolo foi o mesmo

utilizado na consolidação da MCD, porém foram injetados 300pmol de antagonista

seletivo para o receptor B1 ou B2, des-Arg10-HOE140 e HOE140, respectivamente,

seguidos de 300pmol de BK depois da SA na esquiva inibitória; a ST foi realizada 90

minutos depois da sessão de aquisição. Para avaliar se a perda de MCD era

dependente de concentração de agonista, a administração do agonista seletivo para

o receptor B1, des-Arg9-BK, foi realizada em nove concentrações diferentes

(150pmol, 75pmol, 37.5pmol, 18.75pmol, 9.37pmol, 4.68pmol, 2.34pmol, 1.17pmol,

0.58pmol) depois da SA, 90 minutos ou 24 horas antes da ST, seguindo o mesmo

protocolo de consolidação da MCD.

A fim de esquematizar as injeções e os testes com a figura 4 podemos visualizar:

5 dias SA

90min

Injeção de 300pmol em 1µL de BK

ST

Aprendizagem

Implante de cânulas

23

Figura 6. Administrações intra-hipocampais de agonistas e antagonistas dos receptores B1 e B2 em diferentes momentos no teste de esquiva inibitória.

3.8 Imunofluorescência para marcação do receptor B1

A fim de confirmar a presença ou não do receptor B1 na região da

implantação da cânula-guia e identificar em qual tipo de célula neural o receptor

estaria presente, foram feitas duplas-marcações do receptor B1 e NeuN (marcação

de neurônio), GFAP (marcação de astrócitos), ou Iba1 (marcação de micróglia). Um

grupo experimental de cinco animais (n=5) recebeu a cânula-guia unilateralmente e

nenhuma solução foi injetada para evitar danos excessivos ao tecido. O lado

contralateral não-implantado foi usado como controle. Cinco dias após a cirurgia

5 dias SA

90min

Injeção de 300pmol em 1µL de BK 300pmol de NG291

300pmol de HOE140 +BK 300pmol de des-Arg10-HOE140 + BK

Diluições seriadas de des-Arg9-BK

ST

Consolidação da MCD


5 dias SA

24h

Injeção de 300pmol em 1µL de BK 300pmol de des-Arg9-BK

Diluições seriadas de des-Arg9-BK

ST

Consolidação da MLD


Evocação da memória

5 dias SA

24h

Injeção de 300pmol em 1µL de BK

ST Implante de cânulas

24

estereotáxica, os animais foram anestesiados com isofluorano e os cérebros foram

fixados por perfusão transcardíaca com paraformoldeído 4% em salina tamponada

(tampão fosfato pH 7,4; 0,1M). Os cérebros foram removidos e pós-fixados na

mesma solução de fixação a 4ºC por um dia e incubado em 30% de sacarose na

mesma solução de fixação a 4ºC por um dia. As amostras foram emblocadas com o

composto OCT (NEG 50, Thermo Sci.) e rapidamente congelados com spray

congelante (Cytocool II, Thermo Sci.). As amostras congeladas foram cortadas na

espessura de 40µm e por meio do criostato (-20ºC, Microm HM525, Alemanha) e

colocados em PBS. O processo de imunofluorescência foi realizado por agitação

(free-floating) para receptor B1 com co-localização de neurônios, astrócitos ou

micróglia. As emissões de fundo (background) foram controladas por incubação

apenas com os anticorpos secundários. Os cortes foram lavados três vezes (5min)

em PBS. Os cortes foram incubados com soro de cabra (normal serum) por 1h e

depois foram incubados com o anticorpo primário anti-B1 (1:50) (ABR-011 Alomone

labs, Jerusalém, Israel) por 18h a 4ºC. Foram lavados três vezes em PBS por 2min e

incubados com o anticorpo secundário (Alexa Fluor 594, A11012 Life Technologies,

USA) por 2h, em temperatura ambiente. Para a segunda marcação, as amostras

foram lavadas três vezes (5min) em PBS e incubadas por 3h com anticorpo anti-

NeuN (Merck Millipore, ABN78); anti-Iba1 (Abcam, ab108539); anti-GFAP (abcam

ab16997). Os cortes foram lavados três vezes em PBS for 2min e incubados com o

anticorpo secundário (Alexa Fluor 488, A11018 Life Technologies, USA), por 2h em

temperatura ambiente. As lâminas utilizadas foram Superfrost (Fisher Scientific Co.,

USA) e montadas com lamínulas usando ProLong® Diamond Antifade Mountant

(P36962, Life Technologies, USA). As imagens foram adquiridas e analisadas

25

usando o microscópio confocal Zeiss Lases Scanning Microscope (LSM 780, Jena,

Alemanha).

3.9 Análise estatística

Os dados obtidos nos testes realizados em esquiva inibitória foram expressos

em mediana e intervalo interquartil. Foram utilizados testes estatísticos não-

paramétricos devido à heterocedasticidade dos dados, uma vez que estabelecido o

tempo máximo de 300 segundos. Para as comparações entre a SA e ST, foi utilizado

o teste de Wilcoxon, para dados pareados e não-paramétricos. Devido à diferença

significantiva entre as latências da SA dos diferentes grupos em relação ao grupo-

controle, a latência da ST não foi comparada entre os diferentes grupos.

Os dados obtidos pelo teste de atividade motora foram expressos em

média±erro padrão. Para comparação entre o grupo que não passou por cirurgia e o

grupo que passou por cirurgia foi utilizado o teste t de student para dados

paramétricos e não-pareados. Todas as análises foram realizadas utilizado o

programa GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, versão 6). As

diferenças entre os grupos experimentais foram consideradas significativas quando

P<0,05.

26

4. RESULTADOS

4.1 Avaliação da atividade motora dos animais

A avaliação da atividade motora dos animais foi feita antes dos testes de

memória a fim de assegurar que os animais não apresentaram nenhum tipo de

alteração na deambulação devido à cirurgia estereotáxica. Não foi observada

diferença significativa entre as médias de locomoção entre os grupos (P=0,8175)

(Figura 7).

Figura 7. Análise da deambulação dos animais sem e com cirurgia realizada em caixa de atividade motora – No gráfico, os histogramas e barras verticais representam a média e erro-padrão da locomoção total (em unidades arbitrárias).

4.2 Avaliação do efeito da BK na aprendizagem

Para analisar os efeitos da administração de 300pmol de BK sobre a

aprendizagem, submetemos os animais à injeção da substância na região CA1 do

hipocampo dorsal antes da SA. Como pode ser visto na Figura 8, a BK e LCR não

provocaram nenhuma alteração na aprendizagem, sendo a mediana da latência da

ST maior que a SA (Animais LCR: SA (20.05s [12.6s/29.0s]) e ST (31,15s

[18.4s/298,0s]), P<0,05; Animais BK: SA (14.7s [11.9s/27.25s]) e ST (128.7s

[21.2s/298.0s]), P<0,05).

Sem cirurgia Com cirurgia0

200

400

600

800

1000

Dea

mbu

laçã

o (U

A)

27

Figura 8. Efeito da infusão intra-hipocampal de LCR e BK na tarefa de aprendizagem realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=10) e BK (n=10). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.3 Avaliação do efeito da BK na consolidação da MCD

Para verificar os efeitos da administração de 300pmol de BK sobre a

formação da MCD, os animais receberam injeção de BK na região CA1 do

hipocampo dorsal após a SA e submetidos à ST depois de 90 minutos. Podemos

observar que houve efeito amnésico no grupo injetado com BK, não havendo

diferença significativa entre as medianas da ST e SA (Animais LCR: SA (23.6s

[13.6s/58.0s]) e ST (32.5s [20.3s/298.0s]), P<0,05; Animais BK: SA (10.5s

[6.17s/19.65s]) e ST (21.3s [11.18s/62.03s]), P<0,05) (Figura 9).

28

Figura 9. Efeito da infusão intra-hipocampal de LCR e BK na tarefa de consolidação da memória de curta-duração realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=7) e BK (n=8). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.4 Avaliação do efeito da BK na consolidação da MLD

Para verificar se o efeito de 300pmol de BK na MLD, submetemos os animais

ao teste de esquiva inibitória, injetando a BK na região CA1 do hipocampo logo após

a SA, sendo a ST 24 horas depois.

Analisando a Figura 10, podemos observar que a BK não apresentou efeito

sobre a consolidação da MLD, sendo a mediana da ST maior que a da SA. Em

ambos grupos, LCR e BK, apresentaram a mediana da latência da ST maior que na

SA. (Animais LCR: SA (22.65s [4.225s/83.78s]) e ST (182s [14.35s/298.0s]),

P<0,05); Animais BK: SA (14,60s [11.1s/20.58]) e ST (36.7 [14.35s/270,0s]),

P<0,05).

29

Figura 10. Efeito da infusão intra-hipocampal de LCR e BK no teste de consolidação da memória de longa-duração realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=6) e BK (n=8). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.5 Avaliação do efeito da BK na evocação da memória

A fim de investigar os efeitos da administração de 300pmol de BK no

processo de evocação da memória, injetamos a substância na região CA1 do

hipocampo antes da realização da ST. Podemos ver na Figura 11 que a BK também

não apresentou efeito sobre a evocação da memória em ratos sendo a mediana da

latência da ST maior que a da SA. (Animais LCR: SA (22.3s [17.38s/41.73s]),

P<0,05) e ST (50.85 [26.38s/298.0s]), P<0,05).

30

Figura 11. Efeito da infusão intra-hipocampal de LCR e BK no teste de evocação da memória realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=6) e BK (n=6). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

Concluindo os resultados, pudemos observar que não houve efeito da BK nos

processos de aprendizagem, MLD e evocação da memória, mas houve um efeito

amnésico na consolidação da MCD. Esses resultados contribuíram para investigar

qual receptor estaria envolvido na perda de memória.

4.6 Avaliação do bloqueio do receptor B1 na consolidação da MCD

Para verificar se o receptor B2 estaria envolvido com o efeito amnésico na

MCD, fizemos a administração de 300pmol do antagonista seletivo (des-Arg10-

HOE140) para o receptor B1 seguido da injeção de 300pmol de BK na região CA1

do hipocampo dorsal depois da SA. O bloqueio do receptor B1 e administração de

BK não teve efeito na MCD, ou seja, a mediana da latência em ST foi maior que em

SA. (Grupo antagonista B1 + LCR: SA (17.8s [7.6s/32.2s]) e ST (83.8s

[37.7s/298.0s]), P<0,05). Grupo antagonista B1 + BK: SA (26.8s [15.2s/39.5s]) e ST

(298.0s [56.5s/298.0s], P<0,05) (Figura 12).

31

Figura 12. Efeito da infusão intra-hipocampal de antagonista B1 + LCR e antagonista B1 + BK no teste de memória de curta-duração realizada na esquiva inibitória. Observamos o comportamento dos grupos LCR (n=7) e BK (n=7). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.7 Avaliação do bloqueio do receptor B2 na consolidação da MCD

A fim de determinar se o receptor B1 estaria envolvido no déficit de memória,

injetamos 300pmol do antagonista seletivo para o receptor B2, HOE140, seguido da

administração de 300pmol de BK depois da SA. O bloqueio do receptor B2 e a

injeção seguida de BK resultaram em um déficit de memória quando comparadas as

medianas da latência em ST e em SA. (Animais antagonista B2 + LCR: SA (17.85s

[13.15s/70.95s]) e ST (203.8s [48.05s/298.0s], P<0,05). Animais antagonista B2 +

BK: SA (28.40s [16.0s/138.6s]) e ST (56.0s [22.6s/90.9s], P<0,05) (Figura 13).

32

Figura 13. Efeito da infusão intra-hipocampal de antagonista B2 + LCR e antagonista B2 + BK no teste de memória de curta-duração realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=6) e BK (n=7). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

Através desses experimentos pudemos observar a participação do receptor

B1 no déficit de memória ocorrido na MCD após a infusão de BK. Sabemos que a

BK tem uma meia-vida pequena de aproximadamente 15 segundos (Marketou &

Vardas, 2012), e logo é degradada em desArg9-BK, agonista do receptor B1. A

ligação do agonista ao receptor B1 inibe sua internalização constitutiva, reduzindo a

taxa de eliminação espontânea de receptores da membrana celular e retardando a

degradação do mesmo (Enquist et al., 2007).

4.8 Avaliação do efeito do agonista B2 bioestável NG291 na consolidação da

MCD

A fim de confirmar o resultado obtido com o bloqueio farmacológico do

receptor B1, 300pmol/µL do agonista B2 sintético e bioestável, NG291 (Savard,

2013), foram administrados bilateralmente na região CA1 do hipocampo dorsal após

a SA e submetidos à ST depois de 90 minutos. O agonista NG291 é resistente à

degradação, portanto, não sofre a clivagem que resulta na formação de agonista B1,

33

como ocorre com a BK que após ser clivada pela cininase I, dará origem à des-Arg9-

BK.

Neste experimento não foi observado déficit na consolidação da MCD. A

latência da ST (233.5s [52.5s/298.0]) foi significativamente maior que a latência na

SA (29.3s [29.3s/49.2s]), P<0,05 (Figura 14).

Figura 14. Efeito da infusão intra-hipocampal de agonista B2 NG291 (n=6) no teste de memória de curta-duração realizada na esquiva inibitória. No gráfico observamos o comportamento da sessão de aquisição (SA) e sessão de teste (ST). Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.9 Avaliação da resposta dependente de concentração de agonista na

consolidação da MCD

A fim de investigarmos se o efeito prejudicial do receptor B1 na memória se

mantinha em concentrações do agonista próximas às concentrações fisiológicas da

BK, avaliamos o déficit de MCD e MLD com administração desse agonista em

concentrações de diluições seriadas (Tabela 2).

Para a avaliação da MCD as concentrações do agonista seletivo para o

receptor B1, des-Arg9-BK utilizadas foram: 150pmol, 75pmol, 37,5pmol, 18,75pmol,

9,37pmol, 4,68pmol, 2,34pmol, 1,17pmol e 0,58pmol. Na figura 15, podemos

observar que em concentrações de 150 a 2,34pmol o agonista utilizado ainda causa

a perda de memória. Na concentração de 1,17pmol, não observamos o déficit, e o

34

resultado foi confirmado com a administração na concentração de 0,58pmol, não

havendo prejuízo da memória.

Grupo LCR: SA (39.0s [29.5s/67.15s]) e ST (298.0s [97.45s/298.0s]), P<0,05).

Grupo 150pmol: SA (14.85s [10.85s/33.28s]) e ST (50.3s [9.22s/134.2s], P<0,05).

Grupo75pmol: SA (68.2s [11.6s/96.5s]) e ST (81.7s [12.7s/298.0s], P<0,05).

Grupo 37,5pmol: SA (11.5s [5.2s/23.4s]) e ST (38.1s [7.7s/63.1s], P<0,05).






Grupo 0,58pmol: SA (25.2s [11.05s/26.4s] e ST (105.4s [31.7s/166.7s], P<0,05).

35

Figura 15. Efeito da infusão intra-hipocampal de agonista B1 em concentrações no teste de memória de curta-duração realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=9) em “a”, Grupo de 150pmol (n=6) em “b”, Grupo 75pmol (n=7) em “c”, Grupo 37,5pmol (n=7) em “d”, Grupo 18,75pmol (n=9) em “e”, Grupo 9,37pmol (n=9) em “f”, Grupo 4,68pmol (n=6) em “g”, Grupo 2,34pmol (n=12) em “h”, Grupo 1,17pmol (n=11) em “i” e Grupo 0,58pmol (n=11) em “j”. Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

36

4.10 Avaliação da resposta dependente de concentração de agonista na

consolidação da MLD

A administração de 300pmol de BK na consolidação da MLD não resultou em

piora da memória dos animais. Considerando que a BK teve efeito na MCD foi

devido à ativação do receptor B1, avaliamos o desempenho da consolidação da

MLD com administração de 300pmol de des-Arg9-BK, agonista do receptor B1,

pudemos observar o déficit de memória (Figura 16) sendo a mediana da latência da

ST (13.05s [5.525s/16.83s], P<0,05) não foi maior que a da SA (12.65s

[7.825s/28.85s], P<0,05).

Figura 16. Efeito da infusão intra-hipocampal de agonista B1 no teste de MLD realizada na esquiva inibitória – No gráfico observamos o comportamento dos animais (n=8) quando administrados com 300pmol de agonista B1. Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

Devido aos resultados obtidos, avaliamos se as diferentes concentrações do

agonista B1 levariam ao prejuízo da MLD como no teste da MCD. Utilizamos o

agonista seletivo para o receptor B1, des-Arg9-BK, nas seguintes diluições:

37,5pmol, 18,75pmol, 9,37pmol. Observamos na dose de 37,5pmol o agonista

utilizado causa um efeito amnésico, mas nas concentrações de 18,75pmol, não

observamos o mesmo efeito sendo confirmado com a concentração de 9,37pmol

(Figura 17).

37

Grupo LCR: SA (26.6s [9.17s/30.15s]) e ST (212.5s [37.53s/298.0s], P<0,05).


Grupo 18,75pmol: SA (12.2s [8.47s/23.9s]) e ST (74.35s [36.98s/280.5s]), P<0,05).

Grupo 9,37pmol: SA (18.20s [9.4s/34.28s]) e ST (67.2s [29.78s/298.0s]), P<0,05).

Figura 17. Efeito da infusão intra-hipocampal de agonista B1 em diferentes concentrações no teste de MLD realizada na esquiva inibitória. No gráfico observamos o comportamento dos grupos LCR (n=8) em “a”, Grupo 37,5pmol (n=5) em “b”, Grupo 18,75pmol (n=8) em “c”, Grupo 9,37pmol (n=6) em “d”. Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

38

Tabela 2. Efeito do agonista B1, des-Arg9-BK, em diferentes concentrações (medianas com intervalos interquartis) na consolidação da memória de curta e longa duração. SA= sessão de aquisição e ST= sessão de teste. Teste de Wilcoxon, *: P<0,05.

4.11 Imunofluorescência para o receptor B1

Com intuito de verificar a presença de receptores do tipo B1 e em qual tipo

celular eles poderiam estar localizados, foi realizada a imunofluorescência contra o

receptor B1 com dupla marcação com as proteínas NeuN, Iba1 e GFAP que marcam

as células neuronais, micróglias e astrócitos, respectivamente. Foi observada uma

densa imunomarcação do receptor B1 no entorno da cânula-guia implantada na

região hipocampal. Considerando que na região contralateral equivalente não foram

observadas imunomarcações para o receptor B1, podemos sugerir que o implante

da cânula-guia induziu o aumento da expressão de receptores B1 (Figura 18). A

dupla-marcação das proteínas NeuN, Iba1 e GFAP, mostrou co-localização

prevalente do receptor B1 com imunomarcações para Iba1 e GFAP que permite

sugerir a localização dos receptores B1 induzidos pelo implante da cânula-guia em

micróglia e astrócitos (Figura 19).

Memória de Curta-Duração Memória de Longa-Duração [ ] pmol SA (s) ST (s) SA (s) ST (s)

300 - - 12.7 (7.8/28.9) 13.1 (5.3/16.8) 75 68.2 (11.6/96.5) 81.7 (12.7/298.0) - -

37.5 11.5 (5.2/23.4) 38.1 (7.7/63.1) 16.3 (13.2/50.8) 37.4 (35.4/54.3) 18.7 16.7 (11.1/100.6) 89.0 (21.2/298.0) 12.2 (8.5/23.9) 74.4 (36.9/280.5)*

9.3 9.9 (7.0/28.2) 26.1 (14.2/250.0) 18.2 (9.4/34.3) 67.2 (29.8/298.0)* 4.6 17.3 (12.5/30.6) 74.5 (20.2/108.0) 17.9 (13.5/25.3) 55.5 (37.1/136.4)* 2.3 22.6 (16.6/32.9) 27.3 (8.4/60.3) - -

1.17 18.1 (11.1/38.5) 298.0 (53.1/298.0)* - - 0.58 25.2 (11.1/26.4) 105.4 (31.7/166.7)* - -

39

Figura 18. Composição de imagens adquiridas com lente objetiva (aumento 10x). Em “A” representando a localização dos receptores B1 (em vermelho) ao redor da cânula-guia (área pontilhada) e neurônios (em verde). Em “B” uma imagem ilustrativa representando o painel “A”(retângulo pontilhado). Em “C”, a área calculada da inserção da agulha. Os painéis “D-F” mostram as imagens das amostras incubadas somente com os anticorpos secundários e representa a fluorescência de fundo da região analisada. A barra de escala em “A” é de 200µm e para “D-F” é de 50µm.

40

41

Figura 19. Imagem representativa da dupla-marcação por imunofluorescência de receptores B1 (em vermelho) e NeuN (“A-C”) ou GFAP (“D-F”) ou Iba1 (“G-I”) em verde. A figura mostra marcação de receptores B1 localizados em astrócitos (GFAP) e micróglias (Iba1), mas não em neurônios (NeuN). As figuras “J-L” mostram a ausência do receptor B1 na região contralateral equivalente do mesmo corte histológico das imagens “G-I”. A barra de escala é de 50µm.

42

5. DISCUSSÃO

O sistema calicreína-cininas (SCC) está envolvido em respostas biológicas

como permeabilidade vascular, formação de edema, inflamação, liberação de

glutamato e produção de espécies reativas de oxigênios (Wahl et al., 1993; Whalley

& Wahl, 1983). Todos os componentes do SCC estão presentes no sistema nervoso

central, tanto em neurônios como em células da glia (Hösli & Hösli, 1993 e Raidoo &

Bhoola, 1998, Chao et al., 1983), e os receptores cininérgicos são encontrados em

diversas áreas cerebrais (Lewis et al., 1985; Cholewinski et al., 1991; Kozlowski et

al., 1988; Fujiwara et al., 1988, 1989; Sharif & Whiting, 1991). A presença dos

receptores cininérgicos, B1 e B2, em diversas áreas neurais, pode indicar uma

possível relação com doenças neurológicas, como doença de Alzheimer (DA),

esclerose múltipla e epilepsia, traumatismo cranioencefálico (TCE) e acidente

vascular cerebral (AVC) (Albert-Weissenberger et al., 2013; Naffah-Mazzacoratti et

al., 2014).

Em estudo realizado por nosso grupo com animais com deleção gênica do

receptor B1 (knockout B1 – koB1) ou do receptor B2 (knockout B2 – koB2) em

diferentes idades, foi demonstrado que animais koB1 tiveram uma melhora na

consolidação da memória em teste realizado em esquiva ativa, enquanto os animais

koB2 pioraram em relação aos animais selvagens (Wild Type - WT), sugerindo que

a ausência do receptor B1 diminui o déficit cognitivo durante o envelhecimento, e a

ausência do receptor B2 promove aumento do déficit cognitivo (Lemos et al., 2010).

Em modelo de neurodegeneração semelhante à DA por infusão de β-amilóide em

ratos foi mostrada a diminuição do número de corpos celulares nas áreas

hipocampais e corticais com associação de depósitos de β-amilóide. Além disso,

houve aumento da concentração de BK no líquido cérebro-espinhal e do número de

43

ligações dos receptores B1 e B2 em áreas relacionadas aos processos cognitivos

(Iores-Marçal et al., 2006; Viel et al., 2008), o que sugere a ativação do SCC e seu

envolvimento na DA. Também foi mostrado que a infusão crônica do peptídeo β-

amilóide humano 1-40 em animais koB1, koB2 e WT, não resultou em déficit de

memória no grupo koB1, enquanto os grupos WT e koB2 apresentaram déficit de

memória em teste de esquiva ativa (Amaral et al., 2010).

Baseados nesses estudos sobre o envolvimento do SCC no envelhecimento

e na neurodegeneração, o nosso objetivo foi investigar qual o efeito da bradicinina

nos processos de aprendizagem, consolidação e evocação da memória.

A primeira avaliação realizada após submeter os animais à cirurgia

estereotáxica para implantação das cânulas-guia foi com relação à manutenção da

capacidade motora, pois é necessário que os animais não apresentem

comprometimento locomotor, uma vez que no teste cognitivo em esquiva inibitória,

a preservação da deambulação é essencial para o animal passar de um

compartimento ao outro. No presente estudo, não foi verificada diferença na

deambulação dos animais que foram submetidos à cirurgia em comparação aos que

não passar por cirurgia, confirmando a preservação da habilidade locomotora dos

animais.

Quando submetemos os animais aos testes cognitivos na esquiva inibitória

não foi observado efeito da injeção de 300pmol de BK nos processos de

aprendizagem, evocação da memória e consolidação da memória de longa-duração

(MLD), mas pudemos verificar prejuízo na consolidação da memória de curta-

duração (MCD). Esses dados reforçam a idéia de que os processos das MCD e

MLD são mecanismos distintos como afirmado por Izquierdo, 2002. Os eventos

bioquímicos nas MCD e MLD envolvem as enzimas proteína quinase dependente

44

de AMPc (PKA), proteína quinase dependente de cácio (PKC) e proteína quinase

ativada por mitógeno (MAPK) com ação e ativação em janelas temporais diferentes.

A ativação da PKA na MCD se dá no tempo entre 0 e 90 minutos depois da sessão

de aquisição (SA), porém na MLD ocorrem dois picos de ativação da PKA com a

fosforilação do fator de transcrição nuclear CREB1 nos tempos 0 e 180 minutos

após a SA (Bernabeu et al., 1997 e Vianna et al., 2000). A MCD depende da

ativação seletiva das isoformas α e βI da PKC no tempo mais restringido, nos 50

minutos após a SA, enquanto a MLD não apresenta seletividade pelas isoformas da

PKC, e sua ativação ocorre durante 2 horas após a sessão de aquisição.

Finalmente, a ativação pela MAPK também diferencia os dois tipos de memória. A

MAPKK é importante na MLD no período da consolidação da memória, entre 3 e 6

horas (Walz et al., 2000 a b), enquanto é fundamental na indução da MCD (Walz et

al., 1999).

Uma vez que houve prejuízo na consolidação da MCD, o próximo objetivo

desse trabalho foi detectar qual receptor estaria envolvido com esse déficit. Para

isso foi feita a injeção do antagonista seletivo para o receptor B1 (des-Arg10-

HOE140) ou para B2 (HOE140) seguidas da injeção da concentração isomolar de

BK. Através desse experimento, observamos que o antagonista B1 foi capaz de

abolir o déficit de memória. O bloqueio do receptor B2, no entanto, não impediu o

déficit de memória. Sendo assim, os resultados permitem sugerir a participação do

receptor B1 no prejuízo identificado. O receptor B1 é ativado pela des-Arg9-BK, que

é um metabólito da degradação da BK pela cininase I, o que ocorre em menos de

15 segundos (Marketou & Vardas, 2012), portanto, a ativação desse receptor na

avaliação da MCD se deu possivelmente pela des-Arg9-BK oriunda da degradação

da BK injetada. A concentração de BK encontrada no plasma de humanos foi de

45

170pmol/mL e de des-Arg9-BK de 22pmol/mL (Simões et al., 2013). Esses

resultados reforçam trabalhos anteriores do grupo envolvendo o receptor B1 com os

processos neuroinflamatórios (Lemos et al., 2010; Amaral et al., 2011). Lacoste e

colaboradores (2013) verificaram que o tratamento crônico com antagonista do

receptor B1 em animais transgênicos que expressam a proteína precursora amilóide

humana, melhorou significativamente o aprendizado e a memória destes animais,

avaliados por meio do labirinto aquático de Morris, sugerindo a participação do

agente farmacológico, antagonista do receptor B1, agindo como neuroprotetor na

DA (Lacoste et al., 2013). Em contrapartida, outros autores apontam o receptor B2

como promotor da neurodgeneração, como Bicca e colaboradores (2015) que

injetaram o antagonista do receptor B2 (HOE140) por via intracerebroventricular em

camundongos suiços duas horas antes da injeção do peptídeo β-amilóide 1-40, e

mostraram que houve redução na ativação da micróglia e no nível de proteínas pró-

inflamatórias.

Uma vez que foi verificado o envolvimento do receptor B1 com o prejuízo da

memória, avaliamos qual seria a menor dose em que o agonista do receptor B1

poderia ainda desencadear esse prejuízo. Para isso fizemos diluições seriadas do

agonista B1 (des-Arg9-BK) nos testes de consolidação da MCD até que o prejuízo

não fosse mais visto. Pudemos observar que na dose de 1,17pmol, os animais não

apresentaram o déficit de memória e esse dado foi confirmado utilizando a dose de

0,58pmol, em que o grupo também não apresentou déficit de memória. A análise

desses dados sugere que a consolidação da memória foi dependente da dose do

agonista, sendo a dose de 2,3pmol a menor capaz de causar o prejuízo da

consolidação da MCD.

Verificamos que o agonista B1 também é capaz de causar prejuízo na MLD,

46

uma vez que a injeção de 300pmol de des-Arg9-BK levou ao déficit, mas não com a

injeção de 300pmol de BK. Assim, a fim de pesquisar a menor dose que prejudicaria

a consolidação da MLD fizemos diluições seriadas do agonista, e foi obtida a dose

de 37,5pmol, pois na dose de 18,75pmol o prejuízo não ocorreu.

Com isso, é importante observarmos que as doses necessárias para levar ao

déficit da consolidação da MCD e MLD podem ser consideradas próximas às

concentrações fisiológicas encontradas por Elrod e colaboradores (1986), que foram

de 0,6pmol/g de BK em todo o cérebro de rato. As concentrações de BK podem ser

aumentadas durante uma lesão tecidual (Elrod et al., 1986). Considerando que a

dose necessária para causar prejuízo da MLD é 16 vezes maior que a necessária

para causar prejuízo na MCD e que o agonista B1, des-Arg9-BK, é o metabólito da

BK. Provavelmente a quantidade de agonista B1 gerado pelo metabolismo da

injeção de 300 pmol de BK não foi suficiente para causar déficit na MLD.

Para confirmar que a ativação do receptor B1 e não do receptor B2 foi a

responsável pelo déficit de memória observado na MCD foi utilizado o agonista

seletivo sintético bioestável do receptor B2 (NG291), o qual é resistente à

degradação (Savard et al., 2013). O resultado observado foi a manutenção da MCD,

reforçando a participação do receptor B1 no déficit de memória observado.

Sabendo que o receptor B1 é expresso em situações de lesão tecidual e que

ativação desse receptor via agonista causa o prejuízo de memória, verificamos se a

haveria a presença desse receptor pela lesão causada pela implantação das

cânulas-guia. Para isso usamos um grupo de animais que receberam inserção de

cânula-guia em um hemisfério e não tiveram injeção de nenhum peptídeo e fizemos

dupla-marcações por imunofluorescência para verificar em qual tipo celular o

receptor B1 estaria expresso. A imunomarcação específica para o receptor B1 foi

47

encontrada ao entorno da cânula-guia, enquanto na mesma região contralateral não

foi observada imunomarcação. A dupla-marcação das proteínas NeuN, Iba1 e

GFAP, mostrou a co-localização prevalente do receptor B1 em micróglia e

astrócitos, porém escassa em neurônios. Esses dados nos levam a sugerir que a

lesão tecidual causada pela implantação da cânula-guia induziu a expressão do

receptor B1 principalmente em astrócitos e micróglias.

O aspecto principal da resposta imunológica à inflamação é a ativação da

micróglia e infiltração de macrófagos (Asraf et al., 2015). Foi observado que a BK

induz migração de micróglia por estimulação de receptores B1 (Ikufu et al., 2007).

Os astrócitos exercem funções no sistema imune e resposta regenerativa à

doenças cerebrais. Após lesão tecidual como o AVC e TCE, os astrócitos se tornam

reativos e respondem aos ferimentos de maneira típica denominada astrogliose

(Albert-Weissenberger et al., 2013). A ativação da astrocitose e astroglioses

reativas após a lesão cerebral pode inibir a regeneração e reparo do tecido, o que

contribui à inabilidade permanente e declínio cognitivo (Frugier et al., 2012).

Diante desses resultados, o SCC na associação ao TCE leve pode ser

aplicado neste estudo (Unterberg et al., 1986; Schilling & Wahl, 1999; Plesnila et al.,

2001; Austinat et al., 2009; Albert-Weissenberger et al., 2012). Algumas

consequências causadas pelo TCE leve são perda de memória retrógrada (não há

lembrança de fatos que antecederam o evento traumático) e anterógrada

(incapacidade de recordar dos eventos após o trauma) sendo associadas ao

rompimento da memória de trabalho e de curta-duração (Liu et al., 2013; Levin &

Diaz-Arrastia, 2015). Já foi descrito que o TCE pode levar ao aumento de receptores

B1 e B2 em algumas regiões do cérebro, principalmente na zona da penumbra

(Ongali et al., 2006; Trabold et al., 2010). No modelo do impacto cortical controlado

48

de TCE houve aumento das concentrações de BK após duas horas e seis horas

depois, houve aumento significativo de RNAm de receptores B1, permanecendo

elevado até o segundo dia; e o receptor B2 manteve sua expressão constitutiva em

baixas densidades (Trabold et al., 2010). Animais WT que foram tratados com o

antagonista B1 após o TCE, tiveram uma redução da inflamação e formação de

edema, assim como os animais koB1 tiveram redução da lesão axonal e ativação de

astroglia (Albert-Weissenberger et al., 2012). Esses dados corroboram os nossos

resultados, sugerindo que o bloqueio do receptor B1 pode vir a se tornar uma nova

estratégia ao combate de efeitos do SCC em TCE.

Por fim, com base na literatura, propomos a participação para o receptor B1

no déficit de memória após a infusão de BK ou do agonista B1 sabendo que o

receptor B1 e B2 são acoplados à proteína G e suas subunidades, Gαq, Gα i2 e

Gα i3, e possuem vias de sinalização similares, as quais aumentam o cálcio

citosólico (Prado et al., 2002). No entanto, a sinalização celular que induz o

aumento de cálcio é diferente. Enquanto o receptor B2 utiliza cálcio do retículo

endoplasmático, o receptor B1 usa cálcio extracelular (Prado et al., 2002). O cálcio

é extremamente importante para eventos pós-sinápticos necessários para

expressão gênica no neurônio, dependentes de atividade e plasticidade neuronal,

eventos que são essenciais para aprendizagem e memória (Lynch, 2004; Ataei et

al., 2015), por conseguinte, importantes para estabilização da MLD estrutural e

funcionalmente. Entretanto, a depressão ou a potenciação da atividade sináptica

pós-sináptica depende da quantidade e da duração do influxo de cálcio (Lee et al.,

2009). Situações nas quais o cálcio vai além dos limites fisiológicos podem se

assemelhar à perda de neurônios como acontece durante o envelhecimento ou em

doenças neurológicas (Hidalgo & Nunez, 2007). Mostramos que o implante da

49

cânula induziu grande expressão de receptor B1 que foram co-localizados com as

células da glia. Já foi mostrado que em locais lesionados a migração de micróglia é

dependente de receptores B1 e de influxo de cálcio (Ifuku et al., 2007). A ativação

glial e a neuroinflamação estão implicadas na disfunção cognitiva como

consequência de TCE, situações de pós-operatório e abuso de drogas (Perez-Polo

et al., 2015, Wang et al., 2015; Zamberletti et al., 2015). Além disso, em tecidos

lesionados, a ativação de receptor B1 leva a um aumento das respostas

inflamatórias mediadas por TNFα, IL-1β e outros mediadores, os quais também

podem levar a disfunção cognitiva (Viel & Buck, 2011). Por esta razão, acreditamos

que durante a lesão tecidual há o aumento da expressão e ativação de receptores

B1 podendo gerar o aumento da atividade de receptores glutamatérgicos, aumentar

significativamente a entrada de cálcio e, por sua vez, induzir a migração das células

da glia e neuroinflamação levando à diminuição da memória ou até mesmo a morte

celular neuronal (Negraes et al., 2015).

Em suma, a lesão tecidual causada pela cânula-guia levou ao aumento de

receptores B1 e esse dano pode ser comparado ao TCE. Esses dados nos levam a

sugerir a possível participação dos receptores B1 no déficit de MCD, como é

observado no TCE (Yang et al., 2013). Considerando que o TCE é um importante

fator de risco para as doenças de Alzheimer e Parkinson (Hopp & Albert-

Weissenberger, 2015 e Gardner & Yaffe, 2015), e que em ambas situações há uma

crescente evidência do papel fisiopatológico do SCC, a determinação dos efeitos

farmacológicos da inibição do receptor B1 na fase aguda do TCE pode nos abrir

perspectivas para novas abordagens terapêuticas dessas doenças e condições.

50

6. CONCLUSÕES

A bradicinina não interferiu na aprendizagem, evocação e memória de longa-

duração.

A bradicinina causou déficit na consolidação da memória de curta-duração

sem afetar a memória de longa-duração, reforçando a existência de vias distintas

para formação da memória de curta e longa-duração.

Observamos que a perda de memória de curta-duração ocorreu pela ativação

do receptor B1 e não pelo receptor B2.

Baixas concentrações de des-Arg9-BK são capazes de causar déficit na

consolidação da memória de curta-duração.

O des-Arg9-BK é capaz de abolir a memória de longa-duração na

concentração mínima de 37,5pmol.

O receptor B1 é foi expresso na área da implantação da cânula-guia e co-

localizado com células da glia (astrócitos e micróglias), mas não em neurônios.

51

7. ANEXO

52

8. REFERÊNCIAS

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RESUMO

Os efeitos das cininas são mediados pela ativação de dois receptores, B1 e B2. O

receptor B2 é preferencialmente ativada pela bradicinina (BK) enquanto o receptor

B1 é ativado pela des-Arg9-BK, metabólito da BK. O receptor B2 é constitutivamente

expresso e a expressão do receptor B1 é aumentada após lesão tecidual.

Recentemente, tem sido descrito o envolvimento desses receptores na doença de

Alzheimer, acidente vascular cerebral isquêmico e traumatismo crânio-encefálico

(TCE). Neste estudo, nós investigamos o papel da BK nos processos de memória,

tais como aprendizagem, na consolidação da memória de curta e longa-duração

(MCD e MLD) e evocação da memória. Observou-se que a injeção bilateral de BK

(300pmol/µL) interrompeu a consolidação da MCD, mas não a de MLD, avaliadas

pelo teste de esquiva inibitória. O prejuízo da consolidação da MCD devido à injeção

de BK foi bloqueado pela injeção anterior do antagonista B1, des-Arg10-HOE140,

mas não pelo HOE140, antagonista do receptor B2. Para confirmar o dado obtido

pelo bloqueio do receptor B1, o agonista sintético seletivo e bioestável, NG291, foi

injetado (300 pmol/µL) e o déficit da MCD não foi observado. Além disso, a injeção

do agonista B1, des-Arg9-BK, prejudicou a consolidação da MCD e da MLD em

doses próximas à concentração fisiológica do peptídeo (2,3 e 37,5 pmol,

respectivamente), que podem ser alcançadas durante a lesão tecidual. Foi

observado que a presença de receptores B1 em células gliais em torno da cânula-

guia tenha sido decorrente da sua implantação para injeção dos peptídeos,

confirmada por imunofluorescência. Estes dados implicam em uma possível

participação do receptor B1 no comprometimento da consolidação da MCD

observado no TCE, neuroinflamação e neurodegeneração.

65

ABSTRACT

The bradykinin (BK) receptors B1R and B2R are involved in inflammatory responses

and their activation can enhance tissue damage. The B2R is constitutively expressed

and mediates the physiologic effects of BK, whereas B1R expression is induced after

tissue damage. Recently, they have been involved with Alzheimer’s disease,

ischemic stroke and traumatic brain injury (TBI). In this study, we investigated the

role of bradykinin in short and long term memory consolidation (STM and LTM). It

was observed that bilateral injection of BK (300 pmol/µL) disrupted the STM

consolidation but not LTM, both evaluated by inhibitory avoidance test. The STM

disruption due to BK injection was blocked by the previous injection of the B1R

antagonist des-Arg10- HOE140 but not by the B2R antagonist HOE140. To confirm

the data obtained with the pharmacological blockade of B1R, biostable B2R agonist

NG291 was injected (300 pmol/µL) and no short-term memory impairment was

observed. Additionally, the injection of the B1 agonist desArg9-BK disrupted STM

and LTM consolidation at doses close to physiological concentration of the peptide

(2.3 and 37.5 pmol, respectively) which could be reached during tissue injury. The

presence of B1R located on glial cells around the implanted guide cannula used for

peptide injection was confirmed by immunofluorescence. These data imply in a

possible participation of B1R in the STM impairment observed in TBI,

neuroinflammation and neurodegeneration.

Biol. Chem. 2016; 397(4): 353–364

*Corresponding author: Hudson Sousa Buck, Department of Physiological Sciences, Santa Casa de São Paulo School of Medical Science, R. Dr. Cesario Motta Junior, 61, 11° andar, São Paulo, SP 01221-020, Brazil; and Research Group on Neuropharmacology of Aging, Sao Paulo, Brazil, e-mail: [email protected]áris Ester Dong-Creste, Ticiana Baraldi-Tornisielo and Ariadiny Lima Caetano: Department of Physiological Sciences, Santa Casa de São Paulo School of Medical Science, R. Dr. Cesario Motta Junior, 61, 11° andar, São Paulo, SP 01221-020, Brazil; and Research Group on Neuropharmacology of Aging, Sao Paulo, BrazilFernand Gobeil: Faculty of Medicine and Health Sciences, Department of Pharmacology, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Canada; and Faculty of Medicine and Health Sciences, Institute of Pharmacology (IPS), Université de Sherbrooke, Sherbrooke, J1H 5N4, CanadaWagner Ricardo Montor: Department of Physiological Sciences, Santa Casa de São Paulo School of Medical Science, R. Dr. Cesario Motta Junior, 61, 11° andar, São Paulo, SP 01221-020, BrazilTania Araujo Viel: Research Group on Neuropharmacology of Aging, Sao Paulo, Brazil; Graduate Course on Pharmacology, Institute of Biomedical Sciences, Universidade de São Paulo, Avenida Professor Lineu Prestes, 1524, 05508-900 São Paulo, Brazil; and School of Arts, Sciences and Humanities, Universidade de São Paulo, Av. Arlindo Bettio, 1000, São Paulo, SP 03828-080, Brazil

Káris Ester Dong-Creste, Ticiana Baraldi-Tornisielo, Ariadiny Lima Caetano, Fernand Gobeil, Wagner Ricardo Montor, Tania Araujo Viel and Hudson Sousa Buck*

Kinin B1 receptor mediates memory impairment in the rat hippocampus

DOI 10.1515/hsz-2015-0235Received August 27, 2015; accepted December 9, 2015; previously published online December 15, 2015

Abstract: The bradykinin (BK) receptors B1R and B2R are involved in inflammatory responses and their activation can enhance tissue damage. The B2R is constitutively expressed and mediates the physiologic effects of BK, whereas B1R expression is induced after tissue damage. Recently, they have been involved with Alzheimer’s dis-ease, ischemic stroke and traumatic brain injury (TBI). In this study, we investigated the role of bradykinin in short and long-term memory consolidation (STM and LTM). It was observed that bilateral injection of BK (300 pmol/μl) disrupted the STM consolidation but not LTM, both evalu-ated by inhibitory avoidance test. The STM disruption due to BK injection was blocked by the previous injection of the B1R antagonist des-Arg10-HOE140 but not by the B2R antagonist HOE140. Additionally, the injection of the B1 agonist desArg9-BK disrupted STM and LTM consolida-tion at doses close to physiological concentration of the

peptide (2.3 and 37.5 pmol, respectively) which could be reached during tissue injury. The presence of B1R located on glial cells around the implanted guide cannula used for peptide injection was confirmed by immunofluorescence. These data imply in a possible participation of B1R in the STM impairment observed in TBI, neuroinflammation and neurodegeneration.

Keywords: bradykinin; B1R; B2R; cognitive processes; memory impairment.

IntroductionThe kinins bradykinin (BK) and kallidin (Lys-BK) are clas-sical proinflammatory peptides released during tissue injury. Their actions lead to cell migration, vasodilation, increased vascular permeability, pain and hyperalgesia (Marceau and Bachvarov, 1998). Kinin effects are medi-ated by two transmembrane G protein coupled receptors (GPCR), namely B1 (B1R) and B2 (B2R), expressed centrally and peripherally (Regoli et al., 2001). The B2R is a consti-tutive receptor, its stimulation leading to fast desensitiza-tion (Bascands et al., 1993; Mathis et al., 1996). It mediates most of the kinin actions and has high affinity for BK and high sensitivity to low concentrations of the synthetic antagonist Hoe 140 (Regoli et al., 1998). Conversely, B1R has higher affinity to des-Arg9BK and Lys-des-Arg9-BK (Regoli and Barabe, 1980). B1R is resistant to desensitiza-tion and is barely distributed in tissues under physiologi-cal conditions (Leeb-Lunderberg et al., 2005), but shows increased densities under pathological conditions, such as chronic neurological diseases (Marceau and Bachvarov, 1998; Prat et al., 1999, 2000).

Likewise the peripheral systems, kallikrein-kinin system and all their components have been described in central nervous system (CNS) (Hori, 1968; Correa et al., 1979; Kariya et al., 1981; Perry and Snyder, 1984). Exog-enous administration of BK peptide into CNS leads to alterations in animal behavior (Okada et al., 1977), arte-rial blood pressure (Pearson et al., 1969; Unger et al., 1981; Buccafusco and Serra, 1985; Lindsey et al., 1997), and body temperature (Almeida e Silva and Pela, 1978). The

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estimated concentration of BK in whole rat brain samples is 0.6 pmol/g (Elrod et al., 1986).

Kinin B2 receptor has a ubiquitous distribution in the CNS of several species, such as rats (Ongali et al., 2003; Cloutier et al., 2004; Viel et al., 2008; Caetano et al., 2010), mice (Ma et al., 1994b; Caetano et al., 2015), guinea-pigs (Sharif and Whiting, 1991; Fujiwara et al., 1998), bovines (Kozlowski et al., 1988) and humans (Bhoola et al., 1992; Ma et al., 1994a; Raidoo et al., 1996; Raidoo and Bhoola, 1997; De Sousa Buck et al., 2002) being observed in cor-tical astrocytes (Cholewinski et al., 1991), pons, medulla, spinal cord, cortex, hippocampus (Sharif and Whiting, 1991; Fujiwara et al., 1998), cerebellum (Ma et al., 1994a), pituitary gland (Ma et al., 1994b), hypothalamus, thala-mus, caudate putamen, cerebral cortex and brain stem (Raidoo et al., 1996).

The B1R was also observed in many tissues such as cerebral cortex, cerebellum, hippocampus, pituitary gland, hypothalamus (Chai et al., 1996), spinal cord dorsal horn (Wotherspoon and Winter, 2000), thalamus, caudate putamen, spinal cord (Raidoo and Bhoola, 1997; Campos et al., 2005; Viel et al., 2008) and in the inferior olivar nucleus (De Sousa Buck et al., 2002). Induction and increase in densities of this receptor can be observed during inflammation, tissue lesion, cancer, experimen-tal treatment with bacterial endotoxins, some cytokines and growth factors or in the presence of its own agonist (Marceau and Bachvarov, 1998; Yang et al., 2001).

Our group showed that infusion of human 1–40 Aβ peptide in rats leads to an increase in kinin concentra-tion in the cerebrospinal fluid (Iores-Marçal et al., 2006), increase in B1R densities in memory related areas sug-gesting an enhanced activation of the kallilkrein-kinin

system (KKS) (Iores-Marçal et al., 2006; Viel et al., 2008). These alterations of the KKS were accompanied by neuronal loss and disruption in memory consolida-tion. Additionally, a single dose of BK administered in the rat hippocampus promoted hyperphosphorylation of Tau protein, leading to impairment of learning and memory consolidation (Wang and Wang, 2002). In this way, this study aimed at evaluating the involvement of BK in short- and long-term memory formation of Wistar rats and at characterizing the type of receptor, B1 or B2, involved in this process.

Results

BK impairs short-term memory consolidation through B1R activation

To evaluate the influence of BK on short-term memory consolidation, 300 pmol of the peptide was administered bilaterally over the CA1 hippocampal area immediately after the acquisition session (AS) in the inhibitory avoid-ance apparatus. In this paradigm, an increase in the latency to enter the dark side of the box, in the test session (TS), indicates memory consolidation. The short-term-memory consolidation was assessed 90 min later. Animals injected with BK showed no significant increase in latency [AS = 10.5 s (6.17 s/19.65 s) and TS = 21.3 s (11.18 s/62.03 s); p> 0.05] when compared to animals injected with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) [AS = 23.6 s (13.6 s/58.0 s) and TS = 32.5 s (20.3 s/298.0 s); p < 0.05] (Figure 1) indicating that BK caused short-term memory impairment.

Figure 1: Effect of BK on short-term memory formation.Bilateral injection of BK (300 pmol/μl, n = 8, ‘A’) or aCSF (n = 7, ‘B’) over the CA1 hippocampal area immediately after the acquisition session (AS), in the inhibitory avoidance apparatus (footshock intensity, 0.5 mA; interval between sessions, 90 min), impaired short-term memory formation. Data are expressed as median (interquartile range) in seconds and were significant when *p < 0.05 (Wilcoxon test for paired and non-parametric data). AS, Acquisition session; TS, test session.



K.E. Dong-Creste et al.: Memory impairment by B1 receptor 355

In order to verify which receptor is involved with this memory impairment, the pharmacological blockade of B1R or B2R was performed through bilateral injection of the B1 antagonist des-Arg10-HOE140 or the B2 antagonist HOE140 followed by BK, at isomolar concentration. The increase of latency of animals injected with the B1 antago-nist indicates that B1R blockade disrupted the memory impairment caused by the BK injection [AS = 26.8 s (15.2 s/39.5 s) and TS = 298.0 s (56.5 s/298.0 s); p < 0.05, Figure 2A]. Otherwise, injection of the B2 antagonist did not block the memory impairment caused by the BK injec-tion [AS = 28.40 s (16.0 s/138.6 s) and TS = 56.0 s (22.6 s/90.9 s); p > 0.05, Figure 2C]. Injection of the B1 or B2 antagonist followed by aCSF did not alter short-term memory con-solidation [B1R antagonist+CSF: AS = 17.8s (7.6s/32.2s) and TS = 83.8 s (37.7 s/298.0 s); p < 0.05 – B2R antagonist+CSF: AS = 17.8 s (13.1 s/70.9 s) and TS = 203.8 s (48.0 s/298.0 s); p < 0.05, Figure 2B and D].

To confirm the data obtained with the pharmaco-logical blockade of B1R, 300 pmol/μl of the biostable B2R agonist NG291 was administered bilaterally over the CA1

hippocampal area immediately after the AS [29.3 s (29.3 s/49.2 s)] in the inhibitory avoidance apparatus. No short-term memory impairment was observed as the latency in TS [233.5 s (52.5 s/298.0 s)] was significantly greater from the latency in AS (Figure 3).

BK does not impair long-term memory but desArg9-BK does

To evaluate the influence of BK on long-term memory consolidation, BK (300 pmol) was administered bilater-ally over the CA1 hippocampal area, immediately after the AS and the long-term memory formation was tested 24 h later. BK injection showed no impairment of long-term memory formation [AS = 14.6 s (11.1 s/20.6 s) and TS = 36.7 s (14.3 s/270.0 s); p < 0.05], as well as the aCSF injection [AS = 22.6 s (4.2 s/83.8 s) and TS = 182.0 s (14.3 s/298.0 s); p < 0.05, Figure 4A and C]. Considering that the effect of BK on short-term memory was mediated by B1R action, the effect of des-Arg9-BK on long-term memory formation was

Figure 2: Kinin B1R mediates the effect of BK in the hippocampus.B1R blockade disrupted the memory impairment caused by the BK injection (n = 7, ‘A’) but not the blockade of the B2R (n = 7, ‘C’). The injec-tion of B1 (n = 7,‘B’) or B2 (n = 6, ‘D’) antagonists showed no alteration on memory consolidation. Peptides were injected in a concentration of 300 pmol/μl. Data are expressed as median (interquartile range) in seconds and were significant when *p < 0.05 (Wilcoxon test for paired and non-parametric data). AS, Acquisition session; TS, test session.




Figure 4: Effect of BK on long-term memory formation.Bilateral injection of BK (300 pmol/μl, n = 8, ‘A’) or aCSF (n = 6, ‘C’) did not disrupt the long-term memory formation but injection of des-Arg9-BK did (300 pmol/μl, n = 8, ‘B’). Long-term memory forma-tion was assessed on an inhibitory avoidance task (footshock inten-sity, 0.5 mA; interval between sessions, 24 h). Data are expressed as median (interquartile range) in seconds and were significant when *p < 0.05 (Wilcoxon test for paired and non-parametric data). AS, Acquisition session; TS, test session.

Figure 3: NG291 B2R agonist do not disrupt short-term memory formation.Bilateral injection of NG291, a biostable B2R agonist (300 pmol/μl, n = 6) over the CA1 hippocampal area immediately after the acquisi-tion session (AS), does not disrupt the short-term memory forma-tion. Data are expressed as median (interquartile range) in seconds and were significant when *p < 0.05 (Wilcoxon test for paired and non-parametric data). AS, Acquisition session; TS, test session.

tested. The bilateral injection of des-Arg9-BK (300 pmol) was able to significantly block the long-term memory for-mation [AS = 12.6 s (7.8 s/28.8 s) and TS = 13.0 s (5.5 s/16.8 s), p > 0.05, Figure 4B).

The B1R agonist des-Arg9-BK leads to short- and long-term memory formation impairment in doses close to physiological concentration

In order to verify if doses close to physiological concen-tration are able to impair memory formation, decreas-ing concentrations of des-Arg9-BK were tested until no memory impairment was observed. Doses ranging from 75 to 0.6 pmol and 37.5 to 4.68 pmol were applied in short and long-term memory evaluation, respectively (Table 1). The lowest doses that caused memory impairment were 2.3 pmol for short-term memory [AS = 22.5 s (16.6 s/33.0 s) and TS = 27.3 s (8.4 s/60.3 s), p > 0.05, Figure 5A and B] and 37.5 pmol for long-term memory [AS = 16.3s (13.1 s/50.7 s) and TS = 37.4 s (35.3 s/54.3 s), p > 0.05, Figure 5C and D].

B1R immunolabelings in the injection site

In order to confirm the presence or not of B1R in the sur-rounding area of the injection site (CA1 area of the hip-pocampus) and identify in which cell type the B1R is located, qualitative double immunolabelings against B1R

and NeuN (neuronal marker), or GFAP (astrocyte marker), or Iba1 (microglia marker) were performed in brain tissue sections of the antero- posterior level of the implanted




Figure 5: Determination of the lowest doses capable of causing short and long-term memory formation impairment.The lowest doses of des-Arg9-BK leading to memory impairment were 2.3 pmol (n = 12) for short-term memory (STM, ‘A’) and 37.5 pmol (n = 5) for long-term memory (LTM, ‘C’). Bilateral injection of des-Arg9-BK at 1.17 pmol (n = 11, ‘B’) and 18.7 pmol (n = 8, ‘D’) did not disrupt short- or long-term memory formation, respectively. Data are expressed as median (interquartile range) in seconds and were significant when *p < 0.05 (Wilcoxon test for paired and non-parametric data). AS, Acquisition session; TS, test session.

Table 1: Effect of des-Arg9-BK in different concentrations (median with interquartile ranges) on short- and long-term memory.

[ ] pmol

Short-term memory

Long-term memory

AS (s) TS (s) AS (s) TS (s)

300 – – 12.7 (7.8/28.9) 13.1 (5.3/16.8)75 68.2 (11.6/96.5) 81.7 (12.7/298.0) – –37.5 11.5 (5.2/23.4) 38.1 (7.7/63.1) 16.3 (13.2/50.8) 37.4 (35.4/54.3)18.7 16.7 (11.1/100.6) 89.0 (21.2/298.0) 12.2 (8.5/23.9) 74.4 (36.9/280.5)a

9.3 9.9 (7.0/28.2) 26.1 (14.2/250.0) 18.2 (9.4/34.3) 67.2 (29.8/298.0)a

4.6 17.3 (12.5/30.6) 74.5 (20.2/108.0) 17.9 (13.5/25.3) 55.5 (37.1/136.4)a

2.3 22.6 (16.6/32.9) 27.3 (8.4/60.3) – –1.17 18.1 (11.1/38.5) 298.0 (53.1/298.0)a – –0.58 25.2 (11.1/26.4) 105.4 (31.7/166.7)a – –

Data were considered significant where ap < 0.05. AS, Acquisition session; TS, test session.

guide cannula. The contralateral side, with no cannula implantation, of the same slice served as a control. Specific labeling for B1R was observed only in the tissue surround-ing the guide cannula (Figure 6) with no labeling in the equivalent position of the contralateral side (Figure 7J–L). Very scarcely NeuN labeling was observed in the region

labeled for B1R with no colocalization for these two pro-teins (Figures 6 and 7A–C). Immunolabeling colocaliz-ing B1R with astrocytes (GFAP) and microglia (Iba1) was prevailing (Figure 7D–I). This data let us suggest that the tissue lesion promoted by the guide cannula induced the expression of B1R prevailing in astrocytes and microglia.




DiscussionOur data show that the activation of B1R by the BK metab-olite des-Arg9-BK leads to the impairment of short- and long-term memory consolidation. Most importantly, the B1 agonist dose necessary to impair the short and long-memory consolidation (2.3 and 37.5 pmol, respectively) could be considered close to physiological concentration of the peptide and be reached during tissue injury. Elrod and co-workers (1986) have found 0.6 pmol/g as the con-centration of bradykinin in the whole brain, an increase

of this concentration being possible after tissue injury or undetectable disease conditions (Elrod et al., 1986). Addi-tionally, in human plasma, values of 170 and 22 pmol/ml of BK and des-Arg9-BK, respectively, were found (Simões et al., 2013). The same work describes an increase of about 80% in desArg9-BK 45 min after exercise training with no changes in BK concentration. It is important to remark that the dose necessary to impair the long-term memory is 16 times higher than that necessary to impair the short-term memory. Considering that the agonist des-Arg9-BK is a BK metabolite, probably the amount of B1 agonist

Figure 6: Kinin B1R immunolabeling.Panel (A) depicts a composition of several images acquired at lower magnification (10 × ) representing the localization of kinin B1R labeling (red) surrounding the tissue disruption caused by the guide cannula (dotted line) and neurons labeled in green. Panel (B) shows a line draw representing the region pictured in panel (A) (dashed square) and the position of the guide cannula. Panel (C) shows a line draw showing the calculated placement of the needle. Panels (D)–(F) show images from the region below the guide cannula (injured tissue), incubated only with the secondary antibodies and represent the background fluorescence of the analyzed region. cc, Corpus callosum; cg, cingulum; CA1, field CA1 of hippocampus; CA2, field CA2 of hippocampus; CA3, field CA3 of hippocampus; PoDG, polymorphic layer of the dentate gyrus; DG, dentate gyrus; fi, fimbria. Scale bar in panel (A) is 200 μm and scale bar in panel (F) is 50 μm and is applied to panels (D)–(F).




Figure 7: Kinin B1R colocalization.Representative images showing the double immunofluorescence labeling for B1R (red) and NeuN (A–C), or GFAP (D–F), or Iba1 (G–I). The Figure shows B1R labeling localized in astrocytes (GFAP) and microglia (Iba1) but not in neurons (NeuN). Panels (J)–(L) show the absence of B1R labeling in the equivalent contralateral region, in the same slice, from the image shown on panels (G)–(I). Scale bar in panel (I) is 50 μm.




generated from the metabolism of the injected amount of BK was sufficient to impair the short-term memory but not the long-term memory.

Regardless of the well-established role of kinins in the peripheral systems, their participation in central nervous system diseases is still unclear (Amaral et al., 2010; Viel and Buck, 2011; Naffah-Mazzacoratti et al., 2014; Caetano et al., 2015). In this way, in an Alzheimer’s disease model in rats, our group reported significant increase in kinin concentration in the cerebrospinal fluid, suggesting an enhanced activation of the kal-likrein-kinin-system ( Iores-Marçal et al., 2006) and disruption in memory consolidation accompanied by an increase in B1R densities in memory related areas, including the CA1 and CA3 hippocampal areas (Viel et al., 2008). Other works concerning autoimmune CNS diseases also suggested a role for B1R, but the literature is not consensual about its exact role. Despite the numer-ous previous studies showing that targeted interruption of kinin receptor-mediated pathways predominantly exerts anti-inflammatory effects (Dutra et al., 2011; Göbel et al., 2011) one group suggests that activation of kinin B1R limits encephalitogenic T lymphocyte recruitment to the central nervous system (Schulze-Topphoff et al., 2009). It is very important to consider that CNS autoim-mune diseases as well as neurodegenerative diseases are chronic inflammatory conditions and our model is more closely related to an acute inflammatory response. In this way, the memory disruption due to B1R activation observed in this work could be more associated to mild traumatic brain injury.

The kallikrein-kinin system has been frequently asso-ciated to mild traumatic brain injury (Unterberg et al., 1986; Schilling and Wahl, 1999; Plesnila et al., 2001; Austinat et al., 2009; Albert-Weissenberger et al., 2012). Mild traumatic brain injury (TBI) is one of the major public health issues and is characterized by a traumati-cally induced physiological disruption of the brain. Many symptoms could be associated with this condition includ-ing loss of memory for events immediately before or after the incident, being associated with the disruption of working and short-term memory (Liu et al., 2013; Levin and Diaz-Arrastia, 2015). In relation to time duration, memories are similar in terms of content, but consolida-tion mechanisms are independently, separated processes (Izquierdo, 2002). Short-term memory lasts < 6 h and does not require synthesis of new proteins (Izquierdo et al., 1998; Izquierdo, 2002). Long-term memory takes about 6 h to be consolidated into a more or less stable form (Izquierdo and Medina, 1997) requiring synthesis of new proteins, making memory last for days, months or years

(Izquierdo et al., 1998; Izquierdo, 2002; Vianna et al., 2000).

It has already been shown that TBI could lead to an increase of B1R and a decrease of B2R (10–50%) in several brain regions (Ongali et al., 2006), an increase in brain tissue bradykinin, significant up-regulation of B1R mRNA, and enhanced expression of kinin receptor in cells of the traumatic penumbra (Trabold et al., 2010). The same authors show that only B2R are involved in the development of secondary brain damage, brain edema formation, and functional recovery after experimental TBI (Trabold et al., 2010). In an experimental protocol with longer observation of animals submitted to experi-mental TBI (3 and 7 d), a central participation of B1R was observed. In that work mice lacking B1R showed improved functional outcome after focal closed head injury and the protective effect persisted at later stages after trauma. Similar conditions were obtained when using a pharmacological blocker of B1R, the antagonist R-715, in wild-type animals even when the antagonist was applied 1 h after trauma (Albert-Weissenberger et al., 2012). The blocking of B2R had no effect. Functionally, the inhibition of B1R mitigated axonal damage, apoptosis of neurons, and astrocyte activation, while the impact on post-traumatic inflammation was small (Albert-Weissen-berger et al., 2012).

Another important finding of this work is the pres-ence of B1R in astrocyte and microglia, around the guide cannula. No B1R immunolabeling was observed in the equivalent region of the contralateral side of the brain, where no injury occurred. The localization of B1R in astrocytes and microglia, which are related to neuroin-flammatory response, allows us to suggest a possible signaling pathway involved in the observed responses to des-Arg9-BK.

When activated, B1R and B2R couple to G-protein Gαq, Gαi2 and Gαi3 subunits leading to an increase in cytosolic calcium. However, the cell signaling that induces the increase in calcium is different. Whereas B2R utilizes calcium from the endoplasmic reticulum, B1R uti-lizes extracellular calcium (revised by Prado et al., 2002). Calcium is extremely important for postsynaptic events necessary for activity-dependent neuronal gene expres-sion and synaptic plasticity, events that are essential for learning and memory (Lynch, 2004; Ataei et al., 2015) and, consequently, important for long-term structural and functional stabilization of synaptic connections. However, potentiation or depression of the synapse after synaptic activity depends upon the quantity and the dura-tion of calcium influx (Lee et al., 2009). Situations where increases of calcium go beyond physiological limits can




be similar to loss of neurons as happens during aging or certain neurodegenerative states (Hidalgo and Núñez, 2007). We showed that the implantation of the cannulas induced a great expression of B1R that were co-localized with microglial cells. It was already shown that in injured tissues microglial migration is dependent on B1R and calcium influx (Ifuku et al., 2007). Microglial activation and neuroinflammation are implicated in cognitive dys-function as a consequence of different causes like trauma, post-operative situations and drug abuse (Perez-Polo et al., 2015, Wang et al., 2015; Zamberletti et al., 2015). Besides, in injured tissues, activation of B1R leads to increases of neuroinflammatory responses mediated by TNFα, IL-1β and other pro-inflammatory mediators, which also cause cognitive dysfunction (Viel and Buck, 2011).

For this reason, we believe that during tissue injury, the increase in the expression of B1R can greatly increase the entrance of calcium and raises intracellular calcium concentration, microglial migration and neuroinflamma-tion, leading to memory impairment or even neuronal cell death.

ConclusionsThe tissue lesion due to the guide cannula led to the increase of B1R and this damage could be considered a type of traumatic brain injury. This data implies a possi-ble participation of B1R in the short-term memory impair-ment observed in TBI (Yang et al., 2013) as well as in the inflammation, edema and neurodegeneration (Ongali et al., 2006; Trabold et al., 2010; Liu et al., 2013). Our data corroborate recent findings considering B1R an important pharmacological target for the treatment of TBI.

Materials and methodsAnimals

A total of 170 male Wistar rats (3–4 months old; FCMSCSP, São Paulo, Brazil) were used. They were housed in groups of five per cage in a temperature-controlled room (21±1°C) subjected to a 12 h light/dark cycle, with food and water ad libitum.

All efforts were done to reduce the number of animals and their suffering. The experimental proceedings were performed according to the ‘ethics principles for the use of laboratory animals’ described by the Brazilian Society of Laboratory Animal Science (SBCAL, Brazil). The experimental protocols were approved by the Animal Ethics Committee from Santa Casa de São Paulo School of Medical Sciences, under the number 009/14.

Stereotaxic brain surgery

The animals were anesthetized (equithesin, 4 ml/kg) and submitted to a stereotaxic brain surgery for implantation of two guide-cannulas placed 0.5 mm above each side of the CA1 area of the hippocampus (coordinates: anterior -2.5 mm; lateral 2.0 mm and vertical 2.5 mm, related to bregma) (Paxinos and Watson, 2007). Five days after the surgery the animals were submitted to the evaluation of cognitive processes.

Evaluation of aversive-related memory

To evaluate this type of memory, an inhibitory avoidance shuttle box was used (Ugo Basile, Varese, Italy). The box has two chambers, a dark and a light one, separated by a guillotine-door. The method is based on the animal’s aversion for lighted places and its preference for closed and dark places. On the acquisition session, the animal was placed in the light chamber. After 2 s, the door was opened and the animal was left to explore the box. When the animal entered the dark chamber, the door was closed and the animal received an elec-trical stimulus of 0.5 mA on the paws, for 2 s. Time spent to get in the dark chamber was recorded. After that, animals were returned to their home cage. Maximum time for animals staying in the box was 5 min. On the test session, 90 min or 24 h later, for short- and long-term memories respectively, the animals were placed in the lighted side of the box again and the time spent to enter the dark chamber was recorded. The greater the avoidance latency, the more efficacious the memory process. In the test sessions, no electric shock was used. Animals were used only once in each test session.

Evaluation of the effect of kinin analogs over memory consolidation

To evaluate the effect of kinin analogs over memory consolidation, bilateral injection of the desired concentration of the peptides started 30 s after the acquisition session in the inhibitory avoidance shut-tle box and the animal tested (test session) 90 min or 24 h after de acquisition session. Peptide injections were done using gingival needle (30G) connected to a 10 μl syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) by a polyethylene catheter (PE10). The gingival nee-dle was 0.5 mm longer than the guide cannula. The syringe was placed in an automated infusion pump adjusted to inject the desired volume in 90 s. When using des-Arg10-HOE140 (B1 antagonist) or HOE140 (B2 antagonist), these antagonists were injected before BK at isomolar concentration (300 pmol/μl). Concentrations of des-Arg9-BK are described in Table 1. To confirm the data obtained with the pharmacological blockade of B1R, the biostable B2R agonist NG291 ([Hyp(3),Thi(5),(N)Chg(7),Thi(8)]-bradykinin), a synthetic B2R-selec-tive agonist with greater in vitro and in vivo potency and duration of action, was used instead of BK (300 pmol/μl; Savard et al., 2013). The time between antagonist and agonist injections was kept the short-est possible (not longer than 20 s). Injection site was histologically confirmed in all the animals. All the peptides used were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) except for the B2R agonist NG291 which was synthetized in the laboratory of Dr. Fernand Gobeil (Uni-versité de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canada). All the working solutions were prepared in aCSF.




B1R immunolabeling procedure

In order to confirm the presence or not of B1R in the surrounding area of the CA1 area of the hippocampus and identify in which cell type the B1R is located, double immunolabelings against B1R and NeuN (neu-ronal marker), or GFAP (astrocyte marker), or Iba1 (microglia marker) were performed. For this experiment a group of 5 animals (n = 5) received a unilateral guide cannula and was not injected with any solu-tion to avoid the excessive damage of the tissue. The non-implanted contralateral side of the brain served as a control. Five days after the stereotaxic surgery the animals were anesthetized with isoflurane and the brain tissue fixed via transcardiac perfusion with 4% paraformal-dehyde in 0.1 m phosphate buffered saline (PBS), pH 7.5. The brains were removed and post-fixed in the same fixation solution at 4°C for 1 d and incubated in 30% sucrose in the same fixation solution at 4°C for 1 d. The tissues were embedded in OCT compound (Neg 50, Thermo Sci., Waltham, USA) and rapidly frozen with frosting spray (Cytocool II, Thermo Sci., Waltham, USA). Frozen sections (40 μm) were obtained with a cryostat (-20°C, Micron HM525, Zeiss, Jena, Germany) and col-lected in PBS. The slices were immunohistochemically processed by free-floating for B1R receptor colocalization with neurons, astrocyte or microglia. The background was controlled incubating the tissue only with secondary antibodies. Briefly, the sections were washed three times (5 min) in PBS. Non-specific sites were blocked by incubating with goat serum (normal serum) for 1 h and incubating with primary antibody against B1 receptor (1:50) (ABR-011 Alomone Labs, Jerusalem, Israel) overnight at 4°C. Then slides were washed three times in PBS for 2 min and incubated with secondary antibody (Alexa Fluor 594, A11012 Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Grand Island, USA) for 2 h at room temperature. For the second labeling, the sections were washed three times (5 min) in PBS and incubated for 3 h with primary antibody against one of the following proteins: NeuN (ABN78, Merck Millipore, Darmstadt, Germany), Iba1 (ab108539, Abcam Cam-bridge, USA), GFAP (ab16997, Abcam Cambridge, USA). The slices were processed as described for B1R immunolabeling using a secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (A11008 Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Grand Island, USA). The slices were mounted on Superfrost slides (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, USA) and cov-erslip with ProLong® Diamond Antifade Mountant (P36961, Life Tech-nologies, Thermo Fisher Scientific, Eugene, USA). Specificity of the anti-B1R was confirmed using excess free antigen (antibody control antigen serum) before incubation with the primary antibody as a nega-tive control. Images were acquired and analyzed using a Zeiss Laser Scanning Microscope (LSM 780, Zeiss, Jena, Germany).

Statistical analysis

Data obtained in the inhibitory avoidance shuttle box were expressed as medians and interquartile ranges. Nonparametric statistics was used because of the heteroscedasticity of the data and because a 300 s ceiling was established.

Comparisons were performed between the acquisition session and the test session in each group using Wilcoxon matched-pairs non-parametric test. Due to significant differences between the acquisition session latencies of the different groups and the aCSF group, the test session latencies were not compared between different groups. All analyses were done using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA). Values were considered significant when p < 0.05.

Acknowledgments: We thank Professor Tatiana Rosado Rosenstock for the assistance in the image acquisition. This work was supported by grants from FAP-Santa Casa, Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado de Sao Paulo (FAPESP 2007/04800-0 and 2013/013656-1). H.S. Buck holds a Level 2 CNPQ fellowship (303283/2014-9). K.E. Dong-Creste and T. Baraldi-Tornisielo received fellowships from CAPES-PROSUP. Confocal images were obtained at the INFAR/UNIFESP Confocal and Flow Cytometry Facil-ity, which is supported by FAPESP.

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