Dinamica estrus tural dc macronu)lerule^

(LI. Cornudella, ed.)

Treballs de la SCB. Vol. 48 (1998) 147-166

LES ESTRUCTURES DEL DNA

LOURDES URPI' i FERRAN AZORIN'

1. Departament d'Enginveria Quimica, ETSEIB. Unit'ersitat Politecnica de Catalunt'a.

Av. Diagonal, 647.08028 Barcelona.

2. Departanient de Biologia Molecular i Cel-hdar. Institut de Biologia molecular de

Barcelona, CSIC.

Jordi Girona, 18-26. Barcelona.

SUMMARY

The DNA molecule is structurally polymorphic and, depending on the precise envi-

ronmental conditions , it can exist under a variety of different structural conformations

which include different types of double stranded helices, either right handed (B-DNA, A-

DNA, etcetera) or left-handed (Z-DNA), but also triple-stranded and tetra-stranded con-

formations. In this paper we will describe briefly the structural characteristics of the con-

formations that better reflect the high degree of structural polymorphism of the DNA

molecule.

INTRODUCCIO

La molecula del DNA es estructuralment

polimorfica. Quan l'any 1953 James Watson i

Francis Crick van proposar el famds model

de la forma B del DNA, ja es coneixia l'e-

xistencia d'almenys una altra forma estruc-

tural diferent del DNA. La resolucid de 1'es-

tructura de la forma B del DNA es va fer

principalment tenint en compte els diagra-

mes de difraccid de raigs X de fibres de DNA

obtinguts per Rosalind Franklin i Maurice

Wilkins. Aquests estudis mostraven que

1'estructura del DNA depenia del grau d'hi-

dratacid de les fibres i, tambe, del tipus de

contrail emprat en la seva preparaci6.

Aquests diagrames de difraccid es podien

classificar en dos grups: els de tipus B, que

corresponien a la forma hidratada del DNA i

que van ser els que resolgueren Watson i

Crick, i els de tipus A, que s'observaven en

disminuirel grau d'hidratacio o en presencia

de determinate cations (Franklin i Gosling,

1953 ). La resolucid estructural d'aquests 61-

14S LO( 7tl>l. S I RI'l, { 1:118 . L\ i/^JKLV

Tai i n I . Polimortismc cslructural del DNA

ESTRUCTURES BICATENARIES

DUPLEXS ANTIPARAL•LELS

FORMES DEXTROGIRES

FORMES LEVOGIRES

HOMODUPLEXS PURINICS

HOMODUPLEXS PIRIMIDINICS

DUPLEXS PARALLELS

ESTRUCTURES TRICATENARIES

TIPUS I, Y * (R.Y)

TIPUS II, R * (R.Y)

ESTRUCTURES TETRACATENARIES

TETRAI'LEXS DE GUANINESTETRAPLEXS DE PIRIMIDINES

tims, quecorresponen a la forma A del DNA,va trigar encara uns quants ant's. Aixi doncs,la variabilitatconformacional del DNA eraja

palesa en els primers experiments adrecats a

la determinaci6 de la seva estructura.

Avui sabem que el grau de polimorfisme

estructural del DNA es enorme i que, depe-nent de la seva sequencia nucleotidica i deles condicions experimentals precises, lamolecula de DNA pot adoptar in vitro unampli ventall de conformacions estructuralsdiferents. La taula 1 resumeix les mes carac-teristiques. En primer Iloc, trobem el grupd'estructures bicatenaries que inclou les for-

B-DNA, A-DNA

C-DNA, D-DNA,...

Z-DNA

d(GA) • d(GA)d(G)•d(G)d(A')d(A)

d(C') d(C)d(C'T) • d(CT)

d(A)•d(T)d(GA) • d(GA)

d(C'T)[d(G) • d(C)ld(C'T)[d(GA) • d(CT)[d(T)[d(A) d(T)]

d(G)[d(G) d(C)[d(GA)[d(GA) • d(CL)]

mes A i B, altres conformacions estretament

relacionades amb aquestes (formes C i D),

pero tambe conformacions que tenen carac-

teristiques estructurals molt diferents, com

pot ser el sentit de gir de la doble helix (for-

ma Z), l'orientacio de les cadenes polinucleo-

tidiques (duplexs parallels) o la presencia

d'aparellaments no canonics (duplexs ho-

mopurfnics o homopirimidinics). La mole-

cula del DNA tambe pot formar estructures

tricatenaries i tetracatenaries, resultat de

l'associacio de tres o quatre cadenes nucleo-

tidiques respectivament. Aquestes estructu-

res multicatenaries tambe poden ser de dife-

1'1SsSi l'( /?LS 1)LLI).A.1 111)

rents tipus, segons la naturalesa qufmica de

les cadenes que formen el complex i de la

soya oriontaci6 relativa.

En aquest treball pretenern descriure

breument els trots mes caracteristics d'algu-

nes de les conformacions del DNA, les mes

representatives. No volem fer una analisi

exhaustiva de totes i cadascuna d'elles; vo-

lem simplement destacar aquells aspectes

que reflecteixen millor la variabilitat confor-

macional del DNA. El lector interessat tro-

bara en aquest treball cites bibliografiques

que li permetran aprofundir en aquesta

tematica.

ESTRUCTURES BICATENARIES DEL

DNA

Com ja s'ha indicat a la introduccio, a

partir dels estudis de difracci6 de fibres es

van determinar les caracterfstiques de la for-

ma B (Watson i Crick, 1953), que va ser la pri-

mera estructura bicatenaria del DNA que es

va coneixer. Despres, es van poder interpre-

tar cis diagrarnes cle difraccio de la forma A.El 1979 va succeir un fet important per a

la determinacio estructura] del DNA. El

grup d'Alexander Rich va descobrir una

nova estructura del DNA (Wang of 171.,1979)clue, a diferencia de les formes A i 13, es una

soic gran

a)soic petit

helix levogira. Va ser anomenada forma Z a

causa de la ziga-zaga que descriu I'esquelet

sucre-fosfat. Fins aquesta data tot el conei-

xement estructural que es tenia del DNA

procedia dels estudis de difraccio de fibres.

La descoberta de la forma Z es va for a partir

d'un dels primers oligonuclebtids cristal-lit-

zats com a monocristall. Aix6 va ser possi-

ble gracies als avencos en sintesi organica

d'oligodesoxiribonuclebtids. La difracci6

de raigs X de monocristall aporta moltes

mes dades que la de fibres i, per tant, els re-

sultats experimentals son molt mes rics. Ara

be, la metodologia de resoluci6 d'estructura

es molt mes complexa. A partir d'aquesta

data es van cristal•litzar altres sequencies

que van aportar mes informacio sobre les

diverses conformacions del DNA. Aixi, el

1980 es va resoldre ]'estructura del primer

oligonuclebtid en forma B (Wing of al.,

1980), i el 1981, la del primer oligonuclebtid

en forma A (Shakked of al., 1981). Moltes

mes estructures d' oligonucleotids s'han es-

tudiat per difraccio de raigs X de monocris-

tall en el periode que va des de principisdels vuitanta fins a l'actualitat. Mes recent-

ment, la ressonancia magnetica nuclear

(RMN) tambe s'ha mostrat molt eficac per a

l'estudi estructural del DNA.

Com altres tipus de molecules, les coor-

denades de les estructures d'oligonuclob-

soic gran

I it u v 1. InIcraccions de punt d'hidroLcn dc tipu. \\ arson-('rick del, pare]]. dc -,t. :1 I (a) i C G (h). I ambe es rnostra la

situacio dell dos solcs (modi((cat de Calladinc i Ureic, I997).

I ^O /()I RI )L1 ( 7i l ' l , I / 7RKJ \ . i/ORI \

I u'i k \ Rcprr,rnwcio r,yucnuuica <1 una <li,bIC hcliy pcr dclinir alsun, kick pardntctrc,, dc rntaci>i I <Ic tran,I'lcln quc <Ic,-

criuen la confornaci6 del DNA ( adaptat de IIMBO Workshop, 1989).

tids resoltes per cristal.lografia o per RMN,

es dipositen en un banc de dades. Aquestbanc s'anomena ,Nucleic Acid Database,,(NDB), i es publicament i Iliurement accessi-ble per Internet a I'adreca http://ndbser-ver.rutgers.edu. D'aquesta manera es pot

disposar dels details estructurals d'aquestesmacromolecules. Tambe aixi s'obre la possi-

bilitat de comparar estructures relaciona-

des, com tambe de fer estudis estadistics,

donat l'augment important d'estructures

noves.

Parametres conformacionals de les

estructures bicatenaries

El fet comu de les estructures bicatena-ries es que les dues cadenes nucleotidiquesdescriuen una helix. La forma de la molecu-

la es cilindrica amb les bases nitrogenades al'interior i l'esquelet sucre-fosfat a ]a perife-

ria. Les dues cadenes de DNA interaccionen

a traves de ponts d'hidrogen especifics en-tre les bases nitrogenades. A la majoria deconformacions del DNA bicatenari, 1'espe-

cificitat entre bases consisteix en el fet queuna determinada base purinica interacciona

amb una determinada base pirimidinica

(l'adenina amb la timina, i la guanina amb la

citosina), com mostra la figura 1. Aquests

aparellaments de bases van ser enunciats

per primera vegada per Watson i Crick, en

el seu model de ]a forma B, per6 els presen-

ten tambe la forma A, la forma Z i altresconformacions. Un altre tret coma de les es-tructures bicatenaries es que la immensamajoria to les dues cadenes en orientaci6

5' -+ 3' antiparal•lela. I tambe, que presenten

II.:SLSIR I (/I RL/ I )J/ I)\.I /1/

diculars a l'eix de l'helix; etc. Vegeu la taula

2 i les figures 2 i 3.

Caracteristiques estructurals de les formes

dextrogires : A, B, C i D

Forma A Forma B Forma Z

I k ,i ii> I)ue iinataCS h>rprndicuIar ilc ICS urs confur-

macion's hicatenaries inc' conegudcs del I)NA: A, 13 i Z

(nuxliticat de Chandrasekaran ct al., 1989).

dos soles caracteristics (sole gran i sole petit)

perque els enllacos glicosidics de cada pa-

rell de bases es troben tots dos a la mateixa

Banda (figura 1).Els parametres mes basics per descriure

la conformacio del DNA son: els angles detorsi() de I'esquelet sucre-fosfat, els possi-

hles pleginici1 de la 2'-desoxiribosa i la

conformacio de I'enlla4 giicosfdic (enllac en-

tre la base i el sucre). La definiciO d'aquestsparametres es pot trobar en obres mes ex-tenses (Saenger, 1984; Blackburn i Gait,1996; Calladine i Drew, 1997).

Pel fet de ser una helix, les estructures bi-

catenaries del DNA tambe es poden des-criure amb els parametres tipics de les es-

tructures helicoidals: el pas de rosca (P), el

nombre de nuciebtids per pas de rosca (n) i('angle de gir d'un nucleotid al segiient (Q).S2 = 360°/ n.

Hi ha una serie de details de les estructu-res hicatenaries del DNA que fan necessariala definicio de mes parametres (figura 2).

Per exemple, els parells de bases no estancentrats a I'eix de 1'helix, sin() que estan des-pia4ats una certa distancia; els plans delsparells de bases no son exactarnent perpen-

A la conformacio B del DNA, les bases

s'apilen en una disposicio perpendicular a

I'eix de l ' helix, el qua] travessa les bases (fi-

gura 3). El plegament dels sucres es C,'-)'ndo,cosa que estableix la distancia entre fosfats

consecutius d'una mateixa cadena en 7,0 A

(noes gran que a la forma A). Una con-

sequencia d'aquesta conformacio global es

que els dos soles tenen una profunditat sem-

blant i una amplada diferent (vegeu la taula

2). La forma B to 10 parells de bases per volta

d'helix, amb un pas de rosca de 34 A i, per

tant , una ascensio per parell de bases de3,4 A. Ja en els estudis de difraccio de fibres

es van posar de manifest altres conforma-

cions anomenades C i D, que tradicional-ment s'han considerat relacionades amb laforma B; de manera que amb el terme deafamflia Ba es fa refermncia a les tres formes(B, C i D). Les formes C i D, per6, presentenparametres conformacionais molt diferentsde la forma B. Les formes C i D tenen menysimportancia que la forma B i nomes s'obte-nen en condicions especials. Tota la infor-inacio d'aquestes conformacions prove delsestudis de difraccio de fibres, ja que no s'hacristal•litzat cap oligonucleotid en aquestesconformacions, ni tampoc noes tenen dadesde RMN. Aixo fa que la informacio siguimes pobra. La forma C s'ohte amb sals de litia humitat relativament baixa . Aquesta con-formacio to 28 parells de bases en trey voltesd'helix. La forma D es presenta en sequen-cies A-T alternants; la caracteristica princi-pal es el sobrecargolament que presenta1'helix: 8 parells de bases per volta.

Les caracteristiques estructurals de laforma A son molt diferents de les de la fami-lia B. Les bases estan desplacades 4,5 A de

l / 0/ III) I /i'l'l I / KKI \ V()lrl \

I %i i %I I'nrumctres caracteristics de Ic, principals estructures bicaten5rics (1c] DNA

PARAMETRES

sentit de I'helix

FORMA A

dc^tr( Ira

FORMA B

dcyIrogira

FORMA Z

k ^ itgir<t

nre_ nucleotids /volta 11 10 12

angle de gir /p.b. (°) 32,7 36 alternant -9 / -51

desplacament/pb (A) 4,5 -0,2 a -1,8 -2 a -3

asce ns i o /p .b. (°) 2,56 3,3 a 3,4 3,7

inclinac io / p.b. (° ) 20 -6 -7

plegament de la

2'-desoxiribosa

C,'-endo CG'-endo alternant

Cz -endo / U-endo

ampl. sole gran (A) 2,7 11,7 8,8

ampl. sole petit (A) 11,0 5,7 2,0

fond . sole gran (A) 13,5 8,8 3,7

fond . sole petit (A) 2,8 7,5 13,8

conformacio de

1'enllac glicosidic

anti anti alternant anti/syn

jNota de la taula 2

p.b., de parell de bases

ampl.: amplada

fond.: fondaria

La denominacio "sole gran,, i ,sole petit,, es d'acord amb les miles dels dos soles a la forma B. En canviar de

forma es mante la denominacio, perO els adjectius ,petit,, i ,gran, no concorden sempre amt, It. miles relal Ives

dell soles.

l'eix de ]'helix i aixo crea un forat al centre

de I'helix de 3 A de diametre (figura 3). Una

volta d'helix conte 11. earells Lie bases i el

pas de rosca es de 28 A, cosa que propor-

ciona una ascensio per parell de bases de

2,56 A. Per tal de mantenir una separacio

normal entre parells de bases consecutius

amb una bona interaccio de van der Waals

(3,4 A de separacio), les bases s'apilen amb

un angle d'inclinaci6 de 20°. El plegament

dels sucres es C; -endo, laqual cosa d6na Iloc

a una separacio de 5,9 A entre dos fosfats

consecutius at llarg d'una cadena. Un resul-

tat d'aquestes caracteristiques estructurals

es que els dos soles son molt deferents en

amplada i fondaria (taula 2).

Caracteristiques estructurals de les formes

levogires: Z-DNA

La caracteristica principal de la forma L

Os que el sentit de gir de I'helix es cap a l'es-

querra (levogira). Al Ilarg de cada cadena

nucleotidica hi ha una alternanca de la con-

formacio de l'enllac glicosidic dels nucleo-

sids que se succeeixen: anti -syn. Una base

en conformacio anti (normalment una piri-

midina) s'aparella per ponts d'hidrogen

amb una base en conformacio si ii (normal-

ment una purina). Per aquest motiu els dos

sucres d'un parell de bases tenen una orien-

taciO a l'espai molt diferent, com es mostra a

la figura 4. A causa de l'alternanca d'en-

03'

I.1(1 is \ 4. (ontxmacio dcl pare II he bascs (i C a Ia forma Z.

Les tletxes indiquen la diferent orientacib dels sucres, quc

cs deguda a la diferent conformaci6 dels dos enllacos gli-

cosidics: s (.crn) per a la 2'-desoxiguanosina, a (anti) per a la

2'-desoxicitidina (nwdificat de Saenger, 1994).

]tacos glicosidics, que produeix 1'alternanca

d'orientacions dels sucres al llarg de la cade-

na nucleotidica, la ]fnia que uneix els fosfats

descriu una ziga-zaga, d'on prove el nom de

Z. L'alternanca en la conformaci6 de l'enllac

glicosidic va unida a I'alternanca en el ple-

gament del sucre: un enllac glicosidic anti

correspon a un sucre C,'-ends i un enllac gli-

cosidic st/n, a un sucre C,'-endo. Coin que la

forma Z suposa una alternanca d'enllac gli-

cosidic st/n i anti, i les purines poden adop-

tar mes facilment la confomacio st/n que les

pirimidines, la forma Z, es presenta basica-

ment en sequencies alternants pirimidina-

purina (i amb mes contingut de parells C•G

clue A-T).

Un factor destacable de la forma Z es el

diferent valor de Tangle de gir per a la

sequencia d(CpG) (-9°) i per a la sequencia

d(GpC) (-51°); aquesta diferOncia no es pro-

dueix a les helixs dextrogires. Una con-

sequencia d'aquest fet es que la distancia

que separa dos fosfats consecutius al llarg

d'una cadena depOn del nucle6sid que hi

hagi al rnig; si to l'enllac glicosidic stn es

7,5 A i si el to anti es 6,2 A, en contrapo'sicio

amb les formes dextrogires on tots els fos-

fats son equivalents i estan separats per la

mateixa distancia.

Les particularitats de la forma Z respecte

a les formes dextrogires del DNA donen lloc

ILK/. /K( ( 11 RI SW:I1)\I Iii

a una mida global diferent: el DNA Z es una

helix mes prima, de tal manera que el diame-

tre de la base fa 18 A en comparaci6 dels 20 A

de les formes dextrogires (figura 3). Tambe

els fosfats de les dues cadenes son mes a

prop: 8 A, en comparaci6 amb els 11,7 A que

separen els fosfats de ]a forma B. Aix6 expli-

ca que la forma Z requereixi la presencia de

contraions (Mg'', Na', [Co(NH)j'').

Factors que afecten la conformaci6 de les

estructures bicatenaries del DNA

Els factors que determinen la conforma-

ci6 del DNA son ]a sequencia de bases i les

condicions del medi en el qua] es troba. Per

Raman, ressonancia magnetica nuclear

(RMN), infraroig i dicroisme circular, s'ha

posat de manifest que tots els oligomers de

DNA tenen forma B en soluci6 aquosa dilu'f-

da a pH 7 i una concentracio de 0,1 - 1,0 M

de NaCl. Per tal que un oligonucle6tid

adopti una conformacio diferent de la B cal

fer decreixer l'activitat de I'aigua que contO.

Aix6 s'aconsegueix augmentant-ne la con-

centraciO de sal, addicionant-hi cations de

metal is pesants o acid icionant-hi alcohol.

Inicialment els estudis de difraccio de fi-

bres de DNA, i posteriorment la difracci6 de

monocristalls d'oligonucleotid, han posat de

manifest la influOncia de la sequencia de nu-

cleotids en la conformaci6. Les correlacions

mes Glares entre sequencia i conformaci6 s6n:

1. Gs seguides (i Cs seguides) afavorei-

xen la forma A.

2. L'alternanca de bases CG afavoreix ]a

forma Z.

3. L'abundancia de parells AT afavo-

reix la forma B.

4. Les sequencies generals que no com-

pleixen els punts anteriors I i 2 presenten

normalment la forma B.

Cal mencionar un fet curi6s observat en

1I J LU( 1/1)1.s ( AT/ / [AIR I \ ILUIiL\

dues segiiencies relacionades , que es lacoexistencia de les formes A i B en un ma-teix cristall . 0 sigui , que una mateixasequencia en un medi determinat pot existiren dues conformacions diferents . En con-cret, aix6 s ' ha observat per les sequenciesd(GG"'UA"`UACC) i d(GGTATACC) (Ken-nard i Hunter, 1989 ). En aquests casos I'ex-plicacio cal buscar- la en el tipus d'empaque-tament de les molecules al cristall, que es uncas particular de com les condicions delmedi afecten la conformacio . La xarxa cris-tal.lina es formada per molecules de formaA que es disposen al voltant dels eixos sena-ris helicoIdals de la xarxa (grup espacial P6)i originen canals de 26 A de diametre. Enaquests canals se situen les molecules deforma B . La coexistencia de dues conforma-tions de la mateixa sequencia en el mateixcristall indica que les dues conformacionsson properes en energia.

La hidratacio es un aspecte de les condi-cions del medi i, per tant , afecta la conforma-cio del DNA. Com ja s'ha esmentat, la formaB s'obte a alta hidratacio i les formes A i Z, ahidratacio mes baixa . En Ia resolucio de mol-ted estructures d'oligonuclebtids per cris-tallografia s'ha posat de manifest que hi hamolecules d'aigua , ions i molecules petites,que interaccionen amb el DNA i, per tant,son factors importants en l'estructura delDNA. Si el solvent (aigua majoritariament)no esta ordenat, no apareixen pies clars enels mapes de densitat electr6nica . L'absenciade pies de solvent generalment indica quel'aigua esta desordenada . La falta d'aiguaprop dels atoms carregats o electronegatiusseria una situaci6 desfavorable energetica-ment . En les tres conformations principalsdel DNA s'han localitzat molecules d'aiguaen posicions caracteristiques . Aixi, els do-decamers en forma B que tenen a la zonacentral la sequencia AATT presenten enaquesta zona el sole petit estret i ocupat peruna fila de molecules d'aigua que interaccio-

nen d ' una manera especifica amb el DNA.En canvi, altres segi_iencies en forma B pre-senten el sole petit mes ample , de maneraque allotja dues files de molecules d'aigua,tambe amb interaccions especffiques. La for-ma A to poques aigues ordenades al sole pe-tit, contrariament a la forma B . Aquest fet hade ser degut a la diferencia de mida entre elssoles de les dues conformacions . De maneraque ambdues formes presenten hidratat elsole que es mes estret, o sigui, el sole petit a laforma B i el sole gran a la forma A. A la formaZ tambe s ' ha trobat una hidratacio carac-terfstica, formada per dos tipus d'aigues si-tuades al sole petit. Una aigua estabilitza laconformacio syn de la 2' -desoxiguanosina, jaque forma un pont d'hidrogen amb el N2 dela guanina i un altre amb un oxigen del fosfatdel mateix nucleotid . L'altra aigua formauna espina al llarg del sole perque interac-ciona amb 1'02 de citosines de parells de ba-ses consecutius . Aquest esquema d'hidrata-cio esta limitat als parells C.G, ja que en elsparells T•A no s'ha observat. L'adenina no toel grup N2, per tant, la interaccio en que par-ticipa aquest grup no es possible. 0 sigui,que la hidratacio estabilitza mes un parellC•G en forma Z que un parch l T•A en forma Z(vegeu les figures 1 i 4).

Variabilitat dels parametresconformacionals de les estructuresbicatenaries del DNA

La resolucio d'estructures per difracciode raigs X de monocristall ha posat de ma-nifest 1'existencia d'un important grau dediversitat en els valors precisos de les va-riables conformacionals de les estructuresbicatenaries del DNA, en el sentit que unfragment de DNA no presenta les mateixesvariables conforniacionals per cada nucIe6-tid. De les dades de difraccio de fibresnomes s'obte la mitjana de les variables; aixidoncs, la diversitat conformational no es

I[.1t::SIR ( (II R/S/)E11 )\ I I

manifesta . En aquest sentit, les lades de la

taula 2 son valors que provenen d'estudis

de fibres i que normalment estan d'acord

amb els valors mitjans de les variables dels

oligonucleotids . Tanmateix , s'ha observat

una clara discrepancia entre els valors mit-

jans de les variables en octanucle6tids cris-

tal-litzats en forma A (Verdaguer et al., 4991)

i els valors obtinguts de fibres.

Un exemple de la variabilitat de la forma

B es clue alguns nucleotids presenten els su-

cres en conformacio C,'-endo, quan a la for-

ma B el plegament caracteristic dels sucres

es C,'-endo. Els nucleotids de pirimidines (C

i T) tenen una tendencia mes acusada a

adoptar la conformaci6 C; -endo que els nu-

cleotids de purities (G i A); i tambe influeix

el tipus de nucleotids contigus (Subirana ct

al., 1995).

Amb les dades experimentals de que es

disposa , es manifesta que no hi ha cap parell

de nucleotids consecutius que sigui total-

ment rigid . SegG ncies similars poden

adoptar diferents conformacions segons les

interactions que estableixin amb molecules

veines. Tanmateix , estudis estadistics realit-

zats amb estructures en forma B (Subirana i

Faria , 1997) mostren que la variabilitat

intrinseca de cada parell de nucleotids es di-

ferent , i que les sequencies flanquejants po-

den tenir nomes una petita influencia.

Nomes per al pas de nucleotids YR (pirimi-

dina-purina), sobretot per als passos CG i

CA/TG, hi ha una influencia acusada dels

nucleotids flanquejants . La qua] cosa equi-

val a dir que els passos CG i CA/TG tenen

una gran variabilitat conformacional, i la

recta de passos de dinucleotids son mes rf-

gids. Encara es disposa de relativament po-

ques dades per fer un estudi estadistic corn-

plet de les tendencies conformacionals de

les sequencies . Hi ha passos de dinucleotids

dell quals no es to prow informacio per esta-

blir les sever caracteristiques . El pas TA n'es

un exemple , to la caracteristica de tenir un

angle de gir mes elevat de la mitjana de la

forma B, perO en contraposicio hi ha una es-

tructura amb un valor acusadament mes pe-

tit (Urpi et al., 1996).

La forma A tambe mostra una considera-

ble variabilitat conformational. Un estudi

recent (Fernandez et al., 1997) posa de mani-

fest que una mateixa sequencia pot variar

molt la seva conformacio segons les condi-

cions del medi. Aquest estudi s'ha realitzat

amb I'oligonucle6tid d(pCCCGCGGG), que

ha estat cristal•litzat`en cinc condicions defe-

rents, i en cada cas la conformacio varia, tot i

mantenir-se sempre dins la forma A. S'ob-

serva un canvi gradual d'alguns parametres

en les tint estructures, des de I'estructura

mes hidratada o d'empaquetament mes

obert a l'estructura menys hidratada o

d'empaquetament mes compacte. Aixi,

s'observa una variacio molt important en

I'amplada del sole gran; si es considera la

distancia P-P a traves del sole gran, per a

l'estructura mes oberta es 5,7 A i per a la rites

compacta es 0,7 A. Tambe la curvatura de

I'eix de I'helix canvia (de 8,4° a 20,8°) de l'es-

tructura mes oberta a la mes compacta.

En alguns casos la variabilitat conforma-

cional es tan gran que un duplex en forma B

pot presentar en alguna zona parametres

caracteristics de la forma A. Aquest es el cas

de l'hexamer d(CTCGAG) (Wahl ct al.,

1996), que to el plegament de les quatre

2'-desoxiriboses terminals en C,'-endo, fet

que els autors interpreten que esta relacio-

nat amb la facilitat de transicio a la forma A.

De la forma Z, s'ha dit habitualment que

es mes rigida (menus variable) que Ies for-

mes A i B. Aquesta afirmacio prove del fet

que la majoria d'oligonucleotids cristal.lit-

zats en forma Z presenten els mateixos tipus

de contactes entre molecules, cosa que afecta

els parametres conformacionals. Tanmateix,

un estudi recent d'una mateixa sequencia

cristal•litz_ada en dues conditions diferents

en forma Z (Malinina ct al., 1998) i compara-

/ ' I UI I/I )/ I IIV I I.I/I? VURI A

da amb la mateixa sequencia cristal.litzadaanteriorment tambe en forma Z per6 en con-dicions diferents, mostra que la forma Z estan variable com les formes A o B.

Estructures amb cadenes nucleotidiquesque formen diversos duplexs

t-:Is ultims anvs s'han determinat estruc-tures d'una serie d'oligonucleotids que hanposat de manifest l ' existencia de conforma-cions diferents de les esmentades anterior-ment. En diversos casos s'han relacionatles noves estructures amb la seva funciona-litat, pero de moment son nomes hipotesis.Les seves sequcncies son: d (CCGCGG),d(AGGCATGCCT) i d(GCGCGCG). En capdels casos no era previsible a partir de lasequencia l'estructura que s'ha observat. Elfet coma en aquestes estructures es que lapart central presenta una conformacio cone-guda ( A o Z), pero als extrerns de lessequcncies la conformacio es diferent de lesconformacions ja establertes . Un altre fetcaracteristic d'aquestes estructures es que lamateixa cadena nucleotidica forma mesd'un duplex (dos o tres duplexs ). Per aquestmotiu s'han relacionat aquestes estructuresamb funcions com la replicaci6 i la trans-cripci6.

L'oligonuclebtid d(CCGCGG) forma unduplex a la zona central que s'obre pels ex-trems ( Malinina ct al., 1994). El tetramer cen-tral (CGCG ) forma un duplex en forma Z, iles citosines 5' de les dues cadenes del du-plex no interaccionen amb les guanines cor-responents de ]a cadena complementaria,sine que s'orienten cap a 1 ' exterior del du-plex i interaccionen amb les guanines cor-responents d'un altre duplex . De manerasernblant , les guanines terminals 3' interac-cionen amb les citosines corresponents delmateix duplex vei (figura 5 de ]'annex 5). Esprodueix , doncs, una associaci6 de dos du-plexs en conformaci6 Z al centre que bescan-

vien les seves citosines terminals. Totes lesinteraccions dels parells de bases C G sondel tipus Watson -Crick. Aquesta estructurainusual als extrems de la sequencia respon atfet que la sequencia no es alternant C •G alsextrems, cosa que dificulta l'adopci6 de laconformacio Z. La macroestructura forma-da pels dos duplexs associats , a mes de nman-tenir -se per interaccions de ponts d'hidro-gen dels quatre parells de bases dellextrems, tambe esta estabilitzada per un i6sodi que se situa a ]a part central entre elsdos duplexs i que es coordina a 1'06 d'unaguanina de cada duplex. (Aquest i6 no s'harepresentat a la figura 5 de l'annex 5).

Una altra estructura que to similitudsamb l'anterior ha estat determinada poste-riorment (Nunn i Neidle , 1996). Es tracta dela sequencia d(AGGCATGCCT), que pre-senta l'octamer central en forma A i els nu-cleotids 5'-A i 3'-T orientats cap a ('exteriordel duplex i interaccionant amb els nu-cleotids complementaris d'un duplex vei.Malgrat ]a diferent conformacio de la zo-na central [Z per d (CCGCGG) i A perd(AGGCATGCCT)], el tipus d'interacci6dels nucleotids terminals es analeg enaquestes dues estructures , com tambe ho esla macroestructura de quatre cadenes nu-cleotidiques que es forma.

La sequencia d(GCGCGCG) tambe to

una estructura amb analogies amb les es-

tructures anteriors, pero to particularitats

que la diferencien , que provenen de la Ion-

gitud de la sequencia . Aquest oligonucle6-

tid no es totalment autocomplementari, sinO

que to una base extra , nomes sis de les set

bases pollen formar un duplex amb apare-

Ilaments complementaris C.G. L'estructura

determinada (Pan et al., 1997) mostra qu.' la

5'-G es la base que no forma aparellaments

C•G i que la resta de la sequencia forma un

duplex en forma Z. Les guanines 5' de les

dues cadenes del duplex (G1 i G8) adopten

la conformacio anti/ C,'-endo, que s'aIlunya

II:SIiSIR( (1I RLN 01i l)\_I /-5 -

a)

b)

G, -C2-G3-C4-G5-C6-G7

G14-C13-G12-C11-G10 -C9 - G8

G, - C2 - G3 - C4 - G5 - C6 - G7 G1 - C2 - G3 -C4 -

G5 - C6 - G7

G14-C,3-G12-C11-G1o-C9-G8 G14-C13-G12-C11- G10-C9 - Ge

4PARELL DE BASES HOOGSTEEN INVERTIT

C) d)

Fiat u v (,. a ) Nunteraeic dell nucleutids que tdrmen un duplex a I'estructura de I'heptamcr d((iCGCG('G): I') inteaeeion,

cntre dos duplexs veins ( tin duplex representat en gruix normal i I'altre, en negreta ) a tray s dun parcll G G: C) i I) parelI de

bases G-(i amb interaccions de punt d'hidrogen de tipus Iioogsteen i de tipus I Ioogsteen in \ crtit, respectivament.

totalment de la que tindrien si adoptessin la

forma Z. Aquestes guanines (Cl i GH) s'apa-

rellen amb altres guanines de l'extrem 5'

d'un duplex vei mitjancant interaccions del

tipus Hoogsteen invertit ( figura 6). En

aquest cas es forma una macroestructura in-

finita de duplexs mitjancant ponts d'hidro-

gen intermoleculars G•G.

ESTRUCTURES TRICATENARIES

Les estructures tricatenaries o triplexs

resulten de l'associacib d'un fragment de

DNA bicatenari amb una tercera cadena de

DNA (figura 7 de 1'annex 5). Tant la tercera

cadena com el fragment bicatenari poden

ser de naturalesa ribonucleotidica (RNA) i

la formacio de triplexs de RNA o de triplexs

hibrids DNA-RNA esta ampliament de-

mostrada. De fet, la primera estructura tri-

catenaria descrita, l'anv 1957, corresponia a

un triplex de RNA (Felsenfeld et al., 1957).

En aquest treball tractarem nomes el cas

dels triplexs de DNA yue ha estat motiu

d'excel-tents revisions recentment (Cheng i

Pettitt, 1992; Radhakrishnan i Patel, 1994;

Mirkin i Frank- Kamenetskii, 1994; Bernues i

Azorin, 1995; Frank-Kamenetskii i Mirkin,

1995).El nostre coneixement de les caracteristi-

ques estructurals dels triplexs prove princi-

palment d'estudis de RMN que hart permOs

la determinacio estructural de diversos ti-

I ?,v IHI RI)I ( kl'I. / I,RR I \ 1/()R/\

A

CNCHI

H^NS^H...__.-•

H,C'ON'

C

/\ S

\\ H^C•N+-

H-W T C

A

R/H 02

B

R

TIPUS I

H

I CHI

C\C'N'/

T

H

CH2

H^^^H--"-_O\

MSC \Cb^G\ H^N

T C'^H

// AN'

\ '

M C4 C^ N\

^C\R/

N,H

R

I

TIPUS II

HNC

C'-^N'

H'^C•f%

A C'-H

HAM

H O•CH,

pC.^M

R' C\H

\R

O

pr R

H

H- Ne\ HO'• /

7 C^cl

H^Cv^ ^^ \\ HNS C

Ca_N'

R^

N"C\

\R

WIH- ---------O°

H

H

R C. H

N'

I C* I04C\'P ''' "H

tH

H

%H

- H- W.H

C..r- C.

H,re

O/R NY H•---•._

H

R

H

R

I u,i a s S . w Rcprescntaciu csqucmatica dels dos aparcllaments Watson-Crick canonics i / dc Ics quatrc triadcs ins cstablcs.

IIf/:SIR/ (,I,(la /)/ / 1) % t I RR)

pus de triplexs . En aquest cas, la cristal-lo-

grafia de raigs X ha resultat menys informa-

tive donat que, fins ara, nomes ha estat pos-

sible cristal•litzar complexos que, ja sigui

per la seva naturalesa quimica (Betts et al.,

1995 ) o per la seva mateixa estructura (Van

Meervelt et al., 1995 ), representen casos molt

especials.

En un triplex la tercera cadena recorre el

sole gran del duplex ( figura 7 de l'annex 5) es-

tablint interaccions de ponts d'hidrogen amb

les bases del duplex. Aquestes interaccions

donen hoc a la formacio de triades . Als apare-

I laments canonics G.C i A T, les bases purini-

ques mantenen Iliure un major nombre de

grups capacos d'establir interaccions per

ponts d'hidrogen , en comparacio de les bases

pirimidiniques ( figura 8A ). Aquest fet deter-

mina una de les caracteristiques mes impor-

tants dels triplexs : la tercera cadena s'associa

preferentment amb les purines del duplex.

L'estabilitat dell triplexs depen directament

de lade Ilurs triades constituents. Les triades

mes estables son les T(A.T), C+(G•C), A(A•T)

i G(G•C) (figura 813 ) que poden serconsidera-

des com a canoniques . En determinats casos

s'ha pogut demostrar la formacio d'altres ti-

pus de triades menys estables, com les

A'(G•C), A(G•C) o T(C•G), pero la seva for-

macio sempre to un efecte inestabilitzador,

en comparacio de triplexs formats nomes per

triades canOniques. La mateixa estructura

quimica de les triades determina que la for-

macio de triplexs estigui afavorida en se-

quencies que presentin una marcada asime-

tria en la distribucio de purines i pirimidines

entre ambdues cadenes. Segiiencies que pre-

senten alternanca de purines i pirimidines a

la mateixa cadena formen triplexs amb difi-

cultat, ates que aquests triplexs hauran d'in-

cloure triades menys estables o que, com

veurem mes endavant, l'associacio de la ter-

cera cadena amb el duplex haura de canviar

de cadena , i de motiu de reconeixement, a

cada alternan4a purina - pirimidina.

Segons la naturalesa quimica de la terce-

ra cadena, els triplexs es pollen classificar en

dos tipus (figura 8B). Els triplexs de tipus i

tenen la tercera cadena de tipus polipiri-

midinic i estan estabilitzats per la formacio

de triades T(A•T) i C'(G•C). En aquests tri-

plexs, les bases de la tercera cadena adopten

la conformacio anti i els aparellaments que

s'estableixen amb les bases del duplex son

de tipus Hoogsten. Aixo determina que l'o-

rientacio de ]a tercera cadena sigui paral-

lels amb relacio a la cadena purinica del du-

plex. Contrariament, els triplexs de tipus u

tenen la tercera cadena polipurinica i estan

estabilitzats per ]a formacio de les triades

A(A•T) i G(G-C). En aquest cas l'orientacio

de la tercera cadena es antiparal-lela amb re-

lacio a la cadena purinica del duplex, donat

que els aparellaments son del tipus Hoogs-

ten invertit. Aixi doncs, I'orientacio de la

tercera cadena respecte al duplex sera dife-

rent depenent de si s'empra el motiu piri-

midinic (tipus i) o purinic (tipus ii). Final-

ment cal indicar que els triplexs de tipus i

son mes estables a pHs acids, donat el re-

queriment de protonacio de la citosina

(pK,= 4,5) per a la formacio de les triades

C'(G•C). En canvi, els triplexs de tipus a son

estables en un ampli merge de pH, i son es-

tabilitzats per cations divalents, principal-

ment magnesi, pero, en alguns casos, tambe

per certs cations metal•lics de transicio (zinc,

cadmi, cobalt).

La formacio de triplexs constitueix un

mecanisme per al reconeixement especific

del DNA amb acids nucleics de cadena sen-

zilla, com oligonucleotids sintetics. En prin-

cipi, per a qualsevol sequencia de DNA es

pot dissenyar un oligonucleotid sintetic

(TFO) que la reconegui especificament mit-

jancant la formacio d'una estructura trica-

tenaria. El codi de reconeixernent ve deter-

minat pels diferents tipus de triades i to les

limitacions abans esmentades, la principal

de les quals fa referencia a I'efecte inestabi-

jnn 1M RI )O L AT v 1/ ( )R/\

litzador de les alternances purina-pirimidi-na. La figura 9 resumeix esquematicamentaquesta problematica. Per tat de reconeixeruna segiiencia purinica que presenta diver-ses interrupcions de pirimidines, es podenformar triades menys estables amb les piri-midines (figura 9a), o canviar de cadena acada interrupcio. Ara be, aquesta ultima so-lucio, que es en principi la menys dolenta,requereix tambe canviar de motiu de reco-neixement, donats els requeriments d'orien-tacio de la tercera cadena amb relacio at du-plex (figura 9b). De manera alternativa, espot canviar I'orientacio 5' -* 3' de la terceracadena (figura 9c) pero la sintesi d'oligonu-cleotids amb canvis d'orientacio de la cade-na no es encara rutinaria. Tot i aquestes li-mitacions, ha estat possible dernostrar inz'ivo el reconeixement especific de segiien-cies concretes de DNA amb oligonucleotidssintetics formadors de triplexs o TFO.Aquesta estrategia s'ha demostrat util en di-verses aplicacions. TFO conjugats amb Fe-EDTA s'han emprat in vitro com a nucleasesamb alta especificitat de sequencia o, conju-gate amb psolare, coin a sisterna de mutage-nesi dirigida in zviz o. Els TFO tambe s'handemostrat eficacos com a inhibiclors de 1'ini-

5' 3'---YYYYRRYYYY----)^

3' 1 1 1 1 I I I I I I 5 1RRRRYYRRRR----C-

3E--YYYYNNYYYY-- F

5'

ci i de I'elongacio de la transcripcio tant invitro corn in vivo.

Fins aqui ens hem referit als triplexs queanomenem intermoleculars, en els quals latercera cadena i el duplex pertanyen a mole-cules de DNA diferents. Els triplexs tambepoden ser intramoleculars si la tercera cade-na pertany a la mateixa molecula de DNAque el duplex sobre el qual es forma l'estruc-tura tricatenaria. Les caracteristiques fona-mentals de la formacio i 1'estabilitzaci6 delstriplexs intramoleculars son identiques a lesesmentades abans per als triplexs intermole-culars. Ara be, existeixen algunes petites di-ferencies que resumirem a continuacio. Laformacio dels triplexs intramoleculars re-quereix la desnaturalitzacio local de la regiode la molecula de DNA que aporta la terceracadena. Aquest proces de desnaturalitzacioes energeticament desfavorable i, en con-sequencia, la formacio de triplexs intra-moleculars es veu afavorida per factors queel facilitin, com per exemple increments dela superhelicitat negativa del DNA o presen-cia de determinats cations metal•lics de tran-sicio (zinc, cadmi, cobalt). Un cop formatel triplex intramolecular, la regio comple-mentaria a la tercera cadena ha de romandre

5' 3'- '--YYYYRRYYYY---*

3' I I I I I I I I I I 5'F--RRRRYYRRRR--E-

5'3'

(b)

RR53'

- --YYYY YYYY---3' 1 1 1 1 11 11 I I 5

R R R R Y RRR --E-

E--YYYY YYY --E-

(c)

5'Y Y

3'---YYYY YYYY----*

3' I I 1 1 1 1 1 1 1 I 5'F--RRRR Y RRR ---F

E---YYYY YYY 4---3 ' 5'

FRA k0 9. Les alternances purina(R)-pirimidina(Y) tenon un efecte inestabilitzador sabre la formacio d'estructwrs tricatena-ries. A cada alternanca: a) es pot formar una triada menys estable. N o canviar de cadena i do motiu de reconeixement, c) ocanviar I'oricntaci6 de la tercera cadena. R= Purina, Y= pirimidina, N qualsevol base.

II:S/ IR((It ROM IM 1 /hl

3

--

I ss,t It \I I). (1) 1 es quan'e cadenes que formen les tetrades de guanines pollen set paral lelCS ) I I o antiparal ICles (' i I). III, cer-

cles amb creus o punts indiquen la diferent orientaci6 de les cadenes: /)) I'espai entre dues tetrades consecutives to ones di-

mensions ideals per a la coordinaci6 clef potassi.

necessariament desnaturalitzada, en forma

de cadena senzilla.

ESTRUCTURES TETRACATENARIES

Les eshructures tetracaten, ries, o tetra-

plexs, son el resultat de I'associacio de qua-

tre cadenes de DNA. La formacio de tetra-

plexs es veu extraordinddriament afavorida

en sequencies enriquides en residus de gua-

nina, tot i que tambe s'ha observat en altres

tipus de sequencies (Sundquist, 1991, per a

una revisio sobre aquesta tetnatica).

La formacio de tetraplexs de guanina es

fonamenta en la capacitat d'aquests residus

de formar tetrades on quatre guanines s'as-

socien per mitja d'interaccions de punts

d'hidrogen (figura 10). Contrariament al cas

dels triplexs de DNA, la informaci6 estruc-

tural sabre els tetraplexs de guanines, obtin-

guda taut per RMN corn per cristal•lografia

de raigs X, es molt abundant. La formacio

d'aquests tetraplexs requereix la presencia

de, corn a minim, tres tetrades consecutives.

Les tetrades de guanines son estructures

planars que, quan son consecutives, esta-

bleixen fortes interaccions d'apilament.

Aquestes forces d'apilament contribueixen

de manera molt important a I'estabilitat dels

tetraplexs, que es alta. Els tetraplexs de gua-

nines tenen temperatures de fusio similars,

o fins i tot superiors, a les corresponents a

duplexs similars en la conformaci6 B. Es po-

den distingir dos tipus de tetrades segons

que les quatre cadenes tinguin la mateixa

/h_' Ll)('/./){.1'(721'/./7.KR1A.7LO]i/V'

a)

b)

C)

cccc

^cccc

c cc cc cc c

S'

cra~7C CcC CCC Cc

c ^

5' ^'

S'

FiaK:^ I I. Els tetraplexs podrn scricir;inwl^^rulan I^il. hi-molcculars ( h) o unimoleculars Irl.

orientacio paral^lela o be siguin ^ntiparal^le-les dues a dues (figura l0a). Aquestes darre-res poden classificar-se tambe en dos opussegons quo cadascuna de les cadenes tinguiuna orientacio antiparal^lela respecte a lesve^nes (opus 2) o sigui paral•lela a algunad'elles (opus 3). Als tetraplexs parallels lesquatre guanines adopten la conformacioanti, Pero als antiparal•lels s'alternen lesconformacions anti i sign. En el cas dell tetra-plexs antiparal•lels, Ies diferents possibili-tats d'alternan^a en 1'orientacio relativa deles cadenes i la conformacio de les bases

Bona lloc a fins a deu possibles formes es-tructuralment isomeriqucs.

Els cations tenon un paper molt impor-tant en 1'estabilitzacio delstetraplexs. En ge-neral, els cations monovalents tenon un ma-jor efecte estabilitzador quo els de valenciasuperior i, de tots, el potassi es el quo to l'e-fecte mes important. L'efecte estabilitzadordel potassi es deu, d'una Banda, a la neutra-litzacio de les carregues negatives dell fos-fats de les cadenes i, en segos Iloc, a la sevacoordinacio amb els grups 06 de les guani-nes detetrades consecutives (figura ]Oh). Defet, 1'espai compres entre dues tetrades con-secutives constitueix un bon Iloc d'unio perals cations, especialnu^nt pcr al potassi,

Fire ^ii ^ 12. Esyucma do I'csU'uctura de dlC^,^^l. (brma^l;i pcrdos di^plcxs imcrcalats. Les dues cadenes yue fimnen un du-plex sun paral^leles; en eam^i, els dos duplexs tones una dis-pusiciu rclativa antiparal^lel. (Les sagetes indiquen I'oricn-tacio de Ics cadenes. Un duplex s'ha reprcsentat amb liniagruixuda i I'altrc, amb linia cstreta) (adaptat do Wahl iSun-daralingam , 1995).

LI:.SE.4lX( (T( R1^:.1'l>li (.l)1.! lI>i

donat yue les sever dimensions son ideals

per a la coordinacib d'aquest catio. D'acord

amEi aquest argument, 1'efecte estabilitza-

dor dell cations nwnovalents decreix tint

en augmentar (K>Rb>Cs) com en disminuir

(K>Na>Li) el radi ionic.

Els tetraplexs parallels han de ser ne-

cessariament tetramoleculars, es a der, en la

seva formacib intrevenen sempre quatre

molecules de DNA independents (figura

11a). En canvi, els tetraplexs antiparal•lels

pollen ser tambe binx>leculars (figura 11 b)

o unimoleculars (intramoleculars) (figura

11i). L'equilibri entre aquestes deferents for-

mes moleculars esta inHu'it per diversos fac-

tors imolt especialment gels ions. Les for-

mes tetramoleculars es veuen afavorides en

presencia de potassi, mentre que les formes

bimoleculars i intramoleculars es formen

tamEie en presencia de soli. Resulta curios

yue tots els tetraplexs tetramoleculars des-

crits fins ara regain de opus parallel. Es pro-

bable yue el opus de rrtio tingui, tambe en

ayuest car, un efecte determinant.

^T4 T4

A3^^ ^A3

CI G 5

G5/ ^ C2^

/G1 CI6

C6 G1^

T7

a)

T7

L'interes principal de 1'estudi dels tetra-

plexs de guanines radica en el fet que el

DNA telomeric to una gran tendencia a for-

mar estructures tetracatenaries. En general,

les sequencies telomeriques contenen grups

de tres o mes guanines consecutives espaia-

des per 2-4 residus, normalment timines.

Aquestes sequencies s'estenen en forma de

cadena senr.illa a la fi dels cromosomes, en

direccio 3'. D'aci la seva gran tendencia a

formar estructures tetracatenaries.

La formacib d'estructures tetracatena-

ries no esta limitada al car de les sequencies

enriquides en guanina. Altres sequencies

tambe pollen formar tetraplexs encara yue

amli caracteristiques estructurals molt defe-

rents a les dell tetraplexs de guanines. Aixi

per exemple, els oligonuclebtids d(C,),

d(C,T) i d(TAACCC) (Kang et nl., 1995; i al-

gunes referencies contingudes en aquest ar-

ticle) donee lloc a estructures tetracatena-

ries on les interaccions son basicament a

traves de citosines. L'estructura es molt de-

ferent de la dell tetraplexs de guanines. Fls

b)/wx`/^,.oo/xxmm^ovoo`x^/'o'r,vm'mummple^fomuxa|u,u"uoouu,^c(l(o/\nxl`^.^.m,um."`^de Pont "mgm, o,u^Co:^u",mb xu.xu.sc"".o" &mmA^"& ora('"dapuu,/'""u*"^, /px`.

161 LU( Rl)L.ti I Rl'1. /7.RR \ I/URl\

a)

T7

G8

C9

G10

Gil

T6

b)

G1

C2

G3

G4

T5

FRa!sa 14. a) Fsquema del plegament do la sequencia d( (iCGGI ( i('(i(i (i de I'associacio de dues cadcnes per Ilxmar tin tc-traplex. L'esquelet sucre-foslat s'indica amb linia gruixuda , i el sentit 5'-°3' de les cadenes , mitjangant fletxes gruixudes.Les bases C i G es representen amb rectangles , i els ponts d'hidrogen de Ies tdtrades GGGG i cis de tipus Watson - ('rick dela tdtrada C-G'C-G s'indiqucn per tlctxcs primes oricntades del donador a ('acceptor . In negre es mostren les guanines enconformacio syn. b ) Representacio do les tdtrades : GG G.G ( a I'esquerra ) i C-G C-(i (a la dreta ) ( nu)dificat de Kettani er al.,1995).

L[ i YRI (11 RES0I:LI).A I /(c

tetraplexs de citosines son el resultat de 1'as-

sociacio de dos duplexs parallels que s'in-

tercalen ( figura 12 ). Cadascun dels duplexs

estan estabilitzats mitjancant la formacio de

parells C-C ". 0 sigui, que en aquesta estruc-

tura no es formen associacions de quatre ba-

ses, sing de dues bases. Es la intercalacio

dels parells de bases d'un duplex amb les de

l'altre allo que mante unifies les quatre ca-

denes.

Finalment, tambe s " ha observat en al-

guns casos especials la formacio de tetra-

plexs coin a consequencia de la interaccio

entre dos duplexs intramoleculars . Aquest

es el cas de l'oligonucleotid d(GCATGCT)

(Leonard ct al., 1995) que, tot i ser majorita-

riament autocomplementari (part subratlla-

da), en Iloc de formar un duplex intermole-

cular es plega formant un duplex intramole-

cular i dos d'aquests duplexs interaccionen

formant un tetraplex (figura 13a). En aquest

cas la interaccio entre els dos duplexs intra-

moleculars es pels soles petits i dona floc a la

formacio de dues tetrades G.C.G.C, on les

bases de la mateixa cadena s'associen mit-

jancant parells G•C de tipus Watson-Crick,

mentre que les de cadenes diferents formen

parells G-C amb un unic pont d ' hidrogen

(figura 13b). Mes recentment s'ha determi-

nat una estructura semblant en una sequen-

cia ciclica molt diferent , d<pATTCATTC>

(Salisbury ct al., 1997).

Una situacio similar s'observa per a l'oli-

gonucleotid d(GCGGT<GCGG) (Kettani ct

al., 1995), que tambe forma un tetraplex que

es el resultat de I'associacio de dos duplexs

intramoleculars que, en aquest cas, interac-

cionen pel sole gran (figura 14(7 ). La cadena

nucleotidica es plega formant un duplex in-

tramolecular que implica la formacio de dos

parells de bases CG de tipus Watson-Crick

al centre, i dos parells de bases G•G de tipus

I loogsteen a calla banda. Dos d ' aquests du-

plexs s'associen per la zona del sole gran i es

produeixen mes interaccions de pont d'hi-

drogen, i donen hoc a les tetrades represen-

tades a la figura 141).

BIBLIOGRAFIA

Bu,-,ui., J.; Aiowx, F. (1995). ,.Triple-stranded DNA".

Nucleic Acids and Molecular Biology, num. 9, pag.1-

21.

BF-n,,, L; Josry, J. A.; Vi A[, J. M.; JoRDA, S. R. (1995). ,A

nucleic acid triple helix formed by a peptide nu-

cleic acid-DNA complex,,. Science, num. 270, pag.

1838-1841.

B1 _--v( KBEs,, G. M.; GAn, M. J. (1996). ,Nucleic Acids in

Chemistry and Biology". Oxford University Press,

Nova York.

CAI I ADINE, C. R.; Dsrw, H. R. (1997). "Understanding

DNA. The Molecule and Now It Works,,. Acade-

mic Press, San Diego.

CIIANDRASEKARAN, R.; WANG, M.; TANG, M. K.; I h, R. G.;

PUICJANER, L. C.; BVI_ER, M. A.; MILLANE, R. I'.; AR-

Non, S. (1989). "A re-examination of the crustal

structure of A-DNA using fiber diffraction data". 1.

Biomol. Struct. Di/n., num. 6, pag. 1189-1202.

CHLNG, Y. K.; PErrcer, B. M. (1992). ,Stabilities of

double- and triple-strand helical nucleic acids" .

Prog. Biopln/s. Molec. Biol., num. 58, pig. 225-257.

EMBO Workshop. (1989). EMBO 1., num. 8, pag.1-4.

Fri' i crFI.n, G.; DA%D. R.; Ricli, A. (1957). ,Forma-

tion of a three-stranded polvnucleotide molecule".

1. An,. Chern. Soc., num. 79, pag. 2023.

FFRNANDEZ, L. G.; SURIRA.A, J. A.; Vrsn euI1s, N.; P1sHN-

)I, D.; CANir(s, L.; MAIININA, L. (1997). "Structural

variability of A-DNA in crystals of the oc tamer

d(pCpCpCpGpCpGp( pG), . 1. Birnnol. Struct. &

Dyn., num. 15, pag. 151-163.

FRANK-KAMFNFI5KII, M. D.; MIRKIy, S. M. (1995). "l riplex

DNA structures,,. Anna. Rccc. Bioche,n., num. 64,

pag. 65-95.

FRANKLIN, R. E. ; Gcni.ING, R. G. (1953). "The structure of

sodium thymonucleate fibers. I. The influence of

water content,, . Acta Cryst., mini. 6, pag. 673-677.

KANC, C.; BIcER, I.; LCKSHIN, C.; RAces , R.; Moires, R.;

Rico I, A. (1995). ,Stable loop in the crystal structure

of the intercalated four-stranded cytosine-rich met-

azoan telomere". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, num.

92, pag. 3874-3878.

KANC, C.; ZHANG, X.; RA IInr, R.; Mosils, R.; Rico, A.

(1992). ,Crystal structure of four-stranded Oxytri-

cha telomeric DNA,,. Nature, min. 356, pag. 126-

131.

KENNARD, 0.; HLNIIR, W. N. (1989). ,Oligonucleoticle

structure: a decade of results from single crystal

X-ray diffraction studies,). Quaterh/ Reoon o' of

Biophysics, num. 22, pag. 327-379.

100 LOtRI)I:St,RI'l,IL]R.4.V.4LORI,V'

KEVIANI, A.; KUMAR, R. A.; PA TEL, D. J. (1995). "Solutionstructure of a DNA quadruplex containing the fra-gile X syndrome triplet repeat" . J. Mel. Biol., num.254, pag. 638-656.

LAU(;I II.AN, G.; MuR(IiIE, A. I. H.; NORMAN, D.G.; MOORI'.,

M. H.; Mcxso, P. C. E.; LILI.EY, D. M. J.; Luisi, B.(1994). ,The high-resolution crystal structure of aparallel-stranded guanine tetraplex". Science, num.265, pag. 520-524.

LEONARD, G. A.; ZHANG, S.; PETERSON, M. R.; HARROP, S. J.;

HELLIWEL L, J. R.; CRUSE, W. B. T.; LANGLOI5 D'EsrAIN-

ioi, B.; KENNARD, O.; BROWN, T.; HUN[ER, W. N.

(1995). "Self-association of a DNA loop creates a

quadruplex: crystal structure of d(GCATGCT) at

1.8 A resolution,, . Structure, num. 3, pag. 335-340.

MALININA, L.; TE'. nsi lKO, V.; IVANOVA, Z.; SUBIRANA, J. A.;

ZARYIOvA, V.; NEKRA,Ov, Y. (1998). ,Structural va-riability and new intermolecular interactions ofZ-DNA in crystals of d(pCpGpCpGpCpG)". [En-viat]

MAI ININ'A, L.; URPi, L.; SALAS, X.; HUYNH-DINH, T.; SUBIRA-

yv, J. A. (1994). "Recombination-like structure ofd(CCGCGG) J. Mel. Biol., num. 243, pig. 484-493.

MIRKIN, S. M.; FRANK-KAMENESTKII, M. D. (1994). "H-

DNA and related structures,). Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., num. 23, pag. 541-576.

NUNN, C. M.; NEIDI.E, S. (1996). "The high resolutioncrystal structure of the DNA decamer d(AGG-CATGCCT) J. Mal. Biol., num. 256, pag. 340-351.

PAN, B.; BAN, C.; WAHL, M. C.; SUNDARALINGAM, M.

(1997). "Crystal structure of d(GCGCGCG) with5'-overhang G residues". Biophysical J., num. 73,pag. 1553-1561.

RADIIAKRISIINAN, I.; PA [F I, D. J. (1994). "DNA triplexes:Solution structures, hydration sites, energetics, in-teractions and function". Biochein., num. 33, pag.

11405-11416.SAENI iR, W. (1984). "Principles of Nucleic Acid Struc-

ture", pig. 1-296. (C. R. Cantor ed.) Springer-Ver-lag Nova York Inc.

SALISBURY, S. A.; WIISON, S. E.; PowEI.l, H. R.; KENNARD,

0.; LuBINI,P.; S1 iiI i<l( K, G. M.; ESCAJA, N.; ALAZZOU-zi, E.; GRANI,AS, A.; Prososo, E. (1997). ,The bi-loop,a new general four-stranded DNA motif". Proc.Natl. Acad. Sci. USA, num. 94, pag. 5515-5518.

SHAKKED, Z; RABINOVICII, D; CRusF, W. B. T.; EGERi, E.;

KENNARD, 0.; SALA, G.; SALISBURY, S. A.; VISWAMITRA,

M.A. (1981). "Crystalline A-DNA: the x-ray analy-

sis of the fragment d(GGTATACC),,. Proc. R. Soc.Lond. (Biol.), num. 213, pag. 479-487.

SMITH, F. W.; FEEGON, J. (1992). ,Quadruplex structure ofOxytricha telomeric DNA oligonucleotides». Na-ture, num. 356, pag. 164-168.

SUBIRANA, J. A.; FARIA, T. (1997). "Influence of sequenceon the conformation of the B-DNA helix". Biophi,s-ical J., num. 73, pag. 333-338.

SUBIRANA, J. A.; SAI.As, X.; URI'I, L.; FONT, E.; VERDAGUER,

N. (1995). Capitol: ,Aportaciones de la cristalo-grafia al estudio del ADN". A: Cristalograf a,col-leccio: <Nuevas Tendencias», vol. 26, Madrid,CSIC, pag. 223-240.

SuND(1uISr, W. I. "The structures of telomeric DNA". Nu-

cleicAcids and Molecular Biology, num. 5, pag.1-24.

URPI, L.; TERESHKO, V.; MALININA, L.; HCYNH-DINI1, T.;

SUBIRANA, J. A. (1996). ,Structural comparison be-tween the d(CTAG) sequence in oligonucleotidesand trp and inet repressor-operator complexes,,.Nature Struct, Biol., num. 3, pag. 325-328.

VAN MEERVEIF, L.; VLIEGHE:, D.; DAUrANT, A.; GAI.LOIS, B.;

PRE(K;oux, G; KENNARD, O. (1995).,High resolutionstructure of a DNA helix forming (C.G)*G base tri-plets" . Nature, num. 374, pag. 742-744.

VERDAGUER, N.; AYMAMI, J.; FERNANDRZ-FORNER, D.; FITA, I.;

COL., M.; HUYNH-DINH, T.; ICOLEN, J.; SUBIRANA, J. A.

(1991). ,Molecular structure of a complete turn ofA-DNA" . J. Mel. Biol., num. 221, pag. 623-635.

WAHL, M. C.; RAO, S. T.; SUNDARAI.INCAM, M. (1996)."Crystal structure of the B-DNA hexarnerd(CTCGAG): Model for an A-to-B transition,'.Biophysical J., num. 70, pag. 2857-2866.

WAHL, M. C.; SUNDARALINGAM, M. (1995). "New crystalstructures of nucleic acids and their complexes".Current Opinion in Structural Biology, num. 5, pag.282-295.

WANG, A. H.-J.; QLIIGLEY, G. J.; Ko1.'AK, R. J.; CRAWEOR_), J.

L.; VAN BooM, J. H.; VAN DER MARTI., G. A.; Rico. A.(1979). "Molecular structure of a left-handeddouble helical DNA fragment at atomic resolu-tion". Nature, num. 282, pig. 680-686.

WATS.ON, J. D.; CRICK, F. H. (1953). "Molecular structureof nucleic acids: A structure for deoxyribose nu-cleic acid". Nature, num. 171, pag. 737-738.

WING, R.; DREW, H.; TAKANO, T.; BROKA, C.; TANAKA, S.;

I IAKURA, K.; DI( KERSON, R. E. (1980). "Crystal struc-ture analysis of a complete turn of B-DNA". Nature,num. 287, pag. 755-758.