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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Escola de Enfermagem
Lesão renal aguda por glicerol: Efeito antioxidante da
Vitis vinifera L.
Elisabete Cristina de Oliveira Martim
São Paulo
2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Escola de Enfermagem
Lesão renal aguda por glicerol: Efeito antioxidante da
Vitis vinifera L
Elisabete Cristina de Oliveira Martim
Dissertação apresentada ao Programa de Pós –Graduação
em Enfermagem na Saúde do adulto, PROESA, para
obtenção do título de mestre.
Linha de pesquisa: Tecnologia na saúde do adulto
Orientadora: Profª Drª Maria de Fátima Fernandes Vattimo
São Paulo
2007
Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca “Wanda de Aguiar Horta”
Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo
Martim, Elisabete Cristina de Oliveira.
Lesão renal aguda por glicerol: efeito antioxidante da Vitis
vinifera L.. / Elisabete Cristina de Oliveira Martim. – São Paulo,
2007.
64 p.
Dissertação (Mestrado) - Escola de Enfermagem da
Universidade de São Paulo.
Orientadora: Profª Drª Maria de Fátima Fernandes Vattimo
1. Músculo esquelético 2. Necrose 3. Insuficiência renal aguda.
4. Antioxidantes (aplicações terapêuticas). 5. Flavonóides
(aplicações terapêuticas). I. Título.
Trabalho realizado no Laboratório Experimental de Modelos Animais (LEMA) da
Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo com apoio financeiro da
Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (Capes).
Dedicatória
Dedico este trabalho ao meu marido Cláudio Martim por
todo seu amor, carinho, dedicação e compreensão durante
todas as etapas deste estudo e por todos os momentos de
nossas vidas juntos.
À minha mãe Maria Rilza que me ensinou que é preciso
acreditar para vencer e lutar sempre. Uma grande
saudade.
Agradecimentos À Profª Drª Maria de Fátima Fernandes Vattimo, por
acreditar em meu trabalho, pelo apoio constante, paciência e dedicação. Expresso minha admiração não só como
profissional, mas também como pessoa.
Ao Profº Dr. Antônio Carlos Seguro pela oportunidade de aprendizado e contribuição para meu desenvolvimento
científico.
À Drª Heloísa Massola Shimizu por toda paciência, atenção e carinho durante este trabalho.
À amiga Mirian Watanabe por toda sua amizade e companheirismo durante todas as etapas deste
trabalho.Muito obrigada.
À amiga Cláudia Akemi Shibuya pela imensa contribuição no laboratório e apoio nos momentos difíceis.
À Fabíola Maiumi Oshiro pela atenção e disponibilidade durante a coleta de dados.
Ao biomédico Drº Rildo A. Volpini por toda contribuição no estudo histopatológico e pelo estimulo diário.
À funcionária do LEMA Neusa da Silva Oliveira pelo apoio e ajuda prestada neste trabalho.
Às amigas do LEMA: Carolina, Cassiane, Juliana, Márcia e Luciana, por toda contribuição e amizade.
À estatística Eutália A. C. Araújo pelos valiosos préstimos na análise dos resultados deste trabalho.
À química Drª Clara Versolato pela disponibilidade e atenção.
Às enfermeiras da UTI do Hospital alemão Oswaldo Cruz: Acácia, Cíntia, Luciana C, Luciana S, Luciana G, Priscila,
Rosely, Tatiana, Walquíria por toda colaboração.
À gerente Sarah e encarregadas Célia e Janete da UTI do Hospital Alemão Oswaldo Cruz.
Ao meu pai Milton A. de Oliveira e meus irmãos Jussara, Eliane e Milton Jr. por todo carinho e apoio em todos os
momentos da minha vida.
SUMÁRIO
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................11
2. OBJETIVOS ...........................................................................................................23
3. MÉTODOS .............................................................................................................25 3.1 Material.............................................................................................................25
3.1.1 Animais e padronização do modelo experimental....................................25 3.1.2 Apresentação dos grupos experimentais.................................................26
3.2 Métodos............................................................................................................27 3.2.1 Dosagem de creatina-quinase................................................................27 3.2.2 Função renal: clearance de creatinina.....................................................28 3.2.3 Avaliação da função tubular: fração de excreção de sódio e de
potássio ..................................................................................................29 3.2.4 Método FOX para peróxidos urinários .....................................................30 3.2.5 Dosagem de TBARS (substância reativas com ácido tiobarbitúrico) na
urina........................................................................................................32 3.2.6 Análise histológica e morfométrica ..........................................................33
3.3 Local ...............................................................................................................34 3.4 Análise estatística.............................................................................................35
4. RESULTADOS.......................................................................................................37 4.1 Creatina-quinase ..............................................................................................37 4.2 Função renal ....................................................................................................38 4.3 Função tubular: FENa e FEK............................................................................40 4.4 Peróxidos urinários...........................................................................................42 4.5 MDA (TBARS) urinário .....................................................................................43 4.6 Histologia e morfometria renal ..........................................................................44
5. DISCUSSÃO ..........................................................................................................47
6. CONCLUSÕES ......................................................................................................58
REFERÊNCIAS..........................................................................................................60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resultados referentes aos valores da creatina-quinase dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007. .......................................................................................................37
Tabela 2: Resultados referentes à função renal global dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis Vinifera. São Paulo. 2007............38
Tabela 3: Resultados referentes à função tubular [fração de excreção de sódio (FENa) e fração de excreção de potássio (FEK)] dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007............40
Tabela 4: Resultados referentes aos valores de peróxidos urinários dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007. .......................................................................................................42
Tabela 5: Resultados referentes aos valores de malondeldeído urinário dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007. ............................................................................................43
Tabela 6: Resultados referentes aos valores de morfometria realizada no tecido renal dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis Vinifera. São Paulo. 2007. .......................................................................44
LISTA DE ABREVIATURAS
Abs absorbância
ATP adenosina trifosfato
CLcr clearance de creatinina
CK creatina-quinase
DNA ácido desoxirribonucléico
Eros espécies reativas de oxigênio
Fé ferro
FE fração de excreção
FENa fração de excreção de sódio
FEK fração de excreção de potássio
FOX método xilenol laranja
FOX-2 metodo xilenol laranja versão 2
FR função renal
GSH glutationa
HE hematoxilina-eosina
H2O2 peróxido de hidrogênio
HPLC cromatografia de alta pressão
i.m. intramuscular
i.p. intraperitoneal
LRA lesão renal aguda
MDA malondealdeído
NO óxido nítrico
O2.- superóxido
OH radical hidroxila
TBARS substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico
TCA ácido tricloroácetico
v.o. via oral
Martim ECO. Lesão Renal Aguda por glicerol: efeito antioxidante da
Vitis vinifera L. [dissertação] São Paulo (SP): Escola de Enfermagem da
Universidade de São Paulo; 2007.
RESUMO
A Lesão Renal Aguda (LRA) é a complicação mais grave da rabdomiólise.
Nessa síndrome, a liberação do pigmento heme desencadeia uma lesão que
se caracteriza por vasoconstrição glomerular e toxicidade celular direta com
componente oxidativo. A lesão oxidativa desencadeada é uma das linhas
fisiopatológicas mais intrigantes. A renoproteção com antioxidantes tem
demonstrado efeito satisfatório. As proantocianidinas são antioxidantes
naturais encontrados no extrato da semente da uva. O objetivo deste estudo
foi avaliar o efeito antioxidante da Vitis vinifera (extrato da semente de uva)
sobre a função renal de ratos submetidos à lesão por rabdomiólise. Foram
utilizados ratos Wistar, adultos machos, pesando entre 250-300 gramas. A
LRA foi induzida pela administração de glicerol 50% i.m (intramuscular). Os
animais foram distribuídos em 4 grupos: grupo Salina (6ml/Kg de NaCl 0,9%
via intraperitoneal (i.p) 1 vez ao dia), grupo Glicerol (6ml/Kg de glicerol i.m,
cada região femoral recebeu 3ml/Kg de glicerol, 1 vez ao dia), grupo Vitis
vinifera (3mg/Kg v.o por 5 dias) e grupo Glicerol+Vitis vinifera que recebeu
Vitis vinifera por 5 dias antes do glicerol. Foram avaliados o marcador de
lesão muscular (CK), a função renal (FR), a função tubular (FENa e FEK), o
perfil oxidativo (peróxidos urinários-FOX-2 e MDA-TBARS) , a histologia e
morfometria renal. O grupo Glicerol tratado com Vitis vinifera apresentou
melhora da FR e tubular, redução dos níveis da peroxidação lipídica e
melhora da histologia renal. Os resultados deste estudo confirmaram a
proteção antioxidante, com repercussão histológica, da Vitis vinifera na LRA
induzida por glicerol.
Palavras-chaves: Lesão Renal Aguda. Rabdomiólise. Antioxidante.
Proantocianidinas. Flavonóides.
Martim ECO. Acute Kidney Injury by glycerol: antioxidant effect of Vitis
vinifera L. [dissertação] São Paulo (SP): Escola de Enfermagem da
Universidade de São Paulo; 2007.
ABSTRACT
The Acute Kidney Injury (AKI) is the worst complication of rhabdomyolysis. In
this syndrome, the delivery of heme pigment induces an injury that
distinguishes itself by glomerular vasoconstriction and direct cellular toxicity
with oxidative component. The oxidative injury is an intriguing one of the
pathophysiological mechanism. The renoprotection with antioxidants has
demonstrated satisfactory effect. The proanthocyanidins are natural
antioxidants found in grape seed extract. The aim of this study was to
evaluate the antioxidant effect of Vitis vinifera (grape seed extract) on the
renal function of rats submitted to the injury by rhabdomyolysis. Wistar rats,
male, adults, weight ranging from 250-300 g were used. The AKI was
induced intramuscular (i.m.) administration of glycerol 50%. The animals
were distributed in 4 groups: Saline group (6ml/Kg of NaCl 0,9%
intraperitoneal (i.p) once a day), Glycerol group (6ml/Kg of glycerol i.m, each
femoral region received 3ml/Kg of glycerol, once a day), Vitis vinifera group
(3mg/Kg v.o by 5 days) and Glycerol+Vitis vinifera group that has received
Vitis vinifera by 5 days before glycerol. Marker of muscular injury (CK), renal
function (RF), the tubular function (FENa and FEK), the oxidative profile
(urinary peroxides -FOX-2 and MDA-TBARS), the histological and kidney
morphometric were evaluated. The Glycerol group treated with Vitis vinifera
has shown improvements in RF and tubular, reduction of levels of lipid
peroxidation and amelioration of kidney histology. The results of this study
have confirmed the antioxidant protection, with histological repercussion of
Vitis vinifera in AKI induced by glycerol.
Key words: Acute Kidney Injury. Rhabdomyolysis. Antioxidant.
Proanthocyanidins. Flavonoids.
Introdução 11
1. INTRODUÇÃO
A lesão renal aguda (LRA) é uma síndrome relacionada a diversas co-
morbidades e complicações que incorrem em altos índices de
morbimortalidade. Avanços na área de tratamento caracterizados
predominantemente por métodos dialíticos não têm logrado em obter
resultados otimistas no controle dessa síndrome. Há que se ressaltar que
fatores predisponentes como desidratação, doença renal prévia e idade
avançada têm sido exaustivamente apontados, porém, dados conclusivos
quanto aos resultados de estratégias de resgate nessas populações ainda
não estão disponíveis.
Esse cenário desfavorável da história da LRA é suficiente para
referendar a necessidade de se identificar medidas de prevenção como
provavelmente as únicas alternativas capazes de estabelecer condições de
maior conforto epidemiológico. Estudos experimentais têm demonstrado que
diversas estratégias farmacológicas, se adotadas em tempo, podem trazer
esse benefício. Nesse contexto, os agentes antioxidantes, com ênfase aos
fitoterápicos, têm se firmado nessa busca.
A LRA é caracterizada pela queda rápida das funções tubular e
glomerular, tendo como causas freqüentes a isquemia e a nefrotoxicidade.
Vários compostos químicos podem estar relacionados com a redução da
filtração glomerular por vasoconstrição direta renal ou uma lesão direta
celular semelhante ao evento isquêmico. Estes componentes químicos são
medicamentos (aminoglicosídeos), contrastes iodados, peçonha (veneno de
Introdução 12
origem animal) e pigmentos (hemoglobina e mioglobina) (Brenner et al,
1998; Morais et al., 2003).
A associação entre rabdomiólise e LRA foi descrita pela primeira vez
por Bywaters e Beall, durante a segunda Guerra Mundial. Após os
bombardeios, soldados resgatados que sobreviveram aos traumas graves
apresentavam redução do volume urinário e hematúria, caracterizando o
quadro clínico de LRA identificada, naquela feita, como Crush Syndrom
(síndrome do esmagamento). A Crush Syndrom é atualmente conhecida
como rabdomiólise (Zager, 1996).
A musculatura esquelética é constituída por numerosas fibras
musculares, compreendendo 40% da massa corporal total. Possui
propriedades funcionais como: manutenção de gradientes iônicos e
processos metabólicos do mioplasma e mitocôndia que são importantes para
a estabilidade da membrana celular (sarcolema) e responsáveis pela
regulação de transportes iônicos. No relaxamento muscular ocorre o
transporte de cálcio de volta ao retículo sarcoplasmático, já a contração
muscular depende de um impulso neuronal e do gradiente elétrico
transcelular por meio da bomba Na+K+-ATPase. Ambos, contração e
relaxamento muscular se constituem em processos ativos que consomem
ATP, destacando-se que uma vez ocorrida sua depleção, tornam-se
comprometidos. Além disso, no músculo, o cálcio é responsável pela
regulação da entrada e saída de sódio e potássio no interior da célula,
necessário para a propagação do potencial de ação (Guyton, 1991).
Introdução 13
A creatina-quinase (CK) é o marcador laboratorial mais sensível de
lesão muscular e seu nível aumentado parece ter relação direta com o grau
de lesão muscular. Esse marcador, associado a dados da história e sinais,
representam a composição necessária para a formulação diagnóstica da
rabdomiólise (Vanholder et al., 2000).
A rabdomiólise decorre primeiramente da necrose muscular de origem
traumática ou não traumática. As causas traumáticas se caracterizam por
trauma e compressão muscular, oclusão dos vasos musculares, exercício
físico excessivo e choque elétrico. A necrose muscular de origem não
traumática pode estar relacionada à atividade muscular excessiva, isquemia
da musculatura por oclusão vascular, distúrbios metabólicos (hipocalemia,
hipernatremia, cetoacidose diabética), toxinas (monóxido de carbono, álcool,
tétano, envenenamento crotálico), doenças imunológicas (polimiosite),
infecções (viral, bacteriana), drogas ilícitas (cocaína, anfetaminas,
antiinflamatórios não hormonais) e doenças hereditárias (deficiência de
enzimas glicogenolíticas (Síndrome McArdle) e do metabolismo de lipídios
ou ainda deficiência de carnitina.
Ressalte-se que as causas não traumáticas foram identificadas
apenas décadas após as causas traumáticas, especificamente em 1970
(Singh, 2005; Zager, 1996).
Dados epidemiológicos estimam que a rabdomiólise não traumática
compreenda de 5% a 7% de todos os casos de LRA e represente 25% de
Introdução 14
todos os casos de NTA, porém, a prevalência de LRA em pacientes com
rabdomiólise varia entre 17% e 33% (Beetham, 2000).
Entre os mecanismos propostos para explicar a associação entre a
rabdomiólise e a LRA destacam-se a obstrução tubular pela presença de
cilindros formados pelo pigmento heme, a vasocontrição renal e a toxicidade
direta da proteína heme sobre a célula tubular, mecanismos inter-
relacionados e já mencionados. Maior descrição deste detalhamento
fisiopatológico será feito a seguir (Paller, 1988).
A obstrução tubular pode ocorrer por meio da formação de cilindros
de mioglobina. Os cilindros de heme têm efeito tóxico sobre a célula tubular.
Sabe-se que a mioglobina é filtrada facilmente através da membrana basal.
A proteína heme forma cilindros em resposta a sua alta concentração em
nefróns distais, que aumentam com a extensão da lesão muscular. A
excreção de ácido úrico também contribui para a obstrução tubular,
favorecendo a formação de cilindros. Esse mecanismo obstrutivo pode ser
intensificado em situações de depleção de volume, juntamente com a
vasoconstrição renal. Há ainda o fator relacionado à acidez urinária
desencadeada pela acidose ânion gap, que por sua vez, diminui a
solubilidade da mioglobina resultando em precipitação de 98% sob pH
urinário de 5.0 (Knochel, 1992; Zager, 1989).
A vasoconstrição e a hipoperfusão renal também são citadas como
componentes fisiopatológicos. Na lesão descrita elas são desencadeadas
pela perda de fluido para o terceiro espaço mediada pela necrose muscular
Introdução 15
e pela ativação da cascata de endotoxina juntamente com o seqüestro de
óxido nítrico (NO) pela heme proteína na microcirculação renal (Breziz,
1991; Sharma et al., 1987).
A hemecitotoxicidade nas células tubulares está relacionada com a
liberação de ferro da mioglobina, promovendo a formação de radicais livres
(Paller,1988). As proteínas heme, tal como a hemoglobina e a mioglobina,
quando liberadas no espaço extracelular, precipitam a lesão tecidual renal
por meio da degradação da enzima heme-oxigenase, sendo que o acúmulo
de heme livre induz ao estresse oxidativo (Nath, 1992).
A fisiopatologia da mioglobinúria induzida pela administração de
glicerol 50% intramuscular constitui-se em um modelo clássico de LRA
experimental para o estudo do papel do estresse oxidativo, devido a
liberação de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs)
como as radicais superóxido, o radical hidroxil e outros metabólitos como
peróxido de hidrogênio em células tubulares. A solução de glicerol 50%
intramuscular causa a destruição de músculos, levando a miólise e ao
acúmulo de heme livre no sangue, que são posteriormente transportados até
o rim, iniciando o ciclo da lesão oxidativa renal já descrito (Ferraz et al.,
2002; Funez et al., 2003; Singh, Chander, Chopra, 2003) (Fig 1).
Introdução 16
Figura 1: Fisiopatologia da lesão renal aguda por rabdomiólise (Zager, 1996)
A necrose muscular uma vez estabelecida pode exacerbar o distúrbio
oxidativo pela alteração na homeostase do cálcio e a depleção de ATP,
gerando alterações de íons intracelulares, principalmente o aumento do
cálcio citosólico, através da troca pelo íon de sódio. Com os níveis de cálcio
elevados há o desencadeamento de contração muscular persistente
resultando no esgotamento de reservas de ATP, conseqüentemente morte
celular. Nesse contexto, diferentes sistemas enzimáticos como proteases
(calpaína) e fosfolipases (fosfolipase A2) irão contribuir para a formação e
liberação de EROs e substâncias vasoconstritoras, resultando em lesão de
miofibrilas e da membrana celular, em influxo de sódio e morte celular
(Guyton, 1991; Zager,1996 ).
Introdução 17
A lesão oxidativa na rabdomiólise caracteriza-se por mecanismo de
retroalimentação dinâmica, onde o aumento de cálcio citosólico eleva a
produção de radical superóxido, gerando desequilíbrio entre a geração de
intermediários pró-oxidantes e agentes antioxidantes endógenos,
intensificando a lesão celular (Zager, 1996).
Como já é de consenso, o estresse oxidativo pode contribuir para
formação de mediadores vasoativos que comprometem a função renal por
vasoconstrição, diminuindo o coeficiente de ultrafiltração e reduzindo a taxa
de filtração glomerular. As espécies reativas de oxigênio (EROs) são
formadas e degradadas por todos os organismos aeróbios. São conhecidas
como mediadoras de sinalização intracelular, relacionadas à perda da
função celular e estão associadas aos processos de apoptose e necrose.
Possuem também funções de defesa contra infecções por meio da ativação
de fagócitos que produzem EROs em quantidade suficiente contra infecções
(Nordberg, Arnér, 2001).
A lesão oxidativa altera a estrutura e função glomerular devido ao
efeito das EROs em células mesangiais e endoteliais, além de desencadear
uma lesão inflamatória causada pela liberação de mediadores como
citoquinas e a ativação leucocitária (Rovin, et al., 1998; Tak, et al., 2001). A
disfunção endotelial parece estar relacionada ao aumento da produção de
superóxido que reduz a biodisponibilidade de NO implicando em
relaxamento vascular (Berry, et al., 2000).
Introdução 18
Na presença do oxigênio, a ação das EROs sobre os ácidos graxos
polinsaturados caracteriza-se pela formação de hidroperóxidos e
endoperóxidos. Estes compostos podem ainda decompor-se produzindo
radicais adicionais. A medida destes produtos reativos, especialmente
malondealdeído (MDA), o F-2-isoprostanos e os peróxidos urinários podem
ser utilizados como marcadores de peroxidação lipídica em sistemas
biológicos (Lima, Abdalla, 2001).
Neste contexto, sublinhado o papel do desequilíbrio redox na LRA, o
uso de antioxidantes com objetivos preventivos ou curativos tem merecido
destaque na clínica e em ensaios experimentais. A administração
promissora da vitamina E, N-acetilcisteína, isoflavona e outros atenuando a
lesão renal fez suscitar o interesse em avaliar o desempenho de outros
agentes freqüentemente citados não só em literatura científica, como
também na mídia (Shimizu et al., 2004; Watanabe et al., 2007). Destaque-se
o efeito antioxidante dos flavonóides derivados da uva encontrados em
alguns vinhos.
É fato que os antioxidantes naturais podem auxiliar na resposta
antioxidante endógena contribuindo para a depuração das EROs, atenuando
seu efeito oxidativo no rim. Esses agentes podem estar presentes nas
vitaminas C, E, β caroteno, nas proantocianidinas, no zinco, no selênio e em
enzimas antioxidantes como a glutationa, a superóxido dismutase e a
catalase e a superóxido reductase. Serão destacados os papéis da
glutationa, o mais ativo antioxidante endógeno e das proantocianidinas.
Introdução 19
A glutationa (GSH), há décadas reconhecida como o principal
antioxidante endógeno, é um tripeptídeo que se apresenta em altas
concentrações em todas células de mamíferos exercendo proteção celular
contra o estresse oxidativo, caracterizando-se como marcador de toxicidade.
Sua atuação destaca-se sobremaneira na proteção celular contra as
mudanças no quadro oxidativo, atuando principalmente na peroxidação
lipídica e na redução de síntese protéica e do DNA (Halliwell, 1992).
As proantocianidinas são extraídas das sementes de uva Vitis vinifera
L. Os seus componentes ativos consistem em flavonóides ou
proantocianidinas que são digômeros polifenólicos derivados de flavan-3-óis
e flavan-3,4-dióis. Outros componentes ativos presentes no extrato de uva
incluem os ácidos graxos essenciais e tocofenóis (Blumenthal et al., 2000).
De todos os componentes presentes na Vitis vinifera, os compostos
fenólicos, especialmente as proantocianidinas, têm despertado muitos
interesses do ponto de vista farmacêutico e clínico.
As proantocianidinas são antioxidantes naturais que, possuem ações
como seqüestradores de radical livre, promotoras de vasodilatação, além de
possuírem também propriedades anticarcinogênica, antialérgica,
antiinflamatória, antimicrobiana cardioprotetora, estimulação imunológica,
atividade estrogênica e por fim inibição das enzimas fosfolipase A2,
ciclooxigenase e lipooxigenase. Dentre essas ações o principal foco neste
estudo foi a proteção contra as EROs ( Salah, 1995; Rice-Evanz, 1996).
Introdução 20
O seu efeito antioxidante relaciona-se também ao aumento da
capacidade antioxidante no plasma em humano. Outra ação biológica
significativa das proantocianidinas é a redução de LDL para a oxidação
ambos in vivo e in vitro, por justamente possuir a capacidade de seqüestrar
radicais livres implicados na formação da reação de Fenton (Rodrigo, Rivera,
2002).
O emprego dos derivados das uvas viníferas tem sido reforçado
principalmente em condições clínicas como a hipertensão arterial e a
dislipidemia. A interface endotelial dessas patologias é óbvia.
O efeito protetor da Vitis vinifera com melhora da resposta
inflamatória endotelial por ação sobre o desequilíbrio redox dessas
síndromes parece justificar a sua recomendação. No rim, estudos
demonstraram que as proantocianidinas do extrato de semente de uva em
modelos de LRA por glicerol reduziram os níveis de peroxidação lipídica com
melhora da função renal (Rodrigo et al., 2004; Stefanovic et al., 2000).
A busca por alternativas terapêuticas para a prevenção da lesão renal
tem se firmado na última década com o uso de estratégias antioxidantes.
Dentre essas medidas, o uso da N-acetilcisteína e mais recentemente o
bicarbonato de sódio vêm se tornando prática preventiva. Não é possível,
contudo, afirmar os reais benefícios clínicos dessas condutas e nem
tampouco discriminar com segurança os eventuais efeitos indesejáveis
dessa terapêutica.
Introdução 21
Desse modo, contrapondo-se ao cerimonial hegemônico da corrente
alopática, o uso de fitoterápicos começa a fazer sombra a essas tradições
farmacoterápicas. O uso e recomendação da ingestão diária de dose
limitada de vinho adquiriram respaldo médico e têm sido indicados de forma
sistemática. As principais vantagens da ingestão de vinho em dose
reservada estão pautadas no efeito antioxidante proporcionado pela bebida.
Sabe-se, contudo, que o maior teor de proantocianidinas da uva está contido
na semente da fruta, representando pequena fração da bebida.
Isso posto, é consenso que o uso de antioxidantes na prevenção da
LRA recebe hoje merecido reconhecimento. A administração de diferentes
fármacos, contudo, pode trazer efeitos indesejáveis, ainda pouco descritos.
O uso de fitoterápicos como a Vitis vinifera, por seu papel antioxidante,
poderá resultar em efeito renoprotetor ainda mais promissor.
Objetivos 23
2. OBJETIVOS
� Avaliar a função renal de ratos adultos tratados com glicerol.
� Verificar o efeito do pré-condicionamento com Vitis vinifera sobre a
função renal e tubular de ratos submetidos ao tratamento com
glicerol.
� Avaliar o perfil oxidativo da lesão renal pelo glicerol em ratos com
e sem o pré-condicionamento com Vitis vinifera.
� Verificar o efeito da Vitis vinifera sobre a histologia renal de ratos
submetidos ao tratamento com glicerol.
Métodos 25
3. MÉTODOS
3.1 Material
3.1.1 Animais e padronização do modelo experimental
Foram utilizados ratos da raça Wistar adultos machos, pesando entre
250-300 gramas. Os ratos foram fornecidos pelo Biotério Central da
Faculdade de Medicina da USP.
Todos os animais tiveram acesso livre à água e alimento e
permaneceram em condições térmicas com ciclos alternados de dia e noite
durante todo o experimento.
Durante a padronização do modelo observou-se que a administração
do glicerol 50%, com o objetivo de induzir a lesão renal, desencadeava
quadro de dor aguda nos animais. Com o intuito de reduzir o sofrimento, os
animais do grupo glicerol foram anestesiados com solução de hidrato de
cloral 10% (0,1ml/kg) i.p, antes da administração intramuscular de glicerol
50%. Em seguida, foram colocados em gaiola metabólica para a
mensuração do volume urinário e posterior mensuração do clearance de
creatinina.
Após 24 horas em gaiola metabólica, os animais foram anestesiados
novamente e submetidos a laparotomia para coleta sanguínea por meio da
punção da aorta abdominal. A seguir, o rim esquerdo foi retirado,
seccionado, e permaneceu em solução de Metacarn por 24 horas. No dia
seguinte, os fragmentos foram imersos em solução de etanol 70% e foram
preparados para posterior estudo histológico.
Métodos 26
Ao final do experimento os animais foram sacrificados de acordo com
as recomendações para utilização de animais em estudos científicos, em
que se instituiu a inalação de éter dietílico até a parada respiratória total.
3.1.2 Apresentação dos grupos experimentais
Grupo 1. salina ( controle de nefrotoxicidade)
Animais que receberam somente solução de cloreto de sódio (6ml/Kg
de NaCl 0,9%), no mesmo volume do glicerol i.p, 1 vez ao dia.
Grupo 2: glicerol
Animais que receberam glicerol 50%, 6ml/Kg via i.m 1 vez ao dia
(Vitaly - farmácia de manipulação de homeopatia). Cada região femoral
recebeu 3ml/Kg de glicerol.
Grupo 3: Vitis vinifera
Animais que receberam Vitis vinifera (Vittis® - Herbarium Laboratório
Botânico LTDA), na dose 3mg/Kg/dia via oral (v.o.) durante 5 dias.
Grupo 4 : glicerol + Vitis vinifera
Animais que receberam o pré-condicionamento (5 dias) com Vitis
vinifera (Vittis® - Herbarium laboratório Botânico LTDA), na dose de 3m/Kg
/dia v.o. antes da administração de glicerol 50% (6m/Kg via i.m.).
Os animais dos diversos grupos foram submetidos à dosagem CK
(creatina-quinase), análise da função renal por meio do clearance de
Métodos 27
creatinina, função tubular por meio da mensuração da fração de excreção de
sódio e potássio, mensuração de peróxidos urinários pelo método Xilenol
laranja (FOX-2), avaliação da taxa de peroxidação lipídica na urina pelo
TBARS e análise histológica e morfométrica dos rins. Esses métodos serão
descritos a seguir.
3.2 Métodos
3.2.1 Dosagem de creatina-quinase
A creatina-quinase (CK) é um marcador enzimático mais sensível
para lesão muscular.
O sistema para determinação quantitativa da atividade da CK é pelo
modo cinético mensurado no plasma.
A atividade enzimática da CK neste estudo foi determinada de acordo
com a seguinte seqüência de reações:
A CK catalisa a desfosforilação da creatina fosfato para produzir
adenosina trifosfato (ATP), a qual reage com a glicose na presença da
hexoquinase (HK) formando glicose-6-fosfato. A glicose-6-fosfato, na
presença de glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH), é oxidada a 6-
fosfogluconato (6-PG) e reduz o NAD e NADH. A velocidade de incremento
na absorbância em 340nm é proporcional à atividade da CK na amostra.
Neste estudo um volume de 20 µl de plasma foi adicionado em 100µL
do reagente de trabalho (tampão 100 mmol/L, acetato de magnésio 10
Métodos 28
mmol/L, glicose 20 mmol/L, N-acetilcisteína 20mmol/L, ADP 2 mmol/L, AMP
5 mmol/L, NAD 2 mmol/L, diadenosina pentafosfato 10µmol/L, HK ≥2800U/L,
G-6PDF ≥2000U/L, creatina fosfato 30 mmol/L e azida sódica 0,095%) , foi
então homogeneizado e a seguir aspirado pelo aparelho BIO 2000®. Após 2
minutos foi realizada a leitura e os valores obtidos foram expressos em U/L
(IFCC, 2002).
O reagente utilizado neste estudo foi CK-NAC Liquiform da
LABTEST®.
3.2.2 Função renal: clearance de creatinina
A mensuração da creatinina plasmática e urinária foi realizada por
meio do método de Jaffé, conforme descrito a seguir:
� Dosagem de creatinina plasmática
A primeira etapa para mensuração da creatinina plasmática consistiu
na desproteinização do plasma. Neste processo 0,5ml de plasma
centrifugado foi diluído em 1,5 ml de água destilada (diluição 1:5),
adicionando-se 0,25 ml de tungstato de sódio 10% e 0,25 ml de ácido
sulfúrico 0,75N. A solução foi homogeneizada e centrifugada durante 10
minutos a 5.000 rpm e foi retirado 1,5 ml do sobrenadante para a próxima
etapa.
Nesta etapa foram adicionados ao sobrenadante 0,3 ml de hidróxido
de sódio 0,75N e 0,3 ml de ácido pícrico 0,0036M. Foi realizada a
Métodos 29
homogeneização e após 20 minutos em temperatura ambiente realizou-se a
leitura em espectrofotômetro de absorbância em 520nm.
Os resultados foram expressos em mg/dl.
� Dosagem de creatinina urinária
Para a dosagem de creatinina urinária foram utilizados 0,05 ml da
amostra de urina diluída em 5 ml de água destilada (diluição 1:100),
acrescentando-se 1 ml de hidróxido de sódio a 0,75 N e 1 ml de ácido pícrico
a 0,0036 M a solução. Após esta etapa, foram realizados os mesmos
procedimentos descritos anteriormente para a mensuração da creatinina
plasmática.
O Clearance de creatinina foi calculado por meio da seguinte fórmula:
Clcr=creatinina urinária(mg/dl) . fluxo urinário (ml/min) de 24 horas
Creatinina plasmática (mg/dl)
Os valores do Clcr foram expressos em ml/min
3.2.3 Avaliação da função tubular: fração de excreção de sódio e de potássio
A fração excretada de sódio (FENa) e a fração excretada de potássio
(FEK) consistem na porcentagem de sódio e potássio filtrado excretadas na
urina. Correspondem à quantidade desses íons que o rim está ativamente
reabsorvendo sódio e potássio e determinam quantitativamente os íons de
sódio e potássio presentes no soro e na urina.
Métodos 30
Na LRA pré-renal o rim está hipoperfundido, portanto, ocorre
reabsorção ativa de sódio e a FENa é freqüentemente menor que 1%,
enquanto que concentração de sódio na urina, geralmente é menor que 20
mEq/l. Ao contrário, quando há lesão do parênquima ou LRA pós renal, a
FENa está usualmente maior que 3% e a concentração de sódio na urina
maior que 40 mEq/l (Costa, Neto-Vieira,Neto, 1996)
A FENA e a FEK foram avaliadas por meio de fotometria de chamas
(CELM -FC 280), utilizando-se a solução padrão 140Mmol/L de Na e 5,0
Mmol/L de K e 3,0 Mmol/L lítio (CELM®).
A fórmula para cálculos foi:
FE = Clearance da substância
Clearance de creatinina
3.2.4 Método FOX para peróxidos urinários
O método de FOX consiste na determinação dos níveis de peróxido
por meio do método ferro-xylenol orange (XO). Os peróxidos orgânicos são
um dos primeiros produtos semi-estáveis da interação entre radicais livres e
outras espécies reativas de oxigênio no sistema biológico. Os peróxidos são
considerados como potenciais indicadores na formação e ou resultantes das
moléculas reativas (Gay et al., 1999).
O método FOX é feito para leitura por espectrofotometria, onde xilenol
laranja [ácido (o-cresolsulfonaftalina 3’, 3’’ – bis (metilamino) ácido diacético]
X 100
Métodos 31
apresenta alta seletividade com íon Fe3+ produzindo uma coloração azul-
arroxeado (α=4,3 x 104 M-1 cm-1) (Wolff, 1994).
O FOX-2 é usado para determinação de níveis de peróxidos
presentes na fase lipídica como as lipoproteínas, membranas e lipídes. Na
versão FOX foi utilizado o Butylated Hydroxitolune (BHT) e o metanol para
análise dos hidroperóxidos (Wolff, 1994).
Os peróxidos oxidam os íons Fe2+ para íons Fe3+ quando diluídos em
solução ácida como descrita na reação abaixo:
Fe2+ + ROOH →Fe3+ + RO + OH-
A solução FOX-2 foi preparada em diluição de 90 ml de metanol e 10
ml de água biodestilada e acrescentada à solução: 100µM XO (Xlylenol
orange- Sigma; St Louis, USA), 4 mM BHT (BHT – Butylated Hydroxytoline –
Sigma, St Louis, USA), 25µM da solução de ácido sulfúrico (H2so4) e 250
µM de sulfato ferroso de amônio (Sulfato Ferroso de Amônio (Fe(NH4) 2
(SO4)2,6H2) – Vetec Química – RJ, Brasil).
Na etapa seguinte, em 900µl da solução FOX -2 foram acrescentados
100µl da amostra de urina fresca. A solução foi homogeneizada e
permaneceu em repouso durante 30 minutos em temperatura ambiente. A
solução foi centrifugada por 10 minutos para a retirada de resíduos e após
foi mantida em gelo por aproximadamente 10 minutos. A leitura foi realizada
em espectrofotômetro em absorbância de 560 nm, após a retirada de
Métodos 32
resíduos de proteínas ou outros materiais através da centrifugação
(Wolf,1994; Long et al., 1999).
Os valores foram calculados pelo coeficiente para peróxido de
hidrogênio de 4,3 x 10 Mcm (Wolf, 1994) e estabilizados para grama de
creatinina urinária (Halliwell et al., 2004).
3.2.5 Dosagem de TBARS (substância reativas com ácido tiobarbitúrico) na urina
O MDA é um dos aldeídos freqüentemente analisados em métodos
analíticos quantitativos e qualitativos para determinação dos índices de
peroxidação lipídica. O MDA é um dos principais produtos da cascata de
peroxidação lipídica e pode ser detectado por vários métodos dentre eles por
meio da luz ultravioleta em sistema de cromoterapia de alta pressão (HPLC)
e também com o do uso do ácido tiobarbitúrico ao qual reage com várias
substâncias dentre elas o MDA (TBARS) (Lima, Abdalla, 2001).
A dosagem de TBARS na urina consiste na adição de 0,4 ml da
amostra de urina com 0,6 ml de H2O. Foram acrescentados nessa diluição
1,0 ml de TCA 17,5% e 1,0 ml de ácido tiobarbitúrico (0,6% pH 2), sendo que
todos os tubos de ensaio com a solução foram mantidos no gelo durante
essa primeira etapa do processo. A solução foi homogeneizada e depois
colocada em água fervente (banho Maria) durante 20 minutos para reação
com ácido tiobarbitúrico.
Métodos 33
Na etapa seguinte a solução foi retirada do banho-maria, resfriada em
gelo e adicionado 1,0 ml de TCA 70%. A solução foi homogenizada e
incubada durante 20 minutos com o tubo de ensaio tampado. Ao final, a
solução foi centrifugada por 15 minutos a 3000 r.p.m e a leitura foi realizada
em espectrofotometria em absorbância de 534 nm (Walker, Shah, 1990).
Abs x 10 x ml de urina/24h= n moles de TBARS/24h
0,156
A quantidade de MDA apresentado em nanomoles foi calculada
usando coeficiente de extinção molar 1,56 x 105 M-1 cm -1.
3.2.6 Análise histológica e morfométrica
A técnica utilizada para análise histológica dos rins foi a hematoxilina-
eosina (HE). Esse procedimento consistiu em corar o tecido para que se
formassem ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos e
facilitasse, desta forma, a visualização das estruturas presentes no mesmo
(Junqueira, 1990).
O rim foi isolado imediatamente após sacrifício do animal, 4 Mm de
espessura foram seccionados, colocados em solução Metacarn (120 ml de
metanol 60%, 60 ml de clorofórmio 30%, ácido acético glacial 10%) por 24
horas e depois mantidos em álcool 70%.
Os cortes de 4 Mm de espessura do tecido renal obtidos dos animais
controles e experimentais foram corados HE para a análise do
Métodos 34
comprometimento túbulo-intersticial, avaliando-se também a área relativa do
córtex desses animais.
Foram realizados estudos de morfometria para avaliação da
expansão da área intersticial. As imagens obtidas pela microscopia óptica
foram captadas por meio de vídeo-câmera de luz conectada a um analisador
de imagens (Leica-Qwin, Alemanha). Foram analisados 20 campos de cada
animal medindo 37.000Mm2 e foi avaliada a fração percentual do córtex
ocupada pelo interstício. Em seguida foi determinada a porcentagem da área
intersticial em relação a cada campo, excluindo-se os glomérulos (Baroni et
al., 2000).
3.3 Local
Os estudos de função renal foram realizados no laboratório
Experimental de Modelos Animais (LEMA) da Escola de Enfermagem da
Universidade de São Paulo e no Laboratório de Investigação Médica (LIM
12) da Faculdade de Medicina da USP.
Os estudos de histologia e morfometria foram realizados no
Laboratório de Emergência Clínica (LIM 51) da Faculdade de Medicina da
USP.
A mensuração da CK foi realizada no Laboratório da Disciplina de
Nefrologia da UNIFESP.
Métodos 35
3.4 Análise estatística
Utilizou-se o método GLM (Anova univariada) que representa um
procedimento estatístico que incorpora variáveis dependentes normalmente
distribuídas e variáveis independentes categóricas ou contínuas. Para se
verificar quais grupos diferiam entre si ou não, foram empregados os testes
múltiplos de comparação 2 a 2 de Bonferroni ajustado.
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão (SEM).
Os valores de p< 0,05 foram considerados significantes.
Resultados 37
4. RESULTADOS
4.1 Creatina-quinase
Tabela 1: Resultados referentes aos valores da creatina-quinase dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n Creatina-quinase (U/L)
Salina 5 466±105
Glicerol 7 1127±89▲
Vitis vinifera 5 460±105
Glicerol + Vitis vinifera 5 932±105□●
▲ p < 0,001 vs Salina □ p < 0,03 vs Salina ● p < 0,03 vs Vitis vinifera Os dados representam médias ±erro padrão (SEM).
Na tabela 1 estão representados os valores de CK que consiste no
método de confirmação da lesão muscular pelo glicerol.
O grupo Glicerol apresentou resultados que foram considerados
referência de lesão muscular neste estudo para este parâmetro (1127±89),
enquanto que o grupo Salina apresentou resultados tomados como
normalidade (466±105).
O grupo Glicerol + Vitis vinifera quando comparado ao grupo Glicerol
mostrou discreta redução desse parâmetro, sugerindo que a lesão muscular,
mesmo que atenuada pela Vitis vinifera, foi mantida.
Resultados 38
4.2 Função renal
Tabela 2: Resultados referentes à função renal global dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis Vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n Peso
(gramas) Fluxo urinário
(ml/min) Clcr / 100 g (ml/min)
Salina 6 270±6 0,007±0,003 0,65±0,03
Glicerol 8 275±6 0,020±0,002□■ 0,20±0,02▲
Vitis vinifera 5 284±7 0,007±0,003 0,57±0,03
Glicerol+Vitis vinifera 8 307±6▲♦ 0,015±0,002 0,51±0,02□◊
▲ p < 0,001 vs Salina □ p < 0,005 vs Salina ◊ p < 0,001 vs Glicerol ♦ p < 0,003 vs Glicerol ■ p < 0,01 vs Vitis vinifera Os dados representam médias ± erro padrão (SEM).
A tabela 2 mostra diferença significativa de peso nos animais do
grupo Glicerol + Vitis vinifera quando comparado aos demais. Ressalte-se
que esses animais já apresentaram diferença do peso desde o início do
protocolo, não podendo a diferença corporal ser atribuída aos tratamentos
instituídos.
Quanto ao fluxo urinário, observou-se elevação significativa desse
parâmetro no grupo Glicerol quando comparado ao grupo Salina. A elevação
no fluxo também ocorreu no grupo Glicerol + Vitis vinifera, porém, quando
esse foi comparado com seu controle não se constatou diferença
significativa. Esse achado pode estar relacionado ao aumento voluntário da
ingesta hídrica dos animais Glicerol (Glicerol 56±20,05 vs Salina
36±11ml/24hs de água por rato).
Resultados 39
O grupo Salina apresentou valores do Clcr que possibilitaram sua
utilização como parâmetros de normalidade. O grupo Vitis vinifera, utilizado
como grupo controle de tratamento não mostrou variabilidade significativa
quanto à FR e foi adotado como controle para o grupo Glicerol +Vitis
vinifera.
A administração de glicerol 50% i.m reproduziu o modelo de LRA por
rabdomiólise, resultando na redução significativa do Clcr quando comparado
ao grupo Salina (Glicerol 0,20± 0,002 vs Salina 0,65± 0,003). A LRA não
oligúrica esteve então presente.
O tratamento prévio com Vitis vinifera determinou proteção funcional
renal significativa nos animais que receberam glicerol (0,51± 0,02 vs
0,20±0,02), tendo restituído valores de Clcr similares ao grupo Vitis vinifera e
muito próximas do grupo salina.
Resultados 40
4.3 Função tubular: FENa e FEK
Tabela 3: Resultados referentes à função tubular [fração de excreção de sódio (FENa) e fração de excreção de potássio (FEK)] dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n FENa (%) n FEK (%)
Salina 5 0,61±0,41 5 27±22
Glicerol 7 4,50±0,35▲ 5 258±20▲
Vitis vinifera 5 0,89±0,41 5 60±22
Glicerol + Vitis vinifera 6 3,20±0,38▲● 8 112±17□◊
▲ p < 0,001 vs Salina ● p < 0,003 vs Vitis vinifera ◊ p < 0,001 vs Glicerol □ p < 0,03 vs Salina Os dados representam médias ± erro padrão (SEM).
A tabela 3 mostra que o grupo Glicerol teve elevação significativa da
FENa quando comparado ao grupo Salina . Essa alteração pode representar
lesão tubular por rabdomiólise (4,05±0,35 vs 0,61±0,41).
O grupo Glicerol+ Vitis vinifera demonstrou valores de FENa
semelhantes aqueles apresentados pelo grupo Glicerol. Ambos grupos
tratados com Glicerol tiveram FENa significativamente mais elevada do que
seus grupos controles. A Vitis vinifera reduziu a alteração na excreção
tubular de sódio induzida pelo glicerol, porém essa diferença não foi
estatisticamente significante.
Com relação a FEK, observou-se elevação significativa desse
parâmetro no grupo Glicerol quando comparado ao grupo Salina (p<0,001).
O grupo Glicerol + Vitis vinifera demonstrou redução significativa da
FEK quando comparado ao grupo Glicerol, porém, à semelhança do que foi
Resultados 41
observado para o parâmetro FENa, o tratamento com Vitis vinifera não
corrigiu integralmente a FEK do grupo com LRA induzida.
Resultados 42
4.4 Peróxidos urinários
Tabela 4: Resultados referentes aos valores de peróxidos urinários dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n Peróxidos urinários
(nmol/g de creatinina)
Salina 5 4,2±0,4
Glicerol 8 20,0±0,8▲
Vitis vinifera 5 7,1±0,4
Glicerol + Vitis vinifera 5 14,9±1,0▲∆о
▲ p < 0,001 vs Salina ∆ p < 0,001 vs Vitis vinifera о p < 0,004 vs Glicerol Os valores representam médias ± erro padrão (SEM).
Conforme apresentado na tabela 4, o grupo Salina apresentou
resultados de excreção de peróxidos urinários considerados como valores
de referência de normalidade neste estudo para este parâmetro (4,2±0,4).
O grupo Glicerol quando comparado ao grupo Salina apresentou
elevação estatisticamente significante na excreção de peróxidos urinários
(20,0±0,8 vs 4,2±0,4).
O grupo Glicerol+ Vitis vinifera quando comparado ao grupo Glicerol
apresentou redução significativa dos peróxidos urinários (14,9±1,0 vs
20,0±0,8), porém, apesar da visível melhora, os resultados não se igualaram
aqueles expressos para o grupo Vitis vinifera (14,9±1,0 vs 7,1±0,4).
Resultados 43
4.5 MDA (TBARS) urinário
Tabela 5: Resultados referentes aos valores de malondeldeído urinário dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n MDA
(nmol de TBARS urinários / 24 h)
Salina 7 149,6±24,0
Glicerol 8 380,9±22,4▲
Vitis vinifera 5 126,4±28,3
Glicerol + Vitis vinifera 7 233,0±24,0◊
▲ p < 0,001 vs Salina ◊ p < 0,001 vs Glicerol Os valores representam médias ± erro padrão (SEM).
A tabela 5 mostra que o grupo Glicerol apresentou maiores níveis de
MDA quando comparados aos do grupo Salina (380,9±22,4 vs 149,6;
p<0,001).
O grupo Glicerol + Vitis vinifera apresentou redução dos níveis de
MDA quando comparado ao grupo Glicerol (233±24,0 vs 380±22,4). Foi
identificado também que não houve significância estatística entre esse e os
demais grupos controle, sublinhando a ação antioxidante do fitoterápico
testado.
Resultados 44
4.6 Histologia e morfometria renal
Tabela 6: Resultados referentes aos valores de morfometria realizada no tecido renal dos grupos: Salina, Glicerol, Vitis vinifera e Glicerol + Vitis Vinifera. São Paulo. 2007.
Grupos n Morfometria
(área intersticial relativa %)
Salina 5 6,65±1,40
Glicerol 7 14,80±1,19▲
Vitis vinifera 5 8,24±1,40
Glicerol + Vitis vinifera 7 8,90±1,19◊
▲ p < 0,002 vs Salina ◊ p < 0,01 vs Glicerol
Os dados representam médias ± erro padrão (SEM).
O grupo Glicerol apresentou elevação significativa dos valores de
morfometria quando comparado ao grupo Salina, que representa expansão
da área intersticial renal do grupo Glicerol (14,8±1,19 vs 6,65±1,40;
p<0,001).
O grupo glicerol + vitis vinifera apresentou melhora nos parâmetros
morfométricos quando comparado ao grupo glicerol. Esses valores
assemelharam-se aos grupos Salina e Vitis vinifera (Figura 2).
Resultados 45
Figura 2: Cortes histológicos dos rins de ratos corados com Hematoxilina e eosina. (A) grupo Salina, (B) grupo Vitis vinifera, (C) grupo Glicerol e (D) grupo Glicerol + Vitis vinifera. Aumento de x 280.
A figura 2 ilustra os resultados quantitativos demonstrados na tabela 6
onde é possível observar as alterações da área intersticial renal de acordo
com os tratamentos instituídos.
Discussão 47
5. DISCUSSÃO
A LRA é a complicação mais importante que pode ocorrer no curso da
rabdomiólise, consistindo em problema clínico de importância
epidemiológica, pois a rabdomiólise não traumática compreende de 5 a 7%
de todos os casos de LRA e 25% de todos os casos de NTA, porém a
prevalência de LRA em pacientes com rabdomiólise varia entre 17% e 33%
(Vanholder et al., 2000).
A fisiopatologia da mioglobinúria induzida pela administração
intramuscular de glicerol 50% constitui-se em modelo clássico de LRA
experimental. A destruição muscular causada com administração do glicerol
leva a miólise que está relacionada à deterioração da função e estrutura
renal. Os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nesta síndrome são:
obstrução tubular, vasoconstrição renal e estresse oxidativo (Ferraz et al,
2002; Funez et al., 2003; Singh, Chander, Chopra, 2003; Zager, 1996).
Dentre as várias ações deletérias da mioglobina envolvidas no
processo da lesão renal por rabdomiólise, sabe-se que a liberação de ferro
dos estoques celulares estimula a conversão de H2O2 em OH. gerando
maior quantidade do radical hidroxila e conseqüentemente intensificando a
peroxidação lipídica (Paller, 1988; Nath, 1992).
Atualmente, as causas de LRA por rabdomiólise são variadas,
destacando-se o aumento do número de desastres por terremotos que
freqüentemente desencadeiam lesão do tipo dialítica. Mais recentemente,
outras categorias de rabdomiólise têm sido citadas, dentre elas a síndrome
Discussão 48
compartimental glútea após cirurgia bariátrica, o exercício físico abusivo em
maratonas, o uso de altas doses de estatina e a prolongada sedação com
propofol (Benevides et al., 2006; Clarkson et al., 2007; Sabsovich et al.,
2007; Schech et al., 2007).
É importante ressaltar que a enzima CK está presente na musculatura
estriada, portanto na lesão muscular, ela é liberada para a circulação. O
diagnóstico da rabdomiólise é realizado por avaliação clínica e é confirmado
bioquimicamente por meio da determinação dos níveis séricos de CK, sendo
esse considerado o marcador enzimático mais sensível de lesão muscular
(Vanholder et al., 2000). Os níveis de CK altamente elevados após 24 horas
da administração de glicerol 50% i.m neste estudo confirmaram a lesão
muscular e o diagnóstico de rabdomíolise.
Os resultados deste estudo reiteraram a exatidão do modelo glicerol
em induzir LRA mioglobinúrica uma vez que mostraram que a administração
de glicerol 50% em ratos desencadeou redução da função renal
representada pela diminuição dos níveis do Clcr, manutenção do fluxo
urinário e alterações da função tubular representadas pelo aumento dos
níveis da FENa, FEK, conforme resultados exibidos.
Esse padrão de lesão já era esperado e foi descrito por estudos
anteriores. Sabe-se que a rabdomiólise induz a liberação de heme que
contribui para a lesão renal com efeito sobre a hemodinâmica glomerular e
também sobre a fisiologia tubular.
Discussão 49
Quanto ao primeiro evento fisiopatológico, tem sido demonstrado o
efeito vasoconstritor da heme provavelmente mediado pela liberação de
ferro da mioglobina promovendo a formação de EROs. As EROs contribuem
para a formação de mediadores vasoativos que induzem vasocontrição com
diminuição do coeficiente de ultrafiltração e redução da taxa de filtração.
Esse evento é também intensificado pelo seqüestro de NO que agrega
vasoconstrição à microcirculação renal, piorando a lesão renal (Breziz, 1991;
Paller, 1998; Sharma et al., 1987).
A disfunção tubular determinada pela heme está pautada na
toxicidade direta daquele pigmento sobre a célula epitelial. Durante a
mioglobinúria, a lesão tubular proximal é decorrente de dois fatores que
apresentam papel crítico: lesão isquêmica mediada pela habilidade do
pigmento heme em intensificar a vasoconstrição renal e o estresse oxidativo
mediado pelas EROs.
O túbulo proximal é o segmento mais suscetível a efeitos tóxicos
devido a maior reabsorção associada à intensa atividade metabólica com
gasto energético e vulnerabilidade do sistema enzimático. Em condições
normais, no túbulo proximal cerca de 65% da carga filtrada de sódio e
potássio são reabsorvidos, porém, os locais mais importantes para a
regulação da excreção de potássio são os túbulos distais e túbulos
coletores. Nesses segmentos o potássio ou é reabsorvido ou é secretado,
dependendo das necessidades do organismo (Brenner et al., 1998).
Discussão 50
Na LRA instalada essa estabilidade funcional renal é comprometida
resultando em alterações na resposta estrutural da célula tubular, como
pode ser constatado neste estudo, considerando os resultados de redução
da FR e comprometimento da função tubular expressada pelo aumento das
FENa e FEK.
Os resultados referentes a homeostase dos íons sódio e potássio
neste estudo foram avaliados pela fração de excreção. É importante
destacar que a excreção de sódio pode ser regulada por alterações na
filtração glomerular ou reabsorção tubular. Na vigência da LRA uma das
conseqüências fisiológicas da lesão tubular consiste no desequilíbrio
proteico da membrana basolateral em resposta à redução de ATP. Essa
desorganização caracteriza-se pela translocação da bomba Na+K+-ATPase
e contribui para a degeneração da função de reabsorção de sódio no túbulo
proximal, resultando em aumento da FENa (Devarajan, 2006).
Já a excreção do potássio ocorre na porção final dos túbulos distais e
túbulos coletores corticais e é diretamente estimulada pela concentração de
potássio no líquido extracelular. A alta concentração de potássio no líquido
extracelular leva ao aumento de sua excreção e é um dos mais importantes
mecanismos de secreção e regulação de potássio extracelular, portanto, as
alterações tubulares que ocorrem com a diminuição da filtração glomerular
induzem ao aumento da FEK (Devarajan, 2006; Guyton,1998).
Discussão 51
Os resultados obtidos neste estudo com os altos níveis de FENa e
FEK caracterizaram a LRA induzida por glicerol e confirmaram o
comprometimento tubular em reabsorver estes íons.
Mediante a importância clínica da rabdomiólise, considerações
terapêuticas têm sido estudadas exaustivamente com o intuito de reduzir
suas complicações. Medidas renoprotetoras foram o tema do estudo em
questão.
Estudos têm referendado o uso de fitoterápicos no tratamento e
prevenção de doenças crônicas e estresse oxidativo (Watanabe et al., 2007).
Neste contexto, o uso de agentes antioxidantes naturais contidos na dieta e
em bebidas como o vinho tem merecido destaque pelas suas propriedades
antioxidantes que além de seqüestrar radicais livres, quelam metais e
modulam atividades enzimáticas em prol da inibição da peroxidação lipídica,
presente em vários processos patológicos, como em questão a doença renal
(Morillas-Ruiz, 2005; Puiggrós et al., 2005; Simonetti et al., 2002).
Muito se tem dito em favor da ingestão regular e controlada de vinho.
Talvez o primeiro estudo científico demonstrando o efeito de modulação da
função endotelial do vinho e dos produtos da uva vinífera seja o de
Fitzpatrick et al., 1993. Esse estudo apresentou de forma pioneira que
esses produtos demonstram efeito vasodilatador, provavelmente resultado
de interferência benéfica sobre o endotélio vascular.
Há estudos que avançaram na tentativa de elucidação do efeito
vasodilatador do vinho e observaram que a administração de agentes
Discussão 52
viníferos está relacionada à produção aumentada de NO em indivíduos
normais (Del’Agli, Busciala, Bosisio, 2004).
O efeito anti-hipertensivo de produtos obtidos de uvas viníferas já foi
divulgado em estudo nacional, em que se demonstrou que também pode
estar relacionado ao seu papel sobre a disfunção endotelial (Soares et al.,
2002).
Citamos até o momento o papel vasodilatador e antiinflamatório dos
agentes viníferos, ações essas com provável interface com sua ação
antioxidante. O efeito antioxidante do vinho ainda pode estar associado à
sua capacidade antiaterogênica.
Neste cenário, os flavonóides do vinho representam um grupo de
plantas fenólicas que exercem ação antioxidante relevante. De todos os
componentes presentes na Vitis vinifera, os compostos fenólicos,
especialmente as proantocianidinas, têm despertado muito interesse em
estudos clínicos e experimentais. As proantocianidinas são antioxidantes
naturais encontradas no extrato da semente da uva.
Neste estudo, considerando a hipótese da Vitis vinifera apresentar
propriedades antioxidantes com efeito renoprotetor, foi realizado um pré-
tratamento com esse fitoterápico por 5 dias com dose diária de 3m/Kg /dia
em ratos submetidos à lesão renal por glicerol. O tratamento sub-crônico
com Vitis Vinifera antes do glicerol resultou em melhora significante da FR.
Esse achado foi acompanhado pela redução nas FENa e FEK, sendo que a
primeira não estatisticamente significante, apesar da tendência para
Discussão 53
recuperação observada. Esse fato, a melhora das funções glomerular e
tubular, pode estar relacionado ao efeito antioxidante constatado nos
animais Vitis vinifera e discutido a seguir. A avaliação de sua ação
antioxidante foi feita por meio das dosagens de peróxidos urinários, que são
produtos primários da peroxidação lipídica e de MDA que realiza medida de
produtos finais da peroxidação lipídica. Os resultados de ambos os métodos
confirmaram a redução dos níveis da peroxidação lipídica, fortalecendo a
hipótese relativa ao efeito antioxidante da Vitis vinifera. Esse achado
complementou a experiência de melhora do Clcr após o mesmo tratamento.
Stefanovic et al., 2000 realizou estudo sobre o uso de
proantocianidinas, em que ratos receberam glicerol 8ml/Kg via i.m e após 3
dias consecutivos receberam a suplementação de proantocianidinas
20mg/Kg e foram avaliados quanto à função renal (uréia e creatinina sérica),
peroxidação lipídica (MDA) e à atividade enzimática da peptidase renal
(aminopeptidase A, aminopeptidase N e dipeptidilpeptidase I). Os resultados
demonstraram melhora da função renal, confirmada histologicamente,
provavelmente associada à redução dos níveis de MDA e ao aumento da
expressão da dipeptilpeptidase IV com efetiva degradação do TNFα. Este
estudo reiterou os achados descritos com dados relativos a outros produtos
oxidativos.
Sabe-se que na vigência da LRA ocorrem várias alterações
funcionais, que incluem distúrbios hidroeletrolíticos por alterações na
reabsorção de sódio, secreção de potássio, reabsorção de água e
Discussão 54
concentração urinária. Na presença da necrose muscular, a liberação de
ácidos das células musculares envolvidas, leva ao aumento da acidose
ânion gap. Adicionalmente, a hipóxia muscular libera ácido lático para a
circulação, intensificando a acidose e conseqüentemente desencadeando
efeitos deletérios metabólicos como, por exemplo, a hipercalemia. Em
pacientes com lesão muscular maciça, a quantidade de potássio liberada
pode resultar em arritmias, necessitando de tratamento imediato (Chander,
Chopra, 2000).
Rodrigo et al., 2004 em estudo experimental com ratos avaliou ação
antioxidante da exposição crônica a flavonóides presentes na uva por meio
da ingesta de vinho tinto (vinho tinto sem álcool, solução de etanol e água)
por dez dias consecutivos. A rabdomiólise foi induzida por glicerol 50%
(10ml/Kg via i.m). Os dados daquele estudo sugeriram que vinho exerceu
efeito protetor da função, bioquímica e danos morfológicos causados pela
rabdomiólise. Ressaltou também o sinergismo entre etanol e componentes
não alcoólicos do vinho. É fato que o efeito vasodilatador transitório obtido
pela administração do etanol pode ter contribuído para o resultado final do
tratamento. A utilização do principio ativo sem aditivos alcoólicos neste
estudo exclui essa variável e atribui os resultados exclusivamente às
proantocianidinas das sementes da uva.
As alterações morfológicas envolvidas na LRA induzida por glicerol
são achados importantes nessa lesão. As alterações mais comuns são o
apagamento da borda em escova, dilatação tubular, infiltrado inflamatório,
Discussão 55
presença de cilindros e áreas de regeneração celular. Ressalte-se que a
necrose celular é incomum e quando presente é restrita região da medula
externa. A apoptose pode ser encontrada em túbulos proximais e distais em
ambas formas de lesão isquêmica ou nefrotóxica (Devarajan, 2006).
O estudo histopatológico dos rins dos ratos neste estudo foi realizado
por meio da morfometria, cujo objetivo foi mensurar a expansão da área
intersticial relativa. Os resultados mostraram alterações características da
rabdomiólise no grupo que recebeu glicerol. Surpreendentemente, a análise
das lâminas dos rins de animais que receberam o pré-tratamento com Vitis
vinifera revelou melhora histológica significativa, que se confirmou pelos
dados estatísticos relativos a morfometria. O tratamento com Vitis vinifera
nos animais do grupo Glicerol praticamente restabeleceu o aspecto
histológico dos rins controle.
Os dados aqui apresentados sumarizaram de forma privilegiada o
padrão lesão versus proteção determinado por glicerol e Vitis vinifera.
A melhora da taxa de filtração glomerular e a atenuação da
tubulopatia protagonizada pelo tratamento sub-crônico com a Vitis vinifera
reiteraram seu efeito funcional também na lesão renal. A busca por dados
mais precisos sobre esse mecanismo renoprotetor reverenciou o efeito
antioxidante da Vitis vinifera, confirmando a redução da excreção de
peróxidos urinários e MDA.
Discussão 56
O efeito protetor da Vitis vinifera superou a otimização da FR e
redução do desequilíbrio redox e confirmou-se de forma concreta também na
melhora histológica, com função reparadora.
Assim, em linhas gerais, a Vitis vinifera referendou o efeito
renoprotetor relacionado à antioxidação, com resposta histológica sublime.
Estudos que avancem nessa investigação utilizando outros modelos de
lesão em diferentes sujeitos, com provável aplicação clínica imediata, serão
de grande valor para a melhor compreensão dos ramos de lesão e
alternativas terapêuticas na rabdomiólise.
Conclusões 58
6. CONCLUSÕES
� A administração de glicerol 50% induziu LRA não oligúrica em
ratos.
� O pré-condicionamento com Vitis vinifera mostrou melhora da
função renal e função tubular dos animais tratados com glicerol.
� A administração de glicerol 50% elevou a excreção de peróxidos
e malondealdeído urinários, enquanto que o pré-condicionamento
com Vitis vinifera reduziu esses parâmetros, confirmando sua ação
antioxidante.
� O glicerol determinou alteração na histologia renal, essas
alterações estruturais significantes puderam ser prevenidas
quando esses animais receberam o pré-tratamento com Vitis
vinifera.
Referências 60
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