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MIRIAN DE WAELE SOUCHOIS DE MARSILLAC
Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso de
fluoretos em superfície oclusal: Estudo “in vitro”.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Santa Catarina, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia - Área de concentração: Odontopediatria.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira
Florianópolis 2007
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Catalogação na fonte por: Vera Ingrid Hobold Sovernigo CRB-14/009
D278l De Marsillac, Mirian de Waele Souchois Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal: estudo in vitro / Mirian de Waele Souchois De Marsillac; orientador Ricardo de Sousa Vieira. – Florianópolis, 2007. 180 f. ; il. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia - Opção Odontopediatria. Inclui bibliografia.
1. Cárie dentária. 2. Microscopia, eletrônica de varredura; 3. Cimentos de Ionômeros de Vidro; 4. Fluoretos Tópicos. I.Vieira, Ricardo de Sousa. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU 616.314-053.2
3
Mirian de Waele Souchois de Marsillac
Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal:
Estudo “in vitro”.
Esta tese foi julgada adequada para obtenção do título de “Doutor em Odontologia”, área de concentração Odontopediatria, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 23 de novembro de 2007.
_________________________________________ Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________ Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira
Orientador
____________________________________________ Prof. Dr. Orlando Ayrton de Toledo
Membro
____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Flávio Martins Moliterno
Membro
____________________________________________ Prof. Dr. Alberto Carlos Botazzo Delbem
Membro
____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Henrique Maykot Prates
Membro
4
Epígrafe
“Em tudo, dai graças, porque esta é a vontade
de Deus em Cristo Jesus para convosco”.
1 Tessalonicenses 5.18
5
Dedico esta tese a
Deus.
6
Agradecimentos Especiais
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira, pela a sua
paciência, presença constante, disponibilidade, confiança, amizade e sua
retidão.
À memória de minha mãe Arlene Adrienne de Waele Mello e de meu pai
Hilton Souchois de Albuquerque Mello. Agradeço a ambos não só pelo
maravilhoso exemplo de vida, mas também de profissionalismo no atendimento
ao paciente e na elaborção de aulas e textos. Meus primeiros professores de
caráter, humildade, sabedoria e de perseverança em Cristo. Meu amor por
vocês é sem fronteiras.
Ao meu marido Fernando de Marsillac Lapolli, pelo seu amor,
companheirismo, entrega, paciência, disposição, compreensão e colaboração.
Acho que todas as palavras escritas não conseguem expressar o meu amor por
você.
As minhas irmãs Vivian de Waele Mello Braz e Lilian de Waele Mello,
cunhados e sobrinhos e aos demais familiares, pelo amor e apoio.
7
Aos parentes do meu marido, que me apoiaram, dividiram seu amor, me
receberam, em datas comemorativas ou não, e trouxeram esperança em
pequenos gestos. Vocês são jóias raras que Deus colocou no meu conívio.
As minhas amigas Profa. Dra. Hannelore Taschini Loevy, mestres
Gisele Caldas Alexandre e Maria Cristina Quelhas, e a Jacqueline Reifman,
pela presença, apoio e incentivo que vinham sempre por correio, e-mail ou
telefonema.
Aos professores da Disciplina de Odontopediatria do Departamento de
Estomatologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de
Santa Catarina, Dr. Ricardo de Sousa Vieira e Dras. Vera Lúcia Bosco, Maria
José de Carvalho Rocha, Izabel Cristina Santos Almeida, Joecí de Oliveira,
Sílvia Schaefer Tavares e Rosamaria Areal, pelos ensinamentos e troca de
informações, sempre fundamentados em evidências científicas. O esforço
dispendido com o curso de doutorado será sempre lembrado e a amizade
sincera de vocês é meu maior presente.
Aos professores e amigos da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade
de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Sônia Lúcia
Macedo Marçal, Vera Lúcia Campos Santos, Marialice Pentagna, Dr. Luiz
Flávio Martins Moliterno e as Dras. Branca Heloisa de Oliveira Martins
8
Vieira e Vera Sovieiro, pelo incentivo, paricipação e amor, mesmo estando tão
distantes.
À técnica em higiene dental Mirabel de Lima, com quem tive o prazer de
trabalhar no consultório particular, e também meus pais, por incansáveis anos.
Sei que poderei contar sempre com sua honestidade e senso de justiça.
Aos novos amigos e mestres Alice Mara Rodrigues Batista, Thais
Regina Kummer, Karin Faust, Fabiane Borges de Liz, Luciana Rodrigues
Vieira Batista, Fábio Luiz Andretti, Cleonice da Silveira Teixeira e aos
Doutores Meire Coelho Ferreira, Carla Moreira Pitoni, Ângela Scarparro
Caldo-Teixeira, Cláudia Fernandes Volpato, Naudy Brodbeck May, Luiz
Carlos Machado Miguel, Dircelene Colares de Souza, Cimara Fortes
Ferreira, Lizete Feuser e demais colegas do curso de Pós-Graduação em
Odontologia, pelo carinhoso convívio.
9
Agradecimentos
À Universidade Federal de Santa Catarina onde fui tão bem acolhida e
me possibilitou a oportunidade de realizar o curso de Doutorado em
Odontologia.
Ao Diretor do Centro de Ciências da Saúde, Prof. Dr. Cléo Nunes de
Souza, pela simpatia e interesse com que sempre tratou todos os alunos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia na pessoa do
Coordenador, Prof. Dr. Ricardo de Sousa Vieira e do Sub-Coordenador Prof.
Dr. Luiz Henrique Maykot Prates, pelo estímulo, confiança e apoio dedicados a
minha pessoa.
À Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), através do
Programa de Capacitação Docente (PROCAD), por ter possibilitado o meu
afastamento da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da
Universidade do Rio de Janeiro e, assim, me auxiliar nessa empreitada para a
obtenção do título de Doutor em Odontologia.
Aos Chefes do Departamento de Odontologia Preventiva e Comunitária
da Faculdade de Odontologia do Estado do Rio e Janeiro nos anos de 2004-5,
10
Profa. Dra. Branca Heloisa de Oliveira Martins Vieira, e de 2006-7, Profa.
Dra. Flávia Raposo Gebara Artese, por terem apoiado minha escolha em
realizar o Curso de Doutorado na Universidade Federal de Santa Catarina,
permitindo o meu afastamento deste departamento.
Aos Professores Doutores Ricardo de Sousa Vieira, Izabel Cristina
Santos Almeida e Luiz Henrique Maykot Prates da Universidade Federal de
Santa Catarina, pela contribuição feita ao projeto de tese durante a banca
examinadora de qualificação do mesmo.
Aos Professores Doutores Ricardo de Sousa Vieira, Luiz Fávio Martins
Moliterno, Orlando Ayrton de Toledo, Alberto Carlos Botazzo Delbem, Luiz
Henrique Maykot Prates, e à suplente Profa. Dra. Izabel Cristina Santos
Almeida, pela paticição na minha banca examinadora de Tese de Doutorado
em Odontologia – Área de Concentração em Odontopediatria.
Ao Prof. Dr. Miguel Pedro Guerra e à funcionária Maria Luisa Peixoto,
do Laboatório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal,
Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias da Universidade
Federal de Santa Catarina, por cederem o estereomicroscópio e o microscópio
de luz polarizada para a confecção desta tese. É muito bom trabalhar com
pessoas acolhedoras e disponíveis como vocês.
11
À Profa. Dra. Ana Maria Maliska, a Mislene A. de Castro e a Keila
Christina Kleinjohann, do Laboratório de Caracterização Microestrutural do
Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Federal de Santa
Catarina, pela disponibilidade e carinho dispensados a mim durante a confecção
das fotomicrografias desta tese.
À Farmaceutica Dayane Nunes de Andrade, da Farmácia de
Manipulação Flor de Anis, pela formulação das soluções utilizadas nesta
pesquisa. Sua rapidez e o bom atendimento fizeram toda a diferença.
Aos Cirurgiões-dentistas Porfa. Vera Lúcia Campos Santos, Nivaldo
Nuernberg, Levy Rau, Simone Pigozzi Haro e Fernando Baca, que não
mediram esforços em contribuir com a doação e o envio dos terceiros molares
inclusos extraídos de seus pacientes.
À memória da funcionária Janete de Oliveira, auxiliar da Disciplina de
Cirurgia do Departamento de Estomatologia do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Santa Catarina, pelo incansável auxílio na doação dos
cisos inclusos removidos cirurgicamente nessa disciplina.
Ao apoio dos Doutores Professores Mônica Almeida Tostes Amaral,
Cinthia Pereira Machado Tabchoury, Jaime Aparecido Cury e Alberto
12
Carlos Botazzo Delbem, que me ajudaram, à distância através de e-mails, a
solucionar algumas questões metodológicas.
Aos amigos da turma de Doutorado em Odontopediatria, na área de
concentração de Odontopediatria, e atualmente Doutores, Ana Cristina Gerent
Petry Nunes, Ângela Scarparo Caldo-Teixeira, Carla Moreira Pitoni,
Eduardo Grigollo Patussi, Isabelita Azevedo Duarte, Meire Coelho Ferreira
e Michele da Silva Bolan, pelas experiências vividas e compartilhadas.
Aos amigos da turma de Mestrado em Odontopediatria, na área de
concentração de Odontopediatria, e atualmente Mestres, Alice Mara Rodrigues
Batista, Thais Regina Kummer, Ana Carolina Couto Robles, Karin Faust,
Núbia de Rosso Giuliani, pelo carinhoso convívio.
À Dra. Carla Moreira Pitoni, pelo auxílio com a revisão da análise
estatística desta pesquisa e pela nossa amizade.
À Mestra Karin Faust e Dras. Ângela Scarparo Caldo-Teixeira, Meire
Coelho Ferreira e Carla Moreira Pitoni, por terem compartihado
conhecimentos técnicos e laboratoriais tão importantes para a finalização desta
tese.
13
Ao Prof. Dr. Sérgio Fernando Torres Freitas, pelo auxílio em algumas
questões estatísticas.
Às secretárias da Disciplina de Odontopediatria, Elisabete Luz Caldeira
de Andrada e Ivalda Delmore dos Santos, pela prestimosidade e simpatia com
que sempre me trataram.
Às bibliotecárias Vera Ingrid Hobold Sovernigo, Maria Gorete Montguti
Savi e também às funcionárias Avani Feltz e Márcia Dietrich Santiago da
Biblioteca Setorial de Odontologia, pela disposição e o bom humor.
Ao funcionário Lauro Silva, do Labotório de Pesquisa da Odontologia,
pelo companheirismo e incansável auxílio.
À funcionária Ana Maria Vieira Frandolozzo, do Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, e ao estagiário Diego André Caron, por estarem
sempre prontos a atender meus pedidos e resolver meus problemas.
À Profa. Márcia Rosena Soares Freccia, pela revisão do português, às
Profa. Sônia Lúcia Macedo Marçal e à Profa. Dra. Branca Heloisa de
Oliveira Martins Vieira, pelas revisões do inglês. Um texto bem redigido
simplifica a compreenção e traz satisfação ao ler.
14
Aos demais funcionários da Universidade Federal de Santa Catarina,
pelo convívio diário.
15
LISTA DE ABREVIATURAS Å: ångström
°C: grau Celsius
KHN: valor de dureza Knoop (“Knoop Hardness Number”)
kV: Kilovolt
litro: l
m/l: mililitro por litro
ml: mililitro
mm: milímetro
mm2: milímetro quadrado
μm: micrometro
μmol/l F: micromol por litro de íon flúor
M: molar
mM: milimolar
%: porcentagem
ppm F: parte por milhão de íon flúor
pH: potencial hidrogeniônico
rpm: rotações por minuto
®: Marca registrada
™: Marca registrada (“Trademark”)
x: vezes
16
SUMÁRIO Pg
Resumo 17
Abstract 20
Introdução Geral 22
Artigo 1 - Versão em Português
Lesão de mancha branca ativa, com erosão e/ou amolecimento
superficial, em esmalte dental humano produzida por ácido
lático.
28
Artigo 1 - Versão em Inglês
Artificial active white spot lesion with surface softening and/or
erosion in human dental enamel produced by lactic acid.
53
Artigo 2 - Versão em Português
Efeito de um cimento de ionômero vidro e um verniz fluoreto na
perda mineral de cárie artificial oclusal: Estudo in vitro.
76
Artigo 2 - Versão em Inglês
Effect of a glass ionomer cement and a fluoride varnish on
mineral loss of artificial occlusal caries: In vitro study.
107
Referências 136
Apêndices 145
Anexos 156
17
Resumo
18
De Marsillac, Mirian de Waele Souchois. Lesão ativa de cárie em esmalte e perda mineral após o uso e fluoretos em superfície oclusal: Estudo in vitro. 2007. 180f. Tese (Doutorado em Odontologia – Área de concentração Odontopediatria) – Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
O presente estudo in vitro foi dividido em dois artigos. O primeiro artigo foi realizado para avaliar através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano. Dez molares permanentes humanos foram utilizados neste experimento in vitro onde foram induzidas lesões de MBA em superfície lisa e não abrasionadas de esmalte. Uma amostra de superfície lisa de cada dente foi recoberta com duas camadas de esmalte para unhas, exceto por uma área medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2), delimitada no centro da amostra. Cada amostra foi exposta individualmente a 10,4 ml de uma solução desmineralizadora contendo: 0,1 mol/l de ácido lático tamponado; 0,2% de ácido poliacrílico; 0,03 ppm F; e a solução foi saturada com 50% de hidroxiapatita em pH 5,0 durante 42 dias (37oC) sem agitação. As amostras foram seccionadas no centro das lesões de MBA e uma metade foi analisada ao MEV e a outra foi submetida a teste de MI. Resultados: A média de profundidade da lesão de MBA foi de 80 μm (dp = 78,8) e foi possível detectar ao olho nu uma superfície branca rugosa e sem brilho. As fotomicrografias feitas com o MEV demonstraram que embora algumas áreas na superfície das lesões de MBA aparentassem estar relativamente intactas, outros locais da lesão apresentavam erosão. Um padrão prismático de dissolução, com o aumento das bainhas dos prismas de esmalte, foi observado em todas as amostras. Em algumas amostras também foram observados locais de destruição do centro dos prismas de esmalte. Essa metodologia pode ser utilizada para induzir lesões de MBA em esmalte dental humano, porém, quando forem realizados testes de MI, deve ser levada em consideração a erosão na superfície das mesmas. O segundo artigo determinou a perda mineral (∆Z) de lesões de MBA artificiais: apenas expostas a um desafio cariogênico de alto risco (DCAR) ou previamente tratadas com um cimento de ionômero vidro (CIV) ou um verniz fluoretado (VF), passando depois pelo mesmo DCAR. Sessenta terceiros molares humanos não irrupcionados foram secionados na superfície occlusal, em sentido buco-lingual, e desmineralizados por 42 dias. Uma metade oclusal de cada dente foi alocada para o grupo controle (D), e a outra foi destinada para grupos experimentais: A (ciclagem de pH); B (CIV + ciclagem de pH); e C (VF + ciclagem de pH). O teste de microdureza interna foi realizado. O teste de ANOVA de um critério (p=0.008) e o teste de Tukey (95%) determinou haver diferença estatística entre os grupos. Os valores médios para ∆Z foram de 4.983,53 para o grupo A(b); 3.090,93 para B(a); 4.303,29 para C(ab); e 4505.61 para o grupo D(b). Lesões de MBA, quando expostas a um DCAR, sofrem uma perda mineral considerável. Quando essas
19
lesões foram tratadas com CIV obtiveram os menores resultados para ∆Z enquanto o VF promoveu resultados intermediários. Implicações clínicas: Os produtos fluoretados testados podem diminuir a perda mineral de lesões naturais de MBA em superfícies oclusais.
Palavras-chave: Cárie Dentária; Esmalte Dentário, ultraestrutura; Microscopia, eletrônica de varredura; Cimento de Ionômero de Vidro; Cárie Dentária; Fluoretos Tópicos.
20
Abstract
21
De Marsillac, Mirian de Waele Souchois. Enamel active white spot lesion and mineral loss after the use of fluorides in occlusal surface: An in vitro study. 2007. 180f. Thesis (PhD in Dentistry – Pediatric Dentistry) – Post-graduate Program in Dentistry, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis.
ABSTRACT The present in vitro experiment was divided in to two articles. The first article was made to assess trough scanning electron microscopy (SEM) and by cross-section microhardness test (CSMH) whether the methodology exposed in this experiment can be used to induce active white spot lesion (WSL) in human dental enamel. Ten human permanent molars were used in this in vitro experiment to create artificial active WSLs on smooth and unabraided enamel surfaces. One section of each tooth was double coated with nail varnish except for a limited area sized 2.5 mm x 1 mm (2.5 mm2) at the center of the surface. Each specimen was individually exposed to 10.4 ml of a demineralizing solution containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer; 0.2% polyacrilic acid; 0.03 ppm F; and 50% saturated with hydroxyapatite at pH 5.0, during 42 days (37oC) without agitation. Samples were sectioned in the center of the artificial WSL and one half was analyzed in SEM and the other half was submitted to CSMH test. The mean depth of the active WSL was 80 μm (sd= 78.8) and a white dull rough surface could be detected by the unaided eye. SEM images demonstrated that although some surface areas of the active WSL appeared to be relative intact erosion was present. A prismatic pattern of dissolution was observed in all samples with an enlargement of the prism sheaths. In some samples there were also sites of destruction of prism cores. This methodology can be used to induce an active WSLs in human dental enamel but surface erosion has to be taken into account when performing CSMH test.The second article was an experiment sought to determine the mineral loss (∆Z) of artificially induced active WSLs: exposed to a high risk cariogenic challenge (HRCC) using pH cycling; treated with a glass ionomer cement (GIC) or a fluoride varnish (FV) and submitted to the same HRCC. Sixty unerupted human third molars were sectioned buccolingually on the occlusal surface and demineralized for 42 days. One half of each tooth was allocated to a control group (D) and the other were used as experimental groups: A (pH cycling); B (GIC + pH cycling); and C (FV + pH cycling). Cross sectional microhardness test was performed and ∆Z was assessed. One way ANOVA (p=0.008) and Tukey´s test (95%) determined statistical difference among groups. Mean values for ∆Z were 4983.53 for group A(b); 3090.93 for B(a); 4303.29 for C(ab); and 4505.61 for group D(b). HRCC promoted a greater mineral loss in active WSLs. Lesions treated with GIC had the lowest ∆Z improving the mineral content of WSLs while FV had intermediate results. The fluoride products tested might be able to improve mineral loss on natural occlusal WSLs. Key words: Dental Caries; Dental Enamel, ultrastructure; Microscopy, electron scanning; Glass Ionomer Cement; Dental Caries; Topical Fluorides.
22
Introdução
23
INTRODUÇÃO
Analisando dados obtidos no Projeto SB Brasil 2000 para crianças,
adolescentes e adultos, é possível verificar que a cárie dentária ainda é um
problema de saúde pública no nosso país (BRASIL, 2004).
A cárie dentária é associada com maior freqüência a determinados dentes
e à morfologia dentária específica, sendo os sulcos e fissuras os prinicipais
locais onde a doença predomina. Estratégias para avaliação do risco à cárie
dentária devem ser realizadas para uma população específica, indivíduos e
determinados sítios dentários (ANDERSON, 2002).
A face oclusal dos primeiros molares permanentes possui uma tendência
maior à cárie dentária (LI et al., 1993; WORKSHOP ON GUIDELINES FOR
SEALANT USE: RECOMMENDATIONS, 1995; BLAYNEY e HILL, 1967). Esses
dentes são de fundamental importância para o correto desenvolvimento da
oclusão nos seres humanos (TAVARES et al., 2002). Os primeiros molares
permanentes irrompem na boca da criança em torno dos seis anos de idade
(LUNT e LAW, 1974) e, geralmente, são um dos primeiros dentes permanentes
a fazê-lo. Esses elementos dentários levam em torno de 12 meses, desde o
primeiro aparecimento na gengiva, até a completa oclusão funcional
(CARVALHO; EKSTRAND; THYLSTRUP, 1991; SATO, 1991). Dentes não
irrupcionados possuem porosidades no esmalte externo que podem facilitar a
difusão de ácidos oriundos da placa bacteriana, enquanto esses não
completarem sua maturação pós-irruptiva (FEJERSKOV; JOSEPHSEN; NYVAD,
24
1984). Além disso, o potencial de risco à doença cárie nos primeiros molares
permanentes é maior que nos outros dentes devido a sua macromorfologia
oclusal. O acúmulo de placa bacteriana nas fóssulas e fissuras oclusais desses
dentes têm uma redução significativa, quando os mesmos atingem uma oclusão
funcional (EKSTRAND et al., 1993). Sua limpeza pode ficar prejudicada pela
falta de uma adequada higiene bucal. Entretanto, um programa de higiene bucal
individualizado para primeiros molares permanentes em irrupção, com consultas
de retornos para limpeza profissional e motivação, uma escovação diferenciada
e o auxílio dos responsáveis, duas vezes ao dia, foram capazes de reduzir a
placa bacteriana e o número de lesões de mancha branca ativa (MBA) nesses
dentes, durante o período de um ano (CARVALHO; EKSTRAND; THYLSTRUP,
1991).
A utilização de fluoretos é um método reconhecidamente eficaz na
prevenção e na remineralização de lesões iniciais de cárie no esmalte dentário
(TEN CATE e FEATHERSTONE, 1991; FEATHERSTONE, 2000;
FEATHERSTONE, 2004). O uso de fluoretos deve ser baseado no risco de cárie
do paciente (TINANOFF e DOUGLAS, 2002). Para aumentar a possibilidade de
contato do fluoreto tópico à superfície dentária, o mesmo foi adicionado ao
verniz odontológico (VF) a fim de que pudesse, então, permanecer durante
períodos prolongados (MURRAY, 1992; BLINKHORN e DAVIES, 1998). O uso
de vernizes fluoretados é encorajado pela literatura odontológica (ISMAIL, 1998;
BELTRÁN-AGUILAR; GOLDSTEIN; LOCKWOOD, 2000; AMERICAN
ACADEMY OF PEDIATRIC DENTISTRY, 2006-7). Os VFs podem prevenir a
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=9803034&query_hl=12&itool=pubmed_docsum
25
desmineralização do esmalte em dentes decíduos (MURRAY; WINTER; HURST,
1977; WEINSTEIN et al., 1994; WEINTRAUB et al., 2006) e permanentes
(HOLM; HOLST; MEJÀRE, 1984; MURRAY; WINTER; HURST, 1977). Os VFs
também podem retardar a progressão e remineralizar as lesões de MBA em
esmalte dental de decíduos (WEINSTEIN et al., 1994; AUTIO-GOLD e
COURTS, 2001; QUEIROZ et al., 2003), dentes permanentes (ÖGAARD;
RÖLLA; HELGELAND, 1984; HOLMEN et al., 1986; ADRIAENS; DERMAUT;
VERBEECK, 1990), incluindo superfícies de sulcos e fissuras de molares
permanentes (FLÓRIO et al., 2001).
Outra forma de intervir de maneira não invasiva é através do uso de
selantes de fóssulas e fissuras. Os selantes resinosos possuem uma grande
resistência ao deslocamento em relação aos selantes de cimento de ionômero
de vidro (CIV) (WORKSHOP ON GUIDELINES FOR SEALANT USE:
RECOMMENDATIONS, 1995; AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRIC
DENTISTRY, 2006-7). Os selantes resinosos são efetivos na prevenção de cárie
dentária, desde que sua integridade marginal e sua retenção no local sejam
mantidas intactas (GWINNETT et al., 1982). Um estudo clínico demonstrou que
lesões de cárie oclusal, quando seladas com selante resinoso, tornavam-se
inativas desde que o mesmo permanecesse sem infiltração, rachadura e/ou
perda (MERTZ-FAIRHURST; SCHUSTER; FAIRHURST, 1986). Quanto à
retenção do selante de CIV, alguns autores o consideram com uma pequena
capacidade em permanecer retido nos sulcos e fissuras dos dentes (ÖVREBÖ e
RAADAL, 1990; WILLIAMS et al., 1996). Por outro lado, vários estudos clínicos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Dermaut%20LR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlushttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Verbeeck%20RM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
26
utilizando os selantes de CIV têm demonstrado sua efetividade na prevenção de
cárie e uma boa retenção, em consultas de retorno até dois (MCLEAN e
WILSON, 1974), três (HOLMGREN et al., 2000; FRENCKEN; MAKONI;
SITHOLE, 1998) e cinco anos (PARDI et al., 2003; TAIFUR et al., 2003; BARJA-
FIDALGO et al., 2005). Dentes que receberam um selante de CIV e são
expostos novamente ao meio bucal, devido à perda do selamento, possuem
chances menores de desenvolver cárie dentária (WILLIAMS et al., 1996;
BEIRUTI et al., 2006). Esse fato pode ser resultado da combinação do efeito
conjunto da aquisição de fluoreto naquela superfície, oriundo do selante de CIV,
e da presença desse material como resíduo no interior das fóssulas e fissuras
(MEJÀRE e MJÖR, 1990; SEPPÄ e FORSS, 1991). Por isso, Williams et al.
(1996) recomendam o uso do selante de CIV como um material odontológico
capaz de liberação de fluoreto ao invés de um simples obliterador de fóssulas e
fissuras. Esses autores também o indicam em situações onde podem ocorrer
certa presença de umidade, em casos onde o paciente tenha pouca idade ou
não possua capacidade para colaborar.
É necessário que o profissional utilize os conceitos modernos de
diagnóstico de cárie (PITTS, 2004) para fazer observação e controle da lesão
inicial em esmalte dentário ou ainda optar por outros tratamentos não invasivos.
Esses conceitos também auxiliam o profissional a avaliar o desfecho para
qualquer um dos dois procedimentos adotados. A adesão do paciente é sempre
um fator primordial a ser considerado pelo profissional, qualquer que seja o
procedimento adotado por ele. Os fatores etiológicos que impelem o processo
27
carioso devem ser modificados, caso contrário qualquer tratamento não invasivo
ou invasivo que o profissional adote jamais será efetivo a longo prazo. Quando
uma lesão de esmalte é diagnosticada em seu início, o equilíbrio no processo
dinâmico entre a desmineralização e a remineralização pode acarretar em
cavitação, reparo, reversão ou manutenção da situação. O ideal seria que
pequenas concentrações de fluoreto estivessem presentes na interface dente e
fluidos bucais ou entre fluido da placa bacteriana e o dente. O fluoreto altera o
equilíbrio fisiológico entre a perda mineral e o reparo em favor do último (TEN
CATE; FEATHERSTONE, 1991; FEATHERSTONE, 2000).
O presente estudo teve dois objetivos: a) Avaliar por intermédio de
microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna
(MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução
de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano; b)
Determinar a perda mineral (∆Z) de lesões artificiais de MBA, produzidas em
oclusal de terceiros molares inclusos extraídos, apenas expostas a um desafio
cariogênico de alto risco (DCAR) ou previamente tratadas com um CIV ou ainda
um VF, posteriormente também submetidas ao mesmo DCAR.
28
Artigo 1: Versão em Português
29
Lesão de mancha branca ativa, com erosão e/ou amolecimento superficial, em esmalte dental humano produzida por ácido lático.
1. Mirian de Waele Souchois de Marsillac, Mestrado em Odontologia, Aluna
do Doutorado em Odontologia da Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis e Professora Assistente da Disciplina de
Odontopediatria da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Brasil.
2. Ricardo de Sousa Vieira, Doutor em Odontologia, Professor Associado I
na Disciplina de Odontopediatria da Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, Brasil.
Contato com autor:
Mirian de Waele Souchois de Marsillac
Endereço: Boulevard 28 de setembro, 157/ sala 226, Vila Isabel, Rio de Janeiro
– RJ. CEP 20.551-030
e-mail: [email protected]
Telefone/Fax: (21) 2587-6372
mailto:[email protected]
30
Resumo:
Objetivo: Avaliar através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a metodologia descrita neste experimento pode ser utilizada na indução de lesão de mancha branca ativa (MBA) em esmalte dentário humano. Metodologia: Dez molares permanentes humanos foram utilizados neste experimento in vitro onde foram induzidas lesões de MBA em superfície lisa e não abrasionadas de esmalte. Uma amostra de superfície lisa de cada dente foi recoberta com duas camadas de esmalte para unhas, exceto por uma área medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2), delimitada no centro da amostra. Cada amostra foi exposta individualmente a 10,4 ml de uma solução desmineralizadora contendo: 0,1 mol/l de ácido lático tamponado; 0,2% de ácido poliacrílico; 0,03 ppm F; e a solução foi saturada com 50% de hidroxiapatita em pH 5,0 durante 42 dias (37oC) sem agitação. As amostras foram seccionadas no centro das lesões de MBA e uma metade foi analisada ao MEV e a outra foi submetida a teste de MI. Resultados: A média de profundidade da lesão de MBA foi de 80 μm (dp = 78,8) e foi possível detectar ao olho nu uma superfície branca rugosa e sem brilho. As fotomicrografias feitas com o MEV demonstraram que embora algumas áreas na superfície das lesões de MBA aparentassem estar relativamente intactas, outros locais da lesão apresentavam erosão. Um padrão prismático de dissolução, com o aumento das bainhas dos prismas de esmalte, foi observado em todas as amostras. Em algumas amostras também foram observados locais de destruição do centro dos prismas de esmalte. Essa metodologia pode ser utilizada para induzir lesões de MBA em esmalte dental humano, porém, quando forem realizados testes de MI, deve ser levada em consideração a erosão na superfície das mesmas. Relevância clínica: As lesões de MBA induzidas artificialmente foram capazes de se assemelhar às lesões de MBA naturais. As imagens obtidas com o MEV do esmalte dentário poderiam ajudar o clínico a compreender a real extensão da doença e facilitar nos experimentos in situ que estivessem relacionados com a remineralização de lesões de MBA. Palavras-chave: Cárie Dentária; Esmalte Dentário, ultraestrutura; Microscopia, eletrônica de varredura.
31
INTRODUÇÃO:
O primeiro sinal visual da cárie dentária é comumente conhecido como
uma “lesão de mancha branca”. As etapas iniciais dessa lesão não podem ser
detectadas ao olho nu. O diagnóstico clínico desse tipo de lesão só pode ser
realizado quando o dente está limpo, seco e bem iluminado.1,2 A superfície do
esmalte que está envolvida nessa lesão perde o brilho e se torna esbranquiçada,
macia e com uma textura áspera. Algumas vezes essa lesão pode se tornar
pigmentada por material exógeno que é absorvido nessa região porosa.3,4,5
Embora a lesão de MBA seja considerada por muitos como uma lesão
incipiente, essa é um estágio relativamente tardio do processo carioso no
esmalte dentário.6
Alguns estudos in vivo relatam modificações no aspecto clínico e
histológico da superfície do esmalte dentário durante a inativação de uma lesão
de MBA.7,8,9 Tem sido mostrado que as lesões de MBA no esmalte dentário com
uma aparência esbranquiçada, sem brilho e rugosa, quando se tornaram inativas
adquiriram um aspecto de superfície brilhante, lisa e dura.
Antes mesmo que a lesão cariosa se torne visível ao olho nu, essa já
envolveu a dissolução da microestrutura externa do esmalte dentário. A
embebição de amostras de esmalte dentário em quinolina para a observação em
microscopia de luz polarizada, demonstrou que a dissolução era identificada
como uma zona translúcida.3 A liberação de componentes químicos, pela
dissolução parcial da periferia dos cristalitos7,10, para a fase líquida que os
circunda11,12, é uma reação inicial importante entre o ácido oriundo da placa
32
bacteriana e a superfície do esmalte dentário. Quando o ácido lático é utilizado
para o estudo de lesão artificial de MBA, fase líquida da lesão permanece
saturada em relação aos diferentes íons durante o ataque carioso. A
desmineralização de um dente consiste em dois processos: a dissolução do
mineral no limite mais interno da mesma (zona de vanguarda da lesão) e a
difusão dos íons de ácido do metabolismo bacteriano, sendo que os íons
minerais são transportados para fora da matriz do esmalte. Geralmente, a
difusão é um processo mais lento que a dissolução.12 A difusão do ácido da
placa bacteriana ocorre predominantemente nos espaços interprismáticos e
intercristalinos (ou poros) do esmalte dentário preenchidos com água e
proteínas. Vários estudos têm demonstrado que a zona de superfície da lesão é
mais porosa que o esmalte dentário sadio circunjacente ao mesmo. O aumento
das bainhas dos prismas são vias estruturais de passagem do ácido da
superfície do esmalte dentário para a lesão de subsuperfície em formação. O
esmalte dentário abaixo dessa zona afetada é mais poroso que a sua superfície.
Conseqüentemente, essa superfície ou zona de esmalte dentário afetada não é
uma área intacta e mostra uma tendência clara à desmineralização de
subsuperfície.5,7,10,11,13,14,15,16
Um experimento in vivo demonstrou que a dissolução direta da superfície
do esmalte dentário era observada em todos os estágios de desenvolvimento da
lesão, promovendo um aumento dos espaços intercristalinos.7 Com o progresso
da lesão, a erosão direta dessa superfície se torna mais evidente e pode ser
detectada clinicamente como uma MBA. Quando comparado ao esmalte sadio a
33
lesão de MBA possui uma superfície rugosa, esbranquiçada e sem brilho ou com
um aspecto de “branco giz”. Dois fenômenos podem ser relacionados às
características clínicas citadas: uma delas é a desmineralização de
subsuperfície devido ao aumento da porosidade interna do esmalte dentário e a
outra é causada pela erosão direta do esmalte superficial. A superfície irregular
e erodida juntamente com a lesão de subsuperfície geram as características
clínicas já mencionadas típicas da lesão de MBA.10,16
O objetivo do presente estudo in vitro foi de avaliar por microscopia
eletrônica de varredura (MEV) e pelo teste de microdureza interna (MI) se a
metodologia aplicada neste experimento pode ser utilizada para a indução de
lesão artificial de MBA no esmalte dentário humano.
MATERIAIS E MÉTODOS:
Dez molares humanos irrupcionados foram utilizados neste experimento.
O parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina (Brasil) aprovou o
desenvolvimento desta pesquisa. Os dentes usados neste estudo foram
extraídos por motivos alheios à mesma e as razões para tal estavam
especificadas no prontuário odontológico do paciente. Todos os pacientes eram
adultos, residentes em local com água de abastecimento fluoretada (1 ppm F), e
foram atendidos na Universidade Federal de Santa Catarina. Inicialmente todos
os dentes foram limpos com água corrente e detergente, com uma escova
34
dental. Qualquer tecido mole foi removido dos dentes empregando-se uma
cureta dental. Em seguida, foi realizada uma profilaxia com taça de borracha e
uma mistura de pedra-pomes e água deionizada em baixa rotação. Todos os
espécimes foram lavados com água deionizada e o seccionamento das raízes
dentárias foi efetuado com um disco diamantado (no 11-4254, serie 15 LC,
Buehler – Lake Bluff Illinois - EUA) acoplado a uma cortadeira elétrica
(ISOMET™ 1000, Buehler - Lake Bluff, Illinois – EUA) refrigerada com água
deionizada. O tecido pulpar foi removido das coroas dentárias e essas foram
seccionadas duas vezes no longo eixo da coroa dental gerando quatro
amostras. Todas as amostras obtidas foram inspecionadas em um
estereomicroscópio (Olympus SZH10 - Olympus Optical do Brasil, Ltda., São
Paulo, SP - Brasil) acoplado a um sistema de captura de imagem digital
(Olympus DP12 - Olympus Optical do Brasil, Ltda., São Paulo, SP - Brasil) para
excluir exemplares contendo defeitos de superfície, rachaduras, cárie dentária
e/ou alterações de coloração (25x). Apenas uma das amostras de cada dente foi
selecionada.
Todas as superfícies lisas e não abrasionadas foram isoladas com duas
camadas de um esmalte vermelho para unhas, exceto por uma área limitada
com papel adesivo medindo 2,5 mm x 1 mm (2,5 mm2). Após total secagem do
esmalte para unhas em temperatura ambiente, foi removido o papel adesivo e as
amostras foram submersas em 10,4 ml17,18 de uma solução desmineralizadora a
37oC sem agitação. A solução desmineralizadora foi preparada baseada em
White17 e continha: 0,1 mol/l de ácido láctico tamponado; 0,2% de ácido
35
poliacrílico (Carbopol® 980 – DEG Importadora de Produtos Químicos Ltda., São
Paulo, SP - Brazil); 0,03 ppm F19; essa solução foi saturada com 50% de
hidroxiapatita (Gen-phos HA - Hospitália Cirúrgica Catarinense Ltda.,
Florianópolis Santa Catarina - Brasil) em pH 5,0.
As amostras permaneceram em 10,4 ml de solução desmineralizadora
durante 42 dias, sendo que uma nova solução era preparada e trocada a cada
14 dias. Para evitar o crescimento de fungos foi acrescentado 0,18% de
metilparabeno a essa solução.20
Após a desmineralização, cada amostra foi lavada com água deionizada
durante 10 segundos. Todas as amostras foram seccionadas no centro da lesão
de MBA artificial utilizando-se o mesmo disco diamantado em uma cortadeira
elétrica ISOMET 1000. Esse procedimento foi realizado com refrigeração de
água deionizada em baixa rotação (100 rpm). As amostras foram, então, limpas
em frascos individualizados com água deionizada em um aparelho de ultra-som
(Ultrasonic Cleaner 1440D - Odontobrás Indústria de Equipamentos Médicos e
Odontológicos, Ribeirão Preto, SP – Brasil), por 20 minutos, e secadas em
temperatura ambiente sobre papel absorvente. Dez das amostras seccionadas
foram submetidas a teste de microdureza interna (MI) do esmalte dentário e as
outras respectivas secções foram observadas em microscópio eletrônico de
varredura (MEV).
Antes de efetuar o teste de MI as amostras foram incluidas em resina de
poliéster (Central do Fiber Glass, Florianópolis, SC - Brasil) e após a sua presa
foram lixadas e polidas em uma politriz da marca DP10 Struers machine22
36
(Panambra Industrial e Técnica SA, São Paulo, SP - Brasil). O teste de MI do
esmalte dentário foi realizado com um indentador Knoop em um microdurômetro
Shimadzu Micro Hardness Tester, Serie HMV-2 (Shimadzu Corporation Testing
& Weighing equipment division, Kioto - Japão), como descrito previamente por
Argenta et al.21 e De Marsillac et al.22 (em apreciação). Tanto a área da lesão de
MBA quanto o esmalte sadio circunjacente, coberto pelo esmalte para unhas,
foram submetidos ao teste de MI. Após a obtenção das médias de MI, em cada
uma das sete profundidades para o esmalte sadio e da lesão, esses valores
foram transformados em porcentagem do volume mineral segundo a fórmula de
Featherstone et al.23 A profundidade da lesão foi definida por Djikman et al.24
baseada, a partir da parte externa do esmalte, no teor de até 95% do valor de
conteúdo mineral do esmalte sadio.
As amostras submetidas ao MEV requerem desidratação em
concentrações crescentes de etanol.25 Todas as amostras foram cobertas com
uma camada de ouro de cerca de 300 Å de espessura5 em um aparelho Sputter
Coater, Bal-Tec SCD005 (BAL-TEC AG, Balzers - Principado de Liechtenstein) a
vácuo. A superfície externa do esmalte dentário foi observada e fotografada com
um MEV (Philips XL30, Eindhoven - Holanda), de maneira randomizada, nos
seguintes aumentos: 16, 60, 250 e 400 vezes e, em alguns espécimes, um
aumento de 8.000x foi utilizado. Uma visão sagital (interna) do esmalte dentário
com lesão de MBA foi analisada com aumentos de 120, 200 e, em algumas
ocasiões, de 400 vezes. O aparelho de MEV foi operado em 10 ou 20 kV.
37
RESULTADOS:
A tabela 1 contém a média da MI Knoop e o respectivo valor de
porcentagem mineral juntamente com o desvio padrão (dp) obtido em cada
profundidade analisada na lesão de MBA ou no esmalte hígido. Devido à erosão
ou a uma grande perda de substância mineral (amolecimento) na superfície da
lesão de MBA, todas as amostras tiveram um valor de dureza Knoop muito baixo
ou perda da superfície externa em até 20 μm. Sempre que houver um valor
muito baixo de dureza Knoop, esse não poderá ser medido de forma adequada
no monitor do computador. Ainda nessa tabela, a profundidade média da lesão
de MBA foi de 100 μm (80,3 e dp = 12,1).
Table 1 – Valores de microdureza Knoop para esmalte sadio e para a lesão de MBA, volume de porcentagem mineral e desvio padrão (dp) em cada profundidade avaliada.
Esmalte Sadio (N=10) Lesão de MBA (N=10) Profundidade Média Knoop
(dp) % de volume mineral (dp)
Média Knoop (dp)
% de volume mineral (dp)
20 μm 295,8 (39,5) 85,1 (5,1) ---------- ---------- 40 μm 307,8 (44,2) 86,6 (5,5) 29,75 (13,5) 34,4 (3,8) 60 μm 321,7 (58,8) 88,1 (7,2) 116,4 (58,8) 54,4 (17,3) 80 μm 324,1 (39,5) 88,6 (4,8) 231,9 (78,8) 75,9 (10,8) 100 μm 332,8 (30,5) 89,7 (3,7) 265,2 (30,5) 80,3 (12,1) 120 μm 345,6 (33,0) 91,2 (3,8) 307,7 (33,2) 86,6 (3,8) 140 μm 352,3 (23,5) 92,0 (2,7) 327,5 (25,4) 89,1 (2,8)
Tabela 2 (APÊNDICE A) mostra o número de amostras com um baixo
valor Knoop (amolecimento) ao teste de MI ou perda de estrutura do esmalte
(erosão) em todas as profundidades avaliadas.
38
As fotomicrografias feitas com auxílio do MEV foram realizadas de forma
aleatória das áreas de lesão de MBA em cada uma das dez amostras. O local da
amostra exposto a solução desmineralizadora pôde ser distinguido ao olho nú e
também em aumento de 16x ao MEV (figura 1). As imagens demonstraram que,
em aumentos menores (16x ou 60x), algumas áreas da lesão de MBAestavam
erodidas e outras pareciam aparentemente intactas quando comparadas ao
esmalte sadio circundante (figura 1).
Figura 1 – Fotografia da amostra do dente número 4 em estereomicroscópio (7x) demonstrando a área do esmalte dentário exposta à solução desmineralizadora na porção superior direita da imagem. Aspecto da mesma amostra em pequeno aumento (16x) ao MEV.
39
Um padrão prismático de destruição foi observado em todas as amostras
que foram analisadas em áreas erodidas e nas áreas de esmalte aparentemente
intacto. Esse padrão origina um aumento da bainha do prisma (figura 2).
Algumas áreas superficiais foram acometidas por erosão, onde foram
evidenciadas pericimatias subjacentes se sobrepondo no esmalte dentário
(figura 2).
Figura 2 – Amostra do dente número 4 demonstrando a erosão da superfície evidenciando pericimatias subjacentes (60x) na imagem superior direita. As setas na imagem de maior aumento (250x) apontam para a sobreposição das pericimatias. Na mesma fotomicrografia pode ser distinguido um padrão prismático de destruição.
40
Algumas vezes o aumento das bainhas dos prismas criou uma estrutura
em forma de “arcos” (seta na figura 3). Todas amostras apresentaram destruição
do centro dos prismas (figura 3) em áreas de erosão superficial.
Figura 3 – No quadro da maior imagem (400x) a amostra do dente número 3 mostra um padrão prismático de destruição da superfície do esmalte e a seta indica a estrutura em forma de arco. A destruição do centro do prisma pode ser vista na fotomicrografia no canto superior direito (8.000x).
41
Vias estruturais, promovidas pela difusão da solução desmineralizadora,
são observadas nos espaços interprismáticos e intercristalinos em um local de
padrão prismático de desmineralização em uma área não erodida na amostra do
dente 6 (figura 4).
Figura 4 – Amostra do dente número 6 no canto superior direito (8.000x) mostra um local sadio de esmalte dentário e na imagem maior as setas destacam as áreas de dissolução intercristalina e interprismática no mesmo dente, em um local onde não havia erosão da MBA (8.000x).
42
A fotomicrografia da porção interna da lesão de MBA também mostra
algumas partes de perda da superfície externa do esmalte (figura 5).
Figura 5 – Secção transversal da lesão de MBA da amostra do dente número 4 onde as chaves delimitam a porção erodida da superfície do esmalte dentário (120x).
DiSCUSSÃO:
Uma solução de ácido lático tamponada foi utilizada neste experimento
para produzir lesão de cárie em amostras de esmalte dentário humano,17,18
porque esse ácido representa 90% ou mais da sacarose e/ou glicose fermentada
pelos Streptococcus.26,27 Esses são os microorganismos predominantes no início
43
da colonização da placa dental em esmalte ou superfícies radiculares28 em
indivíduos cárie ativos ou não.29
A solução desmineralizadora empregada neste estudo foi capaz de criar
cárie artificial em molares humanos extraídos que se assemelham à lesão
natural de MBA de superfície lisa quando comparados a literatura. O ácido
poliacrílico foi usado nessa formulação para restringir a difusão do ácido láctico
no esmalte dentário e criar lesões de subsuperfície.17,30,31 Uma pequena
concentração de fluoreto19 também foi utilizada para auxiliar na criação da zona
de superfície da lesão de MBA e evitar uma grande erosão do esmalte
dentário.32 Outros estudos laboratoriais têm utilizado diferentes métodos para
restringir a difusão do ácido na superfície do esmalte e criar lesões de
subsuperfície em esmalte dentário humano ou bovino como: sistemas de
géis33,34; soluções desmineralizadoras enriquecidas com cálcio e fosfato
contendo fluoretos35,36,37 ou sem fluoreto38,39; soluções desmineralizadoras com
protetores de superfície e enriquecidas com cálcio e fosfato contendo ou não
fluoretos.11,17,18 As substâncias mais utilizadas como protetores de superfície na
formação de lesões artificiais de subsuperfície em esmalte dentário são ou o
Metano hidroxidifosfonato (MHDP)11 ou o ácido carboxílico (Carbopol™).17 O
MHDP pode interagir com o ácido lático tamponado através da competição com
os locais contendo cálcio no esmalte dentário e o ácido poliacrílico possui uma
ação independente30. O ácido poliacrílico é um excelente protetor de superfície
para o esmalte dentário e ainda permite que os ácidos orgânicos se difundam
44
pela zona de superfície do mesmo, promovendo uma lesão de subsuperfície.
Essa substância química é comercializada com maior facilidade que o MHDP.31
A média da profundidade da lesão artificial de MBA obtida neste estudo in
vitro foi de 100 μm (80,3 e dp = 12,1). Essa pode não ser uma lesão muito
profunda, porém, ela pode ser detectada ao olho nu e como smalte úmido
devido ao somatório dos efeitos da superfície erodida e à lesão de subsuperfície.
Um experimento in vitro realizado por Margolis et al.32 também utilizou uma
solução de ácido lático (0,1 M), parcialmente saturada em relação ao mineral do
esmalte dentário, em pH 4,3, e baixas concentrações de fluoreto. Essa solução
desmineralizadora não possuía um agente protetor de superfície como a usada
no presente estudo e por isso as imagens ao MEV evidenciaram que, após 72
horas, as soluções contendo 0,004 e 0,009 ppm F apresentaram cavitações na
superfície do esmalte. Outras soluções desmineralizadoras contendo 0,024;
0,054 e 0,154 ppm F formaram uma superfície de esmalte dentário
aparentemente intacto após o mesmo período. O exame visual dessas amostras
apresentava um aspecto esbranquiçado, embora nas fotomicrografias com
aumento de 500x não tenha havido diferença entre a área afetada e o esmalte
sadio.
Caso uma lesão de MBA seja detectada após secagem, provavelmente
ela deve estar limitada a uma discreta dissolução da superfície do esmalte
dentário e a uma desmineralização da subsuperfície na sua porção externa.
Quando uma lesão de MBA é visível em uma superfície dentária úmida, a
mesma já penetrou mais na superfície do esmalte dentário1,16. As características
45
de uma lesão de mancha branca com uma superfície de coloração
esbranquiçada, sem brilho e rugosa indicam um estágio avançado da lesão
cariosa no esmalte dentário e é então denominada de MBA.7,8,9,10,16,40 É por isso
que Ekstrand2 sugeriu que as pesquisas clínicas registrassem essas diferenças
nas lesões de mancha branca em esmalte carioso utilizando um critério visual
que possibilitasse constatar a atividade e a profundidade das lesões em faces
oclusais.
As amostras de lesão de MBA obtidas neste experimento apresentaram
dois graus de envolvimento da superfície do esmalte mesmo em aumento de
apenas 16x (figura 1): áreas de erosão e áreas aparentemente
intactassemelhante ao esmalte sadio circundante. Esses locais distintos da
lesão de MBA também demonstraram possuir diferentes graus de dissolução do
esmalte. Nos locais de esmalte dentário aparentemente intacto foi possível
detectar um acometimento inicial do esmalte dentário devido ao acentuamento
das características anatômicas superficiais com: maior definição nas áreas de
sobreposição das pericimátias e aprofundamento das depressões referentes aos
processos de Tomes. Segundo Holmen et al.7 isso já caracteriza uma dissolução
inical do esmalte pelo processo carioso.
Um padrão prismático de desmineralização, com um aumento das
bainhas dos prismas, foi detectado em algumas partes da lesão de MBA (figuras
2 e 3). Esse padrão pôde ser visualizado tanto em locais aparentemente intactos
como nas áreas de erosão de todas as amostras. Estes achados corroboram
com os de Haikel et al.5 , Holmen et al.7, e Frank15 que analisaram lesões de
46
MBA naturais. Alguns autores5,15 consideram que o padrão prismático de
desminerlização seja um dos graus iniciais do processo carioso. Nos locais de
erosão da lesão de MBA também foram observadas áreas onde o padrão
prismático apresentava dissolução do centro dos prismas (figura 3). Segundo
Haikel et al.5 e Frank15 isso indica um grau mais avançado de comprometimento
do esmalte dentário pelo processo carioso.
O presente estudo não teve como foco principal evidenciar a
microestrutura interna da lesão de MBA e sim a superfície da mesma.
Entretanto, o aspecto interno da superfíice erodida do esmalte com lesão de
MBA pode ser verificado na figura 5. Frank15 também estudou ao MEV a porção
interna da lesão natural de MBA em esmalte dentário humano após o
seccionamento. Ele evidenciou que o aumento das bainhas dos prismas também
ocorria nessa porção interna da lesão.
Alguns “buracos ou orifícios focais” foram encontrados em locais de lesão
de MBA e de esmalte sadio nas amostras observadas nessa pesquisa in vitro.
Haikel et al.5 detectaram que apenas 10% das suas amostras apresentaram
“buracos ou orifícios focais” na superfície de lesões naturais de MBA ou nas
lesões cariosas pigmentadas de dentes decíduos ou permanentes. De acordo
com esses autores, os “buracos ou orifícios focais” podem ser encontrados no
esmalte dental sadio ou em lesões de MBA, entretanto, eles não parecem ser
uma característica especial do processo carioso no esmalte dentário.
A figura 4 compara um local com superfície de esmalte sadio a um local
não erodido da superfície de lesão de MBA com padrão prismático de
47
desmineralização de uma mesma amostra usando o mesmo aumento (8.000x).
A imagem maior dessa figura demonstra as vias de difusão criadas pela solução
desmineralizadora nos espaços intercristalinos e interprismáticos. É através
desses espaços que o ácido da placa bacteriana tem acesso a subsuperfície do
esmalte dentário como relatam outros autores. 4,6,9,10,12,14,15
A metodologia apresentada nesta pesquisa pode promover uma
adequada fonte de estudo para o processo carioso de lesões de MBA em
esmalte dentário humano. O teste de MI e as fotomicrografias avaliadas na atual
pesquisa in vitro demonstraram que a solução desmineralizadora utilizada foi
capaz de criar lesão artificial de MBA em esmalte dentário humano de maneira
semelhante à lesão cariosa natural. Contudo, a erosão superficial dessas lesões
deve ser levada em consideração quando forem realizados teste de MI.
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53
Artigo 1: Versão em Inglês
54
Artificial active white spot lesion with surface softening and/or erosion in human dental enamel produced by lactic acid.
1. Mirian de Waele Souchois de Marsillac, DDS, MSc, PhD candidate at the
Department of Pediatric Dentistry from the Federal University of Santa
Catarina, Florianópolis and Assistant Professor, Department of
Community and Preventive Dentistry, State University of Rio de Janeiro,
Brazil.
2. Ricardo de Sousa Vieira, DDS, MSc, PhD, Associate Professor at the
Department of Pediatric Dentistry from the Federal University of Santa
Catarina, Florianópolis, Brazil.
Corresponding author:
Mirian de Waele Souchois de Marsillac
Address: Boulevard 28 de setembro, 157/ sala 226, Vila Isabel, Rio de Janeiro –
RJ. CEP 20.551-030
e-mail: [email protected]
Telephone/Fax: (21) 2587-6372
mailto:[email protected]
55
Artificial active white spot lesion with surface softening and/or erosion in
human dental enamel produced by lactic acid. Abstract:
Purpose: To assess trough scanning electron microscopy (SEM) and
cross-sections microhardness (CSMH) test whether the methodology exposed in
this experiment can be used to study active white spot lesion (WSL) in human
dental enamel. Methods: Ten human permanent molars were used in this in vitro
experiment to create artificial active WSLs on smooth and unabraided enamel
surfaces. One section of each tooth was double coated with nail varnish except
for a limited area sized 2.5 mm x 1 mm (2.5 mm2) at the center of the surface.
Each specimen was individually exposed to 10.4 ml of a demineralizing solution
containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer; 0.2% polyacrilic acid; 0.03 ppm F; and
50% saturated with hydroxyapatite at pH 5.0, during 42 days (37oC) without
agitation. Samples were sectioned in the center of the artificial WSL and one half
was analyzed in SEM and the other half was submitted to CSMH. Results: The
mean depth of the active WSL was 80 μm (sd= 78.8) and a white dull rough
surface could be detected by the unaided eye. SEM images demonstrated that
although some surface areas of the active WSL appeared to be relative intact
erosion was present. A prismatic pattern of dissolution was observed in all
samples with an enlargement of the prism sheaths. In some samples there were
also sites of destruction of prism cores. This methodology can be used to induce
active WSLs in human dental enamel but surface erosion has to be taken into
account when performing CSMH test.
Clinical Significance: Artificial induced active WSLs resembled natural ones. The
SEM images of active WSLs on enamel would help the clinician understand the
actual extent of the disease and could facilitate in situ experiments that deal with
remineralization of enamel lesions.
Key words: Dental Caries; Dental Enamel, ultrastructure; Microscopy, electron scanning.
56
INTRODUCTION:
The first visual clinical sign of dental caries is commonly known as a “white
spot lesion” (WSL). Early stages of this lesion cannot be detected with an
unaided eye. Clinical diagnosis of this kind of lesion can only be performed on a
clean, dried and well illuminated tooth. 1,2 The enamel surface involved in this
lesion looses its gloss and turns whitish, soft and with a roughened texture.
Sometimes this lesion becomes stained by exogenous material adsorbed to the
porous region.3,4,5 Although the white spot lesion is considered by many as an
incipient carious lesion it is actually a relatively late stage of the carious process
in enamel.6
Clinical aspects and histological features of surface enamel changes
during the arrestment of active carious lesions in vivo have been reported.7,8,9 It
has been shown that active carious enamel lesions with a whitish opaque
appearance and a rough surface, when transformed into an inactive stage obtain
a smooth and hard surface.
Before the lesion becomes macroscopically visible to the naked eye it
already involves the dissolution of the external microsurface. Imbibition in
quinoline and observation under a polarized light microscope demonstrated that
this dissolution was identified as a translucent zone.3 An important initial reaction
between the acid from the dental plaque and the enamel surface is the partial
dissolution of the crystallites peripheries,7,10 liberating these chemical
components to the surrounding water phase.11,12 When using lactic acid to study
artificial WSL the fluid within the lesion remained saturated with respect to
57
different ions during caries attack. Demineralization of a tooth consists in two
processes: dissolution of the mineral at the advancing front of the lesion, and
diffusion of acid ions from bacteria metabolism and solubilized mineral ions that
are transported out of the lattice. Generally, diffusion is the slowest of these two
processes.12 Acid diffusion from the dental plaque occurs predominantly in the
interprismatic and intercrystalline spaces (or pores) filled with water and proteins.
A number of studies have demonstrated that the surface zone of the lesion has
more porous than the surrounding sound enamel. Enlargement of prism sheaths
are structure pathways from the enamel surface to the forming sub-surface
lesion. The enamel underneath this affected zone is more porous than the latter.
Consequently, this is not an almost intact surface area as some professionals
assume. Moreover, it clearly shows a tendency to subsurface
demineralization.5,7,10,11,13,14,15,16
An in vivo experiment demonstrated a direct dissolution of the enamel
surface observed in every stage of lesion development, and leading to an
enlargement of intercrystalline space.7 As the lesion progresses the direct
surface erosion becomes more evident and can be clinically detected as an
active WSL. Clinical characteristics of this active lesion are the rough, white dull
(without surface luster) or chalky appearance with a distinct level from the sound
enamel to the affected zone. Two phenomena are related to this clinical
characteristic, one is the subsurface demineralization due to the increased
internal enamel porosity and the other one is caused by the direct surface
58
erosion. Both, the irregular eroded surface and the subsurface lesion, generates
the clinical aspects that are characteristics of a WSL cited above. 10,16
The aim of the present in vitro study was to determine by SEM and cross-
sectional microhardness (CSMH) test whether the methodology used in this
experiment can be use to induce artificial active WSL on human dental enamel.
MATERIAL AND METHODS
Ten extracted irrupted molars were used in this study which had ethical
approval by the Committee of Ethics in Human Being Research of the Federal
University of Santa Catarina (Brazil). These teeth were extracted for reasons
specified at the patient’s dental record forms and had no relation to this
experiment. All patients were adults, living on a water fluoridated area (1 ppm F),
and attending the Federal University of Santa Catarina Dental School. Initially all
teeth were cleaned under running tap water with detergent and a toothbrush. Any
soft tissue was removed from the teeth with the aid of a dental scaler. A
prophylaxis was performed with pumice slurry and a mechanic rotating cup and,
subsequently the teeth were washed with deionized water. Roots were sectioned
with a wafering diamond blade (#11-4254, Series 15 LC, Buehler - Lake Bluff,
Illinois – USA) on a cutting machine (ISOMET™ 1000, Buehler - Lake Bluff,
Illinois – USA) refrigerated with deionized water. Pulp tissues were discharged
and the crowns were sectioned twice on the occlusal surface, trough its long
axis, giving rise to four samples. All samples were visually inspected on a
59
stereomicroscope (Olympus SZH10 - Olympus Optical do Brazil, Ltda., São
Paulo, SP - Brazil) coupled to a digital imaging capturing system (Olympus DP12
- Olympus Optical do Brasil, Ltda., São Paulo, SP - Brazil) for enamel defects
such as cracks, caries or discolorations (x25). Only one sample from each tooth
was selected for the experiment.
All smooth and unabraided surfaces were painted with two coats of a red
nail varnish except for an area limited with an adhesive paper, sized 2.5 mm x 1
mm (2.5 mm2). The adhesive paper was removed after the nail varnish had dried
completely at room temperature and samples were individually immersed in 10.4
ml17,18 of a demineralizing solution without agitation at 37oC. The demineralizing
solution was prepared based on White17 containing: 0.1 mol/l lactic acid buffer;
0.2% polyacrilic acid (Carbopol® 980 – DEG Importadora de Produtos Químicos
Ltda., São Paulo, SP - Brazil); 0.03 ppm F19 and 50% saturated with
hydroxyapatite (Gen-phos HA - Hospitália Cirúrgica Catarinense Ltda.,
Florianópolis Santa Catarina - Brazil) at pH 5.0. Samples remained in 10.4 ml of
demineralizing solution for 42 days and within every 14 days the solutions were
changed for a new freshly prepared one. To avoid fungal growth in the
demineralizing solution 0.18% methylparaben was added to it. 20
After demineralization, each surface was washed in deionized water for 10
seconds and sectioned in half at the center of the lesion utilizing ISOMET 1000
cutting machine and a diamond wafering blade. This procedure was performed
under deionized water cooling and with a low rotating speed of 100 rpm. All
specimens were ultrasonicated (Ultrasonic Cleaner #1440D - Odontobrás
60
Indústria de Equipamentos Médicos e Odontológicos, Ribeirão Preto, SP –
Brazil) for 20 minutes in individual vials containing deionized water and were left
to dry at room temperature on top of an absorbent paper. Ten halves were
submitted to cross-sectional microhardness (CSMH) test and the other ten
halves were observed on a scanning electron microscope (SEM).
Before accomplishing CSMH test all samples were embedded in polyester
resin (Central do Fiber Glass, Florianópolis, SC - Brazil) and after its cure they
were grounded and polished22 on a Politriz DP10 Struers machine22 (Panambra
Industrial e Técnica SA, São Paulo, SP - Brazil). CSMH test was performed with
a Knoop indenter on a Shimadzu Micro Hardness Tester, HMV-2 Series
(Shimadzu Corporation Testing & Weighing equipment division, Kioto - Japan),
as previously described by Argenta et al.21 and De Marsillac et al.22 (In press).
Both active WSL and sound enamel area beneath the nail varnish were
submitted to this test. After obtaining the mean values of CSMH test on each of
the seven tested depths these findings were transformed into volume percent
mineral trough the formula used by Featherstone et al.23 The depth of the lesion
has been defined as up to 95% of the mineral content of the sound enamel.24
SEM analysis required dehydration with increasing concentrations of
ethanol.25 All specimens were coated with a layer of gold-palladium of about 300
Å of thickness5 in a Sputter Coater, Bal-Tec SCD005, machine (BAL-TEC AG,
Balzers - Principality of Liechtenstein) under vacuum. Enamel outer surface was
observed and photographed, at random, with the aid of a scanning electron
microscopy (Philips XL30, Eindhoven - Netherlands) using magnifications of 16,
61
60, 250, 400 times and in some specimens a 8.000 magnification was also used.
Sagital (internal) view of the artificial WSL in the enamel was studied with
magnifications of 120, 200 and sometimes x400. The SEM was operated at 10 or
20kV.
RESULTS:
Table 1 indicates the mean Knoop hardness number and its volume
percent mineral along with their standard deviation obtained on each depth of the
CSMH test in WSL or sound and enamel. Due to surface erosion or to a great
loss of mineral substance (softening) on the surface of the WSLs all samples had
either a very low Knoop value or lost the outer 20 μm enamel structure.
Whenever there is a very low Knoop value it cannot be adequately measured on
the computer monitor. Table 1 also shows that the mean depth of the active WSL
was 100 μm (80.3 and dp = 12.1).
Table 1 - Sound and enamel active WSL’s Knoop hardness value, volume
percent mineral and standard deviation (sd) for each depth evaluated.
Sound Enamel (N=10) WSL (N=10) Mean Knoop
(sd) Volume %
mineral (sd) Mean Knoop
(sd) Volume %
mineral (sd) 20 μm 295.8 (39.5) 85.1 (5.1) ---------- ---------- 40 μm 307.8 (44.2) 86.6 (5.5) 29.75 (13.5) 34.4 (3.8) 60 μm 321.7 (58.8) 88.1 (7.2) 116.4 (58.8) 54.4 (17.3) 80 μm 324.1 (39.5) 88.6 (4.8) 231.9 (78.8) 75.9 (10.8) 100 μm 332.8 (30.5) 89.7 (3.7) 265.2 (30.5) 80.3 (12.1) 120 μm 345.6 (33.0) 91.2 (3.8) 307.7 (33.2) 86.6 (3.8) 140 μm 352.3 (23.5) 92.0 (2.7) 327.5 (25.4) 89.1 (2.8)
62
Table 2 (APPENDIX A) shows the number of samples with a low Knoop
value (softening) for CSHM test and loss of enamel structure (erosion) in every
depth evaluated.
SEM photographs were made at random from WSL areas on each of the
ten samples. Areas exposed to the demineralizing solution could be
distinguished to the naked eye and in x16 magnification on SEM (figure 1) in all
samples. These images also demonstrated that at smaller magnifications (x16 or
x60) some areas of the active WSL appeared to be relative intact compared to
the sound enamel surrounding it (figure 1).
Figure 1 – Sample tooth number 4 photographed on a stereomicroscope (x7) showing the area exposed to the demineralizing solution (upper right image) and a SEM image with a small magnification (x16) of this sample.
63
A prismatic pattern of surface destruction was observed in all of the
samples in both eroded and/or apparently intact areas (figure 2). This pattern
creates a widening of the prism sheaths. Some surface areas were undertaken
by erosion and exposed underneath perikymata overlapping (figure 2).
Figure 2 – Sample tooth number 4 showing surface erosion with exposed underlying perikymata (x60) on the upper right image. Arrows in the larger image point out the overlapping perikymata (x250). In the same image a prismatic pattern of surface destruction can be noticed.
64
Some times the widened prism sheaths created an “arcade-formed”
structure (arrow in figure 3). All samples showed destruction of prism cores
(figure 3) related to areas with surface erosion.
Figure 3 – Sample tooth number 3 with prismatic pattern of surface destruction (x400) on the larger picture with an “arcade-formed” structure (arrow). The upper right image shows the destruction of prism cores in magnifications (x8,000).
65
Diffusion pathways through intercrystalline and interprismatic spaces can
be detected on a non eroded area with a prismatic pattern of demineralization
from tooth sample number 6 (figure 4).
Figure 4 – Sample tooth number 6 showing a sound enamel surface on the upper right image (x8,000). On the larger image arrows pointing out some of the areas with dissolution of crystallines and interprismatic area on an active WSL in the same sample tooth (x8,000).
66
The SEM image of the internal aspect of the active WSL also shows the
loss of some parts of the superficial enamel (figure 5).
Figure 5 – Cross-sectional view (x120) of sample tooth number 4 showing the internal aspect of the surface erosion delimitated by brackets.
DISCUSSION:
A lactate buffer was used to produce artificial caries lesions in human
enamel specimens17,18 due to the fact that this acid represents 90% or more of
the sucrose and/or glucose fermented by Streptococci.26,27 These are the
67
dominant microorganisms in the early colonization of dental plaque in enamel or
root surfaces28 whether in caries active or inactive individuals.29
The demineralizing solution used in this study was able to create artificial
caries on extracted human molar teeth resembling a natural active WSL in
smooth surface. In order to restrict lactic acid diffusion on the enamel and create
caries-like subsurface lesions a polyacrilic acid was used.17,30,31 A small
concentration of fluoride19 was also employed to help create a surface zone in
the WSL and avoid greater surface erosion.32 Other laboratory works have used
different methods to create WSLs in human or bovine teeth as: gel systems33,34;
demineralizing solutions enriched with calcium and phosphate with fluoride35,36,37
or without it38,39; demineralizing solutions with surface protectors, enriched with
calcium and phosphate with or without fluoride.11,17,18 Methane
hydroxydiphosphonate (MHDP)11 or polyacrylic acid (Carbopol™)17 are the most
used surface protectors substances used for in vitro subsurface caries formation.
MHDP might interact with lactate buffer by competition of calcium sites in the
enamel and polyacrylic acid acted independently.30 Polyacrylic acid is an
excellent surface protector for the enamel and it still enables the organic acids to
diffuse through the surface zone generating a subsurface lesion. This chemical
substance is more easily purchased than MHDP.31
The mean depth of artificial active WSL obtained in this in vitro study was
100 μm (80.3 e dp = 12.1). This is not a very deep lesion but it could be detected
by the naked eye and with a humid surface because of the added effect of
eroded surface and the subsurface lesion. A in vitro study performed by Margolis
68
et al.32 also employed a lactate solution (0.1 M) partially saturated with respect
to enamel mineral with a 4.3 pH and low levels of fluoride. This solution did not
have a surface protector agent as the one used in the present study therefore
they found cavitations on SEM images at the surface enamel after 72 hours with
0.004 and 0.009 ppm F demineralizing solutions. Other solutions containing
0.024, 0.054 and 0.154 ppm F formed an apparently intact enamel surface in the
same time interval. Visually the enamel surface appeared whitish although in
SEM photographs with a x500 magnification there was no difference between the
affected area and sound enamel.
If a WSL is detected after air drying it is probably limited to a discrete
dissolution of the enamel surface and to a subsurface demineralization in the
outer enamel. Whenever a WSL is visible on a wet tooth surface it has been
penetrated more into the enamel surface.1,16 The whitish, without luster and
rough surface feature on the surface of the artificial WSL denotes an advanced
stage of the lesion and it is called active WSL.7,8,9,10,16,40 That is why Ekstrand2
suggests that clinical trials record these differences in WSL by using visual
criteria to asses the depth and the activity of occlusal caries.
Even at small magnification as x16 (figure 1) artificial WSLs induced in this
experiment demonstrated two types of enamel surface involvement: areas of
erosion and other areas apparently intact, when compared to the sound enamel
surrounding it. These two distinct sites of the WSL also presented different levels
of enamel dissolution. An initial dissolution pattern was detected in areas with
apparently intact enamel where anatomical features were more pronounced such
69
as perikymata overlappings and deepened Tomes´ process pits. According to
Holmen et al.7 these accentuations of developmental features characterizes an
initial stage of enamel dissolution due to the carious process.
A prismatic pattern of demineralization, with an enlargement of the prism
sheaths, was detected on some parts of the active WSL. It was present either on
apparently intact or eroded areas in every sample (figure 2 and 3). This finding
corroborates to what Haikel et al.5, Holmen et al.7, and Frank15 saw on natural
active WSLs. Some authors5,15 consider that