Lição de Biocatálise - Técnico Lisboa · Tabela – Classificação, nomenclatura e constante de dissociação das cadeias laterais R dos aminoácidos Classificação Nome Abreviatura

4. Actividade e Estabilidade de Enzimas

Lição de Biocatálise

DEQB

ESTRUTURA DE ENZIMAS DEQB


ENZIMA – Entidade de natureza proteica e de origem biológica que levam a cabo in vivo as inúmeras transformações químicas e bioquímicas necessárias à vida dos seres vivos.

Os enzimas, tal como as proteínas, são polímeros complexos constituídos por sequências de aminoácidos, as unidades estruturais básicas, ligadas entre si por uma ligação peptídica.

O homem procura utilizar os ENZIMAS para levarem a cabo in vitro

inúmeras transformações químicas e bioquímicas do qual resultam produtos de alto valor acrescentado.

O Cα O- Cα

C N C N+

Cα H Cα H

ESTRUTURA DE ENZIMAS

H3N+C

H

COO -

R

Os aminoácidos constituintes das proteínas são constituídos por 4 grupos diferentes ligados a um carbono central (Cα):

- um grupo amino (NH3+);

- um grupo carboxílico (COO-);- um átomo de hidrogénio (H);- um grupo variável (R);- um átomo de carbono (carbono-α, Cα), a que se ligam os quatro grupos anteriores.

DEQB


α

As propriedades físico-químicas dos aminoácidos estão associadas ao grupo R variável do amínoácido

H3N+C

H

COO -

R

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- Têm propriedades ácidas e básicas semelhantes, à excepção da prolina.

- As cadeias laterais têm uma enorme variedade de propriedades funcionais (carga eléctrica, polaridade, hidrofobicidade, reactividade química) e estruturais, conferindo aos aminoácidos a respectiva individualidade.

- O grupo α-amino de um aminoácido pode reagir com o grupo β-carboxilo de outro, com formação de cadeias polipeptídicas.

- Podem sintetizar-se quimicamente polipéptidos com uma sequência pre-determinada.

- A sequência de aminoácidos numa cadeia pode ser determinada por hidrólise da cadeiaem fragmentos (péptidos) e análise sequencial da composição dos péptidos a partir de um dos extremos da cadeia.

Tabela – Classificação, nomenclatura e constante de dissociação das cadeias laterais R dos aminoácidos

Classificação Nome Abreviatura de 3 letras

Abreviatura de 1 letra

pKR da cadeia lateral

Alanina Ala A ---- Valina Val V ---- Leucina Leu L ----

Grupo I Isoleucina Ile I ---- Aminoácidos Metionina Met M ----

Apolares Prolina Pro P ---- Fenilalanina Phe F ---- Triptofano Trp W ---- Glicina Gly G Serina Ser S ~ 13

Grupo II Treonina Tre T ~ 13 Aminoácidos Cisteína Cis C 8.33

Polares Tirosina Tyr Y 10.13 Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Lisina Lys K 10.79

Grupo III Arginina Arg R 12.48 Aminoácidos Histidina His H 6.04

Com Grupos R Ácido Aspártico Asp D 3.90 Carregados Ácido Glutâmico Glu E 4.07

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Estrutura química da cadeia lateral (R) de aminoácidos

O grupo R variável

H3N+C

H

COO -

R

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Aminoácidos

pKa ~ 3.9

pKa ~ 4.1

pKa ~ 10.8

pKa ~ 12.5

pKa ~ 6.0

Alif

átic

osH

idro

lixad

os

Dic

arbo

xilic

osB

ásic

ospKa ~ 13.0

pKa ~ 13.0

CH

CH3

CH3

CH2

CHCH3

CH3

CH3

H

CH

CH3

CH2

CH3

CH2

OH

CH

CH3

OH

CH2

C

O

O-

CH2

C

O

NH2

CH2

CH2

C

O

O-

CH2

CH2

C

O

NH2

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

CH2

CH2

CH2

Glicina

NH

Ácido aspártico

C

Valina

N+H2

Alanina

NH2

Leucina

Isoleucina

CH2

Serina

C

Treonina

HC

N NH

CH

Asparagina

Ácido glutâmico

Glutamina

Lisina

Arginina

Histidina

O grupo R variável

H3N+C

H

COO -

R

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pKa ~ 10.1

pKa ~ 8.3

+NH2HC

H2C CH2

CH2

C CH2

C

HC

O

O-

NH

Prolina Triptofano

Cisteina

CH2

SH

Fenilalanina

CH2

Metionina Tirosina

CH2

CH2

S CH3 CH2

OH

Sul

fura

dos

Aro

mát

icos

CH 2

CHC

N NH

CH

Histidina Heterocíclicos

Efeito do pH na Reacção Enzimática

DEQB vpH óptimo

pH

Tabela 2-1 - Exemplos de aminoácidos envolvidos no centro activo de enzimas e respectivos valores de pKa.

Enzima Resíduo pKa Lisozima

Acetoacetato descarboxilase Quimotripsina

Papaína

Glu-35 Lys

α-NH3 (Ile-16) His-159

6,5 5,9

10,0 3,4


As modificações químicas mais comuns de alguns resíduos dos aminoácidos durante ou após a sua biossíntese são:

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- Acetilação do grupo N-terminal.- Carboxilação (Asp e Glu).- Fosforilação (Ser, Thr, Tyr e His).- Formação de pontes dissulfureto (Cys).- Glicosilação (Asn: pontes N-glicosídicas; Ser e Thr: ligações O-glicosídicas).- Metilação (Lys e Glu).- Ligação covalente:

. De grupos prostéticos (grupos de natureza não proteica que se ligam covalentemente (irreversível) ou não-covalentemente (reversível) àproteína na sua forma tridimensional, (p.ex. grupos hemo do citocromo).

. Substituição/modificação de grupos funcionais das cadeias laterais (p.ex. –NH2), alterando assim as propriedades de carga, polaridade ou hidrofobia desse aminoácido. A modificação química específica de alguns resíduos (p.ex. lisinas) é um dos métodos possíveis para melhorar a actividade e estabilidade enzimáticas.

Estrutura Primária e Secundária de proteínas

Hélice αααα Folha ββββ

13 Å

R-CH

HC-R

O=C

R-CH

HC-R

HN

H N

H N

C O

C O

R-CH

HC-R

O=C

R-CH

HC-R

HN

H N

H N

C O

C O

A) B)

R-CH

HC-R

O=C

R-CH

HC-R R-CH

HC-R

R-CH

N-H

HC-R

H N

HN

H N

H N

C O

O C

CO

CO

H NC O

14 Å

Folha ββββ Paralela Folha ββββ Antiparalela

Figura 2-1 – A) Representação esquemática dos dois tipos de estrutura secundária mais frequentemente encontrados em proteínas e enzimas: hélice a e folha β. B) A folha β paralela e antiparalela, com indicação do

avanço por cada dois aminoácidos.

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Estrutura Terciária de proteínas

H 188

S 120

D 175

Figura 2-1– Representação esquemática da estrutura terciária da cutinase de Fusarium solani pisi, com indicação de alguns resíduos que limitam o centro activo, e, em particular, da tríade catalítica (Ser120-His188-Asp175).

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Ligações covalentes

- S – S -

Interacções electrostáticas

Pontes de Hidrogénio

Interacções hidrófobas

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Estrutura Quaternária de proteínas

Pode-se observar em enzimas multiméricos, i.e., enzimas compostos por duas ou

mais cadeias polipeptídicas associadas entre si, por exemplo, penicillin V acylase

de B. sphaericus.

Domínio αααα

Domínio ββββ

� Monomeric enzyme

� Prosthetic group - heme

� 2 calcium ions

� Glycoprotein – 8 specific sites

� Molecular weight - 44 kDa

� Isoelectric point - 7.5

� Catalyses the oxidation of several compounds by the H2O2, e.g. phenols,aromatic amines such as phenolsulfonicacid (PSA) and 4-aminoantipyrine (4-AAP)

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Horseradish peroxidase - HRP

FUNÇÃO DOS ENZIMAS

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Os enzimas (catalisadores biológicos ou biocatalisadores) catalisam reacções bioquímicas, aumentando a sua velocidade, por exemplo:

Em termos de propriedades gerais, comuns aos catalisadores químicos, os biocatalisadores caracterizam-se por:

i) baixarem a energia de activação para que a reacção que catalisam ocorra;

ii) não serem destruídos pelo efeito da reacção;

iii) não alterarem o equilíbrio químico das reacções em que participam.

______________________________________________________________________CATALISADOR Ea (kJ/mol) Velocidade reacção

(Relativa)SEM CATALISADOR 75,4 1,0PLATINA (INORGÂNICO) 50,2 2x104

CATALASE (ENZIMA) 8,4 3x1011

______________________________________________________________________

2H2O2 —> 2H2O + O2


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Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são:

- Muitíssimo específicos:

- tipo de reacção que catalisam,

- tipo(s) substrato(s) que reconhecem,

- ligação química em que actuam,

- bem como à estereo-especificidade dos átomos ou grupo de átomos no substrato.

- especificidade absoluta em relação a único substrato

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Elevada especificidade em relação ao tipo de reacção que catalisam,

DEQB


Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam,

Sacarose Maltose

Lactose

DEQB


Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam,

Maltose

Lactose

SacaroseTrehalose

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Elevada especificidade em relação ao tipo de ligação química em que actuam,

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Elevada especificidade em relação ao tipo da estereoespecificidadedo substrato em que actuam,

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Elevada especificidade em relação ao comportamento dos compostos do tipo Cx1x2yz nas reacções enzimáticas

Estes compostos Cx1x2yz são do ponto de vista da química orgânica substâncias simétricas em solução (pois possuem um plano de simetria) mas comportam-se assimétricas enquanto substratos de certas reacções enzimáticas (quer dizer que x1 pode ser preferencialmente atacado em relação ao x2 apesar de serem grupos funcionais iguais)


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Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são:

- A actividade catalítica regulável,

- Mas devido à sua natureza proteica são lábeis e inactivados por efeito da temperatura, pH, ou na presença de alguns compostos (designados por agentes desnaturantes).

Características do centro activo

O centro activo corresponde geralmente a uma fenda ou cavidade existente na estrutura da molécula proteica onde se localiza o centro catalítico (centro activo) e locais de reconhecimento do substrato (centro de ligação do substrato) e caracteriza-se por:

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- Ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de um enzima;

- É uma entidade tridimensional formada por grupos que pertencem a partes distintas da sequência linear de aminoácidos;

- Os substratos ligam-se às enzimas através de atracções fracas múltiplas (electrostáticas, de van der Waals, hidrófobas, ligações de hidrogénio);

- A especificidade da ligação do substrato depende do arranjo dos átomos no centro activo (modelo da chave e fechadura - E. Fischer, 1890; modelo do ajuste induzido - D. Koshland, 1958).

+

substrato enzima complexoenzima - substrato

a)

+

substrato enzima complexoenzima - substrato

b)

Figura 2-1– a) Modelo chave-fechadura; b) Modelo do ajuste induzido

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Muitas vezes os enzimas exigem pequenas moléculas ou iões (ex: Zn, Fe, Cu, Ca…) para exercerem uma actividade catalítica; a essas espécies chama-se co-factores. Ao enzima sem cofactor chama-se apoenzima, e ao enzima activo intacto (enzima + cofactor) chama-se holoenzima.

- Quando os co-factores são moléculas orgânicas (ex: vitaminas B) ou de natureza nucleotídica (ex: nicotinamida-adenina-dinucleótido - NAD e NAD fosfato - NADP) denominam-se co-enzimas.

NAD NADP


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- Quando são necessários co-factores os enzimas têm que conter centros de ligação adicionais.

- A catálise enzimática pode portanto fazer intervir, não só um número limitado de grupos funcionais que se encontram em cadeias laterais de resíduos de aminoácidos (His, Ser, Tyr, Cys, Lys, Glu, Asp), mas também co-enzimas e catiões metálicos.

FeIII

N

N

NN

NN

HOOH

H2O

FeIV

N

N

NN

NN

+ �

O

FeIV

N

N

NN

NN

O

AHA�

H+

AH

�A H2O+

HRP

Compound ICompound II

PSA + 4-AAP + 2H2O2 →→→→ Quinoneimine + H2O + NaHSO4λ = 490 nm

Reacções de síntese acoplada à hidrólise de 1 molécula de ATP

Ligases ou sintetases

6

Reacções de isomerizaçãoIsomerases5

Remoção de um grupo de uma molécula (sem ser por hidrólise)

Liases4

Reacções de hidróliseHidrolases3

Transferência de 1 átomo ou grupo entre moléculas

Transferases2

Reacções de oxidação-reduçãoOxido-redutases1

Tipo de reacção catalisadaClasse da enzima1º dígito

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Classificação de EnzimasNOMENCLATURA:

- Nomes empíricos (ex: tripsina, pepsina, quimotripsina).- 1ª designação normalizada: nome do substrato + sufixo ase (ex: urease, amilase).- 2ª designação normalizada: nome do substrato + tipo de reacção que catalisam

(ex: malato desidrogenase).- Enzyme Comission EC: nome de acordo com tipo de reacção + substrato + o tipo de aceitador do hidrogénio (ex: malato-NAD-óxido-redutase).

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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas

Assim, cada enzima recebeu,

NOME CURTO (NOME RECOMENDADO),

NOME SISTEMÁTICO (IDENTIFICA A REACÇÃO QUE O ENZIMA CATALISA)

NÚMERO CLASSIFICACÃO

EXEMPLO: ATP + CREATINA < ------ > ADP + FOSFOCREATINA

NOME CURTO: CREATINA CINASE

NOME SISTEMÁTICO: ATP CREATINA FOSFOTRANSFERASE

NÚMERO CLASSIFICAÇÃO: E.C. 2.7.3.2

2. GRUPO das Transferases7. TRANSFERE GRUPOS FOSFATOS3. GRUPO AZOTO COMO ACEITADOR2. Nº DE ORDEM

Tabela 1-1- Subclassificação das hidrolases

ÉsterGlicosilo

ÉterPeptidica

C-N, não peptidicaÁcido anidro

C-CHaleto, C-X

P-NS-NC-P

3.13.23.33.43.53.63.73.83.9

3.103.11

Tipo de ligaçãoClassificação EC

XAE

k

OH

EAX

k

k

AXE ++→↔+

− 2

2

1

1

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Quimosina (EC 3.4.23.4)


Nomenclatura e Classificação de Enzimas

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Nomenclatura e Classificação de Enzimas

GOx

β-D-glucose + oxygen D-glucono-1,5-lactone + hydrogen peroxide

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Óxido-redutases

L-aspartate + 2-oxoglutarate oxaloacetate + L-glutamate

Aminotransferase

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Transferases

Hidrolase (quimosina ou renina)

κ-casein + water para-κ-casein + caseino macropeptide

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Hidrolases

L-histidine urocanate + ammonia

Liase (L-histidina amónia-liase ou histidase)DEQB



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Liases

α-D-glucopyranose α-D-fructofuranose

glucose isomeraseDEQB



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Isomerases

Ligase (glutathione sintetase)

γ-L-glutamyl-L-cysteine + ATP + glycine glutathione + ADP + phosphate

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Ligases ou sintetases

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Medição da actividade enzimática

Os enzimas como catalisadores são testados em condições reaccionais padrão correspondentes, em geral, aos óptimos de pHe concentração do substrato e co-factores (não limitante), de forma que a velocidade da reacção medida seja máxima, isto é, de ordem zero em relação ao substrato.

Por exemplo, o método mais simples de medir a velocidade da reacção efectuada pelo enzima ou determinar a sua actividade émedir ao longo do tempo o aparecimento de um produto da reacção ou desaparecimento de um substrato.

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Hidrólise da ureia pela urease

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Medição da actividade enzimática

Unidade de actividade enzimática (U): é definida pela quantidade de enzima que a transformação do substrato em produto e produz 1 µmole de produto por minuto nas condições óptimas da reacção.

U = 1 µmole/min (T=25°C)

KATAL- Quantidade de actividade enzimática que transforma 1 mole de substrato por segundo.

KAT = l mole/s U = l µmole/min 1U=16,67x10-3 KAT

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Pureza da preparação enzimática

(ACTesp) Actividade específica (U/mg) exprime o número de unidades de actividade enzimática expresso por miligrama de proteína da preparação enzimática.

Esta grandeza permite medir a pureza da preparação enzimáticaquando se compara o seu valor com o do enzima puro e assim permite avaliar o grau de pureza obtido num passo de isolamento ou purificação durante a produção do enzima.

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Medir concentrações por espectrofotometria

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Medição da actividade de desidrogenases

α-D-galactose + NAD+ D-galactono-1,4-lactona + NADH + H+

β-D-galactose dehidrogenase

Desidrogenases + Co-factor


Analito 1st Enzima 2nd Enzima Co-factor e detecção

Alcoóis - Alcool dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmFormaldeído Formaldeído dehidrogenase NAD

+ -λλλλ340nm

D-Fructose - Fructose dehidrogenase Azul Prússia -λλλλ660nmD-Glucose / ATP Glucose quinase Glucose fosfat

dehidrogenaseNAD+ -λλλλ340nm

D-Glucose - Glucose dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmGlicerol / ATP Glicerol quinase Glicerol fosfato

dehidrogenaseNAD+ -λλλλ340nm

Glicerol - Glycerol dehydrogenase NAD+ -λλλλ340nmGlutamate - Glutamato

dehidrogenaseNADPH -λλλλ340nm

D-hidróxiibutirato - D-hidroxibutiratodehidrogenase

NAD+ -λλλλ340nm

Malato - Malato dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmLactato / Piruvato - Lactato dehidrogenase NAD

+-λλλλ340nm

Sarcosina/ creatinina / creatina - Sarcosina dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nm

-

DEQB

DEQB


Reacções com desidrogenases

Eléctrodos enzimáticos

Membrana de teflon, permeável à glucose e ao O2,

e-

e-

+-

Ácido Glucónico + H2O2 Glucose + O2

Cátodo Pt (-600mV) O2 + 4H+ + 4e- 2H2O

Ánodo 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-

Glucose + FAD + H2O Ácido glucónico + FADH2

FADH2 + O2 FAD + H2O2

GOx

Reacções electroquímicas

Reacções enzimáticas

Ag

Cl-

Pt

Clark electrode


DEQB

Actividade da Glucose Oxidase (GOx)

pelo consumo de O2

Act = - d[% O2]dis / dt

DEQB



pela formação de H2O2DEQB


Os ensaios de determinação da actividade da GOx pela formação de H2O2. Glucose + FAD + H2O Ácido glucónico + FADH2

FADH2 + O2 FAD + H2O2

Pela combinação com a HRP que oxida por sua vez compostos fenólicos e percursores de um corante (quinoneimine λmax = 490-520nm) com ε490nm = 5,56 mM-1 cm-1.


pela formação de H2O2DEQB


Neste caso, a actividade de glucose oxidase é definida como número de micromole de H2O2 formados por minuto determinado indirectamente pela medição do aparecimento da cor a 490nm devido á formação do corante (quinoneimine).

Neste caso, a mistura reaccional contêm 0,4mM de 4-AAP, 25mM de PSA e 2 U/ml de HRP em tampão fosfato 0,1M pH 7,0. Caso típico émedir a actividade da GOx pela adição de 25µl da amostra da preparação enzimática a 950 µl da mistura reaccional ao qual foi adicionado previamente 25µl de uma solução de glucose a 10% em água.

Actividade de esterases pela hidrólise de

substratos sintéticosDEQB


O p-nitrofenol absorve a 400 nm (cor intensa amarela), o que permite quantificar a quantidade de produto presente na mistura reaccional.

Actividade da cutinase pela hidrólise de



Os ensaios de determinação da actividade da cutinase são efectuados a partir da hidrólise do p-nitrofenilbutirato (pNPB) em p-nitrofenol (pNP).

CutinasepNPB + H2O pNP + ácido butírico

Quando efectuado em descontínuo, numa cuvette de 1 ml, o ensaio caracteriza-se pela adição de 20µl de amostra da preparação de enzima a 980µl de mistura reaccional e a reacção enzimática deve ocorrer à temperatura ~ 22ºC.

Actividade da cutinase pela hidrólise de



A actividade enzimática na mistura reaccional é calculada a partir da derivação da lei de Beer-Lambert em ordem ao tempo, de acordo com a seguinte equação:

( ) [ ] ( ) 3101400

min. ×××

×=×=

=

ee V

V

ldt

nmdAbs

V

V

dt

pNPdml

molml

Uml

UActε

µ

Em que:- U é a unidade de actividade enzimática definida como a

concentração de enzima necessário para produzir um µmole de pNP por minuto;

- [pNP] é a concentração milimolar de p-nitrofenol;- V é o volume reaccional em ml;- Ve é o volume do extracto enzimático em ml;- Abs(400nm) é a absorvância a 400 nm;- ε é o coeficiente de extinção molar (ε=1,84x104 M.cm-1);- l é a espessura da célula (l=1cm).Este método é válido para variações de absorvância (dAbs/dt) entre

0.1 e 0.9 min-1.

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