LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA - UFPE...Silva, Lidiane Roberta Cruz da Fungos isolados de cultivos do camarão Litopenaeus vannamei Boone e caracterização quanto a produção de quitinase,

LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA

FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus

vannamei BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO

DE QUITINASE, PROTEASE E AFLATOXINA

RECIFE Fevereiro, 2009.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei

BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO DE QUITINASE,

PROTEASE E AFLATOXINA

LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Micologia Aplicada Orientador: Profª. Drª. Cristina Maria de Souza Motta Co-orientador: Profª. Drª. Ana Lúcia Figueiredo Porto

RECIFE Fevereiro, 2009.

Silva, Lidiane Roberta Cruz da Fungos isolados de cultivos do camarão Litopenaeus vannamei Boone e caracterização quanto a produção de quitinase, protease e aflatoxina / Lidiane Roberta Cruz da Silva. – Recife: O Autor, 2009. 97 folhas : il., fig., tab.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2009.

Inclui bibliografia.

1. Fungos 2. Camarão – Criação 3. Proteínas 4. Enzimas proteolíticas I. Título. 579.5 CDD (22.ed.) UFPE/ CCB – 2010- 066

Vem me pedir além do que eu posso dar

É aí que o aprendizado está Vem de onde não sonhei

me presentear... Quando chega o fim da linha

e já não há aonde ir Num passe de mágica

A vida nos traz sonhos pra seguir Queima meus navios

pr'eu me superar às vezes pedindo

que ela vem nos dar o melhor de si E quando vejo,

a vida espera mais de mim mais além, mais de mim

O eterno aprendizado é o próprio fim Já nem sei se tem fim!!!

De elástica, minha alma dá de si Mais além, mais de mim

Cada ano a vida pede mais de mim...

Jorge Vercilo

DEDICO

A Deus de infinita bondade e misericórdia, que me guia e ilumina sempre.

Aos meus pais Roberto (in memorian) e Célia pelos valores transmitidos e incansável amor e a minha doce avó Chica (in memorian) por todo amor, zelo e companheirismo materno, minha eterna saudade.

______________________________________________________________________

OFEREÇO

À minha filha Brennda Heloísa e ao meu amado esposo Paulo Freitas, luz e razão da minha vida. Amo vocês!

_______________________________________________________________________

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas bênçãos derramadas sobre mim e por cumprir mais uma promessa em minha vida.

Ao Profº Drº Paulo Antônio Padovan, pelos ensinamentos, carinho, confiança e incentivo a minha

jornada científica.

Ao Profº Severino do Monte Prazeres (in memorian) pelo exemplo de amor ao ensino, deixando-me

valores que incorporei e os levarei sempre comigo.

À Profª Drª Norma Buarque de Gusmão que me recebeu em seu laboratório, despertando em mim o

amor pelo “fantástico mundo dos fungos”.

À minha querida orientadora Profª Drª Cristina Maria de Souza-Motta, pelos ensinamentos,

paciência e amizade incansáveis.

Às professoras Débora Maria Massa Lima e Maria José dos Santos Fernandes pela enorme

colaboração e identificação de muitos de meus fungos.

À minha querida co-orientadora Profª Drª Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela colaboração no

desenvolvimento da pesquisa.

À Profª Drª Rosalie Reed Rodrigues Coelho, pela colaboração e carinhosa atenção, principalmente

durante o início do desenvolvimento do trabalho.

À Profª Drª Oliane Magalhães, pelas orientações, atenção e carinho sobretudo durante o processo

de seleção de mestrado.

À Profª Drª Rejane Pereira Neves, pela torcida, ensinamentos e amizade.

A todos os professores do Programa de Pós Graduação em Biologia de Fungos que contribuíram

diretamente em minha formação. Um privilégio ter vocês como mestres.

Ao meu amado esposo Paulo Freitas, pelo amor paciente, cumplicidade e parceria durante todos os

momentos de realização deste trabalho. Sem você ficaria difícil conseguir!

À minha amada filha Brennda Heloísa, pela admiração, companheirismo e amor sempre.

Aos familiares que sempre me apoiaram e incentivaram, minha mãe, minha filha, meu Paulo, meu

tio “Biu” e minha irmã Cybelle.

Aos amigos da Micoteca-URM, por todos os momentos compartilhados, auxílio, carinho e

paciência: Carlos, Eliane, Hanilma, Herbert Leonardo, Jadson, Kaliny, Liana, Marília, Minelli,

Odacy, Paula, Polyanna, Raquel, Sthefânia, Taísa, Tatiane, Telma, Tereza e Virgínia.

Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida durante meus dois anos de estudo.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

FUNGOS ISOLADOS DE CULTIVOS DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE E CARACTERIZAÇÃO QUANTO A PRODUÇÃO DE QUITINASE,

PROTEASE E AFLATOXINA

RESUMO

Na carcinicultura Litopenaeus vannamei é a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro. Os objetivos desta pesquisa foram avaliar a capacidade quitinolítica e proteolítica e produção de aflatoxinas por fungos isolados da água de viveiros e dos camarões L. vannamei cultivados em duas fazendas no Rio Grande do Norte, Brasil. Para o isolamento, amostras de água e do camarão foram plaqueadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol contido em placas de Petri. Após 72 horas, as colônias foram transferidas para meios de cultura específicos para identificação. Foram obtidos 146 isolados, pertencentes a 46 espécies. Os gêneros mais representativos foram Aspergillus e Penicillium, além de Phaeoannellomyces werneckii, Rhinocladiella aquaspersa, Syncephalastrum racemosum e outros fungos oportunistas. Foram avaliadas a capacidade quitinolítica, proteolítica e produção de aflatoxina B1. A maioria das espécies apresentou capacidade proteolítica. Dentre os substratos utilizados para detecção da capacidade em degradar quitina o que apresentou melhores resultados foi a carapaça de camarão adicionada de sais, sendo uma importante alternativa para selecionar fungos quitinolíticos. A. fumigatus, A. niveus, A. parasiticus, Penicillium lividum e S. racemosum foram excelentes decompositoras de quitina em meio líquido, liberando N-acetilglicosamina após 96h de fermentação, sendo indicadas para serem aplicadas em processos biotecnológicos. Dentre trinta e três isolados testados, vinte e um de A. flavus e três de A. parasiticus foram capazes de produzir aflatoxina B1, sendo todas procedentes da fazenda com sistema de cultivo inorgânico.

Palavras-chave: Fungos, Litopenaeus vannamei, quitinase.

FUNGI ISOLATED FROM CULTURE OF SHRIMP Litopenaeus vannamei BOONE AND CHARACTERIZATION ON THE PRODUCTION OF CHITINASES, PROTEASES AND

AFLATOXIN

ABSTRACT

In shrimp Litopenaeus vannamei is the species most cultivated in the Brazilian Northeast. The objectives of this research were to evaluate the ability and proteolytic chitinolytic and production of aflatoxins by fungi isolated from water in nurseries and shrimps L. vannamei cultured in two farms in Rio Grande do Norte, Brazil. For the isolation, samples of water and the shrimp were plated on Sabouraud agar plus chloramphenicol contained in Petri dishes. After 72 hours, the colonies were transferred to culture media for specific identification. 146 isolates were obtained, belonging to 46 species. The most representative genera were Aspergillus and Penicillium, and Phaeoannellomyces werneckii, Rhinocladiella aquaspersa, Syncephalastrum racemosum and other opportunistic fungi. We evaluated the ability chitinolytic, proteolytic and production of aflatoxin B1. Most species had proteolytic capacity. Among the substrates used to detect the ability to degrade chitin which showed better results was the carapace of shrimp added salts, and an important alternative to select quitinolíticos fungi. A. fumigatus, A. niveus, A. parasiticus, Penicillium lividum and S. Racemosum were excellent decomposers of chitin in liquid medium, releasing N-acetilglucosamine after 96h of fermentation, and indicated to be applied in biotechnological processes. Among thirty-three isolates tested, twenty-one plus and three A. parasiticus were able to produce aflatoxin B1, are all from the farm system with artificial feeding. Key-words: Fungi, Litopenaeus vannamei, chitinases.

LISTA DE FIGURAS

Páginas

Figura 1 Camarão Litopenaeus vannamei Boone com aproximadamente 200 dias.

18

Figura 2 Fazenda de criação com sistema de alimentação artificial situada

no município de Canguaretama-RN/Brasil. 19

Figura 3

Figura 4

Fazenda de criação com sistema de alimentação orgânica situada

no município de Tibau de Sul/RN-Brasil.

Estrutura primária da quitina.

20

24

Figura 5 Estrutura química da Aflatoxina B1.

29

LISTA DE TABELAS

Páginas

Tabela 1

Tabela 2

Dados de produção da carcinicultura brasileira por estado

em toneladas.

Principais Mercados Importadores de Camarão nos anos

2000 e 2006.

21

21

SUMÁRIO

Páginas

1 INTRODUÇÃO GERAL 13

1.1 AQUICULTURA 14

1.2 CARCINICULTURA 15

1.3 O CAMARÃO Litopenaeus vannamei Boone 16

1.4 TIPOS DE ALIMENTAÇÃO NOS SISTEMAS DE CULTIVO

18

1.5 FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADOS EM ÁGUA

22

1.6 ATIVIDADE QUITINOLÍTICA DE MICRORGANISMOS

24

1.6.1 QUITINA

1.6.2 QUITINASES

1.6.3 PRODUÇÃO DE QUITINASES

24

25

26

1.7 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DE FUNGOS 27

1.8 AFLATOXINAS 29

1.9 COLEÇÕES DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS

31

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 33

3 DIVERSIDADE E DETECÇÃO PROTEÁSICA DE FUNGOS PRESENTES EM ÁGUA DE VIVEIROS E NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE, CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL

42

4 RÁPIDO SCREENING PARA DETECÇÃO DA CAPACIDADE QUITINOLÍTICA POR FUNGOS, UTILIZANDO SUBSTRATO DE BAIXO CUSTO

69

5 DETECÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE AFLATOXINA B1 POR Aspergillus flavus E A. parasiticus ISOLADOS DA ÁGUA DE VIVEIROS E DO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE, CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL

85

6 CONCLUSÕES GERAIS 97

Silva, L.R.C. Fungos i so lados de cu l t ivos . . .

13

1. INTRODUÇÃO GERAL

Ecologicamente, os fungos são classificados como organismos “redutores”, participando

ativamente dos processos de biodeterioração e biodegradação e atuando desta forma na ciclagem

dos nutrientes e manutenção dos ecossistemas. É através da ação de enzimas produzidas pelos

fungos que a matéria orgânica é transformada em produtos naturais mais simples e assimiláveis

(Mangiarotti & Careta, 1984).

Os fungos filamentosos possuem quitina como principal componente da parede celular e

produzem quitinases em todos os estágios ativos de seu desenvolvimento, desde a germinação de

esporos até o crescimento micelial. Estas enzimas proporcionam maleabilidade às extremidades

apicais das hifas, permitindo assim o crescimento do fungo (Gooday 1990 e 1992; Souza et al.,

2003).

A quitina é um homopolímero linear e insolúvel formado por moléculas de N-acetil-D-

glucosamina (Glc-NAc) unidas entre si por ligações β-1,4. Está presente na parede celular da

maioria dos fungos, no exoesqueleto de inúmeros invertebrados, crustáceos, como o camarão, em

algumas algas, moluscos, protozoários e em ovos de nematóides, tornando-se assim, o segundo

biopolímero natural mais abundante da Terra, logo após a celulose (Rattanakit et al., 2002; Chang et

al., 2003; Matsumoto et al., 2004).

Industrialmente as quitinases são empregadas na degradação de resíduos do processamento

de crustáceos e são de extrema importância também no controle biológico de pragas da lavoura, tais

como fungos entomopatogênicos. Desta forma, a utilização de quitinase pode ser uma alternativa

interessante para a reciclagem dos rejeitos da carcinicultura, bem como no manejo de doenças em

plantas sem o impacto negativo dos insumos químicos, que são geralmente caros e podem causar

poluição ambiental e induzir a resistência de microrganismos fitopatogênicos (Chang et al., 2003;

Matsumoto et al. 2004).

As proteases, mais especificamente peptídeo-hidrolases, são enzimas que catalisam a

hidrólise de proteínas, possuem ampla variedade de aplicações, estando entre os três maiores grupos

de enzimas industriais. Constituem um dos mais importantes grupos de enzimas industriais e têm

aplicação em diferentes indústrias, como de alimentos, bebidas, têxtil, farmacêutica e de

detergentes. Estas enzimas são responsáveis por 30% do total de enzimas produzidas no mundo

(Soares et al., 1999).

As aflatoxinas são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário, de algumas

espécies de fungos do gênero Aspergillus. Os seres humanos e várias espécies de animais são


14

sensíveis aos seus efeitos tóxicos que podem ser agrupados como: agudos, mutagênicos,

neoplásicos e teratogênicos (Harrison et al., 1993). A carcinogênese hepática representa o mais

importante efeito de toxicidade crônica das aflatoxinas. Esta capacidade tem sido demonstrada

extensivamente, sobretudo em relação à AFB1, inclusive em peixes e camarões (Divakaran &

Tacon 2000; Bintvihok et al., 2003; Lopes et al., 2005).

A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em cativeiro e

vem se destacando mundialmente nas últimas décadas pelo avanço da produção, rentabilidade e

utilização de terras. O camarão é um crustáceo decápode, de abdomem longo, que possui um

exoesqueleto para proteção mecânica e microbiológica, constituído principalmente por quitina e

proteínas. A família de camarão mais utilizada em viveiros é a Penaideae, sendo Litopenaeus

vannamei Boone, a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro, sobretudo no estado do Rio

Grande do Norte (Figueiredo et al., 2003; Ferreira et al., 2004).

Diante do exposto, é de extrema importância o conhecimento de fungos quitinolíticos,

proteolíticos e produtores de aflatoxina B1, que ocorrem em águas de viveiros e no camarão L.

vannamei, cultivado no Rio Grande do Norte, uma área nunca explorada no Brasil quanto a este

aspecto.

1.1 AQÜICULTURA

A aqüicultura é o cultivo de organismos aquáticos sob monitoramento para benefícios

econômicos. Esta atividade consiste na produção de organismos com habitat predominantemente

aquático em qualquer estágio de desenvolvimento (Valenti & Daniels, 2000). De acordo com

Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação-FAO (2008), três fatores

caracterizam essa atividade: o organismo produzido é aquático; existe manejo na produção; a

criação é propriedade de alguém, ou seja, não se trata de um bem coletivo como os recursos

pesqueiros explorados.

Esta atividade divide-se em:

▪ Aqüicultura de águas interiores: Piscicultura (peixes), Ranicultura (rãs) e Carcinicultura

(camarões);

▪ Aqüicultura marinha: Cultivo de Moluscos: Miticultura (marisco), Ostreicultura (ostras), outros

(vieiras, berbigões, etc.), Cultivo de Algas, Carcinicultura (camarões) e outros crustáceos

(caranguejos, siris, etc.).


15

1.2. CARCINICULTURA

A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em viveiros (Brito

et al., 2006). No ano 2003, a produção mundial do camarão cultivado em mais de 50 países emergentes

girou em torno de 1.630.800 toneladas, cujo volume anual se mantém em torno de 4.450.000 toneladas,

sendo o hemisfério oriental responsável pela produção de 1.258.000 toneladas correspondentes a 77,14% do

total mundial, sendo o principal centro produtor o Sudoeste da Ásia, que inclui, por ordem de importância:

China, Tailândia, Vietnã, Indonésia, Índia, e Bangladesh. No hemisfério ocidental, a produção de 2003

chegou a 224.400 toneladas, representando 13,76% do total; a diferença de 148.800 toneladas, que representa

9,10%, pertence a outros produtores mundiais. O Brasil, com 89.000 toneladas, consolidou a posição de líder

do hemisfério, superando o Equador e o México, que, radicionalmente, ocupavam o primeiro e o segundo

lugar, respectivamente. Outros países produtores incluem Colômbia, Venezuela, Peru, Panamá, Honduras e

Nicarágua (Carvalho, 2005). Segundo Brito et al. (2006) foi com a introdução da espécie Litopenaeus

vannamei Boone, na década de 90 que a carcinicultura brasileira passou a ter um desenvolvimento

extraordinário.

De acordo com dados da ABCC - Associação Brasileira dos Criadores de Camarão (2008),

a criação de camarão no Brasil é desenvolvida principalmente por nove estados nordestinos e cinco

de outras regiões (Santa Catarina, Paraná, Espírito Santo, Pará e Rio Grande do Sul), sendo os

maiores volumes de produção da região Nordeste, provenientes pela ordem decrescente, do Rio

Grande do Norte, Ceará, Bahia, Pernambuco, Paraíba, Piauí, Sergipe, Maranhão e Alagoas (Tabela

1). Rio Grande do Norte, Ceará, Bahia e Pernambuco detêm 85,80% da produção brasileira. Este

expressivo desenvolvimento deve-se principalmente à introdução da espécie L. vannamei que

facilmente se adaptou às condições naturais típicas do nordeste brasileiro: água, sol e temperaturas

ideais para a sua reprodução (Brito et. al, 2006; Campos & Campos, 2006).

Segundo a ABCC (2008) os principais importadores do camarão produzido no Brasil, além

da União Européia são os Estados Unidos, Japão, Ásia, dentre outros (Tabela 2).

A iniciativa de se cultivar camarão no Brasil partiu do governo do Rio Grande do Norte,

com o objetivo principal de apresentar alternativa econômica para salinas desativadas, criando-se o

projeto Camarão. Por dispor de terras litorâneas baixas, o Rio Grande do Norte situado na

confluência das costas setentrional e oriental do Brasil, apresenta grandes potencialidades para a

produção de camarão marinho, sendo atualmente o maior produtor da região nordeste, o que tem

atraído a atenção de muitos investidores para este estado (Pinheiro et al., 2007).


16

Recentemente, com o crescimento do número de fazendas produtoras, verificou-se um

aumento da área física ocupada pela atividade. Além disso, a introdução de novas tecnologias, em

toda a cadeia produtiva, modificou positivamente os níveis de sobrevivência final, proporcionando

incremento na produtividade e, conseqüentemente, na produção total de camarão cultivado no

estado do Rio Grande do Norte (Brito et al., 2006).

No entanto, a rápida expansão do setor tem gerado grande concentração de fazendas de

produção em alguns estuários. A questão da distribuição geográfica das unidades de cultivo

implantadas e em implantação, somada à intensificação dos cultivos, tem levado o setor a

preocupar-se com a capacidade de suporte dos estuários, no que diz respeito à qualidade da água.

Por outro lado, a ameaça constante de doenças exógenas faz com que medidas de biossegurança

necessitem ser efetivamente implantadas (Pinheiro et al., 2007).

1.3 O CAMARÃO Litopenaeus vannamei Boone

O camarão branco L. vannamei Boone (Figura 1), pertence ao grupo dos Artrópodes de

corpo segmentado: cefalotórax mais abdômen, protegido por um exoesqueleto espesso e rígido,

composto principalmente por quitina e proteínas; apresenta apêndices (patas e antenas) articulados.

Possui simetria bilateral: triblásticos, celomados e protostômios (Valenti, 1998).

Há aproximadamente 38.000 espécies de crustáceos catalogadas, que ocorrem nos

ecossistemas aquáticos (dulcícola, marinho e salobro) e terrestres. O camarão L. vannamei está

enquadrado à família Penaideae e ordem Decapoda (Castro & Pagani, 2004).

Esta espécie é exótica no Brasil, tendo como origem as regiões equatorial e tropical do

Pacífico na costa do continente americano. Apresenta uma grande capacidade de adaptação às

variáveis ambientais que envolvem o meio de cultivo (pH, salinidade e alimentação) e está entre as

cinco espécies de camarões marinhos mais cultivados no mundo (Nunes, 2001). Em ambiente

natural pode ser encontrado nas regiões bentônicas cuja profundidade pode atingir até 72 metros

com temperaturas que variam de 26 a 28°C. Sua produção ocorre em alto mar e as pós-larvas

geradas migram para a costa, completando o seu desenvolvimento (Wyban & Sweeney, 1989).

Em termos nutricionais Dall (1992) afirma que o camarão é herbívoro nas primeiras fases

larvais e modifica gradativamente sua nutrição à medida que se desenvolve, tornando-se animais

carnívoros. Na fase juvenil e adulta são onívoros, alimentando-se principalmente de

microinvertebrados aquáticos e organismos vegetais. Além disso, estes animais apresentam


17

comportamento detritívoro, alimentando-se principalmente de material orgânico presente no

substrato (Rosas et al., 2001).

No desenvolvimento desses organismos, a muda ou ecdise, processo comum a todos os

crustáceos, consiste na substituição do exoesqueleto por um novo, no qual ocorre a expulsão da

carapaça (exúvia), necessária para o crescimento corpóreo desses animais. Essa carapaça serve de

proteção mecânica e imunológica para o camarão (Promwikorn et al., 2004).

O cultivo de camarão é geralmente realizado em tanques e/ou viveiros em áreas próximas a

cursos d’água e estuários, o que pode propiciar a degradação ambiental se for realizado de modo

indiscriminado e sem o manejo adequado. O acúmulo de matéria orgânica provenientes de restos de

alimentação e carapaças, podem contaminar tanto a água e o solo do cultivo quanto áreas adjacentes

(Nunes et al., 1996; Paquotte et al., 1998).

Segundo Stickney (2000) o dano ambiental decorrente do cultivo está fortemente associado

aos tipos de cultivos desenvolvidos. Para Stickney, os tipos de cultivos de camarões são

caracterizados em termos de densidade populacional (tamanho da população por unidade de espaço)

e oferta de alimento:

• Extensivo: sem alimentação adicional e densidade de 1 a 3 animais/m2;

• Semi-intensivo: com alimentação adicional e densidade de 10 a 50 animais/m2;

• Intensivo: alimentação exclusiva e densidade populacional de 10 a 50 animais/m2;

• Super-intensivo: alimentação exclusiva e densidade populacional de até 160

animais/m2.

De acordo com Odum (1988) a densidade populacional é um fator limitante, importante à

sobrevivência dos animais no ambiente natural, porém sua elevação pode acarretar no aumento da

competição intra-específica, maior atração de predadores, surgimento de parasitas como

microrganismos e maior disseminação de doenças na população.


18

1.4 TIPOS DE ALIMENTAÇÃO NOS SISTEMAS DE CULTIVO

De acordo com os carcinicultores, existem dois tipos alimentação em viveiros de cultivo de

camarões:

• Alimentação artificial – Neste sistema (Figura 2), os principais elementos da dieta

alimentar dos camarões são a ração balanceada, industrialmente fabricada, composta por

grãos de milho e trigo triturados, aditivados com proteínas, vitaminas, antibióticos e sais e a

artêmia, um microcrustáceo cujos ovos são recolhidos na natureza, comercializados sob a

forma de cistos desidratados e, posteriormente, eclodidos em laboratórios (Brito et al.,

2006). Os náuplios de artêmia, recém eclodidos são ricos em proteínas, lipídios, carboidratos

e ácidos graxos essenciais. Porém não superam todas as necessidades nutricionais das larvas

e pós-larvas, sendo necessário o uso de rações para complementá-las. A ração, principal

item do custo da carcinicultura, incorpora tecnologias de formulação e de processo que lhe

confere atributos nutricionais e físicos, com influência na dieta de engorda do camarão e nos

impactos ambientais provocados pelos restos de nutrientes que se acumulam nos viveiros e

em seus entornos (Campos & Campos, 2006). A qualidade da água dos viveiros é um fator

de extrema importância para o sucesso desta atividade, podendo afetar desde o hábito

alimentar até a própria sobrevivência dos animais no viveiro. Alguns parâmetros precisam

ser monitorados diariamente, como temperatura, pH, oxigênio dissolvido, transparência e

salinidade. O cultivo pode ser comprometido por ocasião de água de qualidade inferior, pois

os camarões estão em ambiente fechado, no caso dos cultivos em viveiros, tendo os

Figura 1. Camarão Litopenaeus vannamei Boone com aproximadamente 200 dias.

Fonte: Amasa, 2008.


19

criadores que tornar o ambiente o mais favorável para o bom desenvolvimento dos camarões

durante o ciclo, evitando problemas sérios como mortalidade, lento crescimento, queda da

conversão alimentar que vai cada vez mais aumentar os custos com ração e aparecimento de

doenças que vão diminuir a qualidade do produto (Pinheiro et al., 2007).

• Alimentação orgânica - Segundo Chellapa et al. (2007), este cultivo é realizado apenas por

uma fazenda brasileira (Figura 3), situada no estado do Rio Grande do Norte, onde seus

viveiros são isentos de produtos químicos, pesticidas, transgênicos, antibióticos e

hormônios. Neste sistema os viveiros são mais espaçosos, pois há uma densidade de apenas

6 camarões/m2, diferentemente da maioria das fazendas com sistema inorgânico ou

convencional, em que há densidade de 50 a 60 camarões/m2. O fundo dos viveiros é

fertilizado com húmus de minhoca e uma cobertura biológica formada por algas e

microcrustáceos que servem de alimento aos camarões. Não há adição de ração, havendo

assim o cuidado em reproduzir nos viveiros um habitat semelhante ao habitat natural dos

organismos cultivados, reduzindo o “stress”, proporcionando seu desenvolvimento de forma

saudável e aumentando a capacidade de sobrevivência. Nos primeiros estágios do ciclo de

vida do camarão, o fitoplâncton é o alimento-base de sua dieta e no segundo estágio (zoea),

é preferencialmente baseada em microalgas. Nesta forma de cultivo o carcinicultor não

Figura 2. Fazenda de criação com sistema de

alimentação artificial situada no município de

Canguaretama-RN/Brasil. Fonte: Camanor (2008).


20

monitora as condições físico-químicas da água dos viveiros, pois pretende manter o

ambiente o mais natural possível. Cada animal que se cria ocupa um nicho ecológico dentro

do ecossistema dos viveiros, diminuindo a competição.

Figura 3. Fazenda de criação com sistema de

alimentação orgânica situada no município de

Tibau de Sul/RN-Brasil.

Fonte: Primar Orgânica (2008).


21

Tabela 1. Dados de produção da carcinicultura brasileira por estado em toneladas

Fonte: ABCC (2008)

Tabela 2. Principais mercados importadores de camarão nos anos 2000 e 2006

MERCADO Ano2000 (X 1000

Toneladas)

Ano2006 (X 1000

Toneladas)

Crescimento médio anual

(%)

Valor/2006 (US$ milhões)

União Européia 564,22 814,48 6,50 5.165,00 Estados Unidos 345,00 590,29 9,36 4.115,00 Japão 246,60 301,00 3,32 3.490,00 Ásia 142,20 296,00 13,00 920,00 Outros 112,90 158,75 5,34 810,00 Total 1.410,92 2.160,53 7,39 14.500,00 Fonte: Eurostat (2008).

Estado 2004 2005 2006 2007 REGIÃO NORTE 242 280 250 200 Pará 242 280 250 200 REGIÃO NORDESTE 70.695 61.300 63.700 63.500 Rio Grande do Norte 30.807 25.000 26.400 27.000 Ceará 19.405 19.500 22.000 21.500 Bahia 7.577 6.000 6.000 6.000 Pernambuco 4.351 3.600 3.850 3.000 Paraíba 2.963 1.700 1.450 1.200 Piauí 2.541 2.350 1.400 1.200 Sergipe 2.543 2.800 2.300 3.000 Maranhão 226 230 200 300 Alagoas 102 120 150 300 REGIÂO SUDESTE 370 350 50 300 Espírito Santo 370 350 50 300 REGIÃO SUL 4.597 3.070 950 1.000 Santa Catarina 4.267 2.500 480 580 Paraná 310 550 450 400 Rio Grande do Sul 20 20 20 20 TOTAL 75.904 65.000 65.000 65.000


22

1.5 FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADOS DE ÁGUA

Os fungos desempenham importante papel nos ecossistemas, atuando como sapróbios,

simbiontes ou parasitas de vegetais e animais. Suas estruturas de propagação podem ser encontradas

no ar, em ambientes terrestres, ou aquáticos. (Alexopoulos et al., 1996). Fungos potencialmente

patogênicos já foram isolados de vários ambientes aquáticos (mar, estuário, rios, lagos, lagoas etc.)

e áreas de contato como areia e lama. Entretanto trabalhos com isolamento de fungos em água de

viveiros de camarão são inexistentes. No trabalho de Dabrova et al. (1964), analisando a água do

mar da Califórnia e isolaram várias espécies potencialmente patógenas ao homem: Hormodendrum

(Phialophora) compactum Bonort, Monosporium apiospermum Barclai, Scopulariopsis brevicaulis

(Saac.) Bainer e Sporothrix schenckii Kektoen & Perkins. Além destas, foram isoladas outras

espécies classificadas como de baixo potencial patogênico, pertencentes aos gêneros: Absidia,

Mucor, Penicillium, Rodhotorula e Trichosporon.

Snellman et al. (1988) analisaram amostras de água do oceano Atlântico e do oceano

Pacífico e obtiveram espécies de Acremonium, Alternaria, Aspegillus, Beauveria, Cercosporidium,

Cladosporium, Cunninghamella, Epicoccum, Graphium, Humicola, Penicillium, Scopulariopsis,

Syncephalastrum e Tetracoccosporium.

De acordo com Khulbe et al. (1993) Achlyan debaryana Kanouse, A. klebsiana Kanouse,

Aphanomyces laevis Minden, Saprolegnia declina Humphrey, S. ferax (Gruith) Thuret, S.

parasitica Coker e Pythium sp. causaram grande mortandade em peixes de um lago na Índia.

Ochromis humicola de Hoog & Von Arx (Hyphomycetes) foi isolado de amostras de

tecido muscular de salmão (Salmo solar L.) por Schaumann et. al. (1994). Segundo os autores

esporos desse fungo também podem ser encontrados em águas salgadas.

Analisando amostras de água das torneiras de hospitais e comparando-as com amostras de

água potável residenciais da Grécia, Arvanitidou et al. (1999) observaram a presença de fungos

filamentosos em 104 das 126 amostras de água dos hospitais e a presença de leveduras em 14

amostras. Foi obtido um total de 27 gêneros de fungos filamentosos com destaque para os gêneros

Aspergillus e Penicillium, além de um total de três gêneros de leveduras, com destaque para o

gênero Candida.

Arvanitidou et al. (2000) analisaram a água utilizada em 85 unidades de hemodiálise na

Grécia e isolaram espécies de Aspergillus, Absidia, Acremonium, Alternaria, Aureobasidium,

Basidiobolus, Botrytis, Chaetomium, Cladosporium, Cryptococcus, Chrysosporium, Curvularia,

Geotrichum, Gliogladium, Helmintosphorium, Mucor, Phoma, Pyrenocheta, Rhizopus,


23

Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Trichothecium e Verticillium, sendo os gêneros mais

representantivos Penicillium e Aspergillus com 33 e 26 isolados, respectivamente.

Varo et al. (2007), isolaram fungos filamentosos de água utilizada em uma unidade de

hemodiálise na cidade de São Paulo, Brasil, e obtiveram 21 isolados, dentre estes os gêneros

Aspergillus, Cladosporium, Exophiala, Fonsecaea, Fusarium, Micelia Sterilia, Penicillium e

Trichoderma, sendo mais representativos os gêneros Aspergillus e Cladosporium.

Analisando sedimentos aquosos na Índia Katiyar & Kushwaha (2000), obtiveram 183

isolados, pertencentes aos gêneros Acremonium, Aphanoascus, Chrysosporium, Gymnoascus,

Geomyces, Geotrichum, Malbranchea, Microsporum, Myceliophthora e Verticillium.

Molitoris et al. (2000) testaram características fisiológicas, como crescimento em várias

temperaturas e detecção por métodos semi-quantitativos da produção das enzimas protease, amilase,

e celulase por métodos semi-quantitativos, dos primeiros fungos filamentosos isolados do mar

morto, sendo eles: Aspergillus phoenicis, Chaetomium nigricolor, Emericella nidulans,

Gymnascella marismortui, Paecilomyces farinosus, Penicillium variable, P. westligii, Acremonium

sp., Stachybotrys chartarum e Ulocladium chlamydosporum, verificando que os isolados foram

bons produtores de todas as enzimas analisadas.

Masuma et al. (2001) isolaram fungos da água do mar das Ilhas Palau - Micronésia,

obtendo os seguintes gêneros: Aspergillus, Aureobasidium, Chaetomium, Trichoderma e

Penicillium.

Hapcioglu et al. (2005), analisaram amostras de água do sistema de distribuição de água de

um grande hospital em Stambul e detectaram a presença dos gêneros Acremonium, Aspergillus e

Penicillium, além de outros gêneros de fungos não identificados.

Analisando água potável de Portugal, Gonçalves, et. al. (2006) isolaram um total de 340

táxons, no qual prevaleceram os gêneros Penicillium e Acremonium. Além destes gêneros,

Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Phialophora e Rhizopus foram isolados.

Cavalcanti & Milanez (2007), analisando água dos açudes Vale do Prata e do Meio, na

Reserva Florestal de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco, Brasil, isolaram as seguintes espécies de

Hyphomycetes: Curvularia tuberculata, Dendrosporium lobatum, Dichotomophthoropsis

nymphaearum, Phaeoisaria glauca e Trichurus spiralis.


24

1.6 ATIVIDADE QUITINOLÍTICA DE MICRORGANISMOS

1.6.1 Quitina

A quitina foi isolada em 1881 por Braconnot, trinta anos antes do isolamento da celulose,

mas a falta de conhecimento básico sobre suas propriedades, incluindo a reatividade química,

limitou severamente suas aplicações industriais até o início dos anos 1970 (Roberts, 1992).

Quitina é um polímero linear no qual a unidade repetitiva é o dissacarídeo formado por 2-

acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose unidos por ligação

glicosídica (Figura 4). Assim como na celulose as ligações são do tipo β(1→4), definindo-se assim

os terminais redutor e não-redutor das cadeias poliméricas, os quais correspondem às extremidades

que contêm grupo hidroxila livre ligado ao carbono 1 (terminal redutor) e carbono 4 (terminal não-

redutor) do anel de glicopiranose. A quitina contém uma quantidade pequena, usualmente 5-10%,

de unidades 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose. Segundo Richard (1951), a quitina nativa, tal como

ocorre associada a outros materiais para constituir as carapaças de caranguejos e exoesqueletos de

camarões, é produto natural de composição variável quanto ao comprimento das cadeias, conteúdo

de unidades de glicosamina acetiladas e desacetiladas e sua distribuição ao longo das cadeias.

Adicionalmente, também podem ocorrer variações em função da espécie considerada, bem como do

estágio de desenvolvimento. A única exceção conhecida é a quitina obtida a partir de algas

diatomáceas (Thalassiosira fluviatilis e Cytlotella cryptica), cuja análise revela que se constitui

exclusivamente de unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose (Abram & Higuera, 2004).

Figura 4. Estrutura primária da quitina.

Fonte: Polymar (2008).

A quitina é a segunda substância orgânica mais abundante na biosfera sendo superada

apenas pela celulose. Quitina e celulose possuem características estruturais semelhantes e atuam

como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa nos organismos em que ocorrem. A


25

quitina encontra-se na matriz da estrutura esquelética de invertebrados, como artrópodes, anelídeos,

moluscos e celenterados, e na parede celular da maioria dos fungos (Patil et al., 2000).

Em função do organismo considerado, mas também do papel que desempenha, a quitina

adota estruturas polimórficas denominadas α-, β- e γ-quitina. As configurações dos polímeros

dependerão das características químicas, físicas, como massa molecular (número de unidades por

molécula), conformação e função no organismo. A α-quitina é encontrada em estruturas rígidas e

resistentes, como o exoesqueleto de camarões, e nesses casos ocorre fortemente associada a

proteínas e sais. As formas β- e γ-quitina ocorrem em estruturas flexíveis embora também

resistentes, como é o caso da parede celular dos fungos, nas quais encontramos β-quitina. Nas lulas

do gênero Loligo a α-quitina constitui uma fina capa que reveste as paredes do esôfago e do

estômago, a β-quitina ocorre como o principal componente dos gládios, ou plumas, e a γ-quitina

integra uma espessa cutícula que recobre outras zonas do estômago (Abram & Higuera, 2004).

1.6.2 Quitinases

Quitinases são enzimas que clivam ligações β-1,4 entre unidades de N-acetilglucosaminas

da quitina. As quitinases são produzidas principalmente por organismos que possuem quitina na sua

parede celular ou exoesqueleto como insetos, crustáceos, fungos, algas entre outros (Patil et al.,

2000).

As enzimas quitinolíticas dividem-se em endoquitinases e exoquitinases. As

endoquitinases clivam a quitina em posições aleatórias gerando multímeros de N-acetil-D-

glicosamina (GlcNAc). As exoquitinases podem ser divididas em dois grandes grupos: as

quitinabiosidade e as β(1,4) N-acetil-glicosaminases. As quitinabiosidases (EC 3.2.1.29) quebram

as extremidades não reduzidas da cadeia de quitina 1,4-β− quitobiosidases liberando

diacilquitobiose. Já as N-acetil-glicosaminases (GlcNAcase, EC 3.2.1.30) utilizam como substrato

as diacetilquitobioses liberando como produto monômeros de GlcNAc (Cannon et al., 1994).

As enzimas microbianas podem ser intracelulares ou extracelulares, as extracelulares, ou

excretadas, são normalmente mais estáveis e produzidas em maiores quantidades em relação às

intracelulares. Estes biocatalisadores têm a função principal de degradar macromoléculas presentes

no meio ambiente, como a quitina e as proteínas, para absorção de seus componentes como

nutrientes (Bon et al., 2008).

Em fungos e crustáceos as quitinases são essenciais para síntese da parede celular e do

exoesqueleto, respectivamente (Patil et al., 2000). Em plantas está relacionada com a defesa contra


26

fungos fitopatogênicos. Por outro lado, em fungos, protozoários e invertebrados, a presença de

quitinase está envolvida na morfogênese (Gooday, 1990; Flach et. al., 1992; Sahai & Manocha,

1993; Graham & Sticklen, 1994; Gooday, 1996). Segundo Gooday (1990) mais especificamente em

fungos, as quitinases possuem função na divisão da parede celular, autólise, germinação de esporos,

desenvolvimento de micélios e ramificações, separação de células, nutrição e parasitismo. A

produção desta enzima por fungos pode caracterizar o potencial patogênico da espécie (Lacaz et al.,

2002; Duo-Chuan, 2005).

Industrialmente, as quitinases são empregadas no controle biológico de pragas da lavoura,

como em fungos entomopatogênicos. Além disto, podem ser uma alternativa interessante para a

reciclagem de carapaças de camarões, que na maioria das vezes, são descartadas no meio ambiente,

sem tratamento prévio, causando grandes impactos ambientais (Chang et al., 2003).

1.6.3 Produção de quitinases

Para a detecção da produção de quitinases por microrganismos a quitina comercial pura é o

substrato mais utilizado em trabalhos científicos (Tweddell et al., 1994; Escott et al., 1998; Matsuo

et al., 1999; Giambattista et al., 2001), entretanto trata-se de um substrato de alto custo

(Giambattista et al., 2001). Visando baratear os custos desta metodologia, alguns autores

trabalharam com carapaça de camarão tratada e triturada, como única fonte de carbono e nitrogênio

para o crescimento de microrganismos produtores de quitinase (Wang et. al., 1995, 1997, 1999 e

2002a, 2002b). Este substrato pode ser uma importante ferramenta, quando se pretende otimizar e

maximizar a produção da enzima, atingindo uma produção em escala industrial (Coelho & Pires,

2008).

El-Katatny et al. (2000), testaram quanto à produção de quitinase 24 isolados de

Trichoderma harzianum procedentes de uma coleção de culturas no Egito, e após a seleção do

melhor produtor da enzima, identificaram seu antagonismo contra o fungo fitopatogênico

Sclerotium rolfsii, concluindo que T. harzianum produz quitinase com efeito antagônico contra S.

rolfsii podendo ser utilizada no controle biológico deste parasita.

Analisando a capacidade quitinolítica de Penicillium janthinelllum contra os fungos

fitopatogênicos Fusarium solanii e Cladosporium cladosporioides, Giambattista et al. (2001)

observaram que P. janthinellum produz quitinase capaz de lisar a parede celular destes fungos, a

qual pode ser empregada no controle biológico dos fungos testados.

Kim et al. (2003) avaliaram a produção de quitinase pela bactéria Streptomyces sp. e

observaram seu elevado potencial antifúngico contra o fungo Botrytis cinerea.


27

Wang et al. (2002a), testaram a atividade antifúngica de cinco espécies de Monascus

contra Fusarium oxysporum em meio de cultura contendo casca de camarão e comparando-o com

meio basal adicionado de quitina coloidal. Os autores observaram maior atividade antifúngica das

espécies de Monascus em meio contendo casca de camarão triturada.

Duo-Chuan et al. (2005), analisaram a produção de quitinases por Talaromyces flavus,

cultivado na presença de quitina comercial. Segundo os autores, T. flavus produziu dois tipos de

quitinases. As enzimas foram testadas contra a parede celular dos fungos Verticillium dahliae,

Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani, apresentando excelente capacidade de lise da parede

celular. Além disso, as enzimas foram testadas contra Alternaria alternata, Fusarium moniliforne e

Magnaporthe grisea, os quais tiveram a germinação inibida.

Bougoure & Cairney (2006) testaram o potencial quitinolítico de Hymenoscuphus ericae,

fungo micorrízico associado à Ecapris pulchella, em meio líquido, observando a produção de

endoquitinase e exoquitinase por este fungo.

Novotná et al. (2008), avaliaram a produção de endoquitinase e exoquitinase por

Orpinomyces sp. e Anaeromyces, verificando que os isolados foram melhores produtores de

endoquitinase.

Zhu et al. (2008) clonaram o gene que codifica a quitinase do fungo Verticillium lecanii,

promissor agente no controle do pulgão e da mosca branca.

1.7 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DE FUNGOS

De acordo com Lacaz et al. (2002); Sidrim & Rocha (2004), proteases são enzimas que

catalisam a hidrólise de proteínas. As proteases executam grande variedade de funções nos

organismos vivos, compreendendo a ativação e a participação em cascatas biológicas, como na

digestão, homeostasia e inflamação em diversos sistemas, sendo imprescindíveis para o perfeito

funcionamento celular (Gavrilescu & Chisti, 2005).

Proteases extracelulares são secretadas primariamente para garantirem nutrientes para as

células, porém nos fungos patogênicos, facilitam a adesão e invasão do tecido hospedeiro,

adquirindo papel significante na destruição de membranas e paredes celulares que são compostas,

principalmente, de lipídios e proteínas (Ghannoum, 2000).

Grande número de microrganismos como bactérias, fungos filamentosos e leveduras são

produtores de proteases (Potumarthi et al., 2007). Nos fungos, sua ação é importante tanto para o


28

crescimento quanto para a invasão do tecido hospedeiro, bem como para sua disseminação após

ruptura da barreira de proteção tecidual (Sana et al., 2006).

A detecção da atividade enzimática de fungos através de métodos semi-quantitativos é

interpretada pela hidrólise do substrato específico, facilmente evidenciada pela formação de halos

transparentes ou opacos ao redor das colônias (Neder, 1992). Diversos substratos são utilizados em

testes de detecção de proteases: gelatina, soro albumina bovina, caseína, entre outros (Lacaz et al.,

2002).

As proteases fúngicas são aplicadas biotecnologicamente, compreendendo as enzimas de

maior relevância industrial (Gavrilescu & Chisti, 2005), representando cerca de 60% do total de

enzimas comercializadas mundialmente (Sana et al., 2006). Estas enzimas possuem grande

variedade de aplicações, sendo utilizadas em indústrias de alimentos (Casaburi et. al., 2008),

farmacêuticas (Daviet & Colland, 2008), de curtumes (Kumar et al., 2008) e de detergentes

(Mukherjee et al., 2008).

Muhsin et al. (1997) detectaram em 123 isolados de dermatófitos e leveduras a atividade

de protease, elastase, queratinase, lipase e fosfolipase em meio sólido e constataram resultados

variáveis na produção dessas enzimas, sendo a protease produzida apenas pelos dermatófitos.

Assis et al. (1999) investigaram a produção de protease e fosfolipase em 20 isolados de

Paracoccidioides brasiliensis, utilizando soro albumina bovina e gema de ovo, respectivamente,

como substrato. Os resultados mostraram que todos os isolados tiveram a capacidade de produzir

proteinase e fosfolipase.

Chakrabarti et al. (2000) purificaram protease produzida por Aspergillus terreus, utilizando

caseína como substrato. A enzima purificada pertence ao grupo das serina proteases.

Mushsin & Salih (2001) estudaram a atividade de quatro enzimas (protease, queratinase,

lipase e amilase), em 182 isolados de fungos pertencentes aos gêneros Alternaria, Aspergillus,

Chaetomium, Chrysosporium, Curvularia, Dreschlera, Epidermophyton, Geotrichum, Microsporum,

Paecillomyces, Scytalidium e Trichophyton. Os resultados revelaram que a queratinase foi produzida

por todos os fungos, com exceção de P. variottii e S. lignicola, sendo altamente expressada pelas

espécies T. mentagrophytes e M. gypseum. A maioria das espécies não-dermatofíticas revelaram

atividade proteásica maior que a dos dermatófitos, sendo as espécies de Curvularia, as que

mostraram atividade mais alta.

Santos et al. (2001) caracterizaram quanto à produção de protease, fosfolipase e

queratinase, dentre outras enzimas, 53 isolados de Trichophyton rubrum procedentes de São Paulo e


29

Florianópolis, Brsail. Os autores observaram que alguns produziram protease, todos os isolados

produziram queratinase, e nenhum produziu fosfolipase.

Khan et al. (2003), detectaram a capacidade da produção de protease por Paecilomyces

lilacinus, além de sua capacidade de produzir quitinase, comprovando que esta espécie pode ser

aplicada no controle biológico contra nematódeos parasitas de vegetais.

Alves et al. (2005) avaliaram a capacidade de produção de proteases extracelulares em 13

isolados de Mucor distribuídos em oito espécies, em três diferentes faixas de pH (ácido, neutro e

básico). Os autores conseguiram detectar elevada atividade proteolítica em todos os isolados, em

cada faixa, um grupo de isolados obteve maior produção.

1.8 AFLATOXINAS

As aflatoxinas são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário, de algumas

espécies de fungos do gênero Aspergillus, principalmente A. flavus e A. parasiticus, os quais se

desenvolvem naturalmente em produtos alimentícios, como amendoim, milho, feijão, arroz e trigo,

entre outros. As espécies de Aspergillus, produtoras de aflatoxinas, e a conseqüente contaminação

de grãos e outros alimentos com aflatoxinas são freqüentes em áreas geográficas com clima quente

e úmido. O Brasil, por ser um país de clima predominantemente tropical apresenta condições

favoráveis ao desenvolvimento destes fungos (Rossetto et al., 2005).

Em relação às propriedades físicas e químicas, as aflatoxinas apresentam-se na forma de

cristais com coloração que vai de incolor a amarelo pálido; são muito pouco solúveis em água (10 a

30 μg/mL); são solúveis em solventes orgânicos como clorofórmio, metanol e dimetilsufóxido; são

instáveis sob radiação ultravioleta, na presença de oxigênio e em condições extremas de pH (pH < 3

e pH > 10), e também na presença de agentes oxidantes; pertencem a uma classe de compostos

denominados furanocumarinas e todas apresentam um núcleo cumarina associado com o furano e a

lactona. As quatro toxinas B1, B2, G1 e G2 têm estruturas bastante semelhantes: as aflatoxinas do

grupo B possuem anel ciclopentenona e as do grupo G, lactona insaturada, enquanto as do grupo M

são derivados hidroxilados de B1 e B2 (Figura 5) (Araújo,1995).

Figura 5. Estrutura química da Aflatoxina B1.

Fonte: Terra Nova Indústria e Comércio, 2009.


30

Atualmente são conhecidos 17 compostos similares, denominados de aflatoxinas, porém os

principais tipos de interesse médico-sanitário são identificados como B1, B2, G1 e G2, dentre estes,

destaca-se a aflatoxina B1, pelo elevado poder toxigênico. A biotransformação da AFB1, em

diversas espécies animais, resulta na produção de M1 e M2. As aflatoxinas M1 e M2 foram isoladas

inicialmente no leite e urina de animais que consumiram alimentos contaminados por AFLs

(Oliveira & Germano, 1997).

Os seres humanos e várias espécies de animais são sensíveis aos seus efeitos tóxicos que

podem ser agrupados como agudos, mutagênicos, neoplásicos e teratogênicos (Harrison et al.,

1993). A carcinogênese hepática representa o mais importante efeito de toxicidade crônica das

aflatoxinas. Esta capacidade tem sido demonstrada extensivamente, sobretudo em relação à AFB1,

inclusive em peixes e camarões (Divakaran & Tacon 2000; Bintvihok et al., 2003; Lopes et al.,

2005).

Divakaran & Tacon (2000), determinaram a quantidade de aflatoxina presente no músculo

e fezes de camarões Penaeus vannamei, cultivados em tanques. Os camarões foram alimentados

com dietas contendo três níveis de aflatoxina B1 (300, 400 e 900 ppb) durante oito semanas.

Através do uso de cromatografia, foram analisados músculos e fezes dos animais, sendo detectada 2

ppb de aflatoxina B1 apenas no músculo. Os autores concluíram que a toxicidade em seres humanos

através do consumo de camarões alimentados com ração contaminada é limitada.

De acordo com Dorner & Cole (2002), Aspergillus flavus e A. parasiticus acometem

plantações durante o período de maturação do campo ou após a colheita, liberando aflatoxinas,

sobretudo se o vegetal apresenta alguma lesão ocasionada por insetos. As culturas comumente

acometidas são milho, amendoim, algodão dentre outros. O uso de alimentos contaminados por

aflatoxina para fabricar rações, tem sido relatado como um problema importante e com sérias

implicações econômicas para a indústria avícola, bem como de outras espécies de interesse

econômico (Batina et al., 2005).

Bintvihok et al. (2003) analisaram 150 amostras de camarão tigre preto Penaeus monodon,

das regiões leste e sul da Tailândia, alimentados com ração contaminada por aflatoxina B1 (AFB1).

Dividiram os camarões em três grupos, além de um grupo controle. Os animais foram alimentados

durante 10 dias com ração contendo, para cada grupo, 5, 10 ou 20 ppb de AFB1. Após os dez dias

da dieta, os camarões foram pesados e sacrificados para exame laboratorial. No músculo dos

camarões dos grupos testados, não foram detectados AFB1 nem seus metabólitos, porém na

hemolinfa do hepatopâncreas dos grupos contaminados, foram encontradas alterações bioquímicas,

além da taxa de mortalidade destes camarões ter sido mais alta do que a dos camarões controle. Os


31

autores concluíram que em sistema de cultivo camarões alimentados com ração contaminada por

aflatoxina pode haver diminuição da produção, causando perdas econômicas.

Lopes et al. (2005), avaliaram o efeito das aflatoxinas sobre o crescimento de alevinos de

jundiá Rhamdia quelen e a deposição no fígado e no músculo de peixes alimentados com ração com

diferentes teores da micotoxina. Foram utilizados 960 alevinos, em dois experimentos, o primeiro

os teores de 41, 90 e 204 ppb de aflatoxinas kg-1 e o segundo, 350, 757 e 1.177 ppb de aflatoxinas

kg-1 de alimento. Os autores concluíram que a concentração de aflatoxinas de 204 ppb kg-1 de ração por

45 dias, causa redução no crescimento de alevinos de jundiá. Concentrações de aflatoxinas de 350, 757 e

1.177 ppb kg-1 de ração, com ingestão por 35 dias, provocam alterações macroscópicas no fígado.

Concentrações de aflatoxinas superiores a 350 ppb kg-1 de ração acarretam deposição residual no fígado e nos

músculos do peixe.

1.9 COLEÇÕES DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS

Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente, contribuindo para a estabilidade

de ecossistemas, atuando em diferentes níveis tróficos, em interações bióticas e abióticas em todos

os ecossistemas aquáticos ou terrestres. Estes constituem a principal forma de ciclagem de

compostos químicos na biosfera, incluindo a degradação e a transformação de poluentes industriais

(Tiedje, 1994). Nas indústrias, a grande maioria dos processos biotecnológicos empregados na

produção de compostos comerciais ou na transformação de substratos em produtos de maior valor

agregado emprega linhagens microbianas (Bull et. al., 1992).

A compreensão do papel de microrganismos no meio ambiente fornece subsídios para o

desenvolvimento de aplicações biotecnológicas, além de ser fundamental no estabelecimento de

políticas de biossegurança, de projetos em agricultura sustentável e de programas de

desenvolvimento industrial (Canhos et al., 1999).

Coleções de culturas são centros de excelência de conservação ex-situ, que mantêm e

estudam um “pool” genético para gerações futuras, oferecendo serviços fundamentais para a

comunidade científica e tecnológica (Canhos, 2003).

A Coleção de Culturas - Micoteca URM, do Departamento de Micologia, do Centro de

Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Pernambuco, foi fundada em 1954, pelo Professor

Augusto Chaves Batista e está registrada no Commonwealth Mycological Institute (CMI) sob a

sigla URM (University Recife Mycologia). É filiada ao World Federation for Culture Collection

(WFCC) sob o número 604, sendo citada em vários catálogos, destacando-se os do American Type


32

Culture Collection (ATCC) nos Estados Unidos, do Institute for Fermentation em Osaka no Japão

(IOF) e do World Data Center for Microorganisms (WDCM) no Japão (Cavalcanti et al., 1996).

O acervo da Micoteca URM consta de aproximadamente 9000 culturas de fungos, sendo

cerca de 1.600 leveduras e 7.400 fungos filamentosos, provenientes dos mais diversos substratos,

todas identificadas ao nível de espécie e mantidas em duplicata por dois métodos de preservação

(Micoteca URM, 2008).

Atualmente, a Micoteca URM está caracterizando culturas de fungos pertencentes ao

acervo quanto à produção de metabólitos de interesse para agricultura, industrial, farmacêutico e

ambiental. São incorporadas ao acervo culturas identificadas ao nível de espécie procedentes de

diversos ambientes, substratos e hospedeiros (Micoteca URM, 2008).


33

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abram, A. P., Higuera, I., 2004. Generalidades en: Quitina y Quitosano. In: Abram, A. P. (Ed.),

Quitina y quitosano: obtencion, caracterizacion y aplicaciones, Programa Cyted 2004, Pontificia

Universidad Catolica del Peru/Fondo Editorial, Lima, pp. 01-25.

Alexopoulos, C.J., Mims, C.W. & Blackwell, M., 1996. Introductory Micology. 4th edition. John

Willey & Sons, New York.

Alves M.H., Campos-Takaki, G.M., Okada, K., Pessoa I.H.F., Milanez, A.V., 2005. Detection of

extracellular protease in Mucor species. Rev. Iberoamericana Micol. 22, 114-117.

Araújo, J.M.A., 2006. Química de alimentos: teoria e prática. Imprensa Universitária, UFV, Viçosa.

Arvanitidou, M, Kanellou, K, Constantinides, T.C., Katsouyannopoulos, V., 1999. The occurende

off ungi in hospital and community potable waters. Lett. Appl. Microbiol. 29, 81-84.

Arvanitidou, M., Spaia, A. Velegraki, M., Pazarloglou, M., Kanetidis, D., Pangidis, P., Askepidis,

N., Katsinans, Ch., Vayonas, G., Katsouyannopoulos, V., 2000. High level of recovery of fungi

from water and dialysate in hemodialysis units. J. Hosp. Infect. 45, 225-230.

Assis, C.M., Gambale, W., Paula, C.R.., 1999. Production of proteinase and phospholipase by

Paracoccidioides brasilienses. Mycophatologia 146, 13-17.

Batina, P.N., Lopes, S.T.A., Santurio, J.M., 2005. Efeitos da Adição de Montmorilonita Sódica na

Dieta Sobre o Perfil Bioquímico de Frangos de Corte Intoxicados com Aflatoxina. Ciência Rural,

35(4): 826-831.

Bidochka, M.J., Khachatourians, G.G., 1987. Purification and Properties of an Extracellular

Protease Produced by the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana. Appl. Environ.

Microbiol. 53(7), 1679-1684.

Bintvihok, A., Ponpornpisit, A., Tangtrongpiros, J., Panichkriangkrai, W., Rattanapanee, R., Doi,

K., Kumagai, S., 2003. Aflatoxin Contamination in Shrimp Feed and Effects of Aflatoxin Addition

to Feed on Shrimp Production. J. Food Prot. 66(5): 882-885.

Bon, E.P.S., Gottschalk, L.M.F., Sá-Pereira, P., Roseiro, J.C., Ferrara, M.A. 2008. Bioprocessos

para produção de enzimas. In: Bon, E.P.S., Ferrara, M.A., Corvo, M.L. (Eds.), Enzimas em

Biotecnologia Produção, aplicações e Mercado. Editora Interciência, Rio de Janeiro, pp. 95-122.


34

Bougoure, D.S., Cairney, W.G., 2006. Chitinolytic activies of ericoid mycorrhizal and root-

associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae). Mycol. Res. 110, 328-334.

Brito, L.O., Costa, W.M., Galvez, A.O., 2006. Utilização de Nitrato de Sódio como Estratégia de

Fertilização na Produção do Camarão Litopenaeus vannamei. Bol. Inst. Pesca São Paulo 32(1), 95-

100.

Bull, A.T., Goodfellow, M., Slater, J.H., 1992. Biodiversity as a source of innovation in

biotechnology. Ann. Rev. Microbiol. 46, 219-252.

Campos, K.C., Campos, R.T., 2006. Alternativa econômica para o novo rural do Nordeste

brasileiro: o cultivo do camarão Litopenaeus vannamei em água doce. Rev. GEPEC. 2, 40-53.

Canhos, V.P., Umino, C.Y., Manfio, G.P., 1999. Coleções de culturas de microrganismos. In: Brito,

M.C.W., Joly, C.A. (Eds.), Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil: síntese do conhecimento

ao final do século XX, Volume 7: Infra-estrutura para conservação da biodiversidade. FAPESP,

São Paulo, pp. 82-101.

Canhos, V.P., 2003. Centro de recursos biológicos: suporte ao desenvolvimento científico e

inovação tecnológica. Ciência e Cultura 55, 27-29.

Cannon, R.D., Niimi, K., Jenkinson, H.F., Shepherd, M.G. Molecular cloning and expression of the

Candida albicans beta-N-acetylglucosaminidase (HEX1) gene. J. Bacteriology 176, 26-40-2647.

Casaburi, A., Di Monaco, R., Cavella, S., Toldra, F., Ercolinib, D., Villania, F., 2008. Proteolytic

and lipolytic starter cultures and their effect on traditional fermented sausages ripening and sensory

traits. Food Microbiol. 25, 335-347.

Castro, A.A., Pagani, G.D., 2004. Secagem e Composição Química da Cabeça do Camarão

(Litopenaeus vannamei, Boone) a Diferentes Temperaturas. Rev. Bras. Prod. Agroind. 6(2), 123-

129.

Carvalho, J.M.M., 2005. Perspectivas para o desenvolvimento da carcinicultura no Nordeste

brasileiro. Fortaleza: Banco do Nordeste do Brasil, 132 pp.

Cavalcanti, M.A., Souza-Motta, C.M., Nogueira, E.B.S., 1996. Catálogo da coleção de culturas da

Micoteca URM. Editora Universitária, Recife,109 pp.

Cavalcanti, M.A.. Milanez, A.I., 2007. Hyphomyceytes isolados da água e do solo da Reserva

Florestal de Dois Irmãos, Recife, PE, Brasil. Acta Bot. Bras. 21, 857-862.


35

Chakrabarti, S.K., Matsumura, N., Ranu, R.S., 2000. Purification and Characterization of an

Extracellular Alkaline Serine Protease from Aspergillus terreus (IJIRA 6.2). Curr. Microbiol. 40,

239-244.

Chang, W.T., Chen, C.S., Wang, S.L., 2003. An antifungal chitinase produced by Bacillus a cereus

with shrimp and crab shell powder as a carbon source. Curr. Microbiol. 47, 102-108.

Chellapa, N.T., Lima, A.K.A., Câmara, F.R.A., 2007. Riqueza de Microalgas em Viveiros de

Cultivo Orgânico de Camarão em Tibau do Sul, Rio Grande do Norte. Rev. Bras. Bioc. 5(2), 120-

122.

Coelho, R.R.R., Pires, R., 2008. Seleção de Actinomicetos Produtores de Enzimas de Interesse

Biotecnológico. In: Bon, E.P.S., Ferrara, M.A., Corvo, M.L. (Eds.), Enzimas em Biotecnologia

Produção, aplicações e Mercado. Editora Interciência, Rio de Janeiro, pp. 72-94.

Dabrowa, N., Landau, J.W., Newcorner, V.D., Piun Kett, O.A., 1964. A survey of tide- washed

coastal area of Southern Califórnia for fungi potentially pathogenic to men. Mycopathology Appl.

1, 137-150.

Dall, W., 1992. Feeding digestion and assimilation in Penaeidae. In: Allan, G.L. and Dall, W.

(Editors). Proceeding Aquaculture Nutrition Workshop, Salamander Bay, Australia, pp. 57-63.

Daviet, L., Colland, F., 2008. Targeting ubiquitin specific proteases for drug discovery. Biochimie

90(2): 270-283.

Divakaran, S., Tacon, A.G.J., 2000. Studies on the Toxicity of Shrimp (Penaeus vannamei) Fed

Dietes Dosed with Aflatoxin B sub(1) to Humans. J. Aquatt. Food Prod. Technol. 9(3): 115-120.

Dorner, J.W., Cole, R.J., 2002. Effect of application of nontoxigenic strains of Aspergillus flavus

and A. parasiticus on subsequent aflatoxin contamination of peanuts in storage. J. Stored Prod. Res.

38, 329-339.

Duo-Chuan, L.I., Chen, S. Jing, L.U., 2005. Purification and partial characterization of two

chitinases from the mycoparasitic fungus Talaromyces flavus. Mycophatologia 159, 223-229.

El-Katatny, M.H., Somitsch, W., Robra, K.H., El-Katatny, M.S., Gübitz, G.M., Production of

Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the Phytophatogenic

Fungus Sclerotium rolfsii., 2000. Food technol. biotechnol. 38(3), 173-180.

Escott, G.M., Hearn, V.M., Adams, D.J., 1998. Inducible chitinolytic system of Aspergillus

fumigatus. Microbiology+ 144, 1575-1581.


36

Ferreira, P.R., Lima, G.A.T. de, Ormond, J.G.P., 2004. A Carcinicultura Brasileira. BNDES

Setorial. No 19, Rio de Janeiro.

Figueiredo, M.C.B. de, Gondim F.M., Sonsol, R., 2003. Sustentabilidade Ambiental da

Carcinicultura no Brasil: Desafios Para a Pesquisa. Revista Econômica do Nordeste. Fortaleza, No

2, v. 34.

Flach, J., Pilet, P.E. Jollès, P., 1992. What’s new in chitinase research? Experientia 48, 701-716.

Gavrilescu, M., Chisti, Y., 2005. Biotechnology sustainable alternative for chemical industry.

Biotech. Adv. 23, 471-499.

Ghannom, M.A., 2000. Potential role of phospholipase in virulence and fungal pathogenesis.

Clinical. Microbiol. Rev. 13, 122-143.

Giambattista, R. Di, Federice, F., Petruccioli, M., Fenice, M., 2001. The chitinolytic activity of

Penicillium janthinellum P9: purification, partial characterization and potential applications. J.

Appl. Microbiol. 91, 498-505.

Gonçalves, A.B., Russel, Paterson, R.R.M., Lima, N., 2006. Survey and significance of filamentous

fungi from tap water. Int. J. Hyg. Envir. Heal. 257-264.

Gooday, G.W., 1990. The ecology of chitin degradation. In: Marshall, K.C. (Ed.), Advances in

Microbial Ecology. Plenum Press, New York, pp 430.

Gooday, G.W., Zhu, W., O’donnell, R.W., 1992. What are the roles of chitinase in growing fungus?

FEMS Microb. Lett. 100, 387-392.

Gooday, G.W., 1996. Aggressive and defensive roles for chitinases. Chitin Enzymology, 2, 125-

134.

Graham, L.S., Sticklen, M.B., 1994. Plant chitinases. Can. J. Bot. 72, 1057-1083.

Hapcioglu, B., Yegenoglu, Y., Erturan, Z., 2005. Heterotrophic Bacteria and Filamentous Fungi

Isolated from a Hospital Water Distribuition System. Indoor Built Environ. 14(6), 487-493.

Harrison, J.C., Carvajal, M., Garner, R., 1993. Aflatoxin exposure in the United Kingdom

constitute cancer risk? Environ. Health Perspect. 99, 99-105.

Katiyar, S., Kushwaha, R.K.S., 2000. Human hair colonizing fungi water sediments of India.

Mycopathologia, 152, 81-84.


37

Khan, A., Williams, K., Molloy, M.P., 2003. Nevalainen, H. Purification and characterization of a

serine protease and chitinases from Paecilomyces lilacinus and detection activity on 2D gels.

Protein Expres. Purif. 32, 210–220.

Khulbe, R.D., Joshi, C., Bishi, G.S., 1993. Fungal diseases of fish in Nanak Sagar, Naini Tal, India.

Mycophatologia, 130: 71-74.

Kim, K., Yang,Y., Kim, J., 2003. Purification and Characterization of chitinase from Streptomyces

sp. M-20. J. Biochem. Mol. Biol. 36 (2), 185-189.

Kumar, A.G., Swarnalatha, S.A.B., Sairam, B.B., Sekaran, G., 2008. Production of alkaline

protease by Pseudomanas aeruginosa using proteinaceous solid waste generated from leather

manufacturing industries. Biores. Technol. 99, 1939-1944.

Lacaz, C.S., Porto, E., Martins, J.E.C., Heins-Vaccari, E.M., Melo, N.T., 2002. Tratado de

Micologia Médica. Sarvier, São Paulo.

Lopes, P.R.S., Neto, J.R., Mallmann, C.A., Lazzari, R., Pedron, F.A., Veiverberg, C.A., 2005.

Crescimento e alterações no fígado e na carcaça de alevinos de jundiá alimentados com dieta com

aflatoxinas. Pesq. agropec. bras. 40 (10): 1029-1034.

Mangiarotti, A.M., Careta, G., 1984. Keratinophilic fungi isolated from a small pool.

Mycopathologia 85, 9-11.

Masuma, R., Yamaguch, Y., Noumi, M., Omura, S., Namikoshi, M., 2001. Effect of sea water

concentration on hiphal growth and antimicrobial metabolite production in marine fungi.

Mycoscience 42, 455-459.

Matsumoto, Y., Castañeda, G.S., Revah, S., Shirai, K., 2004. Production of β-N-

acetylhexosaminidase of Verticillum lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing

shrimp waste silage as substrate and inducer. Process Biochem. 39, 665-671.

Matsuo, Y., Kurita, M., Park. J.K., Tanaka, K., Nakagawa, T., Kawamukai, M., Matsuda, H., 1999.

Purification, Characterization and Gene Analysis of- N-Acetylglucosaminidase from Enterobater

sp. G-1. Biosci. Biotech. Bioch. 63 (7), 1261-1268.

Molitoris, H.P., Buchalo, A.S., Kurchenko, I. Nevo, E., Rawal, B.S., Wasser, S.P., Oren, A., 2000.

Physiological diversity of the first filamentous fungi isolated from the hypersaline dead sea. Fungal

Divers. 5, 55-70.


38

Mukherjee, A.K., Adhikari, H., Sudhir, K.R., 2008. Production of alkaline protease by a

thermophilic Bacillus subtilis under solid-state fermentation (SSF) condition using Imperata

cylindrical grass and potato pell as low-cost medium: Characterization and application of enzyme in

detergent formulation. Biochem. Eng. J. 34, 185-192.

Mushin, T.M., Aubaid, A.H., Al-Duboon, A.H., 1997. Extracellular enzymes characteristics of

filamentous fungi strains isolated from processed oat. Rev. Microbiol. 30, 377-380.

Mushin, T.M., Salih, T.H., 2001. Exocellular enzyme activity of dermatophytes and other fungi

isolated from ruminants in Southern Iraq. Mycopathologia 150, 49-52.

Neder, R.N., Microbiologia: Manual de laboratório. São Paulo: Nobel, 1992.

Novotná, Z., Fliegerová, K., Simůnek, J., 2008. Characterization of Chitinases of Polycentric

Anaerobic Rumen Fungi. Folia Microbiol. 53 (3), 241-245.

Nunes, A.J.P., Martins, P.C.C., Gesteira, T.C.V., 1996. Feeding activity patterns of Southern brown

shrimp Penaeus Subtilis under semi-intensive culture in NE Brazil. Aquaculture 144: 371-386.

Nunes, A.J.P. Panorama de Cultivo de Camarões Marinhos no Brasil, 2001. Rev. Bras. Agrop. 1,

40-41.

Odum, E.P. Ecologia, 1988. Guanabara, Rio de Janeiro, 434 pp.

Oliveira, C.A.F., Germano, P.L., 1997. Aflatoxinas: conceitos sobre mecanismo de toxicidade e seu

desenvolvimento na etiologia do câncer hepático celular. Rev. Saúde Públ. 31(4): 417-424.

Paquotte, P., Chim, L., Martin, J.L.M., Lemos, E., Stern, M., Tosta, G., 1998. Intensive culture

shrimp Penaeus vannamei in floating cages: zootechnical, economic and environmental aspects.

Aquaculture 164, 151-166.

Patil, R.S., Grormade, G., Deshpande, M.V., 2000. Chitinolytic enzyme: an exploration. Enzyme

Microb. Tech. 2, 473-483.

Pinheiro, W.C., Filho, J.A., Maracajá, P.B., 2007. Efeittos Climáticos e Físico-Químicos Sobre a

Biologia do Litopenaeus vannamei Cultivado em Viveiro. Rev. Verde 2(2), 142-150.

Potumarthi, R., Ch., S., Jetty, A., 2007. Alkaline protease production by submerged fermentation in

stirred tank reactor using Bacillus licheniforms NCIM-2042: Effect of aeration and agitation

regimes. Biochem. Eng. J. 34, 185-192.


39

Promwikorn, W., Kirirat, P., Thaweethamsewee, P., 2004. Index of molt staging in the black tiger

shrimp (Penaeus monodon). Songklanakarin. J. Sci. Technol. 26(5),765-772.

Rattanakit, N., Plikomol, A., Yano, S., Wakayama, M., Tachiki, T., 2002. Utilization of Shrimp

Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp. S1-13: Evaluation of a

culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation. Journal Biosc.

Bioeng. 93, 550-556.

Richard, A.G., 1951. The integument of arthropods, University of Minnesota Press, Minneapolis,

110 pp.

Roberts, G. A. F., 1992. Chitin Chemistry. Mc Millan Press Ltda., London, 249 pp.

Rocha, J.P., Rodrigues, J., Amorim, L., 2003. A Carcinicultura Brasileira em 2003. Ver. ABCC

6(1), 30-36.

Rosas, C., Cuzon, G., Taboada, G., Pascual, C., Gaxiola, G., Van Wormhoudt, A., 2001. Effect of

dietary protein and energy levels on growth, oxygen consumption, haemolymph and digestive gland

carbohydrates, nitrogen excretion and osmotic pressure of Litopenaeus vannamei (Boone) and L.

setiferos (Linne) juveniles (Crustacea, Decapada, Penaidae). Aquaculture Res. 32, 537-547.

Rossetto, C.A.V., Silva, O.F., Araújo, A.E.S., 2005. Influência da calagem, da época de colheita e

da secagem na incidência de fungos e aflatoxinas em grãos de amendoim armazenados. Ciência

Rural, 35(2): 309-315.

Sahai, A.S., Manocha, M.S., 1993. Chitinases of fungi and plants: their involvement in

morphogenesis and host-parasite interaction. FEMS Microbiol. Rev. 11, 317-338.

Sana, B., Ghosh, D., Sana, M., Mukherjee, J., 2006. Purification and characterization of a salt,

solvent, detergent and bleach tolerant protease from a new gamma-Proteobacterium isolated from

the marine environment of the Sundarbans. Proc. Biochem. 41, 208-215.

Santos, J.I., Vicente, E.J., Paula, C.R., 2001. Gambale, W. Phenotypic characterization of

Trichophyton rubrum isolates from two geographic locations in Brazil. Europ. J. Epid. 17, 729-735.

Shaumann, K., Pribe, K., 1994. Ochronis humicola causing muscular black spot disease of atlantic

salmon (Salmo solar). J. Bot. 72, 1629-1634.

Sidrim, J.J.C., Rocha, M.G.F., 2004. Micologia médica à luz de autores contemporâneos.

Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, 1388 pp.


40

Snellman, E.A., Collins, R.P., Cooke, J.C., 1988. Utilization of fuel oils by fungi isolated from

oceanic tar balls. Lett. Appl. Microbiol. 6, 105-107.

Soares, V.F., Ferreira, V.S., Bon, E.P.S., 1999. Produção de proteases de Bacillus subtillis usando

óleo de soja como fonte de carbono. In: 4º Seminário Brasileiro de Tecnologia Enzimática.

Resumos. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, pp. 98.

Souza, R.F., Gomes, R.C., Coelho, R.R.R., Alviano, C.S., Soares, R.M.A., 2003. Purification and

characterization of an endochitinase produced by Colletotrichum gloeosporioides. FEMS

Microbiol. Lett. 222, 45-50.

Stickney, R.R., 2000. Shrimp culture. In: Stickney, R.R. (Ed.), Encyclopedia of Aquaculture.

Wiley, New York, USA, pp. 798-868

Tiedje, J.M., 1994. Microbial diversity: of value to whom? ASM News 60, 524-525.

Tweddel, R.J., Jabaji-Hare, S.H., Charest, P.M., 1994. Production of Chitinases and β‐1,3-

Glucanases by Stachybotrys elegans, a Mycoparise of Rhizoctonia solani. Appl. Environ.

Microbiol. 60(2), 489-495.

Varo, S.D., Martins, C.H.G., Cardoso, M.J.O., Sartori, F.G., Montanari, L.B., Pires-Gonçalves,

R.H., 2007. Isolamento de fungos filamentosos em água utilizada em uma unidade de hemodiálise.

Rev. Soc. Bras. Med.Trop. 40(3), 326-331.

Valenti, W.C. 1998. Carcinicultura de água doce: tecnologia para a produção de camarão. Instituto

Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis, Brasília. 396 pp.

Valenti, W.C., Daniels, W.H., 2000. Recirculation hatchery systems and management. In: New,

M.B. & Valenti, W.C. (Eds.) Freshwater Prawn Culture: The farming of Macrobrachium

rosenbergii, Blackwell Science, Oxford, 2000, p. 254-289.

Wang, S.L., Chang, W.T., Lu, M.C., 1995. Production of chitinase by Pseudomonas aeruginosa K-

187 using shrimp and crab shell powder as carbon source. Proc. Natl. Sci. Counc. R.O.C. B. 19,

105-112.

Wang, S., Chang, W.T., 1997. Purification and characterization of two o bifunctional chitinase

lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell

powder medium. Appl. Environ. Microbiol. 63, 380-386.


41

Wang, S.L.,Yieh, T.C. Shih, I.L., 1999. Production of antifungal compounds by Pseudomonas

aeruginosa K-187 using and crab shell powder as a carbon source. Enzyme Microb. Technol. 25,

142-148.

Wang, S.L., Yen, Y., Tsiao, W., Chang, W.T., Wang, C., 2002a. Production of antimicrobial

compounds by Monascus purpureus CCRC31499 using shrimp and crab shell powder as a carbon

source. Enzyme Microb. Technol. 31, 337-344.

Wang, S.L., Shih, I., Liang, T.. Wang, C., 2002b. Purification and Characterization of Two

Antifungal Chitinases Extracellularly Produced by Bacillus amyloliquefaciens V656 in a Shrimp

and Crab Shell Powder Medium. Agric. Food Chem. 50 (8), 2241-2248.

Wyban, J.A., Sweeney, J.N., 1989. Intensive shrimp growout trials in a round pond. Aquaculture

76, 215-225.

Zhu, Y., Pan, J., Qiu, J., Guan, X., 2008. Isoaltion and characterization of a chitinase gene from

entomopathogenic fungus Verticillium lecani. Braz. J. Microbiol. 8(39), 314-320.

SITES CONSULTADOS

ABCC (Associação Brasileira dos Criadores de Camarão). Disponível em: http://www.abcc.com.br.

Acesso em: 27 de outubro de 2008.

Amasa, 2008. Disponível em: http://www.amasa.com.br. Acesso em: 27 de outubro de 2008.

Camanor, 2008. Disponível em: http://www.camanor.com.br. Acesso em: 27 de outubro de 2008.

Eurostat, 2008. Disponível em: http://epp.eurostat.ec.europa.eu/portal. Acesso em: 27 de outubro de

2008.

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). 2002. Yearbook of fisherystatistics:

summary tables. Disponível em: http://www.fao.org. Acesso em: Acesso em: 27 de outubro de 2008.

Micoteca URM. Disponível em: http://www.ufpe.br/micoteca/historico.html. Acesso em: 27 de outubro de

2008.

Polymar, 2008. Disponível em: http://www.polymar.com.br. Acesso em: 27 de outubro de 2008.

Primar Orgânica, 2008. Disponível em: http://www.primarorganica.com.br. Acesso em: 27 de outubro de

2008.

Terra Nova Indústria e Comércio, 2009. Disponível em: http://www.proumih2.com.br. Acesso em:

01 janeiro de 2009.


42

3 DIVERSIDADE E DETECÇÃO PROTEÁSICA DE FUNGOS PRESENTES EM ÁGUA

DE VIVEIROS E NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei BOONE, CULTIVADO EM DUAS

FAZENDAS DO RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL

ARTIGO SUBMETIDO EM 06/12/2008 A AQUACULTURE


43

Diversidade e detecção proteásica de fungos presentes em água de viveiros e no camarão

Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas fazendas do Rio Grande do Norte, Brasil

*Lidiane Roberta Cruz da Silva, Odacy Camilo de Souza, Débora Maria Massa Lima, Maria José

Fernandes, Cristina Maria de Souza-Motta

Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Pernambuco, Brasil

* Autor correspondente: Lidiane Roberta Cruz da Silva.

Endereço: Rua João Manoel, nº 91, Curado II, Jaboatão dos Guararapes, PE, Brasil. Cep 54220-

715.

Telefone: (+5581) 3452-0593

Fax: (+5581) 3255-9115

E-mail address: [email protected], [email protected]


44

Resumo

O Brasil é atualmente o segundo maior produtor de camarão do ocidente, sendo a espécie

Litopenaeus vannamei Boone a mais cultivada no nordeste brasileiro. Este crustáceo quando

cultivado em viveiros é muito susceptível a doenças causadas por agentes como vírus, bactérias,

protozoários, fungos que se propagam muito rapidamente em suas populações, afetando

acentuadamente a produtividade, e preocupando os criadores. Há relatos de estudos de bactérias,

vírus e protozoários em camarões, sendo inexistentes os estudos sobre fungos em água de viveiros e

em camarões. Os fungos são classificados como organismos redutores, participando ativamente dos

processos de biodeterioração e biodegradação, através da liberação de enzimas sobre o substrato. A

carapaça do camarão é constituída basicamente por quitina, proteína e lipídio. Proteases são

enzimas produzidas por fungos que degradam proteínas, podendo facilitar assim, a sua adesão e

invasão no tecido hospedeiro, adquirindo papel significante na destruição das membranas celulares

que são compostas, principalmente, de proteínas e lipídeos. A capacidade proteolítica que algumas

espécies de fungos possuem é considerada um fator indicativo de patogenicidade. O objetivo deste

trabalho foi conhecer a micota presente em água de viveiros e em camarões de duas fazendas

brasileiras. Os camarões alimentados de modo inorgânico em uma das fazendas e de modo orgânico

na outra fazenda. A capacidade proteolítica destes fungos foi avaliada, sugerindo um fator de

patogenicidade aos camarões. Foram obtidos 146 isolados de fungos, sendo 46 espécies

identificadas. Não houve similaridade entre as espécies de diferentes viveiros de uma mesma

fazenda, nem entre as fazendas estudadas. A maioria das espécies isoladas é descrita na literatura

como potencialmente patógenas ao homem e a outros animais. Das 46 espécies, 33 produziram

protease, sugerindo que estes fungos estão com o metabolismo secundário em atividade, podendo se

tornar patógenos aos camarões e conseqüentemente a seus consumidores.

Palavras-chave: camarão, Litopennaeus vannamei, fungos, água, protease.


45

Introdução

A carcinicultura é o ramo da aqüicultura no qual camarões são cultivados em cativeiro,

sendo o Brasil segundo maior produtor ocidental, principalmente por deter características naturais

que favorecem esta atividade por sua posição geográfica, clima, água, tecnologia e grande mercado

consumidor. A família de camarão mais utilizada em viveiros é a Penaideae, sendo Litopenaeus

vannamei Boone, a espécie mais cultivada no Nordeste brasileiro, sobretudo no estado do Rio

Grande do Norte (Campos et al., 2007).

O camarão cultivado em viveiros é muito susceptível a doenças - causadas por agentes

como vírus, bactérias, protozoários, fungos que se propagam muito rapidamente em suas

populações, afetando acentuadamente a produtividade, e preocupando os criadores. Entretanto,

poucos estudos são realizados no sentido de investigar os agentes que acometem este invertebrado,

sendo conhecidos apenas alguns vírus, bactérias e protozoários (Pontes & Arruda, 2005), sendo

raros ou inexistentes os estudos sobre fungos em camarões.

Ecologicamente, os fungos são classificados como organismos redutores, participando

ativamente dos processos de biodeterioração e biodegradação e atuando desta forma na ciclagem

dos nutrientes e manutenção dos ecossistemas. É através da ação de enzimas produzidas pelos

fungos que a matéria orgânica é transformada em produtos naturais mais simples e assimiláveis

(Mangiarotti & Caretta, 1984). Por outro lado, várias espécies são patógenas, causando doenças nas

plantas, no homem e em outros animais (Alexopoulos et al., 1996).

Dentre os principais grupos de enzimas produzidas por fungos, destacam-se o das

proteases. Estas representam uma classe de enzimas com importantes papéis em processos

fisiológicos e biotecnológicos (Gouka et al., 1997). Alguns fungos secretam proteases

primariamente para garantirem nutrientes para as células; entretanto, nos fungos patogênicos estes

metabólitos facilitam a adesão e invasão no tecido hospedeiro, adquirindo papel significante na

destruição das membranas celulares que são compostas, principalmente, de proteínas e lipídeos

(Ghannoum, 2000).


46

Em viveiros inorgânicos, o camarão alimenta-se de ração em cuja composição estão

presentes farelo de milho, soja e trigo, entre outros. Estes grãos, quando mal condicionados, podem

ser contaminados por espécies de fungos com potencial patogênico. Já nos viveiros orgânicos, os

camarões são alimentados com algas e pequenos crustáceos, reproduzindo similarmente o habitat

natural destes animais, o que possivelmente pode abrigar uma comunidade fúngica peculiar (Pontes

& Arruda, 2005).

Com a finalidade de conhecer a micota de água de viveiros e dos camarões, os objetivos

deste trabalho foram isolar, purificar e identificar fungos presentes na água de viveiros e no

camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado no Rio Grande do Norte, Brasil, proceder estudo

comparativo entre as espécies isoladas em uma fazenda com sistema de alimentação artificial e

outra com sistema de alimentação orgânica, bem como detectar a capacidade proteolítica destes

fungos, avaliando assim seu possível potencial patogênico.

2. Materiais e métodos

2.1 Coleta de amostras de água e dos camarões

Foram analisadas amostras de água de viveiros de camarão jovem com até 10 dias de

desenvolvimento pós-larva e de camarão adulto com aproximadamente 202 dias de

desenvolvimento, bem como do camarão adulto de duas fazendas de criação, uma com sistema de

alimentação artificial e outra com sistema de alimantação orgânica, localizadas nos municípios de

Canguaretama e Tibau do Sul - Rio Grande do Norte-Brasil, respectivamente.

Foram realizadas três coletas por fazenda e em cada coleta, três amostras de água, de

pontos eqüidistantes de cada viveiro estudado, totalizando 6 amostras de água por coleta e uma

amostra dos camarões adultos. As coletas foram realizadas em maio, agosto e dezembro de 2007.

As amostras de água e dos camarões foram coletadas em recipientes previamente esterilizados e

transportadas para o Laboratório da Coleção de Culturas Micoteca URM, do Departamento de

Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, sendo manipuladas no mesmo dia.


47

Os camarões coletados em cada fazenda possuíam características da espécie e não

apresentavam lesões externas.

2.2 Isolamento dos fungos da água e dos camarões

Para o isolamento dos fungos da água dos viveiros foi semeado, em triplicata, 1 ml de cada

amostra na superfície do meio de cultura ágar Sabouraud, acrescido de cloranfenicol (50 mg/l)

contido em placas de Petri (Ali-Shtayeh et al., 2003).

Para o isolamento dos fungos dos camarões, foram pesados 25 g de camarões inteiros

suspensos em 225 mL de água destilada esterilizada e após agitações foram semeados, em triplicata,

0,1 mL de cada amostra da água de suspensão na superfície do meio de cultura ágar Sabouraud,

acrescido de cloranfenicol (50 mg/l) contido em placas de Petri (Lacaz et al., 2002).

As placas foram mantidas a temperatura ambiente (T.A 28ºC ±2ºC), até o crescimento dos

fungos, por aproximadamente 10 dias.

2.3 Purificação dos fungos

Para purificação, após o crescimento dos fungos, fragmentos das colônias foram

transferidos separadamente para meio ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol (50 mg/L) contido

em placas de Petri. Após a confirmação da pureza, os fungos foram transferidos para meios

específicos ágar Czapeck (sacarose 30 g, nitrato de sódio 3,0 g, sulfato de magnésio 0,5 g, cloreto

de potássio 0,5 g, sulfato ferroso 0,01 g, fosfato de hidrogênio di-potássio 1,0 g, ágar 16,0 g, água

destilada 1000 mL) (Pitt, 1988), Batata Dextrose ágar (batata inglesa 140,0 g, glicose 20,0 g, ágar

16,0 g, água destilada 1000 mL) (BDA) e ágar Extrato de Malte (dextrose 20,0 g, peptona 1,0g,

extrato de malte 20,0 g, ágar 16,0 g, água destilada 1000 mL.) (Lacaz et al., 2002), contidos em

tubos de ensaio.

2.4 Identificação dos fungos

Para identificação, foram observadas características macroscópicas (coloração, aspecto e

diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas somáticas e reprodutivas) de acordo com

literatura especializada (Carmichael et al., 1980; Domsch et al., 1993; Ellis, 1971, 1976; Klick,


48

2002; Pitt, 1988, 1991; Raper & Fennel, 1977; Rifai, 1969; Samson, 2004; Leslie & Summerell,

2006) através de cultivo sob lamínula (Ridell, 1950), e para identificação de espécie de Aspergillus

e Penicillium, os isolados foram inoculados no centro do meio ágar Czapeck contido em placas de

Petri e mantidos a temperatura ambiente por até 10 dias. Em seguida, foram montadas lâminas,

utilizando azul de Aman como corante e as microestruturas, observadas ao microscópio de luz. A

identificação das espécies de levedura foi procedida de acordo com Barnet et al. (2000) e Lacaz et

al. (2002).

2.5 Avaliação da similaridade

Para avaliar o grau de similaridade entre as espécies isoladas na água dos viveiros e do

camarão das duas fazendas, foi utilizado o Coeficiente de Sorensen (Ss= 2a/b+c; onde a = número

de espécies comuns em dois viveiros/camarões, b= número de espécies no viveiro/camarão da

fazenda I e c= número de espécies no número de espécies no viveiro/camarão da fazenda II) (Zar,

1999).

2.6 Detecção da capacidade proteolítica dos fungos isolados da água e dos camarões

Fragmentos das culturas foram transferidas com o auxílio de uma alça de platina para o

centro do meio de caseína (leite desnatado 50g, ágar 10g e de água destilada 1000 mL), contido em

placa de Petri, e incubadas a TA durante 10 dias. A atividade proteolítica foi evidenciada pela

formação de halo transparente ao redor da colônia. Para distinguir entre a hidrólise da caseína e a

produção de metabólitos ácidos e alcalinos contidos no leite, foi utilizada uma solução acidificada

de cloreto de mercúrio (cloreto de mercúrio 12 g, ácido clorídrico concentrado 16 mL e de água

destilada 100 mL) na placa durante 10 minutos (Lacaz et al., 2002).

3. Resultados

Da água dos viveiros criadouros de camarão e dos camarões adultos, foram obtidos 146

isolados de fungos, destes, 26 foram isolados da água do viveiro de camarão jovem da fazenda I, 27

da água do viveiro de camarão jovem da fazenda II (Tabela 1), 23 da água do viveiro de camarão


49

adulto da fazenda I e 19 da água do viveiro de camarão adulto da fazenda II (Tabela 2). Das

amostras do camarão adulto, foram obtidos 26 isolados da fazenda I e 25 da fazenda II (Tabela 3).

Foram identificadas 16 espécies da água do viveiro de camarão jovem da fazenda I e 15 da

água do viveiro de camarão jovem da fazenda II (Tabela 1). Tanto da água do viveiro de camarão

adulto da fazenda I quanto da fazenda II, foram identificadas 12 espécies (Tabela 2). Das amostras

de camarões adultos da fazenda I foram identificadas 16 espécies e dos camarões adultos da fazenda

II, 18 espécies (Tabela 3).

Os gêneros Aspergillus e Penicillium destacaram-se com o maior número de espécies,

ambos com 9, para a fazenda I. Entretanto, para a fazenda II o gênero Aspergillus apresentou o

maior número de 11 (onze). Aspergillus flavus ocorreu em todas as coletas, tanto na água dos

viveiros da fazenda orgânica quanto na água da fazenda inorgânica (Tabela 04).

De acordo com o coeficiente de Sorensen (Ss) não houve similaridade entre as espécies de

diferentes viveiros de uma mesma fazenda, nem entre as fazendas estudadas. (Tabela 05).

Das 46 espécies isoladas, 33 produziram protease. Do gênero Aspergillus apenas A.

fumigatus e A. japonicus não foram produtores. Do gênero Penicillium, apenas P. simplicissimum

não produziu protease (Tabela 06).

Um representante de cada espécie isolada, que após os processos de identificação e

detecção da produção de protease, manteve a capacidade de esporulação, foi incorporado ao acervo

da Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE (Tabela 07).

4. Discussão

Trabalhos com isolamento de fungos conidiais, Ascomycota e leveduras em água utilizada

na aquicultura são escassos ou inexistentes, entretanto, resultados similares foram obtidos por

Saraiva (1998), que isolou 31 espécies da água da Lagoa do Araçá, Recife-PE, Brasil, tendo se

destacado os gêneros Aspergillus e Penicillium com 9 e 5 espécies, respectivamente, sendo

Aspergillus flavus a espécie presente em todas as coletas. Analisando a qualidade da água utilizada


50

em uma unidade de hemodiálise de Franca-SP, Brasil, Varo et al. (2007), obtiveram 49 isolados,

destacando-se os gêneros Fusarium, Cladosporium e Trichoderma.

A qualidade da água nos sistemas de cultivo do camarão é um fator de extrema

importância para o sucesso desta atividade, podendo afetar desde o hábito alimentar até a própria

sobrevivência dos animais no viveiro. Em viveiros, o fornecimento de alimentos é a principal causa

da diminuição da qualidade da água e do acúmulo de matéria orgânica (Pinheiro et al., 2007), o que

pode explicar a expressiva diversidade de espécies fúngicas isoladas.

Há relatos de estudos sobre a diversidade de vírus (Vidal et al., 2007), bactérias (Cheng et

al., 2005; Moss et al., 2007) e protozoários (Jiménez et al., 2002) que acometem o camarão

Litopenaeus vannamei cultivado em viveiros, porém estudos sobre a micota presente nos viveiros

são raros ou inexistentes.

De acordo com o coeficiente de Sorensen (Ss), só há similaridade entre espécies quando os

coeficientes são iguais ou ultrapassam 50% (Zar, 1999). Não houve similaridade entre as espécies

de diferentes viveiros de uma mesma fazenda, nem entre as fazendas estudadas. Isto pode estar

relacionado com as diferenças nutricionais dos camarões, selecionando as espécies, bem como com

a localização geográfica das fazendas (Tabela 5).

Todas as espécies isoladas, tanto da água quanto dos camarões, possuem o solo como

habitat, podendo tornar-se, dependendo das condições, potencialmente patógenas ao homem e a

outros animais (Hoog et al., 2000; Lacaz et al., 2002).

Aspergillus fumigatus, A. flavus A. niger e A. terreus, são reportados como agentes de

aspergilose pulmonar. A flavus é a mais potente das espécies, produtoras de aflatoxinas,

conseqüentemente carcinogênica (Lacaz et al., 2002). Estas micotoxinas podem contaminar os

camarões e conseqüentemente serem transferidas aos consumidores. Esta espécie ocorreu em todas

as coletas das duas fazendas, tanto na água quanto nos camarões (Tabela 6). Isto provavelmente

ocorreu devido à disponibilidade de matéria orgânica favorável ao desenvolvimento desta espécie.


51

Dos camarões alimentados principalmente por ração, foram isoladas espécies

referenciadas como agente etiológico de micoses em humanos: Phaeoannellomyces werneckii,

causador da Tinea nigra e Rhinocladiella aquaspersa, agente etiológico da cromoblastomicose. Dos

camarões alimentados com algas e pequenos crustáceos, dentre outras espécies de relevância

médica, foi isolado Syncephalastrum racemosum, causador de infecção cutânea (Hoog et al., 2000;

Lacaz et al., 2002). Este o primeiro relato de isolamento de fungos conidiais, Ascomycota e

leveduras em água de cultivo e em camarões.

De acordo com Lacaz et al. (2002), proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de

proteínas e sua ação é importante tanto para o crescimento do fungo quanto para a invasão do tecido

hospedeiro. A carapaça do camarão é composta principalmente por quitina, proteínas e lipídios. Os

resultados demonstram uma expressiva diversidade de fungos, onde na maioria delas, tanto as da

água quanto dos camarões, foi detectada a atividade proteolítica, sugerindo que estas espécies estão

com o metabolismo secundário ativado, podendo ser possíveis patógenas, tanto aos camarões,

quanto aos seus consumidores.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq). Os autores são gratos a Nogueira, E.B.S. e Torres, K.B. pelo apóio técnico.

Referências Bibliográficas

Alexopoulos, C.J., Mims, C.W., Blackwell, M., 1996. Introductory mycology. John Wiley & Sons,

Inc, New York, 868 pp.

Ali-shtayed, Khaleel, T.K.M., Jamous, R.M.F., 2003. Ecology of dermatophytes and other

keratinophilic fungi in swimming pools and polluted and unpolluted streams. Mycopathologia

156(3), 51-59 pp.

Barnett, J.A., Payne, R.W., Yarrow, D., 2000. Yeasts characteristics and identification. Cambridge

University Press, Spain, 1139 pp.


52

Campos, A.A.B., Maia, E.P., Costa, W.M., Brito, L.O., Olivera, A., 2007. Descrição dos principais

grupos fitoplanctônicos do afluente e efluente em fazenda de criação do camarão marinho

Litopenaeus vannamei com sistema de recirculação parcial de água. B. Inst. Pesca. 33, 113-119.

Carmichael, J.W., Kendrick, W.B., Conners, I.L., Singler, L., 1980. Genera of Hyphomycetes.

University of Alberta Press, Canada, 369 pp.

Cheng, W., Wang, L, Chen, J., 2005. Effect of water temperature on the immune response of with

shrimp Litopenaeus vannamei to Vibrio alginolyticus. Aquaculture 250, 592-601.

Domsch, K. H., Gams, W., Anderson, T., 1993. Compendium of soil fungi. IHW – Verlag, San

Francisco, v. I, 859 pp.

Ellis, M.B., 1971. Dematiaceous hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, 608

pp.

Ellis, M.B., 1976. More Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew,

507 pp.

Ghannom, M.A., 2000. Potential role of phospholipase in virulence and fungal pathogenesis. Clin.

Microbiol. Rev. 13, 122-143.

Gouka, R.J., Punt, P.J., van den Hondel, C.A.M.J.J., 1997. Efficient production of secreted proteins

by Aspergillus progress, limitations and prospects. App. Microbiol. Biotechnol. 47, 1-11.

Hoog, G.S, Guarro, J.; Gene, J., 2000. Atlas of Clinical Fungi. Centraalbureua voor

Schimmelcultures, 2nd Edition., Utrecht, The Netherlands, 360 pp.

Jiménez, R., Barniol, L., Machuca, M., 2002. Nematopsis marinus n. sp., a new septate gregarine

from cultured penaeoid shrimp Litopenaeus vannamei (Boone), in Ecuador. Aquaculture res. 33(4),

231-240.

Klick, M.A., 2002. Identification of Common Aspergillus Species. Identification of Common

Aspergillus Species. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht,. the Netherlands, 116 pp.

Lacaz, C.S., Porto, E., Martins, J.C, Heins-Vaccari, E.M., Melo, N.T., 2002. Tratado de Micologia

Médica. Sarvier, São Paulo, 980 pp.


53

Leslie, J.F., Summerell, B.A., 2006. The Fusarium laboratory Manual. 1 st ed. Lowa: Blackwell Publishing,

388 pp.

Mangiarotti, A.M., Careta, G., 1984. Keratinophilic fungi isolated from a small pool.

Mycopathologia 85, 9-11.

Moss, S.M., LeaMaster, B.R., Sweeney, J.N., 2007. Relative abundance and species composition of

Gram-negative, Aerobic Bacteria Associated with the gut of juvenile white shrimp Litopenaeus

vannamei reared in oligotrophic well water and eutrophic pond water. J. World Aquac. Soc. 31(2),

225-263.

Pinheiro, W.C., Filho, J.A., Maracajá, P.B., 2007. Efeitos climáticos e físico-químicos sobre a

biologia do litopenaeus vannamei Cultivado em viveiro. Rev. Verde. 2, 142-150.

Pitt, J.I., 1988. A laboratory Guide to Common Penicillium Species. Commonwealth Scientific and

Industrial Research Organization – Division of Food Processing, North Wales, 187 pp.

Pitt, J.I., 1991. A laboratory Guide to Common Penicillium Species. Commonwealth Scientific and

Industrial Research Organization – Division of Food Processing, North Wales , 187 pp.

Pontes, C. S., Arruda, Maria de F., 2005. Comportamento de Litopenaeus vannamei (Boone)

(Crustacea, Decapoda, Penaeidae) em função da oferta do alimento artificial nas fases clara e escura

do período de 24 horas. Rev. Bras. Zool. 22, 648-652.

Raper, K.B., Fennel, D.I., 1977. The genus Aspergillus. Robert & Krieger, Florida, 686 pp.

Riddell, R.W. 1950. Permanent stained mycological preparation obtained by slide culture.

Mycologia. 42, 265-270.

Rifai, M.A., 1969. A Revision of the genus Trichoderma. Mycol. Pap. 116, 1-56.

Samson, R.A.; Frisvad, J.C., 2004. Penicillium Subgenus Penicillium: new Taxonomics Schemes,

Mycotoxins and Other Extrolites. Stud. Mycol. 49, 1-266.

Saraiva, A.A.F., 1998. Fungos filamentosos isolados da água da Lagoa do Araçá-Recife-PE.

Dissertação de Mestrado, UFPE, Recife, 57 pp.


54

Varo, S.D., Martins, C.H.G., Cardoso, M.J.O., Satori, F.G., Montanari, L.B., Pires-Gonçalves, R.H.,

2007. Isolamento de fungos filamentosos em água utilizada em uma unidade de hemodiálise. Rev.

Soc. Bras. Med. Trop. 40, 326-331.

Vidal, O.M., Granja, C.B., Aranguren, F., Brock, J.A., Salazar, M., 2007. A profound effect of

hyperthermia on survival of Litopenaeus vannamei juveniles infected with White Spot Syndrome

Virus. J. World Aquac. Soc. 32(4), 364-372.

Zar, J.H., 1999. Biostatistical analysis. Prentice-Hall International, New Jersey, 633 pp.


55

Tabela 1. Número de isolados das espécies de fungos presentes nas amostras de água dos

viveiros de camarões jovens cultivados no Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e

Sistema de Alimentação Orgânico (SAO).

ESPÉCIES FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)

C1 C2 C3 TI C1 C2 C3 TI

Aspergillus caespitosus - - - 0 - - 1 1

A. flavus 2 1 1 4 1 3 1 5

A. fumigatus - 3 - 3 3 - - 3

A. japonicus 1 - - 1 - - 1 1

A. niger - 1 - 1 1 1 - 2

A. niveus - - - 0 1 - - 1

A. ochraceus 1 - 1 2 - - - 0

A. parasiticus - - 1 1 1 - 1 2

A. sydowi - - - 0 - - 1 1

A. terreus - - - 0 1 - - 1

Aureobasidium pullulans 2 - - 2 - - - 0

Cladosporium

cladosporioides

-

1

1

2

3

-

-

3

Eurotium chevalieri - - - 0 - 3 - 3

Fusarium lateritium 2 - - 2 - - - 0

F. moniliforme 2 - - 2 - - - 0

Paecilomyces variotii 1 - - 1 - - - 0

Penicillium chrysogenum - - - 0 - - 1 1


56

Tabela 1. (Cont.)

a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agostot/2007); c) C3: coleta 3 (novembro/2007);

d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.

ESPÉCIES

FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)


P. decumbens - - - 0 - - 1 1

P. funiculosum - - 1 1 - - - 0

P. griseofulvum - - - 0 - - 1 1

P. lividum - - 1 1 - - - 0

P. simplicissimum 1 - - 1 - - - 0

P. waksmanii - - 1 1 - - - 0

Phaeoanellomyces

werneckii

1 - - 1 - - - 0

Phialophora radicicola - - - 0 - - 1 1

Total de isolados 13 06 07 26 11 07 09 27

Total de espécies por coleta 09 04 07 07 03 09

Total de espécies por fazenda 16 15


57

Tabela 2. Número de isolados das espécies de fungos presentes nas amostras de água dos viveiros

de camarões adultos cultivados no Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e Sistema de

Alimentação Orgânica (SAO).

ESPÉCIES

FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)


Absidia blakesleeana - - 1 1 - 1 - 1

Acremonium fusidioides 1 - - 1 - - - 0

Alternaria alternata - - - 0 - 1 - 1

Aspergillus flavus 4 3 2 9 4 1 1 6

A. ochraceus - - - 0 - 1 - 1

A. oryzae - - 1 1 - - - 0

A. parasiticus 1 - - 1 1 - - 1

A. sydowii - 1 - 1 - - - 0

Cladosporium

cladosporioides

- - - 0 - 1 - 1

Cunninghamella elegans - - - 0 - 1 - 1

Eurotium chevalieri - 3 - 3 - - - 0

Penicillium

aurantiogriseum

1 - - 1 1 - - 1

P. commune - - - 0 - - 1 1

P. corylophilum - - - 0 - - 1 1

P. griseofulvum 2 - - 2 1 2 - 3


58

Tabela 2. (Cont.)

a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agostot/2007); c) C3: coleta 3

(novembro/2007); d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.

ESPÉCIES

FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)


P. implicatum - 1 - 1 - - - 0

P. janthinellum - 1 - 1 - - - 0

P. pinophilum - - - 0 - - 1 1

Phialophora radicícola - - 1 1 - - - 0





59

Tabela 3. Número de isolados de espécies de fungos presentes em amostras do camarão adulto

de ambas as fazendas.

ESPÉCIES

FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)


Aspergillus flavipes - - - 0 - 1 - 1

A. flavus 6 - - 6 1 2 - 3

A. niger - 1 - 1 - - - 0

A. ochraceus - - - 0 - 1 - 1

A. oryzae - - 1 1 - - - 0

A. parasiticus - - - 0 1 1 - 2

A. terreus - 1 - 1 - - 1 1

Aureobasidium pullulans - - - 0 - - 2 2

Drechslera rostrata - - - 0 1 - - 1

Eurotium chevalieri 1 - - 1 1 - - 1

Fusarium lateritium - - 3 3 - - 1 1

F. oxysporum - 1 - 1 - - - 0

Mucor hiemalis - - - 0 - - 1 1

Paecilomyces variotii - - 1 1 - 1 - 1

Penicillium

aurantiogriseum

- - 1 1 - - - 0

P. citrinum - - - 0 3 - - 3


60

Tabela 3. (Cont.)

a) C1: coleta 1 (maio/2007); b) C2: coleta 1 (agosto/2007); c) C3: coleta 3

(novembro/2007); d) (-): não ocorrência da espécie; e) TI= total de isolados.

ESPÉCIES

FAZENDA I

(SAA)

FAZENDA II

(SAO)


P. commune - - - 0 - 2 - 2

P. corylophilum - - 1 1 1 - - 1

P. funiculosum - - 1 1 - - - 0

P. griseofulvum - - - 0 - - 1 1

P. waksmanii 3 - - 3 - - - 0

Pestalotiopsis guepinii - 1 - 1 - - 1 1

Phaeoanellomyces

werneckii

1 - 1 1 - - - 0

Rhinoclediella aquaspersa - - - 0 - 1 - 1

Rhizopus oryzae - - - 0 - 1 - 1

Rhodotorula glutinis - - 1 1 - - - 0

Syncephalastrum

racemosum

- 1 - 1 - - - 0





61

Tabela 4. Ocorrência de espécies isoladas da água dos camarões jovens e adultos e do camarão

adulto das fazendas com Sistema de Alimentação Artificial (SAA) e Sistema de Alimentação

Orgânica (SAO).

ESPÉCIES ÁGUA CAMARÕES

CJFI CJFII CAFI CAFII FI FII

Absidia blakesleeana - - X X - -

Acremonium fusidioides - - X - - -

Alternaria alternata - - - X - -

Aspergillus caespitosus - X - - - -

A. flavipes - - - - - X

A. flavus X X X X X X

A. fumigatus X X - - - -

A. japonicus X X - - - -

A. niger X X - - X -

A. niveus - X - - - -

A. ochraceus X - - X - X

A. oryzae - - X - X -

A. parasiticus X X X X - X

A. sydowii - X X - - -

A. terreus - X - - X X

Aureobasidium pullulans var.

pullulans

X - - - - X

Cladosporium cladosporioides X X - X - -

Cunninghamella elegans - - - X - -

Drechslera biseptata - - - - - X


62

Tabela 4. (Cont.)



Eurotium chevaliere - X X - X X

Fusarium lateritium X - - - X X

F. moniliforme X - - - - -

F. oxysporum - - - - X -

Mucor hiemalis - - - - - X

Paecilomyces variotii X - - - X X

Pencicillium aurantiogriseum - - X X X -

P. citrinum - - - - - X

P. commune - - - X - X

P. chrysogenum - X - - - -

P. corylophilum - - - X X X

P. decumbens - X - - - -

P. funiculosum X - - - X -

P. griseofulvum - X X X - X

P. implicatum - - X - - -

P. janthinellum - - X - - -

P. lividum X - - - - -

P. pinophilum - - - X - -

P. simplicissimum X - - - - -


63

Tabela 4. (Cont.)



P. waksmanii X - - - X -

Pestalotiopsis guepinii - - - - X X

Phaeoanellomyces werneckii X - - - X -

Phialophora radicicola - X X - - -

Rhinocladiella aquaspersa - - - - - X

Rhizopus oryzae - - - - - X

Rhodotorula glutinis - - - - X -

Syncephalastrum racemosum - - - - X -

X= ocorrência das espécies; (–) = não ocorrência das espécies; CJFI= camarão jovem fazenda I;

CJFII= camarão jovem fazenda II; CAFI= camarão adulto fazenda I; CAFII= camarão adulto

fazenda II; FI= fazenda I; FII=Fazenda II.


64

Tabela 5. Coeficiente de similaridade de Sorensen (Ss) relativo às espécies de fungos isoladas da

água dos viveiros e dos camarões nas fazendas I e II.

a) AVCJ-I: água do viveiro camarão jovem - fazenda I; b) AVCJ-II: água do viveiro camarão

jovem - fazenda II; c) AVCA-I: água do viveiro camarão adulto - fazenda I; d) AVCA-II: água do

viveiro camarão adulto - fazenda II; e) CA-I: camarão adulto fazenda - I; f) CA-II: camarão

adulto fazenda - II.

SUBSTRATO-

FAZENDA

AVCJ-I

(%)

AVCJ-II

(%)

AVCA-I

(%)

AVCA-II

(%)

CA-I

(%)

CA-II

(%)

AVCJ-I - 43,7 20,6 20,6 30,36 37,5

AVCJ-II - - 34,4 29,6 25,80 24,24

AVCA-I - - - 41,6 28,57 28,57

AVCA-II - - - - 21,42 40,00

CA-I - - - - - 41,17

CA-II - - - - - -


65

Tabela 6. Caracterização enzimática das espécies isoladas quanto à habilidade de produzir

protease.

N º ESPÉCIE PROTEASE

1 Absidia blakesleeana Lendn. +

2 Acremonium fusidioides (Nicot) W. Gams -

3 Alternaria alternata (Fr.) Keissler -

4 Aspergillus caespitosus Raper & Thom -

5 A. flavipes (Bain. and Sart.) Thom +

6 A. flavus Link +

7 A. fumigatus Fresenius -

8 A. japonicus Saito -

9 A. niger V. Thieg. +

10 A. niveus Blochwitz +

11 A. ochraceus Wilhelm +

12 A. oryzae (Ahlb.) Cohn +

13 A. parasiticus Speare +

14 A. sydowii (Bain. & Start.)Thom and Church +

15 A. terreus Thom +

16 Aureobasidium pullulans var. pullulans

(de Bary) Arn.

+

17 Cladosporium cladosporioides (Fres) de Vries +

18 Cunninghamella elegans Lendner +

19 Drechslera biseptata (Sacc & Roum) -

20 Eurotium chevaliere L. Mangin -

21 Fusarium lateritium Nees -

22 F. moniliforme Wr. & Rg. -

23 F. oxysporum (Smith) Wr. & Rg. -


66

Tabela 6. (Cont.)

(+) = Positivo; (-) = Negativo.

N º ESPÉCIE PROTEASE

24 Mucor hiemalis for. Hiemalis Schipper +

25 Paecilomyces variotii Bain. +

26 Penicillium aurantiogriseum Dierckx +

27 P. citrinum Thom +

28 P. commune Thom +

29 P. chrysogenum Thom +

30 P. corylophilum Dierck. +

31 P. decumbens Thom +

32 P. funiculosum Thom +

33 P. griseofulvum Dierck. +

34 P. implicatum Biourge +

35 P. janthinellum Biourge +

36 P. lividum Westling +

37 P. pinophilum Hedgcock +

38 P. simplicissimum (Oudemans) -

39 P. waksmanii Zaleski +

40 Pestalotiopsis guepinii (Desm.) Steyaert -

41 Phaeoanellomyces werneckii (Horta) McGinnis

et Schell

+

42 Phialophora radicicola Cain -

43 Rhinocladiella aquaspersa Shell +

44 Rhizopus oryzae Went. & Prinsen Geere +

45 Rhodotorula glutinis (Fr.) Harrison +

46 Syncephalastrum racemosum (Cohn.)Scroet. +


67

Tabela 7. Número de registro dos fungos depositados na Coleção de Culturas -Micoteca URM,

Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE-Brasil.

ESPÉCIES

NÚMERO DE REGISTRO

Absidia blakesleeana 5610/5665

Acremonium fusidioides 5409

Alternaria alternata 5657

A. flavipes 5406

A. flavus 5405/5600/5647/5659/5662/5663

A. fumigatus 5404/5410

A. japonicus 5721/5723

A. niveus 5612/5607

A. ochraceus 5512/5661

A. oryzae 5638

A. parasiticus 5408

A. terreus 5513/5514

Aureobasidium pullulans 5500

Cladosporium cladosporioides 5379/5660/5737

Cunninghamella elegans 5656

Eurotium chevaliere 5624

Drechslera biseptata (Sacc & Roum) 5704

Fusarium lateritium 5521/5697

F.moniliforme 5411

Mucor hiemalis for. Hiemalis 5739


68

Tabela 7. (Cont.)

ESPÉCIES

NÚMERO DE REGISTRO

Paecilomyces variotii 5421/5518

Penicillium aurantiogriseum 5637

P. citrinum 5623

P. commune 5407

P. corylophillum

P. decumbens

5613

5738

P. funiculosum 5518/5519

P. griseofulvum

P. implicatum

5670

5667/5668

P. janthinellum 5671/5750

P. lividum 5699

P. pinophilum 5666

P. wakmanii 5707

Pestalotiopsis guepinii 5515

Phaeoanellomyces werneckii 5345/5346

Phialophora radicicola 5713

Rhinocladiella aquaspersa 5430

Rhizopus oryzae 5554

Rhodotorula glutinis 5722

Syncephalastrum racemosum 5499


69

4 RÁPIDO SCREENING PARA DETECÇÃO DA CAPACIDADE QUITINOLÍTICA POR

FUNGOS UTILIZANDO SUBSTRATO DE BAIXO CUSTO

ARTIGO A SER SUBMETIDO AO JOURNAL OF BASIC MICROBIOLOGY


70

Rápido screening para detecção da capacidade quitinolítica por fungos, utilizando substrato

de baixo custo

*Lidiane Roberta Cruz da Silva, Minelli Albuquerque Sousa, Marília de Holanda Cavalcanti

Maciel, Polyanna Nunes Herculano, Keila Aparecida Moreira, Rosalie Reed Rodrigues Coelho,

Ana Lúcia Figueiredo Porto, Cristina Maria de Souza-Motta

Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Pernambuco, Brasil.

Palavras-chave: quitinase, fungos, camarão, Litopenaneus vannamei.

*Autor correspondente: Lidiane Roberta Cruz, Mestranda em Micologia.

Endereço: Rua João Manoel, 91, Curado II, Jaboatão dos Guararapes, Pernambuco, Brasil. Cep

54220-715.

Telefone: (+5581) 3452-0593

Fax: (+5581) 3255-9115

E-mail: [email protected], [email protected]


71

Resumo

Visando baratear os custos do processo de degradação de resíduos contendo quitina, este

trabalho teve como objetivo detectar a capacidade quitinolítica 41 espécies de fungos isolados da

água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, através do desenvolvimento de meio de

cultura para rápido screening. Foram utilizados diferentes meios de cultura: Meio C+ (controle

positivo) ágar Czapeck modificado; Meio QC (Quitina Coloidal); Meio CC (carapaça de camarão) e

Meio CC+S, contendo carapaça de camarão adicionado de sais. Sete espécies foram selecionadas

para caracterização em meio CC+S líquido onde foi evidenciada visualmente a degradação da

carapaça. Após 96 horas de incubação a 28 °C, as culturas foram analizadas quanto ao

desaparecimento ou não da carapaça comparando com o tempo zero, filtradas e o filtrado analisado

quanto ao teor de proteínas e de N-acetilglicosamina. Das 41 espécies, 40 foram capazes de hidrolisar

quitina, contida nos três meios sólidos testados. Dentre as 26 espécies que apresentaram maior taxa

de crescimento no meio sólido CC+S, Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A.

parasiticus URM5408, Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499

degradaram completamente a carapaça do camarão em suspensão, produzitam proteínas e liberaram

N-acetilglicosamina, sendo indicadas como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina,

podendo ser aplicadas em processos biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura.

Está sendo indicado também um meio para um rápida seleção de fungos decompositores de quitina.

Palavras-chave: quitinase, fungos, camarão.


72

1 Introdução

Quitina é um polímero linear que possui como unidade repetitiva o dissacarídeo formado

por 2-acetamido-2-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose, unidos por ligação

glicosídica [1].

Trata-se da segunda substância orgânica mais abundante na biosfera sendo precedida

apenas pela celulose. Encontra-se na matriz da estrutura esquelética de invertebrados, como

artrópodes, dentre eles os camarões, anelídeos, moluscos e celenterados, e na parede celular da

maioria dos fungos, atuando como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa destes

organismos [2].

Quitinases são enzimas que quebram ligações β-1,4 entre unidades de N-

acetilglucosaminas da quitina. As quitinases são produzidas principalmente por organismos que

possuem quitina no exoesqueleto ou parede celular como insetos, crustáceos, algas e fungos [2].

Industrialmente, as quitinases são empregadas no controle biológico de pragas da lavoura,

tais como as produzidas por fungos entomopatogênicos. Além disto, estas enzimas podem ser uma

alternativa interessante para a reciclagem de carapaças de camarões, que na maioria das vezes, são

descartadas no meio ambiente, sem tratamento prévio, tornando-se poluentes ambientais [3].

As quitinases fúngicas podem ser detectadas através de ensaios no formato “high-

throughput screening” (triagem de alto desempenho-HTS), os quais permitem a prospecção da

atividade enzimática em grande número de amostras, com rápidos resultados sobre uma

determinada atividade biocatalítica dos fungos. Para detecção da atividade quitinolítica por fungos,

o substrato mais utilizado em trabalhos científicos é a quitina comercial pura, entretanto trata-se de

substrato de alto custo [4, 5, 6, 7].

Visando baratear os custos desta metodologia, alguns autores trabalharam com carapaça

de camarão tratada e triturada, como única fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento de

microrganismos produtores de quitinase [8, 9, 10, 11, 12]. Este substrato pode ser uma importante


73

ferramenta, quando se pretende otimizar e maximizar a produção da enzima, atingindo produção em

escala industrial [13].

Este trabalho teve como objetivo detectar a capacidade quitinolítica das espécies de fungos

isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone através do

desenvolvimento do meio de cultura para um rápido screening de culturas de fungos, utilizando

substrato de baixo custo.

2 Material e Métodos

Fungos

Foram testadas 41 espécies de fungos, isoladas de água de viveiros e do camarão

Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas fazendas no Rio Grande do Norte Brasil. As

espécies foram procedentes da Coleção de Culturas – Micoteca URM, do Departamento de

Micologia, da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil (Tabela 1).

Caracterização enzimática em meio sólido das amostras de fungos quanto à degradação da

quitina de diferentes procedências

As amostras dos fungos foram mantidas em ágar Czapeck (sacarose 30g, NaNO3 3g,

MgSO4 0,5g, KCl, 0,5g FeSO4 + 7H2O 0,01g, K2HPO4 1g, ágar 16g e água destilada 1000ml q.s.p.),

para Aspergillus e Penicillium e em BDA – Batata Dextrose Ágar (batata inglesa 140g, glicose 20g,

ágar 16g e água destilada 1000ml q.s.p.) [14], para os demais gêneros. Para caracterização

enzimática, fragmentos das culturas com sete dias de crescimento foram transferidos para o centro

de diferentes meios de cultura contidos em placas de Petri: Meio C+ (controle positivo) em que o

meio ágar Czapeck foi modificado pela substituição da sacarose, por glicose 10g l -1; Meio QC

(Quitina Coloidal), em que a sacarose do meio ágar Czapeck foi substituída por quitina coloidal

[15]; Meio CC (carapaça de camarão), contendo carapaça de camarão como única fonte de carbono

e nitrogênio (10g de carapaça de camarão, 16g de ágar e água destilada 1000ml q.s.p., pH 5,5) [12]

e Meio CC+S, contendo casca de camarão adicionada de sais (10g de carapaça de camarão,


74

K2HPO4 2,8g, KH2PO4 1,2g, MgSO4 2,0g, 16g de ágar e água destilada 1000ml q.s.p., pH 5,5). As

placas foram mantidas à temperatura ambiente e o diâmetro das colônias foi aferido após sete dias

para avaliar o crescimento das amostras fúngicas nos meios QC, CC e CC+S, com a finalidade de

comparar com os resultados obtidos no Meio C+. A taxa de crescimento das colônias nos meios

com quitina comercial (coloidal) e natural, comparada à do meio contendo glicose, foi calculada a

partir da fórmula TX= Q x 100/G, onde Q representa o diâmetro da colônia nos meio contendo

quitina, e o G o diâmetro da colônia em meio C+, que possui glicose como única fonte de carbono,

considerando ainda este diâmetro equivalente a 100% [16].

Para os cálculos da taxa de crescimento foram consideradas como capazes de produzir

quitinase, as amostras que apresentaram nos meios QC, CC e CC+S, colônias com diâmetro,

aspecto do micélio e esporulação iguais ou próximos aos obtidos no meio de glicose (Meio C+); e

não capazes as que não cresceram nos meios QC, CC e CC+S, ou aquelas que apresentaram

colônias com diâmetro equivalente, porém com micélio tênue e esporulação reduzida nestes meios

em relação ao Meio C+.

Caracterização enzimática em meio líquido das amostras de fungos quanto à degradação da

carapaça de camarão

Espécies que apresentaram maiores taxas de crescimento em meio CC+S foram

selecionadas para caracterização em meio líquido, contendo a mesma composição do meio, sem

adição do ágar, para evidenciar a degradação da carapaça do camarão. O pH do meio foi ajustado

para 5,5 com HCl 1N. Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio foram inoculados com 1 x

107 esporos mL-1 de suspensões em solução de NaCl adicionado de Tween 80 (0,1%), procedentes

de culturas com sete dias de crescimento, incubados a 120 rpm a 28 °C por 96 horas. Após este

período, as culturas foram analizadas visualmente quanto ao desaparecimento ou não da carapaça

comparando com o tempo zero. O conteúdo dos Erlenmeyers foi filtrado em seis camadas de gaze

esterilizada, sendo o filtrado considerado como extrato enzimático e analisado quanto ao teor de

proteínas [17] e de N-acetilglicosamina [18].


75

3 Resultados

Das 41 espécies de fungos testadas, 40 foram capazes de degradar quitina, contida nos três

meios sólidos testados, com exceção de Eurotium chevaliere que não apresentou crescimento em

nenhum dos meios testes (Tabela 2). Dentre as espécies, 26 (Absidia blakesleeana, Acremonium

fusidioides, Aspergillus caespitosus, A. fumigatus, A. japonicus, A. ochraceus, A. oryzae, A.

parasiticus, A. terreus, Aureobasidium pullulans var. pullulans, Cladosporium cladosporioides,

Cunninghamella elegans, Drechslera biseptata, F. moniliforme, Mucor hiemalis for. hiemalis, P.

commune, P. corylophilum, P. funiculosum, P. implicatum, P. janthinellum, P. lividum, P.

pinophilum, P. waksmanii, Phaeonellomyces wernekii, Rhynocladiela aquaspersa,

Syncephalastrum racemosum) apresentaram maior taxa de crescimento no Meio CC+S. Em 11

espécies (Alternaria alternata, A niveus, Fusarium lateritium, F. oxysporum, Paecilomyces variotii,

Pencillium aurantiogriseum, P. citrinum, P. decumbens, Pestalotiopsis guepinni, Phialophora

radicicola, Rhizopus oryzae), tanto no meio CC quanto no meio CC+S as taxas de crescimento

foram iguais, porém maiores que no meio QC. Apenas Aspergillus flavus e Rhodotorula glutinis,

apresentaram maior taxa de crescimento no meio CQ. Aspergillus flavipes apresentou a mesma taxa

de crescimento nos meios CQ e CC+S. Penicillium griseofulvum apresentou maior taxa de

crescimento no meio CC (Tabela 2).

Dentre as 26 espécies que apresentaram maior taxa de crescimento no meio sólido CC+S,

Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408, Penicillium

lividum URM5699, P. pinophilum URM5666, P. waksmanii URM5707 e Syncephalastrum

racemosum URM5499 foram aleatoriamente selecionados para verificar a capacidade de

degradação da carapaça do camarão em meio líquido. Penicillium pinophilum URM5666 e P.

waksmanii URM5707 degradaram parcialmente a carapaça do camarão. Entretanto, Aspergillus

fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408, Penicillium lividum

URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 degradaram completamente a carapaça do

camarão em suspensão (Figura 01, Tabela 2).


76

Na Tabela 2 constam os resultados da vizualização da degradação da carapaça do camarão

e os conteúdos de proteínas e de N-acetilglicosamina, no tempo zero e nos extratos enzimáticos. No

tempo zero o conteúdo protéico foi de 0,005mg/mL e não havia N-acetilglicosamina.

Figura 01. Caracterização quanto à capacidade de degradar a carapaça do camarão. A. Meio de fermentação; B. Meio de fermentação após filtração em gaze; C. Extrato enzimático após fermentação por 96 horas por Penicillium waksmanii URM5707 (degradação parcial); D. Extrato enzimático após fermentação por 96 horas por Syncephalastrum racemosum URM5499 (degradação total).

4 Discussão

Os resíduos provenientes da carcinicultura, principalmente as carapaças de camarões, têm

recebido maior atenção devido aos danos que causam ao meio ambiente, sendo as quitinases

fúngicas excelente alternativa para reciclagem destes resíduos. Além desta utilidade, quitinases

produzidas por fungos têm se tornado importantes ferramentas contra a ação de espécies fúngicas

fitopatogênicas. Wang et al. (2002b) [10], testaram a atividade antifúngica de cinco espécies de

Monascus contra o fitopatógeno Fusarium oxysporum, em meio contendo 1% de carapaça de

camarão triturada, confirmando a atividade antifúngica de todas as amostras testadas, porém foi

melhor evidenciada com a adição de 3% de sacarose ao meio de cultura. Os autores, ao analisarem

o antagonismo dos fungos, observaram drástica diminuição do micélio de F. oxysporum em

comparação com o de Monascus sp.

D CB A


77

A quitina comercial apresenta-se como um bom indutor para a produção de quitinase, já que

40 das 41 espécies testadas conseguiram degradá-la, entretanto as taxas de crescimento foram, na

maioria delas, mais baixas que as em meios com quitina natural, procedentes de carapaças de

camarão (Tabela 2).

Excelentes resultados de taxas de crescimento das colônias fúngicas foram obtidas no meio

CC+S, resultados semelhantes aos obtidos por Wang et al. (1997) [9], que testando a atividade

antifúngica de Pseudomonas aeruginosa K-187 contra 36 linhagens de fungos, observaram uma

máxima atividade inibitória quando a bactéria foi inoculada em meio constituído de 4,75% de

carapaça de camarão e caranguejo, carboximetil celulose 0,75%, K2HPO4 0,1%, MgSO4 7H2O

0,05%, NaCl 0,3%, extrato de levedura 0,35%, pH 6,0.

Embora a carapaça do camarão contenha pequena concentração de sais, o meio de cultura

CC+S (carapaça de camarão adicionada de sais) apresentou melhores resultados com maiores taxas

de crescimento das colônias analisadas, tanto em relação ao meio CQ, quanto em relação ao meio

CC (meio contendo apenas carapaça de camarão). As concentrações de sais adicionadas à carapaça

de camarão atuam de forma a induzir melhor produção e conseqüente liberação de quitinases,

evidenciada por maior taxa de crescimento do fungo.

Nem todas as espécies com bom crescimento no meio sólido contendo carapaça do camarão, sais e

ágar (CC+S) degradaram totalmente a carapaça suspensa neste mesmo meio líquido. Logo, sugere-

se que para selecionar fungos que degradem este substrato, além da primeira etapa de seleção em

meio sólido, deve ser utilizada uma segunda etapa de seleção em meio líquido, pois Penicillium

waksmanii URM5707 e P. pinophilum URM5666 degradaram parcialmente a carapaça do camarão

suspensa no meio líquido.

Todas as amostras foram capazes de liberar N-acetilglicosamina após 96 horas de

fermentação quando comparados ao tempo zero em que não foi detectado este carboidrato. Logo,

com o aumento da concentração de proteínas e a liberação de N-acetiliglicosamina no meio de

fermentação, podemos sugerir que houve produção de quitinase pelas amostras testadas. Algumas


78

amostras como Syncephalastrum racemosum URM5499 e Aspergillus fumigatus URM5410,

produziram menores concentrações de proteínas e maiores de N-acetil glicosamina e, como foi

obervada vizualmente a degradação total da carapaça suspensa no meio, sugere-se que a proteína

produzida tinha alta especificidade a quitina presente na carapaça.

Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408,

Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 estão sendo indicadas

como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina, podendo ser aplicadas em processos

biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura. Entretanto, A. fumigatus URM5410

e S. racemosum URM5499 provavelmente produzem enzimas com maior especificidade para

degradar estes resíduos.

O meio CC+S constitui importante alternativa na tentativa de diminuir custos laboratoriais,

bem como na obtenção de melhores resultados qualitativos, para a seleção de fungos com atividade

quitinolítica.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pelo financiamento da pesquisa.

5 Referências

1. Richard, A.G., 1951. The integument of arthropods, University of Minnesota Press,

Minneapolis.

2. Patil, R.S., Grormade, G., Deshpande, M.V., 2000. Chitinolytic enzyme: an exploration.

Enz. Microb. Tech., 2, 473-483.

3. Chang, W.T., Chen, C.S., Wang, S.L., 2003. An antifungal chitinase produced by

Bacillus cereus with shrimp and crab shell powder as a carbon source. Curr. Microbiol.,

47, 102-108.

4. Tweddel, R.J., Jabaji-Hare, S.H., Charest, P.M., 1994. Production of Chitinases and β‐

1,3-Glucanases by Stachybotrys elegans, a Mycoparise of Rhizoctonia solani. Appl.


79

Environ. Microbiol., 60(2), 489-495.

5. Escott, G.M., Hearn, V.M., Adams, D.J., 1998. Inducible chitinolytic system of

Aspergillus fumigatus. Microbiology+, 144, 1575-1581.

6. Matsuo, Y., Kurita, M., Park. J.K., Tanaka, K., Nakagawa, T., Kawamukai, M.,

Matsuda, H., 1999. Purification, Characterization and Gene Analysis of- N-

Acetylglucosaminidase from Enterobater sp. G-1. Biosci. Biotech. Bioch., 63 (7), 1261-

1268.

7. Giambattista, R. Di, Federice, F., Petruccioli, M., Fenice, M., 2001. The chitinolytic

activity of Penicillium janthinellum P9: purification, partial characterization and

potential applications. J. Appl. Microbiol., 91, 498-505.

8. Wang, S.L., Chang, W.T., Lu, M.C., 1995. Production of chitinase by Pseudomonas

aeruginosa K-187 using shrimp and crab shell powder as carbon source. Proc. Natl. Sci.

Counc. R.O.C. B, 19, 105-112.

9. Wang, S., Chang, W.T., 1997. Purification and characterization of two o bifunctional

chitinase lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a

shrimp and crab shell powder medium. Appl. Environ. Microbiol., 63, 380-386.

10. Wang, S.L., Yen, Y., Tsiao, W., Chang, W.T., Wang, C., 2002. Production of

antimicrobial compounds by Monascus purpureus CCRC31499 using shrimp and crab

shell powder as a carbon source. Enzyme Microb. Technol., 31, 337-344.


80

11. Wang, S.L., Shih, I., Liang, T.. Wang, C., 2002a. Purification and Characterization of

Two Antifungal Chitinases Extracellularly Produced by Bacillus amyloliquefaciens

V656 in a Shrimp and Crab Shell Powder Medium. Agric. Food Chem., 50(8), 2241-

2248.

12. Wang, S.L., Yen, Y., Tsiao, W., Chang, W.T., Wang, C., 2002b. Production of

antimicrobial compounds by Monascus purpureus CCRC31499 using shrimp and crab

shell powder as a carbon source. Enzyme Microb. Technol., 31, 337-344.

13. Coelho, R.R.R., Pires, R., 2008. Seleção de Actinomicetos Produtores de Enzimas de

Interesse Biotecnológico. In: Bon, E.P.S., Ferrara, M.A., Corvo, M.L. (Eds.), Enzimas

em Biotecnologia Produção, aplicações e Mercado. Editora Interciência, Rio de Janeiro.

14. Lacaz, C.S., Porto, E., Martins, J.E.C., Heins-Vaccari, E.M., Melo, N.T., 2002. Tratado

de Micologia Médica. Sarvier, São Paulo.

15. Roberts, W.K., Selitrennikoff, C.P., 1998. Plant and bacterial chitinases differ in

antifungal activity. J. Gen. Microbial., 134, 169-176.

16 Souza-Motta, C.M., Cavalcanti, M.A.Q., Fernandes, M.J.S.; Lima, D.M.M., Coimbra,

J.P., Laranjeira, D., 2003. Identification and characterization of filamentous fungi

isolated from the sunflower (Helianthus annus L.) Rhizophere according tho their

capacity hidrolyse inulina. B. J. Microbiology, 34(3), 273-280.

17 Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochemistry,

72, 248-254.


81

18 Reissig, J.L., Strominger, J.L., Leloir, L. F., 1955. A modified colorimetric method for

the estimation of N-acetylamino sugars. J. Biol. Chemistry, 217, 959-966.


82

Tabela 1. Taxa de crescimento (%) das espécies de fungos filamentosos isoladas da água de

viveiros e do camarão, em meios de cultura contendo quitina.

N º URM

Espécie Meio QC Meio CC Meio CC+S

5610 Absidia blakesleeana Lendn. 113,8 119,4 125

5409 Acremonium fusidioides (Nicot) W. Gams 90,9 104,5 113,6

5657 Alternaria alternata (Fr.) Keissler 96,7 116,1 116,1

5859 Aspergillus caespitosus Raper & Thom 83,3 102,7 113,8

5406 A. flavipes (Bain. and Sart.) Thom 85 50 85

5405 A. flavus Link 103,3 87 100

5410 A. fumigatus Fresenius 102,8 105,7 108,5

5723 A. japonicus Saito 102 104,1 106,2

5612 A. niveus Blochwitz 100 102,7 102,7

5661 A. ochraceus Wilhelm 100 90,3 106,4

5638 A. oryzae (Ahlb.) Cohn 93,9 100 109

5408 A. parasiticus Speare 100 75 112,5

5514 A. terreus Thom 90 76,6 100

5500 Aureobasidium pullulans var. pullulans

(de Bary) Arn.

95,4 100 104,5

5737 Cladosporium cladosporioides (Fres) de Vries 97,5 102,4 104,8

5656 Cunninghamella elegans Lendner 100 103 120

5704 Drechslera rostata (Drechsler) Richardson & Frazer

100 103,3 113,3

5624 Eurotium chevaliere L. Mangin 0,0 0,0 0,0

5697 Fusarium lateritium Nees 96,8 103,1 103,1

5411 F. moniliforme Wr. & Rg. 97 102,9 105,8

5739 Mucor hiemalis for. Hiemalis Schipper 90,9 109 120

5518 Paecilomyces variotii Bain. 97,8 102,1 102,1


83

Tabela 1 (Cont.)

a) 0= negativo; b) N º URM= número de registro Coleção de Culturas – Micoteca URM; c) Meio

QC= meio composto de quitina coloidal; d) Meio CC= meio composto de carapaça de camarão; e)

Meio CC+S= meio composto de carapaça de camarão adicionada de sais.

N º URM

Espécie Meio QC Meio CC Meio CC+S

5637 Penicillium aurantiogriseum Dierckx 94,7 102,6 102,6

5623 P. citrinum Thom 88 104 104

5407 P. commune Thom 103,2 112,9 119,3

5613 P. corylophilum Dierck. 96,1 115,3 123

5738 P. decumbens Thom 95,2 109,5 109,5

5519 P. funiculosum Thom 105 105 110

5670 P. griseofulvum Dierck. 100 106,6 71,3

5668 P. implicatum Biourge 96,4 89,2 107,1

5750 P. janthinellum Biourge 90 105 125

5699 P. lividum Westling 96,7 106,4 112,9

5666 P. pinophilum Hedgcock 92 100 120

5707 P. waksmanii Zaleski 93 100 122

5515 Pestalotiopsis guepinni (Desm.)Steyaert 96,7 103,2 103,2

5346 Phaeonellomyces wernekii (Horta) McGinnis et Schell

100 103,5 107,1

5713 Phialophora radicicola Cain 94 103,1 103,1

5430 Rhynocladiela aquaspersa Shell 100 107,1 114,2

5554 Rhizopus oryzae Went. & Prinsen Geere 98,2 105,3 105,3

5722 Rhodotorula glutinis (Fr.) Harrison 100 90 90

5499 Syncephalastrum racemosum (Cohn.) Scroet. 100 101,7 115,5


84

Tabela 2. Degradação da carapaça, conteudos protéico e de N-acetilglicosamina produzidos pelas

amostras de fungos, após 96 horas de fermentação em meio líquido contendo carapaça de camarão

adicionado de sais.

a) - = não detectado; b) DT= degradação total; c) DP= degradação parcial.

Amostras Degradação da Carapaça do

Camarão

Conteúdo Protéico

mg/mL

Conteúdo de N-acetilglicosamina

µg/mL Tempo zero - 0,005 0,000

Branco - 0,539 0,002

Aspergillus fumigatus Fresenius DT 0,007 0,021

A. niveus Blochwitz DT 0,018 0,021

A. parasiticus Speare DT 0,024 0,011

Penicillium lividum Westling DT 0,018 0,024

P. pinophilum Hedgcock DP 0,024 0,021

P. waksmanii Zaleski DP 0,045 0,027

Syncephalastrum racemosum (Cohn.) Scroet.

DT 0,009 0,024


85

5 DETECÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE AFLATOXINA B1 POR Aspergillus

flavus E A. parasiticus ISOLADOS DA ÁGUA DE VIVEIROS E DO CAMARÃO

LITOPENAEUS VANNAMEI BOONE, CULTIVADO EM DUAS FAZENDAS DO RIO

GRANDE DO NORTE, BRASIL

ARTIGO A SER SUBMETIDO A BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY


86

Detecção da capacidade de produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus

isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas

fazendas do Rio Grande do Norte, Brasil

Lidiane R. Cruz da Silvaa*, Hanilma da Silva Rodrigues a e Cristina M. Souza-Mottaa

aDepartamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,

Av. Prof. Nelson Chaves s/n, Recife, Pernambuco, Brasil, 50670-420.

*e-mails: [email protected]

[email protected] *Tel.: 81-2126-8948


87

Detecção da capacidade de produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus

isolados da água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, cultivado em duas

fazendas no NE do Brasil

RESUMO

Aflatoxinas são micotoxinas com potencial carcinogênico, provenientes do metabolismo

secundário de Aspergillus flavus e A. parasiticus, que podem comprometer a saúde do homem e

outros animais que consumirem alimentos contaminados. Os principais alimentos contaminados por

aflatoxinas são os grãos, como milho, soja, amendoim, trigo, dentre outros. Foram testadas 33

amostras de A. flavus e sete de A. parasiticus isolados de água de viveiros e de camarões

Litopenaeus vannamei cultivados em duas fazendas no RN, sendo uma com sistema de alimentação

orgânico e a outra com sistema de alimentação artificial, no qual os camarões são alimentados com

ração em cuja composição estão presentes grãos processados. Para detecção da produção de

aflatoxina B1 pelas amostras, discos de três mm de diâmetro das culturas foram transferidos para o

meio MAC (Meio de Ágar Côco) com pH ajustado para 6,9 e incubadas a 28ºC durante 6 a 7 dias.

A presença de aflatoxina B1 foi verificada observando-se a presença de um halo azulado a violeta

fluorescente observado no reverso da colônia nas placas quando foram submetidos a ondas longas

(365nm) de luz UV. Das 33 amostras de A. flavus e sete de A. parasiticus testadas, 21 e três

respectivamente, produziram aflatoxina B1. Todas as espécies produtoras de aflatoxina B1 foram

procedentes da água e dos camarões da fazenda com sistema de alimantação artificial, ou seja,

camarões alimentados com ração, podendo comprometer o sistema de cultivo, bem como vir a

prejudicar a saúde dos consumidores destes camarões.

Palavras-chave: Aflatoxinas, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, camarão.


88

INTRODUÇÃO

Aflatoxinas (AFLs) são micotoxinas provenientes do metabolismo secundário dos fungos

Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nominus (4, 25). Várias espécies de animais, inclusive os

seres humanos são sensíveis aos efeitos tóxicos das aflatoxinas que podem ser agrupados como

agudos, mutagênicos, neoplásicos e teratogênicos (9, 10). Pertencem a uma classe de compostos

denominados furanocumarinas e todas apresentam um núcleo cumarina associado com o furano e a

lactona (1). Existem vários tipos de aflatoxinas, dentre estas, destacam-se quatro, B1, B2, G1 e G2;

a biotransformação destas toxinas, em diversas espécies de animais, resulta na produção de

aflatoxinas M1 e M2, as quais foram isoladas inicialmente no leite e urina de animais que

consumiram alimentos contaminados por AFLs (17).

Os fungos toxigênicos podem contaminar os alimentos nas diferentes fases de produção e

beneficiamento, desde o cultivo até o transporte e armazenagem. Conforme relatado por Sabino

(22), o Brasil, por apresentar clima tropical, propicia condições ideais para a proliferação dos

fungos responsáveis pela produção de micotoxinas. Além disso, as condições inadequadas de

plantio, colheita, secagem, transporte e armazenamento de produtos agrícolas favorecem o

crescimento fúngico. No grupo das aflatoxinas, especial atenção deve ser dada à B1, por ser a de

maior incidência e a mais tóxica, provocando alterações orgânicas que levam a hemorragias através

da inibição dos fatores II e VII da coagulação sangüínea, além de lesões no hematócrito. A ingestão

de baixas quantidades por longo período determina baixa conversão alimentar nos animais,

imunodepressão e câncer hepático (26). Seus efeitos no homem são verificados através da ingestão

direta de alimentos contaminados derivados de animais que receberam ração contaminada (24).

O camarão branco Litopenaeus vannamei Boone é o mais cultivado em viveiros no Brasil.

Esta espécie possui hábito alimentar onívoro, necessitando de proteínas, lipídios, carboidratos,

vitaminas e sais minerais para a construção e manutenção de seus tecidos, bem como para o

suprimento de energia. Na grande maioria das fazendas de cultivo, os camarões são alimentados

com rações, compostas principalmente por grãos de milho e trigo triturados, aditivados com

proteínas, vitaminas e sais (16). Entretanto, uma fazenda no nordeste do Brasil cultiva seus

camarões sem adição de ração aos viveiros, alimentando-os com recursos naturais como algas e

pequenos crustáceos (6).

Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi detectar a capacidade de produção de

aflatoxina B1 por 33 isolados de Aspergillus flavus Link e sete de A. parasiticus Speare, isolados da

água e do camarão Litopenaeus vannamei Boone, produzido em duas fazendas do Rio Grande do

Norte, sendo uma com alimentação processada ou artificial (ração) e outra com alimentação

orgânica (pequenos crustáceos e algas).


89

MATERIAIS E MÉTODOS

Culturas de Aspergillus

Foram testadas 33 amostras de Aspergillus flavus e sete de A. parasiticus (Tabela 1).

Confirmação taxonômica

Após processo clássico de identificação das espécies isoladas, para confirmação taxonômica,

foi utilizado o meio ADM- Aspergillus Differential Medium (Triptona 15g, Extrato de levedura

10g, Citrato férrico 5g, ágar 16g) descrito por Bhotast e Fennel (4) que diferencia espécies do grupo

flavus. As culturas foram incubadas por 72 horas a 28oC, em estufa sem luz para visualização

macroscópica da presença da pigmentação amarela-laranja a amarelo-oliva no verso da colônia o

que confirmaria que os isolados pertenciam ao grupo flavus, pois A. flavus e A. parasiticus

produzem ácido aspergílico ou noraspergílico, que reagem com o citrato férrico amoniacal presente

no ADM, induzindo a formação de uma pigmentação amarelo-laranja no reverso das colônias.

Detecção da Produção de Aflatoxina B1

Após 2 ou 3 dias de crescimento no meio ADM foram retirados discos de 3 mm de

diâmetro das culturas e transferidos para o meio MAC (Meio de Ágar Côco) com pH ajustado para

6,9 [12] e incubadas a 28ºC durante 6 a 7 dias.

A presença de aflatoxina B1 foi verificada observando-se a presença de um halo azulado a

violeta fluorescente observado no reverso da colônia nas placas contendo o fungo crescido em meio

MAC quando foram submetidos a ondas longas (365nm) de luz ultravioleta em câmara escura

ultravioleta (Tecnal, modelo: TE-540).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todas as culturas analisadas macroscopicamente a presença da pigmentação amarela-

laranja a amarelo-oliva no verso da colônia o que confirmou que os isolados pertenciam ao grupo

flavus [4]. Das 40 amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus testadas, 20 apresentaram um halo

azul-violeta sob ondas de 365 nm – ultravioleta fluorescente (Figura 1), indicando produção de

aflatoxina B1, sendo 18 de A. flavus e duas de A. parasiticus (Tabela 1).


90

De acordo com os resultados, as amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de

água de viveiros e do camarão Litopenaeus vannamei alimentado com ração, em cuja composição

estão presentes grãos de milho e trigo, estão produzindo aflatoxina B1. Já as amostras de A. flavus e

A. parasiticus isoladas da água e do camarão alimentados de forma orgânica (sem ração), não estão

produzindo aflatoxina B1, o que sugere que a ração potencialize a produção de aflatoxina por estes

fungos (Tabela 2).

A ocorrência de aflatoxinas no Brasil tem sido observada com grande freqüência em

alimentos destinados ao consumo humano e animal . Caldas et al. (5) analisaram 366 amostras de

alimentos (amendoim cru e derivados, milho de pipoca, milho em grão e castanha do Pará)

consumidos no Distrito Federal e detectaram aflatoxinas em 19,6% das amostras, a AFB1 estava

presente em 98,5% das amostras positivas. Em Belo Horizonte [18] foi observada uma freqüência

de contaminação de 46,6% em amendoim e produtos derivados de amendoim. Levantamentos,

sobre os níveis de aflatoxinas encontrados em ingredientes para rações e em rações prontas, também

indicam um elevado potencial de amostras positivas, principalmente em rações prontas, sendo

descritos valores de 10,4 a 56,9% para estes produtos [20, 22, 23, 24], o que pode justificar a

produção de aflatoxina B1 por Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de água de viveiros e dos

camarões alimentados com ração.

Giacomini et al. (8) avaliaram o desempenho e plumagem de frangos de corte alimentados

com ração contaminada por aflatoxina B1 e observaram que as aves apresentaram sinais

característicos de intoxicação por aflatoxinas, como desuniformidade da estatura, redução no

consumo de ração e ganho de peso e alterações microscópicas e macroscópicas em órgãos e tecidos.

Observou-se que o coração e o fígado das aves intoxicadas apresentaram um incremento

significativo no peso médio relativo, a massa de penas foi reduzida significativamente (33,8%),

além de um baixo desempenho.

Figura 1: Culturas de Aspergillus flavus em meio MAC, crescidas por 6 dias a 28°C em estufa BOD. (A) positivo para a produção de aflatoxina B1; (B) negativo para produção de aflatoxina B1, sob luz ultravioleta – 365nm.

A B


91

Divakaran & Tacon (7), determinaram a quantidade de aflatoxina presente no músculo e

fezes de camarões Penaeus vannamei, alimentados com ração contaminada. Os camarões foram

alimentados com dietas contendo três níveis de aflatoxina B1 durante oito semanas. A presença de

AFB1 foi evidenciada apenas no músculo. Os autores concluíram que a toxicidade em seres

humanos através do consumo de camarões alimentados com ração contaminada é limitada.

Bintvihok et al. (2) analisaram 150 amostras de camarão tigre preto (Penaeus monodon),

das regiões leste e sul da Tailândia, alimentados com ração contaminada por aflatoxina B1 (AFB1).

Após os dez dias da dieta, os camarões foram pesados e sacrificados para exame laboratorial. No

músculo dos camarões dos grupos testados, não foram detectados AFB1 nem seus metabólitos,

porém a taxa de mortalidade dos camarões testados foi mais alta do que a dos camarões controle. Os

autores concluíram que em sistema de cultivo camarões alimentados com ração contaminada por

aflatoxina pode haver diminuição da produção, causando perdas econômicas.

Lopes et al. (13), avaliaram o efeito das aflatoxinas sobre o crescimento de alevinos de

jundiá (Rhamdia quelen) e sua deposição no fígado e no músculo de peixes alimentados com ração

com diferentes teores da micotoxina concluíram que concentrações de aflatoxinas superiores a 350 ppb

kg-1 presentes na ração de peixes acarretam deposição residual no fígado e nos músculos do animal,

ocasionado lesões no fígado dos mesmos.

As aflatoxinas caracterizam-se pela elevada toxicidade que apresentam. Em saúde animal,

várias espécies domésticas e de experimentação são sensíveis aos seus efeitos tóxicos agudos,

mutagênicos e carcinogênicos, sendo o fígado o principal órgão atingido [15] de modo análogo, em

saúde pública, as aflatoxinas são identificadas como fatores envolvidos na etiologia do câncer

hepático no homem, em conseqüência da ingestão de alimentos contaminados [18]. Lopez et al.

(14) analisaram amostras de sangue de 20, pacientes tratados em um hospital na Argentina, com

problemas hepáticos (hepatite, cirrose, dentre outros) e detectaram a presença de aflatoxina B1 em

apenas um paciente. Através de dados clínicos do paciente, concluíram que o mesmo adquiriu

aflatoxina B1 através de alimentação possivelmente contaminada.

Embora os camarões de ambas as fazendas estivessem aparentemente saudáveis, a

presença de Aspergillus flavus e A. parasiticus produtores de aflatoxina B1, em água de viveiros e

no camarão alimentado com ração, pode afetar a produtividade desta atividade aqüicola, bem como

significar um fator de risco para a população que consome camarão regularmente.


92

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 Araújo, J.M.A. Química de alimentos: teoria e prática. Imprensa Universitária,

UFV, Viçosa, 2006, 478p.

2 Bintvihok, A.; Ponpornpisit, A.; Tangtrongpiros, J.; Panichkriangkrai, W.;

Rattanapanee, R.; Doi, K.; Kumagai, S. Aflatoxin Contamination in Shrimp Feed

and Effects of Aflatoxin Addition to Feed on Shrimp Production. J. Food Prot.,

66(5): 882-885, 2003.

3 Bok, J.W.; Keller, N.P.; Lae, A. A regulator of secondary metabolism in

Aspergillus spp. Euk Cell., 3: 527-535, 2004.

4 Bothast, R.J.; Fennel, D.I. A medium for rapid identification and enumeration of

Aspergillus flavus and related organisms. Mycologia., 66: 365-369, 1974.

5 Caldas, E.D; Silva, S.C.; Oliveira, J.N. Aflatoxinas e ocratoxina A em alimentos

e riscos para a saúde humana. Rev. Saúde Pública., 36(3): 319-323, 2002.

6 Chellapa, N.T.; Lima, A.K.A.; Câmara, F.R.A. Riqueza de Microalgas em

Viveiros de Cultivo Orgânico de Camarão em Tibau do Sul, Rio Grande do

Norte. Rev. Bras. Bioc., 5(2), 120-122, 2007.

7 Divakaran, S.; Tacon, A.G.J. Studies on the Toxicity of Shrimp (Penaeus

vannamei) Fed Dietes Dosed with Aflatoxin B sub(1) to Humans. J. Aquatt.

Food Prod. Technol., 9(3): 115-120, 2000.

8 Giacomini, l.; Fick, F.A.; Dilkin, P.; Mallmann, C.A.; Rauber, R.H.; Almeida, R.

Desempenho e plumagem de frangos de corte intoxicados por aflatoxinas.

Ciência Rural, Santa Maria., 36(1): 234-239, 2006.

9 Groopman, J.D.; Cain, L.G.; Kensler, T.W. Exposure in human populations:

measurements and relationship to cancer. CRC Crit. Rev. Toxicol., 19: 113-145,

1992.

10 Harrison, J.C.; Carvajal, M.; Garner, R. Aflatoxine exposure in the United

Kingdom constitute cancer risk? Environ. Health Perspect., 99: 99-105, 1993.

11 Klich, M. A. Identification of common Aspergillus species. Centraalbureau vöör

Schimmelcultures, 2002, p.116.


93

12 Lin, M.T.; Dianese, J.C. A coconut-ágar medium for rapid detection of aflatoxin

production by Aspergillus spp. Phytopathology., 66: 1466-1469, 1976.

13 Lopes, P.R.S.; Neto, J.R.; Mallmann, C.A.; Lazzari, R.; Pedron, F.A.;

Veiverberg, C.A. Crescimento e alterações no fígado e na carcaça de alevinos de

jundiá alimentados com dieta com aflatoxinas. Pesq. agropec. bras., 40 (10):

1029-1034, 2005.

14 Lopez, C.; Ramos, L.; Bulacio, L.; Ramadan, S.; Rodriguez, F. Aflatoxin B1

content in patientes with hepatic diseases. Medicina., 62(4): 313-316, 2002.

15

Mclean, M.; Dutton, M.F. Cellular interactions and metabolism of aflatoxin: an

update. Pharmacol Ther., 65: 163-192, 1995.

16 Mendes, P.P.; Albuquerque, M.L.L.T.; Queiroz, D.M.; Santos, B.L.S.; Lima,

A.C.; Lopes, Y.V.A. Aclimatação do camarão marinho Litopenaeus vannamei

(Boone, 1931) à água doce com diferentes estratégias de alimentação e calagem.

Acta Sci. Anim. Sci., 28(1): 89-95, 2006.

17 Oliveira, C.A.F.; Germano, P.M.L. Aflatoxinas: conceitos sobre mecanismos de

toxicidade e seu desenvolvimento na etiologia do câncer hepático celular. Rev.

Saúde Pública., 31(4): 417-424, 1997.

18 Oliveira, M.S.; Prado, G.; Abrantes, M.F.; Santos, L.G.; Veloso, T. Incidência de

aflatoxinas, desoxinivalenol e zearalenona em produtos comercializados em

cidades do estado de Minas Gerais no período de 1998-2000. Rev. Inst, Adolfo

Lutz, 2002. 61(1): 1-6, 2000.

19 Osweiler, G.D. Mycotoxins and livestock: what role do fungal toxins play in

illness and production losses? Vet. Med., 85: 89-94, 1990.

20 Ribeiro, J.M.M. Toxigenic mycroflora and mycotoxins (aflatoxins and

ochratoxin A) in poultry feed in Rio de Janeiro, Brasil. International Symposium

on Mycotoxins and Phycotoxins, Guarujá, 2000, p.133.

21 Ritter, A.C.; Noll, I.B. Diferentes pré-inóculos, temperaturas e tempos de

incubação na produção de aflatoxina B1 em arroz. Ciência Rural, Santa Maria,

Online, 2008.


94

22 Sabino, M. Ocorrência e métodos analíticos para determinação de micotoxinas

em grãos e rações. Simpósio Internacional Sobre Micotoxinas e Micotoxicoses

em Aves, Curitiba, 1995. p. 35-47.

23 Santurio, J.M. Aflatoxinas, ocartoxina A e zearalenona em grãos e rações

destinadas ao consumo animal no sul do Brasil. Encontro nacional de

micotoxinas, São Paulo, 1992, p.14.

24 Santurio, J.M. Micotoxinas e Micotoxicoses na Avicultura. Rev. Bras. Cienc.

Avic., 2(1), 2000, p. 1-12.

25 Yu, J.; Cleveland, T.E.; Nierman, W.C.; Bennett, J.W. Aspergillus flavus

genomics: gateway to human and animal health, food safety, and crop resistence

to diseases. Rev. Iberoam. Micol., 22: 194-202, 2005.

26 Zlotowski, P.; Corrêa, A.M.R., Rozza, D.B.; Driemeier, D.; Mallmann, C.A.;

Migliavacca, F.A. Surto de aflatoxicose em suínos no estado do Rio Grande do

Sul. Pesq. Vet. Bras., out./dez., 24(4): 207-210, 2004.


95

Tabela 1. Número de amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus testadas quanto à capacidade

de produzir aflatoxina B1.

FAZENDA INORGÂNICA

FAZENDA ORGÂNICA

TOTAL

Água de viveiros

Camarão Água de viveiros

Camarão

Aspergillus

flavus

13 6 11 03 33

Aspergillus

parasiticus

02 - 03 02 07

TOTAL 15 06 14 05 40


96

Tabela 2. Detecção da produção de aflatoxinas pelas amostras de Aspergillus flavus e A. parasiticus

isoladas da água dos viveiros e dos camarões das duas fazendas no Rio Grande do Norte, Brasil.

(+)= positivo; (-)= negativo; Fazenda I= camarões alimentados com ração; Fazenda II= camarões alimentados com algas e pequenos crustáceos.

Nº Espécie Substrato Fazenda Detecção da produção de aflatoxina

1 Aspergillus flavus Água I +

2 A. flavus Água I + 3 A. flavus Água I + 4 A. flavus Água I - 5 A. flavus Água I + 6 A. flavus Água I + 7 A. flavus Água I + 8 A. flavus Água I + 9 A. flavus Água I + 10 A. flavus Água I + 11 A. flavus Água I + 12 A. flavus Água I + 13 A. flavus Água I + 14 A. flavus Camarão I + 15 A. flavus Camarão I + 16 A. flavus Camarão I + 17 A. flavus Camarão I + 18 A. flavus Camarão I + 19 A. flavus Camarão I + 20 A. flavus Água II - 21 A. flavus Água II - 22 A. flavus Água II - 23 A. flavus Água II - 24 A. flavus Água II - 25 A. flavus Água II - 26 A. flavus Água II - 27 A. flavus Água II - 28 A. flavus Água II - 29 A. flavus Água II - 30 A. flavus Água II - 31 A. flavus Camarão II - 32 A. flavus Camarão II - 33 A. flavus Camarão II - 34 A. parasiticus Água I + 35 A. parasiticus Água I + 36 A. parasiticus Água II - 37 A. parasiticus Água II - 38 A. parasiticus Água II - 39 A. parasiticus Camarão II - 40 A. parasiticus Camarão II -


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6. CONCLUSÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:

Em viveiros de camarão são encontradas espécies de fungos anamorfos (Deuteromycota) e

Ascomycota;

Aspergillus e Penicillium são os gêneros mais freqüentes com maior número de espécies,

tanto na água quanto em camarões cultivados em viveiros;

Aspergillus flavus ocorre em água de viveiros de camarões jovens, água de camarões

adultos, bem como nos camarões adultos, que se alimentam através de ração e nos que se

alimentam de algas e pequenos crustáceos;

Em camarões cultivados em viveiros são encontradas espécies de fungos relatadas como

agentes de micoses em humanos;

Aspergillus flavus e A. parasiticus isolados de água de viveiros e dos camarões alimentados

com ração possuem o seu metabolismo secundário ativado para a produção de aflatoxina

B1;

A maioria das espécies de fungos presentes em viveiros criadouros de camarão possui

capacidade proteolítica e/ou quitinolítica;

Para selecionar fungos que degradem a carapaça do camarão, além de uma primeira etapa de

seleção em meio sólido, deve ser utilizada uma segunda etapa de seleção em meio líquido;

Aspergillus fumigatus URM5410, A. niveus URM5612, A. parasiticus URM5408,

Penicillium lividum URM5699 e Syncephalastrum racemosum URM5499 estão sendo

indicadas como excelentes decompositoras de resíduos ricos em quitina, podendo ser

aplicadas em processos biotecnológicos para o tratamento de resíduos da carcinicultura.

O meio CC+S (carapaça de camarão adicionada de sais) constitui uma importante

ferramenta para a detecção da capacidade quitinolítica por fungos.

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LIDIANE ROBERTA CRUZ DA SILVA - UFPE...Silva, Lidiane Roberta Cruz da Fungos isolados de cultivos do camarão Litopenaeus vannamei Boone e caracterização quanto a produção de quitinase,