Biognius

(kit para aulas prticas de Biologia Molecular no Ensino Secundrio)

Manual do utilizador

1

NDICE ndice 1 Introduo 2 Modo de utilizao do manual 3 Contedos do kit 4 Experincia 1 5

Parte 1 - Extraco de DNA genmico 5 Introduo 5 Material necessrio 5 Material Opcional 5 Protocolo experimental 6 Proposta de Experincia 8 Experincia 2 (Conformao de Plasmdeos) 10 Introduo 10 Material necessrio 11

Protocolo experimental 11 Resultados Esperados 11 Experincia 3 (CSI: Fraude canina?) 13 Introduo 13 Material Biolgico 14 Protocolo Experimental 14 Resultados 14 Perguntas 15 Electroforese em gel de agarose 16 Material Necessrio 16 Preparao da Electroforese 16 a) Preparao das Solues 16 b) Preparao do Gel 18 c) Aplicao das Amostras 19 d) Condies de Electroforese 20 e) Colorao do Gel 21 Figuras 22 Crditos e Contactos 32

2

Introduo O kit Biognius o resultado de uma colaborao longa e frutuosa entre professores de Biologia do ensino secundrio e investigadores da rea da biologia molecular de diversas instituies, no mbito de uma parceria com a Ordem dos Bilogos.

O principal objectivo foi o de fazer chegar aos professores um conjunto de materiais que lhes permitam realizar aulas prticas direccionadas para o programa de Biologia do 12 ano, nomeadamente no captulo da Biotecnologia, que sejam didcticas, motivadoras e que permitam a participao activa de todos os alunos.

A principal preocupao foi a de fazer chegar esse material a

todas as escolas do pas, permitindo que um docente possa realizar estas experincias independentemente de existirem ou no infraestruturas laboratoriais disponveis (laboratrios, bancadas, equipamento, material descartvel, etc.). Na realidade, para a realizao de todas as experincias deste kit, um professor necessita apenas de gua destilada e de um forno microondas ou pequeno fogo para banho-maria.

Adicionalmente, foi um objectivo deste projecto conceber um kit que proporcionasse escola uma base de equipamento simples, eficaz e pouco dispendioso que possa ser utilizado ano aps ano, num sistema aberto que possa ser utilizado com recargas disponveis de reagentes ou material biolgico preparado pelos professores.

O presente manual disponibiliza toda a informao para a realizao das experincias. Para qualquer informao adicional desejada so disponibilizados contactos que podem funcionar como uma help desk para os docentes e formadores.

Este material foi testado em Escolas Secundrias de todo o pas

nos ltimos dois anos por professores e alunos de Vinhais a Almodvar, de Bragana a Faro. A todos os envolvidos, os nossos agradecimentos. Aos novos utilizadores, os nossos votos de sucesso.

Jos Matos (coordenador do Projecto)

3

Modo de utilizao do Manual

O presente kit inclui 3 experincias diferentes:

Experincia 1:

Parte 1 - Extraco de DNA genmico Parte 2 - Proposta de Experincia: O DNA parte-se?

Experincia 2:

Conformao de plasmdeos Experincia 3:

CSI: Fraude canina?

Para cada experincia so fornecidos protocolos detalhados que podem ser fornecidos directamente aos alunos ou adaptados pelo professor ao calendrio de aulas particular. Todas as experincias incluem um passo de electroforese em gel de agarose. A preparao do gel de agarose, solues tampo, marcadores, colorao do gel, etc. so passos comuns a todas as experincias, pelo que so apresentados em separado. Nas figuras so apresentadas diversas fotos ilustrativas dos vrios processos, que podem auxiliar a compreenso das experincias. So ainda fornecidas propostas de questionrios para os alunos que, igualmente, podero ser utilizadas como tal ou adaptadas s necessidades particulares.

4

CONTEDOS DO KIT: 1 Tubo com etanol (~20 mL) 1 Tubo com agarose (~4 g, suficiente para 400 mL, cerca de 16

gis de electroforese) 1 Tubo tampo TBE 10X (~40 mL, suficiente para 400 mL de

soluo 1X) 1 Tubo tampo TE (~5 mL, para a 1 experincia) 1 Saco de pontas de pipeta amarelas 1 Saco de microtubos tipo eppendorf 1 Seringa 5 Pilhas de 9V/(Ou carregador) 1 Placa de Petri 1 Tina de electroforese 1 Pente para a tina 1 Tabuleiro para a tina 2 Cabos de ligao (preto e vermelho) 1 CD (com Manual de Instrues) 1 Caixa de reagentes contendo: 1 tubo de clulas bacterianas 1 tubo Marcador (transparente, 50 L) 1 tubo DNA plasmdico digerido (verde, 35 L) 1 tubo DNA plasmdico (transparente, 35 L) 1 tubo DNA da me (cor-de-rosa; 35 L) 1 tubo DNA pai possvel 1 (azul, 35 L) 1 tubo DNA pai possvel 2 (amarelo; 35 L) 1 tubo DNA filho (verde; 35 L) 1 tubo corante (30 mg) 1 tubo SDS 10% (em gua; 800 L) 1 tubo tampo de aplicao (50 L)

5

Experincia 1:

Parte 1 - Extraco de DNA genmico

Introduo:

Nesta experincia os alunos tero possibilidade de visualizar DNA genmico com um grau de pureza substancialmente mais elevado do que aquele que normalmente fazem nas aulas, vulgarmente a partir de extractos de cebola, morango ou kiwi. Alm disso, esta experincia no termina com a visualizao do DNA. Os alunos podero, posteriormente, analisar, manipular e visualizar o DNA atravs de electroforese em gel de agarose, utilizando este kit.

Para esta experincia foi utilizada uma estirpe de bactrias E. coli, (obviamente no patognica), cultivada em meio lquido rico, com agitao moderada a 37 C. Aps 24 horas a cultura foi centrifugada a 10 000 rpm durante 10 minutos. As clulas recolhidas no fundo do tubo esto includas no kit (tubo clulas bacterianas). A extraco poder ser realizada previamente ou durante as aulas com os alunos. (Nota: a segunda parte desta experincia pode ser tambm realizada com DNA extrado a partir de qualquer outro material biolgico e/ou com mtodos de isolamento alternativos, por exemplo o DNA extrado a partir de morango ou kiwi, pelos mtodos rudimentares convencionais.)

Material necessrio (enviado no kit): - Tubo com Clulas bacterianas (tubo tipo Falcon de cerca de

20 mL) - SDS 10% (sodium dodecil sulphate/dodecil sulfato de sdio, em

gua) - Tampo TE (Tris-EDTA, Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0; EDTA a

1 mM) - Etanol (EtOH) Material opcional:

- Placa de Petri (enviada) - Ponta de pipeta amarela (enviada) - Tubos de microcentrfuga tipo Eppendorf (enviado) - Pipeta de Pasteur de vidro (no enviada)

6

Protocolo experimental:

1 - Ressuspender as clulas em 2,5 mL de tampo TE

Pipetar cerca de 2,5 mL de tampo TE para dentro do tubo (pode utilizar uma pipeta normal do laboratrio ou medir com um copo de vidro pequeno, ou simplesmente verter metade do volume fornecido (~5 mL)), fechar o tubo com a tampa e ressuspender por inverso do tubo na mo vrias vezes (alguns minutos) suavemente, at a suspenso ficar homognea (No agitar vigorosamente, o que provoca formao de espuma)

2 - Adicionar 300 L de SDS

Utilizar a seringa e uma ponta amarela. Inverter como no passo anterior e deixar a incubar durante cerca de 20 minutos temperatura ambiente, com agitao ocasional do tubo.

3 - Adicionar 5 mL de lcool

Adicionar etanol no dobro do volume do tampo TE (2 x 2,5 mL = 5 mL), agitar suavemente invertendo o tubo algumas vezes. Imediatamente se ver o DNA precipitado, de cor branca e aspecto viscoso.

NOTA: No passo de adicionar o etanol convm que todos os alunos prestem ateno, porque o surgimento do DNA precipitado imediato. Se as clulas forem frescas, o DNA aparece num novelo. De as clulas forem velhas (mais de 1 ms) provavelmente o DNA aparece em flocos brancos dispersos.

4 - Retirar o DNA precipitado no tubo

O DNA dever ser retirado do tubo com um material estril. Ou com uma ponta de pipeta amarela (fornecida) ou com uma pipeta de Pasteur de vidro com a ponta previamente dobrada em forma de anzol num bico de Bunsen/lamparina (por exemplo).

Alternativamente, o contedo do tubo pode ser vertido para dentro da placa de Petri (fornecida) e da retirado para um tubo de microcentrfuga novo.

5 Evaporar o etanol ao ar

7

J no tubo novo, este deve ser mantido aberto para deixar evaporar o etanol. Quando o DNA estiver seco, ressuspender em cerca de 100-250 L de tampo TE e agitar suavemente at o DNA ficar totalmente dissolvido no tampo (a soluo ficar bastante viscosa, tanto mais viscosa quando maior for a quantidade de DNA extrado).

Esse DNA pode ser recuperado do tubo e utilizado para um

variado nmero de experincias. Aqui, em seguida, proposta uma delas.

8

Parte 2 - Proposta de Experincia: O DNA parte-se? Introduo

O objectivo desta experincia o de sujeitar o DNA a diferentes condies de armazenamento e analisar o seu efeito na integridade da molcula de DNA. Material necessrio: - DNA extrado no passo anterior - Tubos tipo eppendorf - seringa - pontas amarelas - tampo de aplicao

Protocolo experimental:

O DNA recolhido no passo anterior dever ser dividido por vrios tubos, cada um distribudo a um grupo de alunos, ficando um dos tubos no laboratrio da escola (por exemplo 5 grupos formados, dividindo o DNA extrado por 6 tubos, cada um com 30-50 L cada um).

Cada grupo dever levar o seu tubo de DNA para casa sujeitando-o a diferentes condies de armazenamento. Por exemplo: Grupo 1: Armazenar o DNA no frigorfico a 4 C Grupo 2: Armazenar o DNA no congelador a -20 C

Grupo 3: Abrir o tubo e adicionar-lhe umas gotas de saliva Grupo 4: Submeter o DNA a alguns segundos no microondas

Grupo 5: Ferver o DNA durante alguns minutos em banho-maria

Alternativas:

- congelar e descongelar vrias vezes; - macerar um pouco do precipitado de DNA antes de o

colocar em suspenso; - ferver e depois colocar no gelo (versus ferver e no

colocar no gelo.

9

NO ESQUECER: Deixar uma amostra de DNA no laboratrio, sem submeter a qualquer processo, para utilizao como controlo negativo. Na aula seguinte, os alunos devero trazer o seu tubo e identificar qual o mau-tratamento a que submeteram a amostra.

1 - De todas as amostras (aquelas trazidas de casa e o controlo) deve ser retirada uma fraco de cerca de 10 L para um novo tubo e adicionado cerca de 5 L de tampo de aplicao (lquido azul) para dar densidade e permitir a sua visualizao, para posterior anlise em electroforese em gel de agarose

(Ver Protocolo de: Electroforese em gel de agarose)

Resultados esperados: O DNA genmico, quando analisado em gel de agarose, aparece com um aspecto de cauda de cometa, sendo a cauda tanto mais comprida e tanto mais baixa quanto maior for o grau de degradao do DNA. Assim, tratamentos mais violentos para o DNA iro desnatur-lo e/ou fracturar a sua molcula em fragmentos mais pequenos, originando uma cauda que corre mais baixo no gel.

10

Experincia 2:

Conformao de plasmdeos

Introduo: Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA circular fechado, que se encontram em clulas de microrganismos (por exemplo bactrias e leveduras) e que tm capacidade de replicao autnoma (independente da replicao do DNA cromossmico do organismo). O seu tamanho varivel, podendo atingir centenas de milhares de bases (megaplasmdeos). Todavia, os plasmdeos que so utilizados como vectores de transporte de inseres de DNA estranho (foreign DNA) para o interior das clulas tm normalmente uma dimenso muito pequena para facilidade de manipulao (2-5 kpb). As trs caractersticas principais de um plasmdeo para poder ser utilizado como vector so:

- Possuir uma origem de replicao que lhe permita replicar autonomamente (podem existir centenas de cpias de um plasmdeo numa clula).

- Possuir uma sequncia nica que seja reconhecida por uma dada enzima de restrio (para que seja possvel cortar o DNA num nico local, permitindo a linearizao do DNA circular e posterior insero do DNA estranho)

- Possuir um gene de seleco que permita diferenciar as clulas que incorporaram o plasmdeo daquelas que no o fizeram (normalmente um gene de resistncia a um antibitico. Deste modo, aps a transformao, as clulas so plaqueadas em meio contendo esse antibitico e apenas aquelas que se desenvolverem em colnias nesse meio tero incorporado o vector que lhes conferiu resistncia)

Nesta experincia vamos utilizar, alternativamente, um de dois plasmdeos muito comuns em Biologia Molecular: pUC18 (ver mapa, Figuras 2 e 3) com 2686 pb (pares de bases) de comprimento OU pCR2.1 (ver mapa, Figura 4) com 3900 pares de bases.

11

Material necessrio - DNA plasmdico (tubo transparente) - DNA plasmdico digerido (tubo verde) - Marcador (tubo transparente)

Protocolo experimental: So fornecidos no kit amostras de plasmdeo normal (DNA plasmdico, tubo branco) e plasmdeo digerido (DNA plasmdico digerido) tubo verde. A experincia consiste em calcular o tamanho aproximado do plasmdeo e analisar a sua conformao atravs de electroforese em gel de agarose (Ver abaixo: Electroforese em gel de agarose). Para tal, os alunos tero que

1 - Preparar uma electroforese em gel de agarose (ver protocolo, pg 16)

2 - Aplicar uma amostra de cada um dos plasmdeos (digerido

e no digerido) em pistas diferentes e uma amostra de marcador num poo adjacente

3 - Separar os fragmentos por electroforese 4 - Corar o gel 5 - Avaliar o peso molecular do plasmdeo por comparao

com o peso molecular das bandas (conhecidas) do marcador (ver figuras 5 e 19).

6 - Explicar a existncia de vrias bandas no plasmdeo no

digerido Resultados esperados: Marcador: O marcador constitudo por 3 bandas (ver foto 5) de 3000, 1000 e 500 pares de bases, respectivamente. Em alguns casos ser ainda visvel uma 4 banda de cerca de 2000 pares de bases.

12

O DNA plasmdico digerido (linearizado) apresentar uma banda nica situada entre as bandas do marcador de 3000 e de 1000 pb, revelando que o plasmdeo ter um tamanho prximo dos 2500 (caso o kit contenha pUC18) OU acima da banda de 3000 pb, revelando que o plasmdeo ter um tamanho prximo dos 4000 (caso o kit contenha pCR2.1). Numa verso mais sofisticada podero medir as distncias de migrao das bandas do marcador, fazer uma representao grfica em papel semi-logartmico entre os pesos moleculares e a distncia de migrao, calcular a distncia de migrao do plasmdeo e extrapolar o seu tamanho de uma forma mais aproximada. Todavia, o plasmdeo normal (no digerido) apresentar vrias bandas, nenhuma delas prximo da banda respectiva do plasmdeo linearizado (2600 pb/4000 pb). Uma(s) estaro mais acima, outra(s) mais abaixo. Porqu? A razo tem a ver com o facto de o plasmdeo no digerido no se comportar no gel de modo igual a um fragmento linearizado. Na verdade, o plasmdeo (DNA circular fechado) pode tomar vrias conformaes distintas, desde a sua forma mais relaxada at forma enrolada ou super-enrolada (supercoiled). (Ver figura 19). Na forma relaxada ter mais dificuldade de atravessar a malha da agarose, por isso formar uma banda mais acima do gel (mais prxima do poo). Na conformao super-enrolada, migrar mais facilmente do que a forma linearizada, originando banda(s) mais abaixo.

13

Experincia 3:

CSI: Fraude canina?

Introduo: Esta experincia pretende ser uma introduo rea do DNA fingerprinting e da utilizao de marcadores genticos em cincias forenses, atravs dos quais possvel identificar/excluir um potencial suspeito. Aproveitando a popularidade das sries televisivas norte-americanas CSI Miami/SCI NY, etc., podem designar este trabalho como CSI Lisboa, CSI Mogadouro, etc. Tentando afastar a utilizao de casos (hipotticos) humanos, foi criada a seguinte situao: O Sr. Alo comprou um co a um criador de uma raa muito apreciada. Querendo um animal de grande qualidade, sem olhar a custos, pediu ao criador que lhe vendesse o melhor co da sua explorao. O criador vendeu-lhe um co garantindo que o pai era um co da sua explorao, campeo nacional em exposies. Imensamente feliz, o Sr. Alo levou para casa um belo cachorro que em breve se desenvolveu num co adulto nada parecido com o seu pai, sem aquele porte altivo nem caractersticas de campeo. Admitindo a hiptese de ter sido ludibriado, o Sr. Alo voltou explorao, recolheu amostras de plo da me, do alegado pai, campeo, mas tambm de um outro macho adulto daquela raa que partilhava o canil, e que poderia muito bem ser ele o verdadeiro pai, pois no partilhava as caractersticas de porte e pujana do afamado co e tinha fortes semelhanas com o animal adquirido. Tendo assim amostras de plo dos dois putativos pais, da me e do filho (o seu prprio co), o Sr. Alo pediu a um geneticista molecular que corresse uma bateria de testes com marcadores genticos, que permitissem identificar a paternidade do seu animal. No laboratrio, os tcnicos extraram DNA dos plos de cada um dos animais (em extraces totalmente separadas, de modo a evitar

14

cruzamento das amostras), e amplificaram, pela tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction/Reaco da Polimerase em Cadeia) um fragmento especfico de candeos (e bastante polimrfico) que pode originar dois alelos diferentes (heterozigotia) ou iguais (homozigotia) em cada um dos indivduos. Os produtos dessas amplificaes esto agora nas vossas mos para poderem analisar por electroforese em gel de agarose (ver protocolo: Electroforese em gel de agarose) a eventual paternidade dos indivduos analisados. Material biolgico: DNA da me (tubo cor-de-rosa) DNA do pai possvel 1 (tubo azul) DNA do pai possvel 2 (tubo amarelo) DNA do filho (tubo verde) Marcador (tubo transparente) NOTA: Os DNAs j vm com tampo de aplicao (azul) pelo que s necessrio aplicar as amostras no gel, a partir dos tubos indicados acima. Protocolo experimental:

1 - preparar uma electroforese em gel de agarose (ver protocolo)

2 - aplicar uma amostra (10 L) de cada um dos materiais biolgicos fornecidos (Me, pai 1, pai 2, filho) em pistas diferentes e uma amostra de marcador num poo adjacente (o marcador opcional).

3 Separar os fragmentos por electroforese 4 Corar o gel 5 - Registar as bandas. 6 Analisar os resultados

Resultados:

Para facilidade, diremos que tanto a me como um dos pais putativos so homozigticos para este marcador, pelo que s apresentam uma banda. O filho ser heterozigtico, apresentando duas bandas. Uma vinda da me e outra do pai. Como h certeza sobre a me, uma das bandas do filho ser automaticamente

15

identificada. O outro alelo (a outra banda) ter que vir do pai. Falta ento identificar qual dos potenciais pais possui um alelo igual ao do filho. Tendo a me dois alelos de 1000 pares de bases (homozigtica), o filho ter obrigatoriamente esse fragmento. O filho ter outro fragmento de 600 pb. Como apenas um dos possveis pais possui a banda de 600 pb, esse pai compatvel com a paternidade. O outro NO pode ser o verdadeiro pai, uma vez que homozigtico para a banda a 3000 pb, no tendo o filho nenhuma banda desse tamanho. O professor seleccionar qual das situaes deseja contemplar: Ausncia de fraude: o campeo nacional o pai verdadeiro Presena de fraude: o campeo nacional no o pai verdadeiro

Perguntas: - Dos quatro intervenientes, quais so homozigticos e quais so

heterozigticos? - Qual dos dois pais poder ser excludo? - Podemos dizer que o outro co de certeza absoluta o pai? - Em relao ao animal que foi excludo, podemos dizer que, de

certeza absoluta, no ele o pai?

As questes acima destinam-se a contemplar a seguinte situao, comum a todos os testes de genotipagem:

Se o filho no tem um perfil compatvel com a paternidade,

ento podemos afirmar, com toda a certeza, que aquele possvel pai NO PODE ser o verdadeiro pai.

Todavia, se o filho tem um perfil compatvel com a paternidade,

apenas essa afirmao que pode ser feita. Ou seja, que este animal PODE SER pai daquele co, no sendo possvel garantir que o seja, porque qualquer outro co com aquele perfil compatvel poderia ser o verdadeiro pai. Apenas em populaes confinadas no espao (por exemplo peixes num aqurio, bovinos numa vacaria, etc.), sem hipteses de contacto com o exterior e em que tenham sido genotipados TODOS os machos em idade de reproduo, apenas nesse caso se poderia afirmar que aquele pai seria o nico pai possvel.

16

Electroforese em gel de agarose NOTA: O tabuleiro e o pente da tina de electroforese esto cobertos por uma pelcula aderente para proteco do plstico (branca com ou sem letras no caso dos tabuleiros e verde no caso dos pentes). Essa pelcula DEVE SER REMOVIDA antes da utilizao destes componentes)

Material necessrio:

Para a tina de electroforese:

Tina (com tampa) Tabuleiro Pente Elctrodos (fio vermelho e fio preto) 5 pilhas de 9 V/OU carregador Fita cola (no fornecida)

Para as solues:

Tampo TBE (10x) Agarose gua (no fornecida. Usar gua destilada ou a gua mais pura a que tiver acesso)

Para as amostras:

Tampo de aplicao Seringa Pontas amarelas DNA das experincias anteriores (1, 2 e 3)

Preparao da electroforese:

a) Preparao das solues

O gel de agarose tem que ser preparado em tampo TBE a 0,5 x. O tampo fornecido vem concentrado 10 x, portanto ter que ser diludo 1:20 na gua mais pura que tiverem (gua destilada, gua bidestilada, gua Mili-Q, etc.). Se no tiverem acesso a gua qumica e bacteriologicamente pura, pode ser utilizada gua da torneira, embora com piores resultados.

17

Para um gel necessrio cerca de 40-50 mL de tampo. Para cobrir o gel de uma tina necessrio cerca de 100 mL, o que significa que por cada experincia necessitaro no mximo de 150 mL. Mas podem preparar logo uma maior quantidade (por exemplo, 500 mL). Se a gua tiver boa qualidade e for estril, a soluo pode manter-se estvel durante longos perodos. O tampo enviado est concentrado 10 x. Para uma soluo de 0,5 x pode proceder-se seguinte diluio: Tampo TBE: Tampo TBE 10 X 20 mL gua destilada estril 380 mL Volume final 400 mL

Agitar para homogeneizar a soluo (por exemplo colocando a

soluo num frasco com rolha hermtica e invertendo o frasco vrias vezes).

Aps utilizao, o tampo deve ser mantido em frasco rolhado

temperatura ambiente. Se, aps longos perodos sem utilizao, a soluo ficar contaminada com fungos ou outros microrganismos, descartar e preparar nova soluo. Agarose

A soluo de agarose deve ser preparada em tampo TBE 0,5 x (NOTA: no preparar a agarose no TBE 10X fornecido. Diluir primeiro o tampo como acima descrito) Para os trabalhos presentes a agarose deve ser preparada sempre na concentrao de 1%:

1,0% de agarose (p/v) (1 g de agarose/100 mL de tampo TBE 0,5x)

Preparao da soluo de agarose a 1%

- Pese 1 g de agarose e dissolva em 100 mL de tampo TBE 0,5X num frasco com rolha hermtica.

- Agitar para diluir um pouco. - Colocar no microondas por perodos curtos (15 segundos

de cada vez), - Agitar novamente

18

- Repetir a operao (15 s no microondas + agitao at a soluo ficar TOTALMENTE transparente.

(NOTA: Se existirem ainda gros de agarose no dissolvidos, o gel no ficar homogneo aps solidificao, prejudicando a separao dos fragmentos de DNA)

Preparao do corante do gel (Nile Blue): O corante do gel fornecido em p dentro de um tubo identificado como corante. Para se preparar a soluo, todo o contedo do tubo (40 mg) dever ser dissolvido em 200 mL de gua (a gua mais pura disponvel, de preferncia estril) (concentrao final: 0,02%, ou seja, 0,02 g/100 mL de gua). A soluo dever ser agitada at todo o corante estar bem dissolvido. A soluo DEVE SER OBRIGATORIAMENTE armazenada no escuro (utilizar um frasco de vidro escuro, envolver o frasco com papel de alumnio e guardar num armrio com porta), porque o corante se degrada na presena de luz. A soluo corante reutilizvel. Aps corar um gel, a soluo dever ser novamente colocada no frasco e armazenada at nova colorao. b) Preparao do gel:

- Vedar com fita-cola os dois lados abertos do tabuleiro do gel (azul) que vem dentro da tina.

- Colocar o tabuleiro numa bancada plana (certificar que o tabuleiro fica totalmente horizontal, nivelado, para que o gel no fique mais grosso de um lado e mais fino do outro).

- Verter para o tabuleiro cuidadosamente (devagar e sem deixar formar bolhas) cerca de 40 mL de agarose fundida e arrefecida at cerca de 45-50 C (quando j conseguir segurar o frasco da agarose nas mos, sem se queimar).

- Colocar imediatamente o pente a cerca de 1 cm de distncia do fundo do tabuleiro e completamente paralelo ao fundo do tabuleiro (ver figura 7)*.

19

- Aguardar cerca de 30 minutos, at o gel estar totalmente solidificado.

- Remover o pente para cima, perpendicularmente, com cuidado para no destruir os poos.

- Retirar cuidadosamente a fita-cola, mantendo o tabuleiro na horizontal, e colocar o gel com o tabuleiro dentro da tina, com os poos para o lado do elctrodo preto.

- Verter, cuidadosamente, tampo TBE 0,5x para dentro da tina at cobrir todo o gel de tampo e o nvel deste atingir cerca de 1 mm acima do gel. NOTA: todos os poos do gel devero ficar cheios de tampo

*Os dentes dos pentes devem ficar submersos no gel cerca de 3 mm. Se ao colocar o pente verificar que os dentes ficam de fora ou levemente em contacto com o gel, verta mais alguns mL de gel para dentro do tabuleiro c) Aplicao das amostras: NOTA: Antes de aplicar as amostras coloque a tina com o gel no local da bancada onde a electroforese vai decorrer. Aps a aplicao das amostras a tina no dever ser tocada nem movida.

O volume das amostras a aplicar no deve exceder 10 L por poo, j com o tampo de aplicao (azul) includo. As amostras devem ser colocadas sequencialmente nos poos e deve ser anotado imediatamente, qual a amostra que foi colocada em cada poo. Os poos devem ser numerados de 1 a 8, num esquema no papel. Exemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 Marcador 3 DNA congelado (grupo 1) 4 DNA fervido (grupo 2) 5 DNA armazenado a 4 C (grupo 3) 6 DNA incubado com saliva (grupo 4) 7 DNA sujeito a microondas (grupo 5) 8

20

Se tiver que aplicar 8 amostras, pode utilizar todos os poos. Se

possuir apenas at 6 amostras para aplicar, dever evitar utilizar os poos das extremidades (poos 1 e 8) por serem aqueles em que as amostras migram de forma menos homognea.

Se tiver um nmero menor de amostras (por exemplo na

experincia dos plasmdeos tm apenas 3 amostras) podem deixar um poo de intervalo entre as amostras, para evitar que uma amostra verta de um poo para o do lado e contamine as amostras dos poos adjacentes.

ATENO: aps a colocao das amostras no deve mover a

tina. d) Condies de electroforese: Aps preparao do gel e colocao das amostras: - Colocar a tampa na tina - Ligar os elctrodos (preto ao plo negativo das pilhas;

vermelho ao plo positivo). No caso do carregador coloque os fios nos elctrodos de cores correspondentes na tina e ligue tomada (no importa a posio do carregador na tomada)

- Verificar se h passagem de corrente (nos elctrodos, devero comear a libertar-se umas pequenas bolhas de gs, mais do lado dos poos que do lado oposto)

- Deixar a electroforese decorrer at frente azul escura do corante chegar a cerca de 1 cm do final do gel (cerca de 2 horas, dependendo da espessura do gel, do estado das baterias e da qualidade da gua utilizada)

- Desligar os elctrodos - Retirar o gel cuidadosamente e faz-lo deslizar do

tabuleiro da tina para um recipiente adequado, preferencialmente de vidro. Em alternativa utilizar a tampa da tina como recipiente de colorao.

Nota: Durante o decorrer da electroforese, normal depositarem-se cristais de sal ao longo do elctrodo, dentro da tina, formando uma mucilagem a envolver o elctrodo. Esta mucilagem no interfere na separao dos fragmentos e pode ser eliminada no final na electroforese, eliminado o tampo da tina e esfregando o elctrodo com o dedo ou um esfrego, suavemente, debaixo de gua corrente.

21

e) Colorao do gel

- Colocar o gel num recipiente adequado aps electroforese. Preferencialmente, o recipiente dever ser um tabuleiro de vidro, pouco maior que o gel, mas com uma profundidade que permita cobrir o gel totalmente com o corante.

- Cobrir o gel TOTALMENTE com corante (Nile Blue) preparado como descrito anteriormente (ver, Preparao do corante para gel)

- Deixar a corar (mnimo 60 minutos) com agitao ocasional. (Os melhores resultados so obtidos com colorao durante a noite. Assim, desejavelmente a electroforese deve ser corrida num dia, o gel deixado a corar durante a noite e visualizado no dia seguinte).

- Quando se comearem a ver as bandas, pode retirar-se o gel e fazer o registo. Posteriormente pode prosseguir-se a colorao por mais algum tempo.

- Retirar o corante e vert-lo novamente para o frasco de armazenamento do corante (o corante reutilizvel. Pode corar muitos gis).

- As bandas so melhor visualizadas colocando o gel sobre um papel branco ou, de preferncia, sobre uma superfcie branca iluminada por baixo.

22

Figuras

Figura 1: Composio do kit (Imagem adaptada da revista National Geographic (Portugal), N Fevereiro 2008):

1 Pilhas (5 x 9 V = 45 V) para funcionar como fonte de alimentao

2 Clulas bacterianas para extraco de DNA 3 Tampo TBE/Etanol (ver rtulo) 4 Agarose (em p) 5 CD com informao e protocolos 6 Pontas amarelas para pipeta 7 Placa de Petri (esterilizada por radiao) 8 Tubos tipo Eppendorf 9 Seringa graduada (para usar como pipeta) 10 Caixa com reagentes (corantes, etc.) e material biolgico

(DNAs, etc.) 11 Cabos de ligao entre a tina e a fonte de alimentao 12 Tina de electroforese 13 Tabuleiro para o gel (com pente ao centro)

1 2

3

4

5 6

7 8

9

10 11 12 13

10

23

Figura 2: Mapa do plasmdeo pUC18*. O plasmdeo (DNA circular fechado) possui 2686 pares de bases de comprimento. Possui uma origem de replicao (rep (pMB1)); um gene de resistncia a um antibitico (ampicilina, bla (ApR)), e um stio de clonagem mltiplo (MCS, multiple cloning site, ver pormenor da Figura abaixo).

Figura 3: Pormenor do Stio de Clonagem Mltiplo do plasmdeo pUC18: sequncia que reconhecida por vrias endonucleases (EcoRI, HindIII, etc.) que s clivam o plasmdeo num stio nico (linearizam). *Normalmente os plasmdeos so sintetizados aos pares (p.ex. pUC18/pUC19, o que significa que o MCS, a zona de clonagem que reconhece vrias enzimas de restrio, pode estar na orientao 2->5 (pUC18) ou na orientao inversa (pUC19).

24

Figura 4: Mapa do plasmdeo pCR2.1 com 3900 pares de bases de comprimento, possuindo a origem de restrio do pUC, genes de seleco de resistncia a dois antibiticos (ampicilina e canamicina) e um stio mltiplo de clonagem.

25

Figura 5: Ilustrao do marcador fornecido contendo 3 bandas que variam entre 500 e 3000 pares de bases. (a) (b) 1 2 1 2

Figura 6: Ilustrao esquemtica (a) e em microscopia electrnica de varrimento (b) do plasmdeo na sua forma relaxada (1) e super-enrolada (supercoiled) (2).

3000 pb

1000 pb

500 pb

26

Figura 7: Tabuleiro selado com fita-cola e com o pente colocado na posio correcta

Figura 8: Soluo de Agarose (1%) fundida no microondas

Figura 9: Verter a agarose cuidadosamente no tabuleiro (a agarose foi deixada arrefecer at cerca de 45 C)

27

Figura 10: Tabuleiro com a agarose e o pente colocado na posio correcta

Figura 11: Retirar o pente do gel aps solidificao (com uma das mos segurar o tabuleiro e com a outra puxar o pente para cima, perpendicularmente ao gel).

Figura 12: Verter o tampo cuidadosamente para a tina

28

Figura 13: Gel totalmente coberto com tampo TBE- (A) (B)

Figura 14: Pipeta com um volume de amostra de 5 L (A) e 10 L (B)

Figura 15: Aplicao da amostra num poo do gel

29

Figura 16: Sistema de electroforese montado. Electroforese a decorrer

Figura 17: Electroforese a decorrer. Visualizao de bolhas de gs a libertarem-se do elctrodo.

Figura 18: Colorao do gel (aplicao do corante na tampa da tina. Pode ser feita, preferencialmente, num recipiente (tipo tabuleiro) de vidro).

30

Figura 19: resultado de uma electroforese da Experincia 2, com o plasmdeo pUC18 (2,6 kpb) ND = No digerido D = Digerido M = Marcador L Forma linearizada do plasmdeo SE Forma super-enrolada do plasmdeo R Forma relaxada do plasmdeo NOTA: A banda do plasmdeo pUC18 situa-se entre as bandas de 3000 e de 500 pb, indicando um tamanho de cerca de 2700 pb (tamanho real, 2686 pb). Por este mtodo os alunos podem identificar que se trata de um plasmdeo pUC18 e no o pCR2.1, no qual a banda do plasmdeo linearizado se situaria acima da banda de 3000 pb.

L

SE

R

L

SE

ND D M

3 kb

500 pb

31

Figura 20: Resultado de uma electroforese da Experincia 3 (Fraude Canina)

Legenda: M = Me; P1 = Pai possvel 1; P2 = Pai possvel 2; F = Filho

O filho heterozigtico com dois alelos diferentes (1000 pb e 600 pb). Uma das bases vem da me, que homozigtica (1000 pb), logo o alelo de 600 pares de bases s pode vir do Pai 1, porque o Pai 2 no tem esse alelo.

Figura 21: Aspecto do DNA precipitado (experincia 1)

P1 P2 M F

32

CRDITOS Este trabalho foi financiado pelo Programa Cincia Viva6 e teve o apoio das seguintes Instituies e colaboradores, sem os quais no teria sido possvel a sua realizao. Ordem dos Bilogos Doutor Pedro Loureno Escola Secundria da Amadora (Amadora) Prof. Maria dos Prazeres Cardoso Amaral Fragoeiro Escola Secundria Fernando Lopes Graa (Parede) - Prof Joana Capucho Escola Secundria Ibn Mucana (Alcabideche) Prof Ana Maria Queiroz de Macedo Escola Secundria Jos Saramago (Mafra) Prof. Pedro Passos e e Prof. Martinho Rangel Escola Secundria Padre Alberto Neto (Queluz) Prof Manuela Moura Lopes Escola Secundria Stuart de Carvalhais (Massam) Prof Ana Morais, Prof ngela Neves e Prof. Joo Carlos Ribeiro INETI (Inst. Nac. Engenharia, Tecnologia e Inovao, I.P.) Grupo de Biologia Molecular do Departamento de Biotecnologia Coordenador: Jos Matos Investigadores: Fernanda Simes; Paula S Pereira; Joo Mascarenhas (design) Tcnicos de Investigao: Diogo Mendona, Carla Borges, Mafalda Possante. CONTACTOS: Para dvidas tcnicas: Jos Matos e.mail: jose.matos@inrbi.pt; jose.matos@ordembiologos.pt Telefone: 217 127 141 Para aquisio de novos kits, seus componentes ou reagentes em separado: Bioprincpio: bioprincipio@gmail.com; Telef: 927 577 997 (Dr Sara Duarte)