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MARGOTH MITCHELA MORENO VIGO
MICROARRANJOS DE DNA PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO
GÊNICA EM CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A BENZNIDAZOL
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Parasitologia).
São Paulo
2008
MARGOTH MITCHELA MORENO VIGO
MICROARRANJOS DE DNA PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO
GÊNICA EM CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A BENZNIDAZOL
São Paulo
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Parasitologia Orientadora: Profa. Dra. Bianca Zingales
São Paulo
2008
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Moreno-Vigo, Margoth Mitchela.
Microarranjos de DNA para análise da expressão gênica em cepas de Trypanosoma cruzi suscetíveis e resistentes a Benznidazol / Margoth Mitchela Moreno Vigo. -- São Paulo, 2008.
Orientador: Bianca Zingales. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro. Linha de pesquisa: Parasitologia. Versão do título para o inglês: DNA microarray for gene expression analysis of Trypanosoma cruzi strains sensitive and resistant to Benznidazole. Descritores: 1. Doença de Chagas 2. Quimioterapia 3. Trypanosoma cruzi 4. Expressão gênica 5. Resistência às drogas 6. Transporte através da membrana I. Zingales, Bianca II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro. III. Título.
ICB/SBIB188/2008
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
______________________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Margoth Mitchela Moreno-Vigo.
Título da Tese: Microarranjos de DNA para análise da expressão gênica em cepas de Trypanosoma cruzi suscetíveis e resistentes a Benznidazol.
Orientador(a): Bianca Zingales.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Dedico mi tesis a Norma, mi mamá, por su
inmensurable amor y desprendimiento, por enseñarme a elegir mis propios caminos, por su constante apoyo y fe en mis proyectos, pero sobre todo porque sus ejemplos de fortaleza, profesionalismo, constancia y dedicación, me han servido de inspiración a lo largo de este caminar. Es contigo que he llegado hasta aquí. Te admiro y amo infinitamente.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Profa. Bianca Zingales pelo privilégio de ter tido a sua orientação para a
realização desta tese. Também quero expressar a minha admiração pela sua qualidade como
educadora, cientista, mas sobre tudo pela sua qualidade como ser humano. A experiência da
pós-graduação não somente trouxe para mim conhecimento científico-acadêmico, se não
também levo comigo seus exemplos de determinação, eficiência, compromisso, paciência e
confiança no futuro. A você a minha sincera gratidão.
Agradeço a Ítalo, meu pai, por seu amor, pela sua proteção, confiança em mim e pelas
suas orações que me acompanham sempre.
Ao meu irmão Paul, por seu amor, amizade, compreensão, apoio incondicional, por
todos os momentos compartilhados e porque sei que posso contar sempre com você. Admiro
você pela sua inteligência e coerência.
À Julieta, minha irmãzinha, pelo carinho infinito, pela sua confiança, pela sua torcida,
por fazer parte da minha vida, pela sua doçura e por deixar que a ame. Você sempre será a
minha “bebecita”.
Aos meus adorados avós Teodomira e Hector, Isidora e Antonio por todo o amor.
Ao Oscar, pelo carinho, amizade, compreensão e paciência.
A Carito, pelo seu carinhoso e valioso apoio. Muito obrigada!
A Zaira, minha amiga incondicional e irmã espiritual, pelo seu carinho, paciência, por
ter sido a minha companheira nesta vida acadêmica na qual dividimos os nossos logros e
quedas que nos deixaram mais fortes. Obrigada também pelos momentos de diversão e muita
dança! É muito bom te ter na minha vida!
Aos meus amigos: Rosa, Rocío, Lucy, Vicky, Leo, Luis, Rogério, Leandro e Érica por
ser a minha família putativa, pelo apóio e carinho sinceros. Amo todos vocês.
À Jumi, Fernanda, Cristina, Daday, Renata Toscano, Samia e Renata Diório pela
amizade e agradável convivência em momentos diferentes na minha trajetória em São Paulo.
Ao colega e amigo Aurélio Pedroso, pelas agradáveis conversas e discussões
acadêmicas, por sua ajuda constante, pelas boas risadas e a sua disposição a colaborar sempre.
Aos colegas e ex-colegas do laboratório: Susan, Patrick, Cesar, Marcelo, Nancy,
Sarah, Camila e Cássio, pela amizade, por compartilhar seus conhecimentos, pelas ajudas,
pelas oportunas opiniões, pelos momentos de risadas e pelos deliciosos cafés que dividimos.
Aos colegas do laboratório do Dr. Hugo Armelin, pela amizade e agradável boa
vizinhança.
À Dra. Daniella D’Ávila pela amizade, produtivas conversas e pela hospitalidade ao
me receber na sua casa em Belo Horizonte.
Ao colega Danilo, do departamento de parasitologia (ICB-USP) pelo assessoramento
para a realização dos experimentos de resistência de amastigotas intracelulares.
Ao Dr. Ricardo Vêncio pela ajuda com o planejamento e análise dos dados dos
experimentos de microarranjos.
À Denise e Adriana pelo excelente suporte técnico na realização dos experimentos de
microarranjos.
Ao Professor Gerhard Wunderlich pelo gentil empréstimo do equipamento de PCR em
tempo real.
Ao Professor Renato Mortara, pela colaboração na realização das imagens no
microscópio confocal.
Aos professores Carlos Renato Machado, Lúcia Galvão, Andréa Macedo, Egler Chiari
e Eliane Gontijo da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) pelas amostras de
parasitos, pelas suas contribuições e valiosas opiniões para a realização do nosso trabalho.
À Wilma e Ângela, da secretaria da pós-graduação do departamento de parasitologia
do ICB-USP pela simpatia, disposição e toda a ajuda brindada em todos este anos.
ÀMaria José e Eva, bibliotecárias do ICB, pela cuidadosa revisão desta tese.
À Carla, assistente social da COSEAS pela ajuda e eficiente trabalho.
Ao CNPq pela bolsa de estudos.
Ao CNPq/MCT/MS e FAPESP pelo apoio financeiro ao projeto de pesquisa.
“Piensa en grande y tus hechos crecerán, piensa en
pequeño y quedarás atrás”
Christian Barnard (1922-2001)
RESUMO
MORENO, M.M.V. Microarranjos de DNA para análise da expressão gênica em cepas de trypanosoma cruzi suscetíveis e resistentes a Benznidazol. 2008. 152 f. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Benznidazol (BZ) é uma das duas drogas usadas no tratamento da doença de Chagas.
No entanto, falhas terapêuticas são observadas em muitos pacientes em fase crônica, as quais
foram atribuídas majoritariamente a diferenças na suscetibilidade de cepas do Trypanosoma
cruzi a essa droga. Alguns genes foram implicados na resistência a BZ induzida in vitro, mas
não no fenótipo de resistência natural. O objetivo geral desse estudo foi investigar diferenças
de expressão gênica em cepas de T. cruzi naturalmente suscetíveis e resistentes a BZ,
utilizando microarranjos de DNA. Padronizamos um ensaio in vitro para quantificar a
sensibilidade à droga. Para 12 cepas de laboratório, a concentração de droga que inibe 50% do
crescimento (CI50) variou de 7,6 a 127 µM. Não observamos correlação entre a resistência a
BZ e o grupo filogenético ao qual pertence a cepa. O ensaio foi também aplicado em isolados
obtidos de sete pacientes crônicos submetidos a quimioterapia com BZ. O CI50 dos isolados de
pacientes considerados curados por vários critérios variou de 19 a 35 µM. Analogamente, os
isolados pré-tratamento de quatro pacientes não curados apresentaram CI50 de 15,6 a 51 µM.
Nossos resultados mostram pela primeira vez que a suscetibilidade a BZ da cepa infectante
não é preditiva do sucesso ou falha terapêutica e apóiam a noção de que, além da ação direta
da droga na eliminação do parasito, o efeito de BZ sobre a resposta imune do hospedeiro deve
determinar a eficácia do tratamento. Para investigar a expressão diferencial de genes em três
cepas suscetíveis e três cepas naturalmente resistentes, construímos uma lâmina de
microarranjo contendo ~1100 ESTs de T. cruzi. Não identificamos nenhum gene que
separasse os dois grupos. cDNAs das cepas VL10 (resistente; CI50 23,0 ± 7,0 µM) e 115
(suscetível; CI50 7,6 ± 3,6 µM) foram co-hibridizados numa lâmina de microarranjo (TIGR)
contendo oligonucleotídeos representantes de 12288 ORFs de CL Brener. 578 genes foram
superexpressos em VL10 e 676, em 115. Poucos genes foram validados por RT-PCR em
tempo real. Escolhemos um gene que codifica um transportador ABC, classe de proteínas
associada a resistência a drogas, para estudos adicionais. Esse gene, que denominamos
TcABCG1, apresenta elevada similaridade com proteínas homólogas de Leishmania e T.
brucei. A abundância de transcritos do gene TcABCG1 foi maior em cinco cepas
naturalmente resistentes a BZ em relação a três cepas suscetíveis. Não observamos variação
na abundância de transcritos dos genes que codificam uma nitroredutase (NTR) e uma old
yellow enzyme (TcOYE) cujo produto foi implicado no fenótipo de resistência a drogas
induzida in vitro. Nossos dados sugerem que o transportador TcABCG1 pode ser um dos
componentes envolvidos na resistência natural a BZ.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi; Benznidazol; quimioterapia; resistência a droga;
transportador ABC; microarranjos de DNA.
ABSTRACT
MORENO, M.M.V. DNA microarray for gene expression analysis of Trypanosoma cruzi
strains sensitive and resistant to benznidazole . 2008. 152 p. Thesis (PhD) – Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, São Paulo, 2008.
Benznidazole (BZ) is one of the two drugs used to treat Chagas disease. Nevertheless,
therapeutic failures of BZ were reported in many chronic patients, which were mostly
attributed to different susceptibilities of Trypanosoma cruzi strains to this drug. A few genes
have been implicated in the in vitro induced resistance to BZ, but none in the natural
resistance phenotype. The general goal of the present study was to investigate differences in
gene expression between susceptible and naturally resistant T. cruzi strains employing DNA
microarray technology. We standardized an in vitro assay to quantify the drug activity. For
twelve laboratory strains, the 50% inhibitory concentration (IC50) varied from 7 to 127 µM.
We observed no correlation between BZ resistance and the phylogenetic group to which the
strain belongs. The assay was also applied to isolates retrieved from seven chronic patients
submitted to BZ therapy. The IC50 of the pre-treatment isolates from three patients considered
cured by several criteria varied from 19 to 35 µM. Similarly, pre-treatment isolates from four
non-cured patients presented IC50s of 15.6 to 51 µM. Our results show for the first time that
the susceptibility to BZ of the infecting T. cruzi population is not predictive of therapeutic
success or failure and support the notion that in addition to the direct role in parasite
clearance, the effect of BZ on the host immune response determines the efficacy of treatment.
To investigate the differential gene expression between three susceptible and three naturally
resistant strains, we constructed a microarray slide with ~1100 T. cruzi ESTs. No gene was
identified that separated the two classes of parasites. cDNAs of the VL10 (resistant; IC50 23.0
± 7.0 µM) and the 115 (susceptible; IC50 7.6 ± 3.6 µM) strains were co-hybridized in a
microarray slide from TIGR with oligonucleotides representative of 12,288 CL Brener ORFs.
578 genes were super-expressed in VL10 and 676, in 115. The differential transcription of
few genes was validated by real time RT-PCR. We chose the gene which codes for one ABC-
transporter for further studies, since this class of proteins plays a crucial role in multidrug
resistance. This gene, here named TcABCG1, shows high similarity with homologous
proteins of Leishmania species and T. brucei. The transcript abundance of TcABCG1 was
higher in five naturally resistant strains as compared to three sensitive strains. We observed no
variation in the transcripts levels of the genes coding for a nitroreductase (NTR) and the old
yellow enzyme (TcOYE) implicated in the in vitro-induced drug resistance. Our data suggest
that TcABCG1 transporter may be one of the components involved in natural drug resistance
in T. cruzi.
Key words: Trypanosoma cruzi; Benznidazole; chemotherapy; drug resistance; ABC
transporter; DNA microarrays.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 16 1.1 O Trypanosoma cruzi ............................................................................................................. 16 1.1.1 Formas evolutivas e ciclo de vida......................................................................................... 16 1.1.2 Diversidade genética e biológica de T. cruzi ........................................................................ 17 1.1.3 Peculiaridades moleculares do T. cruzi ................................................................................ 19 1.2 A Doença de Chagas .............................................................................................................. 20 1.2.1 Situação epidemiológica ....................................................................................................... 20 1.2.2 Formas de transmissão.......................................................................................................... 21 1.2.3 Fases e manifestações da doença .......................................................................................... 21 1.3 Tratamento da doença de Chagas ........................................................................................ 22 1.3.1 Drogas utilizadas no tratamento ........................................................................................... 22 1.3.2 Uso de BZ em humanos........................................................................................................ 22 1.3.3 Eficácia do tratamento e suscetibilidade de cepas de T. cruzi .............................................. 23 1.4 Mecanismos de resistência .................................................................................................... 24 1.5 Alvos para a quimioterapia da doença de Chagas ............................................................. 28 1.6 Projeto genoma de Trypanosoma cruzi ................................................................................ 28 1.7 Microarranjos de DNA ......................................................................................................... 31 2 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 36 3.1 Soluções .................................................................................................................................. 37 3.2 Reagentes e enzimas .............................................................................................................. 37 3.3 Oligonucleotídeos ................................................................................................................... 38 3.4 Cultivo celular ........................................................................................................................ 39 3.4.1 Cultura de formas epimastigotas .......................................................................................... 39 3.4.2 Obtenção de formas de cultura de tecidos ............................................................................ 39 3.5 Extração de ácidos nucléicos ................................................................................................ 40 3.5.1 Extração de DNA total ......................................................................................................... 40 3.5.2 Extração de RNA total .......................................................................................................... 40 3.6 Lâmina de microarranjos preparada por nós .................................................................... 41 3.6.1 Sondas para a construção da lâmina de microarranjos ......................................................... 41 3.6.1.1 Agrupamento das seqüências – CAP3 ............................................................................... 41 3.6.2 Amplificação, análise e purificação de ESTs ....................................................................... 41 3.6.2.1 Amplificação das ESTs (em Placas de 96 poços) ............................................................. 41 3.6.2.2 Análise dos produtos de amplificação ............................................................................... 42 3.6.2.3 Purificação dos produtos de PCR ...................................................................................... 42 3.6.3 Construção da lâmina de microarranjos ............................................................................... 42 3.6.4 Qualidade da lâmina de microarranjos ................................................................................. 43 3.6.4.1 Marcação de DNA total com fluoróforos .......................................................................... 43 3.6.4.2 Purificação de DNA marcado ............................................................................................ 43 3.6.4.3 Quantificação da incorporação de Cy3 e Cy5 nas moléculas de DNA ............................. 44 3.6.4.4 Hibridização da lâmina de microarranjos .......................................................................... 44 3.6.4.5 Lavagens pós-hibridização ................................................................................................ 44 3.6.5 Síntese de cDNA a partir de RNA total e marcação com Cy3 ou Cy5 ................................ 45 3.6.6 Análise dos dados ................................................................................................................. 45 3.7 Lâmina de microarranjo do PFGRC e condições de hibridização ................................... 46 3.8 Confirmação de dados dos microarranjos .......................................................................... 46 3.8.1 Southern blot ........................................................................................................................ 47 3.8.2 Northern blot ........................................................................................................................ 47 3.8.3 Obtenção de sondas radioativas e condições de hibridização .............................................. 47
3.8.3.1 Marcação por random primer extension ............................................................................ 47 3.8.3.2 Hibridização de sondas radioativas com ácidos nucléicos imobilizados .......................... 48 3.8.3.3 Lavagem das membranas .................................................................................................. 48 3.8.3.4 Desibridização das membranas ......................................................................................... 49 3.9 RT-PCR em tempo real ......................................................................................................... 49 3.9.1 PCR convencional ................................................................................................................ 49 3.9.2 Síntese da primeira fita de cDNA ......................................................................................... 50 3.9.3 Síntese da segunda fita de cDNA e PCR em tempo real ...................................................... 50 3.9.4 Análise dos dados ................................................................................................................. 50 3.10 Ensaio para avaliar a suscetibilidade a BZ ....................................................................... 51 4 RESULTADOS ......................................................................................................................... 52 4.1 Padronização de um ensaio para quantificar a suscetibilidade de cepas de T. cruzi a BZ. ................................................................................................................................................. 52 4.1.1 Toxicidade do dimetil sulfóxido (DMSO)............................................................................ 52 4.1.2 Doses de BZ e tempo de exposição ...................................................................................... 52 4.1.3 Determinação dos valores de CI50 para BZ........................................................................... 53 4.1.4 Suscetibilidade a BZ de cepas mantidas em laboratório ...................................................... 54 4.1.5 Estabilidade do valor de CI50 ................................................................................................ 55 4.1.6 Sensibilidade a BZ em parasitos presentes no sobrenadante de monocamadas de células LLC-KM2 ...................................................................................................................................... 56 4.2 Construção da lâmina de microarranjos ............................................................................. 58 4.2.1 Análise e agrupamento de ESTs de T. cruzi ......................................................................... 58 4.2.2 Construção e topologia da lâmina de microarranjos ............................................................ 59 4.2.3 Análise da qualidade da lâmina ............................................................................................ 63 4.3 Análise da expressão diferencial de genes em cepas sensíveis e resistentes a BZ ............ 65 4.3.1 Escolha das cepas ................................................................................................................. 65 4.3.2 Desenho experimental .......................................................................................................... 66 4.3.3 Determinação da curva de corte ........................................................................................... 66 4.3.4 Normalização por Lowess (locally weighted scatterplot smoothing ) ................................. 67 4.3.5 Identificação de genes diferencialmente expressos entre os grupos fenotípicos .................. 68 4.3.6 Validação da transcrição diferencial dos genes identificados nos experimentos de micro arranjos .......................................................................................................................................... 69 4.4 Análise da expressão diferencial de genes em cepas sensíveis e resistentes a BZ com lâmina de microarranjos do TIGR ............................................................................................ 71 4.4.1.1 Critérios de escolha dos genes e justificativa .................................................................... 73 4.4.2 RT-PCR em tempo real ........................................................................................................ 76 4.4.3 Verificação da abundância de transcritos em outras cepas de T. cruzi................................. 78 4.5 Abundância de transcritos de genes que codificam putativas calpaínas .......................... 80 4.6 Suscetibilidade a BZ em isolados de pacientes submetidos a tratamento com a droga .. 81 4.6.1 Características dos pacientes ................................................................................................ 82 4.6.2 Determinação da CI50 ........................................................................................................... 82 4.6.3 Abundância dos transcritos do transportador ABC nos isolados de pacientes com falha terapêutica ...................................................................................................................................... 83 4.6.4 Cópias do gene que codifica o transportador ABC nos isolados .......................................... 85 4.7 Abundância de transcritos de genes potencialmente envolvidos na resistência a BZ em cepas de T. cruzi ..................................................................................................................... 87 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 91 5.1 Suscetibilidade a BZ em cepas de T. cruzi e isolados humanos ......................................... 91 5.2 Estrutura e qualidade da lâmina de microarranjos de DNA ............................................ 94 5.3 Expressão diferencial de genes em cepas suscetíveis e resistentes a BZ ........................... 95
5.4 O transportador ABC ........................................................................................................... 98 6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 105 6.1 Avaliação da suscetibilidade a BZ......................................................................................... 105 6.2 Expressão difrenecial de genes .............................................................................................. 105 REFERENCIAS ........................................................................................................................ 106 ANEXOS .................................................................................................................................... 122 Anexo A. Artigo submetido para publicação .............................................................................. 122 Anexo B. Lista de genes super expressos nas cepas VL10 e 115.. ............................................. 122
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 O Trypanosoma cruzi
1.1.1 Formas evolutivas e ciclo de vida
O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas
ou Tripanossomíase Americana que afeta de 16 a 18 milhões de pessoas no continente
americano e coloca em risco de infecção outros 100 milhões (World Health Organization
(WHO), 2002; Organização Pan Americana da Saúde (OPS), 2006).
O T. cruzi é um parasito dixênico que tem insetos triatomíneos da família Reduviidae,
subfamília Triatominae, comumente chamados de barbeiros, como hospedeiros
intermediários, e mamíferos, como hospedeiros definitivos. O parasito apresenta um ciclo de
vida complexo e três formas evolutivas distintas, que são nomeadas de acordo com a posição
do cinetoplasto em relação ao núcleo e à região de emergência do flagelo. Estas formas
evolutivas são: o epimastigota (forma flagelada, replicativa no intestino do inseto e não
infectante); o tripomastigota (forma flagelada, infectante e não replicativa, presente no vetor e
nos hospedeiros mamíferos); e o amastigota (forma com pequeno flagelo intracelular,
replicativa, presente nos mamíferos e possivelmente infectante). O tripomastigota é a forma
que representa o elo entre o vetor e hospedeiros mamíferos (BRENER, 1973; DE SOUZA,
2002) (Figura 1).
Figura 1 - Formas evolutivas de T. cruzi. A, amastigota; B, epimastigota; C, tripomastigota. K:
cinetoplasto e N: núcleo. O ciclo de vida do T. cruzi é representado na figura 2. Quando o inseto vetor se
alimenta com sangue do mamífero, defeca, e os tripomastigotas metacíclicos, eliminados nas
17
fezes e urina, atravessam a pele ou mucosa do hospedeiro e penetram nas células próximas ao
local da picada. Na célula, transformam-se em amastigotas que se multiplicam no citoplasma
e, após várias gerações, diferenciam-se em tripomastigotas que são liberados na corrente
sangüínea para infectar células de vários tecidos como muscular, cardíaco ou nervoso.
Os insetos triatomíneos são contaminados com formas tripomastigotas sangüíneas ao
se alimentar do sangue do mamífero infectado. No intestino médio do inseto, os
tripomastigotas se diferenciam em formas epimastigotas e, no final do tubo digestivo, parte
destas formas se diferencia em tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados pelas fezes
quando o inseto se alimenta novamente, começando assim um novo ciclo de infecção (DE
SOUZA et al., 2002).
Figura 2 - Representação esquemática do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Extraído de Expert Reviews in Molecular Medicine: www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/0200412Xh.htm.
Os insetos triatomíneos são infectados com formas tripomastigotas sangüíneas ao se
alimentar do sangue do mamífero contaminado. No intestino médio do inseto, os
tripomastigotas se diferenciam em formas epimastigotas e, no final do tubo digestivo, parte
destas formas se diferencia em tripomastigotas metacíclicos que são eliminados pelas fezes
quando o inseto se alimenta novamente, começando assim um novo ciclo de infecção (DE
SOUZA et al., 2002).
Figura 2 - Representação esquemática do ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Extraído de Expert
Reviews in Molecular Medicine: www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/0200412Xh.htm.
1.1.2 Diversidade genética e biológica de T. cruzi
O T. cruzi constitui um grupo de parasitos genética e biologicamente heterogêneo
devido à sua evolução clonal (TIBAYRENC e AYALA, 1988). Estudos realizados a partir da
18
década de 60 indicam uma variação considerável no conteúdo de DNA em isolados de T.
cruzi (RIOU e PAUTRIZEL, 1969; LANAR; LEVY; MANNING, 1981; DVORAK et al.,
1982; KOOY et al., 1989). Evidências obtidas por marcadores de DNA, tais como genes de
RNA ribossômico (rRNA) e de mini-exon (SOUTO et al., 1996), perfil de isoenzimas
(TIBAYRENC e AYALA, 1988) e de Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
(SOUTO et al., 1996) e análises filogenéticas do gene rRNA 18S (KAWASHITA et al.,
2001) indicam que as populações de T. cruzi podem ser agrupadas em duas grandes linhagens
filogenéticas, denominadas por um comitê de expertos: T. cruzi I e T. cruzi II (ANÔNIMO,
1999). Subseqüentemente, o grupo T. cruzi II foi dividido em cinco sub-grupos (IIa-IIe)
(BRISSE; BARNABÉ; TIBAYRENC, 2000).
Com base em estudos epidemiológicos conduzidos em doze estados brasileiros, foi
concluído que T. cruzi I predomina no ambiente silvestre, ao passo que T. cruzi II prevalece
no ambiente doméstico (ZINGALES et al., 1998) (Figura 3).
Figura 3 - Representação esquemática da distribuição dos grupos T. cruzi I e T. cruzi II nos ciclos silvestre e doméstico de transmissão no Brasil (ZINGALES et al., 1998).
Apesar da clara existência de dois grupos de T. cruzi, várias evidências indicam o
caráter híbrido de alguns isolados. Uma das primeiras evidências genotípicas foi obtida a
partir da análise do domínio D7 do rRNA 24Sα (SOUTO et al., 1996). Utilizando-se
iniciadores específicos para ensaios de PCR, obtiveram-se produtos de 125 pb para um grupo
de cepas (correspondente a T. cruzi II) e 110 pb para o outro grupo (correspondente a T. cruzi
I). Em alguns isolados, denominados grupo de rDNA 1/2, ambos os produtos foram obtidos, o
que levou à suposição de que estes isolados seriam “híbridos” dos dois grupos (SOUTO et al.,
19
1996). Outra evidência que aponta para a existência de híbridos em T. cruzi foi obtida a partir
da análise filogenética dos genes da diidrofolato redutase-timidilato sintase e tripanotiona
redutase (MACHADO e AYALA, 2001). CL Brener, o organismo referência do projeto
genoma de T. cruzi (ZINGALES et al., 1997a), é um exemplo de cepa híbrida e algumas
evidências indicam ser um mosaico de genes de T. cruzi I e T. cruzi II (PEDROSO;
CUPOLILLO; ZINGALES, 2003; STURM et al., 2003; VARGAS; PEDROSO; ZINGALES,
2004; ELIAS et al., 2005).
As diferenças genotípicas entre as cepas se traduzem em diferenças fenotípicas tais
como: diferenças na morfologia, tropismo tissular, virulência, associação com vetores e
suscetibilidade a drogas.
1.1.3 Peculiaridades moleculares do T. cruzi
Uma série de características diferencia T. cruzi e os Kinetoplastida em geral dos
demais eucariotos. A primeira se refere à presença de uma mitocôndria única, cujo genoma
consiste de uma rede de minicírculos e maxicírculos de DNA concatenados, que se concentra
numa região denominada cinetoplasto. Para a replicação, as moléculas de DNA são liberadas
da rede e direcionadas aos sítios de replicação de posição polar no cinetoplasto (GUILBRIDE
e ENGLUND, 1998; MORRIS et al., 2001). O processamento dos transcritos do maxicírculo
ocorre por um processo denominado Editoração, em que se verifica inserção ou deleção de
uridinas no transcrito primário. Este processo é determinado por RNA guias codificados pelos
minicírculos (STUART et al., 2005).
A cromatina nuclear de T. cruzi está organizada em filamentos de nucleossomos, como
ocorre em eucariotos pluricelulares. Entretanto, esta cromatina apresenta uma capacidade
reduzida de condensação durante a mitose. Desta forma, o cariótipo dos Kinetoplastida é
analisado por eletroforese em campo pulsado, concluindo-se que o genoma destes
organismos, e o de T. cruzi em particular (CANO et al., 1995; HENRIKSSON et al., 1995;
VARGAS; PEDROSO; ZINGALES, 2004), apresenta grande plasticidade, com elevado
polimorfismo no número e tamanho dos cromossomos dos isolados.
Foi verificado que a maquinaria da replicação do DNA localiza-se na periferia do
núcleo e que os cromossomos se deslocam para este local para serem duplicados (ELIAS et
al., 2002).
Não foram encontradas seqüências promotoras no DNA dos tripanossomatídeos. Os
genes codificadores de proteína carecem de íntrons e são transcritos policistronicamente por
20
uma RNA polimerase I (LEE e VAN DER PLOEG, 1997). O RNA primário é processado em
transcritos independentes por um processo de trans-splicing, onde a seqüência do mini-exon
de 39 nucleotídeos é adicionada à extremidade 5’ de cada mRNA (ULLU e TSCHUDI, 1991;
XU et al., 2001). Não existem seqüências consenso de poliadenilação nos mRNAs dos
Kinetoplastida, o que sugere que o trans-splicing e a poliadenilação são processos
interdependentes, sendo que a adição do mini-exon antecederia à poliadenilação
(MATTHEWS; TSCHUDI; ULLU, 1994). Apenas nos genes que codificam a poli-A
polimerase de Trypanosoma brucei e T. cruzi foram observados íntrons que são removidos
por cis-splicing (MAIR et al. 2000).
Os mecanismos e os fatores celulares que estão envolvidos na transcrição,
processamento e tradução nos tripanossomatídeos ainda não são bem conhecidos. No entanto,
uma série de dados indica que o controle da expressão gênica é feito no nível pós-
transcricional (HEHL et al., 1994; FURGER et al., 1997; CLAYTON e SHAPIRA, 2007).
1.2 A Doença de Chagas
1.2.1 Situação epidemiológica
Em 1980 foi lançado o projeto denominado “Iniciativa do Cone Sul”, que tinha como
objetivo final interromper a transmissão da doença de Chagas pela eliminação de vetores
domiciliados e controle nos bancos de sangue. Os países que participaram deste projeto foram
Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai. As medidas adotadas nesse projeto
tiveram sucesso na maior parte dos países participantes. Outras iniciativas de interrupção de
transmissão vetorial estão em andamento em países Andinos e da América Central, com
alguns resultados promissores (WHO, 2002).
O Ministério da Saúde do Brasil recebeu no dia 9 de junho de 2006 a Certificação
Internacional de Eliminação da Transmissão da Doença de Chagas pelo Triatoma infestans,
conferida pela Organização Pan-Americana da Saúde
(http://www.radiobras.gov.br/materia.phtml?materia=267098&editoria=NA). No entanto, é
importante lembrar que no Brasil há grande diversidade de espécies de triatomíneos vetores
da doença, sobretudo na região Nordeste, que incluem T. brasiliensis, T. pseudomaculata e T.
sordida. Estas espécies têm como habitat o peridomicílio e são passíveis de domiciliação
(DIAS; SILVEIRA; SCHOFIELD, 2002). Desta forma, é importante manter-se um esquema
21
de vigilância epidemiológica permanente para evitar que o esforço da eliminação da
transmissão vetorial intradomiciliar seja perdido.
1.2.2 Formas de transmissão
Embora a via natural de transmissão do T. cruzi ao homem e a outros mamíferos
ocorra através de triatomíneos hematófagos, existem outras vias de transmissão como por
transfusão sangüínea, transplante de órgãos ou através da placenta (congênita). Existe também
contaminação por acidente laboratorial quando há manipulação inadequada do parasito e de
material contaminado.
Outra forma de transmissão é a oral, que ocorre pela ingestão de alimentos
contaminados, sendo comum entre mamíferos do ciclo silvestre que se alimentam de
triatomíneos ou de outros mamíferos infectados (DIAS, 2000; MONCAYO, 2003). Vários
casos de transmissão oral foram reportados no Brasil. Mais recentemente, cita-se um surto de
doença de Chagas no Estado de Santa Catarina, causado por ingestão de caldo de cana
contaminado, ocorrido em fevereiro de 2005. Segundo a Secretaria de Vigilância em Saúde do
Ministério foram confirmadas 24 pessoas infectadas, sendo que três evoluíram para óbito
(Ministério da Saúde. Nota Técnica de 04.04.2005: www.saude.gov.br/svs). Mais
recentemente, entre julho e agosto de 2007, em algumas cidades do Pará, aconteceram surtos
de infecção com T. cruzi, sendo 35 casos da doença registrados por consumo de açaí que foi
manipulado e armazenado de forma inadequada
(http://www.bonde.com.br/bondenews/bondenewsd.php?id=891&dt=20070827).
1.2.3 Fases e manifestações da doença
A doença de Chagas apresenta uma fase aguda inicial, que se caracteriza por uma
adenopatia regional chamada chagoma, febre de intensidade variável e pela abundância de
formas tripomastigotas no sangue. À fase aguda segue uma fase indeterminada com baixa
parasitemia e aparente ausência de patologia, mas com altos níveis de anticorpos anti-T. cruzi.
Humanos podem entrar numa fase crônica sintomática 10 a 20 anos pós-infecção, na qual
apresentam diferentes manifestações clínicas: 30 a 40% exibem um grau variado de
miocardiopatia e 8 a 10% apresentam a forma digestiva que se caracteriza por uma dilatação
patológica do esôfago e/ou do cólon. Ocasionalmente, ambas as manifestações podem estar
22
associadas. No Brasil 50 a 60% dos indivíduos são assintomáticos e apresentam a forma
indeterminada da doença (WHO, 2002).
1.3 Tratamento da doença de Chagas
1.3.1 Drogas utilizadas no tratamento
Desde a década de 60, dois nitroderivados, o Nifurtimox (NFX) e o Benznidazol (BZ),
são utilizados no tratamento da doença de Chagas (Figura 4).
Figura 4 - Estrutura química do Nifurtimox (A) e Benznidazol (B).
Estes dois agentes são pró-drogas, que agem diretamente no parasito após serem
ativados por nitroredutases próprias (WILKINSON et al., 2008).
NFX age via geração de radicais nitroânion que, na presença de oxigênio, formam
intermediários reativos (O2.- e H2O2). Uma vez que T. cruzi é parcialmente deficiente em
mecanismos de detoxificação de radicais livres, isto explica sua suscetibilidade a estes
intermediários (DOCAMPO e MORENO, 1986). O mecanismo de ação do BZ é pouco
conhecido, mas, aparentemente, não depende da formação de radicais de oxigênio como no
caso do NFX (MAYA et al., 2007). Sua ação tripanocida envolveria a ligação covalente de
intermediários de nitroredução do BZ com macromoléculas do parasito como DNA, RNA,
lipídeos e proteínas (POLAK e RICHLE, 1978). Também há evidências de que BZ promove
quebras na dupla fita de DNA (GOIJMAN; FRASCH; STOPPANI, 1985).
1.3.2 Uso de BZ em humanos
Estudos da década de 90, realizados em crianças brasileiras tratadas com BZ,
mostraram que cerca de 60% dos indivíduos apresentaram negativação dos testes de sorologia
convencional e que os efeitos tóxicos da droga foram pouco representativos (DE ANDRADE
et al., 1996). Em adultos da Argentina, que apresentavam cardiomiopatia chagásica, o
A B
23
tratamento com BZ ocasionou uma diminuição significativa da deterioração clínica e dos
títulos de anticorpos anti-T. cruzi (VIOTTI et al., 2006). Em outros países, a eficácia de NFX
no tratamento da fase aguda e em crianças também foi relatada (WHO, 2002).
Estes resultados, dentre outros, levaram o Comitê de Expertos da Organização
Mundial da Saúde a recomendar que qualquer indivíduo na fase aguda ou crônica da doença
de Chagas fosse submetido ao tratamento com BZ ou NFX (WHO, 2002). No Brasil, a droga
utilizada no tratamento da doença de Chagas é o BZ.
1.3.3 Eficácia do tratamento e suscetibilidade de cepas de T. cruzi
O modelo de evolução clonal postulado para T. cruzi (TIBAYRENC e AYALA, 1988)
prediz uma correlação entre a divergência filogenética dos clones e suas propriedades
biológicas. Vários estudos têm enfocando a relação entre a diversidade genética dos isolados e
suas características biológicas ou clínicas (ANDRADE et al., 1985; ANDRADE e
MAGALHÃES, 1996; DVORAK, 1984; REVOLLO et al., 1998; TOLEDO et al., 2002;
VILLARREAL et al., 2004). Neste contexto, um achado importante é a ocorrência de cepas
naturalmente resistentes ao BZ e ao NFX relatado por Filardi e Brener (1987). Neste estudo, a
sensibilidade natural às duas drogas foi ensaiada em 47 cepas de T. cruzi isoladas de
pacientes, vetores domésticos e vetores ou reservatórios silvestres. Estes isolados foram
inoculados em camundongos que foram tratados alternativamente com os dois nitroderivados,
monitorando-se a porcentagem de cura 20 dias pós-tratamento (Figura 5).
Figura 5 - Sensibilidade individual de 47 cepas de T. cruzi a Nifurtimox e Benznidazol determinada em camundongos infectados experimentalmente. Extraído de Filardi e Brener (1987).
24
Os autores verificaram que a eficiência terapêutica variava entre 0% a 100%,
classificando as cepas em resistentes (0 a 33% de cura); intermediárias (33 a 66%) e sensíveis
(66 a 100%). Curiosamente, foi verificado um comportamento semelhante na eficácia de NFX
e BZ. Neste estudo também foi relatada uma aparente correlação entre a suscetibilidade de
algumas cepas e a área geográfica de sua procedência. Em estudo similar, Neal e van Bueren
(1988) verificaram diferenças na resposta ao NFX e BZ em cinco cepas de T. cruzi tanto in
vivo quanto in vitro.
A resistência natural aos nitroderivados é apontada como um dos fatores mais
importantes que explicaria a baixa taxa de cura de alguns pacientes (ANDRADE et al., 1992).
1.4 Mecanismos de resistência
Nas últimas décadas, o maior obstáculo para o tratamento de doenças causadas por
organismos procariotos e eucariotos foi o surgimento de resistência às drogas (BORST e
OUELLETTE, 1995; PAPADOPOULOU et al., 1994; PEEL, 2001; OUELLETTE, 2001).
Em parasitos protozoários, diferentes mecanismos são responsáveis pelo aparecimento
de resistência a quimioterápicos. Estes incluem: inativação da droga (DAVIES, 1994),
diminuição de sua concentração intracelular (LEWIS, 1994; BALZI e GOFFEAU, 1994;
OUELLETTE; LEGARE; PAPADOPOULOU, 1994) e alterações dos alvos moleculares
(SPRATT, 1994).
Tsuhako et al. (1991) analisou o metabolismo do NFX em formas epimastigotas de
três cepas de T. cruzi que apresentavam diferentes suscetibilidades à droga. Neste trabalho foi
concluído não haver diferenças significativas no metabolismo, mas sim diferenças na
capacidade de captação da droga, ou seja, a cepa mais resistente foi aquela que menos
incorporou NFX. Os autores sugerem que a capacidade do parasito em captar a droga poderia
ter um papel mais importante no fenótipo de resistência do que o metabolismo da droga
propriamente dito.
Um mecanismo de resistência bem conhecido e conservado desde bactérias até o
homem e, também encontrado nos parasitos protozoários, envolve o bombeamento da droga
para fora do citoplasma, diminuído sua concentração interna e, conseqüentemente, sua
citotoxicidade (LEWIS, 1994; BALZI e GOFFEAU, 1994; GOFFEAU, 1994; OUELLETTE;
LEGARE e PAPADOPOULOU, 1994).
Esse processo é mediado por proteínas transmembrana de uma superfamília específica
que apresenta sítios de ligação de ATP. Estas proteínas são chamadas de ATP-binding
25
cassette (ABC) e atuam como transportadores de uma variedade de moléculas contra um
gradiente de concentração, num processo dependente de energia (HIGGINS, 1992). Via de
regra, as proteínas ABC são constituídas de 4 domínios (Figura 6): 2 domínios de membrana
(MDs), cada um usualmente constituído de 6 segmentos transmembrana em α-hélice (TMS) e
2 domínios de ligação a nucleotídios (nucleotide-binding, NBDs). Os NBDs contém em sua
seqüência os motivos Walker A e Walker B (WALKER et al., 1982) que são comuns a todas
as proteínas que ligam ATP. Além disso, os domínios NBD possuem uma pequena seqüência
conservada chamada ABC signature que é típica dos membros da família ABC (HIGGINS et
al., 1988).
Figura 6 - Esquema geral de um transportador ABC e de seus domínios (Extraído de KLOKOUZAS
et al., 2003).
Foi comprovado que membros da superfamília ABC, que incluem as glicoproteínas P
(PGP) e outras proteínas associadas à resistência a múltiplas drogas (MDR ou MRP),
conferem o fenótipo de resistência a células tumorais (GERMANN, 1996). Em vários
parasitos protozoários, como Leishmania spp (OUELLETTE e BORST, 1991; LEPROHON
et al., 2006; COELHO et al., 2003, 2004, 2006, 2007), Entamoeba histolytica
(DESCOTEAUX et al., 1995), Cryptosporidium parvum (PERKINS et al., 1997;
BONAFONTE et al., 2004; BENITEZ; MCNAIR ; MEAD, 2007), Plasmodium falciparum
(PRICE et al., 1999, 2004; SIDHU et al., 2006; ALKER et al., 2007; NAIR et al., 2007); e T.
brucei (MASER e KAMINSKY, 1998; SHAHI; KRAUTH-SIEGEL; CLAYTON, 2002;
ALIBU et al., 2006), genes que codificam proteínas ABC foram descritos e seu papel na
quimioresistência está bem estabelecido.
Pouco se sabe a respeito dos mecanismos implicados na resistência ou suscetibilidade
de T. cruzi às drogas utilizadas no tratamento da doença de Chagas e o envolvimento dos
transportadores ABC no fenótipo de resistência não foi claramente comprovado.
Inicialmente, foram descritos dois genes da superfamília ABC (Tcpgp1 e Tcpgp2) em
T. cruzi (DALLAGIOVANNA; CASTANYS; GAMARRO, 1994; DALLAGIOVANNA;
26
GAMARRO; CASTANYS, 1996). A seqüência de aminoácidos da proteína Tcpgp1 apresenta
similaridade com segmentos dos transportadores LtpgpA de L. tarentolae e HuMRP de
humanos, exibindo uma identidade de 59,1 e 48,4%, respectivamente. O gene Tcpgp1 também
exibe grande similaridade com genes HuCTFR de humano, Ehpgp1 de E. histolytica, Humdr1
de humanos, Pfmdr1 de P. falciparum e Ldmdr1 de L. donovani.
O gene Tcpgp2, que foi caracterizado e seqüenciado na cepa Y de T. cruzi, codifica
uma proteína de 1534 aminoácidos que apresenta homologia com genes de proteína P de L.
tarentolae, com o fator de calmodulina (YCF1) de levedura e com proteínas MDR associadas
à resistência a drogas em humanos. Foi visto também que a proteína Tcpgp2 é codificada por
um só gene, que foi mapeado num cromossomo de cerca de 900 kb. Um transcrito
poliadenilado de Tcpgp2 foi detectado em formas epimastigotas e amastigotas, mas não na
forma tripomastigota (DALLAGIOVANNA; GAMARRO; CASTANYS, 1996). Estudos
subseqüentes mostraram que o fenótipo de resistência a BZ em T. cruzi não está associado à
super-expressão ou à amplificação gênica dos transportadores Tcpgp1 e Tcpgp2 (MURTA et
al., 2001). Por outro lado, um membro da superfamília ABC foi implicado na detoxificação
do grupo heme (gerador de espécies reativas de oxigênio) em formas epimastigotas do
parasito (LARA et al., 2007).
No genoma de T. cruzi (EL-SAYED et al., 2005), pudemos identificar a existência de,
no mínimo, 24 transportadores ABC, cuja função ainda não foi esclarecida.
Outras moléculas foram putativamente implicadas no fenótipo de resistência a drogas
em T. cruzi, como, por exemplo, a pteridina-redutase1 (PTR1), cujo gene é contíguo ao gene
Tcpgp2, e que apresenta alta homologia com genes PTR1 de L. major e L. tarentolae. A
proteína PTR1 está envolvida em várias reações de óxido-redução. A amplificação e super-
expressão do gene PTR1 em Leishmania promove resistência a antifolatos, como metotrexato
(MTX). Este gene é contíguo ao gene pgpA, ambos localizados no elemento
extracromossomal H (OUELLETTE e BORST, 1991; PAPADOPOULOU et al, 1994). pgpA
não está relacionado à resistência MTX mas confere resistência aos antimoniais (EL FADILI
et al., 2005; MUKHERJEE et al, 2007). A presença de dois genes contíguos, envolvidos na
resistência a drogas, sugere que genes relacionados a mecanismos de detoxificação podem ser
co-transcritos em Leishmania de forma policistrônica (ROBELLO et al., 1997).
Formas epimastigotas de T. cruzi, transfectadas com o gene PTR1 do próprio parasito,
apresentaram aumento na resistência a antifolatos, como MTX, aminopterina e trimetroprima,
sugerindo que existe homologia funcional entre PTR1 de Leishmania e de T. cruzi
(ROBELLO et al., 1997).
27
Em clones de T. cruzi com resistência a BZ induzida in vitro por pressão seletiva, foi
verificada a deleção de três dos quatro genes que codificam a old yellow enzyme (TcOYE),
com conseqüente redução do nível de expressão deste gene e da proteína, quando comparado
com o fenótipo sensível (MURTA et al., 2006). A proteína TcOYE é uma flavina
oxidoredutase NAD(P)H dependente, que pode estar envolvida no metabolismo do BZ,
gerando radicais ânion tóxicos para o parasito. Cabe ressaltar, no entanto, que a expressão do
gene TcOYE encontra-se reprimida unicamente em parasitos com resistência induzida, mas
não em parasitos que apresentaram resistência natural ao BZ (MURTA et al., 2006).
Mais recentemente, foi descrito que os nitroderivados NFX e BZ são ativados por uma
nitroredutase própria de T. cruzi e T. brucei para exercer a sua ação tripanocida
(WILKINSON et al., 2008). A perda de uma cópia do gene que codifica esta nitroredutase
mitocondrial, dependente de NADH, é suficiente para causar resistência a uma variedade de
drogas nitroheterocíclicas.
Superóxido dismutases (SOD) também foram implicadas no fenótipo de resistência a
drogas em T. cruzi. Esta classe de enzimas atua removendo o excesso O2.-, gerado no estresse
oxidativo, via dismutação a O2 e H2O2. Temperton et al. (1998) transfectaram formas
epimastigotas com um vetor contendo o gene Fe-SOD e observaram que a super-expressão
desta enzima promovia um aumento na suscetibilidade ao BZ. Por outro lado, em trabalho
posterior, Nogueira et al. (2006) verificaram que parasitos com resistência a BZ induzida in
vitro apresentavam super-expressão de FeSOD-A. Estes autores levantaram a possibilidade de
que nesses parasitos haveria também a super-expressão de outras enzimas antioxidantes
envolvidas no metabolismo de H2O2 e, desta forma, ocorreria a detoxificação do
hidroperóxido, promovendo o fenótipo de resistência.
Utilizando-se a técnica RADES (random differentially expressed sequences), foi
observada a expressão diferencial de transcritos em populações de T. cruzi expostas a BZ em
concentrações correspondentes ao seu CI50 natural e em populações com resistência induzida
à droga (VILLARREAL et al., 2005).
O conjunto de dados descritos acima sugere que o fenótipo de resistência a BZ seja
resultante da ação de diferentes mecanismos, que podem atuar de forma independente ou
concertada.
28
1.5 Alvos para a quimioterapia da doença de Chagas
Embora BZ e NFX sejam as únicas drogas utilizadas no tratamento da doença de
Chagas, ambas são pouco eficientes na fase crônica da doença e apresentam efeitos colaterais
indesejáveis para o paciente (URBINA e DOCAMPO, 2003). Desta forma é necessário o
desenvolvimento de novas drogas que contemplem vários requisitos, tais como: sejam
eficazes contra todos os estágios de desenvolvimento do parasito; não tenham efeitos
colaterais para o paciente; possam ser administradas por via oral; sejam estáveis nas
condições de uso; e sejam de baixo custo. Idealmente, estas drogas deveriam ser dirigidas
para um alvo molecular específico, representado por enzimas ou vias metabólicas próprias do
parasito, ou então, encontradas tanto no hospedeiro quanto no parasito, porém, essenciais para
a sobrevivência apenas do parasito. Graças aos progressos da pesquisa da bioquímica e
fisiologia do parasito (DE SOUZA, 2002), e, mais recentemente, graças à publicação do
genoma de T. cruzi (EL-SAYED et al., 2005) algumas enzimas foram identificadas como
potenciais alvos para novas drogas. Dentre elas cita-se a cruzipaína (CAZZULO, 2002), a
tripanotiona redutase (ARIYANAYAGAM e FAIRLAMB, 2001), a gliceraldeído 3 fosfato
desidrogenase glicossomal (gGAPDH) (OPPERDOES, 1987), enzimas da via de síntese de
ergosteróis (URBINA, 1997) e vias de transdução de sinal (NAULA; PARSONS;
MOTTRAM, 2005).
1.6 Projeto genoma de Trypanosoma cruzi
Em 1994, foi lançado o projeto de seqüenciamento do genoma de T. cruzi por
iniciativa do UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in
Tropical Diseases (TDR). Para este projeto foi selecionada uma cepa de referência, o clone
CL Brener, que recebeu este nome em homenagem ao Prof. Zigman Brener, quem o isolou e
clonou em seu laboratório no Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ, Belo Horizonte)
a partir de formas tripomastigotas sangüíneas obtidas de camundongos infectados com a cepa
CL.
CL Brener apresenta características biológicas importantes (ZINGALES et al., 1997a;
b): originalmente deriva de Triatoma infestans, um vetor estritamente domiciliar (BRENER e
CHIARI, 1963); é muito infectante para camundongos; tem parasitismo preferencial por
células musculares e cardíacas (MELO e BRENER, 1978); tem habilidade de se diferenciar in
29
vitro; infecta monocamada de células e é suscetível a drogas utilizadas no tratamento da
doença de Chagas (FILARDI e BRENER, 1987).
A tipagem molecular baseada no tamanho do amplicon do gene de rRNA 24Sα
(SOUTO et al., 1996) indica que CL Brener pertence ao grupo T. cruzi II; por outro lado, uma
série de marcadores moleculares mostram que CL Brener é um organismo “híbrido”, que
pode ter sido originado da hibridização entre cepas dos subgrupos IIb e IIc e grupo T. cruzi I
(PEDROSO; CUPOLILLO; ZINGALES, 2003; STURM et al., 2003; BRISE et al., 1998;
MACHADO E AYALA, 2001; GAUNT et al., 2003; WESTENBERGER; STURM e
CAMPBELL, 2006.). O cariótipo molecular de CL Brener foi estabelecido como contendo
vinte bandas cromossômicas, que podem ser divididas em duas classes levando em conta o
tamanho das mesmas: um grupo composto de doze bandas de 1,0 até 3,5 Mb e outro grupo de
oito bandas que variam de 0,45 até 1,0 Mb (CANO et al., 1995). Com base na análise
densitométrica de cromossomos separados por eletroforese em campo pulsado foi estimado
um tamanho do genoma de 87 Mb (CANO et al., 1995). Foi observado que o cariótipo é
estável mesmo depois de 100 gerações de repiques em meio LIT (ZINGALES et al., 1997a).
Uma das primeiras atividades do projeto genoma foi a construção e seqüenciamento de
bibliotecas de etiquetas de seqüências transcritas (ESTs). As ESTs representam uma
abordagem rápida e de baixo custo para a descoberta de novos genes e análise do estado
metabólico de determinado estágio de desenvolvimento a partir da classificação funcional dos
transcritos. Foram construídas bibliotecas normalizadas e não normalizadas de formas
epimastigotas (BRANDÃO et al., 1997; URMENYI et al., 1999; VERDUN et al., 1998)
gerando um total de cerca 10.000 seqüências. Mais tarde, foram obtidas cerca de 2.800 ESTs
de formas amastigotas e tripomastigotas (AGUERO et al., 2004). Em geral, as seqüências
depositadas no NCBI (National Center for Biotechnology) referem-se a cerca de 300 pb da
região 5’ do cDNA e, mais raramente, da região 3’ do cDNA. A análise das ESTs de T. cruzi
indica que cerca de 68% das seqüências dos estágios do hospedeiro mamífero não apresentam
similaridade com ESTs da forma epimastigota, devendo ser transcritos estágio-específicos e
de potencial interesse para o entendimento da patogenia da doença de Chagas.
Além de bibliotecas de ESTs, também foram construídas bibliotecas de fragmentos
genômicos, clonados em vetores de grande capacidade como YACs, BACs e cosmídeos
(ZINGALES, 1997a).
O seqüenciamento do genoma, de fato, foi acelerado quando foi utilizada a estratégia
de Whole Genome Shotgun, adotada pelo Trypanosoma cruzi Sequencing Consortium (TSK-
TSC) formado por três centros de seqüenciamento: The Institute for Genomic Research
30
(TIGR), Seattle Biomedical Research Institute e Karolinska Insitute, e de diversos
laboratórios do Hemisfério Norte e América Latina (EL-SAYED et al., 2005). Os parâmetros
para a montagem (assembly) dos dados foram adaptados para contemplar a grande variação
alélica. Na montagem, muito contribuiu o seqüenciamento do genoma da cepa Esmeraldo
(cobertura de 2,5 vezes), pertencente ao subgrupo IIb e tida como um dos progenitores da
cepa CL Brener. No genoma de CL Brener foi possível distinguir dois haplótipos em muitos
casos (EL-SAYED et al., 2005). Neste sentido, salienta-se que no GenBank a seqüência de
muitos “alelos” de CL Brener é indicada como Esmeraldo-like haplotype e non-Esmeraldo-
like haplotype. De acordo com os dados atuais de montagem, o genoma de CL Brener é
constituído por 5.489 scaffolds (que contém 8.740 contigs), totalizando 67 Mb. Com base nos
resultados de montagem, o tamanho do genoma diplóide de CL Brener foi calculado como
sendo de 106,4 a 110,7 Mb. Este valor é superior àquele estimado anteriormente como sendo
87 Mb, baseado no cariótipo molecular (CANO et al., 1995). Uma função putativa foi
atribuída a 50,8% dos genes codificadores de proteína, com base na análise de similaridade
com proteínas ou domínios funcionais previamente caracterizados. Cerca de 50% do genoma
de CL Brener é representado por seqüências repetitivas, tais como retrotransposons e famílias
multigênicas que codificam proteínas de superfície (trans-sialidases, mucinas, gp63s e mucin-
associated surface proteins - MASP). A presença de seqüências reiteradas dificultou muito a
montagem do genoma e, desta forma, o genoma ainda não está definido em sua totalidade.
Estima-se que o genoma diplóide de CL Brener contenha aproximadamente 22.570
genes cuja média de tamanho é de 1.513 pb. Destes genes, 6.159 representam alelos do
haplótipo Esmeraldo, 6.043 representam alelos do outro haplótipo e 10.368 representam
seqüências que não puderam ser atribuídas a um haplótipo particular. Os genes de RNA, que
incluem tRNA, rRNA, slRNA, snRNA, snoRNA e srpRNA perfazem um total de cerca de
550 genes. O conteúdo de G+C de todo o genoma é de 51%, sendo que o conteúdo de G+C
das regiões codificadoras (53,4 %) é maior do que das regiões intergênicas (47%). Os genes
codificadores de proteína estão dispostos em grandes agrupamentos (clusters) de dezenas a
centenas de genes. Agrupamentos contíguos estão localizados na mesma fita de DNA na
maior parte das vezes. Funções putativas puderam ser atribuídas a 50,8% dos genes preditos
para proteínas.
31
1.7 Microarranjos de DNA
Os microarranjos de DNA ou chips de DNA consistem em uma coleção de seqüências
nucleotídicas fixadas a uma lâmina de vidro, resina ou plástico como pontos microscópicos
em uma ordem específica. As seqüências imobilizadas na lâmina podem ser de DNA
genômico, cDNA, ou oligonucleotídeos que representam a fase aberta de leitura dos genes.
Na tecnologia desenvolvida pela Affymetrix, pequenos oligonucleotídeos podem ser
sintetizados in situ diretamente sobre a lâmina (LOCKHART et al., 1996).
A tecnologia dos microarranjos também está sendo aplicada na área da proteômica.
Atualmente, existem disponíveis lâminas com proteínas imobilizadas, que permitem o estudo
de interações proteína-proteína, proteína-droga e modificações pós-traducionais, entre outros
(STEARS; MARTINSKY e SCHENA, 2003; HALL; PTACEK e SNYDER, 2007).
As lâminas de microarranjos contendo seqüências nucleotídicas são utilizadas para
duas finalidades principais: em estudos de genômica comparativa e na análise da expressão
diferencial de genes. Neste caso, representa uma ferramenta muito poderosa para a descoberta
de genes envolvidos em diversos processos biológicos, uma vez que é possível fazer uma
varredura da expressão de milhares de genes ao mesmo tempo, ou seja, um estudo de
expressão gênica em larga escala (SCHENA et al., 1995). A grande massa de dados que é
obtida com a tecnologia de microarranjos de DNA proporciona pistas para entender processos
moleculares ou vias complexas envolvidas no funcionamento da célula em determinada
condição (BOOTHROYD et al., 2003).
A descoberta dos genes se baseia na hibridização de sondas marcadas, provenientes de
amostras biológicas de diferentes tecidos, cepas, estágios de desenvolvimento ou condições
ambientais/fisiológicas (STEARS et al., 2003). As amostras-problema, que podem ser DNA
ou cDNA, são marcadas com fluoróforos e a abundância das sondas é determinada a partir da
hibridização diferencial com as seqüências fixadas na lâmina.
Para gerar a informação sobre a expressão diferencial, as amostras podem ser
marcadas com um ou dois fluoróforos. No primeiro caso, as amostras são marcadas e
hibridizadas em lâminas diferentes e depois as imagens são sobrepostas, comparadas e
analisadas. No segundo caso, duas amostras são marcadas com fluoróforos diferentes,
usualmente Cyanine3 (Cy3) e Cyanine5 (Cy5), e hibridizadas simultaneamente na mesma
lâmina que depois é varrida com laser para gerar imagens a partir dos dois canais para a
posterior análise dos dados (STEARS et al., 2003) (Figura 7).
32
Figura 7 - Análise de expressão diferencial de genes por microarranjos de DNA. A- análise usando um único fluoróforo e duas lâminas para gerar os perfis de expressão de duas ou mais amostras. B- análise usando dois fluoróforos e uma única lâmina para gerar os perfis de expressão de duas amostras diferentes (Figura extraída e adaptada de STEARS, 2003).
As duas formas de gerar a informação de expressão diferencial por microarranjos
foram comparadas em termos de reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade,
verificando-se que produzem resultados comparáveis (PATTERSON et al., 2006).
De forma geral existem dois tipos de desenhos experimentais ao se aplicar
microarranjos para questões comparativas (EISEN e BROWN, 1999) (Figura 8). No
experimento de tipo I, duas amostras são marcadas com diferentes corantes fluorescentes e, a
condição A é comparada com a condição B. Este tipo de experimento requer que todas as
comparações sejam realizadas em pares e não permite comparar dados de vários
microarranjos e experimentos. Os experimentos do tipo II utilizam uma amostra referência
que é marcada com um dos dois fluoróforos e é sempre co-hibridizada na mesma lâmina com
a amostra problema marcada com o outro corante. Este desenho permite comparação de dados
de diferentes experimentos (BOOTHROYD et al., 2003)
A B
33
Figura 8 - Comparação dos desenhos experimentais de Tipo I e Tipo II para análises de microarranjos (Figura extraída e adaptada de BOOTHROYD et al., 2003).
A escolha de um ou outro desenho experimental depende do tipo de pergunta
levantada. Por exemplo, em um experimento onde as amostra são extraídas de quatro tempos
diferentes: T1, T2, T3 e T4, a pergunta pode estar direcionada a descobrir diferenças de
expressão entre T1 e todos os outros tempos (experimento de tipo II, Figura 8b) ou então, a
expressão entre os tempos consecutivos T1-T2, T2-T3 e T3-T4 (experimento tipo I, Figura
8a) (ARMSTRONG e VAN DE WIEL, 2004). Supondo que os quatro pontos temporais
sejam de amostras de um tecido em desenvolvimento, provavelmente um experimento tipo I
permite explorar maior informação do quadro de expressão de genes ao longo do processo de
desenvolvimento. Por outro lado, quando se quer comparar a diferença de expressão de genes
em amostras diferentes, um experimento de tipo II provavelmente seria o mais adequado.
Esta última abordagem foi utilizada no estudo de tumores (ALIZADEH e STAUDT, 2000).
A tecnologia de microarranjos visando descobrir a expressão diferencial de genes tem
sido aplicada com sucesso a um grande número de problemas biomédicos e biológicos que
incluem o estudo de câncer (ALIZADEH e STAUDT, 2000; ALIZADEH et al., 2000;
SORLIE et al., 2001; MÉNDEZ et al., 2002), a metamorfose de Drosophila melanogaster
(WHITE et al., 1999), a expressão diferencial em bactérias (SEO et al., 2007; MÄURER et
al., 2007; COLANGELI et al., 2007), e a expressão diferencial em fungo (MEYER et al.,
2007).
Na atualidade, a tecnologia de microarranjos está sendo utilizada também para análises
clínicas, como por exemplo, na identificação rápida e com grande sensibilidade e
especificidade de cepas virais (MEHLMANN et al., 2007). Também se aprecia a
34
possibilidade de utilizar esta tecnologia no prognóstico da resposta à terapia em pacientes com
câncer de mama, individualizando desta forma o tratamento (MURPHY; MILLAR; LEE,
2005; SIMS et al., 2006), assim como no prognóstico de doenças crônicas hepáticas e
carcinoma hepatocelular (LEMMER; FRIEDMAN; LLOVET, 2006).
Além do uso nos estudos de expressão diferencial de genes, os experimentos de
microarranjos podem ser usados para uma análise comparativa de genomas. Em parasitologia,
os experimentos de microarranjos podem ser direcionados a entender a patogênese e estudar,
por exemplo, o que torna uma cepa de uma determinada espécie virulenta e a outra cepa
avirulenta, como é o caso de Entamoeba histolytica e E. dispar cujos genomas apresentam
cerca de 98% de identidade. No entanto, a primeira é patogênica e a segunda coloniza o
intestino do hospedeiro sem causar transtorno (DIAMOND e CLARK, 1993).
Outra aplicação interessante, ainda no contexto da análise comparativa de genomas, é
a utilização de microarranjos de DNA para estudar cepas atenuadas para vacina, como é o
caso dos bacillus Calmette–Géurin (BCG), que são clones derivados da bactéria virulenta
Mycobacterium bovis e que são comumente utilizados como vacina para prevenir tuberculose
(TB). Os experimentos de microarranjos realizados em lâminas Affymetryx GeneChipTM
contendo o genoma de M. tuberculosis e utilizando DNA genômico marcado de BCG
mostram que a falta de uma região chamada RD1 em BCG está associada com a atenuação da
virulência (MOSTOWY et al., 2003).
A tecnologia de microarranjos tem sido efetiva também como ferramenta para a
análise da expressão diferencial de genes em parasitos protozoários como Plasmodium
(HAYWARD et al., 2000; BOZDECH et al., 2003; GISSOT et al., 2004) e Toxoplasma
gondii (SINGH; BREWER e BOOTHROYD, 2002; CLEARY et al., 2002).
Em parasitos da ordem Kinetoplastida a utilização da tecnologia de microarranjos
revelou a expressão estágio específica de genes de T. brucei (DIEHL et al., 2002) e L. major
(SAXENA et al., 2003).
Até 2003, um único trabalho havia sido publicado mostrando a aplicação de um
microarranjo construído com clones genômicos e fases abertas de leitura de T. cruzi para
identificar a expressão diferencial de genes durante a transformação de formas tripomastigotas
da cepa Brazil em amastigotas (MINNING et al., 2003). Uma vez que isolados de T. cruzi
apresentam elevada diversidade genética, nosso laboratório avaliou se microarranjos de DNA
contendo predominantemente ESTs de CL Brener podiam ser usados para estudos de
genômica comparativa e para investigar a expressão diferencial de genes em cepas do
parasito. Para esta finalidade, foi construído um protótipo de lâmina de microarranjo contendo
35
710 ESTs e 20 genes bem caracterizados de diversas cepas de T. cruzi (BAPTISTA et al.,
2004). O microarranjo foi hibridizado com DNA ou cDNA de dois pares de cepas: CL Brener
(T. cruzi II, híbrido) e Silvio X10 cl1 (T. cruzi I) e duas cepas T. cruzi II, isoladas,
respectivamente, de um indivíduo assintomático e de um paciente com manifestações
cardíacas e digestivas. Várias seqüências com hibridização diferencial foram confirmadas por
Southern e northern blot. Os resultados deste trabalho mostraram a utilidade dos
microarranjos para estudos comparativos entre cepas e confirmaram que T. cruzi possui um
grau elevado de regulação pós-transcricional para controlar a abundância de RNA
(BAPTISTA et al., 2004). Mais recentemente, nosso laboratório analisou a transcrição
diferencial de genes em cepas isoladas de indivíduos assintomáticos e com cardiopatia
chagásica utilizando microarranjos de DNA, e identificou alguns genes que teriam aplicação
potencial para o diagnóstico/prognóstico da cepa infectante e no estudo da patogênese da
doença de Chagas (BAPTISTA et al., 2006). Microarranjos de DNA também foram utilizados
para verificar a diferença de expressão em cepas de T. cruzi sensíveis e resistentes a BZ
(MURTA et al., 2006). Foi verificado que transcritos da old yellow enzyme eram seis vezes
menos abundantes na cepa com resistência à droga induzida in vitro, mas não variavam nas
cepas naturalmente resistentes.
Esta tecnologia também tem sido utilizada no estudo da expressão temporal de genes
de células humanas em cultura infectadas com T. cruzi (VAENA DE AVALOS et al., 2002) e
de células do miocárdio de camundongos infectados in vivo (GARG; POPOV;
PAPACONSTANTINOU, 2003).
36
2 OBJETIVOS
O presente estudo tem como objetivo geral investigar diferenças de expressão gênica
em cepas de T. cruzi naturalmente suscetíveis ou resistentes a Benznidazol, utilizando a
tecnologia de microarranjos de DNA. Espera-se com isto poder caracterizar genes
potencialmente envolvidos no processo de resistência e/ou relacionados com o mecanismo de
ação desta droga.
São objetivos específicos do projeto:
1. A padronização de um ensaio para quantificar a suscetibilidade in vitro de cepas de T. cruzi
a BZ.
2. O preparo de lâminas de microarranjo contendo Etiquetas de Seqüências Transcritas (ESTs)
das formas epimastigota e amastigota de CL Brener.
3. A análise da expressão diferencial de genes em cepas suscetíveis e resistentes a BZ.
4. A validação de algumas seqüências gênicas por northern blot e PCR em tempo real.
5. A aplicação do teste de suscetibilidade a BZ em isolados humanos de pacientes submetidos
a tratamento com a droga.
37
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Soluções
- PBS - Tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2; NaCl 150 mM
- SDS - lauril sulfato de sódio
- SSC 1x - NaCl 0,15 M; citrato de sódio 0,015 M, pH 7,0
- SSPE 20X -NaCl 3 M; NaH2PO4 H2O 0,2 M; EDTA 0,02 M, pH 7,4
- TBE 1x – Tris-ácído bórico 90 mM; EDTA 2 mM, pH 8,0
- TE - Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0
- MOPS - ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico 20 mM, acetato de sódio 5 mM, EDTA 1
mM.
3.2 Reagentes e enzimas
- Sais e solventes diversos - Merck
- RNAse, Meio de cultura para diferenciação Grace, DEAE-Celulose (D3764), Dietil
pirocarbonato; Formamida deionizada - Sigma
- Enzimas de restrição - New England Biolabs
- Matriz de nylon Hybond-N e Kit para extração de DNA de gel (GPX), [α-P32]dATP (3.000
Ci/mmol) - Amersham Biociences
- Inibidor de RNAse (RNAsin) (Recombinant Rnasin R, Inhibitor 10,000 U (400 U/µL));
Ribonuclease H (RNAse H); RQ1 RNAse-Free DNAse 1,000 U (1U/µL) - Promega
- Fragmento Klenow da DNA polimerase e DNAse - Boehringer Mannheim
- Trizol reagent - Invitrogen
- Random Primer DNA Labeling System - Life Technologies
- Taq DNA Polimerase - Gibco
- Cy3-dCTP; Cy5-dCTP; dNTP set (Ultrapure); Microarray hybridization buffer; Nonamer
primers; Randon primers (hexameros); Nucleotide mix; Oligo dT primers (Anchored dT25);
Microarray crosslinking reagent - Amersham Pharmacia Biotech
- Formamida super pure - Fisher Scientific:
- Guanidine Hydrochloride; Superscript ™ II RNAse H (10.000unid/epp); Bioprime DNA
labeling System (Klenow fragment 40unidades/ul) – Invitrogen.
38
- SDS 20% solution ultrapure; SSC 20X solution, pH 7,0; Água RNAse free - USB
3.3 Oligonucleotídeos
- Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação das ESTs:
T7 (5´-GTAATACGACTCATAGGGC-3´), T3 (5´- AAC CCT CAC TAA AGG G-3´).
- As seqüências dos iniciadores utilizados nos experimentos de PCR em tempo real estão
descritos na tabela 1.
Tabela 1. Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados nos experimentos de PCR em tempo real.
Gene GenBank Seqüência dos oligonucleotídios
5’ – 3’
Triparedoxina peroxidase Citossólica
XM_803661.1 TCAATGAGACGGCGCTGAT ACCAGCCACTTGCCCTTGTA
Tripanotiona sintetase XM_814378.1 TAGCCGATCAGAACCGCTTT TCAACACATTCCAGCGGAAA
FeSOD-A1 XP_804176.1 CTGGCAGGGACAACATACGA CCTTCTTCTCGGCGTCATTT
FeSOD-A2 XM_805945.1 GGGCCTCTCCGTCTTTCTTC GTAACGTCCGGCGCATTT
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; normalizador)
XM_814806 GACGACACGCCCATGTTTG ACGAGGCGTTGGAGACGAT
Transportador de membrana TcABCG1(gene completo)
XM_813521
GTGAACGCAAACGCACAAGTA GAGGTGGGTTCATCCAGCAA
Transportador ABC TcABCG1(fragmento de 615 pb)
XM_813521
ACTTTGAGTCCATCGGATTCCCTTG TATACTGGATGGTGGGTCTTTACCG
Transportador de membrana MatE XM_811151 GCCTTTGAAGTGCAGGCATT TGTTCATTGCCACACCAAAAA
Calpaína-símile 3 XM_801272 CTGGAGTCCGGTGAGCATTT TCACACGGCCTTCGATGAA
Calpaína-símile 8 XM_811603 GGAAAATGGAAGAGACATCCAATT CCATCCAAAATGTTCCATCGT
Transportador de membrana TcABCD1
XM_814141
GTGGCTTCACGCGTGTTG GTGTGACCGCATTCGTTGAT
Nitroredutase (NTR)
XM_805552
CATGACGGTACGGGCTCCTA CGTTGCTCCTCCTCGTGTATG
TcOYE
U31282
CATGTACCAAGGACGGAATCG CGCCTCGGCAATGATAAGAC
Tcpgp1 L20818 TTGTTGTGGCGGTTGTCTTTT TGGCTGGGAACACAATGGT
Tcpgp2
Z49222
GCGTCACGTCACAGCTCAAT AGGATACGGTCACGTGTCATGTC
39
3.4 Cultivo celular
3.4.1 Cultura de formas epimastigotas
Formas epimastigotas das cepas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT (Liver
Infusion Tryptose) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). O meio foi preparado
segundo Castellani et al. (1967). As culturas foram mantidas a 28°C sem agitação e repicadas
na fase exponencial de crescimento. Para a extração de ácidos nucléicos, um total de 5 x 108
células (para RNA) e de 109 células (para DNA) foram lavadas 2 vezes com PBS 1X e os
sedimentos foram estocados em nitrogênio liquido.
3.4.2 Obtenção de formas de cultura de tecidos
A infecção de monocamadas de células LLCMK2 (células epiteliais de rim de Macaca
mulatta) foi iniciada com formas tripomastigotas metacíclicas. Estas foram obtidas a partir da
diferenciação de 2 x 107 epimastigotas/mL em meio LIT-10% SFB contendo 20% (v/v) de
meio de inseto Grace (Sigma), a 28oC, por 7-10 dias (ZINGALES et al., 1997a). As
monocamadas foram cultivadas em frascos de 75 cm2 de área contendo 15 mL de meio DME
(Dulbecco’s modified Eagle) com 10% de SFB, 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL
de estreptomicina a 37°C em uma atmosfera úmida de 5 % de CO2. As células foram
propagadas a cada três dias após a digestão com tripsina (ZINGALES et al., 1982).
As monocamadas de LLCMK2 foram cultivadas até semi-confluência.
Tripomastigotas metacíclicos (1,2 × 107 parasitos) foram adicionados às monocamadas e
incubados por 24 horas a 34°C em atmosfera de 5% de CO2 em meio DME-2% de SFB. Após
24 horas, o meio foi aspirado para remover os parasitos que não foram interiorizados. As
monocamadas foram mantidas em meio DME-2% SFB, nas condições acima. Uma alíquota
do sobrenadante foi analisada ao microscópio óptico a cada dois dias, para verificar a
presença de parasitos. Esses foram utilizados para propagar a infecção das monocamadas.
Formas tripomastigotas e amastigotas extracelulares foram recuperadas do meio de cultura
após centrifugação a 7000 rpm, por 7 minutos a 4°C. Os parasitos foram utilizados
imediatamente nos ensaios de sensibilidade a BZ. Alternativamente, foram lavados com PBS
como descrito acima e estocados em N2 líquido para extração de RNA.
40
3.5 Extração de ácidos nucléicos
3.5.1 Extração de DNA total
Para a extração de DNA, foi realizado o procedimento descrito por Gruber e Zingales
(1993). O sedimento celular (109 células) foi ressuspendido em 1 mL de tampão de lise (NaCl
0,1 M; EDTA 0,25 mM; proteinase K 100 µg/mL; lauril sarcosinato de sódio 0,5 % (p/v);
RNase A (livre de DNase) 10 µg/mL), e incubado a 50 ºC por 30 minutos, com agitação a
cada 5 minutos. A extração foi feita com volume igual de fenol, agitação leve por uma hora à
temperatura ambiente e centrifugação por 5 minutos a 1500 g. A fase aquosa foi retirada e
extraída por mais duas vezes com igual volume clorofórnio/álcool isoamílico (24:1) e
centrifugação (1500 g por 30 segundos). A fase aquosa foi dialisada contra 1 litro de tampão
(Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM) durante a noite, com agitação constante a 4ºC. Foi
acrescentada RNase A (livre de DNases) para a concentração final de 100 µg/mL, seguida de
incubação a 37ºC por 3 horas. O DNA foi purificado por uma extração com igual volume de
fenol e dialisado com TE a 4ºC durante a noite. A concentração de DNA foi determinada pela
leitura da absorbância a 260 nm. A presença de contaminações foi verificada pela leitura da
absorbância a 280 nm, 230 nm e 270 nm.
3.5.2 Extração de RNA total
A extração do RNA total foi realizada com o reagente Trizol - Invitrogen (solução de
fenol e isotiocianato de guanidina). O sedimento de parasitos foi ressuspendido em 1 mL de
Trizol frio e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente. Um volume de 200 µL de
clorofórmio foi adicionado, incubado por 3 minutos à temperatura ambiente seguido de
centrifugação a 12000 rpm por 15 minutos de 2 a 8 °C. A fase aquosa (contendo o RNA) foi
coletada e misturada com 0,5 mL de isopropanol e incubado por 10 minutos à temperatura
ambiente seguido de centrifugação nas condições anteriores. O sobrenadante foi descartado. O
precipitado de RNA foi lavado com etanol 75% gelado, seguido de nova centrifugação (10000
rpm por 5 minutos). O precipitado foi seco com bomba de vácuo e então ressuspendido em 35
µL de água tratada com DEPC. Para eliminar a contaminação do RNA com DNA, a amostra
foi tratada com 10U de DNAse (Promega) por 30 minutos a 37 °C, extraída com fenol,
41
precipitada com etanol e analisada por eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com
brometo de etídio.
Nota: Todo o material e os reagentes foram tratados para eliminar contaminação por RNases
conforme recomendações descritas (SAMBROOK et al., 1989).
3.6 Lâmina de microarranjos preparada por nós
3.6.1 Sondas para a construção da lâmina de microarranjos
3.6.1.1 Agrupamento das seqüências – CAP3
Para a construção da lâmina de microarranjos tínhamos disponíveis 1233 clones e
respectivas seqüências de ESTs de amastigotas de CL Brener (gentilmente cedidos pelo Dr.
Antonio González do Instituto de Parasitología y Biomedicina, Granada, Espanha), 44 ESTs
de amastigotas da cepa Tulahuén (gentilmente disponibilizadas pela Dra. Santuza Teixeira da
UFMG) e 723 clones e seqüências de ESTs de epimastigotas de CL Brener (gentilmente
cedidos pelos Drs. Wim Degrave e Adeilton Brandão da FIOCRUZ), perfazendo um total de
2000 seqüências. Para evitar redundância na lâmina, as seqüências foram submetidas a um
processo de agrupamento com CAP3 – Contig Assembly Program (HUANG e MADAN,
1999). O programa fornece também a seqüência consenso de cada grupamento assim como a
relação de singletons (seqüências que não formam parte de nenhum agrupamento).
3.6.2 Amplificação, análise e purificação de ESTs
3.6.2.1 Amplificação das ESTs (em Placas de 96 poços)
Na reação de amplificação foram utilizados de 1 a 5 ng de DNA (para isso o DNA das
ESTs estoques foi diluído em 1:50 e somente 5 µL foram utilizados para amplificar). As
amplificações foram feitas na presença de 0,5 µM de cada oligonucleotídeo iniciador (T3 e
T7), 0,2 mM de dNTPs, tampão de DNA polimerase 10X (pH 8,8; (NH4)2SO4 160 mM; Tris-
HCl 670 mM, Tween 20 0,1%), MgCl2 1,5 mM, 1U de DNA polimerase (BIOLASE) em um
volume final de 100 µL, em placas de 96 poços. O termociclador utilizado foi PTC200 MJ de
42
96 poços. As temperaturas utilizadas foram: desnaturação a 94 oC por 4 minutos, seguida de
40 ciclos de três temperaturas: 1 min a 94 oC para desnaturação, 1 min a 55 oC para
anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores e 1 min a 72 oC para extensão, terminando-se
com incubação a 72 oC por 7 minutos.
3.6.2.2 Análise dos produtos de amplificação
Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,2%.
Como marcador de tamanho molecular foi utilizado o Mass ladder da Pharmacia. O gel foi
submetido à eletroforese com voltagem de 100V por 30 minutos. O gel foi fotografado em
transiluminador com luz UV.
3.6.2.3 Purificação dos produtos de PCR
Para a purificação dos produtos de PCR foram utilizadas as placas da Millipore (placas
de 96 poços). Inicialmente foram adicionados 10 µL de tampão de ligação do PCR (PCR
Binding Buffer-Guanidina HCl 7M; Tampão MÊS 200 mM, pH 5,6) em cada poço da placa
Millipore que foi centrifugada a 2800 rpm por 1 minuto. Em seguida, foram adicionados 100
µL tampão de ligação da PCR em cada poço da placa contendo os produtos amplificados.
Após misturar bem, todo líquido foi transferido para a placa Millipore que novamente foi
centrifugada a 2800 rpm por 1 minuto, a 25 oC. O líquido foi descartado e a placa foi lavada
duas vezes: uma vez com 200 µL de etanol 80% com posterior centrifugação a 2800 rpm por
1 minuto e uma segunda vez com etanol 80% com centrifugação a 2800 rpm por 12 minutos.
O DNA foi eluído com 50 µL de TE em placas de 96 poços após centrifugação a 3000 rpm
por 5 minutos. A análise da purificação foi feita em gel de agarose como descrito acima.
3.6.3 Construção da lâmina de microarranjos
As seqüências amplificadas e purificadas foram distribuídas em quatro microplacas de
384 poços (Amersham Pharmacia Biotech) em uma proporção 1:1 (10 µL de produto de PCR
: 10 µL de reagente D Microarray crosslinking (DMSO)). O reagente DMSO permite uma
melhor fixação das amostras de DNA na lâmina. A distribuição das seqüências nas
microplacas foi necessária para a deposição das mesmas na lâmina de microarranjos devido
43
ao número de agulhas do aplicador Molecular Dynamics (spotter de 12 agulhas) do robô
Generation III Array spotter. As seqüências foram imobilizadas em lâminas de vidro do tipo
7, recobertas com uma solução de 3-aminopropiltrimetoxisilano e DMSO. Entre o vidro e esta
solução existe uma película de metal. Depois da imobilização das seqüências, estas foram
irradiadas com luz ultravioleta de 254 nm (Stratagene lamp) com 50 mJ total de energia.
3.6.4 Qualidade da lâmina de microarranjos
3.6.4.1 Marcação de DNA total com fluoróforos
A qualidade da lâmina foi verificada por hibridização com DNA total marcado com
dois fluoróforos. Para isto, 5 µg de DNA total de CL Brener (por reação) foi fragmentado
mecanicamente por passagens consecutivas por uma agulha de seringa de insulina de 1 mL.
Aos tubos contendo o DNA foram adicionados 20 µL de 2,5X buffer (Tris 125 mM, pH 6,8;
MgCl2 12,5 mM; 2-mercaptoetanol 25 mM) e 2 µg de nonâmeros. As reações foram
desenvolvidas a 100 ºC por 5 minutos e, em seguida, colocadas em gelo. Após desnaturação
do DNA, a cada amostra foram adicionados 3 µL de 10X dNTP mix, 60 µM (Amersham
Biosciences) de Cy3-dCTP em uma reação, 10 µL de Cy5-dCTP na outra e 40 U da enzima
Klenow em cada reação. Em seguida, os tubos foram incubados por duas horas a 37 ºC para a
incorporação dos fluoróforos nos fragmentos de DNA. Após este período, a reação foi
interrompida por adição de 5 µL de EDTA 0,5M, pH 8.0.
3.6.4.2 Purificação de DNA marcado
Para retirar os fluoróforos não incorporados, os fragmentos de DNA foram purificados
adicionando-se 80 µL de Filter Binding Buffer (guanidina HCl 5,3 M; KOAc 150 mM, pH
4,8) e colocando-se imediatamente todo o volume em um poço de uma placa com flitro
millipore de 96 poços. Foi utilizada uma placa em fundo U para a coleta do líquido de
descarte após centrifugação a 1000 g por um minuto. O DNA ligado ao filtro foi lavado
quatro vezes com 200 µL de etanol 80%. Depois de cada lavagem seguiu-se uma
centrifugação de 1000 g por 1 minuto, usando-se a placa em fundo U para coletar as lavagens.
Após lavagens, o DNA no filtro foi seco por centrifugação a 1200 g por 5 minutos e então
eluído com 3 volumes de 30 µL de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, seguido de centrifugação por 1
44
minuto a 1000 g depois de adicionar cada volume. Foi utilizada uma placa em fundo U nova
para coletar o eluato contendo o DNA marcado.
3.6.4.3 Quantificação da incorporação de Cy3 e Cy5 nas moléculas de DNA
As absorbâncias foram medidas para as amostras marcadas com Cy3 e Cy5. Os
comprimentos de onda utilizados para esta leitura foram: 650 nm para Cy5 e 550 nm para
Cy3.
Com base nos valores de absorbância obtidos, foram calculadas as quantidades de DNA
marcado com Cy3 e Cy5, usando as seguintes fórmulas:
Após quantificação, as amostras foram secas sob vácuo e guardadas (se necessário) a -
70 ºC, protegidas da luz, por até uma semana.
3.6.4.4 Hibridização da lâmina de microarranjos
Os dois sedimentos de DNA marcados com Cy3 e Cy5 foram dissolvidos e misturados
em um volume final de 15 µL de água. Às amostras foram adicionados 30 µL de formamida e
15 µL de buffer de hibridização resultando um volume final de 60 µL. A reação foi colocada
em banho a 92 °C por 3 minutos e em seguida em repouso no gelo. O volume total da reação
foi aplicado cuidadosamente na lâmina pelas bordas. A lâmina foi coberta com uma lamínula
e a hibridização procedeu a 42 °C por 16 horas, em uma câmara umedecida.
3.6.4.5 Lavagens pós-hibridização
Após a hibridização, as lâminas foram lavadas com 1X SSC, 0,2% SDS, seguido por
duas lavagens com 0,1x SSC, 0,2% SDS. Todas as lavagens foram realizadas a 55 oC por 10
minutos. Uma lavagem adicional foi realizada à temperatura ambiente com 0,1 X SSC por 1
minuto. Logo em seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada por 10 segundos,
Cy3 = (valor da absorbância / 0,15) x volume da eluição
Cy5 = (valor da absorbância / 0,25) x volume da eluição
45
secas com jatos de nitrogênio e submetidas à detecção de fluorescência com o confocal laser
scanning da Molecular Dynamics. Utilizamos um PMT de 750 para Cy3 e para Cy5. As
intensidades de fluorescência foram obtidas pelo programa ArrayVision.
3.6.5 Síntese de cDNA a partir de RNA total e marcação com Cy3 ou Cy5
Para a reação de síntese da simples fita de cDNA, aproximadamente 14 µg de RNA
foram utilizados. Para a marcação foram utilizados Cy3- dCTP ou Cy5-dCTP 0,05 mM, 1 µL
do iniciador oligo-dT(15) (Amersham), 4 µl de random nonâmeros (Amersham), dATP, dCTP,
dTTP 0,1 mM e dCTP 0,05 mM, ditiotreitol 10 mM e 400 unidades de Superscript II Reverse
Transcriptase (Invitrogen) no tampão fornecido pelo fabricante. A incubação foi feita 42 oC
por 2,5h. Em seguida, o RNA foi hidrolisado pela adição de 2 µl de NaOH 2,5 M e incubação
a 37 ºC por 15 minutos. A solução foi neutralizada pela adição de 10 µL de Hepes 2 M. As
amostras foram purificadas conforme o item 3.6.4.2. A medida de incorporação, hibridização
com as lâminas e condições de lavagem foram as mesmas descritas acima para o DNA.
3.6.6 Análise dos dados
Para classificar determinado gene como diferencialmente expresso, utilizamos uma
ferramenta disponível na rede (http://blasto.iq.usp.br/~rvencio/HTself) (VÊNCIO E KOIDE,
2005), que envolve a realização de experimentos de hibridização self-self para derivar curvas
de corte (cutoff) com cDNA de CL Brener marcado com Cy3 e Cy5. Utilizamos um intervalo
de credibilidade de 0,995. Um determinado gene foi considerado diferencialmente expresso
quando a razão de expressão (R) de pelo menos 80% das suas réplicas na lâmina estivesse
localizada fora da curva de corte. Utilizamos o algoritmo de Lowess para normalizar os dados
de expressão em cada hibridização independente (DUDOIT et al., 2002).
Para a seleção dos genes cuja expressão varia nas cepas sensíveis e resistentes a BZ,
usamos como premissa escolher genes que apresentam aumento ou diminuição de expressão
em todas as cepas sensíveis em relação a todas cepas resistentes. Utilizamos o teste
estatístico Bayboots que é uma ferramenta para identificar marcadores de classe a partir de
dados de expressão (VÊNCIO et al., 2006). Maiores explicações são fornecidas no item
Resultados.
46
3.7 Lâmina de microarranjo do PFGRC e condições de hibridização
A lâmina de microarranjo foi preparada pelo Pathogen Functional Genomics Resource
Center (PFGRC) do The Institute for Genomic Research (TIGR). Contém 25.576 elementos
representados por oligonucleotídeos de fita simples (70-meros), aplicados em duplicata e
desenhados para cobrir 12.288 ORFs de CL Brener. A página do PFGRC
(http://pfgrc.tigr.org/slide_html/array_descriptions/T_cruzi.shtml) fornece informações sobre
o desenho, produção, utilização e análise dos dados das hibridizações. Aproximadamente 20
µg de RNA tratado com DNase são utilizados para a síntese da primeira fita de cDNA
(Superscript Indirect cDNA Labeling System; Invitrogen), conforme descrito no item 3.6.5.
Após purificação em Multiscreen plates (Millipore), o cDNA foi marcado com Cy3 ou Cy5
(Invitrogen) por pelo menos 1,5h à temperatura ambiente, de acordo com o protocolo do
fabricante. Seguindo-se nova purificação em placas Millipore. A incorporação foi
determinada por medidas espectrofotométricas (550 nm para Cy3 e 650 nm para Cy5). As
amostras foram secas sob vácuo, dissolvidas em água para 25% do volume final e acrescidas
de 25% de tampão de hibridização (Amersham Pharmacia) e 50% formamida. O cDNA foi
desnaturado a 95 °C por 1 minuto. Antes da hibridização, cada lâmina foi incubada com 5 x
SSC, 0,1% SDS, 1% BSA por pelo menos 1h a 42 °C e seca por centrifugação (644 x g por 5
minutos). A hibridização ocorreu como descrito acima. Após hibridização, as lâminas foram
lavadas seqüencialmente com: (a) 2X SSC, 0,1% SDS; (b) 0,1X SSC; 0,1% SDS; (c) 0,1X
SSC. Todas as lavagens foram realizadas a 55 oC por 5 minutos. Após secagem por
centrifugação, as lâminas foram submetidas à detecção de fluorescência com laser scanner
(Genepix 4000B; Molecular Devices) resultando imagens de 16-bits. As intensidades foram
extraídas com o software ArrayVision 8.0 (GE Healthcare). Os dados foram obtidos para duas
réplicas biológicas. Para cada réplica foi feito um experimento de dye-swap. A normalização
dos dados foi feita pelo algoritmo de Lowess e a determinação da expressão dos genes foi
realizada com ajuda do programa estatístico R
(http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/arraysoft_rpackages.html).
3.8 Confirmação de dados dos microarranjos
Algumas ESTs que apresentaram hibridização diferencial nos microarranjos foram
analisadas em experimentos de Southern blot e/ou northern blot com preparações de DNA e
RNA, respectivamente, ou por PCR em tempo real.
47
3.8.1 Southern blot
Após digestão de 10 µg de DNA com a enzima de restrição Pst I (New England
Biolabs) por 14 horas a 37 oC, o DNA foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8%.
Após a eletroforese, o DNA foi despurinado com HCl 0,2 M por 10 minutos. Em seguida, o
DNA foi desnaturado duas vezes com NaOH 0,5 M por 15 minutos, e neutralizado com NaCl
1,5 M, Tris-HCl 0,5 M pH 7,2; EDTA 1 mM por 30 minutos (duas vezes). O DNA foi
transferido para membranas de Nylon (Hybond-N, Amersham Pharmacia) em 2X SSC por 16
horas e foi fixado por exposição à luz UV por 5 minutos e aquecimento a 80 oC por 2 horas.
Em seguida, as membranas foram hibridizadas com sondas derivadas dos genes de interesse,
marcadas com [α-P32]dATP.
3.8.2 Northern blot
Amostras de RNA foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 0,8% em
tampão MOPS 1X e formaldeído 0,67 M (SAMBROOK et al., 1989). RNA total (10 µg) foi
liofilizado, ressuspenso em 20 µL de formamida 50%, formaldeído 6% e MOPS 1X e
aquecido a 65 oC por 15 minutos. Às amostras foram adicionados 2 µL de tampão de amostra
para RNA (glicerol 50%, azul de bromofenol 0,4%, xilenocianol 0,4%, EDTA 1 mM) e o
material foi aplicado no gel. A eletroforese foi realizada em tampão MOPS 1X a 70V, à
temperatura ambiente por 3 horas. Após a eletroforese, o gel foi submetido a tratamento
alcalino suave (NaOH 50 mM, NaCl 10 mM por 45 minutos), neutralização (Tris-HCl 0,1 M,
pH 7,5 por 45 minutos) e, em seguida, equilibrado com 20X SSC por uma hora. O RNA foi
transferido para membrana de nylon (Hybond-N, Amersham Pharmacia) usando como tampão
de transferência 20X SSC. A transferência ocorreu à temperatura ambiente por 16 horas. O
RNA foi fixado por exposição à UV por 5 minutos e aquecimento a 80 oC por 2 horas.
3.8.3 Obtenção de sondas radioativas e condições de hibridização
3.8.3.1 Marcação por random primer extension
Para a incorporação de nucleotídeos radioativos, sondas de DNA foram marcadas com
[α-P32]dATP com o kit de marcação de DNA utilizando random primers (Invitrogen). O
48
equivalente a 200 ng de DNA foi diluído para um volume final de 23 µL em água e
desnaturado em banho fervente por 5 minutos. O tubo contendo o DNA foi transferido para
gelo e foi adicionado ao tubo: 20 µM de dTTP, dCTP, dGTP e [α-P32]dATP (10 µCi),
tampão de mistura do random primer (Hepes 0,67 mM, Tris-HCl 0,17 mM, MgCl2 17 mM,
β-mercaptoetanol 33 mM, BSA 1,33 mg/mL, hexanucleotídeos iniciadores 18 DO260
unidades/mL, pH 6,8) e 3U de Klenow em volume final de reação de 50 µL. A reação
desenvolveu-se à temperatura ambiente por 3 horas e foi interrompida pela adição de tampão
de parada (EDTA 0,5 M, pH 8,0). A sonda foi purificada de nucleotídeos não incorporados
por passagem em coluna de Sephadex G50 (SAMBROOK et al., 1989). Para a medida de
incorporação foi feita contagem em contador de cintilação líquida.
3.8.3.2 Hibridização de sondas radioativas com ácidos nucléicos imobilizados
As membranas de Southern blot foram pré-hibridizadas em forno HyBaid a 60 oC por
90 minutos com 10 mL de tampão de hibridização (Ficoll 0,1%, PVP 0,05%, EDTA 1 mM,
SSC 3X, SDS 0,1% e DNA de esperma de salmão 100 µg/mL). Essa solução foi substituída
por 10 mL de tampão de hibridização contendo a sonda desnaturada por aquecimento. A
hibridização ocorreu por 12 a 16 horas a 60 oC. As membranas de northern blot foram pré-
hibridizadas em forno HyBaid a 42 oC por 90 minutos com 10 mL de tampão de hibridização
(SSPE 5X, formamida 50%, Denhardt 5 X, SDS 0,5%). Essa solução foi substituída por 10
mL de tampão de hibridização contendo a sonda desnaturada por aquecimento. A hibridização
ocorreu por 12 a 16 horas a 42 oC.
3.8.3.3 Lavagem das membranas
Após a hibridização, as membranas de Southern blot foram lavadas seqüencialmente a
60 oC nas seguintes condições: 2 lavagens em solução 3X SSC, SDS 0,1% por 15 minutos; 1
lavagem 1X SSC, SDS 0,1% por 15 minutos; 1 lavagem 0,1X SSC, SDS 0,1% por 30
minutos. As imagens radioativas foram coletadas em Phosphor Screens (Kodak) expostos por
diferentes períodos e escaneados com o aparelho Storm (Molecular Dynamics). A análise
densitométrica do sinal radioativo foi obtida com o programa ImageQuant Molecular
Dynamics.
49
As membranas de northern blot foram lavadas seqüencialmente a 42 oC nas seguintes
condições: 2 lavagens em solução 2X SSPE, SDS 0,1% a 42 oC por 15 minutos; 1 lavagem
em 1X SSPE, SDS 0,1% a 42 oC por 15 minutos; 1 lavagem 0,1X SSC, SDS 0,1% por 15
minutos. As imagens radioativas foram coletadas como descrito acima.
3.8.3.4 Desibridização das membranas
Para reutilização das membranas de Southern blot, as sondas foram retiradas por
lavagem com 0,1X SSC, SDS 0,5% a 90 oC por 60 minutos. Para as membranas de northern
blot, as sondas foram retiradas por lavagem com 0,1X SSPE, SDS 0,1% a 90 oC por 30
minutos. Para verificar a eficiência do processo, as membranas foram expostas a Phosphor
Screens.
3.9 RT-PCR em tempo real
Estes iniciadores foram desenhados sobre a seqüência nucleotídica completa de cada
gene em estudo com o auxílio do programa Primer Express (Applied Biosystems) que os
desenha com as características necessárias para os experimentos de PCR em tempo real. O
tamanho dos fragmentos amplificados foi de 75 pb. O RNA utilizado nos ensaios foi obtido
conforme descrito no item 3.5.2.
Nota: Os oligonucleotídeos utilizados nos experimentos estão descritos na tabela 1.
3.9.1 PCR convencional
Para verificar a adequação dos oligonucleotídeos iniciadores desenhados, realizamos
uma PCR convencional com 300 ng de DNA de CL Brener e cada par de iniciadores. Ainda,
para comprovar a ausência de DNA contaminante nas amostras de RNA tratadas com DNase,
realizamos também uma PCR convencional com RNA de cada cepa e os iniciadores. Neste
caso, esperaríamos não obter nenhum produto de amplificação.
Para cada reação, utilizamos amostra de DNA ou RNA, 2,5 mM de mix de dNTP, 10
pmoles de cada oligonucleotídeo iniciador (específico para cada gene), 1U de Taq DNA
polimerase (GO Taq) e 5 µL de tampão de reação 5X fornecido no kit. A PCR foi realizada
nas seguintes condições: passo 1: 94 ºC por 4 minutos; passo 2: 94 ºC por 1 minuto; passo 3:
50
58 ºC por 1 minuto; passo 4: 72 ºC por 1 minuto. Repete-se desde o passo 2 até o passo 4 por
33 vezes. Passo 5: 94 ºC por 1 minuto; passo 6: 58 ºC por 1 minuto; passo 7: 72 ºC por 10
minutos e para finalizar, passo 8: 4 ºC finais por tempo indeterminado. Para todas as reações
foi incluído um controle negativo (sem DNA ou RNA).
3.9.2 Síntese da primeira fita de cDNA
Para a síntese da primeira fita de cDNA foi utilizado 5 µg de RNA total tratado com
DNAse, 1,5 µL de dNTP mix 10 mM, 2 µg de hexâmeros randômicos e o volume da reação
foi completada a 19 µl com água. O volume total foi aquecido por 5 minutos a 65 ºC e
imediatamente colocado em gelo. A esta reação foi adicionado 6 µL de tampão 5X; 3 µL de
DTT 0,1 M e 1 µL de inibidor de RNase. A amostra foi aquecida por 2 minutos a 42 ºC e,
após este período, foram adicionadas 20 U de Transcriptase Reversa Super Script II
(Invitrogen) incubando-se a 25 oC por 10 minutos e 42 oC por 50 minutos. A reação foi
interrompida por aquecimento a 70 oC por 15 minutos e a amostra foi diluída 4 vezes com
água livre de nucleases.
3.9.3 Síntese da segunda fita de cDNA e PCR em tempo real
Para a síntese da segunda fita de cDNA e conseqüente incorporação do corante Sybr
Green foram utilizados 5 µL de cDNA simples fita, 8 pmoles de cada oligonucleotídeo
iniciador (específico para cada gene testado) e 10 µL de SybrGreen, num volume final de 20
µL. A reação foi desenvolvida no equipamento Mastercycler Realplex (Eppendorf), nas
seguintes condições: 95 °C por 2 minutos, 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 55 °C por 15
segundos e 68 °C por 20 segundos.
3.9.4 Análise dos dados
Cada ensaio foi realizado em triplicata. Os dados foram analisados usando o software
Realplex (Eppendorf systems®) e normalizados para os valores do housekeeping gene que
codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Para cada amostra foi obtido o Ct
(Threshold cycle) que é definido como o ciclo onde a fluorescência se encontra
estatisticamente acima do background. Foi obtida a média dos Cts das triplicatas e seu desvio
padrão.
51
Uma vez que a expressão do gene é analisada em relação ao controle interno
(GAPDH), foi então calculado o ∆Ct, ou seja, a diferença entre as médias do Ct de cada
amostra e a média do Ct do controle interno (GAPDH).
Posteriormente, foi calculado o ∆∆Ct que consiste na diferença do ∆Ct de cada
amostra em relação ao ∆Ct da amostra de referência (cepa CL Brener).
Os ∆∆Ct encontrados refletem as diferenças de abundância de produto entre os ciclos,
mas não refletem diretamente a diferença de produto entre as amostras. Para calcular a razão
relativa da abundância dos transcritos de cada gene em relação à abundância de transcritos na
cepa de referência, foi aplicada a fórmula 2-∆∆Ct, que parte do princípio de que a cada ciclo da
PCR a quantidade de produto dobra, sendo então necessário contemplar que o ganho de cada
ciclo (2 vezes) seja elevado à potência do inverso de ∆∆Ct (PFAFFL, 2001).
A análise estatística dos resultados de comparação da abundância de transcritos entre
as cepas foi obtida com o programa Sigma plot.
3.10 Ensaio para avaliar a suscetibilidade a BZ
O ensaio foi realizado em placas de 24 poços de fundo plano (Falcon) em 1 mL de
LIT-10% SFB (para formas epimastigotas) ou em 1 mL DME–5% SFB (para formas do
sobrenadante de cultura de tecidos - FCT). Diferentes quantidades de BZ (de uma solução
estoque 50 mM em DMSO) foram adicionadas a cada poço. Formas epimastigotas em
crescimento exponencial ou FCT foram incubadas com a droga na concentração final de 107
parasitas/mL, por 72h a 28 oC (epimastigotas) ou 34 oC numa incubadora com 5% CO2 (FCT).
Após este período, o número de parasitos foi contado em câmara de Neubauer. A atividade de
BZ foi estimada calculando-se a porcentagem de inibição do crescimento de formas
epimastigotas ou inibição de sobrevivência em FCT, em relação a culturas controle em
ausência de droga. Três ensaios independentes foram realizados em diferentes ocasiões com
duplicatas em cada ensaio. Para o cálculo da CI50, que corresponde à concentração de BZ que
inibe o crescimento (ou sobrevivência) do parasito em 50%, os dados foram tratados com o
software Sigma plot (versão 10), empregando-se o algoritmo four parameter logistic.
NOTA: Este ensaio está descrito no manuscrito de Moreno et al., 2008 (submetido a
publicação).
52
4 RESULTADOS
4.1 Padronização de um ensaio para quantificar a suscetibilidade de cepas de T. cruzi a BZ.
4.1.1 Toxicidade do dimetil sulfóxido (DMSO)
Tendo em vista que o solvente utilizado para diluir o BZ foi DMSO, investigamos o
efeito de diferentes concentrações do solvente sobre uma cultura de formas epimastigotas da
cepa VL10. Esta cepa foi escolhida por ter sido descrita como resistente a BZ, mostrando
apenas 27% de cura em camundongos tratados com a droga (FILARDI e BRENER, 1987).
Nos ensaios, os parasitos foram incubados com 0% (controle) até 4% de DMSO por 72 horas.
Findo este tempo, a densidade das culturas foi determinada (Tabela 2). Podemos observar que
o intervalo de concentrações de DMSO utilizadas não afeta o crescimento das culturas. Nos
ensaios de sensibilidade a BZ, a concentração máxima de DMSO adicionado foi de 2%. As
variações nos valores da densidade das culturas são intrínsecas ao método utilizado (contagem
em câmara de Neubauer).
Tabela 2 - Densidades celulares de culturas da cepa VL10 expostas por 72 horas a diferentes
concentrações de DMSO.
4.1.2 Doses de BZ e tempo de exposição
Para a padronização dos ensaios de sensibilidade a BZ, formas epimastigotas da cepa
VL10 foram incubadas com três concentrações da droga (10; 50 e 100 µM) nos tempos de 24,
48, 72 e 96 horas. A densidade das culturas foi determinada e a porcentagem de inibição de
crescimento foi calculada em relação à cultura incubada na ausência de BZ nos mesmos
% DMSO Parasitas (106/mL)
0 55,5 0,031 48 0,062 61,5 0,125 52,5 0,25 48 0,5 47 1 50 2 49 4 51
53
tempos experimentais (Figura 9). Observamos que após 24 horas de incubação, as três
concentrações de BZ não têm efeito inibitório dose-dependente. Este torna-se mais nítido em
incubações por tempos maiores. A partir das 72 horas fica evidente que doses de 50 µM e 100
µM inibem o crescimento das culturas de forma significativa quando comparado com a
cultura controle e a cultura submetida a 10 µM de BZ. Levando em conta estas observações,
decidimos fixar o tempo de exposição a BZ em 72 horas nos experimentos subseqüentes.
Figura 9 - Efeito do tempo de incubação e concentração de BZ no crescimento de formas
epimastigotas da cepa VL10. Acima das barras indica-se a porcentagem de inibição de crescimento em relação ao controle (C) na ausência de droga.
4.1.3 Determinação dos valores de CI50 para BZ
Para a determinação da CI50, a cepa VL10 foi incubada com sete doses de BZ
(concentração final de 15,6 µM a 1 mM, em diluições seriadas de 1:2) por 72 horas (Figura
10A). Cada ponto experimental representa a média de três experimentos independentes. O
valor de CI50, que corresponde à concentração de BZ que inibe o crescimento da cultura em
50% em relação à cultura controle sem droga, foi determinado com o programa SigmaPlot
(versão 10) usando o algoritmo Four Parametric Logistic. Neste conjunto de experimentos, o
valor de CI50 foi de 23,0 ± 7 µM. Na figura 10A, verifica-se que BZ nas concentrações de 500
54
µM e 1 mM promove morte celular. Desta forma, para definir com maior precisão o valor de
CI50, determinamos a suscetibilidade de formas epimastigotas de VL10, variando a
concentração de BZ de 1,2 a 480 µM (Figura 10B). Nestes experimentos o valor de CI50 foi de
27,3 ± 4 µM, que é muito próximo do valor determinado acima.
Figura 10 - Determinação do valor de CI50 em formas epimastigotas incubadas com diferentes concentrações de BZ por 72 horas.
4.1.4 Suscetibilidade a BZ de cepas mantidas em laboratório
Uma vez padronizado o ensaio de sensibilidade a BZ, determinamos a CI50 de onze
cepas de T. cruzi adicionais que estavam criopreservadas em nosso laboratório (Tabela 3).
Nesta tabela apresentam-se algumas características das cepas estudadas. Observa-se que o
valor de CI50 dos isolados variou de 7,6 a 127 µM. A suscetibilidade a BZ de cinco destas
cepas havia sido previamente determinada em modelos experimentais infectados e tratados
(FILARDI e BRENER, 1987) (Tabela 3). De acordo com aqueles autores, as cepas foram
classificadas em resistentes (taxas de cura < 33%), parcialmente suscetíveis (taxas de cura
33% a 66%) ou suscetíveis (taxas de cura > 66%). Em nossos ensaios, para as cepas Berenice
62 (suscetível) e YuYu (resistente) obtivemos valores de CI50 de 12,8 ± 4,9 µM e 32,0 ± 0,2
µM, respectivamente (Tabela 3). A cepa Colombiana, que foi considerada resistente, pois
mostrou apenas 7% de cura em camundongos infectados e tratados (FILARDI e BRENER,
1987), apresentou um valor elevado de CI50 (25,4 ± 5,7 µM), condizente com as conclusões
prévias. Dentre as cinco cepas anteriormente investigadas, apenas a cepa Silvio X10,
considerada sensível por FILARDI e BRENER (1987), apresentou valor de CI50 discrepante
(26,1 ± 2,5 µM).
A
BZ (µΜ)
0 200 400 600 800 1000
Para
sitos (
10
6 / m
L)
0
10
20
30
40
50
CI50
= 23,0 ± 7,0
BZ (µΜ)
0 100 200 300 400 500 600
Pa
rasito
s (
10
6 / m
L)
0
20
40
60
80
100
CI50
= 27,3 ± 4,0
B
55
Tabela 3 - Características das cepas e valores de CI50 para BZ. Cepa Origem geográfica Hospedeiro – fase;
manifestação clínica Grupoa CI50 BZ (µµµµM)
(média ±±±± dp) (% de cura)b
115 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica; forma cardíaca
II 7,6 ± 3,6 ND
B147 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica; forma cardíaca
II 25,5 ± 7,3 ND
Berenice 62 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica; forma indeterminada
II 12,8 ± 4,9 93
Berenice 78 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica; forma indeterminada
II 15,8 ± 3,8 ND
CL Brener Rio Grande do Sul BR) T. infestans II 13,6 ± 4,4 100
Colombiana Colombia Humano – fase crônica; forma cardíaca
I 25,4 ± 5,7 7
Esmeraldo cl3 Bahia (BR) Humano – fase aguda II 26,7 ± 0,3 ND SC2005 Santa Catarina (BR) Humano - fase aguda II 32,1 ± 5,9 ND Silvio X10 Pará (BR) Humano – fase aguda I 26,1 ± 2,5 69 VL10 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica;
forma indeterminada II 23,0 ± 7,0 27
YuYu Bahia (BR) T. infestans I 32,0 ± 0,2 0 116 Minas Gerais (BR) Humano – fase crônica;
forma indeterminada
II 127,6 ± 0,07 ND
ND – não determinado a Grupos definidos com base no tamanho do amplicon do gene de rRNA 24Sα (SOUTO et al. 1996). b Porcentagem de cura determinada em modelo experimental (FILARDI e BRENER, 1987). 4.1.5 Estabilidade do valor de CI50
Para verificar a estabilidade do fenótipo de sensibilidade a BZ, os valores de CI50 de
quatro cepas mantidas em meio LIT por tempos diferentes e sub-cultivadas periodicamente
foi determinado (Figura 11). Observa-se que estes valores têm uma variação muito pequena
em cepas mantidas por até 10 meses em cultura.
56
Figura 11 - Valores de CI50 determinados para cepas de T. cruzi mantidas em cultura por dez meses.
Acima dos cilindros indica-se o mês e ano em que o parâmetro foi determinado. 4.1.6 Sensibilidade a BZ em parasitos presentes no sobrenadante de monocamadas de células
LLC-KM2
Determinamos também a sensibilidade a BZ dos estágios de T. cruzi presentes no
sobrenadante de monocamadas de células epiteliais de macaco (LLC-MK2) infectadas com as
cepas VL10, 115 e CL Brener. No sétimo dia pós-infecção, observamos uma predominância
de formas tripomastigotas para as cepas 115 e CL Brener. Para a cepa VL10, verificamos a
presença de tripomastigotas e amastigotas, na proporção 3:1. Os amastigotas, provavelmente,
são o resultado da lise prematura de células infectadas ou da diferenciação extracelular de
formas tripomastigotas. Foi descrito que os amastigotas extracelulares são capazes de invadir
qualquer tipo de células, onde realizam todo o ciclo celular (MORTARA, 1991; PROCÓPIO
et al., 1998; FERNANDES et al., 2006; MORTARA et al., 2008).
Nos ensaios de suscetibilidade a BZ consideramos o número total de parasitos
(tripomastigotas e amastigotas) que foram denominados formas de cultura de tecidos (FCT).
As FCTs foram expostas a diferentes concentrações de BZ por 72 horas e a CI50 foi
determinada como descrito acima (Tabela 4). Para comparar os valores de CI50 entre as FCTs
e as formas epimastigotas, o ensaio foi feito em paralelo com este estágio (Tabela 4). Os
dados mostram que a suscetibilidade a BZ é maior em FCTs, como descrito anteriormente
(NEAL e VAN BUEREN, 1988).
07
/200
6
07
/200
6
07
/200
6
05
/200
7
05
/200
7
05
/200
7
05
/200
7
07
/200
6
CI 5
0 (µ
M)
57
Embora, a sensibilidade relativa a BZ seja mantida nas FCTs, onde a cepa 115 é a
mais sensível, e a cepa VL10, a mais resistente a BZ, não verificamos conservação nas razões
de sensibilidade. De fato, com base nos valores de CI50, a forma epimastigota da cepa VL10 é
cerca de 3 vezes mais resistente a BZ em relação a epimatigotas da cepa 115; ao passo que em
FCTs, a cepa VL10 é apenas cerca de 2 vezes mais resistente. Isto pode ter sido ocasionado
pela morte natural das FCTs em meio de cultura livre de células durante o período de
incubação de 72 horas. Determinamos então o valor de CI50 a BZ em FCTs mantidas por 24 e
72 horas em presença de diferentes concentrações de BZ. O experimento foi realizado com
duplicatas (Tabela 5). Conforme esperado, observamos uma variação no valor de CI50 com o
tempo de exposição à droga. No tempo de 24 horas, a suscetibilidade a BZ da cepa 115 é
cerca de 4 vezes maior que a de VL10. Não temos explicação para esta observação, que
poderia estar relacionada com a proporção diferente de formas tripomastigotas e amastigotas
presentes nas culturas das duas cepas.
Tabela 4 - Sensibilidade a BZ em formas de cultura de tecidos (FCT) e formas epimastigotas.
Exposição por 72 horas. Tabela 5 - CI50 de formas de cultura de tecidos expostas a diferentes concentrações de BZ por 24 e 72
horas.
Cepa CI50 (µM)
FCT Epimastigotas
115 3,9 ± 0 8,8 ± 0,8
CL Brener 6,4 ± 1,0 14,6 ± 2,4
VL10 7,5 ± 2,6 27,3 ± 4
Cepa Tempo de exposição (horas)
CI50 (µM)
115 24 14,9 ± 2,2 72 3,9 ± 0
VL10 24 67 ± 1,0 72 7,5 ± 2,6
58
4.2 Construção da lâmina de microarranjos
4.2.1 Análise e agrupamento de ESTs de T. cruzi
Para a construção da lâmina de microarranjos, tínhamos disponíveis em nosso
laboratório 2000 clones de ESTs de dois estágios evolutivos de T. cruzi e suas respectivas
seqüências, sendo: 723 de epimastigotas e 1233 de amastigotas de CL Brener e 44 de
amastigotas da cepa Tulahuén.
Inicialmente, removemos das ESTs as seqüências que correspondiam ao vetor e ao
spliced leader (SL). Para evitar redundância, realizamos o agrupamento das seqüências com
CAP3 – Contig Assembly Program (HUANG e MADAN, 1999). Este programa forma os
agrupamentos de acordo com a similaridade das seqüências e remove as sobreposições de
seqüências de baixa qualidade. Numa fase posterior, ocorre um alinhamento múltiplo das
seqüências que formam cada agrupamento para construir uma seqüência consenso (HUANG e
MADAN, 1999). A eficiência do programa CAP3 foi comparada com a de outro programa
utilizado para a formação de agrupamentos – PHRAP. Foi observado que este último forma
agrupamentos com um número maior de membros, no entanto, o CAP3 produz menos erros
ao formar a seqüência consenso (HUANG e MADAN, 1999). Desta forma, optamos por usar
o CAP3.
O CAP3, além de gerar os agrupamentos e a seqüência consenso dos mesmos, fornece
também a relação de singletons, ou seja, as seqüências únicas que não fazem parte de nenhum
agrupamento. O resultado do processo de agrupamento é mostrado na tabela 6 e na figura 12.
De um total de 2000 ESTs, foram obtidos 1153 agrupamentos, dos quais 814 continham
apenas uma EST (singletons), representando 70,6% dos agrupamentos e 339 agrupamentos
(29,4%) continham múltiplas ESTs (contigs). Os 1153 consensos representam 57,7%
(1153/2000) das seqüências submetidas ao processo de agrupamento, indicando uma
redundância moderada a alta das bibliotecas de cDNA.
59
Tabela 6 - Agrupamento de 2000 ESTs de formas amastigotas e epimastigotas de T. cruzi por CAP3.
Número de ESTs por agrupamento
Número de agrupamentos
2 170 3 76 4 40 5 24 6 8 7 4 8 4 9 3 10 1 11 1 12 2 13 1 14 0 15 1 16 0 17 1 18 0 19 1 20 2
Singletons 814
Total de seqüências únicas 1153
Figura 12 - Distribuição de ESTs por agrupamento com base no CAP3.
4.2.2 Construção e topologia da lâmina de microarranjos
Escolhemos 288 singletons de amastigotas de CL Brener de um total de 814 (35%)
para amplificação da seqüência clonada, purificação e posterior aplicação na lâmina de
60
microarranjos. A amplificação dos singletons foi realizada usando os oligonucleotídeos
iniciadores T3 e T7 que flanqueiam o inserto. O produto de amplificação foi analisado por
eletroforese em gel de agarose. A figura 13 mostra o produto de amplificação de alguns
clones antes e após purificação, concluindo-se que são produtos de boa qualidade com
tamanho variando de 300 a 700 pb.
Figura 13 - Eletroforese dos produtos de PCR de singletons de CL Brener. A. antes da purificação; B. depois da purificação. Nas laterais do gel mostra-se o padrão de massa molecular.
Escolhemos representantes dos 339 agrupamentos (Tabela 6). Na seleção do
representante de cada agrupamento levamos em conta três critérios: (i) que fosse uma
seqüência grande (que englobasse as outras seqüências do agrupamento); (ii) que a seqüência
escolhida tivesse um cromatograma de boa qualidade; e (iii) que levasse em conta a igual
representatividade de seqüências de formas epimastigotas e amastigotas. Quando o
agrupamento era considerado populoso (com mais de 4 seqüências), pelo menos dois
representantes foram escolhidos. No caso de agrupamentos com um número baixo de ESTs,
todos os componentes do grupo foram amplificados. Desta forma, um total de 782 ESTs
representantes dos agrupamentos foram amplificadas e purificadas.
Nas lâminas foram também aplicadas 31 seqüências de T. cruzi, isoladas de diferentes
cepas e representantes de regiões codificadoras de proteínas ou RNA, assim como de regiões
não codificadoras (Tabela 7) e 37 open reading frame expressed sequence tags (ORESTES)
(DIAS NETO et al., 1997) da forma epimastigota de CL Brener obtidas pela Dra. Camila A.
O. Martins em nosso laboratório (MARTINS, 2007). Como controle, também foram aplicados
sete DNAs fragmentados de diferentes organismos, dois plasmídios e a seqüência telomérica
de T. brucei.
A B
61
Tabela 7 - Outras seqüências clonadas de T. cruzi aplicadas na lâmina (N=31) Identificação Características Isolado-grupo
de T. cruzi
Número de acesso
B11 Retrotransposon Y-TcII U15615 B12 Antígeno de 230 kDa Y-TcII L07759 B13 Antígeno de 140/116 kDa Y-TcII U15616 C6 Elemento de DNA repetitivo G-TcI U16295 CL65 DNA satélite de 195 bp Silvio Tc-I AY327543 G3C DNA satélite de 195 bp Y-TcII K011771 Mini-exon Gene de mini-exon e região intergênica Silvio Tc-I X62674 GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase CL Brener-TcII H49 Antígeno imunodominante associado a
citoesqueleto e flagelo G-TcI U16294
18SY 18S rDNA Y-TcII AF301912 18SG 18S rDNA G-TcI AF239981 24Sα 24Sα rDNA Y-TcII M28885 JL8 Antígeno Tulahuén 2-TcII AF147956 RNAhel RNA helicase da família DEAD-Box CL Brener-TcII AF067953 HSP70 Proteína de choque térmico 70 Maracai-TcII X07083 Peef Fator de elongação subunidade α Y-TcII L76077 Pact Actina 2 Dm28c-TcI XM800951 SLA RNA nuclear pequeno Tulahuén Tc-II AF016400 TR Tripanotiona redutase CL Brener-TcII M38051 DHFR Diidrofolato redutase-timidilato sintase Y-TcII L22484 TH Transportador de hexose CL Brener-TcII U05588 IF8 Proteína fagelar que se liga a cálcio Y-TcII U70035 GP85 Pseudogene de glicoproteína gp85/sialidase Y-TcII M91469 GP82 Glicoproteína de superfície de estágio
específica gp82 CL Brener-TcII AF128843
TEUF0001 Histona CL Brener-TcII AA399704 TEUF0058 EST de epimastigotas, Sem similaridade CL Brener-TcII AA441764 TEUF0062 EST de epimastigotas, Sem similaridade CL Brener-TcII AA441768 TEUF0008 EST de epimastigotas, Sem similaridade CL Brener-TcII AA441772 TEUF0075 EST de epimastigotas, ND7 mitocondrial CL Brener-TcII DQ663087 TENF0516 EST de epimastigotas, Sem similaridade CL Brener-TcII AA676002 tcMSH2 Proteína reparadora de "mismatch" de DNA 167-TcII AY092825
Em resumo, na lâmina de microarranjo foram aplicados 288 singletons de amastigotas
de CL Brener, 782 ESTs de contigs de formas epimastigotas e amastigotas das cepas CL
Brener e Tulahuen, 37 ORESTES, 31 seqüências clonadas de diferentes cepas de T. cruzi e 10
sondas controle, dando um total de 1148 sondas. Salienta-se que a lâmina contém
preferencialmente ESTs de amastigotas de CL Brener (56%) e que o conjunto de seqüências
aplicadas representa aproximadamente 10% do total de genes de T. cruzi (EL-SAYED et al.,
2005).
A lâmina está composta de dois conjuntos de 12 sub-arranjos (lado esquerdo e lado
direito da lâmina) (Figura 14), sendo que os subarranjos 1 e 12 de ambos lados da lâmina
62
contém apenas DMSO. As sondas foram aplicadas em triplicata em cada sub-arranjo e, cada
sonda está representada no mínimo 3 e no máximo 12 vezes na lâmina.
Figura 14 - Topologia da lâmina de microarranjos. As sondas foram aplicadas nos sub-arranjos de 2 a 11, cuja topologia é mostrada do lado direito da figura. E e D, lados esquerdo e direito da lâmina. DMSO = dimetilsulfóxido.
A classificação funcional das ESTs imobilizadas na lâmina de microarranjos foi
efetuada por comparação com o banco de dados KOG, um compêndio de grupos de proteínas
ortólogas de genomas completos de eucariotos (TATUSOV et al., 2003). O gráfico de pizza
mostrado na figura 14, indica a distribuição funcional das seqüências de maior similaridade
obtidas por BLASTX (busca efetuada em agosto de 2008).
Este gráfico mostra abundância de ESTs de proteínas hipotéticas de função
desconhecida (55%). O segundo grupo mais abundante está constituído por ESTs relacionadas
com a estrutura, biogênese de ribossomo e processo de tradução e por ESTs relacionadas com
a estrutura e dinâmica da cromatina (15% das ESTs). Esta observação é uma indicação do
envolvimento ativo dos parasitos no processo de síntese protéica e replicação.
63
Função desconhecida/proteínas hipotéticas
55%
Biogênese da membrana celular3%
Motilidade celular0,5%
Citoesqueleto0,5%
Trâfego intracelular, secreção e transporte vesicular
1%
Modificação pós-traducional, reposição de proteínas,
chaperonas1%
Mecanismo de defesa2%
Mecanismos de transdução de sinal1%
Estrutura nuclear0,5%
Controle do ciclo celular, divisão celular, divisão de cromossomos
1%
Transcrição1%
Replicação, recombinação e reparo
1%
Estrutura e dinâmica da cromatina0,5%
Produção e conversão de energia3%
Transporte e metabolismo de carboidratos
1%Metabolismo e transporte de
aminoácidos 4%
Metabolismo e transporte de lipídeos
2%
Processamento e modificação de RNA3%
Tradução, estrutura ribossomal e biogênese
15%
Função geral predita4%
Figura 15 – Categorização funcional das ESTs imobilizadas na lâmina de microarranjos com base no
banco KOG.
4.2.3 Análise da qualidade da lâmina
Para verificar a eficiência do processo de construção da lâmina, esta foi hibridizada
com DNA total de CL Brener. Para isto, cerca de 10 µg de DNA de CL Brener foram
fragmentados por passagens consecutivas em seringa de 1 mL. O aspecto do DNA antes e
após fragmentação é mostrado na figura 16.
64
Figura 16 - Eletroforese em gel de agarose do DNA de CL Brener antes (canaleta C) e após (canaleta
B) quebra mecânica. Marcador de massa molecular: DNA de λcI857 digerido com EcoRI e HindIII (canaleta A). A seta indica a posição do kDNA.
Os fragmentos de DNA foram submetidos à incorporação de Cy3 e Cy5 (ver Material
e Métodos). Para quantificar a incorporação dos fluoróforos, foi medida a absorbância a 650
nm para Cy5 e 550 nm Cy3. Obtivemos 66 pmoles de DNA marcado com Cy3 e 68,76
pmoles de DNA marcado com Cy5. Estes foram misturados e hibridizados com a lâmina
(Figura 17A, nota: a reprodução da imagem é de baixa qualidade). A lâmina foi também
hibridizada com DNA da cepa VL10 fragmentado e marcado como acima. Obtivemos 128
pmoles de DNA marcado com Cy3 e 80 pmoles de DNA marcado com Cy5. A imagem da
hibridização da lâmina é mostrada na figura 17B. Os resultados indicam que a lâmina é de boa
qualidade com hibridização da maior parte das sondas imobilizadas. Também observamos
sinais de hibridização iguais para as réplicas de cada sonda, o que aumenta a confiabilidade
dos dados a serem obtidos.
kDNAkDNA
A B C
65
Figura 17 - Imagem da hibridização da lâmina de microarranjo com DNA de: (A) CL Brener (sub-
arranjos 2 a 8, lado esquerdo da lâmina) e (B) VL10 (sub-arranjos 6 a 9, lado esquerdo da lâmina) marcados com Cy3 e Cy5.
4.3 Análise da expressão diferencial de genes em cepas sensíveis e resistentes a BZ
4.3.1 Escolha das cepas
Com o intuito de identificar genes que poderiam estar correlacionados com o
fenômeno de resistência a BZ, decidimos comparar a expressão diferencial de genes em três
cepas sensíveis e três cepas resistentes a este nitroderivado, utilizando a lâmina de
microarranjo por nós construída. Salientamos que uma abordagem análoga havia sido
utilizada em nosso laboratório por Cassio da Silva Baptista, em seu projeto de doutorado, na
análise da expressão diferencial de genes em isolados de pacientes com a forma cardíaca e
indeterminada da doença de Chagas (BAPTISTA et al., 2006).
Na escolha das cepas (Tabela 8), levamos em conta dois critérios: o valor de CI50 para
BZ por nós determinado (Tabela 3), e o fato de a sensibilidade das cepas a BZ ter sido
previamente determinada em modelo experimental (FILARDI e BRENER, 1987). As cepas
indicadas na Tabela 8 foram arbitrariamente consideradas sensíveis (CI50 de 7,6 a 13,6 µM)
ou resistentes a BZ (CI50 de 23 a 32 µM). Apenas a cepa 115 não foi ensaiada em modelo
experimental.
A B
66
Tabela 8 - Cepas utilizadas nas hibridizações com os microarranjos.
4.3.2 Desenho experimental
A cepa CL Brener (sensível) foi escolhida como referência, e as hibridizações
competitivas foram realizadas em pares, representados pela cepa de referência e a cepa
problema. O esquema do desenho experimental é apresentado na figura 18.
Figura 18 - Desenho experimental para a análise da expressão diferencial de genes entre o grupo de
cepas suscetíveis (azul claro) e resistentes (azul escuro) a BZ. Entre parênteses se indica o valor de CI50 para BZ.
4.3.3 Determinação da curva de corte
Diferentes métodos estatísticos foram desenvolvidos para classificar determinado gene
como diferencialmente expresso. Em nosso estudo, utilizamos uma ferramenta disponível na
rede (http://blasto.iq.usp.br/~rvencio/HTself), desenvolvida por nossos colegas Ricardo
Vêncio e Tie Koide (VÊNCIO e KOIDE, 2005), que nos auxiliaram nas análises. Esta
abordagem envolve a realização de experimentos de hibridização self-self para derivar curvas
CEPA IC50 BZ (µµµµM) (média ±±±± dp)
115 7,6 ± 3,6 Berenice 62 12,8 ± 4,9 CL Brener 13,6 ± 4,4
VL10 23,0 ± 7,0 Colombiana 25,4 ± 5,7
YuYu 32,0 ± 0,2
YuYu (32.0 ± 0.2)
Colombiana (25.4 ± 5.7)
VL10 (23.0 ± 7.0)
115 (7.6 ± 3.6)
Berenice 62 (12.8 ± 4.9)
CL Brener (13.6 ± 4.4)
CL Brener
67
de corte (cutoff) dependentes da intensidade de hibridização e técnicas de estimativa não-
paramétrica.
Para a determinação da curva de corte realizamos uma hibridização self-self com
cDNA de CL Brener marcado com Cy3 e Cy5 (Figura 19).
Figura 19 - Curva de corte obtida a partir de uma hibridização self-self com cDNA de CL Brener.
Foi usado um intervalo de credibilidade de 0,995. Assim, um determinado gene foi
considerado diferencialmente expresso quando a razão de expressão (R) de pelo menos 80%
das suas réplicas na lâmina estivesse localizada fora da curva de corte (para cima ou para
baixo).
4.3.4 Normalização por Lowess (locally weighted scatterplot smoothing )
Uma fonte conhecida de ruído que ocorre em todos os experimentos de microarranjos
é resultante da variação experimental intrínseca, motivo pelo qual os dados precisam ser
normalizados. Normalização é o termo utilizado para descrever o processo de remoção dessas
variações.
Neste estudo, utilizamos o algoritmo de Lowess para normalizar os dados de
expressão em cada hibridização independente. Lowess é uma técnica de correção linear
amplamente utilizada em experimentos de microarranjos (DUDOIT et al., 2002).
68
Na figura 20 mostramos o processo de normalização dos dados do experimento self-
self setup onde duas amostras idênticas de cDNA de CL Brener foram marcadas com Cy3 ou
Cy5 e hibridizadas em uma mesma lâmina. As intensidades de fluorescência foram obtidas
pelo programa ArrayVision e o gráfico de dispersão comparando a hibridização do cDNA
marcado com os corantes Cy3 e Cy5 é mostrado na figura 20A. Os dados também podem ser
visualizados no gráfico de dispersão MA (YANG et al., 2002), onde M é a razão de
hibridização [M = log2 (Cy5/Cy3)] e A está relacionado com a intensidade de fluorescência
[A = ½ log2 (Cy5 x Cy3)] (Figura 20B). Neste experimento, a razão de hibridização Cy3/Cy5
esperada é 1 e o valor de M esperado é zero (por tratar-se da mesma amostra marcada com
flouoróforos diferentes). No entanto, podemos observar no painel 20B (antes da
normalização) que os valores de M tendem a ser superiores a 1 quando os valores de A são
baixos. Este é um exemplo de uma variação inerente a todos os experimentos de microarranjo
e é a normalização que corrige este desvio, figura 20C.
Figura 20 - Hibridização do microarranjo com cDNA de CL Brener marcado com Cy3 e Cy5. Gráfico de dispersão (A); gráfico MA antes da normalização (B); dados normalizados por Lowess (C).
4.3.5 Identificação de genes diferencialmente expressos entre os grupos fenotípicos
O RNA total foi extraído de duas culturas independentes de cada cepa (formas
epimastigotas em fase exponencial de crescimento), tratado com DNase e submetido a
transcrição reversa para obtenção de cDNA, o qual foi marcado com os fluoróforos Cy3 ou
Cy5, conforme descrito em Material e Métodos. Estas representam réplicas biológicas.
Cy3
Cy5
A
M
0 2 4 6 8 10
M
-4
-
2
0
2
4
M
A
0 2 4 6 8 10
-4
-
2
0
2
4
M
CL BRENER X CL BRENER
Cy3
Cy5
Cy3
Cy5
A
M
0 2 4 6 8 10
M
-4
-
2
0
2
4
M-4
-2
0
2
4
-4
-2
0
2
4
M
A
0 2 4 6 8 10
-4
-
2
0
2
4
M
A
0 2 4 6 8 10
-4
-
2
0
2
4
M
A
0 2 4 6 8 10
A
0 2 4 6 8 10
-4
-
2
0
2
4
M
CL BRENER X CL BRENER
A B C
A B C
69
As hibridizações foram realizadas em pares: o cDNA da cepa problema com o cDNA
de CL Brener (cepa de referência). O cDNA de cada réplica biológica foi hibridizado em uma
lâmina gerando no mínimo 6 e no máximo 24 réplicas de cada gene (considerando as réplicas
técnicas).
Os dados obtidos deste conjunto de co-hibridizações foram normalizados pelo
algoritmo de Lowess.
Para identificar os genes super-expressos ou reprimidos nos três isolados sensíveis em
relação aos três isolados resistentes a BZ utilizamos o teste estatístico Bayboots que é uma
ferramenta para identificar marcadores de classe a partir de dados de expressão (VÊNCIO et
al., 2006). Este método permite verificar se as réplicas de cada gene estão, de fato, separadas
nos dois grupos de cepas. A separação ou sobreposição dos dois grupos é indicada pelo valor
(E). Ou seja, quanto mais próximo de zero for o valor de E, maior será a separação entre os
dois grupos. Conseqüentemente, quanto mais próximo de 1 for o valor de E, maior será a
sobreposição entre os grupos, indicando não haver variação de expressão gênica entre eles. O
teste Bayboots foi utilizado e validado em trabalho anterior de nosso laboratório (BAPTISTA
et al., 2006). Neste teste, o valor de corte (cutoff) recomendado para aceitar um gene como
diferencialmente expresso é de 0,05 (VÊNCIO et al., 2006). Utilizando esta exigência não
identificamos nenhum gene de expressão diferencial entre os dois grupos de cepas. Desta
forma, alteramos o valor de corte para 0,07 e três sondas foram identificadas: a amastina
(GenBank XM_815166), a proteína ribossomal L6 (GenBank XM_811802) e uma proteína
hipotética (GenBank XP_819782).
4.3.6 Validação da transcrição diferencial dos genes identificados nos experimentos de micro
arranjos
Para validar a transcrição diferencial dos três genes especificados acima, o RNA total
de nove cepas, cuja CI50 para BZ havia sido determinada, foi purificado, submetido a
eletroforese em gel de agarose, transferido para membranas e hibridizado com as três sondas
marcadas (Figura 21).
70
Figura 21 - Northern blot com RNA total de nove cepas de T. cruzi hibridizado com três sondas
identificadas nos ensaios de microarranjo. A CI50 (µM BZ) de cada cepa é indicada entre parênteses.Cinco das seis cepas utilizadas no experimento de microarranjo são indicadas com asterisco. Abaixo de cada painel indica-se o padrão de migração das três espécies de RNA ribossômico. Do lado direito, indica-se o tamanho do transcrito em kb.
Para a sonda que representa a proteína hipotética não observamos variações
apreciáveis na abundância de transcritos entre as cepas. Para as sondas de amastina e da
proteína ribossomal L6 observam-se variações nos níveis dos transcritos, mas que não se
correlacionam com o fenótipo de suscetibilidade ou resistência a BZ. Desta forma, a
transcrição diferencial dos três genes selecionados, nos dois grupos de cepas, não foi validada
pelos ensaios de northern blot. Por outro lado, estes dados indicam que o teste Bayboots é
eficiente na identificação de genes diferencialmente expressos entre duas classes de
populações e que o valor de corte de 0,05 deve ser respeitado.
Amastina
Proteína ribossomal L6
Proteína Hipotética
* *
*
*
*
71
4.4 Análise da expressão diferencial de genes em cepas sensíveis e resistentes a BZ com
lâmina de microarranjos do TIGR
A lâmina de microarranjos construída por nós continha apenas 1148 seqüências que
representariam cerca de 10% dos genes de CL Brener. No início de 2006, nosso laboratório
teve um projeto aprovado pelo NIAID/NIH e recebeu lâminas de microarranjo preparadas
pelo Pathogen Functional Genomics Resource Center (PFGRC) do TIGR. Estas lâminas
contêm oligonucleotídios (70-meros) representantes de 12.288 ORFs de CL Brener
(http://pfgrc.tigr.org/slide_html/array_descriptions/T_cruzi.shtml).
Decidimos então fazer experimentos de hibridização diferencial apenas com uma cepa
resistente (VL10, CI50 23,0 ± 7,0 µM) versus uma cepa sensível (115, CI50 7,6 ± 3,6 µM).
Realizamos 2 réplicas biológicas. Os genes diferencialmente transcritos entre as duas cepas
seriam posteriormente validados com várias cepas portadoras dos dois fenótipos. Os dados
dos experimentos de hibridização foram normalizados pelo algoritmo de Lowess e a
determinação da expressão dos genes foi realizada com ajuda do programa estatístico R
(http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/arraysoft_rpackages.html).
Verificamos a super-expressão de 578 genes na cepa VL10 em relação à cepa 115 e,
por sua vez, a super-expressão de 676 genes na cepa 115 em relação a VL10.
Aproximadamente 90% dos genes super-expressos em uma ou outra cepa apresentavam uma
razão de hibridização R ≤ 10; 9% dos genes, R entre 11 e 50; e apenas 1% dos genes R > 50
(ver lista de genes no Material Suplementar). Reunimos os genes diferencialmente transcritos
nas cepas em classes funcionais e, na Tabela 9, mostramos as classes mais populosas destes
genes. No primeiro grupo (em verde) estão as classes de genes super-expressos em VL10; no
segundo grupo (em magenta), as classes de genes super-expressos em 115 e no terceiro grupo
(em azul) as classes de genes super-expressos em ambas cepas.
72
Tabela 9 - Classes de genes super-expressos exclusivos de cada cepa e classes mais populosas comuns às cepas VL10 e 115.
Conforme esperado, as classes de proteínas hipotéticas conservadas e proteínas
hipotéticas (possivelmente T. cruzi-específicas) são aquelas que contêm maior número de
membros diferencialmente transcritos entre as cepas. Na cepa VL10, os grupos super-
expressos mais populosos e exclusivos são representados por genes que codificam as
proteínas putativas: calpaínas (n=13), quinases (n=8), transportadores ABC (n=3) e proteínas
putativas de choque térmico (HSP70) (n=3). Na cepa 115, as classes super-expressas mais
populosas e exclusivas são representadas por genes que codificam majoritariamente proteínas
de superfície: trans-sialidases (n=27), Dispersed gene family proteína 1 (n=19 + 16), Protease
GP63 (n=9), MASP (n=6); além de outras classes de genes (ver Tabela 9).
De um modo geral, observam-se diferenças quantitativas e qualitativas nas classes de
genes super-expressos em VL10 e 115.
Classes de genes
N° membros
VL10 115
Calpaína símile cisteína peptidase, putativa 8 0 Proteína kinase, putativa 8 0 Calpaína símile cisteína peptidase (pseudogene), putativa 5 0 Transportador ABC, putativa 3 0 Heat shock 70 kDa, precursor mitocondrial, putativa 3 0 Trans-sialidase (pseudogene), putativa 0 27 Dispersed gene family proteína 1 (DGF-1), putativa 0 19 Retrotransposon hot spot (RHS), putativa 0 18 Dispersed gene family proteina 1 (DGF-1, pseudogene), putativa 0 16 Proteína hipotética, conservada (pseudogene) 0 14 Protease de superfície GP63, putativa 0 9 Proteínas de superfície associadas a genes de mucina (MASP, pseudogene) 0 6 Mucina TcMUCI, putativa 0 4 Ubiquitin-conjugating enzyme E2, putativa 0 3 Proteína RNA-binding, putativa 0 3 Proteína hipotética, conservada 202 306 Proteína hipotética 39 102 Mucina TcMUCII, putativa 11 26 Retrotransposon hot spot (RHS, pseudogene), putativa 11 15 Trans-sialidase, putativa 7 33
73
4.4.1 Validação de alguns genes diferencialmente transcritos
4.4.1.1 Critérios de escolha dos genes e justificativa
Em função da limitação de tempo, apenas alguns genes que apresentavam expressão
diferencial entre as cepas 115 e VL10 puderam ser validados por RT-PCR em tempo real. Na
escolha dos genes levamos em consideração alguns critérios: (i) valor da razão de expressão
diferencial do gene; (b) função putativa do gene; (c) preferência para genes super-expressos
em VL10 por tratar-se de uma cepa resistente a BZ. De fato, apenas 27% de cura foi
observada em camundongos infectados com esta cepa e tratados com BZ (FILARDI e
BRENER, 1987). Na Tabela 10 apresentam-se as características dos genes selecionados.
Tabela 10 - Genes com expressão diferencial nos experimentos de microarranjo selecionados para validação por RT-PCR em tempo real.
Identidade GenBank Razão de hibridização
VL10/115 115/VL10
Transportador ABC XP_818614 1,8 e 3,6 - Proteína de membrana (MatE) XP_816244 7,9 - Calpaína 3 (Calp3) XP_806365 1,6 - Calpaína 8 (Calp8) XP_816696 10,0 - Tripanotiona sintetase XP_819471 4,0 - Triparedoxina peroxidase AAL37182 2,7 - *Fe-Superóxido dismutase A (FeSOD-A1)
XP_804176
- 5,5
*Fe-Superóxido dismutase A (FeSOD-A2)
XP_811038
- 7,5
*1 e 2 Isoformas mitocondriais de Fe-SOD-A Os genes super-expressos em uma ou outra cepa que apresentaram R muito elevados,
representam, na sua maioria, proteínas hipotéticas e proteínas hipotéticas conservadas (ver
Material Suplementar). Tendo em vista sua função desconhecida, decidimos não escolhê-los
para serem validados numa primeira instância.
Transportador ABC
No conjunto de genes super-expressos e exclusivos da cepa VL10 verificamos a
presença de 3 genes que codificam transportadores ABC putativos (Tabela 9). Conforme
descrito na Introdução, transportadores ABC estão implicados no fenótipo de resistência a
74
drogas em vários organismos. Por outro lado, em T. cruzi, seu envolvimento na resistência a
quimioterápicos não foi demonstrado até o momento.
O gene que codifica o mesmo transportador ABC (GenBank XP_818614) que é super-
expresso em VL10 (Tabela 10) está representado na lâmina do TIGR por dois
oligonucleotídeos (QTC00005_L_15 e QTC00014_D_3), que fornecem razões de
hibridização VL10/115 de 1,8 e 3,6, respectivamente. O fato de os dois oligonucleotídeos
indicarem uma super-expressão do gene na cepa VL10 indica veracidade dos resultados.
Decidimos verificar a posição que cada oligonucleotídeo representa no gene/proteína.
Na Figura 22 mostramos a seqüência protéica do transportador ABC em estudo, os domínios
conservados que o caracterizam como um membro verdadeiro da super-família ABC e as
regiões cobertas pelos dois oligonucleotídeos no gene correspondente.
MSCCRAEVNEPVTPSSASSLESDDQIAPKQKGNEPQIEDYSIIAPGFSIKGSVAQFDAVEQNKSSVSGRF
SIPVSWHNLSYSANGTKILCGLTGTALPSRCLAVMGSSGAGKTTFLNAISDRLTTSRTLKLTGKRQLGDL
EYKRHYRRMVGFVAQDDILSPRATPEDSLRFSLRVRRGTSISETNKFVEETLEELRLVHCRETIVGIPGL
VSGLSGGERKRTSIGVELICDPKILLLDEPTSGLDSVTSVKIVHLLNNIARTGRTVIYTIHQPTAETLTY
FDDLMLLTGGRCAYHGTMAKSVEYFESIGFPCPERYTPSDFFMKLLQDPEISKVLVKKWKSYLKHGVRTP
HTTAVELNPNPSESPTAKNIESYLGRFGSTSCIQFQELFRRFSMDLSRNHVYIFSHFIQAAFFAVIVGLI
FLNVKDDLAGMQDREGVFFMVTMNRAMGQTFIMVNSFMQDKALYVREQMVGSYSPFIFFLSKTLVEFPMR
VFFAFLECCILYWMVGLYRQAGAFFYYFAVIALLTEVASGLGFAIGATFKSLVVASGTAPVILLPLAMVG
GLLANTDRLHPYWYWLEKPSFIRQAYILLARNEFKHIDHIRCDGRGKPPGFCKDKPQNGEDILRQLGFQQ
KQYENWVLWLTLALLYIAFRGWAVISLYSAARTKF
Figura 22 – Seqüência protéica do transportador ABC de T. cruzi (GenBank XP_818614). Em retângulos estão indicados os domínios conservados característicos de proteínas ABC. Em negrito, a região coberta pelo oligonucleotídeo QTC00005_L_15 e em azul a região coberta pelo oligonucleotídeo QTC00014_D_3.
Proteína putativa de membrana (MatE)
O oligonucleotídeo QTC00002_O_17 apresentou uma razão de hibridização
VL10/115 de 7,9 (Tabela 10). Este oligo representa o gene que codifica uma proteína putativa
de membrana (GenBank: XP_816244) (Tabela 10). Inicialmente procuramos sua
categorização pelo Gene Ontology (GO) e verificamos que esta seqüência corresponde a uma
proteína de membrana que estaria putativamente envolvida no transporte de drogas (Figura
23A).
---- Walker A ---- Walker B ---- ABC signature
75
Figura 23 - A. Categorização pelo GO da seqüência protéica representada pelo oligonucleotídeo
QTC00002_O_17. B. Domínios conservados encontrados pelo banco InterPro.
Esta proteína é constituída por 517 aminoácidos, sendo que as regiões entre os
resíduos 39-193 (pfam01554) e os resíduos 261-419 (pfam01554) apresentam domínios com
grande similaridade com domínios de membros da família de proteínas Multi Antimicrobial
Extrusion (MatE) (Figura 23B).
O grupo de proteínas MatE representa um sistema de transporte antiporto onde dois
solutos diferentes se movimentam através da membrana simultaneamente ou seqüencialmente
em sentidos opostos. No caso das proteínas MatE, elas co-transportam drogas/sódio ou
hidrogênio. Em bactérias estas proteínas estão relacionadas com a resistência a norfloxacina e
etídeo; em plantas estão envolvidas na detoxificação de metabólitos secundários incluindo
alcalóides; e em células de mamífero são responsáveis pelo passo final na excreção de
metabólitos residuais, assim como na excreção de cátions orgânicos xenobióticos (OMOTE et
al., 2006). Em tripanossomatídeos não foi descrita a funcionalidade deste grupo de proteínas.
Calpaínas-símile
Os genes de duas calpaína-símile putativas: calpaína 8 (GenBank XP_816696) e
calpaína 3 (XP_806365) foram super-expressos em VL10 com razões de hibridização
VL10/115 de 10 e 1,6, respectivamente (Tabela 10) e escolhidos para serem validados pelas
razões que seguem.
As calpaínas atuam em vários processos em células de eucariotos superiores e, na
última década, tem sido descrita sua participação em processos de resistência a
quimioterápicos (OHKAWA et al., 1999; MŁYNARCZUK-BIAŁY et al., 2006). Em
tripanossomatídeos, as calpaínas apresentam uma estrutura diferente da dos demais eucariotos
(calpaínas-símile) (ERSFELD; BARRACLOUGH; GULL, 2005) (ver Discussão). Em T.
cruzi sua função não foi avaliada.
A B
76
Tripanotiona sintetase e Triparedoxina peroxidase
Os genes da tripanotiona sintetase (GenBank XP_819471) e da triparedoxina
peroxidase (GenBank AAL37182) também foram super-expressos em VL10, com razões de
hibridização de 4 e 2,7 respectivamente (Tabela 10). Tendo em vista que os produtos destes
genes participam de importantes vias de detoxificação e resposta ao estresse oxidativo
(FAIRLAMB e CERAMI, 1992), também decidimos validar sua expressão diferencial nas
cepas de T. cruzi.
Fe-Superóxido dismutase (SOD)
Nos experimentos de microarranjo observamos a super-expressão na cepa 115 de dois
genes que codificam isoformas mitocondriais da FeSOD-A (GenBank XP_804176 e
XP_811038). Estes genes apresentam razões de hibridização 115/VL10 de 5,5 e 7,5,
respectivamente (Tabela 10). A super-expressão de dois genes de uma mesma família na cepa
115 fala a favor da possível veracidade dos dados, razão pela qual a expressão destes genes
também foi validada por RT-PCR em tempo real.
4.4.2 RT-PCR em tempo real
Para os ensaios, utilizamos pares de oligonucleotídios iniciadores específicos para
cada um dos oito genes (desenhados com o programa Primer Express software - Applied
Biosystems) (Tabela 1 de Material e Métodos). Inicialmente, para verificar a adequação dos
iniciadores para amplificar cada gene, realizamos uma PCR convencional com DNA de CL
Brener, confirmando sua eficiência (dados não mostrados). Também realizamos PCRs com
amostras de RNA (tratado com DNase) de cada cepa. Os resultados negativos obtidos
comprovaram a ausência de DNA contaminante nas amostras (dados não mostrados).
Para os ensaios de RT-PCR em tempo real, utilizamos o housekeeping gene da
GAPDH como normalizador interno. Nos experimentos de microarranjo, havíamos verificado
que este gene não apresentou variação de expressão significativa entre as cepas 115 e VL10
(dados não mostrados). Os ensaios de RT-PCR em tempo real foram realizados em triplicata
em todas as cepas. Comprovamos a conservação da expressão do gene de GAPDH (dados não
mostrados), confirmando a validade deste gene como normalizador interno.
77
Os ensaios de RT-PCR em tempo real foram executados conforme descrito em
Material e Métodos. Para a determinação da abundância relativa dos transcritos e posterior
análise das razões de expressão utilizamos o método comparativo ∆∆Ct (PFAFFL, 2001).
Para comparar as razões de expressão entre as cepas, escolhemos a cepa CL Brener como
referência.
Para a validação dos dados do microarranjo, inicialmente analisamos a abundância
relativa dos transcritos dos oito genes nas cepas VL10 e 115, em relação a CL Brener (Figura
24).
Figura 24 - Abundância relativa de transcritos nas cepas VL10 e 115 em relação aos transcritos da
cepa CL Brener.
Para considerar um gene diferencialmente expresso, definimos como valor de corte
uma razão de expressão >1,5. Na Tabela 11 comparamos os valores da razão de hibridização
nos microarranjos e da abundância relativa dos transcritos de cada gene nas cepas VL10 e
115.
78
Tabela 11 - Validação da transcrição diferencial de genes entre as cepas VL10 e 115.
Gene Razão nos microarranjos
Razão nos ensaios de RT-PCR em tempo real
Conclusão*
VL10/115 VL10/115
Transportador ABC 1,8 e 3,6 4,54 Valida MatE 7,9 1,80 Valida Calpaína 3 1,6 1,47 Não valida Calpaína 8 10.0 1,15 Não valida Tripanotiona sintetase 4,0 4,33 Valida Triparedoxina peroxidase 2,7 0,46 Não valida 115/VL10 115/VL10 Fe-SOD-A1 5,5 1,22 Não valida Fe-SOD-A2 7,5 4,66 Valida * Valida ou não os dados do microarranjo. Para RT-PCR em tempo real cutoff > 1,5.
Com base nestes dados, concluiu-se que a RT-PCR em tempo real validou apenas a
expressão diferencial dos genes que codificam as seguintes proteínas putativas: transportador
ABC, MatE, e tripanotiona sintetase (super-expressos em VL10) e Fe-SOD-A2 (super-
expresso em 115). Curiosamente, para o gene da calpaína 8, onde a razão VL10/115 no
microarranjo foi de 10 (a maior obtida entre os genes analisados), a razão da abundância de
transcritos foi de apenas 1,15.
4.4.3 Verificação da abundância de transcritos em outras cepas de T. cruzi
Para a verificação da expressão diferencial dos quatro genes validados nas cepas VL10
e 115 e sua associação com os fenótipos de suscetibilidade ou resistência a BZ, escolhemos
seis cepas adicionais cuja CI50 para BZ havíamos determinado. Para efeito de comparação, os
valores da CI50 dos isolados são mostrados novamente na tabela 12.
79
Tabela 12 - Valores de CI50 de cepas usadas para a validação da expressão diferencial de genes por RT-PCR em tempo real.
Para a determinação da abundância relativa dos transcritos utilizamos como referência
a cepa CL Brener. Os dados são mostrados na figura 25.
Figura 25 - Razão da abundância relativa de transcritos de quatro genes em cepas suscetíveis (barras
brancas) e resistentes (barras cinza) a BZ em relação à cepa CL Brener.
Cepa CI50 Média ± dp (µM)
115 7,6 ± 3,6 Berenice 62 12,8 ± 4,9 CL Brener 13,6 ± 4,4
VL10 23,0 ± 7,0 Colombiana 25,4 ± 5,7
Silvio X10 cl1 26,1 ± 2,5 Esmeraldo cl3 26,7 ± 0,3
YuYu 32,0 ± 0,2
SOD-A2
Transportador ABC Tripanotiona sintetase
MatE
80
Para definir se algum dos genes analisados apresenta diferenças significativas na
abundância de transcritos entre o grupo de cepas resistentes a BZ (n = 5) e o grupo de cepas
susceptíveis (n = 3), os dados foram submetidos ao teste estatístico de Student, que avalia as
diferenças das médias entre dois grupos amostrais pequenos (SPIEGEL, 1993). O teste foi
aplicado com um nível de confiança de 95% para aceitar a hipótese nula (H0: não existe
diferença de expressão significativa do gene entre os dois grupos). A diferença foi
considerada significativa quando o valor p era menor que 0,05 (Tabela 13). A análise indica
que apenas o gene que codifica o transportador ABC separa os dois grupos de cepas.
Tabela 13 - Teste de Student com um intervalo de confiança de 95%, com seis graus de liberdade
(t0,975= 2,45), aplicado à expressão diferencial de genes em cepas susceptíveis e resistentes a BZ.
Gene Valor de t Conclusão*
Transportador ABC -2,935 Separa MatE -1 Não separa
Tripanotiona sintetase 0,45 Não separa Fe-SOD-A2 1,11 Não separa
*Conclusão sobre a separação dos grupos de cepas suscetíveis e resistentes a BZ com base no valor de t.
4.5 Abundância de transcritos de genes que codificam putativas calpaínas
Chamou a atenção o fato de que na cepa VL10 foram super-expressos 13 genes que
codificam putativas calpaínas (Tabela 9). As calpaínas representam uma família bem
conservada de cisteíno-proteases dependentes de cálcio, que são reguladas in vivo pelas
calpastatinas (MURRAY et al., 1997). Conforme comentado acima e discutido adiante, a
estrutura e putativa função das calpaínas foram investigadas em alguns tripanossomatídeos,
mas não em T. cruzi.
Apesar de os dados de RT-PCR em tempo real não terem validado os resultados
obtidos com os microarranjos, relativos à expressão diferencial dos genes que codificam a
calpaína 8 e calpaína 3, decidimos determinar a abundância de transcritos em algumas cepas
(Figura 26). Em todas as cepas observamos que a abundância de transcritos do gene da
calpaína-símile 8 é sempre maior que a do gene da calpaína-símile 3.
81
Figura 26 – Abundância relativa de transcritos dos genes de calpaína-símile 3 (Calp 3) e 8 (Calp 8)
em cepas de T. cruzi. Ao nível de transcritos de Calp 3 da cepa CL Brener foi atribuído o valor unitário.
4.6 Suscetibilidade a BZ em isolados de pacientes submetidos a tratamento com a droga
NOTA: Parte dos Resultados descritos a seguir (items 4.6.1 e 4.6.2) constam no manuscrito
Moreno et al., 2008 (submetido para publicação).
Conforme comentado na Introdução, vários autores atribuem, pelo menos em parte, a
falha terapêutica tanto no caso do tratamento com BZ como com NF a diferenças na
suscetibilidade das cepas infectantes a estas drogas. No entanto, esta hipótese nunca foi
comprovada. No presente estudo, nós determinamos a CI50 para BZ em isolados obtidos de
sete pacientes antes e após tratamento com este nitroderivado.
Os isolados foram obtidos por hemocultura (conforme descrito no manuscrito) por
nossos colaboradores Prof. Dr. Egler Chiari e Dra. Lúcia Galvão do Departamento de
Parasitologia do ICB-UFMG. O tratamento dos pacientes e a avaliação sorológica e clínica
dos mesmos esteve a cargo da Dra. Eliane Gontijo do Departamento de Medicina Preventiva
da FM-UFMG (detalhes descritos no manuscrito anexo).
82
4.6.1 Características dos pacientes
As características dos pacientes submetidos ao tratamento com BZ são apresentadas na
Tabela 14. Todos os pacientes apresentaram sorologia para a doença de Chagas e hemocultura
positivas antes do tratamento.
Tabela 14 - Características dos pacientes submetidos a quimioterapia
Código do paciente
Sexo Forma clínica Idadea Estado da hemocultura pós-tratamentob
003 F Indeterminada 28 (+) 6 m (-) 16 m; 31 m; 71 m e 92 m
007 F Indeterminada 33 (-) 7 m; 52 m; 66 m; 95 m e 102 m 012 M Indeterminada 51 (+) 29 m e 56 m
(-) 18 m; 38 m e 42 m 019 M Cardíaca 45 (+) 22 m; 47 m; 67 m e 93 m
(-) 112 m 022 F Indeterminada 37 (-) 7 m; 18 m; 35 m; 56 m; 72 m e
84 m 036 M Indeterminada 25 (-) 4 m; 56 m e 91 m 050 F Indeterminada 39 (-) 6 m; 34 m and 63 m
(+) 22 m; 48 m e 74 m a Idade do paciente no início do tratamento. b Hemocultura positiva (+) ou negativa (-); m (meses pós-tratamento).
Os dados da tabela 14 indicam que as diversas hemoculturas realizadas nos pacientes
007, 022 e 036 pós-tratamento foram negativas mesmo depois de 6 (036); 7 (022) e 8 (007)
anos de finalizado o tratamento. Estes resultados, aliados ao fato de que estes pacientes
também apresentaram negativação da serologia para a doença de Chagas e não tiveram
amplificação de kDNA de T. cruzi (dados não mostrados), sugerem que estes indivíduos
foram curados. Por outro lado, as hemoculturas positivas observadas para os pacientes 003;
012; 019 e 050 atestam a falha terapêutica.
4.6.2 Determinação da CI50
A suscetibilidade a BZ dos isolados dos pacientes (formas epimastigotas) obtidos
antes e após tratamento (no caso da falha terapêutica) foi determinada utilizando o ensaio
padronizado por nós (ver Material e Métodos e o manuscrito anexo) (Tabela 15). O isolado
012d foi obtido durante o tratamento, especificamente no dia 30 após iniciado o mesmo que é
de 60 dias. Os valores de CI50 estimados para os isolados dos pacientes considerados curados
(007, 022 e 036) obtidos antes do tratamento estão entre 19 e 35 µM (Tabela 15). Por outro
83
lado, para os isolados pré-tratamento dos pacientes com falha terapêutica (003, 012, 019 e
050) obtivemos valores de CI50 no intervalo de 15,6 a 51,4 µM (Tabela 15). Estes dados
indicam não haver uma correlação entre o valor da CI50 da cepa infectante e o sucesso de cura
com BZ.
Tabela 15 – Suscetibilidade a BZ de isolados de T. cruzi obtidos de pacientes que foram submetidos a tratamento.
Isolado a
(código) Antes do
tratamento Meses pós- tratamentob CI50 BZ (µM)
(média ± dp)
007a + -- 35 ± 4 022a + -- 19,2 ± 4 036a + -- 19,4 ± 4 003a + -- 31,5 ± 4,3 003b - 6 10,1 ± 1,8 012a + -- 15,6 ± 3 012d - Durante o tratamentoc 37,5 ± 7 019a + -- 51,4 ± 1 019b - 47 43,45 ± 3,5 019c - 93 48,9 ± 5 050a + -- 24,4 ± 7 050b - 48 55,2 ± 3,5
a Obtido antes (a); após (b,c) ou durante (d) o tratamento com BZ. b Época em que o isolado foi obtido. c No dia 30 após o início do tratamento.
Também determinamos os valores de CI50 dos isolados obtidos dos pacientes 003, 012,
019 e 050 pós-tratamento (Tabela 15). A comparação dos valores de suscetibilidade a BZ dos
isolados do mesmo paciente ante e após-tratamento mostra dados interessantes. Para o
paciente 019, os isolados apresentaram valores elevados e conservados (019a, 51,4 ± 1 µM;
019b, 43,45 ± 3,5; 019c, 48,9 ± 5 µM). O isolado pós-tratamento do paciente 050 apresentou
um aumento de cerca 2 vezes da resistência a BZ em relação àquela determinada para o
isolado pré-tratamento. Por outro lado, o isolado pós-tratamento do paciente 003 apresentou
uma diminuição de cerca 3 vezes da resistência a BZ. Estes dados serão discutidos adiante.
4.6.3 Abundância dos transcritos do transportador ABC nos isolados de pacientes com falha
terapêutica
Os resultados apresentados no item 4.4.3 indicaram que a abundância de transcritos de
um transportador ABC era maior em cepas que apresentavam resistência a BZ em relação a
cepas suscetíveis à droga. Decidimos então analisar o nível relativo de transcritos deste gene
84
nos isolados pré e pós-tratamento dos pacientes 003 e 050 que apresentaram falha terapêutica
(Tabela 15).
Para a realização dos ensaios de RT-PCR em tempo real seguimos os mesmos
procedimentos descritos no item 4.4.2 (ver também Material e Métodos). A abundância
relativa de transcritos foi determinada com relação a CL Brener (Figura 27).
Figura 27 - Abundância relativa dos transcritos do gene que codifica um transportador ABC em isolados de humanos obtidos antes (AT) e após tratamento (DT) com BZ.
Na tabela 16 comparam-se os valores de CI50 para BZ e a abundância relativa de transcritos
do gene do transportador ABC nos isolados dos pacientes 003 e 050. Os dados indicam uma redução
da abundância de transcritos deste gene associada a uma redução da resistência a BZ.
Tabela 16 – Valores de IC50 para BZ e abundância relativa de transcritos do gene do transportador
ABC
a Período de obtenção do isolado: antes do tratamento (AT); depois do tratamento (DT). b Abundância relativa de transcritos determinada por RT-PCR em tempo real.
Isolado Hemoculturaa CI50 BZ (µM) Transcritos ABCb
003a AT 31,5 ± 4 3,3 003b DT 10,1 ± 1 1,8
050a AT 24,4 ± 7 1
050b DT 55,2 ± 3 3
Abu
ndân
cia
rela
tiva
de
tran
scri
tos
AT
AT DT
DT
85
4.6.4 Cópias do gene que codifica o transportador ABC nos isolados
Tendo por objetivo verificar se o nível dos transcritos do transportador ABC estava
relacionado com o número de cópias do gene que o codifica, o DNA (10 µg) de cinco cepas
de T. cruzi foi digerido com a enzima PstI, submetido a eletroforese em gel de agarose corado
com brometo de etídio (Figura 28A). Apesar de a concentração de DNA de cada amostra ter
sido quantificada após determinação da absorbância a 260 nm, notam-se diferenças na
quantidade de amostra aplicada no gel. O DNA foi transferido para membrana de Nylon e
hibridizado com uma sonda de 615 pb específica para o gene do transportador ABC (Figura
28B). Esta sonda foi desenhada sobre a região transmembrana entre os aminoácidos de
posições 910 e 1525. Em todas as amostras, a sonda hibridiza com duas bandas de alto peso
molecular (3,9 e 3,6 kb) e com bandas de menor tamanho. Uma exposição mais prolongada da
membrana indica que este padrão é conservado em todas as cepas (dados não mostrados).
Supomos que as duas bandas maiores correspondam ao gene do transportador ABC, uma vez
que o gene, cuja seqüência está depositada no GenBank, tem ~2 kb, e não apresenta sítios
para PstI. Não há informações sobre o número de cópias deste gene no genoma de T. cruzi.
As duas bandas poderiam corresponder a diferentes cópias do gene, ou aos dois alelos do
gene, que teriam diferenças estruturais ou nas seqüências flanqueadoras onde estariam
localizados sítios para PstI. As bandas menores de hibridização poderiam corresponder a
regiões de outros transportadores ABC ou outros genes, que estariam em tandem e seriam
reconhecidos pela sonda. Na figura 28C é apresentada a imagem obtida por PhosphorImager
Storm 840 (24 horas de exposição) da região das bandas de 3,9 e 3,4 kb. O sinal de
hibridização correspondente a cada uma das bandas foi quantificado por análise
densitométrica com o programa ImageQuant Molecular Dynamics (Tabela 17). Chama a
atenção o fato de haver diferenças na intensidade de hibridização de cada banda, dentro de
cada cepa. Por exemplo, na cepa YuYu a banda de 3,6 kb apresenta um sinal cerca de 4,5
vezes maior do que o sinal da banda de 3,9 kb.
Com o objetivo de normalizar os dados das hibridizações, a sonda do transportador
ABC foi removida e a membrana foi hibridizada com uma sonda correspondente ao gene de
actina 2, considerado um housekeeping gene, e que identifica uma banda de 3,7 kb. Na figura
28D apresenta-se a imagem obtida por PhosphorImager Storm 840, após 24 horas de
exposição. O sinal de hibridização com esta sonda foi quantificado como descrito
anteriormente e a intensidade relativa da banda de hibridização de cada cepa é indicada na
abaixo da figura 28D, atribuindo-se valor unitário ao sinal de menor intensidade.
86
Figura 28 - Arranjo genômico do gene do transportador ABC em cepas de T. cruzi. O DNA foi
digerido com a enzima PstI, submetido a eletroforese em gel de agarose 1% e corado com brometo de etídio (A). O DNA foi transferido para membrana de Nylon e hibridizado com uma sonda para o transportador ABC (B). O sinal de hibridização das bandas do gene putativo ABC (C) e da banda do gene actina 2 (D) foi obtido por PhosphorImager Storm 840 após 24 horas de exposição. Abaixo do painel D apresenta-se a intensidade relativa do sinal de hibridização. Atribuiu-se o valor unitário ao sinal de menor intensidade.
Na tabela 17, apresenta-se o valor do sinal de hibridização de cada banda que
corresponderia ao gene ABC, a somatória dos sinais das duas bandas e a normalização dos
valores após considerar o sinal de hibridização do gene de actina 2 nas cepas (ver Fig. 28D).
Para efeito de comparação, nesta tabela apresenta-se ainda a abundância relativa de transcritos
de ABC determinada por RT-PCR em tempo real (Figuras 25 e 27). Tomados em seu
conjunto, os dados indicam não haver uma correlação entre a abundância de genes do
transportador ABC e de seus transcritos.
CL B
rener
VL10
YuY
u
003a
003b
CL B
rener
VL10
YuY
u
003a
003b
A
4,2 3,8 3,7
3,5
3,2
B
CL B
rener
VL10
YuY
u
003a
003b
3,9 3,6
3,7
1,3 1 3 1,2 1,1
A B
C - ABC
D – Actina 2
87
Tabela 17 – Intensidade da hibridização das bandas que corresponderiam ao gene do transportador ABC. Valores em pixels x 10-3.
Cepa / isolado
ABC (3,9 kb)
ABC (3,6 kb)
Soma das bandas ABC
Valores ABC Normalizadosa
Abundância relativa de transcritos de ABCb
CL Brener 74,6 58,9 133,5 102,7 1 VL10 19,4 28,8 48,2 48,2 5 YuYu 47,0 208,2 255,2 85,6 3,6 003a 50,6 36,6 87,2 72,6 3,3 003b 52,2 40,6 92,8 84,3 1,8
a Normalização em função do sinal obtido com a sonda de actina 2 b Determinada por RT-PCR em tempo real.
4.7 Abundância de transcritos de genes potencialmente envolvidos na resistência a BZ
em cepas de T. cruzi
Na literatura, alguns genes foram associados ao fenótipo de resistência a drogas em T.
cruzi. Dentre eles destaca-se o gene que codifica uma nitroredutase (NTR) (GenBank número
XP_810645) mitocondrial de tipo I, dependente de NADH (WILKINSON et al., 2008). Esta
enzima atua ativando pró-drogas nitroheterocíclicas como NFX e BZ, para que exerçam sua
ação tripanocida. A perda de uma única cópia deste gene, seja por pressão seletiva com NFX,
seja por deleção dirigida (knock out) promove uma resistência significativa a vários
nitroderivados.
Ainda em parasitos com resistência a BZ induzida in vitro, foi descrito que a deleção
do gene que codifica a old yellow enzyme (TcOYE) (GenBank número U31282), uma
NAD(P)H flavina oxidoredutase, está relacionada ao fenótipo de resistência (MURTA et al.,
2006).
Por outro lado, ao contrário dos resultados apresentados nesta tese, que sugerem o
envolvimento de um transportador ABC na resistência natural de T. cruzi a BZ, dados
publicados anteriormente mostram que a super-expressão ou amplificação gênica de dois
transportadores ABC, denominados TcPgp1 e TcPgp2, não está relacionada com o fenótipo de
resistência a esta droga (MURTA et al., 2001).
Desta forma, decidimos investigar a abundância relativa de transcritos da NTR,
TcOYE, TcPgp1 e TcPgp2 em algumas cepas de T. cruzi que apresentam resistência natural a
BZ. Além disto, uma vez que nos experimentos de microarranjos havíamos verificado a
super-expressão de três transportadores ABC na cepa VL10 em relação à cepa 115 (ver
Tabela 9), investigamos ainda a abundância de transcritos de outro transportador ABC,
denominado ABC* (GenBank XP_819234), que apresentou uma razão de hibridização
88
VL10/115 de 2,9. Este transportador apresenta os domínios conservados típicos da família
ABC (Figura 29). A estrutura e características dos transportadores ABC e ABC* será
discutida adiante.
MTLAAELFAKIEAAKVASRVLLFSLAVMLFHGIYQRMRSHQESTHPRRLVRRLSEPRKRPGVHFDRTLLRRIIELLRVCFPRIVSAESGLVLLLTSLLMLRTTLTLTFSQISASNTKALMQKNFRHFIFGLLDVAVYAIPATITGVGINYATATLEQCFRGNLQNALHQEYFEGCKMYDLAIKGLVDNPAHRVTHDVQRFCSELSGLFPAVIKPILDIAIFSSALAGFGGYGVPLVMMLYYAFVALMFRMLLPNFAGWVARSREKEGNLRLLHTQLIQHAEEVAFYRGAEIEGENAERLLESFICVERRLKRAKWWSTFINGILVKYAATGVGYAVCAVVVAREKGRLDAAALTQVFVRCTQLYIPLSLAMGRLLSLHLKVSSLCSSAHRVGELRDVLSAMEGVDQGALSKIVEIPNGDEIVFRDVVIVSPSDQIVLLDYTATFKAGRHLLIMGCNGAGKTALLRTLCGLWPLRSGTVERPAMPELMFLTQRTYLPPGTLRTQLIYPAVEGEEQARRMPDEMLLQLAAEVGLNGVVEREGGLDAEKEWGEVFSGGERQRISIVRAMCHCPTFVFLDECTSAISQDVEPALYELLQLRGVTLVTVSHREALKALHHETLILDGMGGYNMSVLGDSQ
Figura 29 - Seqüência protéica do transportador ABC* de T. cruzi (GenBank XP_819234). Em retângulos estão indicados os domínios conservados característicos de proteínas ABC.
A abundância dos transcritos foi determinada por RT-PCR em tempo real com os
pares de iniciadores descritos na tabela 1 de Material e Métodos, utilizando cDNA das cepas
CL Brener, 115 (sensível) e VL10 (resistente) e dos isolados dos pacientes 003 e 050 obtidos
antes e após tratamento com BZ. A cepa CL Brener foi utilizada como referência (Figura 30).
---- Walker A ---- Walker B ---- ABC signature
89
1,4
1,1
2,8
1,9
2,72,6
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
VL10 115 003a 003b 050a 050b
1,21,3
1,41,5
0,5
1,1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
VL10 115 003a 003b 050a 050b
2,7
1
1,7
2
1,3
1,1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
VL10 115 003a 003b 050a 050b
3,8
1,7
5,4
17
1,1
5,9
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
VL10 115 003a 003b 050a 050b
0,5
1
1,5
0,80,7
1,4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
VL10 115 003a 003b 050a 050b
Figura 30 – Abundância relativa de transcritos dos genes indicados em cada painel nas cepas VL10 e
115 e nos isolados dos pacientes 003 e 050 obtidos antes (003a, 050a) e após (003b, 050b) tratamento com BZ. Ao nível de transcritos da cepa CL Brener foi atribuído o valor unitário. As barras pretas indicam cepas resistentes, e as barras brancas, cepas suscetíveis.
Para a análise dos dados, atribuímos arbitrariamente a cada par de cepas o fenótipo de
suscetível ou resistente. Conforme descrito anteriormente (WILKINSON et al., 2008)
esperaríamos uma menor abundância de transcritos de NTR em cepas resistentes, em relação
às sensíveis. A análise da figura 30A mostra resultados inversos para os pares VL10/115 e
003a/003b. No par 050a/050b o nível de transcritos de NTR é praticamente o mesmo. Para as
cópias do gene de TcOYE, foi proposto que sua deleção está associada também ao fenótipo de
resistência induzida a BZ. Nossos dados (Figura 30B) sugerem igual abundância relativa de
transcritos deste gene nos pares VL10/115 e 003a/003b, e uma abundância cerca de duas
Exp
ress
ão r
elat
iva
do tr
ansc
rito
Exp
ress
ão r
elat
iva
do tr
ansc
rito
A- NTR B- TcOYE
Exp
ress
ão r
elat
iva
do tr
ansc
rito
C- TcPgp1
Exp
ress
ão r
elat
iva
do tr
ansc
rito
D- TcPgp2
Exp
ress
ão r
elat
iva
do tr
ansc
rito
E- ABC*
90
vezes maior de transcritos de TcOYE na cepa 050b (mais resistente) em relação a seu par
050a. Para os transportadores ABC denominados TcPgp1 e TcPgp2 também não notamos
uma correlação entre a abundância de seus transcritos e o fenótipo de suscetibilidade a BZ
(Figura 30C e 30D). Chama a atenção a abundância relativa de transcritos de TcPgp2 no
isolado 003b (Figura 30D).
Finalmente, a abundância relativa de transcritos do gene ABC* (Figura 30E) nos
isolados dos pacientes 003 e 050 é cerca de duas vezes maior nos isolados resistentes a BZ
(003a e 050b) em relação a seus pares suscetíveis (003b e 050a). Por outro lado, no par
VL10/115 o nível de transcritos de ABC* é 2 vezes maior na cepa suscetível (115).
91
5 DISCUSSÃO
5.1 Suscetibilidade a BZ em cepas de T. cruzi e isolados humanos
A resistência a quimioterápicos é um problema sério verificado em várias doenças
como por exemplo doenças infecciosas causadas por diversos agentes e câncer. Tal resistência
pode surgir por diferentes mecanismos que podem afetar a droga - tais como, diminuição na
sua concentração intracelular, em seu processo de ativação ou aumento em sua detoxificação;
ou o alvo da droga – como, mutação ou amplificação do alvo molecular (OUELLETTE,
2001). A resistência natural de populações de T. cruzi aos nitroderivados BZ e NF é descrita
como um fator importante que poderia explicar falhas terapêuticas em humanos e modelos
experimentais (GONTIJO, 1999; CAMPOS, 2005). Apesar de estes dois compostos serem
utilizados há décadas no tratamento da doença de Chagas, a natureza bioquímica dos
elementos envolvidos em sua resistência permanece desconhecida.
No presente trabalho, abordamos esse tema utilizando microarranjos de DNA para
comparar a expressão diferencial de grande número de genes em cepas do parasito suscetíveis
e naturalmente resistentes a BZ. Para esta finalidade, inicialmente, desenvolvemos um ensaio
para quantificar a suscetibilidade a esta droga. Os estágios epimastigota, tripomastigota e
amastigota de T. cruzi foram utilizados por diferentes autores para a varredura de drogas in
vitro (SCHLEMPER; CHIARI e BRENER, 1977* apud CROFT,1986; MCCABE;
REMINGTON e ARAUJO†, 1984 apud CROFT,1986; DOCAMPO e MORENO, 1986;
NEAL e VAN BUEREN,1988).
O modelo de amastigotas intracelulares parece ser o mais consistente para avaliar a
atividade de quimioterápicos. De fato, cetoconazol mostrou ser mais ativo contra formas
intracelulares em relação a epimastigotas. Por outro lado, tripacidina e primaquina foram
ativas contra epimastigotas e tripomastigotas e ineficazes contra amastigotas. Recentemente,
foi observado que heteroalil-5-nitrofuranos, drogas ativas na indução de estresse oxidativo e
inibição da síntese de esteróis, apresentam CI50s semelhantes para epimastigotas e amastigotas
intracelulares (GERPE et al., 2008). No nosso caso, optamos por utilizar formas
* SCHLEMPER, B.R. JR; CHIARI, E; BRENER, Z. Growth-inhibition drug test with Trypanosoma cruzi culture forms. J. Protozool., v. 24, p. 544-547, 1977. † MCCABE, R.E.; REMINGTON, J.S.; ARAUJO, F.G. Ketoconazole inhibition of intracellular multiplication of Trypanosoma cruzi and protection of mice against lethal infection with the organism. J. Infect. Dis., v. 150, p. 594-601, 1984.
92
epimastigotas tendo em vista serem o estágio predominante em hemoculturas derivadas de
indivíduos infectados. De fato, tínhamos em mente desenvolver um ensaio relativamente
rápido que medisse a sensibilidade a BZ da cepa infectante, para servir de subsídio ao clínico
envolvido no tratamento de pacientes. Deve ser lembrado que a diferenciação de
epimastigotas (da hemocultura) em tripomastigotas metacíclicos, que seriam utilizados para
estabelecer a infecção de monocamadas, visando obter amastigotas intracelulares para realizar
os testes de suscetibilidade a BZ, é um processo muito demorado. Nesse processo poderia
ocorrer a seleção de sub-populações do parasito, que não refletiriam a real composição da
população infectante.
Utilizando o ensaio por nós padronizado em 12 cepas de laboratório, verificamos que a
CI50 para BZ variou de 7,6 ± 3,6 a 127,6 ± 0,07 µM. Valores desta ordem de magnitude foram
descritos na literatura (NEAL e VAN BUEREN, 1988). A suscetibilidade a BZ de cinco
destas cepas havia sido determinada previamente em modelos experimentais, determinando a
sua classificação em cepas resistentes, parcialmente suscetíveis e suscetíveis de acordo com as
taxas de cura observadas (FILARDI e BRENER, 1987). Para quatro das cepas analisadas
observamos uma concordância entre os valores de CI50 aqui determinados e a porcentagem de
cura em camundongos infectados e tratados. Desta forma adotamos a classificação de Filardi
e Brener (1987) para definir cepas suscetíveis e resistenctes a BZ.
Alguns autores descreveram que cepas silvestres (grupo T. cruzi I) eram mais
resistentes a BZ do que cepas do ciclo doméstico (TOLEDO et al., 2003). Nós não
verificamos nenhuma correlação entre os valores de CI50 e a divisão filogenética das cepas,
corroborando conclusões de outros autores (VILLARREAL et al., 2004).
De posse do ensaio, investigamos a hipótese de a falha terapêutica do BZ em humanos
estar relacionada com os diferentes graus de suscetibilidade das cepas infectantes.
Concluímos que os valores de CI50 de isolados pré-tratamento, obtidos de três pacientes
putativamente curados e de quatro indivíduos não curados, não são preditores do sucesso
terapêutico. Estes valores variaram de 15,6 ± 3 a 51,4 ± 1 µM, estando próximos da
concentração de BZ no plasma de humanos submetidos a tratamento (50 µM)
(RAAFLAUB,1980).
Nos pacientes não curados comparamos a suscetibilidade a BZ dos isolados obtidos
antes e após tratamento. Para um paciente, verificamos conservação da CI50; para outro
paciente verificamos que a população pós-tratamento apresentou um aumento de cerca duas
vezes na suscetibilidade à droga; para um terceiro paciente, surpreendentemente, observamos
uma diminuição de cerca três vezes na suscetibilidade a BZ. O aumento da CI50 poderia ser
93
explicado pela seleção natural de sub-populações mais resistentes, originalmente presentes na
população infectante. Alternativamente, o aumento da resistência a BZ poderia ser resultante
da pressão da droga administrada durante 60 dias. A favor da primeira hipótese foi descrito
um aumento de resistência a BZ em isolados de T. cruzi recuperados de cães infectados por
longo tempo e não tratados (VELOSO et al., 2001). A favor da segunda hipótese foi mostrado
que cepas resistentes a BZ e NF foram obtidas in vitro utilizando concentrações de droga na
faixa de 10 a 200 µM (NIRDÉ; LARROQUE; BARNABÉ, 1995; VILLARREAL et al.,
2005; WILKINSON et al., 2008), e que parasitos resistentes mantiveram este fenótipo in vitro
durante seis meses sem pressão de droga (NIRDÉ; LARROQUE e BARNABÉ, 1995).
A observação em um paciente de que parasitos pós-tratamento apresentaram aumento
de suscetibilidade a BZ é intrigante. Poderia se pensar que esta sub-população estivesse
presente na cepa original e que, por algum motivo desconhecido, não fosse atingida pela
droga. Coincidentemente, em camundongos infectados com uma mistura de cepas suscetíveis
e resistentes a BZ, a cepa recuperada após tratamento foi a mais suscetível (MARTINS et al.,
2007). Os autores não apresentam explicações para este aparente processo de seleção. No
manuscrito anexo, mostra-se a análise do perfil de microsatélites (realizada pela Dra. Andréa
M. Macedo e colaboradores no ICB-UFMG), para avaliar possíveis eventos de seleção de
sub-populações durante o tratamento dos pacientes. Concluímos que as populações antes e
após tratamento são as mesmas.
Uma vez que a CI50 para BZ não permite predizer a eficácia do tratamento, outros
fatores devem estar envolvidos. Dentre eles, poderiam ser incluídas diferenças na
farmacocinética da droga. Lamentavelmente, este aspecto foi abordado num único estudo
endereçado para apenas oito pacientes, não sendo observadas diferenças significativas na
farmacocinética do BZ (RAAFLAUB, 1980). Este tema certamente merece maior
investigação. Outro fator poderia ser a carga parasitária do indivíduo, cuja quantificação é
bastante difícil em função da possibilidade de haver parasitemia intermitente.
Em algumas doenças parasitárias foi demonstrado que a condição imunológica do
paciente afeta a eficácia do tratamento. Apesar de estar bem estabelecido o papel da resposta
imune na patogênese da doença de Chagas, poucos estudos descreveram o impacto do
tratamento com BZ nesta resposta. Em modelos experimentais foi demonstrado que a
administração simultânea de uma dose sub-ótima de BZ e IL-12 recombinante aumenta a
eficácia do tratamento, reduzindo a parasitemia e prolongando a sobrevivência
(MICHAILOWSKY et al., 1998). Coincidentemente, foi verificado que cepas resistentes à
droga induzem fracamente a produção de IL-12 tanto in vivo quanto in vitro
94
(MICHAILOWSKY et al., 1998). Essas observações sugerem que a ativação precoce do
compartimento celular do sistema immune por IL-12 pode favorecer a atividade tripanocida
de BZ in vivo. Também foi mostrado, seja em humanos como em modelos experimentais, que
o eixo IL-12/interferon (IFN)-γ do sistema imune desempenha um papel importante na cura
parasitológica promovida por quimioterápicos (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; ROMANHA
et al., 2002). Assim, a maior a capacidade do hospedeiro de produzir IFN-γ poderia estar
associada à maior eficácia terapêutica durante a fase aguda da doença de Chagas (BAHIA-
OLIVEIRA et al., 2000). Foi descrito ainda que o tratamento precoce de pacientes com a
forma indeterminada com BZ modificou a expressão de citocinas de células envolvidas na
resposta imune inata e adaptativa, com um viés para um perfil inflamatório tipo T1
(SATHLER-AVELAR et al., 2006; SATHLER-AVELAR et al., 2008). Em modelos
experimentais em fase crônica submetidos a tratamento foi documentado o desenvolvimento
de uma memória celular T CD8+, independente de antígeno parasitário, que é estável e
protetora (BUSTAMANTE; BIXBY; TARLETON, 2008). O conjunto de observações sugere
que BZ além de ter uma ação direta na eliminação do parasito atuaria afetando a regulação do
sistema imune do hospedeiro. Desta forma, é possível que o tratamento com a droga induza
mudanças seletivas na resposta imune do paciente, que variam de indivíduo para indivíduo e
da fase (aguda ou crônica) em que ela é administrada.
Em resumo, nossos resultados indicam que a suscetibilidade a BZ da cepa infectante
não permite prever o sucesso do tratamento. Estudos voltados para a análise do estado
imunológico pré e pós-tratamento são importantes no desenvolvimento racional de novas
drogas para o tratamento da doença de Chagas.
5.2 Estrutura e qualidade da lâmina de microarranjos de DNA
Em 2004, Cássio Baptista, em nosso laboratório, construiu lâminas de microarranjos
contendo ESTs da forma epimastigota da cepa CL Brener (BAPTISTA et al., 2004) e validou
esta tecnologia para o estudo de genômica comparativa e de expressão diferencial de genes
em T. cruzi. Em nosso projeto, iniciado em 2003, construímos uma nova versão de lâmina,
incluindo ESTs da forma amastigota, tendo em vista este estágio ser encontrado no mamífero.
Desta forma, em nossa lâmina 56% das seqüências são da forma amastigota e 44% da forma
epimastigota. Para evitar redundância, as ESTs foram submetidas a um processo de
agrupamento pelo CAP3. O conjunto de seqüências aplicadas representa cerca 10% do
genoma de T. cruzi, considerando os dados obtidos pelo seqüenciamento do genoma desse
95
parasito (EL-SAYED et al., 2005). A análise funcional das ESTs imobilizadas indica que
55% representam proteínas hipotéticas, algumas possivelmente T. cruzi específicas. O
segundo grupo mais abundante é constituído por proteínas relacionadas com processos de
tradução, estrutura ribossomal e biogênese, o que reflete a ativa síntese protéica das formas
evolutivas representadas na lâmina. O teste para verificar a qualidade da lâmina mostra que a
grande maioria das sondas e as suas réplicas hibridizam de forma comparável, concluindo-se
que a lâmina pode ser usada para a análise da expressão diferencial de genes.
5.3 Expressão diferencial de genes em cepas suscetíveis e resistentes a BZ
Na primeira abordagem, comparamos a transcrição diferencial de genes em três cepas
suscetíveis e três cepas resistentes a BZ. A análise dos resultados foi direcionada para
identificar genes que apresentam aumento ou diminuição de expressão em todas as cepas
suscetíveis em relação a todas as cepas resistentes. Nessa análise, utilizamos o teste estatístico
Bayboots (VÊNCIO et al., 2006), que foi empregado na análise de resultados de SAGE de
tumor de cérebro (VÊNCIO et al., 2004) e na análise da expressão diferencial de genes em
cepas de cardíacos e de assintomáticos (BAPTISTA et al., 2006). No teste Bayboots, o valor
de corte para o Erro de Classificação de Bayes (DUDA; HART; STORK, 2000) é de E=0,05.
Com esse valor de corte, nenhum gene foi identificado. Diminuindo a exigência para 0,07,
identificamos três genes candidatos, os quais codificam a proteína ribossomal L6, a amastina
e uma proteína hipotética. No entanto, ao validarmos o nível de transcritos desses genes em
cepas suscetíveis e resistentes a BZ, observamos variações individuais que não se
correlacionam com os fenótipos. Por outro lado, esses dados indicam que o teste Bayboots é
eficiente na identificação de genes diferencialmente expressos entre duas classes de
populações e que o valor de corte de 0,05 deve ser respeitado (VÊNCIO et al., 2006).
Em 2006, após publicação do genoma de T. cruzi, o TIGR preparou lâminas de
microarranjo contendo oligonucleotídeos representantes de ORFs da quase totalidade dos
genes desse parasito. De posse dessa lâmina, analisamos a expressão diferencial de genes
entre o par de cepas VL10 (resistente) e 115 (sensível). Grande número de genes mostrou ser
super-expresso em uma ou outra cepa, sendo majoritariamente representados genes que
codificam proteínas hipotéticas conservadas e proteínas hipotéticas (possivelmente T. cruzi-
específicas). Também foram diferencialmente expressos genes das superfamílias da trans-
sialidase, DGF, GP63, dentre outras.
96
Dentre os genes super-expressos em VL10, treze codificam putativas calpaínas, que
correspondem a cisteíno-proteases dependentes de cálcio, reguladas in vivo pelas
calpastatinas. Defeitos nessa regulação estão associados a várias patologias humanas,
incluindo distrofia muscular, câncer, doença de Alzheimer, injúria neurológica, diabetes e
formação de catarata. Na última década, as calpaínas foram implicadas em processos de
resistência a quimioterápicos (OHKAWA et al., 1999; MŁYNARCZUK-BIAŁY et al., 2006).
As calpaínas típicas possuem quatro domínios: o domínio I de aproximadamente 20
aminoácidos, cuja função é desconhecida; o domínio II que corresponde ao sítio catalítico da
enzima; o domínio III que funciona como ponte de ligação e de transmissão de sinal entre o
domínio II e o domínio IV, o qual possui estruturas em alfa hélice (EF-hand), responsáveis
pela ligação de cálcio (SORIMACHI; ISHIURA; SUZUKI, 1997). Em tripanossomatídeos as
calpaínas são atípicas (calpaínas-símile), pois possuem apenas o domínio I e o domínio II,
sendo que o primeiro domínio tem um tamanho de aproximadamente 100 aminoácidos, muito
maior que o das calpaínas típicas (ERSFELD et al., 2005). Além disso, nesses organismos
também foi encontrada uma classe de proteínas denominada Small kinetoplastid calpain-
related proteins (SKCRPs) que apresenta apenas o domínio 1 das calpaínas. Curiosamente, os
tripanossomatídeos possuem um número de genes para calpaínas (calpaínas-símile e SKCRPs)
muito superior ao de outros organismos, sugerindo que essas proteínas desempenhem papel
importante (ERSFELD et al., 2005).
Em T. brucei, a calpaína CAP5.5, associada ao citoesqueleto, teria a função potencial
de comunicação entre a membrana plasmática e o citoesqueleto (HERTZ-FOWLER et al.,
2001). Em L. amazonensis, a proteína META1 está localizada na membrana celular e
apresenta uma porção C-terminal similar às calpaínas-símile de Trypanosoma (RAMOS et al.,
2004). A super-expressão dessa proteína aumenta a virulência em camundongos (ULIANA et
al., 1999) e sua inibição promove distúrbios celulares e morte dos parasitos (D’AVILA-
LEVY et al., 2006). Em L. donovani foi observado que a SKCRP14.1 modula a morte celular
programada induzida por miltefosina e promove a morte celular programada induzida por
antimoniais (VERGNES et al., 2007). O conjunto de dados aponta as calpaínas como sendo
elementos importantes numa série de funções nos Kinetoplastida. Por outro lado, em T. cruzi
a função das calpaínas não foi avaliada. Ao analisar a abundância de transcritos de dois genes
que codificam putativas calpaínas-símile em algumas cepas de T. cruzi, observamos que a
abundância de transcritos do gene da calpaína-símile 8 é sempre maior que a do gene da
calpaína-símile 3. A função dessa classe de proteínas em T. cruzi certamente merece estudos
posteriores.
97
Os dados das hibridizações com os microarranjos indicaram super-expressão dos
genes da tripanotiona sintetase e da triparedoxina peroxidase na cepa VL10 (resistente). Os
tripanossomatídeos possuem um metabolismo de tiol único, onde o sistema
glutationa/glutationa redutase, presente em outras células, é substituído pelo sistema
tripanotiona/tripanotiona redutase (KRAUTH-SIEGEL et al., 2003; SCHLECKER et al.,
2005). Esse, em conjunto com a triparedoxina e a triparedoxina peroxidase constitui o sistema
da tripanotiona peroxidase (LOPEZ et al., 2000) que atua em vias de detoxificação e resposta
ao estresse oxidativo (FAIRLAMB et al., 1992). Nos ensaios de RT-PCR em tempo real foi
confirmada apenas a maior abundância de transcritos da tripanotiona sintetase em VL10. Por
outro lado, esse gene não foi super-expresso em outras cepas resistentes a BZ.
Para o metabolismo de O2•–, os tripanossomatídeos expressam superóxido dismutases,
metalo-proteínas que funcionam removendo o excesso de O2•– para formar H2O2 e O2. Nesses
organismos apenas Fe-SOD são observadas (LE TRANT et al., 1983), representadas em
quatro isoformas: FeSOD-A e FeSOD-C, de localização mitocondrial, FeSOD-B1, localizada
no glicossomo e FeSOD-B2, no glicossomo e citossol (WILKINSON et al., 2006). Para
FeSOD-A dois transcritos diferentes foram observados em T. cruzi (FeSOD-A1 e Fe-SOD-A2)
(NOGUEIRA et al., 2006). Em cepas com resistência induzida a xenobióticos foi relatado um
aumento nos transcritos de FeSOD-A, com conseqüente aumento nos níveis de proteína e
atividade enzimática (NOGUEIRA et al., 2006). Os autores explicam este resultado sugerindo
que paralelamente à super-expressão desta FeSOD-A existiria a ativação de mecanismos que
estariam agindo para eliminar o acúmulo de H2O2. Por outro lado, Temperton et al. (1998),
em parasitos transfectados com um gene que codifica uma SOD, verificaram aumento de
sensibilidade a BZ e violeta de genciana. Os dados de microarranjo indicaram super-
expressão de Fe-SOD-A1 e Fe-SOD-A2 de localização mitocondrial na cepa 115 (sensível a
BZ). Foi confirmada a maior abundância de transcritos apenas para a Fe-SOD-A2.
Na cepa VL10 foi confirmada a maior abundância de transcritos de dois
transportadores de membrana - ABC e MatE - pertencentes a famílias distintas, cujos
membros estariam relacionados com o transporte de xenobióticos em outros organismos.
Nenhum membro das duas famílias foi associado anteriormente ao fenótipo de resistência a
BZ ou NFX em T. cruzi. A extrusão de drogas para o meio externo é um dos mecanismos de
defesa mais bem conservado em todos os organismos e é responsável, em muitos casos, pela
resistência ao tratamento com quimioterápicos como, por exemplo, em vários tipos de câncer.
Apenas o gene que codifica o transportador ABC foi validado como separador de
grupos fenotípicos com um número considerável de cepas suscetíveis e resistentes a BZ,
98
sendo os transcritos deste gene mais abundante nas cepas resistentes. Os primeiros
transportadores da família ABC descritos em T. cruzi foram o Tcpgp1 e Tcpgp2
(DALLAGIOVANA et al., 2004, 2006). No entanto, sua super-expressão ou amplificação
gênica não mostrou correlação com o fenótipo de resistência a BZ (MURTA et al., 2001).
No presente estudo, concluímos que a abundância de transcritos de um membro da
classe de transportadores ABC é maior em cepas naturalmente resistentes a BZ.
5.4 O transportador ABC
A super-família de transportadores de membrana ABC é constituída por sete sub-
famílias, cujos membros apresentam os domínios conservados (Walker A, Walker B e ABC
signature), característicos deste grupo de proteínas. As sub-famílias se diferenciam quanto ao
número e arranjo dos domínios transmembrana (TMD) e domínios de ligação a ATP (NDB)
(VAN VEEN e KONINGS, 1997). A figura 31 mostra de forma esquemática a organização
topológica dos domínios TMD e NDB nas sub-famílias.
Figura 31 – Modelo esquemático da topologia dos domínios transmembrana (TMD) e domínios de
ligação a ATP (NDB) das sub-famílias dos transportadores ABC. (A) sub-famílias ABCA e ABCB; (B) sub-família ABCC; (C) sub-famílias ABCE e ABCF; (D) sub-
C D
MC
MC
EEC
MC
EIC
EEC
EEC
EIC
EIC EIC
A B
99
famílias ABCD e ABCG. MC = membrana celular, EEC = espaço extracelular, EIC = espaço intracelular. Extraído e modificado de Zhang JT, 2007.
Ao fazer a busca dos domínios conservados (Banco Prosite) nas proteínas Tcpgp1 e
Tcpgp2 (DALLAGIOVANA et al., 2004) pudemos constatar que Tcpgp1 não apresenta o
motivo WalkerB, mas sim o motivo WalkerA e a seqüência ABC signature. Esta proteína não
tem o domínio transmembrana. Desta forma, sua localização seria citoplasmática e este
transportador poderia ser membro das sub-famílias ABCE ou ABCF (Figura 31, painel C).
Nenhuma função de transporte foi atribuída a membros dessas sub-famílias. Por outro lado, o
transportador Tcpgp2 é um transportador típico com dois domínios citoplasmáticos de ligação
de ATP e dois domínios transmembrana. Por busca de similaridade por BLASTX verificamos
que este transportador pertence à sub-famílias ABCA (dados não mostrado) (Figura 31, painel
A). Membros desse grupo também não estão relacionados com o transporte de drogas. No
entanto Tcpgp2 poderia estar relacionado ao transporte e tráfego intracelular. O envolvimento
do gene ABCA (sub-famíla A) em T. cruzi no tráfego vesicular intracelular foi constatado
(TORRES et al., 2004).
O transportador ABC (XP_818614) que identificamos como separador dos dois grupos
fenotípicos de cepas é constituído por uma seqüência de 665 aminoácidos e apresenta uma
massa molecular estimada de 72,4 kDa. Observamos que esse transportador apresenta um
único domínio de ligação a ATP e um domínio transmembrana composto de seis α-hélices
(Tabela 18 e Figura 32). Concluímos tratar-se de um “meio transportador” ABC das sub-
famílias ABCD ou ABCG (Figura 31, painel D).
Tabela 18 - Segmentos de aminoácidos que correspondem às hélices transmembrana do transportador ABC. As hélices foram determinadas pelo sistema SOSUI da Universidade de Nagoya (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/cgi-bin/adv_sosui.cgi)
No da hélice transmembrana
N-terminal
Sequência da região transmembrana C-terminal
Tamanho da hélice
1 404 FSHFIQAAFFAVIVGLIFLNVKD 426 23 2 463 LYVREQMVGSYSPFIFFLSKTLV 485 23 3 487 FPMRVFFAFLECCILYWMVGLY 508 22 4 514 FFYYFAVIALLTEVASGLGFAIG 536 23 5 544 VASGTAPVILLPLAMVGGLLANT 566 23 6 637 VLWLTLALLYIAFRGWAVISLYS 659 23
100
MSCCRAEVNEPVTPSSASSLESDDQIAPKQKGNEPQIEDYSIIAPGFSIKGSVAQFDAVEQNKSSVSGRFSIPVSWHNLSYSANGTKILCGLTGTALPSRCLAVMGSSGAGKTTFLNAISDRLTTSRTLKLTGKRQLGDLEYKRHYRRMVGFVAQDDILSPRATPEDSLRFSLRVRRGTSISETNKFVEETLEELRLVHCRETIVGIPGLVSGLSGGERKRTSIGVELICDPKILLLDEPTSGLDSVTSVKIVHLLNNIARTGRTVIYTIHQPTAETLTYFDDLMLLTGGRCAYHGTMAKSVEYFESIGFPCPERYTPSDFFMKLLQDPEISKVLVKKWKSYLKHGVRTPHTTAVELNPNPSESPTAKNIESYLGRFGSTSCIQFQELFRRFSMDLSRNHVYIFSHFIQAAFFAVIVGLIFLNVKDDLAGMQDREGVFFMVTMNRAMGQTFIMVNSFMQDKALYVREQMVGSYSPFIFFLSKTLVEFPMRVFFAFLECCILYWMVGLYRQAGAFFYYFAVIALLTEVASGLGFAIGATFKSLVVASGTAPVILLPLAMVGGLLANTDRLHPYWYWLEKPSFIRQAYILLARNEFKHIDHIRCDGRGKPPGFCKDKPQNGEDILRQLGFQQKQYENWVLWLTLALLYIAFRGWAVISLYSAARTKF Figura 32 – Seqüência de aminoácidos do transportador de membrana ABC (XP_818614). As
seqüências em cores representam as hélices do domínio transmembrana (TMD) (ver Tabela 18).
Uma busca de homologia com o programa BLASTX mostrou elevada similaridade do
transportador ABC com transportadores da sub-família G de outros Kinetoplastida (Tabela
19). Por esse motivo, passamos a denominar esse transportador TcABCG1 pois seria o
primeiro transportador membro da sub-família G descrito em T. cruzi .
Tabela 19 – Similaridade por BLASTX do transportador TcABCG1.
Membros da sub-família ABCG estão envolvidos em processos de quimiorresistência
em eucariotos superiores e inferiores. Dentro dessa sub-família o mais conhecido é o
transportador ABCG2 humano, chamado também de ABCP (placenta specific ABC), BCRP
(breast cancer resistance protein) ou MXR (mitoxantrona resistance protein). Esse
transportador confere às células tumorais uma significativa resistência a fármacos diferentes
como mitoxantrona, topotecan, daunorubicina, doxorubicina, metotrexato, entre outros (ROSS
et al,, 1999; DOYLE et al., 1999; SCHEFFER et al., 2000). Encontramos 29% de
Similaridade Organismo GenBank Score (Bits) E-value Sub-família
Transportador ABC, putativo
T. cruzi XP_806666.1 1311 0,0 G
Transportador ABC, putativo
L. major XP_001680778.1 760 0,0 G
Transportador ABC L. infantum XP_001463092.1 758 0,0 G Transportador ABC,
putativo L. major XP_001680777.1 753 0,0 G
Transportador ABC L. infantum XP_001463091.1 747 0,0 G Transportador ABC,
putativo L. brasiliensis XP_001561945.1 736 0,0 G
Transportador ABC, putativo
L. brasiliensis XP_001561938.1 734 0,0 G
Transportador ABC T. brucei XP_823004.1 713 0,0 G
---- Walker A ---- Walker B ---- ABC signature ---- Sítio de ligação da fosfopanteteína
101
similaridade da seqüência do gene TcABCG1 e o gene ABCG2 humano. Em Leishmania, a
super-expressão dos transportadores ABCG4 e ABCG6 confere resistência a fármacos
hidrofóbicos como miltefosina, edelfosina e perifosina (CASTANYS-MUÑOZ et al., 2007;
2008).
Utilizando o banco Prosite, encontramos um sítio conservado de ligação de
fosfopanteteína (TSGLDSVTSVKIVHLL) no transportador TcABCG1. Esse sítio estende-se
do resíduo 241 até 256, na região que corresponde ao NBD, próxima à seqüência Walker B
(Figura 32). A fosfopanteteína é um grupo prostético de proteínas que geralmente fazem parte
de complexos e serve como âncora de lipídeos ou de outras proteínas. A fosfopanteteína se
liga a resíduos de serina (PUGH e WAKIL, 1965)
Os meio-transportadores precisam dimerizar para ser funcionais. Para o transportador
ABCG2 humano, que é um homodímero, foi demonstrada a fosforilação dos meio-
transportadores por uma serina/treonina quinase de 44 kDa, denominada Pim-1L (XIE et al.,
2008). Na seqüência protéica da TcABCG1 identificamos sítios de fosforilação (Tabela 20).
Tabela 20 - Sítios de fosforilação identificados na proteína TcABCG1 pela busca de motivos no
Prosite (http://www.predictprotein.org/get_results.php?req_id=43934#prosite)
Número de sítios de fosforilação
Localização do sítio Quinase
3 NBD Quinase dependente de cAMP e cGMP 15 13 no NBD
2 no TMD Quinase C
10 9 no NBD 1 no TMD
Caseína quinase II
1 NBD Tirosina quinase
A presença de sítios de fosforilação na seqüência protéica de TcABCG1 sugere a
possível ação de quinases que promoveriam a dimerização do meio-transportador.
Coincidentemente, observamos a super-expressão na cepa VL10 de nove proteína quinases
putativas (Tabela 9 em Resultados). Surge a possibilidade de que algum membro desse grupo
fosforile o TcABCG1, ativando-o. Por outro lado, em Leishmania, a transfecção de vetores
contendo apenas os transportadores ABCG4 (CASTANYS-MUÑOZ, et al., 2007) e ABCG6
(CASTANYS-MUÑOZ, et al., 2008) foi suficiente para gerar o fenótipo de resistência a
xenobióticos.
Nos experimentos de microarranjos, envolvendo o par VL10-115, observamos ainda a
super-expressão em VL10 de outro transportador da família ABC (XP_819234), aqui
indicado como ABC*. Esse transportador apresenta os domínios conservados que o
caracterizam como um membro verdadeiro dessa super-família (Figura 29). Com base em
102
análises de similaridade por BLASTX, concluímos que ABC* é membro da sub-família D
que também é constituída por meio-transportadores (Figura 31, painel D), que não foram
relacionados com o transporte de drogas. Passamos a charmar este gene de TcABCD1. Esses
transportadores estariam localizados na membrana do peroxissomo e, provavelmente,
participariam no transporte de ácidos graxos de cadeia longa para o interior da organela
(TANAKA et al., 2002).
A super-expressão de TcABCD1 não foi validada na cepa VL10 por ensaios de RT-
PCR em tempo real. Por outro lado, observamos um paralelismo entre a abundância relativa
de transcritos de TcABCD1 e TcABCG1 nos isolados dos paciente 003 e 050 antes e após
tratamento com BZ (Figura 33).
Essa observação sugeriria uma coordenação na expressão desses meio-transportadores,
que poderia levar a um aumento (isolado 050b) ou diminuição (isolado 003b) da abundância
de transcritos após tratamento com BZ, coincidente com o aumento ou diminuição dos valores
de CI50 (Figura 33). É possível que a pressão da droga durante o tratamento atue regulando a
expressão desses transportadores ABC. Essa hipótese está sendo avaliada por um estudante de
mestrado em nosso laboratório.
1,5
0,80,7
1,4
3,3
1,8
1
3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
003a 003b 050a 050b
TcABCD1
TcABCG1
CI50 31.5 ± 4 10.1 ± 1 24.4 ± 7 55.2 ± 3
Figura 33 – Abundância relativa de transcritos dos genes codificadores de transportadores ABC nos isolados dos pacientes 003 (003a =isolado antes do tratamento, 003b = isolado depois do tratamento) e 050 (050a = isolado antes do tratamento, 050b =isolado depois do tratamento). Abaixo do gráfico indicam-se os valores de CI50 para BZ (µM).
Em células neoplásicas foi comprovado que a resistência a quimioterápicos é um
fenômeno multifatorial, que pode ser adquirido durante o tratamento. Entre os fenômenos
envolvidos no processo de resistência estão a ejeção da droga para fora da célula por
transportadores ABCs, alterações no mecanismo de reparo de DNA e a supressão do processo
Abu
ndân
cia
rela
tiva
de
tran
scri
tos
103
de apoptose tumoral (KUWANO et al., 1999; CALSOU; SALLES, 1993; BARRET e HILL,
1998; REED, 1997; ASHKENAZI e DIXIT; 1998;). Em experimentos preliminares em que
cDNA das cepas VL10 e 115, incubadas por 72 horas com concentrações de BZ
correspondentes ao valor de CI50, foram hibridizados com lâminas de microarranjos,
verificamos a super-expressão de 10,8 vezes na cepa VL10 do gene putativo Mre11, cujo
produto está envolvido no reparo de quebras em DNA dupla fita e manutenção da estrutura do
telômero (IIJIMA et al., 2008) (dados não mostrados). Embora esse resultado não tenha sido
validado por RT-PCR em tempo real, poderia sugerir que mecanismos de reparo de DNA
estariam também sendo acionados com mais eficiência na cepa VL10 do que em 115. De fato,
já foi mostrado que BZ promove degradação de DNA em T. cruzi (GOIJMAN; FRASCH;
STOPPANI, 1985).
Para explorar um pouco essa hipótese, determinamos a CI50 para BZ em formas
epimastigotas da cepa CL Brener transfectadas com genes de T. cruzi que codificam
TcRAD51 (atuante no reparo de quebras de DNA dupla fita nuclear; REGIS-DA-SILVA et
al., 2006) e TcPolK (atuante no reparo do DNA do cinetoplasto; LOPES et al., 2008, no
prelo). Observamos um discreto aumento (cerca de 1,7 vezes) na resistência a BZ nos dois
transfectantes em relação à cepa CL Brener controle (dados não mostrados), sugerindo que
genes de reparo de DNA poderiam também contribuir para o fenótipo de resistência à droga.
Conforme descrito acima, a expressão diferencial dos genes TcOYE e NTR foi
implicada na resistência induzida in vitro a BZ e NFX em T. cruzi (MURTA et al., 2006;
WILKINSON et al., 2008). Analisando pares de cepas naturalmente suscetíveis ou resistentes
a BZ não observamos variação na abundância de transcritos desses dois genes que
explicassem as diferenças de CI50 e concluímos então, que a abundância de transcrito deste
dois genes potencialmente envolvidos em quimioresistencia induzida, não apresentam
correlação com os fenótipos de suscetibilidade ou resistência natural a BZ.
Esses dados reforçam a hipótese de que os fenômenos de resistência natural e
resistência induzida por pressão seletiva sejam mediados por processos diferentes e que o
fenômeno de resistência seja multifatorial onde diferentes componentes podem atuar de forma
independente ou cooperativa. A variabilidade de resposta seria decorrente da heterogeneidade
genética dos isolados de T. cruzi.
Em resumo, nesse trabalho mostramos que a maior abundância de transcritos do gene
TcABCG1 se correlaciona com o fenótipo de resistência natural a BZ em várias cepas do
parasito e que, aparentemente, o nível de transcritos não é resultante do número de cópias
gênicas. Temos claro, no entanto, que em função da regulação da expressão gênica em
104
tripanossomatídeos ocorrer principalmente no nível pós-transcricional será importante
verificar se o nível elevado de transcritos se traduz na abundância do transportador ABC em
questão. Também será interessante verificar se transfectantes que super-expressam o gene
TcABCG1 apresentam aumento de resistência a BZ e a outras drogas. Experimentos nessa
direção estão em andamento no laboratório.
105
6. CONCLUSÕES
6.1 Suscetibilidade de cepas de T. cruzi a BZ
• Foi padronizado um ensaio que quantifica a suscetibilidade de formas epimastigotas
de T. cruzi a BZ.
• As cepas apresentam variações consideráveis de sensibilidade à droga.
• Não existe correlação entre os valores de CI50 a BZ e grupo filogenético ao qual
pertence a cepa.
• O valor de CI50 de isolados obtidos de pacientes submetidos a quimioterapia com BZ
não é preditivo de sucesso terapêutico.
6.2 Expressão diferencial de genes
• A expressão diferencial de genes em cepas de T. cruzi naturalmente resistentes e
suscetíveis a BZ foi analisada utilizando microarranjos de DNA.
• A abundância de transcritos de um gene que codifica um transportador ABC
(TcABCG1) foi maior em cepas naturalmente resistentes a BZ em relação a cepas
sensíveis.
• TcABCG1 apresenta elevada similaridade com proteínas homólogas de Leishmania e
T. brucei.
• Nos isolados de dois pacientes que apresentaram falha terapêutica, a abundância de
transcritos do gene TcABCG1 está diretamente relacionada aos valores de CI50.
• Nas cepas analisadas a abundância de transcritos do gene da calpaína-símile 8 é
sempre maior que a do gene da calpaína-símile 3.
• A abundância de transcritos dos genes TcOYE e NTR, potencialmente envolvidos em
quimiorêsistencia induzida em T. cruzi, não mostrou correlação com os fenótipos de
suscetibilidade ou resistência natural a BZ.
• Os dados sugerem que o transportador TcABCG1 seja um dos componentes
envolvidos na resistência natural a BZ.
106
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ANEXOS
Anexo A - Artigo submetido para publicação
MORENO M .; SILVA MN.; GALVÃO LMC.; D’AVILA DA.; CHIARI.; E .; GONTIJO.; ED.; ZINGALES.; B. Benznidazole Clearance of Trypanosoma cruzi Human Infection does not Correlate with Parasite Drug Susceptibility: A 10-Year Prospective Study. Antimicrob. Agents Chemother, 2008.
Anexo B - Lista de genes super expressos nas cepas VL10 e 115.
Este anexo econtra-se no CD entregue à secretaría da pós-graduação do departamento de
parsitología.
