Mecanismos de VascularizaçãoEstudo em dois modelos

Ana Lúcia Cordeiro

António Figueiredo

Filipa Godinho

Inês Martins

Orientadora: Prof. Doutora Delminda Magalhães

Regente: Prof. Doutora Deolinda Teixeira

23 de Maio, 2005

Introdução

O que são mecanismos de vascularização?

Angiogénese: mecanismo de proliferação de células endoteliais e musculares lisas para formarem novos vasos sanguíneos.

Vasculogénese: origina os vasos de grande calibre “de novo”, no embrião, a partir de percursores mesodermicos conhecidos por angioblastos.

Angiogénese propriamente dita: ocorre após formação de grandes troncos vasculares em que estes últimos se ramificam e se distribuem numa rede vascular complexa. Este processo mantém-se durante toda a vida do indivíduo, dependendo de factores de crescimento vascular.

VEGF

Factor de crescimento vascular endotelial;

Regulador chave da angiogénese fisiológica durante a embriogénese,

crescimento ósseo, funções reprodutivas;

Também está implicado na angiogénese patológica associada a

tumores, desordens neovasculares intraoculares...

Pertence a uma família que inclui PlGF (Factor de crescimento

placentário), VEGF B, C e D;

O gene do VEGF A humano está organizado em oito exões

separados por sete intrões. O splicing alternativo resulta na formação de

quatro isoformas com diferente número de ácidos aminados. Analisou-se o VEGF A porque é o mais bem estudado e o mais importante ao nível do crescimento vascular.

Receptor de VEGF (VEGFR)

Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por dois receptores: VEGFR-1 e VEGFR-2, ambos com acção da cínase da tirosina. Estudou-se o VEGFR-2 porque este é aquele ao qual o VEGF se liga preferencialmente.

Estudou-se o tecido cavernoso do pénis de rato devido às patologias que lhe estão associadas, nomeadamente a disfunção eréctil. A glândula supra-renal foi estudada pois é um tecido muito vascularizado.

Modelos em estudo

Objectivos

Identificar as junções intercelulares de aderência.

Analisar as alterações na expressão e localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso de pénis de rato.

Caracterizar a localização do VEGFR-2 no tecido do corpo cavernoso do pénis de rato.

Relacionar o estudo efectuado com patologias.

Familiarização com técnicas de microscopia e de laboratório.

Métodos

Imunocitoquímica

1º dia

Desparafinar os cortes; Hidratar em concentrações descendentes de etanol em água; Inibição de peroxídase endógena, usando uma solução de metanol; Aquecer 200 ml de tampão citrato no microondas até a ebulição; Adicionar 100 µl de tampão de incubação; Ligação do anticorpo primário ao corte.

2º dia

Ligação do anticorpo secundário ao corte;

Adicionar cerca de 100 µl de solução de estreptavidina-biotina-

peroxidase e incubar durante 30 min;

Adicionar solução de DAB/H2O2 ao corte e incubar durante 7 min;

Corar com hemateína;

Desidratar em etanol de concentrações crescentes e xilol;

Montar em Entellan;

Observar os cortes ao microscópio de luz.

Microscopia electrónica e de luz

Preparação dos cortes: Cortes efectuados no ultramicrótomo, usando uma faca de vidro – Cortes semi-finos e ultra-finos; Os cortes semi-finos foram corados com azur, observados ao microscópio óptico e fotografados; Os cortes ultra-finos foram colocados em grelha de cobre e contrastados com acetato de uranilo e citrato de chumbo, sendo posteriormente observados ao microscópio electrónico e fotografados com revelação dos negativos e passagem a papel por método de rotina do laboratório.

Preparação de blocos de Epon: Fixação; Pós-fixação com tetróxido de ósmio; Desidratação em etanol com concentrações crescentes; Inclusão em Epon.

ResultadosMicroscopia de luz

Imunocitoquímica

Fig.1- Amostra controlo de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 20x.

Fig.2- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato adulto normal, com ampliação total de 20x.

Fig.3- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato idoso (18 meses), com ampliação total de 20x.

Fig.4- Amostra de tecido cavernoso de pénis de rato orquidectomizado, com ampliação total de 20x.

Coloração com Azur

Fig.5- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato, com ampliação total de 20x.

Fig.6- Corte semi-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 40x.

Fig.7- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 20x.

Fig.8- Corte semi-fino de tecido de supra-renal de rato, com ampliação total de 40x.

Microscopia electrónica Tecido cavernoso de pénis de rato

Fig.9- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

Fig.10- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 9400x.

Fig.11- Corte ultra-fino de tecido cavernoso de pénis de rato com ampliação total de 4500x.

Tecido de supra-renal

Fig.12- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 3400x.

Fig.13- Corte ultra-fino de tecido de supra-renal de rato com ampliação total de 5400x.

Conclusões

Foi possível confirmar a localização de VEGFR-2, o qual se encontra

apenas nas células endoteliais, sendo a sua localização e expressão

independentes das condições do animal.

Aquando da observação ao microscópio electrónico, não se conseguiu

identificar junções intercelulares de aderência nas preparações de pénis

de rato, contrariamente ao tecido de supra-renal onde estas estruturas

eram claramente visíveis.

Relativamente às patologias dos tecidos mencionados, não foi possível

retirar conclusões neste sentido.

Bibliografia Soares T. Angiogénese: mecanismos e factores reguladores. RFML

2003; Série III; 8 (5): 319-325.

Bazzoni G, Deyana E. Endothelial Cell-to-Cell Junctions: Molecular

Organization and Role in Vascular Homeostasis. Physiol Rev 84: 869-901,

2004.

Carmeliet P. Mecanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat

Med.2000; 6: 389-95.

Costa C, Soares R, Schmitt F. Angiogenesis: Now and then. APMIS

2004; 112: 00-00.

Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its

receptors. Nat Med. 2003; 9 (6): 669-674.

http://mphywww.tamu.edu/Movies/angio.mpg

Agradecimentos

Professora Doutora Delminda Magalhães

Professor Doutor Henrique de Almeida

Sr. Vitor Hugo Mata

Sr. D. Amélia Sarmento Ferreira

Obrigado pela atenção!