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MELHORAMENTO GENÉTICO DE AGENTES
BIORREMEDIADORES E SEU USO EM
BIORREATORES
Ronaldo BiondoDoutor em Biotecnologia
2009
PESQUISAS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE
MICRORGANISMOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO
DE EFLUENTES DE METAIS PESADOS
PARTE II
Convênio CVRD/CPB-NAP-USP
Coordenadoras: Profª Drª Ana Clara Guerrini Schenberg
Profª Drª Elisabete José Vicente
2009
LINHAS DE PESQUISA:
• DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES BACTERIANOS PARA DETECÇÃO DE METAIS PESADOS.
• DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS BIORREMEDIADORES DE EFLUENTES CONTAMINADOS POR METAIS PESADOS.
Laboratório de Genética de Microrganismos
2007 - 6 bilhões
2025 – 9,1 bilhões
Consumo
74% setor agrícola
20% setor inustrial
6% consumo doméstico
Aumento de
resíduos
Metais pesados
resíduos
CONSTRUÇÃO DO BIOSSENSOR PARA DETECÇÃO DE MERCÚRIO EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
Faixa de detecção: 0,15 µM – 2,5 µM
CONAMA: 0,05 µMVANTAGENS: •Testes rápidos e de baixo custo;
• Fácil análise dos resultados;• Não necessita de substrato.
Aumento da Faixa de Sensibilidade do Biossensor de Mercúrio;
Construção do Biossensor de Chumbo;
Construção do Biossensor de Arsênio.
ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO (2009-2010)
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PARA BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES CONTAMINADOS
POR METAIS PESADOS:
BACTÉRIAS Gram-negativas;
BACTÉRIAS Gram-positivas;
LEVEDURAS
Resistência
Ag+2, Bi+2, Cd+2, Co+2, CrO4-2,
Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2, SeO4
-3, Tl+1 e Zn+2
150 genes
Cupriavidus metallidurans CH34
BACTÉRIAS Gram-negativas
Figura esquemática do plasmídeo pBB-panEGFP.
pan = derivado do promotor do gene mrgA(metal regulated gene A) de Bacillus subtilis com modificações.
Expressão do promotor pan em C. metallidurans CH34
B
Visualização de células de C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP em microscópio de epifluorêscencia com aumento de 1000 vezes.
µM de Cd+2
mg psµM de Co+2
mg psµM de Cu+2
mg psµM de Hg+2
mg psµM de Mn+2
mg psµM de Ni+2
mg psµM de Zn+2
mg psµM de Pb+2
mg ps
C. metalliduransCH34
11,1 4,5 24,29 0,05 4,73 5,84 16,0 17,62
C. metalliduransCH34/pCM2
12,6 5,0 25,72 0,1 5,06 6,46 18,82 25,14
C. metalliduransCH34/pCM2
Induzido
17,6(59%)
5,1(13%)
42,65(76%)
0,05-
6,2 (31%)
8,46(45%)
51,07(219%)
54,75 (210%)
Capacidade de Biossorção de metais
Espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma indutivamente ativado (ICP-MS), realizada no Laboratório de Caracterização Química e Isotópica do IPEN.
Eletromicrografia de transmissão de cortes histológicos de células de C. metallidurans CH34.
A - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQ;
B - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQcontendo Pb+2;
C - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM e incubada com água MilliQe;
D - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada em meio TSM contendo Pb+2 e incubada com água MilliQ contendo Pb+2.
A visualização das células foi realizada com aumento de 46.000 vezes. As setas indicam a presença de agregados do elemento Pb+2 ligados na membrana externa da célula bacteriana.
• 02 - Pedidos de Patentes – INPI
• 02 - Prêmios
Santander de Ciência e Inovação Prêmio ANA/MMA (Biotecnologia) (Agência Nacional de Águas)
• 01 -Menção Honrosa no Congresso do ICB/2008
ETAPAS EM DESENVOLVIMENTO (2009-2010)
• Estabilização Genética das Linhagens recombinantes já construídas;
• Biorreatores;
• Construção de bactérias Gram-positivas remediadoras;
• Construção de Leveduras remediadoras (fase final);
• Construção de linhagens bacterianas que apresentam capacidade de biorremediar íons seletivamente: Ar+2, Pb+2 e Hg+2.
Biorreatores
• Batelada: volumes de operação definidos;
• Contínuo: amplamente utilizados em tratamento de efluentes;
• Batelada Alimentada: produção de produtos biológicos.
Reator de Biodisco Rotativo (RBR)
Problema: Formação de Biofilme
(exopolímeros que encobrem a membrana)
Inviabiliza o Cell surface display daCupriavidus metallidurans recombinante.
1ª Abordagem do Projeto
Processo Contínuo
As células podem ser mantidas em estado fisiológico e crescimento constantes;
Cultivo mais longo que a batelada;
Reatores e equipamentos associados menores, gerando menor custo;
A principal aplicação é no tratamento de efluentes.
2ª Abordagem do Projeto
Escolha do melhor tipo de reator
Vantagens do Air-lift em relação aos reatores agitados:
Agitação mais suave;Melhor transferência de O2;
Mais baratos;Permitem processos contínuos;Homogeneidade;Eficiência de mistura; São empregados em tratamento de efluentes.
Air-liftCSTR
“Continuous Stirred Tank Reactor”
Outros Projetos:
• Construções Genéticas de linhagens microbianas biorremediadoras de poluentes orgânicos.
• Fitorremediação de solos.
A – Na célula portadora do plasmídeo codificante do lócus ParB, ocorre a expressão do RNA-m de hok e do RNA antisenso sok, evitando a expressão da toxina letal Hok; B – Na célula onde o plasmídeo é perdido, ocorre a tradução do RNA-m hok devido à falta da fita antisenso, ocorrendo a expressão da toxina letal.