MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS - repositorio.ul.ptrepositorio.ul.pt/bitstream/10451/34302/1/TM_Leticia_Bastos.pdf · No relatório de estágio é apresentado o local onde decorreram

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

ABORDAGEM GENÉTICA DA DOENÇA DE ALZHEIMER

FAMILIAR: DO DIAGNÓSTICO AO TRATAMENTO

Leticia de Bastos

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera e pelo Dr.

Carlos José Faria Diogo Cortes, e coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

2018





Leticia de Bastos

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera e pelo Dr.

Carlos José Faria Diogo Cortes, e coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.


2018

IX Mestrado em Análises Clínicas

Relatório de Estágio

Leticia de Bastos

3

Prefácio

O presente trabalho é parte integrante do plano de estudos do Curso de Mestrado em

Análises Clínicas pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Este documento é

composto por duas partes fundamentais, que visam alcançar objetivos distintos, mas

interligados.

A primeira é composta pelo relatório de estágio, onde é apresentado todo o trabalho

desenvolvido e os conhecimentos adquiridos, de uma forma sintetizada, nas áreas da

Bioquímica, Hematologia e Microbiologia. O estágio de Bioquímica decorreu no Serviço de

Patologia Clínca do Hospital de Cascais e o estágio das valências de Hematologia e

Microbiologia foram realizadas no Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da

Graça, em Tomar, tendo tido deste modo o privilégio de conhecer a dinâmica de dois Serviços

distintos.

A segunda parte é composta pela dissertação, que foi desenvolvida na área da genética,

com o tema: “Abordagem genética da doença de alzheimer familiar: do diagnóstico ao

tratamento.” A escolha do tema deveu-se ao interesse em aprofundar os conhecimentos

relativamente à doença de Alzheimer, aliada à importância da genética no possível diagnóstico

e tratamento precoce.



4 Leticia de Bastos

Resumo

O presente trabalho é parte integrante do plano de estudos do Mestrado em Análises

Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e constitui um dos principais

elementos da avaliação final. Este documento encontra-se dividido em duas partes

fundamentais. A primeira parte consiste no relatório de estágio e a segunda é constituída pela

dissertação.

No relatório de estágio é apresentado o local onde decorreram os estágios e as atividades

desenvolvidas em cada valência, focando os aspetos mais relevantes no que diz respeito à

experiência desenvolvida e ao enquadramento dos conhecimentos adquiridos no contexto real

de trabalho num Laboratório e da sua aplicação à Clínica.

O estágio foi realizado em Laborotórios de Serviços de Patologia Clínica de dois

hospitais. No Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, decorreu o estágio de Bioquímica, no

período compreendido entre os dias 9 de janeiro e 10 de março de 2017. No Hospital da Nossa

Senhora da Graça, em Tomar, foram realizadas as valências de Hematologia e Microbiologia,

entre os dias 3 de abril e 4 de agosto de 2017.

Na dissertação, é apresentada uma revisão da literatura na qual é desenvolvido o tema:

"Abordagem genética da doença de Alzheimer Familiar: do diagnóstico ao tratamento".

A doença de Alzheimer (DA) de início precoce é a forma rara da doença (5-10% dos

casos diagnosticados), apresentando um padrão de hereditariedade autossómico dominante e

tendo essencialmente origem em mutações nos genes que codificam as presenilinas (PSEN1 e

PSEN2) e a proteína precursora amilóide (APP), que levam ao aumento do péptido Aβ42 e,

consequentemente, à perda de função e morte neuronal.

Atualmente, o diagnóstico definitivo desta patologia é obtido a partir da autópsia dos

tecidos cerebrais, pois os procedimentos de diagnóstico tradicionais da DA assentam

essencialmente na exclusão de outras causas de demência. Contudo, diversas pesquisas estão

centradas na possibilidade do diagnóstico precoce recorrendo a biomarcadores específicos, que

capturam tanto a extensão da patologia quanto os seus efeitos sobre a função cerebral, passando

de uma abordagem de diagnóstico de exclusão para um diagnóstico positivo. Os biomarcadores



Leticia de Bastos

5

encontram-se divididos em duas grandes categorias permitindo uma observação sequencial de

eventos relacionados com os processos fisiopatológicos da doença, sendo fundamentais para

uma possível caracterização da situação clínica do doente.

Relativamente ao tratamento, este é baseado essencialmente na sintomatologia, sendo

usados inibidores da acetilcolinesterase e antagonistas do recetor do N-Metil-D-Aspartato. No

entanto, diversos tratamentos baseados na etiologia encontram-se já em estudo e englobam, não

só a imunoterapia Aβ, mas também inibidores das secretases, da agregação do péptido Aβ, e da

fosforilação e agregação da proteína tau.

No futuro, os micro-RNAs (miRNAs), elementos reguladores da expressão de genes,

constituem biomarcadores promissores para o diagnóstico precoce e as tecnologias baseadas

em RNA de interferência poderão abrir novos caminhos para o tratamento da DA.

Palavras-chave: DA, APP, presenilinas, péptido Aβ, biomarcadores.



6 Leticia de Bastos

Abstract

The present work is an integral part of the study plan of the Masters in Laboratorial

Medicine of the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon and is one of the main

elements of the final evaluation. This document is divided into two fundamental parts. The first

part consists of the internship report and the second part consists of the monograph.

The internship report presents the place where the internships and activities developed

in each valency took place, introducing the most relevant aspects regarding the experience

developed and the framework of the knowledge acquired in the real context of work in a

Laboratory and its application to the Clinic.

The internship was carried out in Clinical Pathology Laboratories of two hospitals. At

the Dr. José de Almeida Hospital in Cascais, the biochemistry course was held from January 9

to March 10, 2017. At the Nossa Senhora da Graça Hospital in Tomar, the Hematology and

Microbiology, areas took place between April 3 and August 4, 2017.

In the monograph, a review of the literature in which the theme "Genetic Approach of

Familial Alzheimer's Disease: from Diagnosis to Treatment" is presented.

Early-onset Alzheimer's disease (AD) is the rare form of the disease (5-10% of

diagnosed cases), presenting an autosomal dominant inheritance pattern and essentially

originating from mutations in genes encoding presenilins (PSEN1 and PSEN2) and amyloid

precursor protein (APP), which lead to the increase of the Aβ42 peptide and, consequently, loss

of neuronal function and death.

Currently, the definitive diagnosis of this pathology is obtained from the autopsy of

brain tissues, since the traditional diagnostic procedures of AD are essentially based on the

exclusion of other causes of dementia. However, several studies are focused on the possibility

of early diagnosis using specific biomarkers, which capture both the extent of the disease and

its effects on brain function, moving from an exclusion diagnosis approach to a positive

diagnosis. Biomarkers are divided into two broad categories allowing a sequential observation

of events related to the pathophysiological process of the disease and are fundamental for a

possible characterization of the clinical situation of the patient.



Leticia de Bastos

7

Regarding treatment, this is based essentially on symptomatology, using

acetylcholinesterase inhibitors and N-methyl-D-Aspartate receptor antagonists. However,

several treatments based on the etiology are already under study and encompass not only Aβ

immunotherapy, but also inhibitors of secretases, aggregation of Aβ peptide, and

phosphorylation and aggregation of tau protein.

In the future, micro-RNAs (miRNAs), regulators of gene expression, are promising

biomarkers for early diagnosis and interference-based RNA technologies may open new

avenues for AD treatment.

Key words: DA, APP, presenilins, Aβ peptide, biomarkers.



8 Leticia de Bastos

Agradecimentos

É com satisfação que expresso o meu agradecimento a todos os que contribuíram para

que chegasse até aqui.

Aos meus pais, Glória e Fernando, pois sem eles nada disto seria possível. Obrigada por

tudo, pelos valores transmitidos, pelo amor e apoio incondicional que me têm dado ao longo da

vida.

À minha irmã por acreditar em mim e ter estado sempre presente quando lhe pedi ajuda.

Ao Patrick por todo o amor e paciência que tem demonstrado ao longo desta caminhada.

Aos colegas de mestrado, pelos momentos que passamos juntos, pela amizade, troca de

experiências e sabedoria.

Aos Professores do Mestrado em Análises clínicas, pela aprendizagem que

proporcionaram, em especial à Doutora Isabel Bettencourt, pela força que me deu quando a

minha vontade era desistir, à Doutora Isabel Rivera, pela orientação na dissertação e à Doutora

Cristina Marques, por todo o apoio no processo transição de local de trabalho/estágio.

Às minhas colegas de trabalho que fizeram com que a conciliação entre a minha vida

profissional e académica se tornasse mais fácil.

A todos, os meus sinceros agradecimentos.



Leticia de Bastos

9

Índice Geral

Relatório

Índice………………………………………………………………………………………….14

Índice de Figuras ……………………………………………………………………………...19

Índice de Tabelas...………………………………………………………………...…………21

Siglas e Abreviaturas …………………………………………………………………………23

1. Introdução ……………………………………………………………………………….27

1.1. Objetivo ……………………………………………………………………………..27

2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica ……………………………………….28

2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida …………………….28

2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça ………………..30

3. Higiene e Segurança no Laboratório …………………………………………………….33

4. Fluxograma Geral ………………………………………………………………………..37

5. Amostras Inadequadas para Análise …………………………………………………….39

6. Controlo de Qualidade …………………………………………………………………..40

6.1. Controlo de Qualidade Interno ……………………………………………………..40

6.2. Avaliação Externa da Qualidade ……………………………………………………42

7. Valência de Bioquímica ………………………………………………………………….43

7.1. Bioquímica Clínica …………………………………………………………………43

7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos …………...90

7.3. Análise da Urina Tipo II ……………………………………………………………91

7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado ……………………………………….103

8. Valência de Hematologia ………………………………………………………………105

8.1. Hemogramas……………………………………………………………………….105

8.2. Hemoglobina Glicada ……………………………………………………………..124

8.3. Eletroforese das Hemoglobinas ……………………………………………………126



10 Leticia de Bastos

8.4. Hemostase …………………………………………………………………………128

9. Valência de Microbiologia ……………………………………………………………..139

9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia …………………………………………...139

9.2. Exame Microscópico ………………………………………………………………141

9.3. Exame Cultural ……………………………………………………………………146

9.4. Testes de Identificação Presuntiva ………………………………………………...154

9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7 ……………………………..157

9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae …………………………...158

9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos 159

9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A ………………………………….162

9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae …………………………………162

9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila ………………………………….163

9.11. Teste Screening para Clostridium difficile ……………………………………...164

9.12. Teste Screening para Campylobacter spp.…..…………………………………..166

9.13. Pesquisa de Vírus………………………………………………………………..167

9.14. Pesquisa de Micobactérias ………………………………………………………170

9.15. PCR em Tempo Real ……………………………………………………………175

9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras ……………….176

9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos ………………….202

9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos …………………..204

9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras …………………………………..205

9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos ……………………….206

9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes …………………………………………..206

10. Fase Pós-Analítica……………………………………………………………………208

11. Conclusão …………………………………………………………………………….209

12. Referências Bibliográficas …………………………………………………………...210



Leticia de Bastos

11

Dissertação

Índice………………………………………………………………………………………...225

Índice de Figuras …………………………………………………………………………….227

Índice de Tabelas ……………………………………………………………………………228

Siglas e Abreviaturas ………………………………………………………………………..229

1. Introdução ………………………………………………………………………………231

1.1. Objetivos …………………………………………………………………………..233

2. Doença de Alzheimer Familiar …………………………………………………………234

2.1. Proteína Precursora Amilóide ……………………………………………………..235

2.2. Presenilinas 1e 2 …………………………………………………………………...241

2.3. Apolipoproteína E …………………………………………………………………248

2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1……………………………………………………….249

3. Em Portugal …………………………………………………………………………….250

4. Diagnóstico ……………………………………………………………………………..251

4.1. História Clínica do Doente ………………………………………………………..253

4.2. Entrevista a Informante Informado ………………………………………………..254

4.3. Testes Cognitivos Breves ………………………………………………………….255

4.4. Investigação Laboratorial ………………………………………………………….256

4.5. Testes Neuropsicológicos ………………………………………………………….256

4.6. Testes Genéticos …………………………………………………………………...256

4.7. Neuroimagem ……………………………………………………………………..257

4.8. Outros Biomarcadores …………………………………………………………….259

5. Hipóteses Terapêuticas …………………………………………………………………261

5.1. Tratamento Sintomático …………………………………………………………...261

5.2. Tratamento Baseado na Etiologia………………………………………………….262

6. No futuro………………………………………………………………………………..269

7. Materiais e Métodos ……………………………………………………………………272




8. Discussão e Conclusão …………………………………………………………………273

9. Referências Bibliográficas ……………………………………………………………..275

Anexos

Anexo I………………………………………………………………………………………283

Anexo II ……………………………………………………………………………………..285

Anexo III …………………………………………………………………………………….287

Anexo IV …………………………………………………………………………………….288

Anexo V ……………………………………………………………………………………..289

Anexo VI …………………………………………………………………………………….291



RELATÓRIO DE ESTÁGIO

Leticia de Bastos

Relatório de estágio orientado pelo Dr. Carlos José Faria Diogo Cortes,

coorientado pela Dra. Joana Selada Domingues.


2018




Índice

Índice ........................................................................................................................................ 14

Índice de Figuras ...................................................................................................................... 19

Índice de Tabelas ...................................................................................................................... 21

Siglas e Abreviaturas ................................................................................................................ 23

1. Introdução ......................................................................................................................... 27

1.1. Objetivo ..................................................................................................................... 27

2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica ............................................................ 28

2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida ................................ 28

2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça .......................... 30

3. Higiene e Segurança no Laboratório ................................................................................. 33

4. Fluxograma Geral ............................................................................................................. 37

5. Amostras Inadequadas para Análise ................................................................................. 39

6. Controlo de Qualidade ...................................................................................................... 40

6.1. Controlo de Qualidade Interno .................................................................................. 40

6.2. Avaliação Externa da Qualidade ............................................................................... 42

7. Valência de Bioquímica .................................................................................................... 43

7.1. Bioquímica Clínica .................................................................................................... 43

7.1.1. Avaliação do Ionograma .................................................................................... 45

7.1.2. Avaliação do Metabolismo do Ferro .................................................................. 47

7.1.3. Avaliação da Função Cardíaca ........................................................................... 50

7.1.4. Avaliação da Função Renal ................................................................................ 55

7.1.5. Avaliação da Função Pancreática ....................................................................... 58

7.1.6. Avaliação da Função Hepática ........................................................................... 60

7.1.7. Avaliação da Glicémia ....................................................................................... 66



Leticia de Bastos

15

7.1.8. Avaliação do Metabolismo Lipídico .................................................................. 67

7.1.9. Avaliação das Proteínas ..................................................................................... 72

7.1.10. Avaliação da Gonadotrofina Coriónica Humana ............................................... 74

7.1.11. Avaliação da Desidrogenase Láctica .................................................................. 75

7.1.12. Avaliação da Creatina-Cinase ............................................................................ 76

7.1.13. Metabolismo Mineral-Ósseo .............................................................................. 77

7.1.14. Avaliação da Proteína C Reativa ........................................................................ 81

7.1.15. Monitorização de Drogas Terapêuticas .............................................................. 81

7.1.16. Rastreio de Drogas de Abuso ............................................................................. 85

7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos .................. 90

7.3. Análise da Urina Tipo II ............................................................................................ 91

7.3.1. Exame Físico e Químico da Urina Tipo II ......................................................... 92

7.3.2. Avaliação Microscópica do Sedimento Urinário ............................................... 98

7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado ............................................................. 103

8. Valência de Hematologia ................................................................................................ 105

8.1. Hemogramas ............................................................................................................ 105

8.1.1. Esfregaço de Sangue Periférico ........................................................................ 115

8.1.2. Velocidade de Sedimentação Eritrocitária ....................................................... 123

8.2. Hemoglobina Glicada .............................................................................................. 124

8.3. Eletroforese das Hemoglobinas ............................................................................... 126

8.4. Hemostase ................................................................................................................ 128

8.4.1. Determinação do Tempo de Protrombina ........................................................ 132

8.4.2. Determinação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada ......................... 132

8.4.3. Determinação do Tempo de Trombina ............................................................. 133

8.4.4. Determinação do Fibrinogénio ......................................................................... 133

8.4.5. Determinação do Anticoagulante Lúpico ......................................................... 133

8.4.6. Determinação da Antitrombina III ................................................................... 134




8.4.7. Determinação da Proteína C ativada ................................................................ 136

8.4.8. Determinação da Proteína S Livre ................................................................... 136

8.4.9. Determinação dos D-Dímero ........................................................................... 137

8.4.10. Fator von Willebrand ........................................................................................ 137

8.4.11. Fator VIII .......................................................................................................... 138

9. Valência de Microbiologia .............................................................................................. 139

9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia .................................................................. 139

9.2. Exame Microscópico ............................................................................................... 141

9.2.1. Exame Direto a Fresco ..................................................................................... 141

9.2.2. Exame após Coloração ..................................................................................... 141

9.2.3. Exame Direto a Fresco com Contraste Negativo por Tinta da China .............. 145

9.2.4. Análise Morfológica de Fungos Filamentosos ................................................. 145

9.3. Exame Cultural ........................................................................................................ 146

9.3.1. Técnica de Sementeira ..................................................................................... 152

9.3.2. Condições de Incubação ................................................................................... 153

9.3.3. Aspeto Macroscópico das Colónias ................................................................. 154

9.4. Testes de Identificação Presuntiva .......................................................................... 154

9.4.1. Prova da Catalase ............................................................................................. 154

9.4.3. Prova de Sensibilidade à Optoquina ................................................................. 155

9.4.4. Prova da Urease ................................................................................................ 156

9.4.5. Prova da Coagulase .......................................................................................... 156

9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7 .............................................. 157

9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae .......................................... 158

9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos 159

9.7.1. Preparação da Suspensão ................................................................................. 160

9.7.2. Identificação de Microrganismos ..................................................................... 160

9.7.3. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos ................................................. 161



Leticia de Bastos

17

9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A .................................................... 162

9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae .................................................... 162

9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila .................................................... 163

9.11. Teste Screening para Clostridium difficile ........................................................... 164

9.11.1. Pesquisa da Desidrogenase do Glutamato ........................................................ 165

9.11.2. Pesquisa das Toxinas A/B ................................................................................ 165

9.12. Teste Screening para Campylobacter spp. ........................................................... 166

9.13. Pesquisa de Vírus ................................................................................................. 167

9.13.1. Teste Screening para Rotavírus e Adenovírus ................................................. 167

9.13.2. Teste Screening para Vírus Sincicial Respiratório ........................................... 168

9.13.3. Pesquisa do Vírus Influenza A e B ................................................................... 169

9.13.4. Pesquisa do Vírus Papiloma Humano de Alto Risco ....................................... 170

9.14. Pesquisa de Micobactérias ................................................................................... 170

9.14.1. Exame Direto e Cultural ................................................................................... 171

9.14.2. Hemoculturas ................................................................................................... 173

9.14.3. Pesquisa por PCR ............................................................................................. 175

9.15. PCR em Tempo Real ........................................................................................... 175

9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras ......................... 176

9.16.1. Trato Respiratório Superior .............................................................................. 177

9.16.2. Trato Respiratório Inferior ............................................................................... 178

9.16.3. Exsudado Ocular .............................................................................................. 180

9.16.4. Exsudado Auricular .......................................................................................... 181

9.16.5. Exsudados Purulentos ...................................................................................... 182

9.16.6. Biópsias Cirúrgicas e Material de Próteses ...................................................... 184

9.16.7. Líquido Biliar e Líquidos de Serosas: Ascítico, Pleural, Sinovial e Pericárdico.

………………………………………………………………………………...184

9.16.8. Líquido Cefalorraquidiano ............................................................................... 186




9.16.9. Urina Asséptica ................................................................................................ 187

9.16.10. Esperma e Exsudado Vaginal, Endocervical e Uretral .................................... 191

9.16.12. Hemoculturas ................................................................................................... 195

9.16.13. Catéteres ........................................................................................................... 198

9.16.14. Fezes ................................................................................................................. 199

9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos ............................ 202

9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos .............................. 204

9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras ...................................................... 205

9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos ..................................... 206

9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes .................................................................. 206

10. Fase Pós-Analítica ....................................................................................................... 208

11. Conclusão .................................................................................................................... 209

12. Referências Bibliográficas .......................................................................................... 210

Anexo I ................................................................................................................................... 283

Anexo II .................................................................................................................................. 285

Anexo III ................................................................................................................................ 287

Anexo IV ................................................................................................................................ 288

Anexo V ................................................................................................................................. 289

Anexo VI ................................................................................................................................ 291



Leticia de Bastos

19

Índice de Figuras

Figura 1. Pictogramas de perigo. .............................................................................................. 34

Figura 2. Fluxograma geral que se aplica ao Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Cascais

e ao do C.H.M.T. ...................................................................................................................... 38

Figura 3. Dimension® EXLTM with LM, da Siemens. .............................................................. 44

Figura 4. Equipamento Aution Max, da A. Menarini Diagnostics .......................................... 92

Figura 5. Sysmex XN-1000TM. ............................................................................................... 108

Figura 6. Tecnologia da focagem hidrodinâmica ................................................................... 108

Figura 7. Histograma de plaquetas (à esqueda) e dos eritrócitos (à direita). ......................... 109

Figura 8. Tecnologia da citometria de fluxo e sinais de dispersão da luz frontal, lateral e da

fluorescência lateral ................................................................................................................ 110

Figura 9. Diagramas de dispersão normal dos leucócitos do canal DIFF, à esquerda e diagrama

de dispersão com a localização das diferentes células da série branca, consoante as suas

características físico-químicas, à direita. ................................................................................ 111

Figura 10. Diagramas de dispersão normal do canal WNR ................................................... 112

Figura 11. Diagramas de dispersão normal do canal das plaquetas fluorescentes. ................ 112

Figura 12. Diagrama de dispersão no canal dos reticulócitos com distribuição normal ........ 113

Figura 13. Ilustração de como fazer um esfregaço de sangue periférico, à esquerda e esfregaço

bem executado, à direita ......................................................................................................... 115

Figura 14. Equipamento de coloraçãoAutomate RAL Stainer. ............................................. 116

Figura 15. Alifax Test 1 THL ................................................................................................. 124

Figura 16. Arkray Adams A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics ................................. 125

Figura 17. Representação esquemática da percentagem da produção de diversos tipos de

hemoglobinas desde o inicio da gestação até à idade adulta .................................................. 127

Figura 18. HYDRASYS, da sebia. ......................................................................................... 127

Figura 19. Migração, em pH alcalino, das hemoglobinas normais à esquerda e as variantes mais

frequentes à direita. ................................................................................................................ 128




Figura 20. Cascata da coagulação. ......................................................................................... 129

Figura 21. Sistema fibrinolítico e inibidores da fibrinólise .................................................... 130

Figura 22. STA Compact Max®, da Satgo. ........................................................................... 130

Figura 23. Princípio de medição por cronometria. ................................................................. 131

Figura 24. Marcha laboratorial em Microbiologia, quando um doente possui uma infeção. . 140

Figura 25. Representação esquemática da parede celular das bactérias Gram negativo e Gram

positivo ................................................................................................................................... 143

Figura 26. Representação esquemática da técnica de sementeira em quatro quadrantes. ...... 152

Figura 27. Representação esquemática da técnica de sementeira por espalhamento. ............ 152

Figura 28. Representação esquemática da técnica de sementeira semi-quantitativa. ............ 152

Figura 29. Equipamento GeneXpert® System, em cima e cartucho de reação em baixo. ..... 176

Figura 30.Fluxograma para identificação de cocos Gram negativos. .................................... 202

Figura 31. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram negativo. ................................ 203

Figura 32.Fluxograma para a identificação de cocos Gram positivo. ................................... 204

Figura 33. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram positivo. ................................. 205

Figura 34. Fluxograma para identificação de leveduras. ....................................................... 205

Figura 35. Fluxograma para identificação de fungos filamentosos. ...................................... 206

Figura 36. Representação esquemática da hematopoiese…………………………………...293



Leticia de Bastos

21

Índice de Tabelas

Tabela 1. Triagem e acondicionamento de resíduos num laboratório ...................................... 35

Tabela 2. Causa do aumento e da diminuição dos eletrólitos no soro ..................................... 46

Tabela 3. Marcadores bioquímicos após situação de EAM sem complicações ....................... 51

Tabela 4. Causa do aumento e da diminuição do cálcio, fósforo e magnésio no soro ............. 80

Tabela 5. Compostos dosados na urina para o rastreio de drogas de abuso e respetivo conjugado

.................................................................................................................................................. 89

Tabela 6. Concentrações utilizados para estabelecer valores de índice HIL ........................... 90

Tabela 7. Células que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado clínico

.................................................................................................................................................. 99

Tabela 8. Cilindros que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado

clínico ..................................................................................................................................... 100

Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se encontram

................................................................................................................................................ 101

Tabela 10. Alterações qualitativas da serie vermelhas que podem ser observados com a

coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas ................................................. 117

Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a coloração

de May-Grünwald-Giemsa e principais causas ...................................................................... 121

Tabela 12. Alterações quantitativas da serie plaquetar que podem ser observados com a

coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas. .................................................... 123

Tabela 13. Teste de primeira linha para investigação de alterações hemostáticas ................. 135

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados ............................................................................ 147

Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do Hospital de

Cascais. ................................................................................................................................... 283

Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do Hospital

de Tomar. ............................................................................................................................... 285




Tabela 17. Estirpes bacterianas disponíveis manipuladas semanalmente segundo a ordem

estabelecida, e respetivo teste de identificação e TSA executados no equipamento automático.

................................................................................................................................................ 287

Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL ........................................................................... 289



Leticia de Bastos

23

Siglas e Abreviaturas

α-KG α-cetoglutarato

AEQ Avaliação Externa da Qualidade

ADH (Anti-diuretic Hormone) Hormona Anti-diurética

ADP Adenosina Difosfato

ALP (Alkaline Phosphatase) Fosfatase Alcalina

ALT Alanina Aminotransferase

aPTT (Activated Partial Thromboplastin Time) Tempo de Tromboplastina Parcial

Ativada

AST Aspartato Aminotransferase

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosina Trifosfato

BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes

BHI (Brain Heart Infusion) Caldo Cérebro e Coração

BK Bacilo de Koch

BNP (Brain Natriuretic Peptide) Péptidos Natriuréticos Cerebral

CAM Gelose Campylosel

CAN2 Gelose chromIDTM Candida

CHGM Concentração de Hemoglobina Globular Média

CIVD Coagulação Intravascular Disseminada

CK Creatina CCinase




CKMB Isoenzima MB da Creatina CCinase

CLED Gelose Cistina, Lactose, Deficiente em Eletrólitos

CNA Gelose COS com Ácido Nalidíxico e Colistina

COS Gelose de Columbia +5% de Sangue de Carneiro

CPR (Chlorophenol Red) Vermelho de Clorofenol

CPRG (Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside) Vermelho de Clorofenol-β-D-

galactopiranosido

CQ Controlo de Qualidade

CQI Controlo de Qualidade Interno

EAM Enfarte Agudo do Miocárdio

EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético

FSC (Forward) Dispersão da Luz Frontal

GDH Desidrogenase Específica do Glutamato do Clostridium difficile

GGT Gama-glutamil Transferase

GLDH Glutamato Desidrogenase

G-6-PDH Glucose-6-fosfato Desidrogenase

HAE2 Gelose Chocolate Heamophilus 2

Hb Hemoglobina

HbA1c Hemoglobina Glicosilada ou Glicada

hCG Gonadotropina Coriónica Humana

HEK Gelose Hektoen

HDL (High Density Lipoprotein) Lipoproteínas de Alta Densidade

HGM Hemoglobina Globular Média



Leticia de Bastos

25

HIL Hemólise, Icterícia e Lipémia

HK Hexocinase

HPV (Human Papillomavirus) Papiloma Vírus Humano

HTC Hematócrito

ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva

IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) Federação Internacional de

Química Clínica

INR (International Normalized Ratio) Índice Internacional Normalizado

LCR Líquido Cefalorraquidiano

LDH (Lactate Dehydrogenase) Desidrogenase Láctica ou Lactato Desidrogenase

LDL (Low Density Lipoprotein) Lipoproteínas de Baixa Densidade

MCK Gelose MacConkey

NAD+ Nicotinamida e Adenina Dinucleótido (forma oxidada)

NADH Nicotinamida e Adenina Dinucleótido (forma reduzida)

NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (forma oxidada)

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato (forma reduzida)

NRBC (Nucleated Red Blood Cells) Eritroblastos

NT-proBNP N-terminal proBNP

OMS Organização Mundial de Saúde

PCR Proteína C-reativa

PDW (Platelet Distribution Width) Coeficiente de Dispersão Plaquetária

PEG Polietilenoglicol

PLT Plaquetas




PVX Gelose Chocolate PolyViteX

RBC (Red Blood Cells) Eritrócitos

RDW (Red Cell Distribution Witdth) Coeficiente de Dispersão Eritrocitária

RSV (Respiratory Syncytial Virus) Vírus Sincicial Respiratório

SFL Fluorescência Lateral

SGC2 Gelose Sabouraud com Cloranfenicol 2

SNC Sistema Nervoso Central

SSC (Scatter) Dispersão da Luz Lateral

STRB Gelose chromIDTM Strepto B

TP Tempo de Protrombina

TSA Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos

TSDT Técnico Superior de Diagnóstico e Terapêutica

TT Tempo de Trombina

UFC Unidade Formadora de Colónias

VCA3 Gelose Chocolate VCAT

VGM Volume Globular Médio

VPM Volume Plaquetário Médio

VS Velocidade de Sedimentação Eritrocitária

YER Gelose Yersinia



Leticia de Bastos

27

1. Introdução

O Relatório de Estágio pretende fazer uma apresentação do local onde decorreram os

estágios, descrever as atividades desenvolvidas em cada valência, realçando a importância do

controlo de qualidade interno e da avaliação externa da qualidade, bem como alguns aspetos da

fase pré-analítica. Dentro de cada valência encontra-se destacado o tipo de produto biológico

necessário à execução dos diferentes parâmetros analíticos, quais os equipamentos utilizados

ou técnicas manuais desenvolvidas, o fundamento dos métodos, apresentando os aspetos mais

relevantes no que diz respeito à experiência desenvolvida e ao enquadramento dos

conhecimentos adquiridos no contexto real de trabalho num Laboratório e da sua aplicação à

Clínica.

O estágio é de grande importância para sedimentar e aprofundar conhecimentos, assim

como adquirir capacidade de organização e de execução das tarefas diárias num Laboratório.

Neste caso, tive o privilégio de conhecer a dinâmica de dois Serviços de Patologia Clínca

distintos.

O estágio profissional da valência de Bioquímica decorreu no Serviço de Patologia

Clínca do Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, no período compreendido entre o dia 9 de

janeiro e o 10 de março de 2017. As valências de Hematologia e Microbiologia foram realizadas

no Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, em Tomar, entre o dia 3

de abril e 4 de agosto de 2017.

1.1. Objetivo

O principal objetivo do estágio e da execução do relatório é a aquisição competências e

métodos de trabalho, bem como consolidar conhecimentos.




2. Caracterização dos Serviços de Patologia Clínica

Os Serviços de Patologia Clínca, do Hospital Dr. José de Almeida, em Cascais, bem

como o do Hospital Nossa Senhora da Graça, em Tomar, respondem às necessidades da

urgência hospitalar tendo um funcionamento permanente para garantir um rápido e adequado

apoio aos doentes. Também são realizadas análises de rotina aos doentes internados, bem como

aos utentes da consulta que procuram estas unidades de saúde, que se regem segundo os mais

rigorosos padrões de qualidade, respeitando as Boas Práticas Laboratoriais.

Ambos os Serviços de Patologia Clínica possuem um fluxo de trabalho bastante

organizado e encontrando-se na sua maioria automatizados e informatizados, conseguido, deste

modo, a total rastreabilidade de todo o processo.

Possuem ainda uma diferenciada secção de Microbiologia que presta apoio ao Hospital

e à Comissão de Controlo da Infeção Hospitalar.

Os Serviços de Patologia Clínca têm ainda implementado um Sistema de Gestão de

Qualidade e encontram-se Certificados pela norma NP EN ISO 9001.

2.1. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Dr. José de Almeida

O Hospital Dr. José de Almeida, situado em Alcabideche, é um hospital público de

gestão privada que presta cuidados de saúde à população de Cascais e Sintra (na área materno-

infantil) tendo como objetivo tornar esta região um exemplo na prestação dos cuidados de

saúde. Atualmente possui um total de 287 camas.

O Serviço de Patologia Clínica, gerido pela empresa Labco, foi instalado de forma a

proporcionar aos utentes, um serviço de qualidade e excelência. A Direção Técnica encontra-

se a cargo do Doutor Luís Santos, Patologista Clínico.

Para além do Diretor Técnico, existe ainda uma Patologista Clínica, uma Técnica

Superior de Saúde, a Dra. Joana Domingues, responsável pela secção de Microbiologia, uma



Leticia de Bastos

29

Técnica Superior de Regime Geral, coordenadora do serviço, diversos Técnicos Superiores de

Diagnóstico e Terapêutica (TSDT) e uma Assistente Operacional.

O Serviço de Patologia Clínica é constituído de uma central de colheitas com sala de

espera e um laboratório que possui diversas secções, nomeadamente, Microbiologia,

Hematologia, Hemóstase, Bioquímica e Imunologia. Tudo o que não é processado no

laboratório é encaminhado para o Laboratório Central, situado em Lisboa.

2.1.1. Missão

A General Lab é um grupo de laboratórios dedicados à realização de análises clínicas,

que oferece aos seus clientes um serviço responsável, profissional e inovador, com eficiência e

qualidade, tanto humana como técnica.

2.1.2. Visão

A General Lab pretende ser o líder europeu no setor das Análises Clínicas e proporcionar

um serviço que acompanha e tende a superar as expectativas dos clientes utilizando os nossos

valores.

2.1.3. Valores

O potencial dos Recursos Humanos;

A capacidade de adaptação dos nossos processos às necessidades dos clientes;

Espirito de inovação na procura constantes de novas soluções técnicas;

A parceria e a integração de todos os profissionais e colaboradores incluindo os

fornecedores;

O poder de estabelecer alianças estratégicas com outras Organizações;

O compromisso com o meio ambiente e a sociedade em geral.




2.1.4. Política da Qualidade

A política de qualidade do Grupo General Lab consiste em fomentar o trabalho em

equipas, no controlo e melhoria contínua dos processos para garantir a satisfação do cliente e

superar as suas expectativas.

2.2. Serviço de Patologia Clínica do Hospital Nossa Senhora da Graça

O Centro Hospitalar do Médio Tejo, E.P.E. (C.H.M.T.) é constituído por três Unidades

Hospitalares, Abrantes (Hospital Doutor Manoel Constâncio) Tomar (Hospital Nossa Senhora

da Graça) e Torres Novas (Hospital Rainha Santa Isabel), distribuídas, entre si, a uma distância

de 30-35km. O C.H.M.T possui um total de 400 camas, disponíveis para o internamento de

doentes, tendo como objetivo o tratamento e a reabilitação, em tempo clinicamente adequado,

com condições ótimas de qualidade e humanidade dos serviços prestados.

O Serviço de Patologia Clínica encontra-se centralizado no Hospital Nossa Senhora da

Graça que possui uma estrutura laboral bem definida que compreende as áreas de Hematologia,

Bioquímica, Imunoquímica, Imunologia, Microbiologia e Urgência, tendo cada setor um

especialista responsável. Possui ainda uma sala de colheitas com sala de espera e consulta de

hipocoagulação, que se realiza uma vez por semana. Para além de dar resposta aos serviços do

próprio Hospital, também processa amostras da consulta vindas dos Hospitais de Abrantes e

Torres Novas. No entanto, em cada unidade existe um Serviço de Patologia Clínica que possui

uma central de colheitas, um laboratório com capacidade de dar resposta à urgência e ao

internamento, bem como um espaço para a execução da consulta da hipocoagulação. O sector

de Microbiologia encontra-se totalmente centralizado em Tomar.

A direção do Serviço de Patologia Clínica é da responsabilidade do Dr. Carlos Cortes e

a coordenação dos TSDT encontra-se a cargo da TSDT Sandra Paredes. O Serviço de Patologia

Clínica abrange trabalhadores qualificados nomeadamente, 4 Técnicos Superiores de Saúde, 2

Técnicos Superiores de Regime Geral, 5 Patologistas Clínicos, diversos TSDT e 4 Assistentes

Operacionais.



Leticia de Bastos

31

2.2.1. Visão

O C.H.M.T. pretende ser reconhecido como um Centro Hospitalar de referência na

prestação de cuidados de saúde, com especialidades diferenciadas, apostando no

desenvolvimento de serviços eficientes e inovadores com uma gestão adequada dos recursos,

sempre com o objetivo de atingir a satisfação dos seus utentes.

2.2.2. Missão

Prestação de cuidados de saúde diferenciados, com eficiência e qualidade, em

articulação com outros serviços de saúde e sociais da comunidade, a custos comportáveis,

assumindo-se como um Centro de elevada competência na organização e prestação assistencial,

uma referência no esforço de investigação, desenvolvimento e inovação, promovendo a

complementaridade entre as 3 Unidades Hospitalares.

2.2.3. Valores

Qualidade, procurando obter os melhores resultados e níveis de serviço na

prestação de cuidados, tendo como base a satisfação das necessidades da comunidade,

assumindo o princípio da melhoria contínua e promovendo a cooperação entre os

diferentes Serviços;

Ética e integridade, orientando as ações tomadas segundo os mais nobres

princípios de conduta, nas relações;

Respeito pelos direitos individuais, assumindo o compromisso de salvaguardar

a dignidade de cada indivíduo nas relações decorrentes da sua operacionalidade;

Competência e inovação, promovendo o desenvolvimento da Instituição e a

implementação de novas soluções que permitam assegurar a prestação dos melhores

cuidados de saúde.

2.2.4. Política da Qualidade

O C.H.M.T. orienta a prestação de cuidados de saúde na perspetiva dos princípios da

Gestão pela Qualidade, visando a satisfação dos utentes e colaboradores.




Neste sentido, a política da qualidade é estabelecida pelos seguintes princípios:

Competência e respeito pelos requisitos legais, éticos e deontológicos no

exercício das suas atividades, sempre orientadas para a satisfação das necessidades dos

utentes.

Cumprimento dos requisitos aplicáveis a de melhoria contínua da eficácia do

Sistema de Gestão da Qualidade.

Cultura de Qualidade e Segurança assente num modelo de gestão global de risco.

Cultura de competências assente na responsabilidade e formação contínua dos

colaboradores, garantindo a sua satisfação e otimizando a performance organizacional.

Garantia de uma comunicação eficaz com os colaboradores e com a comunidade

envolvente à área de influência do Médio Tejo.



Leticia de Bastos

33

3. Higiene e Segurança no Laboratório

Em ambos os Laboratórios existe um procedimento escrito de Higiene e Segurança, que

contempla os requisitos para a segurança de pessoas e instalações, planos de emergência,

tratamento de resíduos, requisitos para a limpeza das instalações, bem como para a lavagem e

esterilização de materiais.

As Normas Gerais de Segurança visam minimizar o risco de acidentes, assim como

estabelecer normas que garantem a proteção dos profissionais saúde, nomeadamente os

técnicos, sendo fundamental:

A utilização de equipamentos de segurança individual e coletivos, sempre que

necessário;

Tratar todos os produtos como sendo potencialmente perigosos;

Os recipientes e/ou requisições visivelmente conspurcados com matéria orgânica

não devem ser aceites pelo laboratório;

Colocar tampas nos tubos antes de se proceder à sua centrifugação e

armazenamento;

Frascos que contenham produtos transferidos ou preparados a partir de frascos

originais devem ser etiquetados com a identificação do produto, data da preparação e

de validade, modo de preparação, rúbrica de quem o preparou e simbologia de perigo

adequada (Figura 1);

Não comer, fumar, beber ou conservar alimentos/bebidas na zona laboratorial;

Manter as áreas de trabalho limpas e desimpedidas;

Fechar portas e gavetas de armários após utilização;

Minimizar o uso de objetos pessoais;

Os acessos de saída devem ser desobstruídos.




Antes de se iniciar qualquer operação, é necessário conhecer as características dos

equipamentos, reagentes e produtos que se irão manipular e os seus requisitos de segurança.

Quanto à gestão de resíduos do Laboratório, os resíduos hospitalares são classificados

de acordo com o Despacho conjunto nº242/96 de 5 de julho bem como de acordo com a Portaria

nº 209/2004 de 3 de março (Lista Europeia de Resíduos) (Tabela1).

Figura 1. Pictogramas de perigo [1].



Leticia de Bastos

35

Tabela 1. Triagem e acondicionamento de resíduos num laboratório (Adaptado de [2]).

Res

ídu

os

Não P

erig

oso

s

Grupo I - Resíduos equiparados a urbanos

Grupo II - Resíduos hospitalares não perigosos

Embalagens vazias com exceção dos incluídos no Grupo III

e IV.

Material não contaminado e sem vestígios de sangue.

Material de proteção individual utilizados nos serviços de

apoio, com exceção dos utilizados na recolha de resíduos.

Res

ídu

os

Per

igoso

s

Grupo III - Resíduos com risco biológico

Amostras biológicas;

Material contaminados ou com vestígios de sangue;

Material de proteção individual em que exista contacto com

produtos contaminados.

Grupo IV - Resíduos hospitalares específicos

Resíduos cortantes e perfurantes;

Citostáticos e todo o material utilizado na sua manipulação e

administração;

Produtos químicos passíveis de incineração.

Resíduos Especiais Perigosos

Resíduos líquidos de risco biológico.

Reagentes não identificados ou obsoletos ou

outros resíduos sujeitos a recolha pontual.




A eliminação e tratamento dos resíduos depende da classe a que pertencem. A

Legislação aplicável à gestão de resíduos são o D.L nº 178/2006 e o D.L nº73/2011.

A recolha de resíduos é efetuada por uma empresa contratada, especializada e licenciada

neste tipo de serviço – Stericycle Portugal ®. A recolha periódica deve ser registada em modelo

próprio para posterior elaboração do relatório anual a enviar à Direção Geral de Saúde.

Os resíduos sólidos perigosos não descartáveis (Grupo III) são colocados em recipiente

contendo lixívia diluída. No fim do dia, a lixívia é despejada sob água corrente e o material é

lavado numa cuba de lavagem contendo detergente e lixívia diluída.



Leticia de Bastos

37

4. Fluxograma Geral

Colheita e identificação das amostras

Fornecer instruções para colheita(s)

Prescrição médica

Registo da colheita

Acondicionamento e envio das

amostras ao Laboratório

Receção das amostras

Requisição conforme?

É atribuído um número de registo

que servirá para a identificação da

amostra, com os dados do utente

(nome, número de processo e data

de nascimentos/idade), serviço,

tipo de tubo e secção a que se

destina ou origem do produto (no

caso da microbiologia) e código de

barras.

Não Contacto com o médico prescritor

Retificação da requisição

Sim

Dependendo dos analitos a serem

doseados o transporte é feito à

temperatura ambiente, refrigerado

ou a 37ºC.




Amostra conforme? Não Rejeição da amostra

Solicitação de nova colheita

Sim

Dar entrata dos produtos no sistema

informático do Serviço de Patologia

Clínica

Centrifugar as amostras se necessário

Distribuição dos produtos pelas

diversas secções analíticas ou

aliquotar e armazenar a fim de

manterem a estabilidade até serem

processadas.

Todas as amostras que não são

processadas in situ são

devidamente acondicionadas para

serem enviadas a outro

Laboratório (externo ou do

grupo/centro hospitalar).

Processamento das amostras

Amostra conforme?

(se não repetir passos anteriores)

A programação pode ser manual

ou automática, recorrendo à

transmissão bidirecional entre os

equipamentos e o programa

informático do Laboratório (veio

minimizar erros de programação e

de transcrição de resultados).

Validação de resultados

Figura 2. Fluxograma geral que se aplica ao Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Cascais e ao do

C.H.M.T.



Leticia de Bastos

39

5. Amostras Inadequadas para Análise

A fase pré-analítica concentra a grande maioria dos erros laboratoriais que geram a

rejeição de amostras biológicas, com possibilidade de vir a ser necessário a repetição da

colheita. Entre eles, destacam-se aspetos relacionados com o não cumprimento das

recomendações que antecedem à colheita ou com a colheita em si:

Hemólise: Libertação do conteúdo intracelular do eritrócito para o plasma, que

leva à elevação de alguns parâmetros analíticos e a cor vermelha que pode causar

interferências analíticas na leitura das absorvências (dependendo do grau de hemólise,

o grau de interferência varia). Pode ser patológico ou resultante de erro pré-analítico.

Lipémia: Turvação do soro devido à elevada concentração de lipoproteínas ricas

em triglicéridos que leva a interferências em diversas técnicas analíticas. Atenua se o

tempo de jejum for cumprido.

Icterícia: Relacionada com patologia hepatobiliar. Pode causar interferência

nalgumas técnicas analíticas.

Amostra coagulada: Deve-se geralmente colheitas difíceis e demoradas, ou à não

homogeneização dos tubos que contenham anticoagulante logo após colheita. Leva a

interferência nos resultados e poderá entupir o equipamento.

Proporção sangue-anticoagulante não respeitada: leva a alterações nos resultados

analíticos. É importante encher os tubos até a marca. A largura da marca presente nos

tubos indica a margem de tolerância.




6. Controlo de Qualidade

O Controlo de Qualidade (CQ) num Laboratório de Análises Clínicas, trata-se de um

processo estatístico útil na monitorização e avaliação dos processos analíticos, assegurando a

qualidade e fiabilidade dos resultados, através de um conjunto de ações pré-estabelecidas e

sistemáticas, que abrange as fases pré-analítica, analítica e pós-analítica [3,4].

Os procedimentos de controlo incluem o controlo de qualidade interno (CQI) e a

avaliação externa da qualidade (AEQ) [3], sendo que as matérias de controlo devam ser

examinadas periodicamente, com uma frequência baseada na estabilidade do procedimento e

tendo em conta o risco de danos para o utente de um resultado errado [4].

6.1. Controlo de Qualidade Interno

O CQI define-se como um conjunto de procedimentos que se destinam a assegurar e

controlar a qualidade dos resultados obtidos durante a execução de análises laboratoriais [3].

Permite avaliar a precisão dos sistemas analíticos. A precisão é a concordância entre os vários

valores medidos de um analíto (mínimo 20 réplicas), na mesma amostra, sob as mesmas

condições (repetibilidade) ou sob condições variáveis (reprodutibilidade), sendo afetada pelo

erro aleatório. A imprecisão é medida através do cálculo do coeficiente de variação (CV).

𝐶𝑉 (%) =𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑜 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜 (𝐷𝑃)

𝑀é𝑑𝑖𝑎 (𝑋)× 100

𝐷𝑃 = √∑ (𝑋𝑖 − 𝑋)𝑛

𝑖=1

𝑛 − 1

𝑋 = ∑ 𝑋𝑖𝑛

𝑖=1

𝑛



Leticia de Bastos

41

Em ambos os Serviço de Patologia Clínca, são processados diariamente CQI, no entanto

os níveis de controlo e a periodicidade com que são passados depende do que está estabelecido

na instrução de trabalho e aprovado pelo Diretor Técnico (Anexos I e II).

Para além do que está estipulado na rotina diária, existem outras situações em que é

necessário processar CQI: após uma calibração ou recalibração, sempre que se utilize um novo

reagente, após uma manutenção específica ou procedimentos de resolução rápida de um

problema no equipamento, quando se verifica uma possível tendência nos resultados, e sempre

que se achar necessário.

Os controlos, tal como as amostras, são programados através de um sistema de códigos

de barras. A transmissão bidirecional permite que os resultados sejam transmitidos para um

programa informático e registados em cartas de Levey-Jennings que diariamente são analisadas,

sendo os critérios de aceitação estabelecidos pelo responsável da qualidade do laboratório,

tendo como base as Regras de Westgard.

Quando alguma regra de controlo de qualidade é violada, ou se verifica uma tendência,

os resultados das análises podem ser suscetíveis de conter erros clinicamente significativos.

Neste caso, as amostras devem ser de novo examinadas após a correção do erro, podendo ser

necessário executar manutenções, recalibrar ou colocar um novo regentes. Qualquer ação

corretiva ou preventiva tem de ser devidamente registada.

Antes de se iniciar o processamento das amostras dos utentes é necessário validar os

resultados de controlo e verificar se tudo está operacional.

No que diz respeito à secção de Microbiologia, o CQI é executado com base na

manipulação e conservação de estirpes bacterianas ATCC (do inglês American Type Culture

Collection), que têm características fenotípicas previamente conhecidas. As estirpes a utilizar é

quase sempre obtidas a partir das culturas de trabalho. A cultura de trabalho é preparada uma

vez por semana com início de procedimento às segundas, terças ou quartas-feiras (Anexo III,

A). O controlo é realizado semanalmente (uma estirpe diferente por semana), procedendo-se à

sua identificação e teste de suscetibilidade aos antimicrobianos no equipamento automático

(Anexo III, B). Quando algum resultado não estiver conforme o esperado, deverá procurar-se a

causa do erro e corrigir-se sempre que possível. Nestas situações, o teste deverá ser repetido na




semana seguinte, juntamente com o programado para essa semana, devendo qualquer ação

corretiva ficar devidamente registada.

Relativamente às técnicas manuais, os controlos são processados sempre que uma caixa

nova é colocada a uso, e, se possível (se os controlos não foram de uso único), sempre que haja

dúvidas no desempenho ou interpretação do resultado de um teste, sendo o dia da abertura, lote

do Kit e o desempenho do controlo registado no dossier das técnicas manuais.

6.2. Avaliação Externa da Qualidade

A AEQ corresponde à avaliação por um organismo exterior da qualidade dos resultados

fornecidos pelo laboratório. Permite a melhoria dos níveis de desempenho do laboratório e a

comparabilidade de resultados com outros laboratórios, dando uniformidade e credibilidade ao

trabalho desenvolvido [3]. Quando um resultado de controlo não cumpre os critérios de

desempenho pré-estabelecidos tem de se implementar ações corretivas.

Em ambos os Serviço de Patologia Clínca, a grande maioria dos parâmetros são alvos

da AEQ, permitindo deste modo aferir a exatidão dos resultados, avaliar e quantificar a

inexatidão e as tendências dos sistemas analíticos. As amostras são enviadas com uma

periodicidade adequada, para que se possa efetuar correções aos eventuais desvios observados

em tempo útil. A exatidão é afetada pelo erro sistemático.

A inexatidão (ou bias) corresponde à percentagem do afastamento entre o valor medido

em relação ao valor verdadeiro.

𝐵𝑖𝑎𝑠(%) =|𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑖𝑟𝑜|

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑖𝑟𝑜× 100

O resultado da AEQ é avaliado pelo Diretor Técnico, em conjunto com o responsável

da qualidade do Serviço de Patologia Clínca e o responsável da secção.

Os planos de controlo da AEQ em que os Serviços de Patologia Clínica participam

encontram-se apresentados no Anexo IV.



Leticia de Bastos

43

7. Valência de Bioquímica

7.1. Bioquímica Clínica

A área da Bioquímica Clínica é uma área multidisciplinar, que tem por objetivo

determinar os parâmetros bioquímicos, permitindo a sua utilização no diagnóstico, prognóstico,

tratamento e monitorização da doença.

Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Dr. José de Almeida, Cascais

Responsáveis da secção:

Dr. Luis Santos (Patologista Clínico)

Dra. Stela Lopes (Patologista Clínico)

Dra. Joana Domingues (Técnica Superior de Saúde)

Período de Estágio: 09/01/2017 - 10/03/2017

Volume de trabalho: Em média cerca de 6900 pedidos/mês (estatística feita com base no

número de pedidos ionograma/mês)

Atividades realizadas na seção no referendo período:

Colheitas de produtos biológicos no internamento e consulta externa;

Receção de produtos e avaliação da sua conformidade;

Manutenção dos equipamentos;

Execução e avaliação CQI e das amostras da AEQ;

Processamento de amostras;

Validação técnica de resultados;

Gestão de stocks.




Equipamento em funcionamento na secção:

Equipamento: Dimension® EXLTM with LM, da Siemens

O Dimension® EXLTM possui um sistema automatizado que permite a determinação dos

parâmetros bioquímicos em amostras de soro, plasma, urina e líquidos orgânicos,

nomeadamente, líquido cefalorraquidiano (LCR).

Os produtos que se destinam a determinações bioquímicas neste equipamento são

centrifugados a 3500rpm, 10 minutos. As urinas não precisam de nenhum tratamento específico

a não ser que se apresentem muito turvas ou com uma consistência viscosa, e neste caso também

têm de ser centrifugadas, a fim de prevenir o entupimento das agulhas do equipamento.

Quanto aos líquidos orgânicos, sempre que haja pedido de citoquímico1, primeiro tem

de se avaliar a cor e o aspeto do líquido e posteriormente centrifugar para ser processado no

equipamento. Quando é pedido a densidade e o pH esta determinação é efetuada recorrendo a

tiras de teste de análise de urina tipo II.

Diversos parâmetros bioquímicos são doseados no Dimension® EXLTM with LM

(Figura 3) com o objetivo de auxiliar o médico no diagnóstico e prognóstico de determinada

patologia ou condição clínica.

1 Geralmente, o pedido do citoquímico vem sempre acompanhado do exame citológico (líquido colhido em tubo contendo

como anticoagulante o EDTA), em que após a contagem de células pelo analisar automático, proceder-se à montagem da

câmara de Nageotte para contagem dos leucócitos, com contagem diferencial entre células polimorfonucleares e

mononucleares, assim como efetuar uma avaliação semi-quantitativa dos eritrócitos.

Figura 3. Dimension® EXLTM with LM, da Siemens.



Leticia de Bastos

45

7.1.1. Avaliação do Ionograma

A função dos eletrólitos no corpo humano é múltipla, sendo que quase todos os

processos metabólicos são dependentes dos eletrólitos ou afetados por eles. O aporte destes

eletrólitos no organismo é feito através da dieta [5].

Os iões de cloretos (Cl-) e sódio (Na+) são os principais iões extracelulares, sendo

responsáveis pela osmolalidade do plasma e desempenham um papel fundamental na

manutenção da distribuição da água e da pressão osmótica no compartimento líquido

extracelular [5]. A hiponatrémia leva a convulsões, letargia, desorientação, edema pulmonar,

cefaleias, coma ou até mesmo à morte. A hipernatrémia pode levar à agitação, espasmos

musculares, letargia e irritação [6].

Os iões de potássio (K+) são os principais catiões intracelulares, sendo responsáveis por

manter o equilíbrio da água, em conjunto com o sódio, regular processos metabólicos e

excitabilidade muscular. A hipocaliémia leva a fraqueza muscular, diminuição dos reflexos e

arritmias cardíacas. A hipercaliémia pode levar a confusão mental, fraqueza, dormência,

formigueiro nas extremidades, fraqueza muscular e paragem cardíaca [5].

Diferentes causas podem estar na origem das alterações hidro-eletrolíticas, sendo que

algumas delas encontram-se apresentadas na Tabela 2.

Amostra: Soro, plasma heparinizado2 ou urina [7].

Método: Potenciometria.

Existem 3 elétrodos incorporados no Multisensor Integrado QuikLYTE® que são

seletivos para os iões de sódio, potássio e cloro, para além do elétrodo de referência. Depois

de uma amostra ser posicionada no sensor, os iões estabelecem um equilíbrio com a superfície

do elétrodo. É gerado um potencial que é proporcional ao logaritmo da atividade da substância

a analisar na amostra, que é comparado com o potencial gerado numa solução padrão. A

concentração dos iões é calculada com recurso à Equação de Nernst [7].

2 Heparina é um anticoagulante. Ativa (co-fator) a antitrombina III que exerce ação anticoagulante, principalmente pela inibição

da trombina (fator IIa) mas também dos fatores IXa, Xa, XIa e XIIa, impedindo a formação da rede de fibrina.




Intervalo de Medição Analítica: Soro:Na+: 50-200mmol/L, K+: 1.0-10.0mmol/L, Cl-:

50-200mmol/L; Urina: Na+: 5-300mmol/24H, K+: 1.0-300mmol/24H, Cl-: 10-330mmol/24H[7]

Valores de Referência: Soro: Na+: 136-145mmol/L, K+: 3.5 -5.1mmol/L, Cl-: 98-

107mmol/L; Urina: Na+: 40-220mmol/24H; K+: 25-125mmol/24H, Cl-: 110-250mmol/24H

Tabela 2. Causa do aumento e da diminuição dos eletrólitos no soro (Adaptado de [5]).

Eletrólitos Aumento Diminuição

Sódio

Desidratação

Níveis diminuídos de ADH

Produção excessiva de mineralocorticóides

Infusão intravenosa de Na+

Ingestão excessiva de sal sem entrada de

água

Insuficiência renal

Hiperaldosteronismo

Queimaduras

Diurese osmótica

Ingestão diminuída

Perdas gastrointestinais

Sudação excessiva

Insuficiência de mineralocorticóides

Hipoaldosteronismo

Acetoacidose diabética

Acidose tubular renal

Insuficiência cardíaca


Hipoalbunimémia

Níveis aumentados de ADH

Administração excessiva de água

Potássio

Infusão intravenosas de K+

Desidratação

Rabdomiólise

Queimaduras graves


Hemorragias

Acidose metabólica

Défice de mineralocorticóides

Diuréticos

Ingestão diminuída

Perdas gastrointestinais

Perdas renais

Alcalose metabólica

Incorporação celular

Doença hepática

Insuficiência cardíaca

Queimaduras

Diurese osmótica

Cloro

Desidratação

Insuficiência renal aguda

Acidose metabólica

Diabetes insipidus

Nefropatia

Perdas intestinais de bicarbonato

Insuficiência adrenal

Alcalose metabólica

ADH hormona anti-diurética (do inglês anti-diuretic hormone)



Leticia de Bastos

47

7.1.2. Avaliação do Metabolismo do Ferro

O ferro é um elemento fundamental e vital para o bom funcionamento do organismo. O

tecido com maior necessidade de aporte em ferro é a medula óssea para a síntese de

hemoglobina, sendo este aporte garantido pela dieta [8]. O ferro que não é utilizado é

armazenado nas formas de ferritina e hemossiderina [9]. Porém, capacidade de armazenamento

é limitada e em excesso torna se tóxico para o organismo [8].

A transferrina é fundamental para o transporte do ferro para os locais de armazenamento

(células do sistema reticuloendotelial do fígado, baço e medula óssea) e para as células que

sintetizam compostos contendo ferro, tais como hemoglobina, mioglobina e citocromo. Esta

glicoproteína é produzida no fígado, sendo os seus níveis plasmáticos influenciados pela

disponibilidade de ferro. A carência de ferro leva a um aumento da sua síntese [10].

Os níveis de ferritina circulante refletem com exatidão os níveis de ferro que se

encontram armazenados no organismo e são úteis em situações de suspeita de deficiência ou

sobrecarga de ferro [9]. É um indicador precoce, manifestando alterações antes da diminuição

dos níveis séricos de ferro e do aparecimento de anomalias morfológicas nos eritrócitos [11].

Existe um forte mecanismo homeostáticos, no entanto podem surgir distúrbios do

metabolismo do ferro que levam a situações patológicas, das quais de destacam a anemia

ferropénica, anemia da doença crónica [12], hemossiderose, hemocromatose, anemia

sideroblástica [11], anemia hemolítica e necrose hepática aguda (por libertação aumentada do

ferro armazenado) [13].

Na anemia ferropénica verifica-se uma diminuição dos níveis plasmáticos de ferro

resultante da depleção das reservas, podendo ser consequência de deficiências nutricionais,

perdas sanguíneas ou problemas de absorção [12].

Frequentemente, as doenças infeciosas, inflamatórias, traumáticas, neoplásicas ou com

comprometimento hepático, são acompanhadas por uma anemia leve a moderada, com

diminuição dos níveis plasmáticos de ferro e níveis normais ou ligeiramente aumentados de

ferritina, denominada de anemia de doença crónica, causada pela resposta de fase aguda

associada à inflamação crónica [12].




Ferritina

Amostra: Soro ou plasma heparinizado [14].

Método: Imunoensaio enzimático.

A amostra é incubada com partículas de dióxido de crómio revestidas com anticorpos

monoclonais específicos para a ferritina (FERR) e com um conjugado (β-galactosidase marcada

com anticorpo monoclonal específico para um segundo local de ligação na ferritina). O que não

se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com um substrato cromogénico, o

vermelho de clorofenol-β-D-galactopiranosido (CPRG, do inglês chlorophenol red-β-D-

galactopyranoside). A hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o vermelho de clorofenol

(CPR, do inglês chlorophenol red). A concentração de ferritina é diretamente proporcional à

taxa de variação de cor devido à formação de CPR medida a 577/700nm [14].

Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000ng/mL [14]

Valores de Referência: Mulher: 8 – 252ng/mL [µg/L]; Homem: 26 – 388ng/mL

[µg/L]; Combinadas: 8 – 388ng/mL [µg/L]

Ferro




Leticia de Bastos

49

Método: Adaptação do método desenvolvido por Smith et al. utilizando o cromóforo

Ferene®3, que possui uma elevada sensibilidade para a determinação do ferro. A potencial

interferência do cobre é minimizada pela adição de tioureia.

Em condições ácidas, o ferro férrico (Fe3+) ligado à transferrina é libertado. Na presença

do agente redutor, ácido ascórbico, o Fe3+ é reduzido para ferro ferroso (Fe2+). O Fe2+ forma

um complexo azul com o sal dissódico do àcido 5,5’(3-(2-piridil)-1,2,4-triazina-5,6-diil)-bis-2-

furano-sulfónico (Ferene®). A absorvência do complexo é medida por uma técnica bicromática

de ponto final (600, 700nm) sendo diretamente proporcional à concentração do ferro presente

na amostra [13].

Intervalo de Medição Analítica: 5 – 1000µg/dL [0.9 – 179.0µmol/L] [13]

Valores de Referência: Homens: 65 – 175µg/dL [11.6 – 31.3µmol/L]; Mulheres: 50 –

170µg/dL [9.0 – 30.4µmol/L]

Transferrina


Método: Turbidimétrico.

A transferrina liga-se a anticorpo policlonal levando à formação de imunocomplexos. A

adição de polietilenoglicol (PEG) que acelera a sua formação. O aumento da turvação é

proporcional à concentração de transferrina, medida através de uma técnica bicromática de

ponto final (340, 700nm) [15].

3 Ferene® é uma marca registada da Diagnostic Chemicals, LTD., Charlottetown, P.E.I, Canada C1A4H5.




Intervalo de Medição Analítica: 40 – 750mg/dL [0.40 – 7.50g/L] [15]

Valores de Referência: 202 – 364mg/dL [2.02 – 3.64g/L]

7.1.3. Avaliação da Função Cardíaca

O enfarte agudo do miocárdio (EAM) é uma das principais causas de morte e de

incapacidade em todo o mundo, sendo a sua deteção precoce crucial. A nível laboratorial define-

se com a subida e/ou descida do biomarcador cardíaco (de preferência troponina, ou como

alternativa a isoenzima MB da creatina cinase - CKMB), pelo menos um valor acima do

percentil 99 do Limite Superior de Referência [16].

No entanto, existem outros marcadores bioquímicos cardíacos e o conhecimento da sua

cinética tem grande importância não só para auxiliar no diagnóstico, como na estratificação do

risco, prognóstico, monitorização do doente, mostrando a extensão e comprometimento

cardíaco.

A mioglobina é uma proteína heme encontrada no músculo cardíaco e esquelético sendo

libertada para a circulação quando ocorre lesão celular. Na ausência de traumatismos do

músculo esquelético ou de outros fatores que levam a um aumento de mioglobina circulante de

origem não cardiaca, a sua determinação é utilizada como um marcador precoce de EAM

(Tabela 3) [17].

A CKMB encontra-se essencialmente ao nível do músculo cardíaco e em concentrações

substancialmente mais baixas no músculo esquelético. Esta isoenzima para além de ser um

biomarcador de eleição para o perioperatório de EAM nas primeiras 48h, a sua determinação

também tem sido utilizada para avaliar a extensão do enfarte e reenfartes subsequentes,

apresentando uma boa sensibilidade, especificidade e eficiência para o diagnóstico (Tabela 3)

[18].



Leticia de Bastos

51

O complexo da troponina é constituído por três componentes polipeptídicos distintos: a

troponina C, troponina I e a troponina T, que desempenham um papel essencial na contração

do musculo estriado. O doseamento da troponina I pode ser utilizada como auxiliar no

diagnóstico de EAM e na estratificação de risco em doentes com síndrome coronário agudo

relativamente ao risco relativo de mortalidade. Também está aumentada em traumatismos no

peito, cirurgia, insuficiência cardíaca congestiva (ICC), insuficiência renal, toxicidade cardíaca

provocada por fármacos, miocardite, embolismo pulmonar, doenças infiltrativas e doenças

neurológicas agudas. Este biomarcador é mais específico do que a CKMB para a deteção de

lesões do miocárdio na presença de lesões do músculo esquelético (Tabela 3) [19].

Os péptidos natriuréticos cerebrais (BNP, do inglês Brain natriuretic peptide) têm

propriedades natriuréticas, diuréticas e também são eficazes no controlo do funcionamento do

sistema cardiovascular. O proBNP é segregado principalmente ao nível do ventrículo esquerdo,

que posteriormente se dissocia em BNP (fisiologicamente ativo), e no fragmento N-terminal

proBNP (NT-proBNP), que pode ser utilizado para fins de diagnóstico, prognóstico e

estratificação do risco em doentes com síndromes coronários agudos e insuficiência cardíaca.

A determinação do NT-proBNP ajuda a identificar indivíduos com disfunção no ventrículo

esquerdo, que pode ocorrer devido a uma doença coronária, hipertensão arterial, doença

valvular e doença primária do miocárdio, insuficiência cardíaca crónica. Nestes casos, ambas

as concentrações de BNP e NT-proBNP aumentam. Também se verifica um aumento dos níveis

de NT-proBNP em doentes com angina instável e após EAM [20].

Tabela 3. Marcadores bioquímicos após situação de EAM sem complicações (Adaptado

de [17-19]).

EAM: enfarte agudo do miocárdio; CKMB: isoenzima MB da creatina cinase.

Marcadores

Bioquímicos

Aumento após a

EAM Pico

Regresso aos Valores

Basais

Mioglobina 1-3h 6-12h 24-36h

CKMB 4-8h 12-24h 48h

Troponina I 4-8h 12-16h 5-9 dias




Mioglobina




monoclonais específicos para a mioglobina (MYO), formando um complexo partícula/MYO.

O que não se ligou é removido. Posteriormente, o complexo é incubado com o conjugado

(anticorpos monoclonais específicos para a MYO marcados com β-galactosidase). O que não

se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico

CPRG. A hidrólise do substrato liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de MYO

presente na amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação

do CPR, medida a 577nm [17].

Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000 ng/mL [µg/L] [17]

Valores de Referência: Homem 16 – 96 ng/mL [µg/L]; Mulher 9 – 82 ng/mL [µg/L]

Isoenzima MB da Creatina Cinase

Amostra: Soro, plasma EDTA4 (ácido etilenodiaminotetracético) ou heparinizado [18].


4 Anticoagulante EDTA K3 é um quelante de cálcio ionizado (Ca2+). O facto de deixar de haver cálcio disponível para a cascata

da coagulação, leva a que o sangue não coagule. Assegura a conservação das células até 24h após a colheita, a 4ºC, e a sua

morfologia até 2h após a colheita.



Leticia de Bastos

53


monoclonais específicos para a subunidade CKMB e um conjugado (anticorpos monoclonais

específicos para a isoenzima CKMB marcados com β-galactosidase). O que não se ligou é

removido. A β-galactosidase ligada é combinada com o substrato cromogénico CPRG. A

hidrólise do CPRG liberta um cromóforo, o CPR. A concentração de CKMB presente na

amostra é diretamente proporcional à taxa de alteração de cor devido à formação do CPR,

medido a 577nm [18].

Intervalo de Medição Analítica: 0.5 – 300ng/mL [µg/L] [18]

Valores de Referência: 0.00 – 3.6ng/mL

Troponina I Cardíaca


Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®5.

Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti-

troponina I e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads que contém esferas revestidas

com estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas

revestidas com um anticorpo monoclonal anti-troponina I e um corante quimioluminescente.

A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo biotinilado formando uma uma

sandwich esfera/troponina I/anticorpo biotinilado. Posteriormente, o reagente Sensibeads é

adicionado e liga-se à biotina formando imunocomplexos. A iluminação do complexo a 680nm

produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para o

5 LOCI®: Imunoensaio luminescente de canalização de oxigénio, do inglês Luminescent oxygen channeling immunoassay.




reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é

medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração da troponina I presente na

amostra [19].

Intervalo de Medição Analítica: 0.017 – 40ng/mL [µg/L] [19]

Valores de Referência: 0.000 – 0,056ng/mL [µg/L]

N-terminal pro-péptido natriurético cerebral

Amostra: Soro ou plasma EDTA ou heparinizado [20].

Método: Imunoensaio quimioluminescente, baseado na tecnologia LOCI®.

Os reagentes LOCI® incluem um fragmento de anticorpo monoclonal biotinilado anti-

NT-proBNP e dois reagentes sintéticos: o reagente Sensibeads contém esferas revestidas com

estreptavidina e um corante fotossensível, e o reagente Chemibeads que contém esferas

revestidas com um anticorpo específico para um segundo epítopo no NT-proBNP e um corante

quimioluminescente. A amostra é incubada com o reagente Chemibeads e o anticorpo

biotinilado para formar uma sandwich esfera/NTP/anticorpo biotinilado. O Sensibeads é

adicionado e liga-se à biotina para formar imunocomplexos. A iluminação do complexo a

680nm produz singletos de oxigénio, proveniente do reagente Sensibeads, que se difunde para

o reagente Chemibeads e desencadeia uma reação quimioluminescente. O sinal resultante é

medido a 612nm, sendo diretamente proporcional à concentração de NT-proBNP na amostra

[20].

Intervalo de Medição Analítica: 5 – 35000pg/mL [20]

Valores de Referência: 0 – 125pg/mL



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55

7.1.4. Avaliação da Função Renal

O rim é responsável pela formação de urina, regulação do equilíbrio hidro-eletrolítico e

ácido-base, excreção de produtos do metabolismo, assim como também é responsável pela

produção de hormonas e de vitamina D [21].

A ureia, creatinina e o ácido úrico são compostos azotados não proteicos e são

considerados marcadores endógenos mais frequentemente utilizados na avaliação da função

renal e na discriminação entre alterações pré-renal, pós-renal ou renais [22].

A ureia, por vezes referida como BUN (Blood Urea Nitrogen), constitui o principal

produto do catabolismo oxidativo proteico, responsável pela excreção de mais de 75% do azoto

não proteico. No figado, as proteínas são degradadas a aminoácidos que sofrem reação de

desaminação, formando amónia, que é rapidamente convertida a ureia (ciclo da ureia), para

evitar a toxicidade, sendo posteriormente transportada no sangue até aos rins onde é filtrada

livremente pelo glomérulo. Em condições normais, 40 a 50% é reabsorvida ao nível do túbulo

proximal [22].

Uma ampla variedade de doenças renais e fatores não-renais podem levar ao aumento

dos níveis de ureia em circulação, limitando a sua utilização como indicador da função renal.

A sua concentração no sangue é condicionada pela função e perfusão sanguínea renal, fluxo

urinário, distúrbios pós-renais, assim como pelo teor proteico da dieta, catabolismo proteico,

hemorragia gastro-intestinal, estado de hidratação, jejum prolongado e lesão hepática grave [22].

A creatinina, marcador clássico do volume de filtração glomerular, resulta da

degradação não enzimática da creatina no músculo. A quantidade de creatinina endógena

produzida é proporcional à massa muscular, por isso varia em função da idade e do sexo, não

sofrendo grandes alterações com a dieta. A sua taxa de excreção, na ausência de doença renal

ou pós-renal, é relativamente constante, correlacionando-se com a produção endógena. É

filtrada pelo glomerulo e praticamente não é reabsorvida pelos túbulos renais, contudo, a sua

concentração também depende da secreção tubular proximal (7- 10%) [22]. A nível sérico, a

concentração de creatinina só se altera quando a função renal apresenta uma redução de pelo

menos 30% do volume de filtração glomerular [23], sendo por isso considerado um parâmetro

mais estável e especifico do que a ureia na avaliação da função renal [24].




O ácido úrico é sintetizado no fígado, e constitui o produto final do metabolismo das

purinas, e a excreção é feita ao nível dos rins, sendo excretada apenas 6-12% da quantidade

filtrada. Em líquidos corporais supersaturados, o urato monossódico precipita e deposita-se nas

articulações e tecidos, sendo responsável pelo aparecimento de sinais e sintomas clínicos. A

deposição de cristais de urato pode levar ao aparecimento de artrite gotosa, nefrolitíase,

deposição intratubular aguda de cristais de urato ou nefropatia gotosa [22].

A hiperuricémia pode ser atribuída a defeitos enzimáticos específicos na via do

metabolismo das purinas (embora seja raro), doença renal, síndrome mieloproliferativo e

terapêuticas citotóxicas. A hipouricémia, pode ser secundária a doença hepatocelular grave,

defeitos na reabsorção tubular renal e tratamento para a hiperuricémia [22].

Ureia

Amostra: Soro, plasma ou urina [25].

Método: Enzimático.

A urease hidrolisa a ureia com formação de amónia e dióxido de carbono. A amónia é

utilizada pela enzima glutamato desidrogenase (GLDH) para aminar por redução o α-

cetoglutarato (α-KG), com oxidação simultânea da forma reduzida da nicotinamida adenina

dinucleótido (NADH). A redução da absorvência, pelo desaparecimento da NADH, é

diretamente proporcional à concentração de ureia na amostra, medida utilizando uma técnica

cinética bicromática (340, 383nm) [25].

Intervalo de Medição Analítica: 0 – 150mg/mL [0 – 53.5mmol/L] [25]

Valores de Referência: Soro: 7 – 18mg/dL [2.5 – 6.4mmol/L]; Urina: 7 – 20g/24h [249

– 714mmol/24h]



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57

Creatinina


Método: Técnica cinética de Jaffé modificada.

Na presença de NaOH, o picrato reage com a creatinina para formar um cromóforo

vermelho. O aumento da absorvência, causada pela formação deste cromóforo, é diretamente

proporcional à concentração de creatinina na amostra, medida utilizando uma técnica cinética

bicromática (510, 600nm). A bilirrubina é oxidada pelo ferricianeto de potássio para evitar

interferências [24].

Intervalo de Medição Analítica: Soro ou plasma: 0.15 – 20.00mg/dL [13 –

1768µmol/L]; Urina: 5.00 – 400.00mg/dL [442 – 35360µmol/L] [24]

Valores de Referência: Soro ou plasma: Homens: 0.70 – 1.30mg/dL [62 – 115µmol/L];

Mulheres: 0.55 – 1.02mg/dL [49 – 90µmol/L]; Urina: Homens: 0.95 – 2.49g/24h [8.4 –

22.0mmol/24h]; Mulheres: 0.60 – 1.80g/24h [5.3 – 15.9mmol/24h]

Ácido Úrico

Amostra: Soro, plasma ou urina [26].

Método: Método da uricase modificado.

O ácido úrico que absorve a 293nm é convertido pela uricase em alantoína, que não

absorve neste comprimento de onda. A diminuição da absorvência é diretamente proporcional

à concentração de ácido úrico presente na amostra, medida utilizando uma técnica bicromática

de ponto final (293, 700nm) [26].




Intervalo de Medição Analítica: 0 – 20.0mg/dL [0 – 1190µmol/L] [26]

Valores de Referência: Soro: Mulher 2.6 – 6.0mg/dL [155 – 357µmol/L]; Homem 3.5

– 7.2mg/dL [208 – 428µmol/L]; Urina: 150 – 990mg/24h [0.89 – 5.89mmol/24h]

7.1.5. Avaliação da Função Pancreática

O pâncreas é uma glândula composta por tecido endócrino, responsável pela produção

de hormonas envolvidas no metabolismo dos hidratos de carbono e tecido exócrino que produz

suco pancreático e muitas enzimas digestivas, nomeadamente -amilase e lipase [27].

A lipase, sintetizada essencialmente no pâncreas, também pode ser secretada pela

língua, mucosa gástrica, pulmonar e intestinal. A sua determinação é utilizada no diagnóstico

de distúrbios pancreáticos como, por exemplo, pancreatite aguda e crónica, alterações intra-

abdominais agudas, obstrução do canal pancreático e neoplasia pancreática [28].

A amilase é secretada, fundamentalmente, pelas glândulas salivares e pelo pâncreas.

A sua determinação é principalmente utilizada para o diagnóstico e avaliação do tratamento de

pancreatite aguda e crónica, abcesso pancreático, lesões traumáticas e carcinoma pancreático.

No entanto, também pode apresentar valores elevados em patologias não-pancreáticas,

designadamente na insuficiência renal, tumor pulmonar, derrame pleural, apendicite, peritonite

e doenças das glândulas salivares [28].

Lipase


Método: Adaptação do método colorimétrico descrito por Neumann et al.



Leticia de Bastos

59

Este método utiliza como substrato o éster de 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-ácido

glutárico-(6'-metilresorufina) que é hidrolisado pela lipase em pH alcalino, na presença de

colipase, sais biliares e cloreto de cálcio, produzindo 1,2-O-dilauril-rac-glicerol e éster de ácido

glutárico-6'-metilresorufina. O éster de ácido glutárico-6'-metilresorufina fragmenta-se e

produz metilresorufina, um composto cromogénico livre que é proporcional à atividade da

lipase na amostra. A taxa de produção de metilresorufina é medida por uma técnica cinética

bicromática (577, 700nm) [30].

Intervalo de Medição Analítica: 10 -1500U/L [30]

Valores de Referência: 73 – 393U/L

Alfa-amilase

Amostra: Soro, plasma heparinizado ou urina [31].


A α-amilase catalisa a hidrólise de um substrato sintético, o 2-cloro-4-nitrofenil-a-D-

maltotriósido (CNPG3), para produzir 2-cloro-4-nitrofenol (CNP), 2-cloro-4-nitrofenil-α-D-

maltósido (CNPG2), maltotriose (G3) e glicose. Após uma incubação a 37°C, a formação do

CNP é proporcional à atividade da amilase, medida utilizando uma técnica cinética bicromática

(405, 577nm) [31].

Intervalo de Medição Analítica: 0 – 650U/L [31]

Valores de Referência (37ºC): Soro: 25 – 115U/L; Urina: 59 – 401U/24h




7.1.6. Avaliação da Função Hepática

O fígado é um órgão complexo com grande capacidade funcional e de regeneração

celular. Desempenha um papel fundamental no metabolismo, síntese de proteínas plasmáticas

(exceto imunoglobulinas), armazenamento de ferro, glicogénio, lípidos e vitaminas;

desintoxicação de xenobióticos e excreção de produtos metabólicos [32].

As análises laboratoriais para avaliação da função hepática são baseadas na avaliação

da síntese, de algumas funções de excretoras e na determinação da atividade das enzimas

hepáticas libertadas para a circulação [32].

As transaminases são enzimas intracelulares presentes em grandes quantidades nos

hepatócitos, embora amplamente distribuídas no organismo. A alanina aminotransferase (ALT

ou transaminase glutâmica-pirúvica, GPT) encontra-se principalmente ao nível do citoplasma,

enquanto que a aspartato aminotransferase (AST ou transaminase glutâmica-oxalacética, GOT)

possui duas isoenzimas, a citoplasmática e a mitocôndrial, sendo que a mitocôndrial apenas

surge em circulação quando a lesão hepática é mais grave. Assim quando a lesão hepática é

ligeira, a enzima libertada para o sangue é essencialmente a que está presente no citoplasma.

Deste modo, em situações agudas a razão de Ritis, AST/ALT é menor que 1 e em situações de

doença crónica esta razão é superior a 1 [33].

Observam-se elevações significativas das transaminases, por vezes mesmo antes do

aparecimento clínico da icterícia, nas doenças hepáticas como a hepatite, necrose, icterícia e

cirrose [34]. Também podem estar elevadas na mononucleose infeciosa, colestase extra-hepática

aguda, embolia pulmonar, pancreatite aguda [29]. A ALT apresenta uma maior atividade que a

AST na hepatite alcoólica, cirrose hepática, carcinoma hepático e consumo de certas drogas ou

fármacos [34].

A AST também pode estar aumentada noutras patologias, como EM, ICC, distrofias

musculares, dermatomiosite ou nas patologias do músculo esquelético [34].

A fosfatase alcalina (ALP, do inglês alkaline phosphatase) está presente em

praticamente todos os tecidos do organismo, especialmente ao nível das membranas celulares,

ocorrendo em níveis particularmente elevados ao nível do fígado, epitélio intestinal, túbulos



Leticia de Bastos

61

renais, osso (osteoblastos) e placenta. Contudo, as formas presentes em circulação têm origem

no sistema hepatobiliar e no esqueleto [35].

A ALP aumenta em resposta à obstrução biliar, uma vez que os principais locais de

síntese ocorrem nos hepatócitos adjacentes aos canalículos biliares. A elevação tende a ser mais

marcante nas obstruções extra-hepáticas do que na intra-hepáticas, e será tanto maior quanto

mais completa for a obstrução. Também se verifica um aumento moderado em situações de

hepatite viral. Relativamente às doenças ósseas, observam-se níveis elevados da atividade da

fosfatase alcalina na doença de Paget, síndrome de Fanconi, hiperparatiroidismo e cancros

ósseos. Verifica-se ainda um aumento fisiológico desta enzima no crescimento ósseo e na

gravidez [35].

A gama-glutamil transferase (GGT) está presente na membrana citoplasmática de todas

as células, exceto no músculo. No entanto, quando presente em circulação é essencialmente

proveniente do sistema hepatobiliar, apresentando valores elevados em todas as formas de

doença hepática, especialmente na obstrução biliar, sendo mais sensível que a fosfatase alcalina

em situações de icterícia obstrutiva, colangite e colecistite [36]. Também se observam valores

aumentados em situações de hepatite viral ou medicamentosa, pancreatite, corticoterapia e

metástase hepáticas [34].

Assim, o doseamento da GGT é útil para diferenciar causas de elevação da ALP,

apresentando valores normais na gravidez, crescimento e patologias de carácter ósseo [36].

A bilirrubina que resulta do catabolismo do grupo heme, cerca de 85% deriva da

hemoglobina e os restantes 15% são provenientes dos percursores dos eritrócitos, mioglobina,

citocromos e peroxidase [37]. O grupo heme é metabolizado no sistema reticuloendotelial, dando

origem à bilirrubina não conjugada (insolúvel em água). Esta é ligada à albumina e transportada

para o fígado onde é conjugada com ácido glucorónico. A bilirrubina conjugada (direta ou

hidrossolúvel) passa para os canalículos biliares sendo eliminada através do aparelho digestivo.

Uma parte é reabsorvida, voltando ao fígado, onde é excretada na bílis e a outra parte é filtrada

para a urina [32].

O doseamento das bilirrubinas é útil no diagnóstico diferencial, tratamento e

monitorização de doenças ou alterações hepatobiliares e colestáticas, doenças genéticas,




metabólicas e hemolíticas [38, 39]. Sendo também muito importante o seu doseamento na

avaliação da icterícia do recém-nascido.

A amónia, que resulta do catabolismo dos aminoácidos, em circunstâncias normais é

metabolizada em ureia por enzimas hepáticas. Contudo, várias doenças e distúrbios metabólicos

produzem um excesso de amónia, que tem efeitos tóxicos para o sistema nervoso central (SNC).

As deficiências hereditárias de enzimas do ciclo da ureia são a principal causa de

hiperamonémia em crianças. As causas adquiridas resultam frequentemente de insuficiência

hepática ou renal e síndrome de Reye [40].

Aspartato Aminotransferase

Amostra: Soro ou plasma [41].

Método: Adaptação da metodologia recomendada pela Federação Internacional de

Química Clínica (IFCC, do inglês International Federation of Clinical Chemistry).

A AST catalisa a transaminação do L-aspartato em α-cetoglutarato, formando L-

glutamato e oxalacetato. O oxalacetato é reduzido para malato pela malato desidrogenase

(MDH) com oxidação simultânea da forma reduzida do NADH. A redução da absorvência

devida à conversão de NADH em NAD+, é diretamente proporcional à atividade da AST,

medida utilizando uma técnica cinética bicromática (340, 700nm) [41].


Valores de Referência: 15-37U/L



Leticia de Bastos

63

Alanina Aminotransferase


Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC. Este método utiliza o

piridoxal-5-fosfato (P5P) como ativador enzimático.

A ALT catalisa a transaminação de L-alanina em α-KG, formando L-glutamato e

piruvato. O piruvato formado é reduzido para lactato pela desidrogenase láctica (LDH, do inglês

lactate dehydrogenase) com oxidação simultânea da forma reduzida do NADH. A redução da

absorvência é diretamente proporcional à atividade da ALT, medida utilizando uma técnica

cinética bicromática (340, 700nm) [42].

Intervalo de Medição Analítica: 6 – 1000U/L [0.10 – 16.70µkat/L] [42]

Valores de Referência: Mulheres: 14 – 59U/L [0.24 – 0.99µkat/L]; Homens: 16 –

63U/L [0.27 – 1.05µkat/L]

Fosfatase Alcalina


Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37ºC.

A ALP catalisa a transfosforilação do p-nitrofenilfosfato (p-NPP) em p-nitrofenol (p-

NP), na presença do tampão transfosforilante, 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). A reação é

melhorada com a utilização de iões de magnésio e zinco. A variação da absorvência pela

formação de p-NP é diretamente proporcional à atividade da ALP, sendo medida utilizando

uma técnica cinética bicromática (405, 510nm) [43].




Intervalo de Medição Analítica: 10 – 1000U/L [0.17 – 16.70µkat/L]

Valores de Referência: 46 – 116U/L [0.77 – 1.90µkat/L]

Gama-Glutamil Transferase


Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC.

A GGT catalisa a transferência da glutamil da γ-glutamil-3-carboxi-4-nitranilida

(GCNA) para a glicilglicina, com libertação do 5-amino-2-nitrobenzoato, medido utilizando

uma técnica de cinética bicromática (405, 600nm), sendo proporcional à atividade da GGT [44].


Valores de Referência: Mulheres 5 – 55U/L; Homens 15 – 85U/L

Bilirrubina Total

Amostra: Soro, plasma EDTA ou heparinizado [38].

Método: Adaptação do método diazo, descrito por Jendrassik e Grof.

A bilirrubina (não conjugada) na amostra é solubilizada por diluição numa mistura de

cafeína/benzoato/acetato/EDTA. Com a adição de ácido sulfanílico diazotado, a bilirrubina

solubilizada, incluindo a bilirrubina conjugada, é convertida em diazo-bilirrubina, um

cromóforo vermelho, medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540, 700nm),



Leticia de Bastos

65

que é proporcional à concentração de bilirrubina total presente na amostra. Nesta técnica é

utilizado um branco de amostra para eliminar a interferência de outros pigmentos que não a

bilirrubina [38].

Intervalo de Medição Analítica: 0.1 – 25.0mg/dL [2 – 428µmol/L] [38]

Valores de Referência: 0.2 – 1.0mg/dL [3 – 17µmol/L]

Bilirrubina Direta


Método: Adaptação do método diazo, descrito por Jendrassik e Grof.

A amostra é diluída em HCl 0.5M. É efetuada uma leitura de um branco de amostra para

eliminar a interferência de outros pigmentos que não a bilirrubina. Com a adição de ácido

sulfanílico diazotado, a bilirrubina conjugada é convertida em diazo-bilirrubina, um cromóforo

vermelho, medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540, 700nm), que é

proporcional à concentração de bilirrubina direta presente na amostra [39].

Intervalo de Medição Analítica: 0. 05 – 16.0mg/dL [0.86 – 274µmol/L] [39]

Valores de Referência: 0.0 – 0.2mg/dL [0 – 3µmol/L]




Amónia

Amostra: Plasma EDTA ou heparinizado. O tubo deve ser conservado em gelo e

centrifugado de imediato, devendo ser analisada no espaço de 30 minutos após a centrifugação.

Se o plasma for separado e refrigerado (2-8°C), permanece estável 2h [45].


A amónia (NH4+) reage com α-cetoglutarato e o cofactor reduzido, que na presença da

GLDH irá formar L-glutamato e o cofactor oxidado. A diminuição da absorvência pela

oxidação do cofactor é monitorizada a 340/700nm, sendo proporcional à concentração de

amónia presente na amostra [45].

Intervalo de Medição Analítica: 17 – 1277μg/dL [10 – 750μmol/L] [45]

Valores de Referência: 19 – 54μg/dL [11 – 32μmol/L]

7.1.7. Avaliação da Glicémia

As medições de glucose são utilizadas no diagnóstico e tratamento de distúrbios do

metabolismo dos hidratos de carbono, tais como a diabetes mellitus, gestacional,

endocrinopatias diversas, diabetes induzida por químicos ou fármacos, hipoglicémia neonatal

e o insulinoma [46].

A causa mais frequente de hiperglicémia é a diabetes mellitus, originada pelo défice de

secreção ou da ação da insulina. Outros fatores secundários podem contribuir para a existência

de níveis altos de glicose, como a pancreatite, disfunção da tiroide, a insuficiência renal e

hepatopatias [46].



Leticia de Bastos

67

Relativamente à hipoglicémia, pode surgir por um jejum prolongado, ou ser secundária

a outras patologias, tais como o insulinoma, deficiências enzimáticas congénitas ou hormomais,

disfunção hepática severa, falência renal crónica ou induzida pelo excesso de insulina.

A determinação da glucose na urina (glicosúria), pode ser utilizado para o despiste e/ou

monitorização da diabetes mellitus e para detetar defeitos tubulares renais [47].

Amostra: Soro, plasma, urina e LCR [47].

Método: Adaptação do método da hexoquinase.

A hexocinase (HK) catalisa a fosforilação da glucose na presença de adenosina trifosfato

(ATP) e magnésio, formando glicose-6-fosfato e adenosina difosfato (ADP). A glicose-6-

fosfato é então oxidada pela glucose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH) na presença de NAD+

para produzir 6-fosfogliconato e NADH. A absorvência é determinada utilizando uma técnica

bicromática de ponto final (340, 383nm). A quantidade de NADH produzida é diretamente

proporcional à quantidade de glucose presente na amostra [47].

Intervalo de Medição Analítica: 0 – 500mg/dL [0 – 27.8mmol/L] [47]

Valores de Referência: Soro: 74 – 106mg/dL [4.1 – 5.9mmol/L]; LCR: 40 – 70mg/dL

[2.2 – 3.9mmol/L]; Urina tipo II: 1 – 15mg/dL [0.1 – 0.8mmol/L]; Urina: <0.5 g/24h [<

2.8mmol/24h]

7.1.8. Avaliação do Metabolismo Lipídico

Os lípidos e as lipoproteínas em circulação têm sido fortemente associados a doença

coronária, distúrbios associados ao metabolismo lipídico e aterosclerose [48]. Deste modo, é

fundamental efetuar-se o diagnóstico da dislipidémia, através da análise do colesterol total,

triglicéridos, colesterol das lipoproteínas de alta densidade (HDL, do inglês high density




lipoprotein) e colesterol das lipoproteínas de baixa densidade (LDL, do inglês low density

lipoprotein), após um jejum de 12h. Os resultados devem ser confirmados com uma segunda

determinação realizada com um intervalo de mínimo de 4 semanas e antes de se iniciar qualquer

terapêutica. As dislipidémias podem ser primárias, em que há uma interação entre uma

predisposição genética e fatores ambientais, ou secundária, isto é, relacionada com outras

doenças [49].

O colesterol é o principal componente das membranas celulares, mas também atua como

precursor de muitas moléculas sinalizadoras, incluindo hormonas esteroides e cortisol. Uma

parte é proveniente da dieta, mas a maioria é de síntese endógena. Na corrente sanguínea, é

transportado e solubilizado essencialmente por duas lipoproteínas, as HDL e as LDL [48]. A sua

concentração ao nível sérico depende de muitos fatores, tais como a idade, sexo, estilo de vida

e outras doenças existentes.

As HDL têm como principal função transportar o colesterol dos tecidos periféricos para

o fígado, onde é metabolizado, sendo considerado um mecanismo de proteção contra doenças

cardiovascular. A sua determinação é útil na identificação de doentes em risco de doença

aterosclerótica [48].

O colesterol das LDL fornece a principal fonte de substrato para a síntese de hormonas

esteroides, no entanto quando presente em níveis elevados ocorre a deposição de colesterol na

parede das artérias, podendo levar à aterosclerose [48].

A hipercolesterolémia familiar é a forma mais comum e a mais grave de todas as

hipercolesterolémias sendo causada maioritariamente por defeitos no gene do recetor das LDL,

cuja função é a remoção do colesterol-LDL do plasma. O diagnóstico é geralmente baseado

num conjunto de critérios clínicos, bioquímicos e na história familiar de hipercolesterolémia e

de doença cardiovascular prematura [49].

A hipercolesterolémia secundária pode ser causada por hipotiroidismo, síndrome

nefrótico, gravidez, síndrome de Cushing, anorexia nervosa, agentes imunossupressores e

terapêutica com corticosteroide [49].



Leticia de Bastos

69

Quanto aos triglicéridos, uma fração é obtida na dieta e outra é sintetizada pelo fígado,

circulando no organismo ligados as lipoproteínas [48]. A determinação de triglicéridos é útil no

diagnóstico de dislipidémias.

A hipertrigliceridémia pode ter origem genética (hipertrigliceridémia familiar), ou ser

secundária ao consumo de álcool, dieta rica em hidratos de carbono simples, obesidade, diabetes

mellitus, hipotiroidismo, doença renal, gravidez, doenças autoimunes e terapia com

corticosteroides, estrogénios (especialmente os administrados oralmente), ciclosporina e

antirretrovirais [49]. A avaliação dos triglicéridos deve ser feita em conjunto com o restante perfil

lipídico.

Colesterol Total



A esterase do colesterol (CE) catalisa a hidrólise dos ésteres de colesterol para produzir

colesterol livre que, juntamente com o colesterol livre pré-existente, é oxidado numa reação

catalisada pela colesterol oxidase (CO) para formar colest-4-eno-3-ona e peróxido de

hidrogénio. Na presença da peroxidase (HPO), o peróxido de hidrogénio irá oxidar a N,N-

dietilanilina-HCl/4-aminoantipirina (DEA-HCl/AAP), produzindo um cromóforo. A

absorvência é medida utilizando uma técnica policromática de ponto final (452, 540, 700nm),

sendo diretamente proporcional à concentração de colesterol total presente na amostra [50].

Intervalo de Medição Analítica: 50-600mg/dL [1.3 – 15.5mmol/L] [50]

Valores de Referência: Desejável <200mg/dL [5.2mmol/L]; Acima da média: 200-

239mg/dL [5.2 – 6.2mmol/L]; Elevado: ≥ 240mg/dL [6.2mmol/L]




Colesterol-HDL



Na primeira reação as quilomicras, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL, do

inglês very low density lipoprotein) e as LDL formam, na presença de sulfato de magnésio,

complexos hidrossolúveis com o sulfato de dextrano, tornando-os resistentes à ação das

enzimas colesterol esterase e colesterol oxidase modificadas pelo PEG, que reagem com o

colesterol-HDL. Na presença de oxigénio, o colesterol-HDL é oxidado pela com produção de

peróxido de hidrogénio. O peróxido de hidrogénio reage com a 4-aminoantipirina e a N-(2-

hidroxi-3-sulfopropil)-3.5-dimetoxianilina sódica (HSDA), que na presença de peroxidase irá

firmar um composto colorido que é medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final

(600, 700nm). A intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração sérica do

colesterol-HDL [51].

Intervalo de Medição Analítica: 3 – 150mg/dL [0.08 – 3.89 mmol/L] [51]

Valores de Referência: Colesterol-HDL baixo <40mg/dL [1.04mmol/L]; Colesterol-

HDL alto ≥60mg/dL [1.55mmol/L]



Leticia de Bastos

71

Colesterol-LDL

O colesterol-LDL é calculado pela Fórmula de Friedewald, se os triglicéridos forem

inferiores a 400 mg/dL:

Colesterol-LDL(mg/dL)= Colesterol Total – (colesterol-HDL+ 𝑇𝑟𝑖𝑔𝑙𝑖𝑐é𝑟𝑖𝑑𝑜𝑠

5 )

Para valores de Triglicéridos ≥400 mg/dL a fórmula não pode ser aplicada, pelo que tem

de ser efetuada a determinação laboratorial (efetuado no Laboratório Central).

Triglicéridos [52]



A amostra é incubada com um reagente enzimático, a lipoproteína lipase (LPL), que

converte os triglicéridos em glicerol livre e ácidos gordos. A glicerol cinase (GK) catalisa a

fosforilação do glicerol pela ATP para glicerol-3-fosfato. A glicerol-3-fosfato-oxidase (GPO)

oxida o glicerol-3-fosfato para fosfato de di-hidroxiacetona e peróxido de hidrogénio (H2O2).

A ação catalítica da peroxidase (POD) forma quinoneimina a partir de H2O2, aminoantipirina e

4-clorofenol. A variação da absorvência pela formação de quinoneimina é diretamente

proporcional à quantidade de glicerol presente na amostra, que corresponde ao teor de

triglicéridos. A absorvência é medida utilizando uma técnica bicromática de ponto final (510,

700nm) [52].

Intervalo de Medição Analítica: 15 – 1000mg/dL [0.17 – 11.3mmol/L] [52]




Valores de Referência: Normal <150mg/dL [< 1.70mmol/L]; Acima da linha limite

150 – 199mg/dL [1.70 – 2.25mmol/L]; Elevada 200 – 499mg/dl [2.26 – 5.64mmol/L]; Muito

alta ≥ 500mg/dL [≥ 5.65mmol/L]

7.1.9. Avaliação das Proteínas

As proteínas plasmáticas são sintetizadas sobretudo no fígado, células plasmáticas,

gânglios linfáticos, baço e medula óssea. O doseamento das proteínas totais no soro é utilizado

no diagnóstico e tratamento de diversas patologias que envolvem o fígado, rim ou medula óssea,

assim como perturbações metabólicas ou nutricionais [53].

A hipoproteinémia deve-se, essencialmente, à hemodiluição ou diminuição da

concentração de uma ou mais proteínas especificas no plasma. A hiperproteinémia ocorre em

casos de desidratação grave (hemoconcentração) ou por aumento da concentração de uma ou

mais proteínas especificas no plasma [54].

A determinação das proteínas totais na urina e no líquido cefalorraquidiano é utilizada

no diagnóstico e tratamento de doenças renais e do SNC, respetivamente [55].

A albumina, sintetizada pelo fígado, é a proteína presente em maior concentração no

plasma. Tem como principal função o transporte de diversos componentes, nomeadamente o

cálcio, ácidos gordos, bilirrubina, hormonas, vitaminas e fármacos. É igualmente importe na

manutenção da pressão osmótica coloidal [56].

A hipoalbuminémia pode dever-se a hiper-hidratação, reações de fase aguda,

analbuminémia congénita, doença renal, hepática, má nutrição ou dieta pobre em proteínas [57].

Proteínas Totais


Método: Adaptação do método do Biureto. Este método incorpora o tartarato como um

agente complexante para evitar a precipitação de Cu(OH)2.



Leticia de Bastos

73

O ião de cobre (Cu2+) reage com as ligações peptídicas da proteína, numa solução básica,

formando um complexo proteíco de cobre (II) azul que é proporcional à concentração de

proteína total na amostra, sendo medido utilizando uma técnica bicromática de ponto final (540,

700nm) [53].

Intervalo de Medição Analítica: 2.0 – 12.0g/dL [20 – 120g/L] [53]

Valores de Referência: 6.4 – 8.2g/dL [64 – 82g/L]

Proteínas Urinárias/Líquido Cefalorraquidiano [55]

Amostra: Urina e LCR [55].

Método: Adaptação do método vermelho de pirogalolmolibdato.

O vermelho de pirogalolmolibdato de sódio, que absorve a 470nm, reage com a proteína

presente na amostra, em solução ácida, formando um complexo azul arroxeado que absorve a

600nm e que é diretamente proporcional à concentração de proteína na amostra [55].

Intervalo de Medição Analítica: 6 – 250mg/dL [60 – 2500mg/L] [55]

Valores de Referência: Urina <11.9mg/dL, <149.1mg/dia [<119mg/L]; LCR 15 –

45mg/dL [150 – 450mg/L]

Albumina


Método: Adaptação do método púrpura de bromocresol (BCP).




Na presença de um agente solubilizante, o BCP liga-se com elevada especificidade à

albumina a um pH de 4.9. A formação do complexo é medida utilizando uma técnica

policromática de ponto final (600, 540, 700nm), sendo directamente proporcional à

concentração de albumina presente na amostra [57].

Intervalo de Medição Analítica: 0.6 – 8.0g/dL [6 – 80g/L] [57]

Valores de Referência: 3.4 – 5.0g/dL [34 – 50g/L]

7.1.10. Avaliação da Gonadotrofina Coriónica Humana

A gonadotrofina coriónica humana (hCG) é uma glicoproteína produzida pela placenta

imediatamente após a implantação de um óvulo fertilizado na parede uterina. A hCG no soro

começa a aumentar pouco tempo depois da conceção, tornando-a um excelente marcador para

a confirmação e monitorização da gravidez [58]. Fisiologicamente, a hCG é vital para a

manutenção e promoção da secreção de progesterona pelo corpo lúteo no início da gravidez e

na sustentação do endométrio [59].




monoclonais específicos para a subunidade α da hCG, formando imunocomplexos. Todo o que

não se ligou é removido. Posteriormente, os imunocomplexos são incubados com o conjugado

(anticorpos monoclonais específicos para a subunidade β da hCG marcados com β-

galactosidase). O conjugado que não se ligou é removido. A β-galactosidase ligada é combinada

com o substrato cromogénico CPRG que catalisa a hidrólise do substrato em CPR. A

absorvência é medida a 577/700nm, sendo diretamente proporcional à concentração de hCG na

amostra [60].



Leticia de Bastos

75

Intervalo de Medição Analítica: 1 – 1000mIU/mL [IU/L] [60]

Valores de Referência: Mulher não grávida (22-87anos): 0-6mIU/mL [IU/L]; Homem

adulto (19-83anos): 0-2mIU/mL [IU/L]. Na gravidez, aumenta rapidamente na primeira semana

de gestação, duplicando aproximadamente a cada dois dias, atingindo um nível máximo entre

as 10-12 semanas, seguindo-se uma diminuição lenta no terceiro trimestre [60].

7.1.11. Avaliação da Desidrogenase Láctica

A desidrogenase láctica também designada de lactato desidrogenase, está presente no

citoplasma de todas as células, sendo mais abundante no miocárdio, rins, fígado, músculo e

eritrócitos. Uma pequena de lesões nos tecidos pode levar ao aumento significativo da LDH no

soro [61].

A LDH apresenta valores muito aumentados na anemia megaloblástica, carcinoma

metastático, hepatite viral e hipoxia. Embora com valores mais baixos, também se encontra

elevada no EAM, miocardite, ICC, anemia hemolítica e das células falciformes, hepatite não

viral, linfoma, pancreatite aguda, cirrose, icterícia obstrutiva, doença renal, doenças músculo-

esqueléticas e doenças neoplásicas [61].


Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37°C.

Este método utiliza L-lactato tamponado a um pH de 9.4 como substrato. A LDH oxida

o substrato na presença de NAD+ para formar piruvato e NADH. A formação do NADH, medida

por uma recção de cinética a 340nm, é proporcional à atividade da lactato desidrogenase

presente na amostra [62].




Intervalo de Medição Analítica: 6 – 1000U/L [0.10 – 16.70μkat/L] [62]

Valores de Referência: Homens: 85 – 227U/L [1.42 – 3.7μkat/L]; Mulheres: 81 –

234U/L [1.35 – 3.91μkat/L]

7.1.12. Avaliação da Creatina-Cinase

A creatina cinase (CK) é um dímero composto por 2 subunidades: a B, de brain

(cérebro) e a M, de muscle (músculo). Podem existir 3 pares diferentes de subunidades: BB,

MB e MM, que correspondem, respetivamente, à CK1, CK2 e CK3, classificadas de acordo

com a mobilidade eletroforética. A CK1, predomina no cérebro, próstata, intestino, pulmão,

bexiga, útero, placenta e tiroide, a CK2 encontra-se essencialmente no músculo cardíaco e a

CK3 no musculo cardíaco e esquelético [63].

A atividade da CK total, no soro, está sujeita a uma gama de variações fisiológicas,

estando dependente da massa muscular do indivíduo. Apresenta valores aumentados após lesão

muscular, exercício físico extenuante, doenças músculo-esqueléticas, particularmente na

distrofia muscular, EAM, isquemia cerebral, doença vascular cerebral aguda e traumatismo

craniano [63]. A sua determinação é útil não só no diagnóstico, como na monitorização do

tratamento.


Método: Adaptação da metodologia recomendada pela IFCC, a 37°C.

A CK total, presente na amostra do doente, catalisa a transfosforilação do fosfato, do

fosfato de creatina para a ADP, produzindo ATP, que na presença de HK fosforila a glucose

levando à formação de glucose-6-fosfato, que será oxidada pela G-6-PDH, com a redução

simultânea da NADP+. A taxa de formação do NADPH é diretamente proporcional à atividade

da CK na amostra, medida bicromaticamente a 340 e 540nm [64].



Leticia de Bastos

77

Intervalo de Medição Analítica: 7 – 1000U/L [0.12 - 16.67μkat/L] [64]

Valores de Referência: Homens: 39 – 308U/L [0.65 – 5.1µkat/L]; Mulheres: 26 –

192U/L [0.43 – 3.19µkat/L]

7.1.13. Metabolismo Mineral-Ósseo

O osso é constituído por células e matriz extracelular, que contém componentes minerais

e orgânicos. O mineral é constituído essencialmente por cálcio e fosforo, enquanto que a matriz

orgânica é composta essencialmente por colagénio [65].

As concentrações de cálcio, fósforo e magnésio em circulação são dependentes do

equilíbrio entre a velocidade de deposição do mineral ósseo, reabsorção óssea, absorção

intestinal e depuração renal [65].

O cálcio encontra-se essencialmente em três compartimentos: osso, tecido mole e

líquido extracelular. Em circulação, o cálcio pode estar na forma livre, ligado a proteínas (80%

ligado à albumina e o restante associado às globulinas) ou complexado. A nível extracelular, é

útil para fornecer iões para a manutenção do cálcio intracelular, mineralização óssea,

coagulação, manutenção do potencial de membrana citoplasmática, contração muscular,

atividade enzimática e secreção hormonal. Uma diminuição do cálcio livre em circulação pode

levar a excitabilidade neuromuscular aumentada e tetania, enquanto que o aumento dos seus

níveis diminui a excitabilidade muscular [65].

O fósforo, na sua forma de fosfato inorgânico, encontra-se amplamente distribuído no

organismo. No osso desempenha um papel importante no apoio estrutural do corpo e no

fornecimento de fosfato para os meios intra e extracelulares, faz parte da constituição dos ácidos

nucleicos, membranas fosfolipídicas, fosfoproteínas, assim como da NADP+. Os níveis de

fosfato são críticos para a atividade de vários sistemas enzimáticos, assim como na transcrição

de genes e crescimento celular [65].




Relativamente ao magnésio, cerca de 55% encontra-se ao nível do esqueleto, 1% é

extracelular e o restante é intracelular. Do magnésio extracelular 55% encontra-se na forma

livre, 30% associado a proteínas (essencialmente à albumina) e 15% encontra-se complexado

[65].

O magnésio é fundamental para a atividade de muitas enzimas, no entanto também é

importante para a fosforilação oxidativa, glicólise, replicação celular, metabolismo nucleotídico

e biossíntese proteica. A nível extracelular fornece iões para a manutenção do magnésio

intracelular. A redução dos níveis de magnésio em circulação resulta no aumento da

excitabilidade neuromuscular, pois inibe competitivamente a entrada de cálcio para dentro dos

neurónios [65].

De um modo geral, a determinação do cálcio, fósforo inorgânico e magnésio é utilizada

no diagnóstico e tratamento de doença óssea, da paratiroide e renal. As causas do aumento e da

diminuição deste analítos, no soro, estão representados na tabela 4.

Cálcio Total [66]

Amostra: Soro ou urina [66].

Método: Modificação da reação do cálcio o-cresolftaleína complexona (OCPC). Este

método incorpora o 8-quinolinol para reduzir a interferência do magnésio e tampão de glicina

para controlo de pH.

O cálcio reage com a OCPC para formar um complexo de cor púrpura. A quantidade de

complexo formado é proporcional à concentração de cálcio, medido utilizando uma técnica

bicromática de ponto final (577, 540nm) [66].

Intervalo de Medição Analítica: 5.0 – 15.0mg/dL [1.25 – 3.75mmol/L] [66]



Leticia de Bastos

79

Valores de Referência: Soro: 8.5 – 10.1mg/dL [2.12 – 2.52mmol/L]; Urina: 42 –

353mg/24h [1.0 – 8.8mmol/24h]

Fósforo

Amostra: Soro, plasma EDTA, heparinizado ou urina [67].

Método: Modificação do método do fosfomolibdato.

O fósforo inorgânico (PO4-3) reage com molibdato de amónia na presença

de ácido sulfúrico para formar um complexo que é medido a 340nm. A quantidade de complexo

formado é proporcional à concentração de fósforo inorgânico presente na amostra [67].

Intervalo de Medição Analítica: Soro e plasma: 0.5 – 9.0mg/dL [0.16 – 2.91mmol/L];

Urina: 5.0 – 90.0mg/dL [1.61 – 29.07mmol/L] [67]

Valores de Referência: Soro e plasma: 2.6 – 4.7mg/dL [0.84 – 1.52mmol/L]; Urina:

0.4 – 1.3g/24h [12.9 – 42.0mmol/24h]

Magnésio

Amostra: Soro, plasma heparinizado ou urina [68].

Método: Modificação do método complexométrico do azul de metiltimol (MTB). A

interferência do cálcio é minimizada pela formação de um complexo com o sal de bário do

ácido etilenobis (oxietilenonitrilo) tetracético (Ba-EGTA) - agente quelante [68].

O MTB forma um complexo azul na presença de magnésio (Mg2+). A quantidade de

complexo formado é proporcional à concentração de magnésio, medido utilizando uma técnica

bicromática de ponto final (600, 510nm) [68].




Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 20.0mg/dL [0.00 – 8.22mmol/L] [68]

Valores de Referência: Soro: 1.8 – 2.4mg/dL [0.74 – 0.99mmol/L]; Urina: 24 –

255mg/24h [0.99 – 10.5mmol/24h]

Tabela 4. Causa do aumento e da diminuição do cálcio, fósforo e magnésio no soro

(Adaptado de [65]).

Parâmetros Aumento Diminuição

Cálcio

Hiperparatiroidismo primário

Hipertiroidismo

Insuficiência adrenal aguda

Doenças granulomatosas

Proteínas séricas aumentadas

Imobilização

Ingestão aumentada

Hipoalbuminémia

Insuficiência renal crónica

Défice de magnésio

Hipoparatiroidismo

Osteomalacia

Raquitismo

Fósforo


Hipoparatiroidismo

Acromegalia

Ingestão aumentada

Acidose láctica

Acidose respiratória

Cetoacidose diabética não tratada

Rabdomiólise

Hemólise intravascular

Terapia citotóxica

Alcalose respiratória

Hiperparatiroidismo

Defeitos tubulares renais

Distúrbios gastrointestinais

Síndrome de má absorção

Cetoacidose

Magnésio

Ingestão excessiva


Rabdomiólise

Hipercalcémia

Hipocalciúrica familiar

Distúrbios gastrointestinais

Doenças renais

Diabetes mellitus

Interações medicamentosas que levam à

perda renal



Leticia de Bastos

81

7.1.14. Avaliação da Proteína C Reativa

A proteína C-reativa (PCR) é uma proteína sintetizada no fígado de “fase aguda

positiva” [69], sendo que a sua determinação é útil no diagnóstico presuntivo e monitorização de

um processo infecioso e/ou inflamatório [70].

Como é um parâmetro inespecífico o seu valor apenas deve ser interpretado em conjunto

com a história clínica do doente [69].


Método: Imunoensaio turbidimétrico.

As partículas sintéticas revestidas com anticorpos específicos para a PCR agregam-se

na presença de PCR na amostra. O aumento de turvação devido à formação de imunocomplexos

é proporcional à concentração de PCR na amostra (absorve a 340nm) [69].

Intervalo de Medição Analítica [69]: [0.5 – 250.0mg/L] 0.05 – 25.00mg/dL

Valores de Referência: <0.3mg/dL [3mg/L]

7.1.15. Monitorização de Drogas Terapêuticas

A determinação dos níveis plasmáticos de determinado fármaco em circulação é

utilizada para a monitorização da terapêutica, assim como no diagnóstico e tratamento de

sobredosagens. Em determinadas situações também pode ser útil para averiguar o cumprimento

da terapêutica [71-78].

Digoxina

A digoxina é um glicósido cardíaco, utilizado no controlo da insuficiência cardíaca,

arritmia supraventricular e fibrilação auricular. No entanto, tem uma janela terapêutica estreita

o que exige que o clínico esteja atento às várias características do paciente, incluindo a função

renal e uso concomitante de outros medicamentos, de modo a evitar a toxicidade potencialmente

fatal [79].





Método: Imunoensaio.

O acetato de magnésio é utilizado para ativar a enzima e o tampão de ácido N-2-

hidroxietilpiperazina-N-1-etanossulfónico (HEPES) para proporcionar um pH ótimo à reação

[71].

A digoxina, presente na amostra, liga-se ao F(ab΄)2-ß-galactosidase (conjugado).

Partículas magnéticas revestidas com o análogo da digoxina são adicionadas para se ligarem ao

conjugado livre, que será removido magneticamente. Posteriormente é adicionado um substrato

CPRG. A fração ß-galactosidase (ß-gal) do complexo Digoxina-F(ab’)2-ß-galactosidase

catalisa a hidrólise do CPRG em CPR. A variação da absorvência a 577nm causada pela

formação de CPR é diretamente proporcional à atividade da ß-galactosidase, que corresponde

à quantidade de digoxina presente na amostra, medida utilizando uma técnica cinética

bicromática (577, 700nm) [71].

Intervalo de Medição Analítica: 0.20 – 5.00ng/mL [0.26 – 6.41nmol/L] [71]

Intervalo Terapêutico: 0.90 – 2.00ng/mL [1.15 – 2.56nmol/L]; Toxicidade

>2.00ng/mL [2.56nmol/L]

Carbamazepina

É utilizado essencialmente no tratamento de determinado tipo de convulsões, no

tratamento de algumas doenças neurológica, tais como a nevralgia do trigémeo, assim como em

certas situações psiquiátricas. Possui um metabolismo hepático, sendo o principal responsável

pelas concentrações plasmáticas do fármaco [80].

Intervalo de Medição Analítica: 0.0 – 20.0µg/mL [0.0 – 84.7µmol/L] [72]



Leticia de Bastos

83

Intervalo Terapêutico: 4.0–12.0µg/mL [16.9 – 50.8µmol/L]; Toxicidade:> 15.0µg/mL

[63.5µmol/L] [72]

Gentamicina

Antibiótico (aminoglicosídeo) de largo espectro, que se liga à subunidade ribossómica

30S das bactérias, inibindo assim a síntese proteica [80]. É eficaz, essencialmente, contra

bactérias aeróbias Gram negativo e possui uma toxicidade relativamente baixa. É administrada

por via intramuscular ou intravenosa [73].


Intervalo Terapêutico: 4.0 – 10.0µg/mL [8.64 – 21.6µmol/L]; Toxicidade >2µg/mL

[4.32µmol/L] durante períodos superiores a 10 dias [73].

Fenobarbital

Especialmente utilizado como sedativo e tranquilizante [74], mas também no tratamento

de convulsões, exceto em crises de ausência. O metabolismo hepático é uma das principais

vias de eliminação, sendo que a redução da função hepática leva ao prolongamento de semi-

vida do fármaco e se a função renal também estiver afetada ocorre uma diminuição da sua

depuração [80].

Intervalo de Medição Analítica: 0.0 a 80.0µg/mL [0 – 344 µmol/L] [74]

Intervalo Terapêutico: 15.0 – 40.0µg/mL [64 – 172µmol/L]; Toxicidade >50.0µg/mL

[215µmol/L] [74]

Fenitoína

Antiepilético e anticonvulsivante, eficaz em todos os tipos de perturbações convulsivas,

com exceção de crises de ausência. Também pode ser utilizado no controlo de arritmias

cardíacas. A fenitoína é metabolizada a nível hepático, contudo o seu metabolismo pode ser




saturado dentro do intervalo terapêutico. Nestes casos, pequenos incrementos da dose resultam

em grandes alterações da concentração plasmática, o que explica a grande variação

interindividual da dose necessária para obter o efeito terapêutico [80].


Intervalo Terapêutico: 10.0 – 20.0µg/mL [39.6 – 79.2µmol/L]; Toxicidade >

30.0µg/mL [118.9µmol/L] [75]

Teofilina

Tem efeito broncodilatador utilizado no alivio e prevenção da asma. O metabolismo

hepático é a principal via de eliminação do fármaco da corrente sanguínea. Na presença de

doença ou imaturidade hepática e insuficiência cardíaca uma semi-vida do fármaco pode ser

prolongada [80].

Intervalo de Medição Analítica: 2.0 – 40.0µg/mL [11 – 222µmol/L] [76]

Intervalo Terapêutico: 10 – 20µg/mL [56 – 111µmol/L]; Toxicidade >20.0µg/mL

[111µmol/L] [76]

Ácido Valpróico

Utilizado para o tratamento de crises de ausência, sendo útil no controlo de certo tipo

de convulsões, quando administrado com outros agentes antiepiléticos [80].


Intervalo Terapêutico: 50 – 100µg/mL [346 – 693µmol/L] [77]

Vancomicina

Antibiótico glicopéptidico que atua inibindo a polimerização de peptidoglicano na

parede celular das bactérias. É utilizada para o tratamento e prevenção de várias infeções



Leticia de Bastos

85

bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus resistente

à meticilina (MRSA). Possíveis complicações são a ototoxicidade, que tende a ser permanente

e dependente da dose, e a nefrotoxicidade, embora pouco comum, normalmente é reversível.

Dosagem de vancomicina com base na depuração estimada da creatinina é uma técnica

comumente utilizada para prevenir nefrotoxicidade [81].


Intervalo Terapêutico: Pico: 18 – 26µg/mL [12.1 – 17.4µmol/L]; Vale: 5 – 10g/mL

[3.4 – 6.6µmol/L] [78]

Determinação quantitativa de Carbamazepina, Gentamicina, Fenobarbital, Fenitoína, Teofilina,

Ácido Valpróico e Vancomicina [72-78]:

Amostra: Soro ou plasma [72-78].

Método: Imunoensaio de inibição turbidimétrico melhorado de partículas homogéneas

(PETINIA). Utiliza um reagente de partículas sintéticas análogas ao fármaco a dosear e um

anticorpo monoclonal específico desse fármaco [72-78].

O fármaco presente na amostra compete com as partículas sintéticas pelo anticorpo,

diminuindo a sua taxa de agregação. A taxa de agregação é inversamente proporcional à

concentração do fármaco presente na amostra e é medida utilizando leituras turbidimétricas

bicromáticas (340, 700nm) [72-78].

7.1.16. Rastreio de Drogas de Abuso

O rastreio de drogas de abuso é utilizado no diagnóstico, tratamento do consumo ou

sobredosagem de droga de abuso [82-87].

O método utilizado fornece apenas um resultado preliminar de teste analítico. Para obter

um resultado analítico confirmado, deve utilizar-se um método químico alternativo com maior

especificidade, como por exemplo a cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG/EM)

[82-87].




Cocaína

A cocaína é um estimulador do SNC que provoca um estado de alerta aumentado e

euforia. É praticamente toda metabolizada ao nível hepático com formação dos metabolitos

benzoilecgonina e éster metílico de ecgonina, que posteriormente são eliminados pela urina.

Apenas uma pequena quantidade de cocaína é excretada na urina na forma inalterada [88].

Os metabolitos da cocaína podem ser detetados na urina até cerca de 2 dias após o

consumo. No entanto, a taxa de excreção varia de indivíduo para indivíduo e de acordo com o

modo de administração e a frequência do consumo. Com este teste é doseado de forma semi-

quantitativa a benzoilecgonina [82].

Intervalo de Medição Analítica: 35 – 900ng/mL (cut-off: 300ng/mL) [82]

Anfetaminas/ Metanfetaminas

As anfetaminas são substâncias estimuladoras do SNC. Uma porção significativa da

dose ingerida é eliminada na forma inalterada na urina, de modo dependente do pH urinário,

outra porção sofre metabolização hepática [88].

As anfetaminas surgem na urina no período de 3h após qualquer tipo de administração,

podendo ser detetadas durante 24-48h após a última administração [83].


Opiáceos

Os opiáceos são alcaloides analgésicos de ocorrência natural ou semi-sintéticos,

derivados do ópio. A morfina e a codeína são alcalóides de ocorrência natural e a heroína é um

derivado semi-sintético da morfina. Apenas a morfina e a codeína são consideradas drogas

legais [88].

Os opiáceos são absorvidos rapidamente, sendo a heroína convertida rapidamente em 6-

acetilmorfina (6-AM), que por sua vez é hidrolisada a morfina. Posteriormente, é inativada pela

conjugação com o glucuronato. Da morfina total na urina, cerca de 90% é eliminada na forma



Leticia de Bastos

87

de metabolito glucuronidado e 10% na forma de livre [88]. A excreção decorre por um período

de 2 dias [84].

A presença de opiáceos na urina indica o uso de heroína, morfina e/ou codeína [84].


Benzodiazepinas

As benzodiazepinas são sedativo-hipnóticos, sendo que alguns fármacos são de

utilização generalizada. As diferentes benzodiazepinas são absorvidas a taxas diferentes e os

efeitos psicoativos variam de acordo com a taxa de absorção. São metabolizadas no fígado e

podem potenciam o efeito de outros depressivos do SNC, tal como o álcool etílico [85].


Barbitúricos

Os barbitúricos, uma classe de depressores do SNC, são rapidamente absorvidos, dos

quais 30-40% encontram-se ligados a proteínas plasmáticas, estando os restantes distribuídos

pelo músculo, tecido adiposo e fígado (onde são desativados) [86].

A forma como o fármaco é excretado depende da sua duração da ação, sendo que os de

curta duração normalmente excretados na urina na forma de metabolitos, enquanto que os de

longa duração irão aparecer inalterados [86].


Canabinóides

O canabinóide ∆9-tetrahidrocanabinol (THC), principal composto psicoativo da

marijuana e do haxixe [88], é rapidamente absorvido, sendo quase totalmente metabolizado por

enzimas hepáticas [87].




Aproximadamente, 30% da dose de THC é excretada na forma de metabolitos urinários

nas 72h após a exposição, sendo esta concentração depende da quantidade absorvida, da

frequência do consumo e da hora da colheita. Em utilizadores crónicos, o THC pode acumular-

se no tecido adiposo originando tempos de deteção mais longos na análise de urina em relação

aos utilizadores ocasionais [87].


Determinação semi-quantitativa de Drogas de Abuso [82-87]:

Amostra: Urina - colhidas em recipientes de vidro ou plástico (certos plásticos podem

absorver determinados fármacos), limpos e estanques. O ácido bórico não deve ser utilizado

como conservante. As amostras devem possuir um pH entre 5-8, caso contrário deverão ser

ajustadas através da adição de HCI 1N ou NaOH 1N [82-87].

Método: Imunoensaio de competição [82-87].

A droga de abuso excretada na urina (Du) compete com um análogo desse composto

marcado com a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (C-G6PDH) pelo anticorpo (Atc). A

concentração de Du determina a quantidade de C-G6PDH que está ligado ao anticorpo e

consequentemente a quantidade que se encontra livre. O conjugado livre catalisa a oxidação da

glucose-6-fosfato com a redução simultânea da NAD para NADH. O aumento da absorvência

a 340nm, está relacionado com a concentração da droga presente na amostra (Tabela 5).



Leticia de Bastos

89

Tabela 5. Compostos dosados na urina para o rastreio de drogas de abuso e respetivo

conjugado (Adaptado de [82-87]).

Droga de Abuso Rastreada Du C-G6DH

Metabolitos da Cocaína Benzoilecgonina Benzoilecgonina

Anfetaminas/ Metanfetaminas Anfetamina/

Metanfetaminas

d-anfetamina/

d-metanfetaminas

Opiáceos Opiáceos Morfina

Benzodiazepinas Benzodiazepinas Diazepam

Barbitúricos Barbitúricos Secobarbital

Canabinóides Canabinóides ∆9 –THC

Du: produto de excreção da droga de abuso na urina; C-G6DH: conjugado (composto marcado com a enzima glicose-6-fosfato

desidrogenase)

Etanol

O álcool etílico é a droga mais popular e fortemente consumida pelos seres humanos.

O principal local de absorção é o intestino delgado, sendo posteriormente distribuído

uniformemente pela água do organismo e atravessa facilmente a barreira hematoencefálica,

bem como a placenta, podendo causar a síndrome alcoólica fetal. Cerca de 95% da totalidade

do etanol ingerido é metabolizado ao nível hepático [89].

A determinação do etanol pode ser utilizada no diagnóstico, controlo de intoxicação e

envenenamento por álcool etílico [89].

Amostra: Soro, plasma EDTA, heparinizado ou urina. Não desinfetar o braço com

soluções alcoólicas [89].


A álcool desidrogenase (ADH) catalisa a oxidação do álcool etílico em acetaldeído.

Durante esta reação, a NAD é reduzida a NADH com um aumento concomitante da absorvência

a 340nm proporcional à concentração de álcool presente na amostra [89].




Intervalo de Medição Analítica: 3 – 300mg/dL [0.7 – 65.1mmol/L] [89]

7.2. Interferência da Hemólise, Icterícia e Lipémia nos Métodos Analíticos

Equipamento: Dimension® EXLTM with LM, da Siemens

A automatização de um processo de inspeção de amostras, com avaliação de

interferências espectrais da Hemólise, Icterícia e Lipémia6 (HIL) veio padronizar e uniformizar

os procedimentos laboratoriais. A interferência HIL é geralmente uma interferência direta

devido aos espectros de absorção da cor do interferente. Para efetuar essa determinação o

equipamento necessita apenas de 20μL de soro/plasma, e irá medir a absorvência a 405, 452 e

700nm, convertendo automaticamente os resultados obtidos para os valores do índice HIL,

correspondentes aos intervalos de concentração apresentados na Tabela 6 [90].

Tabela 6. Concentrações utilizados para estabelecer valores de índice HIL (Adaptado de

[90]).

Índices Hemoglobina

(mg/dL) Bilirrubina (mg/dL) Lipémia (mg/dL)

1 H ≤ 25 I ≤ 2 L ≤ 25

2 25 < H ≤ 50 2 < I ≤ 5 25 < L ≤ 50

3 50 < H ≤ 200 5 < I ≤ 20 50 < L ≤ 200

4 200 < H ≤ 300 20 < I ≤ 40 200 < L ≤ 600

5 300 < H ≤ 500 40 < I ≤ 60 600 < L ≤ 1000

6 500 < H ≤ 1000 60 < I ≤ 80 1000 < L ≤ 3000

H: Hemoglobina; I: Ictrícia; L: Lípémia.

Os valores dos índices HIL para cada método são apresentados em Anexo, na Tabela 18

(Anexo V) e representam os níveis de índice em que hemólise, icterícia ou lipémia interferem

6 O que é doseado não é a quantificação real de lípidos, mas a estimativa é baseada na medição da turvação da amostra.



Leticia de Bastos

91

nos resultados do teste em pelo menos ± 10%, em comparação com amostras sem interferentes

[90].

Devido às interferências da hemólise e da lipémia na determinação do ionograma esses

métodos também foram incluídos, mesmo que não sejam fotométricos [90].

Tendo em conta a política do Serviço de Patologia Clínca, as amostras que possuem um

índice de hemólise de 2 ou 3, em todos os métodos que sofrem interferência com este grau de

hemólise, ao resultado é adicionada a mensagem de “amostra hemolisada” e essa informação é

disponibilizada ao clínico. Se o resultado obtido, mesmo com interferência da hemólise, estiver

abrangido na tabela dos resultados crítico, o resultado é comunicado, sugerindo-se a repetição

da colheita para confirmação de resultado. As amostras que apresentam um índice de hemólise

igual ou superior a 4, os métodos que apresentam interferências são bloqueados, não sendo

disponibilizado o resultado para o clínico, com indicação de “amostra hemolisada, solicita-se

nova colheita”.

As amostras lipémicas são doseadas e se necessário procede-se a uma diluição para que

seja possível efetuar-se o doseamento. Nas amostras em que o índice de lipémia interfere com

o método, a acompanhar o resultado a mensagem de “amostra lipémica” é disponibilizada para

o clínico. Quando não é possível efetuar-se o doseamento, o parâmetro é bloqueado e apenas é

libertada a mensagem de “amostra lipémica” no boletim de resultados.

7.3. Análise da Urina Tipo II

A análise de urina fornece uma ampla variedade de informações clínicas úteis, sendo

importante no diagnóstico, monitorização de patologias do trato urinário, screening de doenças

em populações assintomáticas e avaliação do efeito terapêutico. A análise de urina tipo II

consiste no exame físico e químico da urina e no exame microscópico do sedimento urinário.

A amostra utilizada é, preferencialmente, a primeira urina da manhã, por ser a amostra

mais concentrada, assegurando a deteção de substâncias químicas ou de elemento figurados que

podem não estar presentes numa amostra colhida aleatoriamente, bem como permite excluir a

proteinúria ortostática. As amostras de urinas devem ser processadas, preferencialmente, até 2h

após a colheita.




7.3.1. Exame Físico e Químico da Urina Tipo II

Equipamento: Aution Max, da A. Menarini Diagnostics

O equipamento Aution Max (Figura 4) destina-se à primeira fase da análise da urina

tipo II, possibilitando a determinação de diferentes parâmetros, nomeadamente efetuar a leitura

dos resultados da tira de teste, diminuindo assim os erros de leitura visual por parte do técnico.

Densidade ou Gravidade Específica

A densidade é uma medida que permite avaliar as substâncias químicas dissolvidas na

urina, sendo dependente do poder de excreção e de concentração dos rins [91].

Valores de densidade baixos podem ser encontrados em casos de ingestão aumentada

de água, uso de diuréticos, incapacidade de concentração e diabetes insipidus. Enquanto que

valores de densidade elevados podem ocorrer em situações de desidratação, insuficiência

adrenal [91], febre, glicosúria e proteinúria.

Método: Índice de refração [92]

A luz emitida pelo díodo emissor de luz (LED) transforma-se num feixe de luz ao

atravessar uma fenda e lentes. O feixe de luz atravessa a célula do prisma que contém a amostra

de urina e, em seguida, é dirigido para o detetor. O índice de refração altera-se de acordo com

a gravidade específica da amostra contida na célula do prisma [92].

Figura 4. Equipamento Aution Max, da A. Menarini Diagnostics



Leticia de Bastos

93

Valores de Referência: 1.010 – 1.025

Cor

A cor normal da urina é amarela, que se deve, sobretudo, à presença de um pigmento

denominado urocromo, que é um produto do metabolismo produzido de uma forma constante,

em condições normais. Outros pigmentos, tais como a uroeritrina e a urobilina também estão

presentes embora em menor quantidade. As alterações não patológicas devem-se

essencialmente ao estado de hidratação e à capacidade de concentração da urina. No entanto,

existem alterações com importância clínica [91]:

Cor âmbar – possível presença de bilirrubinas;

Cor vermelha, rosa, castanha – possível presença de sangue;

Quase incolor - diabetes insipidus:

Cor preta – presença de ácido homogentísico, característico da alcaptonúria.

Método: Reflectância a diferentes comprimentos de onda (635nm; 565nm; 430nm;

760nm), sendo analisadas 23 tonalidades [92].

Aspeto/ Turvação

O aspeto refere a transparência da urina. A urina normal é límpida, porém pode aparecer

uma turvação não patológica causada pela precipitação de cristais amorfos (frequente em

amostras refrigeradas), células epiteliais de descamação, muco, uso de cremes vaginais e sémen.

Uma turvação patológica pode estar relacionada com a presença elementos celulares, bactérias,

lípidos, linfa, leveduras e matéria fecal [91]. Uma urina límpida nem sempre é sinónimo de

normalidade.

Método: Luz dispersa. O resultado da turvação é apresentado com a seguinte

nomenclatura: Límpida, Turva ou Muito Turva [92].




Tira de Teste

Método: Reflectância bicromática, exceto para a avaliação de sangue na urina em que

é monocromática. Os comprimentos de onda diferem consoante o parâmetro em estudo [92].

As amostras são pipetadas e dispensadas sobre as tiras de teste (URIFLET S 9UB). As

tiras de teste são tiras de plástico com áreas impregnadas com reagentes para a determinação

de diversos parâmetros, recorrendo a diferentes métodos de leitura. Os parâmetros

determinados resultam da reação da urina com a área de teste impregnada com reagente,

levando a uma alteração da cor. Posteriormente, para efetuar a leitura, um multi-LED irradia

luz com 1ou 2 comprimentos de onda diferentes, consoante o parâmetro em estudo, nas áreas

de reação das tiras de teste e na secção de compensação da tonalidade7. A luz refletida é recebida

por três detetores [92].

pH

O rim, bem como os pulmões, é dos maiores reguladores do conteúdo ácido-base do

organismo. A determinação do pH urinário é importante para a deteção de possíveis distúrbios

hidro-electrolíticos. O valor do pH da urina varia consoante o teor da dieta [91].

Método: Princípio de duplo indicador de pH que reagem com os iões H+ levando à

produção de cor, permitindo a diferenciação do nível do pH de 4.5 – 9 [93].

A contaminação bacteriana pode conduzir a falsos resultados [93].

Valores de Referência: 5.0 - 8.0

Glucose

Em circunstâncias normais, a urina normal contém quantidades mínimas de glucose. No

entanto, em situações de hiperglicémia, ao se atingir o limiar de reabsorção renal, observa-se

glucosúria (160-180mg/dL). A glucosúria com hiperglicémia pode ocorrer na diabetes mellitus,

tumor pancreático, hipertiroidismo e outras alterações hormonais ao nível da hipófise e glândula

adrenal. A glucosúria sem hiperglicémia é geralmente associada à lesão tubular renal. Na

7 Secção de compensação da tonalidade: zona branca da tira, que não contém reagentes, permite ao analisador fazer uma

compensação na determinação de diversos parâmetros tendo em conta a cor intrínseca da urina.



Leticia de Bastos

95

gravidez pode-se verificar glucose na urina com níveis baixos de glicémia, devido ao aumento

da taxa de filtração glomerular [91].

Método: Glucose oxidase-peroxidase. Esta área de teste não é afetada pela presença de

substâncias redutoras ou de outros açúcares, nomeadamente, sacarose, lactose e frutose [93].

Falsos negativos: Grandes quantidades de ácido ascórbico [93].

Falsos positivos: Substâncias oxidantes como o hipoclorito e cloro, assim como urinas

com pH inferior a 4 [93].

Valores de Referência: 0.0 – 30.0mg/dL

Bilirrubinas

A presença de bilirrubina na urina pode ser indicativa de patologia hepática ou biliar,

podendo observar-se em situações de hepatite, cirrose ou colestase [91].

Método: Ligação da bilirrubina a um sal de diazóico, com produção de uma coloração

azo castanho-avermelhada. Esta área de teste reage de uma forma mais sensível à bilirrubina

direta. Este teste é instável na presença de luz solar [93].

Falsos negativos: Presença de ácido ascórbico, ácido úrico e nitritos [93].

Falsos positivos: Presença de urobilinogénio e metabolitos de medicamentos [93].


Proteínas

Podem ser detetadas pequenas quantidades de proteínas na urina de indivíduos

saudáveis, variando de 2 a 10mg/dL (inferior ao limite de deteção da tira de teste). No entanto,

a deteção de uma quantidade anormal de proteínas na urina é indicativa de patologia renal [91].

Método: Princípio do “erro proteico” de um indicador de pH, o azul de tetrabromofenol.

A reação é particularmente sensível à albumina, mas menos sensível à globulina, proteína de

Bence-Jones e às mucoproteínas [93]. Este método não deteta proteinúria abaixo dos 8-10mg/dL




Falsos negativos: pH inferior a 3 [93].

Falsos positivos: pH superior a 8, grandes quantidades de hemoglobina, substâncias de

alto peso molecular, desinfetantes incluindo compostos de amónia quaternário [93].


Sangue

O sangue pode estar presente na urina sob a forma de eritrócitos íntegros (hematúria) ou

de hemoglobina livre (hemoglobinúria) resultando da destruição dos eritrócitos, sendo

importante a observação do sedimento ao microscópio para auxiliar na distinção destas duas

condições [91].

A hematúria pode estar relacionada com patologias de origem renal ou urogenitais e a

hemoglobinúria pode ocorrer devido à lise de eritrócitos no trato urinário ou ser resultante de

hemólise intravascular [91].

A presença de mioglobinúria, surge raramente, resultando de distúrbios decorrentes de

destruição do tecido muscular [91].

Método: Baseia-se na atividade da pseudoperoxidase que catalisa a oxidação do

indicador de pH na presença do peróxido de hidrogénio na área de teste, originando uma

coloração azul-esverdeada, sendo mais sensível à hemoglobina e mioglobina do que aos

eritrócitos. A ausência de hemólise poderá levar a resultados negativos apesar da presença de

eritrócitos no sedimento [93].

Falsos negativos: Elevada densidade da urina, elevado teor proteico, presença de

inibidores de origem biológica ou farmacológica (ácido úrico, ácido ascórbico, glutatião) [93].

Falsos positivos: Presença de substâncias oxidantes como o hipoclorito e o cloro [93].




Leticia de Bastos

97

Corpos cetónicos

Geralmente não surgem em quantidades mensuráveis na urina, contudo sempre que haja

um defeito no metabolismo dos hidratos de carbono, na absorção ou no aporte inadequado da

dieta, o organismo compensa aumentando o metabolismo lipídico que, em grande escala, leva

ao aumento dos corpos cetónicos no sangue que consequentemente são excretados pela urina.

Verificando-se em situações de cetoacidose diabética, jejum prolongado, após exercício físico

intenso e hiperemese gravídica [91].

Método: Princípio do teste de Legal: o ácido acetoacético e a acetona reagem com

nitroprussiato de sódio, em meio alcalino, originando um complexo cor violeta [93].

Falsos positivos: Presença de fenilcetona, cefalosporina e anti-enzima redutora da

aldose [93].


Urobilinogénio

O urobilinogénio é um pigmento biliar que resulta da redução da bilirrubina pelas

bactérias intestinais. Cerca de metade do urobilinogénio é reabsorvido pelo intestino, entra na

circulação porta, sendo excretado na bílis. A maioria é excretado pelas fezes, encontrando-se

em pequenas quantidades na urina, podendo aumentar em patologias hepáticas, colestase e

colangite. Na presença de distúrbios hemolíticos observa-se o aumento do urobilinogénio com

ausência de bilirrubinas na urina [91].

Método: Reação do urobilinogénio com um sal diazónio estável originando um corante

azo castanho avermelhado [93].

Falsos negativos: Grandes quantidades de ácido ascórbico [93].

Falsos positivos: Presença de carbapenem [93].





Nitritos

A presença de nitritos é sugestiva de infeções urinárias, mesmo quando assintomáticas,

pela capacidade de algumas bactérias patogénicas reduzirem nitratos a nitritos, levando ao seu

aparecimento na urina [91].

Método: Princípio da reação de Griess. Na presença de nitritos a zona de teste surge

com uma coloração rosa-vermelha [93].

Falsos negativos: Presença de ácido ascórbico e densidade elevada da urina [93].

Falsos positivos: Urinas não frescas [93].

Valores de Referência: Não detetável.

Leucócitos

Os leucócitos aparecem frequentemente na urina, podendo ser sugestivos de infeção do

sistema urogenital [91].

Método: O teste baseia-se na reação da esterase dos leucócitos com produção de um

corante violeta [93].

Falsos negativos: Glucosúria superior a 500mg/dL, proteinúria superior a 300mg/dL,

pH reduzido e elevada densidade na urina [93].

Falsos positivos: Presença de formaldeído ou bilirrubinas na urina [93].

Valores de Referência: 0.0 – 25/uL

7.3.2. Avaliação Microscópica do Sedimento Urinário

A existência de parâmetros positivos na tira de teste ou a sua solicitação pelo clínico

constituem os critérios para a execução do exame microscópico do sedimento urinário. Para tal,

a amostra de urina é centrifugada a 1500rpm, 10 minutos, posteriormente é decantado o



Leticia de Bastos

99

sobrenadante, permanecendo com cerca de 1mL de amostra de forma a ressuspender o

sedimento, que será observado a fresco, ao microscópio ótico na objetiva de 10x e 40x.

Elementos que podem ser observados

O exame microscópico do sedimento urinário tem como objetivo detetar, identificar

e/ou quantificar de forma semi-quantitativa células, cilindros, cristais, formas leveduriformes,

bactérias e parasitas. É preciso ter atenção aos artefactos para não serem confundidos com

nenhuma outra estrutura.

Células

Na tabela 7 encontram-se as diferentes células que podem ser observadas num

sedimento urinário e o seu significado clínico.

Tabela 7. Células que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu significado

clínico (Adaptado de [91]).

Imagem Células Significado Clínico

Células tubulares renais

Necrose tubular renal, rejeição de

transplante renal e outras lesões

isquémicas renais.

Células do epitélio de

transição

Quando em número elevado e com

morfologia anormal é sugestivo de

malignidade.

Células epiteliais de

descamação

Contaminação vaginal ou uretral. Sem

significado patológico. Mais abundante

na mulher.

Eritrócitos

Doença renal, infeção, calculo renal,

doença extra-renal, reação tóxica a

drogas ou causa fisiológica.

Leucócitos Infeção ou inflamação do trato urinário.




Cilindros

Os cilindros são os únicos elementos exclusivamente de origem renal encontrados no

sedimento urinário. São compostos de mucoproteínas Tamm-Horsfall presentes na urina na

forma solúvel, que em situações de estase urinária precipitam tomando a forma do local onde

se formaram. Existem diversos fatores que aumentam a sua predisposição, tais como: a

concentração aumentada de proteínas, pH urinário baixo e a presença de sais. Quaisquer

elementos presentes no filtrado tubular podem prender-se à matriz do cilindro e estão na base

da sua classificação (Tabela 8) [91].

Tabela 8. Cilindros que podem ser observadas num sedimento urinário e o seu

significado clínico (Adaptado de [91]).

Fotografia Cilindros Significado Clínico

Cilindros hialinos

Doença renal, febre, desidratação, terapia

com diuréticos, ICC, transitório com o

exercício.

Cilindros granulosos Doença glomerular e tubular renal

Cilindros cerosos

Doença renal crónica, inflamação e

degeneração tubular.

Cilindros eritrocitários Glomerulonefrite

Cilindros leucocitários Pielonefrite, nefrite intersticial, síndrome

nefrótico

Cilindros de células

epiteliais Lesão tubular renal



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101

Cristais

Embora raramente tenham significado clínico, deve proceder-se à sua identificação para

confirmar se representam ou não um estado patológico. São formados pela precipitação de sais

na urina quando submetidos a alterações de pH, temperatura ou concentração, podendo aparecer

na forma de cristais verdadeiros ou de material amorfo [91].

Os cristais considerados patológicos são os de cistina, que aparecem em casos de erros

congénitos do metabolismo, e os de leucina e tirosina que ocorrem em situações de patologia

hepática grave [91].

Um dos recursos mais úteis na identificação dos cristais é o conhecimento do pH

urinário, pois este determinará o tipo de substância precipitada (Tabela 9) [91].

Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se

encontram (Adaptado de [91]).

Fotografia Cristais pH urinário

Cristais de ácido úrico pH ácido

Cristais de oxalato de cálcio pH ácido ou neutro

Cristais de cistina pH ácido

Cristais de leucina pH ácido

Cristais de tirosina pH ácido




Tabela 9. Cristais que podem ser observadas num sedimento urinário e o pH a que se

encontram (Adaptado de [91]). Continuação.

Uratos amorfos

(cálcio, magnésio, sódio e

potássio)

pH ácido e neutro

Cristais de fosfato triplo

(amónio, magnésio) pH alcalino e neutro

Fosfato de cálcio pH alcalino ou neutro

Fosfatos amorfos

(cálcio e magnésio)

pH alcalino e neutro

Outras estruturas que podem ser observadas:

Formas leveduriformes

Bactérias

Parasitas: Trichomonas vaginalis, Schistosoma haematobium

Muco

Espermatozoides

O sedimento urinário normal pode conter diversos elementos, mas quando presentes em

determinadas quantidades é considerado patológico:

Mais de 5 eritrócitos ou leucócitos por campo;

Mais 2 células tubulares renais por campo;

Mais de 3 cilindros hialinos por campo;



Leticia de Bastos

103

1 Cilindro granuloso;

Mais de 10 bactérias por campo;

Presença de fungos;

Presença de parasitas;

Presença de cristais patológicos;

Grandes quantidades de cristais normais.

7.4. Avaliação da Urina a Tempo Determinado

A colheita de urina a tempo determinado é útil na avaliação da função renal, permitindo

determinar a diurese, bem como dosear diversos metabolitos ou outras substâncias que são

excretados na urina.

A diurese é determinada pelo grau de hidratação do organismo, podendo ser

influenciada, pela secreção de ADH, necessidade de excretar quantidades aumentadas de

substâncias dissolvidas e patologia pré-renal, renal ou pós-renal. Uma diurese considerada

normal situa-se entre os 600-2000mL/24h [92].

A determinação da clearance de creatinina é utilizada como indicador da filtração

glomerular. No entanto, o seu valor é ligeiramente superior ao débito de filtração glomerular,

pois cerca de 10% da creatinina é secretada pelos túbulos renais [92].

Como existem muitos erros associados à colheita da urina a tempo determinado,

atualmente utilizam-se equações que permitem estimar o débito de filtração glomerular a partir

da creatinina sérica [94]. A Fórmula de Cockroft e Gault pode predizer-se à clearance de

creatinina (Cl. Creat):

Cl. Creatinina calculada (mL/min) = (140−𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (𝑎𝑛𝑜𝑠))𝑥𝑝𝑒𝑠𝑜 (𝐾𝑔)𝑥𝑓

𝐶𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 𝑠é𝑟𝑖𝑐𝑎 (𝑚𝑔/𝑑𝐿)𝑥72

f = 1 para o homem e 0.85 na mulher




Contudo, esta fórmula não pode ser aplicada quando o índice de massa corporal é

inferior a 19 ou superior a 35Kg/m2, quando se verificam alterações importante da massa

muscular, na gravidez, insuficiência renal aguda, hepatopatias graves, edema generalizado ou

ascite.

Para o doseamento de diversos produtos excretados na urina (como por exemplo

proteínas para avaliar a proteinúria e consequentemente o grau de lesão renal) muitos clínicos

já não recorrem à urina a tempo determinado, pedindo o seu doseamento numa urina aleatória

e estabelecem uma razão em função da creatinina urinária.



Leticia de Bastos

105

8. Valência de Hematologia

8.1. Hemogramas

O hemograma é uma das análises de rotina mais requisitadas. Contudo, é uma análise

complexa composta por vinte e seis parâmetros, acrescentando-se a contagem de eritroblastos

e reticulócitos se necessário:

Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, Tomar


Dr. Mohsen Rostami (Assistente Hospitalar)

Dra. Sandra Monteiro (Técnica Superior de Saúde)


Volume de trabalho: Em média cerca de 6150 hemogramas/mês.


Colheitas de produtos biológicos aos utentes da consulta externa;


Manutenção dos equipamentos;

Execução e avaliação CQI e processamento de amostras para a AEQ;

Execução e interpretação de hemogramas;

Execução de velocidades de sedimentação eritrocitária;

Doseamento da hemoglobina glicada (HbA1C);

Estudo de hemoglobinopatias;

Avaliação da hemostase;

Realização e observação de esfregaços de sangue periférico.




Eritrograma: Hematócrito (HTC), Concentração de hemoglobina, Contagem de

Glóbulos Vermelhos, Índices Hematimétricos (Volume Globular Médio, VGM;

Hemoglobina Globular Média, HGM; Concentração de Hemoglobina Globular Média,

CHGM) e Coeficiente de Dispersão Eritrocitária (RDW, do inglês Red Cell

Distribution Witdth);

Leucograma: Contagem total de leucócitos e Fórmula leucocitária

Plaquetograma: Contagem de plaquetas, Plaquetócrito, Volume Plaquetário

Médio (VPM) e o Coeficiente de Dispersão Plaquetária (PDW, do inglês Platelet

Distribution Width).

Como exemplo de patologias diagnosticadas em Hematologia Laboratorial, sublinha-se

a Anemia, uma das doenças mais prevalentes do mundo. Segundo a Organização Mundial de

Saúde (OMS) é definida pelo valor da hemoglobina, inferior a 13g/dL no homem, inferior a

12g/dL na mulher, sendo variável em crianças de acordo com a idade [95].

A classificação das anemias pode ser morfológica ou fisiopatológica. A classificação

morfológica engloba o MCH (anemia normocrómica ou hipocrómica) assim como outros

índices, como o MCV (normocítica, microcítica ou macrocítica). Enquanto que a classificação

fisiopatológica recorre à contagem de reticulócitos, de forma a designar as anemias como

resultando da diminuição da produção/produção inadequada, eritropoiese ineficaz ou aumento

da destruição/perdas hemorrágicas [97]. A determinação de alguns parâmetros bioquímicos,

designados fatores da hematopoiese, como a ferritina, vitamina B12, ácido fólico, e outros,

torna-se mandatório no estudo da etiologia das anemias [96].

A policitémia é classicamente definida pela elevação do hematócrito acima do valor

normal, ou pelo aumento da concentração da hemoglobina, com valores de Hb superior a

18,5g/dL no sexo masculino e superior a 16,5g/dL no sexo feminino, ou do número de glóbulos

vermelhos [96, 97].

Para classificar as Policitémias em primárias (Policitemia Vera) ou secundária, é

importante ter em consideração, para além dos factores enunciados anteriormente, o número de

leucócitos, plaquetas, saturação de oxigénio e quantidade de eritropoietina presente em

circulação [96].



Leticia de Bastos

107

Existem outras patologias prevalecentes em que o estudo do eritrograma se torna

fundamental para o respetivo diagnóstico, como por exemplo na Hemocromatose.

O leucograma avalia as alterações fisiológicas e patológicas dos glóbulos brancos. As

alterações podem ser diagnosticadas através do estudo quantitativo, morfológico, citoquímico,

citogenético ou por técnicas de biologia molecular.

Relativamente às plaquetas, estas possuem um papel muito importante ao nível da

hemostase primária. As alterações ao nível das plaquetas podem ser quantitativas ou

qualitativas, no entanto, o plaquetograma permite essencialmente fazer uma avaliação

quantitativa.

A observação do esfregaço de sangue periférico é fundamental no diagnóstico e

seguimento das hemopatias mais prevalentes.

Equipamentos em funcionamento na secção:

Equipamento: Sysmex XN-1000TM

Amostra: Sangue total colhido em tubos com anticoagulante EDTA K3. Na presença

de pseudotrombocitopénias despista-se a possível reação das plaquetas ao anticoagulante, que

leva à agregação plaquetar, através da contagem de plaquetas em sangue total colhido em tudo

com anticoagulante citrato trissódico8 0,109M.

O Sysmex XN-1000 é um analisador eficiente para a realização de hemogramas,

proporcionando informações clínicas pertinentes. Para além da determinação quantitativa,

também permite fazer uma avaliação qualitativa das 3 séries e ainda apresenta alarmes para

alertar determinadas anomalias (Figura 5).

8 Anticoagulante, atua como agente quelante do cálcio ionizado com formação de citrato de cálcio.




Contagem de Eritrócitos e Plaquetas

A contagem de eritrócitos (RBC, do inglês Red Blood Cells) e plaquetas (PLT) é

efetuada no canal RBC/PLT [98].

Método: Focagem hidrodinâmica com deteção por impedância elétrica.

Uma porção da amostra é injetada, para uma câmara cónica, formando uma coluna de

partículas que passam por uma abertura (célula de contagem) que contém um elétrodo de cada

lado, onde passa uma corrente contínua. A passagem de uma partícula/célula, envolvidas num

líquido condutor, pela abertura gera um impulso elétrico, resultando na alteração da

condutividade da corrente elétrica (Figura 6). O número de impulsos está relacionado com o

número de partículas e a amplitude (intensidade) com o volume da célula. Os dados obtidos são

convertidos em histogramas (Figura 7). A separação destas 2 populações celulares é efetuada

por discriminadores automáticos [98].

Figura 6. Tecnologia da focagem hidrodinâmica [99].

Figura 5. Sysmex XN-1000TM.



Leticia de Bastos

109

O objetivo da focagem hidrodinâmica é minimizar a perda e a variação dos impulsos

elétricos na zona de deteção e a recirculação de células, de forma a evitar interferências nas

contagens celulares, melhorando a precisão e reprodutibilidade do método [98].

O hematócrito, definido como o volume relativo ocupado pelos glóbulos vermelhos, é

determinado diretamente através da deteção individual do volume de cada eritrócito [98].

Doseamento da Hemoglobina

O doseamento da hemoglobina é feito no canal da hemoglobina [98].

Método: Lauril Sulfato de Sódio (SLS, do inglês Sodium Lauryl Sulfate).

A amostra é colocada em contacto com um reagente de lise, que irá destruir os eritrócitos

e leucócitos. Posteriormente, ocorre a oxidação do ferro presente na hemoglobina, permitindo

a ligação do reagente SLS ao grupo heme, formando um complexo corado estável. A

quantificação da hemoglobina é feita recorrendo a um método fotométrico, sendo a absorvência

medida a 555nm proporcional à concentração da hemoglobina presente na amostra [98].

Este método apresenta uma boa correlação com o método de referência

(cianometahemoglobina) [98].

Contagem Diferencial dos Leucócitos

A análise diferencial dos leucócitos (WBC, do inglês White Blood Cell) é feita no canal

WDF [98].

Figura 7. Histograma de plaquetas (à esqueda) e dos eritrócitos (à direita) [100].




Método: Citometria de fluxo de fluorescência.

Uma porção da amostra é colocada em contacto com um surfactante que induz a lise dos

RBC e a formação de poros ultramicroscópicos ao nível da membrana dos glóbulos brancos

através dos quais um marcador de fluorescência patenteado de polimetina migra e se liga aos

ácidos nucleicos. Em seguida, a amostra é transportada para o citometro de fluxo, onde é

emitido um feixe de lazer de díodo semicondutor (633nm), que separa as células usando três

sinais diferentes (Figura 8) [98]:

Dispersão da luz frontal (forward ou FSC): determina o volume/tamanho célular;

Dispersão da luz lateral (scatter ou SSC): avalia o conteúdo/complexidade

(núcleo e grânulos) celular;

Fluorescência lateral (SFL): a intensidade de fluorescência é proporcional ao

conteúdo em ácidos nucleicos presentes nas células nucleadas.

A dispersão da luz frontal e lateral são recebidos por fotodíodos, e a florescência lateral

é recebida por um fotomultiplicador. A luz recebida é convertida em impulsos elétricos,

permitindo diferenciar os leucócitos em neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos, com

elevada precisão [98].

Posteriormente, os resultados são apresentados em diagrama de dispersão (Figura 9). O

algoritmo adaptável de alarmes Sysmex, baseado no reconhecimento da forma da área da

Figura 8. Tecnologia da citometria de fluxo e sinais de dispersão da luz frontal, lateral e da fluorescência

lateral [101].



Leticia de Bastos

111

população celular, consegue discriminar linearmente o agrupamento celular do gráfico de

dispersão, analisando a forma e o posicionamento de diferentes populações de células

mononucleares [98].

Contagem Total de Leucócitos e Eritroblastos

O canal WNR é o principal canal para contagem de leucócitos e eritroblastos.

Método: Citometria de fluxo de fluorescência, que utiliza um reagente ácido que

provoca a lise celular, nomeadamente dos eritrócitos e das plaquetas, e um corante de

polimetina específico que cora os ácidos nucleicos. As diferenças em termos volumétricos e de

complexidade existentes são analisadas a partir dos sinais de dispersão dos feixes frontal e

lateral (Figura 10) [98].

Figura 9. Diagramas de dispersão normal dos leucócitos do canal DIFF, à esquerda [101] e diagrama de dispersão

com a localização das diferentes células da série branca, consoante as suas características físico-químicas, à direita

[100].




Contagem de Plaquetas Fluorescentes

Método: Citometria de fluxo de fluorescência com corante específico, a Oxazina.

No canal de plaquetas fluorescentes, as plaquetas são identificadas e quantificadas pelo

corante que tem afinidade para a superfície do retículo endoplasmático rugoso e mitocôndrias.

Essa reação tem excelente correlação com a análise de CD41/CD61, minimizando as

interferências na presença de fragmentos celulares. É ainda capaz de analisar graus de

imaturidade das plaquetas (Figura 11).

Figura 10. Diagramas de dispersão normal do canal WNR [101].

NRBC: eritroblastos; BASO: basófilos; WBC: leucócitos.

Figura 11. Diagramas de dispersão normal do canal das plaquetas fluorescentes [101].

RBC: eritrócitos; IPF: fração de plaquetas imaturas; PLT-F: plaquetas fluorescentes.



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113

Contagem de Reticulócitos

Método: Citometria de fluxo com fluorescência

No canal RET O, o surfactante, presente no reagente, perfura ligeiramente as

membranas permitindo a entrada do marcador de fluorescência que irá marcar os ácidos

nucleicos presentes no interior dos WBC, eritroblastos (NRBC, do inglês Nucleated Red Blood

Cells) e reticulócitos, pelo que a intensidade do sinal de fluorescência resultante é diretamente

proporcional ao teor de ácido nucleico, podendo ser divididos em três categorias consoante o

grau de maturidade (Figura 12) [98].

Índices Hematimétricos

Os índices eritrocitários são calculados pelo software do equipamento [98].

Volume Globular Medio (VGM)

Indica o volume médio de um eritrócito do indivíduo:

𝑉𝐺𝑀 (𝑓𝑙) =𝐻𝑇𝐶 (%)

𝑅𝐵𝐶 (𝑥106/µ𝐿) 𝑥 10

Figura 12. Diagrama de dispersão no canal dos reticulócitos com distribuição normal [101].

RET: reticulócitos; RBC: eritrócitos; LFR: reticulócitos de baixa fluorescência; MFR: reticulócitos de fluorescência média; HFR:

reticulócitos de alta fluorescência; IRF: reticulócitos imaturos e resulta da soma dos MFR com os HFR; PLT: Plaquetas.




Hemoglobina Globular Média (HGM)

Indica o peso médio da hemoglobina contida num eritrócito médio do indivíduo:

𝐻𝐺𝑀 (𝑝𝑔) =𝐻𝐺𝐵 (𝑔/𝑑𝐿)

𝑅𝐵𝐶 (𝑥106/µ𝐿) 𝑥 10

Concentração da Hemoglobina Globular Média (CHGM)

Indica a concentração média de hemoglobina do indivíduo por unidade de volume de

eritrócitos:

𝐶𝐻𝐺𝑀 (𝑔/𝑑𝐿) =𝐻𝐺𝑀 (𝑔/𝑑𝐿)

𝐻𝑇𝐶 (%)𝑥100

Coeficiente de Dispersão Eritrocitário

O RDW indica o grau de anisocitose eritrocitária (em percentagem), sendo obtido a

partir do histograma de distribuição de volume dos eritrócitos (coeficiente de variação) [98].

Coeficiente de Dispersão Plaquetário

O PDW indica o grau de anisocitose plaquetar (em percentagem), sendo obtido a partir

do histograma de distribuição do volume das plaquetas (coeficiente de variação) [98].

Análise de Líquidos Biológicos

Método: Citometria de fluxo de fluorescência.

Permite a análise precisa de líquidos biológicos, sem necessidade de preparação prévia

da amostra [98].



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115

8.1.1. Esfregaço de Sangue Periférico

Um esfregaço de sangue periférico consiste na preparação de uma fina camada de

células sobre uma lâmina de vidro, que posteriormente será corada para posterior observação

ao microscópico, sendo essencial para uma correta investigação hematológica.

Apenas é efetuado quando solicitado pelo clínico, ou quando quem está a validar achar

pertinente a sua execução para confirmar e/ou complementar os resultados fornecidos pelo

equipamento.

Amostra: Sangue total colhido em tubo com EDTA K3.

Execução do Esfregaço de Sangue Periférico

1. Depositar uma gota de sangue na extremidade de uma lâmina (lâmina 1),

próximo da zona esmerilada (figura 13-A);

2. Segurar outra lâmina (lâmina 2) ou lamela e deslocá-la, sempre apoiada na

lâmina 1, até à gota de forma a que ambas façam um ângulo de 30º a 45º (figura 13-

B);

3. Deixar que a gota se difunda ao longo da lâmina 2 (figura 13-B);

4. Com um movimento uniforme, deslizar a lâmina 2 no sentido da extremidade

livre até que o sangue se esgote (Figura 13-C e D);

5. Identificar a amostra e deixar secar.

Figura 13. Ilustração de como fazer um esfregaço de sangue periférico,

à esquerda e esfregaço bem executado, à direita [102].

A B C D




Coloração do Esfregaço de Sangue Periférico

Equipamento: RAL Stainer (Figura 14)

Método: Coloração de May-Grünwald-Giemsa (coloração panótica)

1. Solução May-Grünwald, permite fixar o esfregaço, pelo metanol presente na

solução (solução metanólica de eosinato de azul de metileno);

2. Solução May-Grünwald com tampão fosfato, permite dissociar o corante em

eosina e azul de metileno;

3. Solução de Giemsa com tampão fosfato, permite a dissociação do corante em

eosina, azul de metileno e azur de metileno.

A eosina (corante ácido) cora os componentes citoplasmáticos básicos da célula de rosa-

alaranjado (eosinófilos ou acidófilos) e o azul de metileno (corante básico) cora o núcleo e os

componentes citoplasmáticos ácidos da célula de azul-arroxeado (basófilos). A granulações que

coram com o azul de metileno e a eosina ficam rosas (neutrófilas). O azur de metileno cora as

granulações azurófilas de vermelho-púrpura.

Observação ao Microscópio Ótico do Esfregaço de Sangue Periférico Corado

Para observar um esfregaço morfológico de sangue periférico é necessário em primeiro

lugar observar o esfregaço com uma objetivas de baixa ampliação (10x) para avaliar a qualidade

Figura 14. Equipamento de coloraçãoAutomate RAL Stainer.



Leticia de Bastos

117

da preparação e a distribuição celular. Posteriormente, com a objetiva de maior ampliação (40

e 100x) observar a morfologia da serie eritrocitária, plaquetar e leucocitária bem como realizar

a contagem de leucócitos e eritroblastos, numa região do esfregaço onde as células se encontram

individualizadas.

Série Vermelha

As alterações da série vermelha podem manifestar-se de diversas formas, podendo

observar-se reticulócitos e/ou eritroblastos no sangue periférico, anisocitose9, poiquilocitose,

anisocromia, mas também inclusões eritrocitárias (que podem ser causadas ou não por infeção

parasitária) (Tabela 10) [103].

Na presença de eritroblastos o Sysmex XN-1000TM efetua automaticamente a correção

da fórmula leucocitária.


coloração de May-Grünwald-Giemsa e as principais causas (Adaptado [103]).

Imagem Alteração Principais Causas

Tamanho

Microcitose

Anemia ferropénica

Algumas hemoglobinopatias

Anemia da doença crónica

Macrocitose

Anemia megaloblástica

Mielodisplasia

Doença hepática crónica

Alcoolismo

Quimioterapia

9 A avaliação do RDW juntamente com o grau de anisocitose é importante nas anemias microcítica hipocrómicas para auxiliar

na distinção ente anemia ferropénica (RDW> 15% com elevada anisocitose eritrocitária) e hemoglobinopatias (RDW normal).






Continuação.

Cor

Hipocromia

Anemia ferropénica

Talassemias

Anemia da doença crónica

“Hipercromia”10 Esferocitose hereditária

Policromasia11

Anemia regenerativa

Tratamento de anemias

Anemia hemolítica

Forma

Esferócitos

Esferocitose hereditária

Doença hemolítica do recém-nascido por

incompatibilidade ABO

Reações transfusionais

Anemia hemolítica autoimune

Queimaduras extensas

Eliptócitos

Eliptocitose hereditária


Anemia ferropénica

Talassemias

Estomatócitos

Estomatocitose hereditária

Alcoolismo

Doença hepática obstrutiva

10 Geralmente cursa com CHGM entre 36 a 38g/dL, no entanto quando não se observam esferócitos no sangue periférico,

possivelmente a amostra estará hemolisada ou será um erro do equipamento (por exemplo, poderá ser necessário calibrar). 11 Coloração acinzentada dos eritrócitos, devido à presença de proporções idênticas de componentes ácidos e básicos –

correspondente aos reticulócitos.



Leticia de Bastos

119



Continuação.

Células em alvo ou target cells

Hemoglobinopatias

Anemia ferropénica

Drepanocitose

Doença hepatobiliar

Pós-esplenectomia

Drepanócitos Drepanocitose

Acantócitos

Acantocitose hereditária

Doença hepática

Pós-esplenectomia

Má absorção lipídica

Equinócitos

Urémia

Insuficiencia renal

Défice de piruvato cinase

Queimadura grave

Dacriócitos

Talassemia

Anemia ferropénica


Mielofibrose

Esplenomegalia

Síndromes Mielodisplásicas

Esquizócitos

e

Queratócitos

Anemia hemolítica secundária a implantes

Doença hemolítica microangiopática

Coagulação intravascular disseminada

(CIVD)

Inclusões Eritrocitárias

Pontuado Basófilo

Perturbações da eritropoiese

Intoxicação por chumbo

Drepanocitose

Talassemia

Anemia megaloblástica e sideroblástica






Continuação.

Doença hepática (alcoolismo)

Corpos de Howell-Jolly

Pós-esplenectomia


Anemia hemolítica

Anel de Cabot

Anemia perniciosa

Intoxicação por chumbo

Em determinadas situações pode observar-se alterações na distribuição dos eritrócitos

(rouleaux12, aglutinação13) ou a presença de 2 populações distintas (dimorfismo), podendo ser

consequência da doença, tratamento ou transfusão.

Série Branca

Permite observar a morfologia dos leucócitos, estado de maturação (aspeto da

cromatina/citoplasma) (Anexo VI), presença de blastos, assim como corrigir/confirmar

fórmulas leucocitárias emitidas pelo equipamento. Também permite analisar a presença de

linfócitos atípicos, célula picnóticas, bastonetes de Auer, corpos de Döhle, céluas de Pelger-

Huët ou Pseudo Pelger-Huët, a granulação dos neutrófilos ou a presença de vacúolos. Algumas

alterações quantitativas da fórmula leucocitária encontram-se na Tabela 11 [103].

12 Eritrócitos aderem uns aos outros formando pilhas de eritrócitos. Pode ocorrer em situações de gravidez e doenças

inflamatórias, infeciosas ou mieloma múltiplo. 13 Pode ocorrer pela presença de auto-anticorpos ou crioaglutininas.



Leticia de Bastos

121

Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a

coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas (Adaptado [103]).

Leucócitos

(4-10x109/L)

Alterações

(V.R) Causa Possível

Neutrófilos

(45-70%)

Neutropénia

(<1.5x109/L)

Hereditária

Drogas, Alcolismo


Causa medicamentosa

Hemoglobina Paroxística Noturna

Hiperesplenismo

Imune

Doença hemato-oncológica

Aplasia medular

Neutrofilia

(>7.0x109/L)

Hereditária

Inflamação/Infeção

Síndrome Mieloproliferativo

Tratamento com corticosteroides

Últimos meses de gravidez

Intoxicação

Tabagismo

Eosinófilos

(1-5%)

Eosinofilia

(>0.4x109/L)

Alergias

Síndrome hipereosinofílica idiopática

Hipersensibilidade medicamentosa

Infeção parasitária

Doença linfoproliferativa

Síndrome Mieloproliferativo

Doenças autoimunes

Basófilos

(<1%)

Basofilía

(> 0.1x109/L)

Síndromes Mieloproliferativos

Leucemias




Tabela 11. Alterações quantitativas da serie branca que podem ser observados com a

coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas (Adaptado [103]). Continuação.

Leucócitos

(4-10x109/L)

Linfócitos

(20-40%)

Linfopénia

(<1.0x109/L)

Terapêutica com corticosteroides

Imunodeficiências

Linfocitoses

(>3.7x109/L)

/L)

Infeções viral

Mononucleose Infeciosa

Lupus Sistémico Eritematoso

Toxoplasmose

Doenças Autoimunes

Leucemia Linfocítica Aguda e

Crónica

Macroglobulinémia de Waldenström

Monócitos

(2-10%)

Monocitopénia

(<0,2x109/L)

Leucemia a “hairy cells”

Terapêutica com glucocorticoides

Monocitose

(>0.7x109/L)

Infeções (tuberculose, malária, febre

tifoide, endocardite bacteriana…)

Doenças inflamatórias

Linfoma de Hodgkin

Leucemias Mielomonocítica e

Monocítica

Síndromes Mielodisplásicos

V.R: Valores de referência do Adulto; >: acima de; <: abaixo de.

Série Plaquetar

Permite observar a morfologia das plaquetas (anisocitose plaquetar, plaquetas gigantes),

granulação, distribuição (agregados, satelitismo) e confirmar alterações quantitativas (Tabela

12) [103].



Leticia de Bastos

123

Tabela 12. Alterações quantitativas da serie plaquetar que podem ser observados com a

coloração de May-Grünwald-Giemsa e principais causas.

Alterações

(V.R) Causa Possível

Trombocitopénias

(< 150x109/L)

Presença de auto ou alo-anticorpos, infeções virais, malária, Púrpura

Trombocitopenia Imune, Síndrome Hemolítico Urémico, CIVD, trombocitopénia

gestacional, sequestração esplénica, cirrose hepática, neoplasias hematológicas,

aplasia medular, infiltração medular ou trombopoiese ineficaz.

Trombocitoses

(> 450x109/L)

Processos inflamatórios agudos, após hemorragias ou distúrbios

mieloproliferativos.

V.R: Valores de referência do adulto; >: acima de; <: abaixo de.

8.1.2. Velocidade de Sedimentação Eritrocitária

A velocidade de sedimentação eritrocitária (VS) reflete a presença de uma resposta

inespecífica do organismo a uma agressão, embora seja útil para auxiliar e identificar um

processo inflamatório, infecioso ou neoplásico, avaliar a extensão e atividade da doença, bem

como a resposta à terapêutica. Um resultado normal não exclui a existência de doença [104].

A VS é definida pela distância, em milímetros, que os RBC percorrem por ação da

gravidade num determinado período de tempo, geralmente 1h [104].

Na presença de doença inflamatória verifica-se o aumento de proteínas de fase aguda

no plasma, nomeadamente do fibrinogénio. Como possuem carga positiva são atraídas para a

superfície dos RBC, neutralizando as cargas repulsivas. Deste modo, os eritrócitos tendem a

agregar-se com formação de rouleaux, aumentando a massa celular o que consequentemente

leva ao aumento da VS. No entanto, patologias que levam a anomalias na forma dos eritrócitos

levam à diminuição da VS, por interferir com a formação de rouleaux. Na insuficiência hepática

e cardíaca, no uso de anti-inflamatórios e na hipofibrinogenémia, a VS está diminuída por

dificuldade de agregação celular [104].

Por outro lado, em situações de anemia, leucemia, policitémia, no decurso de neoplasias

malignas, bem como nos recém-nascidos, a VS está aumentada, por diminuição das forças

repulsivas que mantêm as células em suspensão [104].




No laboratório, a medição da VS é feita num equipamento automatizado:

Equipamento: Alifax Test 1 THL (Figura 15)

Amostra: Sangue total colhido em tudo de EDTA K3.

Método: Fotometria capilar de fluxo.

O sangue é aspirado para um capilar o qual é centrifugado a 20g, a uma temperatura de

37ºC e a leitura é feita por fotometria de infravermelhos a 950nm. Os impulsos elétricos

captados por um detetor de fotodíodos estão diretamente relacionados com a concentração de

eritrócitos no capilar. O número de impulsos medidos, por metade do tempo, é usado para

delinear a curva de sedimentação para cada amostra. Estes valores são depois convertidos para

valores comparados ao Método de Westergreen (método de referência) [105].

Valores de Referência: 0 - 20mm/h.

8.2. Hemoglobina Glicada

O doseamento da hemoglobina glicosilada ou glicada (HbA1c) é um indicador de grande

utilidade clínica, principalmente nos doentes diabéticos, pois permite obter uma retrospetiva

dos níveis médios de glicémia dos últimos 120 dias [106]. O seu doseamento é efetuado na seção

de hematologia por uma questão de logística do próprio Serviço de Patologia Clínca.

Figura 15. Alifax Test 1 THL



Leticia de Bastos

125

A HbA1c resulta de uma reação não enzimática, lenta e irreversível (glicação), que

ocorre entre a glucose que circula no sangue e os grupos amina livres existentes na hemoglobina

A (HbA) dos eritrócitos. Esta reação varia em função da concentração da glucose a que os

eritrócitos são expostos, ao longo do seu tempo de vida [106, 107]. As vantagens do seu doseamento

prendem-se como facto de [107]:

Os indivíduos não necessitarem de estar em jejum para efetuar a colheita,

podendo ser feita a qualquer hora do dia;

Refletir a concentração de glucose no sangue dos últimos 3-4 meses;

A sua concentração predizer o desenvolvimento de complicações

microvasculares da diabetes;

Orientar o tratamento.

Tem como desvantagens a possibilidade de o resultado ser falseado pela presença de

hemoglobinopatias ou outras doenças que alterem o tempo de vida dos eritrócitos [107].

Equipamento: Arkray AdamsTM A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics (Figura 16)


Método: Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC, do inglês High Performance

Liquid Chromatography).

Esta metodologia utiliza uma coluna composta por uma resina de troca catiónico de fase

Figura 16. Arkray Adams A1c HA-8160, da A. Menarini Diagnostics




reversa. As hemoglobinas (Hb), carregadas positivamente, são separadas nas diferentes

componentes através da adsorção na fase estacionária (carregada negativamente), presente na

coluna cromatográfica, sendo posteriormente eluída pela fase móvel [108].

A identificação das diferentes hemoglobinas baseia-se na análise dos tempos de retenção

da amostra em relação aos controlos e a deteção é feita pela determinação da absorvência a 415

e 500nm. Podendo assim obter-se as seguintes frações: HbA1c, HbA1, HbF, HbA2 e

hemoglobinas variantes. A HbE pode sobrepor-se à HbA2. Este aparelho é capaz de diluir,

hemolisar e remover a base de Schiff (resultado da reação responsável pela formação da

hemoglobina glicosilada) automaticamente [108].

Para quantificar a hemoglobina, basta calcular a área abaixo do pico [108].

Valores de Referência: 4-6%

8.3. Eletroforese das Hemoglobinas

A hemoglobina é o principal constituinte do eritrócito e tem como principal função o

transporte de oxigénio e dióxido de carbono. É uma proteína globular com estrutura tetramérica,

constituída por dois pares de subunidades polipeptídicas, designadas de globinas. Cada cadeia

de globina encontra-se ligada a um grupo prostético - o heme, cada um contendo um átomo de

ferro, ao qual se liga o oxigénio, se se apresentar na forma ferrosa (Fe2+) [109].

Ao longo do desenvolvimento são sintetizadas quantidades variáveis de vários tipos de

hemoglobina até à altura em que o seu padrão de síntese é praticamente igual ao do adulto

(Figura 17) [96].

As hemoglobinopatias são doenças hereditárias caracterizadas por mutações dos genes

das globinas, levando a alterações quantitativas da síntese de alguma das cadeias de globina

(talassémias) ou à síntese de uma globina estruturalmente diferente - alteração qualitativa -

levando à formação de uma hemoglobina anómala, comprometendo a sua função vital [111].

Existem diversas variantes de hemoglobina, tais como a hemoglobina C, E, H e S [112].



Leticia de Bastos

127

Figura 17. Representação esquemática da percentagem da produção de diversos tipos de hemoglobinas desde o inicio

da gestação até à idade adulta [110].

Equipamento: HYDRASYS, da Sebia (Figura 18)


Método: Eletroforese das hemoglobinas em pH alcalino (pH 8.0-9.0) e coloração com

solução de negro de amido, sendo o excesso de corante eliminado com uma solução ácida [112].

A estrutura espacial da Hb e outras propriedades moleculares dependem da sua natureza

e da sequência de aminoácidos que formem as cadeias. Uma mutação, que leva à substituição

de aminácidos, é responsável pelo aparecimento de variantes de Hb que possuem diferentes

cargas superficiais e consequentemente diferentes mobilidades eletroforéticas, dependendo do

pH, força iónica do tampão e da natureza do suporte [112].

Hemoglobinas embrionárias

Hb Gower 1 ζ2ε2

Hb Gower 2 α2ε2

Hb Portland ζ2γ2

Hb Fetal α2γ2

Hb adulto α2β2

α2δ2

Figura 18. HYDRASYS, da sebia.




As eletroforeses são executadas a partir do hemolisado dos eritrócitos e a separação

eletroforética ocorre em gel de agarose. As hemoglobinas, carregadas negativamente, quando

submetidas a um campo elétrico irão migrar em direção ao polo positivo. Posteriormente, são

analisadas visualmente e avaliadas por densitometria, o que permite obter uma quantificação

relativa e precisa das diferentes hemoglobinas presentes no sangue periférico. Este método

permite separar e identificar hemoglobinas normais e as principiais hemoglobinas anómalas:

HbS ou HbD e HbE ou HbC (Figura 19) [112].

HbS: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma valina.

HbC: substituição do ácido glutâmico na posição 6 da cadeia β por uma lisina.

HbE: substituição do ácido glutâmico na posição 26 da cadeia β por uma lisina.

HbD: substituição do ácido glutâmico na posição 121 da cadeia β por uma glutamina.

Valores de Referência: Adulto - HbA1 ≥ 96.5%; HbA2 ≤ 3.5% e HbF ≤ 2.0%

8.4. Hemostase

A hemostase é um processo fisiológico complexo que permite preservar a normal

funcionalidade da circulação sanguínea, tendo um papel importante na manutenção da

integridade vascular e fluidez do sangue [113].

Figura 19. Migração, em pH alcalino, das hemoglobinas normais à esquerda e as variantes mais frequentes à direita.

+

-

Migração



Leticia de Bastos

129

O sistema hemostático engloba cinco componentes fundamentais, os vasos sanguíneos,

plaquetas, que devem ser normais em número e funcionalmente, fatores plasmáticos, seus

inibidores e o sistema fibrinolítico [113].

Após uma lesão vascular ocorre uma vasoconstrição local e a exposição ao colagénio

conduz à adesão e agregação plaquetária, com formação de um trombo plaquetário, e à ativação

da cascata da coagulação - hemostase primária [113].

Na hemostase secundária, segundo o modelo clássico14, existem 2 vias distintas que

convergem para uma via comum, com formação do coágulo de fibrina. A via intrínseca é

ativada quando o quininogénio de alto peso molecular, a pré-calicreína e o fator XII entram em

contacto com a superfície dos fosfolípidos das plaquetas ativadas (carga negativa), enquanto

que a via extrínseca é ativada pelo fator tissular, sendo a sua expressão induzida, na superfície

das células, pela lesão dos tecidos e citocinas inflamatórias (Figura 20) [113].

Toda a cascata da coagulação é regulada por vários mecanismos inibidores, que têm por

objetivo limitar a extensão e a disseminação do processo da coagulação, sendo de destacar o

sistema da proteína C/proteína S, a antitrombina e o inibidor do fator tissular [113].

14 Foi proposto um novo conceito para a cascata da coagulação, que começa a ser cada vez mais evidente a existência de apenas

uma via para a formação do trombo de fibrina.

Figura 20. Cascata da coagulação [114]. Ambas as vias intrínseca e extrínseca convergem na

ativação do fator X, que juntamente com o fator V

ativado, Ca2+ e fosfolípidos irão converter o fator II a

trombina, desencadeando a formação do coágulo de

fibrina. O feedback positivo amplifica o sinal, no

entanto um feedback negativo promove a ativação de

vários mecanismos anticoagulantes, com a inibição de

diversos fatores procoagulantes pela antitrombina,

inibição do complexo TF/FVIIa/FXa pelo inibidor da

via do fator tissular, e inativação proteolítica do FVa

e FVIIIa pela proteína C ativada. A trombina, aPC e

outras proteases de coagulação regulam a inflamação

e a remodelação do tecido.

TF: fator tissular (do inglês tissue factor); a: ativado;

F: fator; AT: Antitrombina; TFPI: inibidor da via do

fator tissular (do inglês tissue factor pathway

inhibitor), PC: proteína C.




Por fim, segue-se a fibrinólise (hemostase terciária), importante para restaurar a

integridade do vaso, sendo mediada pelo ativador do plasminogénio tissular (t-PA) que converte

o plasminogénio em plasmina, que por sua vez, degrada a fibrina, podendo ser inativada pela

α2-antiplasmina (α2-AP). A fibrinólise é bloqueada pelo inibidor do ativador do plasminogénio

(PAI-1), produzido essencialmente pelas células endoteliais (Figura 21) [113].

É necessário que haja um equilíbrio constante entre a coagulação e a fibrinólise, tanto

que uma potencial disfunção em qualquer uma das etapas pode levar ao aparecimento de

hemorragias ou tromboses, sendo por isso muito importante a avaliação laboratorial da

hemostase. Testes específicos devem ser efetuados sempre que se verifiquem alterações nos

testes de rastreio, e são necessários para determinar a natureza do defeito.

Equipamento: STA Compact Max® (Figura 22)

Figura 21. Sistema fibrinolítico e inibidores da fibrinólise [115].

PDF: Produtos de degradação da fibrina; PAI-1: inibidor do ativador do plasminogénio, t-PA: ativador do plasminogénio

tecidual; u-PA: urocinase; α2-AP: α2-antiplasmina.

Figura 22. STA Compact Max®, da Satgo.



Leticia de Bastos

131

Amostra: Plasma citratado, obtido por centrifugação de sangue total colhido para tubo

com anticoagulante citrato trissódico 0,109M, a 1500rpm, 10 minutos. Para pedidos de

coagulação especiais tem de se proceder a uma dupla centrifugação da amostra para se obter

plasma pobre em plaquetas. A contagem de plaquetas é efetuada no equipamento dos

hemogramas, sendo que apenas se processam os plasmas que apresentarem um valor de

plaquetas inferior a 5x109/L; se o valor obtido for superior procede-se a uma nova

centrifugação.

O STA Compact Max® é concebido para auxiliar no diagnóstico de distúrbios

hemostáticos ou na monitorização da terapêutica anticoagulante. Possui 2 tecnologias

fundamentais: o princípio de medição por cronometria e o princípio de medição por fotometria

[116].

O princípio de medição por cronometria consiste na deteção mecânica do coágulo, em

que se mede a variação da amplitude de oscilação da esfera, através de sensores indutivos. Cada

cuvete de reação possui uma esfera metálica que apresenta um movimento pendular obtido

graças a um campo eletromagnético alternativo criado por 2 bobinas independentes. À medida

que a viscosidade aumenta, devido à formação do coágulo de fibrina, a amplitude de oscilação

diminui, sendo medido o tempo, em segundos, que o coágulo demora a formar-se (Figura 23)

[116].

O princípio de medição por fotometria é o principio de deteção das análises

cromogénicas (reacção enzimática) ou imunoturbidimétricas. Baseia-se na determinação da

absorvência (densidade ótica) de uma fonte de luz monocromática (405 ou 540nm) que

posteriormente é convertida em concentração, pela aplicação da Lei de Lambert-Beer [116].

No laboratório, diversos parâmetros são determinados para avaliar a hemóstase.

Figura 23. Princípio de medição por cronometria [117].




8.4.1. Determinação do Tempo de Protrombina

O tempo de protrombina (TP) é utilizado para monitorizar a terapêutica com

anticoagulante oral, controlo da síntese hepática e na avaliação da presença de distúrbios na

cascata da coagulação ao nível da via extrínseca e comum (Tabela 13) [118].

Método: Cronométrico [119]

Na presença de tromboplastina cálcica é medido o tempo de coagulação do plasma do

doente [119].

Valores de Referência: 12,8-15,70seg; 74,8-106,5%

Na tentativa de obviar a enorme discrepância entre os diferentes tipos de testes que

avaliam o TP, a OMS preconizou o uso do Índice Internacional Normalizado (INR, do inglês

International Normalized Ratio) para padronizar os resultados do teste. Para o cálculo do INR

os fabricantes da tromboplastina fornecem o International Sensitivity Index (ISI) [120]:

𝐼𝑁𝑅 = (𝑇𝑃 𝑈𝑡𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑚 𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜𝑠

𝑇𝑃 𝑅𝑒𝑓𝑒𝑟ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑚 𝑠𝑒𝑔𝑢𝑛𝑑𝑜𝑠)

𝐼𝑆𝐼

8.4.2. Determinação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada

O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, do inglês, activated partial

thromboplastin time) avalia a via intrínseca e comum da cascata da coagulação, sendo também

utilizado na monitorização da terapêutica com heparina (Tabela 13) [118].


Na presença de cefalina (substituto plaquetário), caulino (ativador do fator XII) e cloreto

de cálcio é medido o tempo de coagulação do plasma [121].

Valores de Referência: 25,4-34,3seg



Leticia de Bastos

133

8.4.3. Determinação do Tempo de Trombina

O tempo de trombina (TT) avalia o tempo de conversão do fibrinogénio em fibrina [118];

no entanto, não sofre alterações em situações de défices de fator XIII (fator estabilizador da

fibrina) (Tabela 13) [122].


Na presença de uma determinada quantidade de trombina cálcica é medido o tempo de

coagulação do plasma [122].

Valores de Referência: 11-16seg

8.4.4. Determinação do Fibrinogénio

Glicoproteína de fase aguda positiva, sintetizada a nível hepático, presente em grande

quantidade no plasma, fundamental para a formação do trombo de fibrina (Tabela 13) [118].

Método: Cronométrico (método de Clauss) [123]

Na presença de um excesso de trombina, o tempo de coagulação de um plasma, diluído

em proporções adequadas, depende diretamente do nível de fibrinogénio plasmático [123].

Valores de Referência: 2-4g/L

8.4.5. Determinação do Anticoagulante Lúpico

Imunoglobulinas dirigidas contra complexos fosfolípidos/proteínas, com ação

procoagulantes. interferindo com teste laboratoriais dependentes de fosfolípidos. Encontra-se

associado a doenças auto-imunes, tromboses e abortos recorrentes, sendo que a sua presença

pode ser transitória ou persistente [125].


O teste de screening é realizado na presença de uma baixa concentração fosfolípidos,

em que na presença de anticoagulante lúpico o tempo de coagulação será prolongado.

Posteriormente, o teste confirmatório é realizado com uma concentração mais elevada de




fosfolípidos que neutralizam os anticoagulantes lúpicos presentes no plasma a testar, e

consequentemente o tempo de coagulação será mais curto, comparativamente ao teste de

screening [125].

Os reagentes contêm fosfolípidos, cálcio, um inibidor da heparina e veneno de víbora

Russell (um ativador do fator X que na presença de cálcio desencadeia a coagulação,

eliminando as interações dos fatores da via intriseca e extrínseca) [125].

Valores de Referência: Negativo ou Positivo (rácio superior a 1.2)

8.4.6. Determinação da Antitrombina III

Gliciproteína de síntese hepática, responsável pela inibição de diversos fatores da

coagulação, nomeadamente os fatores IIa (trombina), IXa, Xa, XIa, XIIa, sendo esta reação

acelerada pela presença de heparina [126].

Os défices de antitrombina III podem ser hereditários ou adquiridos, podendo ocorrer

em situações de CIVD, síndromes nefróticos ou alterações hepáticas [126].

Método: Cromogénico [126]

Primeiro ocorre a incubação do plasma com heparina e um excesso de trombina. De

seguida, é medida a trombina residual, pela sua atividade amidolítica no substrato cromogénio.

A libertação de paranitroanilina é medida a 405nm. A quantidade de trombina neutralizada é

proporcional à quantidade de antitrombina presente no meio [126].

A quantificação não é influenciada pela heparina terapêutica [126].

Valores de Referência: 80,0-130,0%



Leticia de Bastos

135

Tabela 13. Teste de primeira linha para investigação de alterações hemostáticas

(Adaptado de [124]).

Parâmetros doseados

Condições

TP aPTT TT Fibrinogénio Contagem

Plaquetas

N N N N N

Hemostase normal

Disfunção plaquetária (congénita ou adquirida)

Défice de FXIII

Défice/doença leves da coagulação

Distúrbios fibrinolíticos

Distúrbios vasculares

N N N N

Défice FVII (congénito ou adquirido)

Anticoagulante oral (cumarínicos)

Doença hepática crónica

N N N N

Défice de fatores da via intrínseca (congénito

ou adquirido)

Doença de von Willebrand (défice de FVIII)

Anticoagulante lúpico

Terapêutica com heparina

N N N

Défice de Vitamina K

Anticoagulantes orais

Défice de fatores da via intrínseca e extrínseca

Doença hepática

N/Anormal N

Altas doses de heparina

Doença hepática

Disfibrinogénia ou Hipofibrinogenémia

Inibição da polimerização da fibrina

Hiperfibrinólise

N N/Anormal Doença hepática

Doença hepática aguda

CIVD

N: normal; ↑: alto; ↓: baixo.




8.4.7. Determinação da Proteína C ativada

Proteína de síntese hepática, vitamina K-dependente, que se encontra no plasma na

forma de pro-enzima, sendo ativada na presença da trombina, cálcio e fosfolípidos. Esta

ativação é potencializada por um fator endotelial, a trombomodulina. Quando ativada e na

presença da proteína S, regula o processo de coagulação, neutralizando os fatores Va e VIIIa.

A sua ação é inibida pelo inibidor da proteína C ativada e pela α1-antitripsina [127].

Os défices de proteína C podem ser congénitos, que se traduzem essencialmente na

trombose venosa com recidivas, ou adquiridas, podendo ocorrer pela presença de doença

hepáticas, tratamento com medicamentos anti-vitamina K e CIVD [127].

Método: Cromogénico [127]

Na presença de um ativador específico, a proteína C presente no plasma é ativada. A

quantidade de enzima formada é doseada pela sua atividade amidolítica sobre um substrato

sintético. A libertação de paranitroanilina é medida a 405nm [127].

Valores de Referência: 70,0-130,0%

8.4.8. Determinação da Proteína S Livre

Proteína plasmática, vitamina K-dependente, sintetizada no fígado, que atua como

cofator da proteína C ativada, amplificando a sua ação anticoagulante [128].

Os défices em proteína S predispõe a um estado de hipercoaguabilidade que aumenta o

risco de doença tromboembólica, os quais podem ser de origem congénita ou adquirida, e

podendo estar associados a síndromes inflamatórios, alterações hepáticas, síndrome nefrótico,

contracetivos orais e tratamentos com medicamentos anti-vitamina K [128].

Método: Imunoturbidimétrico [128].

As microesferas de látex possuem anticorpos monoclonais específicos para a proteína

S; na presença da proteína S livre, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas microesferas,

elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [128].




Leticia de Bastos

137

8.4.9. Determinação dos D-Dímero

Ao nível do trombo, a fibrina é degradada pela plasmina em D-Dímeros, que

testemunham a atividade fibrinolítica, secundária a ativação da coagulação, sendo útil a sua

determinação para a exclusão de tromboembolismo venoso, quando o seu valor é inferior a 500

µg/L. Também se verifica o aumento dos D-Dímeros na CIVD, períodos pós-operatórios,

neoplasias, hemorragias e patologias infeciosas graves [129].

É recomendado a determinação dos D-Dímeros antes de se iniciar qualquer terapêutica

anticoagulante [129].

Método: Imunoturbidimétrico [129]

As microesferas de látex possuem anticorpos monoclonais específicos para D-Dímeros;

na presença de D-Dímeros, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas microesferas,

elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [129].

Valores de Referência:0-500µg/L

8.4.10. Fator von Willebrand

Glicoproteína sintetizada pelas células endoteliais e macrófagos. Desempenha um papel

preponderante na adesão das plaquetas ao sub-endotélio vascular e na formação de trombos

pela sua ligação aos complexos glicoproteicos Ib/IX e IIb/IIIa. Também intervém na hemostase

secundária como transportador do fator VIII, protegendo-o da degradação [130].

O défice de factor von Willebrand está associado à doença de von Willebrand; no

entanto, outras patologias podem levar à diminuição deste fator, nomeadamente mieloma,

linfoma e lúpus sistémico eritematoso. O aumento desta glicoproteína ocorre sempre que o

epitélio vascular é lesado [130].

Método: Imunoturbidimétrico [130]

As microesferas de látex possuem anticorpos específicos para o fator von Willebrand;

na presença do fator von Willebrand, no plasma a testar, ocorre a aglutinação destas

microesferas, elevando a turvação da mistura reacional, medida por fotometria [130].




Valores de Referência: Grupo sanguíneo O: 42.0-141.0%; 0.42-1.41UI/mL e Grupo

sanguíneo A, B e AB: 66.1-176.0%; 0.66-1.76UI/mL

8.4.11. Fator VIII

Glicoproteína sintetizada no fígado, baço, rins e linfócitos, que circula no plasma ligado

ao fator de von Willebrand (ligação não covalente). Pode ser ativado pela trombina e pelo fator

Xa. O fator VIIIa acelera a ativação do fator X, na presença do fator IXa, fosfolípidos e cálcio

[131].

Encontra-se diminuído na Hemofilia A, na presença de inibidores específicos do fator

VIII, e nalgumas doenças como a de von Willebrand. No entanto, pode estar aumentado em

complicações tromboembólicas, aterosclerose coronária, insuficiência renal, diabetes e

síndromes inflamatórios [131].


Na presença de cefalina e do ativador, é determinado o tempo de coagulação de um

sistema onde todos os fatores são presentes em excesso, à exceção do fator VIII da amostra a

testar [131].




Leticia de Bastos

139

9. Valência de Microbiologia

9.1. Marcha Laboratorial em Microbiologia

O Laboratório de Microbiologia pode fornecer informações cruciais para o diagnóstico

e tratamento de doenças infeciosas suspeitas ou confirmadas, contudo tal só é possível se as

amostras forem de boa qualidade e acompanhadas por informação clínica pertinente (Figura

24).

Neste setor, todo o procedimento que envolva manipulação de amostras

biológicas/microrganismos é feito em câmaras de fluxo laminar, de modo a assegurar a

manutenção do ar estéril na zona de trabalho e a proteção do operador. Na câmara de fluxo

Local: Serviço de Patologia Clínca do Hospital Nossa Senhora da Graça, Tomar


Dra. Paula Gama (Patologista Clínica)

Dra. Arminda Gonçalves (Técnica Superior de Saúde)

Dr. Luís Morais (Técnico Superior de Saúde)


Volume de trabalho: Em média cerca de 1641pedidos/mês



Processamento de amostras biológicas;

Execução, fixação e coloração de esfregaços;

Realização de testes screening para identificação de microrganismos;

Execução de testes de identificação e testes de suscetibilidade aos

antimicrobianos.




laminar existe um bico de Bunsen para a esterilização do material a uso (pinças ou tesouras) e

fixação dos esfregaços. As ansas utilizadas são estéreis e de uso único.

Figura 24. Marcha laboratorial em Microbiologia, quando um doente possui uma infeção.

Doente com Infeção

Colheita e transporte da amostra

Receção da amostras e avaliação da

conformidade

Observação do Exame Direto

Observação do Exame Cultural

Provas Complementares

Culturas Puras

Identificação

Teste de suscetibilidade aos

antimicrobianos

Informação

preliminar

Validação

final

INF

OR

MA

ÇA

O C

LÌN

ICA

Processamento da Amostra



Leticia de Bastos

141

9.2. Exame Microscópico

O exame microscópico, que inclui o exame “a fresco” e/ou após coloração, é a primeira

etapa do estudo para identificação de microrganismos. Também permite avaliar a qualidade da

amostra, bem como observar a existência de possíveis elementos celulares cuja presença pode

facilitar o diagnóstico.

9.2.1. Exame Direto a Fresco

Amostra: Produto biológico.

Objetivo: Permite fazer uma avaliação semi-quantitativa de elementos celulares e

microrganismos (bactérias, fungos e parasitas).

Procedimento: Colocar o produto numa lâmina, cobrir com uma lamela e observar ao

microscópio com a objetiva de 10 e 40x. No caso da urina, centrifugar a 1500rpm, 10 minutos,

antes de observar.

9.2.2. Exame após Coloração

Equipamento: Poly Stainer, da IUL Instruments®

Antes de se proceder à coloração, os esfregaços têm de estar secos e fixados pelo calor,

à chama do bico de Bunsen. Deste modo, as formas vegetativas morrem e aderem à lâmina.

Depois de corados e secos, a observação é feita essencialmente com a objetiva de

imersão (100x).

Técnica de Esfregaços

Amostras biológicas líquidas e culturas de caldo: colocar o produto numa

lâmina e estender em camada fina.




Amostras biológicas sólidas e culturas de meios sólidos: colocar sobre a lâmina

uma gota de água destilada e juntar uma pequena porção do produto, emulsioná-la na

gota, estendendo de seguida.

Amostras espessas ou purulentas: técnica de estiramento - colocar uma porção

de produto numa lâmina e pressionando com outra lâmina, fazer deslizar as duas

lâminas ao longo uma da outra, várias vezes.

Exsudados colhidos por zaragatoa: rolar a zaragatoa sobre a lâmina. Se tiver

vindo só uma zaragatoa, primeiro proceder à sementeira dos meios de cultura sólidos,

de seguida fazer 2 esfregaços e só depois inoculá-la em meio líquido de

enriquecimento, se for necessário.

Coloração de Gram

Amostra: Produtos biológicos ou colónias isoladas provenientes do exame cultural.

Objetivo: Permite o diagnóstico presuntivo do agente infecioso, avaliação da qualidade

da amostra e da flora saprófita existente, para além de ser útil na classificação das bactérias em

Gram positivo ou Gram negativo, assim como distinguir a forma e o arranjo das células após

divisão celular. As bactérias podem apresentar-se, essencialmente, sob a forma de cocos

(redondas), bacilos (alongadas ou em bastonete), vibrião (curva) ou espirilo (espiralada).

Princípio: As bactérias podem ser classificadas em Gram positivo ou Gram negativo,

tendo em conta a estrutura da parede celular e a sua percentagem em peptidoglicano. As

bactérias Gram positivo possuem uma parede celular rica em peptidoglicano, capaz de reter o

primeiro corante, logo adquirem a cor púrpura. Como a parede das bactérias Gram negativo é

formada por uma fina camada de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de

lipopolissacarídeos e proteínas, que não retém o cristal violeta, sendo contra-coradas pela

safranina apresentando uma coloração vermelha (Figura 25) [132].



Leticia de Bastos

143

Procedimento: Colocar as lâminas no suporte do equipamento, verificar os reagentes e

selecionar o programa no aparelho de coloração. O programa executa os seguintes passos:

1. Cristal de violeta (1º corante): 1 minuto;

2. Lavagem com água corrente: 1,5 minutos;

3. Iodina (mordente, ajuda a fixar o primeiro corante): 1 minuto;

4. Lavagem com água corrente: 1,5 minutos;

5. Descoloração com solução álcool/acetona (solvente orgânico): 1 minuto;

6. Lavagem com água corrente: 1 minuto;

7. Safranina (2º corante, contraste): 1 minuto;

8. Secagem da lâmina.

Coloração de Kinyoun

Amostra: Líquidos serosos após descontaminação (observação de interferências

quando corados pela Auramina) e todos os produtos após exame cultural.

Objetivo: Permite detetar a presença de bacilos ácido-álcool resistentes (BAAR).

Figura 25. Representação esquemática da parede celular

das bactérias Gram negativo e Gram positivo [133].




Princípio: Os bacilos de Koch (BK), quando corados pela Fuscina, por possuírem uma

quantidade elevada de lípidos na parede celular, que lhe confere hidrofobicidade, vão resistir

fortemente à descoloração com soluções ácido-álcool, apresentando-se vermelhos sobre um

fundo azul.



1. Fucsina (1º corante): 4 minutos;

2. Lavagem com água corrente: 30 segundos;

3. Descorante ácido-álcool: 5 segundos;


5. Azul de Metileno (2º corante, contraste): 30 segundos;



Coloração de Auramina O

Amostra: Observação de produtos descontaminados, exceto líquidos serosos.

Objetivo: Detetar a presença de BAAR.

Princípio: A Auramina O é um corante fluorescente que cora os BAAR de amarelo-

esverdeado, o que permite distingui-las de outros microrganismos e estruturas celulares

presentes na lâmina. Este é um bom método para rastrear amostras em caso de suspeita de

tuberculose, onde a contagem de bacilos é geralmente baixa.



1. Auramina (1º corante): 15 minutos;


3. Descorante ácido-álcool: 40 segundos;



Leticia de Bastos

145


5. Fuscina (2º corante): 2 minutos;



9.2.3. Exame Direto a Fresco com Contraste Negativo por Tinta da China

Amostra: Produtos biológicos, nomeadamente LCR, ou colónias em cultura

Objetivo: Permite evidenciar a presença de Cryptococcus spp.

Princípio: A Tinta da China é utilizada como material contrastante. A presença da

cápsula do Cryptococcus spp. exclui a tinta, criando um halo transparente ao redor da cápsula

fúngica.

Procedimento: Diluir uma gota de Tinta da China em uma gota de soro fisiológico num

tubo e homogeneizar, posteriormente:

Se a amostra biológica for líquida ou de cultura em meio líquido, é necessário

proceder à sua centrifugação (1500rpm, 20 minutos) e pipetar uma gota do sedimento

para o tubo contendo a Tinta da China diluída;

Se forem colónias em meio sólido retirar uma porção da colónia em estudo e

colocar no tubo que contem a Tinta da China diluída.

Homogeneizar bem a preparação e pipetar uma pequena gota sobre uma lâmina e cobrir

com uma lamela. De seguida, observar ao microscópio.

9.2.4. Análise Morfológica de Fungos Filamentosos

Amostra: Colónias de fungos filamentosos em cultura.

Objetivo: Permite observar o tipo de hifas (septadas ou não), o pigmento (hialinos ou

demácios), bem como as estruturas reprodutoras dos fungos filamentosos, de modo a auxilixar

na sua identificação.




Procedimento: Tocar com a fita-cola na periferia da colónia e colocar sobre uma

lâmina que comtém uma gota de líquido de montagem (Azul de Lactofenol). De seguida

cobrir com uma lamela e observar ao microscópio.

9.3. Exame Cultural

A cultura primária de produtos biológicos para o estudo microbiológico destina-se à

recuperação de microrganismos para posterior identificação e eventual teste de suscetibilidade

aos antimicrobianos, quando justificável e possível. Para tal, é necessário adequar os meios de

cultura ao produto biológico a analisar assim como conhecer o tempo e as condições ideias de

crescimento dos agentes patogénicos.

Existem meios de cultura de natureza sólida, semi-sólida e líquida. No laboratório,

apenas são usados meios sólidos e líquidos. Os sólidos permitem a observação de colónias que

se desenvolvem à superfície da gelose e auxiliam na sua identificação. Os meios líquidos são

usados para o enriquecimento de produtos biológicos.

Os meios de cultura são escolhidos conforme o protocolo estabelecido pelo laboratório,

podendo ser:

Não seletivos: sem inibidores de crescimento e com nutrientes, permitem o

crescimento da grande maioria dos microrganismos encontrados em produtos

biológicos.

Seletivos: contêm uma mistura de antimicrobianos ou substâncias químicas que

permitem o crescimento de alguns microrganismos em detrimento de outros, cujo

crescimento é inibido.

Diferenciais: com substâncias químicas ou corantes, que permitem distinguir

grupos de microrganismos presentes no mesmo inóculo.

De enriquecimento: com nutrientes, permitem a multiplicação de

microrganismos de interesse que se encontram no produto biológico em baixo inóculo.



Leticia de Bastos

147

De transporte: mantêm a viabilidade dos microrganismos até 24h, geralmente,

inibindo a sua multiplicação e a sua escolha depende do produto biológico (meio

Amies, Cary-Blair, Portagerm Amies Agar).

De identificação: evidenciam características bioquímicas de determinadas

espécies, permitindo o seu reconhecimento e identificação.

No laboratório estão à disposição os seguintes meios (Tabela 14):

Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]).

Meio de Cultura Princípio Classificação

BHI

(Caldo Cérebro e

Coração, do

inglês Brain

Heart Infusion)

Meio de enriquecimento composto por uma base

nutritiva de coração e cérebro. Meio líquido de

enriquecimento

não seletivo

Selenito

Utilizado para coprocultura. A seletividade do

meio baseia-se na presença de selenito, que inibe a

maioria das Enterobacteriaceae, incluindo

algumas estirpes de Shigella spp e bactérias Gram

positivo. A subcultura para meios sólidos deve

ocorrer entre 6-12h (prazo médio de inibição de

outras estirpes, tal como o Proteus spp.)

Meio líquido de

enriquecimento

seletivo para

Salmonella spp.

COS

(Gelose de

Columbia +5% de

Sangue de

Carneiro)

Meio nutritivo, rico, complementado com sangue

desfibrinado de carneiro que permite observar a

presença ou não de hemólise e o tipo de hemólise

(critério básico para orientação da identificação de

algumas bactérias, como os Streptococcus spp. e

Staphylococcus spp.). Também é adequada para o

isolamento de microrganismos anaeróbios.

Meio sólido não

seletivo




Tabela 14. Descrição dos meios utilizados (Adaptado de [134]). Continuação.

CNA

(Gelose COS com

ácido nalidíxico e

colistina)

Meio rico que contém uma mistura de peptonas

adaptado à cultura de microrganismos exigentes

(Streptococcus spp., Listeria spp.). A mistura de

antimicrobianos inibe o crescimento da grande

maioria das bactérias Gram negativo e dos

Bacillus.

Meio sólido

seletivo para

Gram positivo

PVX

(Gelose

Chocolate

PolyViteX)

A Gelose de Chocolate é obtida a partir da Gelose

Columbia ao qual foi adicionado sangue de

carneiro aquecido a 80ºC (hemólise dos

eritrócitos), sendo rica em fatores X (hemina) e V

(NAD) fornecidos pela hemoglobina. É ainda

adicionado o PolyViteX, que fornece ao meio

vitaminas, aminoácidos, co-enzimas, glucose e

outros fatores que melhoram o crescimento de

estripes fastidiosas como Neisseria spp.,

Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae.

Meio sólido não

seletivo

HAE2

(Gelose

Chocolate

Heamophilus 2)

Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma

mistura de antimicrobianos que permitem inibir a

maioria das bactérias Gram positivo e das

leveduras.

Meio sólido

seletivo para

Haemophilus spp.

VCA3

(Gelose

Chocolate

VCAT)

Gelose de Chocolate à qual foi adicionada uma

mistura de antimicrobianos (Vancomicina,

Colistina, Anfotericina B, Trimetoprim) que

permitem inibir a maioria das bactérias e leveduras.

Meio sólido

seletivo para

Neisseria

gonorrhoeae e

Neisseria

meningitidis



Leticia de Bastos

149


HEK

(Gelose Hektoen)

O meio permite evidenciar colónias que fermentam

1 dos 3 açúcares contidos no meio (lactose,

sacarose, salicina) formando colónias amarelas ou

amarelas-salmão; os restantes produzem colónias

verdes ou verdes-azuladas. Os microrganismos que

reduzem o tiossulfato de sódio produzem sulfureto

de hidrogénio (H2S) formam colónias com centro

negro. As colónias de Salmonella são verdes ou

verdes-azuladas, com ou sem centro negro. As

colónias de Shigella são verdes ou verdes-azuladas

sem centro negro. A presença de sais biliares inibe

o crescimento das bactérias Gram positivo e

retardam o crescimento de algumas

Enterobacteriaceae.

Meio sólido

seletivo e

diferencial para a

Salmonella spp. e

Shigella spp.

CAM

(Gelose

Campylosel)

A presença de sangue de carneiro facilita o

crescimento da espécie pesquisada. A fertilidade é

aumentada devido à utilização de redutores. A

seletividade é assegurada pela presença de

antimicrobianos no meio que inibem a maior parte

das bactérias e fungos. As colónias características

de Campylobacter são pequenas e acinzentadas.

Meio sólido

seletivo para

Campylobacter

spp.

YER

(Gelose Yersinia)

Meio destinado à deteção e diferenciação das

diferentes espécies de Yersinia spp. O manitol e o

vermelho neutro presente no meio, permitem a sua

diferenciação pela coloração das colónias rosa-

escuro a vermelhas. A presença de colato,

desoxicolato, cristal violeta, Irgasan e de

antimicrobianos inibe o desenvolvimento das

bactérias Gram positivo e da maioria das Gram

negativo.

Meio sólido

seletivo





CLED

(Gelose Cistina,

Lactose,

Deficiente em

Eletrólitos)

O meio permite diferenciar os microrganismos que

fermentam a lactose dos que não fermentam,

recorrendo ao indicador azul de bromotimol. As

bactérias fermentadoras da lactose originam

colónias amarelas por acidificação do meio,

enquanto que as não fermentadoras originam

colónias verdes, azuis ou incolores. A baixa

concentração de eletrólitos impede o swarming do

Proteus.

Meio sólido não

seletivo e

diferencial

MCK

(Gelose

MacConkey)

A presença de lactose no meio permite evidenciar

as bactérias fermentadoras pela viragem do

indicador de pH, originando colónias rosa ou

vermelhas. As que não fermentam originam

colónias incolores. A seletividade é proporcionada

pelos ácidos biliares e cristal violeta, que impedem

o crescimento de bactérias Gram positivo.

Meio sólido

seletivo para

Gram negativo e

diferencial

STRB

(Gelose

chromIDTM

Strepto B)

Este meio contém base nutritiva que associa

diferentes peptonas e 3 substratos cromogénicos.

As colónias sugestivas de S. agalactiae

apresentam-se rosa claro a vermelho, redondas e

em forma de pérola. A maioria das outras espécies

bacterianas e leveduras não se desenvolvem neste

meio ou não formam colónias características.

Meio sólido

cromogénico e

diferencial para

Streptococcus

agalactiae

(Grupo B)

SGC2

(Gelose

Sabouraud com

Cloranfenicol 2)

A acidificação do meio e a presença de peptonas e

dextrose favorecem o desenvolvimento de fungos e

leveduras. A presença de gentamicina e

cloranfenicol inibem o crescimento bacteriano.

Meio sólido

seletivo para

leveduras e

fungos



Leticia de Bastos

151


CAN2

(Gelose

chromIDTM

Candida)

Meio cromogénico para isolamento seletivo de

fungos leveduriformes e identificação de espécies

de Candida albicans, que apresentam uma

coloração azul pela hidrólise de um substrato

cromogéneo de hexosaminidase. Também permite

a diferenciação presuntiva de um conjunto de

espécies que agrupa C. tropicalis, C. lusitaniae e C.

kefyr, que hidrolisam um segundo substrato,

apresentando colónias com uma coloração rosa.

Assim, permite diferenciar as culturas mistas e

orientar a identificação para outras espécies. A

mistura de inibidor permite inibir o crescimento da

maior parte das bactérias.

Meio sólido

cromogénico

Meio Müller

Hinton

Possui uma substancial fonte de proteínas e

carboidratos que proporcionam o crescimento

bacteriano, e uma baixa concentração de timina e

timidina e níveis adequados de cálcio e magnésio.

Meio

recomendado para

TSA pelo método

de Kirby-Bauer,

segundo a

EUCAST.

TSA: teste de susceptibilidade aos antimicrobianos; EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing.




9.3.1. Técnica de Sementeira

Meios Sólidos em Placa

Quatro quadrantes

Espalhamento

Semi-quantitativa

Figura 26. Representação esquemática da técnica de sementeira em quatro quadrantes.

Figura 27. Representação esquemática da técnica de sementeira por espalhamento.

Rotação da placa cerca de 90º

Figura 28. Representação esquemática da técnica de sementeira semi-quantitativa.



Leticia de Bastos

153

Inundação

Verter uma porção do líquido biológico em estudo sobre a gelose e espalhar girando a

placa em movimentos rotativos.

Método de Maki

Rolar o catéter sobre a gelose com auxílio de uma pinça ou ansa esterilizada.

Meios Líquidos

Com uma pipeta, ansa ou zaragatoa, dependendo do produto, transferir uma pequena

porção da amostra para o meio líquido e homogeneizar

9.3.2. Condições de Incubação

As condições e o tempo de incubação dos meios de cultura vão variar consoante as

necessidades dos microrganismos em estudo.

Existem disponíveis no laboratório três estufas: duas com atmosfera de aerobiose e uma

com atmosfera enriquecida com 5% de CO2. Também existem saquetas comercias para gerar

atmosferas de microaerofilia em sacos.

A temperatura ótima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos ronda os

35+2ºC, tendo um desenvolvimento otimizado com uma humidade igual ou superior a 70%,

sendo também importante para a manutenção da hidratação dos meios durante o período de

incubação. Uma das estufas de aerobiose encontra-se a 25+2ºC, para a incubação dos meios de

cultura na suspeita da presença de fungos filamentosos.




9.3.3. Aspeto Macroscópico das Colónias

Depois das culturas terem cumprido o período de incubação, após uma observação

diária, os meios sólidos permitem avaliar a dimensão, densidade, bordo, cor, textura,

consistência, produção de pigmento, tipo de hemólise e cheiro das colónias.

A expressão da hemólise ajuda na diferenciação e identificação presuntiva das bactérias:

β-hemólise (hemólise total): Presença de halo transparente ao redor das colónias;

α-hemólise (hemólise parcial): Presença de halo esverdeado ao redor das colónias;

γ-hemólise (sem hemólise): Os eritrócitos permanecem íntegros.

No exame cultural, se apresentar o desenvolvimento de bactérias potencialmente

patogénicas ou estritamente patogénicas deverá proceder-se à identificação do microrganismo

e realização do teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA). Caso contrário, se não

houver desenvolvimento de bactérias patogénicas, o resultado deverá ser expresso por “não se

desenvolveram bactérias potencialmente patogénicas”, ou como “negativo”, se o produto for

de origem esteril.

9.4. Testes de Identificação Presuntiva

9.4.1. Prova da Catalase

Teste Comercial: ID color Catalase (ID-ASE), da bioMérieux.

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva, com 18-24h de incubação

Objetivo: Distinguir os Staphylococcus spp., que são detentores da enzima catalase, dos

Streptococcus spp. ou Enterococcus spp.

Princípio: Na presença da enzima catalase o peróxido de hidrogénio (H2O2) é

hidrolisado em água e oxigénio, verificando-se uma efervescência pela libertação de O2 (teste

positivo) [135].

Procedimento: Com uma ansa retirar 1 a 2 colónias, e introduzi-las num tubo contendo

1,5mL de H2O2 (3%) e observar de imediato. Devido à existência de catalase nos eritrócitos, a



Leticia de Bastos

155

prova deve ser interpretada com muito cuidado quando efetuada a partir de colónias retiradas

de meios contendo sangue (possibilidade de falsos positivos) [135].

9.4.2. Prova da Oxidase

Teste Comercial: BD BBLTM DrySlideTM Oxidase

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva, com 18-24h de incubação.

Objetivo: Diferenciar os bacilos de Gram negativo com metabolismo oxidativo

(Pseudomonas spp. e Neisseria spp.) dos oxidase-negativa (Enterobacteriaceae) [136].

Princípio: O di-hidrocloreto de N,N,N ',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina é um reagente

é incolor no estado reduzido. Na presença do citocromo oxidase, produzido pelo

microrganismo, não ocorre a oxidação direta do reagente, mas sim do citocromo C que, por sua

vez, irá oxidar o reagente para formar um composto de cor púrpura, sendo indicativo de um

teste positivo [136].

As citocromo-oxidases são hemoproteínas que atuam como aceitadores finais de

eletrões na cadeia de respiração aeróbia, transferindo eletrões para o oxigénio, com formação

de água [136].

Procedimento: Esfregar as colónias diretamente sobre o papel de filtro impregnado

com N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina dihidrocloridrato e examinar dentro de 20

segundos. O ácido ascórbico, incorporado no reagente, age enquanto agente redutor para limitar

a auto-oxidação e melhorar a estabilidade do reagente [136].

9.4.3. Prova de Sensibilidade à Optoquina

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α-

hemólise, com 18-24h de incubação.

Objetivo: Diferenciar Streptococcus pneumoniae de outros estreptococos α-

hemolíticos, tendo em conta que é o único sensível à optoquina (cloridrato de etil-

hidrocupreína).




Princípio: Difusão da optoquina em meio COS e medição do diâmetro do halo de

inibição. Se for superior ou igual a 14mm pode-se presumir a identificação de Streptococcus

pneumoniae.

Procedimento: Executar uma suspensão da colónia a testar em 1mL de soro fisiológico,

com uma densidade ótica de 0.5 na escala de McFarland (medida no densitómetro). De seguida,

semear a suspensão em meio COS, com estrias apertadas de forma a gerar colónias confluentes.

O disco de optoquina é colocado no centro da gelose e incubado a 35+2ºC, 18-24h, em

atmosfera enriquecida com 5% de CO2.

9.4.4. Prova da Urease

Teste Comercial: Meio ureia indol, da bioMérieux

Amostra: Colónias em meio HEK não fermentadoras da lactose, com 18-24h de

incubação.

Objetivo: Excluir a presença de Salmonella spp. e Shigella spp. caso a prova seja

positiva.

Princípio: Na presença de urease, a ureia presente no meio reacional é hidrolisada em

amónia, água e dióxido de carbono. A amónia produzida irá alcalinizar o meio fazendo com

que o indicador de pH, o Vermelho de Fenol, passe de amarelo a vermelho, sendo uma reação

positiva para a presença de urease [137].

Procedimento: Num tubo de hemólise pipetar cerca de 0,5mL de reagente e inocular

cerca de 2-3 colónias do microrganismo em estudo. Posteriormente incubar a 35 + 2ºC, 18-24h

e observar [137].

9.4.5. Prova da Coagulase

Teste Comercial: BD BBLTM Coagulase Plasmas



Leticia de Bastos

157

As infeções mais comuns causadas por Staphylococcus aureus são cutâneas, no entanto

também pode ser responsável por infeções severas (septicémias, endocardites, meningites,

pneumonias, osteomielites) em meio hospitalar.

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Staphylococcus spp., 18-24h de

incubação.

Objetivo: Diferenciar Staphylococcus aureus de outras espécies de Staphylococcus spp.

Princípio: Capacidade do S. aureus produzir uma coagulase extracelular livre, que atua

sobre a protrombina presente no plasma de coelho, dando origem a um produto semelhante à

trombina, que irá atuar no fibrinogénio originando um coágulo de fibrina [138].

Procedimento: Num tubo contendo cerca de 0,5mL de plasma de coelho citratado

inocular uma colónia isolada e incubar a 35 ± 2ºC, com leitura após 4h de incubação, se ainda

não se tiver formado o coágulo prolongar a incubação até às 24h, para descartar possíveis falsos

negativos. Pode ocorrer lise do coágulo antes da sua observação por produção de enzimas

fibrinolíticas pela estirpe em estudo (falsos negativos) [138].

9.5. Teste de Identificação da Escherichia coli O157:H7

Teste Comercial: E. coli O157 Latex Test, da Oxoid.

A Escherichia coli é parte integrante da microbiota do trato intestinal em humanos

saudáveis, contudo, algumas são patogénicas podendo levar a alterações gastrointestinais. O

serotipo O157:H7 da E. coli tem sido o mais frequentemente isolado nos casos de colite

hemorrágicas e síndrome urémica hemolítica, com produção de uma Verotoxina, sendo esta E.

coli designada de entero-hemorrágica [139].

A transmissão ocorre através da ingestão de água ou alimentos contaminados, ou pelo

contacto com animais ou pessoas infetadas (transmissão fecal-oral) estando muito associadas a

surtos alimentares [139].

Amostra: Fezes depois de semeadas em meio MCK. As colónias de interesse são as

sugestivas de E. coli, não fermentadoras de sorbitol. É necessário testar pelo menos 10 colónias.




Objetivo: Identificação do serogrupo E. coli O157.

Método: Reação de aglutinação [140].

O reagente teste contém partículas de latex sensibilizadas com anticorpos específicos

reativos contra o antigénio somático O157. O controlo contém partículas de latex sensibilizadas

com imunoglobulina de coelho pré-imunizada [140].

Procedimento: Realizar uma suspensão, com 1 gota de solução salina e parte de 1

colónia. Posteriormente, adicionar 1 gota de reagente teste e misturar de forma a cobrir a área

de reação. Empreender movimentos circulares ao cartão, 1 minuto, procurando visualizar sinais

de aglutinação. Se aglutinar, testar a outra porção da colónia com o controlo para garantir que

o isolado não é uma estirpe auto-aglutinante [140].

Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%

9.6. Teste para identificação de Streptococcus pneumoniae

Teste Comercial: Oxoid Dryspot™ Pneumo Test

O Streptococcus pneumoniae é o principal agente causador da pneumonia bacteriana,

meningite, otite e bacteriémia. Os sintomas são diversos dependendo da parte do corpo infetada

e em casos mais graves pode levar à perda de audição, lesões cerebrais irreversíveis e morte

[141].

Os grupos de risco são os adultos com 65 anos ou mais, crianças menos de 2 anos de

idade e indivíduos imunodeprimidos [141].

A virulência deste microrganismo deve-se às propriedades anti-fagocitárias do

polissacárido capsular [142].

Amostra: Colónias com morfologia sugestiva de Streptococcus spp. produtores de α-

hemólise, com 18-24h de incubação.

Objetivo: Pesquisa do antigénio capsular do Streptococcus pneumoniae, para o

diferenciar de outros estreptococos α-hemolíticos.



Leticia de Bastos

159

Método: Reação de aglutinação [142].

O teste utiliza partículas de látex desidratadas em cartão, sensibilizadas com anticorpos

específicos para o pneumococo, na área de teste e partículas de látex desidratadas,

sensibilizadas com imunoglobulinas não reativas, na área de controlo [142].

Procedimento: Adicionar 1 gota de solução salina na região branca da área teste e da

área de controlo e emulsionar algumas colónias sugestivas de modo a obter uma suspensão

ligeiramente opalescente e homogénea. De seguida, misturar a suspensão com o reagente látex

desidratado até à completa reidratação e homogeneização sobre a área de reação. Proceder da

mesma forma na área de controlo. Empreender movimentos circulares ao cartão, durante 1

minuto, e observar. A presença de aglutinação é indicativa da presença do antigénio. O teste é

invalidado se ocorrer aglutinação na área de controlo, sendo indicativo de auto-aglutinação [142].

Sensibilidade: 97.9%; Especificidade: 93.2%

9.7. Identificação de Microrganismos e Teste de Suscetibilidade aos

Antimicrobianos

Equipamento: VITEK® 2, da bioMérieux

A identificação e TSA só devem ser realizados a partir de colónias isoladas em cultura

pura.

Não é necessário proceder-se à identificação e TSA caso seja isolada a mesma espécie

de microrganismo em amostras idênticas colhidas em dias sucessivos. No entanto, se a segunda

amostra tiver vindo com um intervalo igual ou superior a 5 dias já será necessário, pois pode

ter havido alterações na flora ou no padrão de suscetibilidade.

O VITEK® é um equipamento capaz de fazer a identificação de microrganismos de

interesse e TSA. É constituído por uma estação de enchimento de cartas por vácuo, que força a

suspensão da amostra a fluir para as cartas, uma zona de selagem, outra de incubação e leitura

automática de cartas.




O reconhecimento das cartas de identificação e de TSA é feito através de uma unidade

de leitura de códigos de barras. O software tem a capacidade de cruzar a informação da

identificação com a do antibiograma e alerta caso o resultado do antibiograma não seja

consistente com a bactéria identificada.

9.7.1. Preparação da Suspensão

O primeiro passo para se proceder à identificação de microrganismos e/ou TSA é

preparar uma suspensão das colónias em estudo, em 3mL de solução salina, com a ajuda do

densitómetro (Densichek). Para diferentes microrganismos, diferentes densidades são

requeridas:

0.50-0.65 McFarland para a maioria das bactérias Gram positivo e Gram

negativo;

1.8-2.20 McFarland para leveduras;

2.8-3.30 McFarland para Neisseria spp., grupo HACEK (Haemophilus spp.,

Aggregatibacter, actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella

corrodens e Kingella kingae), anaeróbios e Corynebacterium spp.

Para cada ensaio faz-se um controlo da suspensão, inoculando 1µL em meio COS,

permitindo manter a viabilidade do microrganismo, assim como averiguar a pureza da

suspensão.

Depois de preparadas as suspensões, são acondicionadas numa rack que será

programada no equipamento, em que é associado o número de cultura às cartas de identificação

e/ou TSA.

9.7.2. Identificação de Microrganismos

Método: Colorimetria

As cartas de identificação utilizadas no laboratório possuem poços que contêm

substratos bioquímicos liofilizados, que são utilizados pelas bactérias ou leveduras. A



Leticia de Bastos

161

metabolização destes substratos com alteração da sua cor é lida por sensores fotométricos,

permitindo, deste modo, efetuar a identificação do microrganismo em estudo.

No laboratório são utilizadas as seguintes cartas de identificação:

Carta GP (para bactérias Gram positivo);

Carta GN (para bactérias Gram negativo);

Carta NH (para Neisseria spp., Haemophilus spp., Campylobacter spp.).;

Carta YST (para leveduras);

Carta ANC (para bactérias anaeróbias e Corynebacterium spp).

9.7.3. Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos

Método: Turbidimetria.

As cartas de TSA contém diversos antimicrobianos liofilizados, em diferentes poços,

com os quais as bactérias ou leveduras irão reagir, resultando numa alteração da turvação do

meio, que será lida pelos sensores fotométricos permitindo, assim, fazer o TSA do

microrganismo em estudo.

No laboratório foram utilizadas as seguintes cartas de TSA:

Carta AST-N355 (para Enterobacteriaceae)

Carta AST-N354 (para Pseudomonas spp., e eventualmente Enterobacteriaceae

multirresistentes)

Carta AST-P648 (para Staphylococcus spp.);

Carta AST-P586 (para Enterococcus spp.);

Carta AST-ST03 (para Streptococcus spp.).

Os resultados são expressos com base em breakpoints e classificados como sensível,

intermédio ou resistente. O analisador está programado para interpretar os resultados consoante

as diretrizes em vigor, que são as da EUCAST (do inglês European Committee on Antimicrobial




Susceptibility Testing). Para casos duvidosos, ou caso não haja cartas de testes de

suscetibilidade, como é o caso de Haemophillus spp., fazem-se os antibiogramas de forma

manual, usando o método de difusão em disco.

9.8. Teste Screening para Streptococcus do Grupo A

Teste Comercial: Clearview® Exact Strep A Cassette, da AlereTM.

O Streptococcus β-hemolítico do grupo A é um dos principais agentes responsáveis por

infeções respiratórias superiores, nomeadamente da faringite. O diagnóstico precoce e terapia

imediata adequada demostrou reduzir a gravidade dos sintomas e outras complicações, como

febre reumática e glomerulonefrite [143].

Amostra: Exsudado faríngeo sem meio de transporte.

Objetivo: Pesquisa do antigénio do Streptococcus β-hemolítico do Grupo A (Strep A).

Método: Imunocromatografia.

Procedimento: Extrair o antigénio da zaragatoa usando reagentes de extração. A

solução extraída é colocada na cassete. Na presença do antigénio este irá complexar-se com o

conjugado, migrar por capilaridade até à zona de teste e ao entrar em contacto com os anticorpos

anti-Strep A adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão formar uma linha visível.

Independentemente da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo,

formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento.

Quinze minutos depois ler o resultado do teste. Um resultado negativo não exclui a presença de

infeção pois a quantidade de antigénio presente na amostra pode ser inferior ao limite de deteção

do teste [143].

Sensibilidade: 95.2%; Especificidade: 99%.

9.9. Teste Screening para Streptococcus pneumoniae

Teste Comercial: Streptococcus pneumoniae Antigen Card, da AlereTM BinaxNOW®.



Leticia de Bastos

163

A progressão da doença é muito rápida sendo decisivo o diagnóstico e tratamento

imediato.

Amostra: Urina (pneumonia pneumocócica) ou LCR (meningite pneumocócica).

Objetivo: Pesquisa do antigénio solúvel Streptococcus pneumoniae.


Procedimento: Procedimento e interpretação do teste semelhante ao apresentado na

secção 9.8. No entanto, antes de se iniciar o teste é necessário mergulhar uma zaragatoa

esterilizada na amostra, que de seguida será inserida no cartão de teste. Adicionar a solução

tampão e fechar o cartão, colocando a amostra em contacto com a membrana de nitrocelulose.

O conjugado é composto por anticorpo anti-S. pneumoniae e anticorpo anti-Streptococcus

marcados e na zona de teste encontram-se adsorvidos na membrana anticorpos anti-

S. pneumoniae [144].

Sensibilidade: Urina – 90%; LCR - 97%; Especificidade: Urina - 78%; LCR - 99%

9.10. Teste Screening para Legionella pneumophila

Teste Comercial: Legionella K-SeT, da Coris BioConcept.

A Legionella é responsável por pneumonias graves, sendo que aproximadamente 90%

das infeções é causada pela Legionella pneumophila, das quais 80% pelo serogrupo1 [145].

A L. pneumophila também pode ser responsável por infeções extra-pulmonares ou não-

pulmonares, apresentando uma sintomatologia menos grave, semelhante a um caso de gripe

leve. A maioria dos pacientes desenvolve febre geralmente superior a 39,5°C. A tosse pode ser

o primeiro sinal de infeção pulmonar. Outros sintomas incluem dores de cabeça, musculares,

no peito e falta de ar. Os sintomas gastrointestinais também são comuns [145].

A Legionella é ubiquitária e encontra-se em habitats aquáticos, principalmente de água

doce, torres de arrefecimento e sistemas de água potável, podendo sobreviver numa ampla gama

de condições e de temperaturas [145].




A doença do legionário é transmitida por aerossóis e as pessoas com maior risco de

contrair a doença são os imunodeprimidos, idosos, portadores de doença pulmonar obstrutiva

crónica ou doença renal crónica [145].

Amostra: Urina

Objetivo: Pesquisa do antigénio solúvel da Legionella pneumophila do serogrupo1.



secção 9.8. No entanto, neste teste uma porção da amostra é diretamente colocada na cassete, o

o conjugado é constituído de anticorpos anti-Legionella e na zona de teste encontram-se

adsorvidos na membrana anticorpos anti-Legionella [145].

Sensibilidade: 97.6%; Especificidade: 100%

9.11. Teste Screening para Clostridium difficile

Teste Comercial: RIDA®QUICK da R-biopharm

O Clostridium difficile, bactéria anaeróbia obrigatória formadora de esporos, é parte

integrante da flora intestinal normal dos seres humanos. A taxa de colonização em condições

normais vai diminuindo ao longo dos anos apresentando uma percentagem média de 2-10% na

idade adulta. Em circunstâncias específicas, com a diminuição da flora intestinal protetora,

antibioterapia ou outros fatores que possam comprometer a imunidade intestinal, a colonização

é favorecida podendo mesmo desenvolver-se quadros sérios de colite pseudomembranosa [146,

147].

Relativamente à infeção provocada por esta bactéria, um dos fatores determinantes é a

produção das toxinas A (Enterotoxina) e B (Citotoxina), que podem atuar individual ou

sinergicamente. Visto que nem todas as estirpes são produtoras de toxina, em caso de suspeita

de diarreia associada ao Clostridium difficile, a deteção das toxinas A e B é o único

procedimento de significado patognomónico [146, 147].

Amostra: Fezes diarreicas.



Leticia de Bastos

165


9.11.1. Pesquisa da Desidrogenase do Glutamato

Objetivo: Pesquisa da desidrogenase específica do glutamato (GDH) do Clostridium

difficile.

Procedimento: Diluir uma porção da amostra com uma solução contendo anticorpos

anti-GDH, homogeneizar e deixar sedimentar 5 minutos. Na presença do antigénio, haverá a

formação de imunocomplexos. Posteriormente, 150µL do sobrenadante é pipetado para a

cassete, e irá migrar por capilaridade pela membrana de nitrocelulose até à zona de teste, onde

se encontra adsorvida a estreptavidina que liga os imunocomplexos afluentes através da biotina

acoplada ao anticorpo anti-GDH, levando à formação de uma linha visível. Independentemente

da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo, formando uma linha

visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento. Quinze minutos depois

ler o resultado do teste. Um resultado negativo não exclui a presença de infeção, pois existem

muitos fatores que podem interferir, no entanto se houver uma forte suspeita devem ser

solicitadas mais amostras para serem analisadas [146].


Um resultado positivo obriga a determinação da produção das toxinas A e B associadas

à infeção [146].

9.11.2. Pesquisa das Toxinas A/B

Objetivo: Pesquisa das toxinas A e B do Clostridium difficile.

Procedimento: Procedimento do teste é semelhante ao apresentado na secção 9.11.1. O

que difere é a composição da solução com que a amotra é diluída, que possui anticorpos anti-

toxina A e B, e na zona de teste a estreptavidina irá ligar os imunocomplexos afluentes através

da biotina acoplada à anti-toxina A e a anti-toxina B [147].





Caso a pesquisa do antigénio seja positiva e a toxina negativa por teste

imunocromatográfico é obrigatório a pesquisa do gene da toxina por PCR (ver secção 9.15).

9.12. Teste Screening para Campylobacter spp.

Teste Comercial: RIDA®QUICK da R-biopharm

O Campylobacter geralmente encontra-se no intestino das aves e animais,

nomeadamente galinhas e vacas, sem que apresentem sinais de doença. A transmissão ao

homem ocorre via fecal-oral, pela da ingestão de fruta, vegetais, água ou leite contaminado com

fezes que possuem a bactéria. O leite também se pode contaminar se a vaca possuir uma infeção

mamária por Campylobacter [148].

A pasteurização do leite e boas condições de higiene ajudam a prevenir a doença [148].

Os indivíduos infetados geralmente desenvolvem diarreia, dor abdominal e febre. A

diarreia pode ser sanguinolenta e acompanhada de náuseas e vómitos. Estes sintomas

geralmente surgem 2 a 5 dias após a exposição ao microrganismo podendo prevalecer cerca de

1semana. No entanto, algumas pessoas permanecem assintomáticas. Em imunodeprimidos,

ocasionalmente, pode ocorrer bacteriémia levando a infeções graves [148].

O Campylobacter jejuni e Campylobacter coli são os principais causadores da

gastrenterite nos humanos, sendo a dose infetante relativamente baixa [148].

Amostra: Fezes

Objetivo: Pesquisa do Campylobacter jejuni e/ou Campylobacter coli.



secção 9.11.1. O que difere é a composição da solução com que a amotra é diluída, que possui

anticorpos anti-Campylobacter, e na zona de teste a estreptavidina irá ligar os imunocomplexos

afluentes através da biotina acoplada ao anticorpo anti-Campylobacter, com formação de uma

linha visível [149].



Leticia de Bastos

167

Sensibilidade:98,4%; Especificidade: 98,6%

9.13. Pesquisa de Vírus

9.13.1. Teste Screening para Rotavírus e Adenovírus

Teste Comercial: Teste RIDA®QUICK Rotavirus/Adenovirus Combi da R-biopharm

Os adenovírus (família Adenoviridae) são vírus de dupla cadeia DNA, relativamente

resistentes a desinfetantes comuns e podem ser detetados em superfícies, tais como maçanetas,

objetos e água de piscinas [150].

Embora muito associado a doenças respiratórias agudas, também já foram descritas

epidemias com adenovírus entéricos. A doença gastrointestinal é muito frequente na infância

[151], sendo que os bebés e indivíduos imunodeprimidos correm alto risco de desenvolver

doenças graves. Algumas pessoas podem permanecer assintomáticas [150].

Os rotavírus (família Reoviridae) são vírus de dupla cadeia de RNA, estáveis no meio

ambiente. São os principais agentes causadores de gastroenterite não bacteriana, caracterizada

por vómitos e diarreia aquosa de 3-8 dias, podendo ser acompanhada de febre, dor abdominal,

perda de apetite e desidratação. O período de incubação é de aproximadamente 2 dias [152].

O principal modo de transmissão é a via fecal-oral, geralmente através do contato

próximo entre pessoas, objetos/superfícies, água ou alimentos contaminados. A doença

apresenta um padrão sazonal de inverno, observando-se uma maior taxa de infeção em lactentes

e crianças pequenas, principalmente com idade inferior a 5 anos. Os adultos também podem

contrair a doença, no entanto tende a ser mais suave [151].

Nem a vacina, nem a infeção natural oferecem imunidade total, contudo a primeira

infeção na criança é a que causa os sintomas mais graves [152].

Amostra: Fezes

Objetivo: Pesquisa da presença de Adenovirus/Rotavirus.





Procedimento: Procedimento do teste é semelhante ao apresentado na secção 9.8. No

entanto é necessária uma preparação prévia da amostra. Diluir uma porção da amostra num

tampão de extração, homogeneizar e deixar sedimentar 3 minutos. Posteriormente, 200µL do

sobrenadante é pipetado para a cassete. O conjugado é composto anticorpos acoplados a

partículas de látex coloridas (vermelhas – rotavírus e azuis - adenovírus) e na zona de teste

encontra-se adsorvida anticorpos específicos [150].

Interpretação do resultado do teste [150]:

Positivo para Adenovírus - linha azul e verde são visíveis.

Positivo para Rotavírus - linha vermelha e verde são visíveis.

Positivo para Adenovírus e Rotavírus - tiras azul, vermelha e verde são visíveis.

Negativo: somente a tira verde é visível.

Um resultado negativo não exclui uma possível infeção causada pelo

adenovírus/rotavírus. Existem muitos fatores que podem interferir. Se houver uma forte

suspeita devem ser solicitadas mais amostras para serem analisadas [150].

Adenovírus - Sensibilidade: 90%; Especificidade: 100%

Rotavírus - Sensibilidade: 100%; Especificidade: 99%

9.13.2. Teste Screening para Vírus Sincicial Respiratório

Teste Comercial: BinaxNOW® RSV, da AlereTM

O Vírus Sincicial Respiratório (RSV, do inglês Respiratory Syncytial Virus), família

Paramyxoviridae, é responsável por infeções e surtos que ocorrem no outono, inverno e

primavera. Geralmente, as pessoas infetadas apresentam sintomas leves, sendo que a maioria

recupera ao fim de 1 a 2 semanas. Embora também possam causar doenças respiratórias em

crianças mais velhas e adultos, a doença tende a ser mais grave em crianças com menos de 1

ano, sendo o causador mais comum de bronquiolite e pneumonia [153].

Amostra: Exsudado nasofaríngeo ou lavado nasal



Leticia de Bastos

169

Objetivo: Pesquisa do antigénio das proteínas de fusão do RSV, em bebés ou crianças

com menos de 5 anos [154].



secção 9.8. No entanto, os exsudados nasofaríngeos colhidos em zaragatoa têm de ser eluídos

numa solução de extração, posteriormente, uma porção do lavado nasal ou do produto de

extração é pipetado para o cartão e de seguida é fechado, colocando a amostra em contacto com

a membrana de nitrocelulose. O conjugado é composto de anticorpo anti-RSV e na zona de

teste encontram-se adsorvidos na membrana anticorpos anti-RSV [154].

Sensibilidade: Lavado nasal 89%; Zaragatoa 93%; Especificidade: Lavado nasal

100%; Zaragatoa 93%;

9.13.3. Pesquisa do Vírus Influenza A e B

O vírus influenza é responsável por doenças respiratórias contagiosas. Geralmente,

ocorre repentinamente e os sintomas são febre ou calafrios, tosse, dor de garganta, nariz

entupido, fadiga, dores musculares e cabeça. Nas crianças, é comum observar-se vómitos e

diarreia [155].

A maioria das pessoas recupera ao fim de 2 semanas, no máximo, mas algumas pessoas,

nomeadamente crianças, adultos com 65 anos ou mais, grávidas ou indivíduos que padeçam de

doenças crónicas possuem alto risco de desenvolver complicações graves, requerendo

hospitalização, podendo levar à morte. Uma grande variedade de complicações pode ser

causada pelo vírus isoladamente ou ser resultante da co-infeção com bactérias, podendo até

mesmo levar à pioria de algumas condições crónicas do doente [155].

Amostra: Exsudado nasofaríngeo em meio de transporte (VIRCELL15).

Objetivo: Pesquisa de RNA do Vírus Influenza A e B com alerta de H1N1.

Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15)

15 O meio de transporte evita a secagem da amostra, mantém a vitalidade dos microrganismos entre a colheita e a inoculação e

retarda o sobrecrescimento bacteriano em amostras muito contaminadas.




9.13.4. Pesquisa do Vírus Papiloma Humano de Alto Risco

O Papiloma Vírus Humano (HPV, do inglês Human Papillomavirus) é um vírus

responsável por infeções sexualmente transmissíveis, sendo que pessoas assintomáticas podem

transmitir o vírus e os sintomas desenvolverem-se apenas ao fim de vários anos [156].

Existem vários subtipos que podem causar diferentes problemas de saúde. Na maioria

dos casos, a infeção resolve-se sozinha, mas quando persiste é responsável pelo aparecimento

de verrugas genitais e cancro, nomeadamente cervical, da vulva, vagina, pénis, ânus e

orofaringe. Os indivíduos imunodeprimidos são mais propensos a desenvolver problemas de

saúde resultante da infeção pelo HPV [156].

O rastreio de mulheres com idade entre 21 a 65 anos pode prevenir cancro cervical [156].

Amostra: Exsudado endocervical sem meio de transporte.

Objetivo: Rastreio de DNA do Vírus do Papiloma Humano de alto risco e genotipagem

dos sub-tipos16, 18/45.

Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15)

9.14. Pesquisa de Micobactérias16

A tuberculose é uma doença causada na maioria dos casos pela bactéria Mycobacterium

tuberculosis, também designada de BK [157].

A transmissão da tuberculose ocorre quando indivíduos com tuberculose pulmonar ou

laríngea tossem, espirram ou gritam e se geram gotículas infeciosas que são transportadas pelo

ar podendo ser inaladas e atingir os alvéolos pulmonares de outra pessoa. A maioria destes

bacilos são destruídos ou inibidos pelos macrófagos alveolares; no entanto, um pequeno número

pode multiplicar-se no seu interior e serem libertados para os canais linfáticos ou corrente

sanguínea atingindo vários tecidos e órgãos [157].

Objetivo: Pesquisa de BK.

16 No Serviço de Patologia Clínica existe uma sala destinada para o efeito.



Leticia de Bastos

171

9.14.1. Exame Direto e Cultural

Colheita

Amostras são diversas dependendo do quadro clínico do doente.

Transporte e Conservação da Amostra

Enviada em contentor estéril, sem meio de transporte e refrigerada.

Exame Micobacteriológico

Todas as amostras antes de serem processadas para exame direto e/ou cultural têm de

ser descontaminadas, à exceção dos líquidos serosos e LCR que forem estéreis para bactérias

ou fungos.

Descontaminação da amostra:

Dissolver a amostra com o MycoPrep na proporção de 1:1 (solução de digestão

e descontaminação) e homogeneizar bem;

Deixar repousar à temperatura ambiente 15 minutos e posteriormente perfazer o

volume (45 mL) com água bi-destilada estéril e homogeneizar (para parar a reação de

digestão e descontaminação);

Centrifugar 15 minutos a 3000rpm;

o Enquanto centrifuga a amostra, reconstituir o frasco PANTA/F BACTEC

liofilizado (constituído por antimicrobianos que ajudam a eliminar tudo o

que não seja micobactérias que tenham sobrevivido à descontaminação)

com 10mL de Suplemento/F BACTEC (para favorecer o crescimento do

M. tuberculosis). Para amostras estéreis não utilizar o PANTA/F, utilizar

apenas o Suplemento/F.

o Após reconstituição, inocular cada frasco de cultura BACTEC Myco/F

Lytic com 2 mL da mistura (PANTA/F e Suplemento/F).

Após a centrifugação, decantar o sobrenadante;




Ressuspender o sedimento com 1 mL de água bi-destilada, verificar o seu pH,

que deve estar entre 6,8 – 7 e, se necessário, acertar adicionando HCl ou NaOH;

Exame Direto:

É efectuado:

Quando é pedido a pesquisa de BK direto;

Antes de inocular os frascos de cultura, a fim de dar uma resposta imediata ao

clínico.

Corar consoante o tipo de amostra (ver secção 9.2.2).

Exame Cultural:

Inocular 1mL, de amostra descontaminada, nos frascos de cultura BACTEC

Myco/F Lytic (formulação do meio líquido de Middlebrook 7H9 e de BHI).

Introduzir o frasco no aparelho BACTECTM9000MB. Onde os frascos são

agitados a cada 10 minutos para obter um isolamento ótimo. Cada garrafa possui um

sensor capaz de detetar a diminuição da concentração de O2 no seu interior, resultante

do metabolismo e do crescimento dos microrganismos. O sensor é monitorizado pelo

equipamento a cada 10 minutos. A velocidade de diminuição do oxigénio é medida

pelo aumento da fluorescência, determinando a sua positividade [158].

Nota:

Os frascos de cultura que se mantenham negativos ao fim de 42 dias são retirados do

equipamento e o resultado sai como negativo. Se algum frasco positivar é realizado um

esfregaço sujeito à coloração de Kinyoun.

Na observação de BAAR no esfregaço, procede-se à pesquisa de antigénio de M.

tuberculsosis. Caso o antigénio seja detetado, as garrafas são enviadas para o Instituto Nacional

de Saúde, Ricardo Jorge (INSA) para eventual TSA. Por outro lado, se a pesquisa de antigénio

de M. tuberculosis for negativa, tem de se considerar a valorização do resultado, em termos da

natureza da amostra, critérios clínicos e imagiológicos; caso seja relevante, segue também a

garrafa para o INSA, para identificação e eventual TSA.



Leticia de Bastos

173

Se a positividade for resultante de uma má descontaminação e o tempo de incubação

tenha sido curto, a amostra é novamente descontaminada e recolocada no equipamento; no

entanto, se positivar quando estiver quase a perfazer os 42 dias de incubação, a garrafa é

colocada na estufa e quando tiver completado o tempo é feito novo esfregaço. Se a etiologia da

infeção for bacteriana ou fúngica o exame micobacteriológico sai como negativo.

Teste screening para a pesquisa do M. tuberculsosis

Teste Comercial: SD Bioline TB Ag MPT64 Rapid, da AlereTM


Objetivo: Pesquisa do antigénio MPT-64 do M. tuberculsosis.

Procedimento: Na presença do antigénio este irá complexar-se com o conjugado,

migrar por capilaridade até à zona de teste e ao entrar em contacto com os anticorpos anti-

MPT64 adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão formar uma linha visível.

Independentemente da presença do antigénio, a migração continua até à zona de controlo,

formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho adequado do procedimento.

Quinze minutos depois ler o resultado do teste [158].

Sensibilidade:98,6%; Especificidade: 100%

9.14.2. Hemoculturas

Colheita

O sangue deve ser sempre colhido por punção venosa de veia periférica, após uma

correta desinfeção da pele com solução antissética deixando-a secar. É importante desinfetar

também a tampa do frasco de hemocultura, tendo o cuidado de deixar evaporar o desinfetante

antes de puncionar a borracha. Após a colheita, inocular 5mL de sangue total para a garrafa de

hemocultura específica para pesquisa de Micobactérias, sem mudar de agulha.





Enviar hemocultura de imediato ao laboratório, mantendo a garrafa à temperatura

ambiente até ser colocada no BACTECTM9000MB, que possui um sistema automatizado de

incubação (37ºC), homogeneização e monitorização das hemoculturas.

Incubação

Equipamento: BACTECTM9000MB

Os frascos de hemocultura contêm um meio de cultura com condições nutricionais e

ambientais adequadas aos microrganismos [158].

Os frascos de cultura que se mantenham negativos durante um período mínimo

de 42 dias e que não apresentem sinais visíveis de positividade são retirados do

equipamento e o resultado sai como negativo. Caso algum frasco dê positivo, é feito o exame

micobacteriológico.

Exame Micobacteriológico

Retirar as hemoculturas positivas do equipamento, desinfetar a tampa com solução

antisséptica e deixar secar. Posteriormente, perfurar a tampa com uma agulha que contem um

dispensador, que permite retirar o conteúdo da garrafa. Depois de feitos os esfregaços,

desinfetar novamente a tampa dos frascos das hemoculturas.

Exame Direto:

Coloração de Kinyoun

Nota:

Na observação de BAAR no esfregaço, procede-se à pesquisa de antigénio de M.

tuberculsosis (Ver nota da secção 9.14.1).



Leticia de Bastos

175

9.14.3. Pesquisa por PCR

Amostra: Diversas. Enviadas refrigeradas até serem processado e não podem vir em

meio de transporte.

Método: PCR em tempo real (ver secção 9.15).

Efetuado sempre que haja um pedido específico para pesquisa de DNA de Mycobacterium

tuberculosis por PCR.

9.15. PCR em Tempo Real

Equipamento: GeneXpert® System, da Cepheid®.

Amostra: Produtos em contentor estéril ou zaragatoa sem meio de transporte, exceto

para pesquisa de vírus Influenza em que o produto deverá vir em meio de transporte específico.

Método: PCR (do inglês, Polymerase Chain Reaction) em tempo real, para pesquisa

de:

MRSA (exsudado nasal e perineal) [160]

Enterococcus resistentes à Vancomicina (exsudado perianal) [161]

Carbapenemases com diferenciação de KPC (do inglês Klebsiella pneumoniae

Carbapenemase), NDM (do inglês New Delhi metallo-β-lactamase), VIM (do inglês

Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase), IMP-1& (do inglês IMP-type

metallo-beta-lactamase), OXA-48 (OXA abreviatura do inglês Carbapenem-

hydrolysing oxacillinase), cobrindo OXA-181 e OXA-232 (exsudado retal) [162]

Gene da Toxina do Clostridium difficile (ver secção 9.11) [163]

RNA do Vírus Influenza A e B com alerta para H1N1 (ver secção 9.13.3) [164]

DNA do HPV de alto risco e genotipagem dos subtipos 16,18/45 (ver secção

9.13.4) [165]

DNA do Mycobacterium tuberculosis (ver secção 9.14.3) [166]




Eluir a zaragatoa/amostra numa solução de eluição fornecida no kit e homogeneizar no

vórtex, posteriormente pipetar a solução dentro do cartucho e introduzi-lo no equipamento. No

caso da pesquisa do vírus Influenza, as zaragatoas já vêm em meio de transporte pronto a ser

utilizado sendo apenas necessário pipetar o sobrenadante para o cartucho.

O sistema GeneXpert® realiza de modo completamente automatizado a preparação de

amostras e PCR em tempo real, realizando todos os passos da extração de DNA ou RNA e

amplificação, com ciclos rápidos de aquecimento e arrefecimento necessários (Figura 29) [160-

166].

As reações são continuamente monitorizadas em cada cartucho de modo a criar

rapidamente cópias suficientes de ácido nucleico da amostra para uma medição fiável [160-166].

9.16. Colheita de Produtos Biológicos e Processamento de Amostras

Um produto biológico para estudo microbiológico tem de ser colhido em condições de

assepsia e ser representativo do local anatómico em estudo, evitando a sua contaminação com

a flora saprófita do doente e/ou com bactérias do meio ambiente. É fundamental que a amostra

seja colhida em quantidade suficiente e se possível antes de se ter inicido a antibioterapia.

O modo de processamento do exame cultural e valorização clínica das estirpes isoladas,

baseia-se na compreensão da patogenia da infeção nos diferentes locais anatómicos.

Sempre que o exame pretendido não fizer parte da rotina laboratorial, deve ser

contactado o Laboratório de Microbiologia.

Figura 29. Equipamento GeneXpert® System, em cima e cartucho de reação em baixo [167].



Leticia de Bastos

177

9.16.1. Trato Respiratório Superior

As infeções respiratórias são comuns e localizam-se maioritariamente ao nível da

orofaringe, nasofaringe e cavidade nasal, provocando angina, corrimento nasal e, por vezes,

febre, sendo frequentemente de etiologia viral. Concomitantemente surgem muitas vezes

infeções secundárias, resultantes do desequilíbrio da flora normal, diminuição da imunidade ou

lesão, por bactérias que habitualmente pertencem à microbiota do trato respiratório superior.

Em doentes sujeitos a antibioterapia pode também surgir candidose [168].

A maioria das infeções bacterianas da nasofaringe é causada por Streptococcus β-

hemolítico do grupo A (Streptococcus pyogenes), Corynebacterium diphteriae e Bordetella

pertussis [168].

A presença de Neisseria gonorrhoeae pode causar faringites exsudativas,

particularmente em indivíduos que praticam sexo oro-genital [168].

No exsudado nasal apenas se faz o estudo de colonização para MRSA (ver secção 9.15).

Colheita

Exsudado faríngeo: Pedir ao utente que abra a boca, afastar a língua e com recurso a

uma espátula de madeira colher o produto ao nível das amígdalas e porção posterior da faringe

utilizando uma zaragatoa seca. Durante o procedimento deve evitar-se o contacto com outras

regiões da cavidade oral, a fim de minimizar a contaminação. Não obter amostra se existir

inflamação da epiglote, pois pode causar espasmos com consequente obstrução respiratória.


Zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies);

Zaragatoa seca colhida há menos de 1h.




Exame Microbiológico

Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, o meio COS e de seguida inocular para BHI. Incubar

18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2 o meio COS e em atmosfera de

aerobiose o BHI.

Nota:

Não se faz Gram para exsudados faríngeos. A flora é, invariavelmente, mista e o Gram

não é informativo.

Outros testes que podem ser pedidos pelo Clínico:

Teste screening para Streptcoccus do grupo A (Pediatria).

9.16.2. Trato Respiratório Inferior

Ao contrário do trato respiratório superior, no trato respiratório inferior, normalmente,

não se verifica colonização por bactérias comensais. No entanto, quando o sistema imunitário

está debilitado, ou após infeção primária causada por um vírus, fica sujeito a invasão pelos

microrganismos das vias respiratórias superiores, ou até mesmo sofrer infeção primária por

microrganismos patogénicos que possam ser inalados, como é o caso da tuberculose [169]. Os

indivíduos mais afetados são os que padecem de doenças crónicas concomitantes, tais como a

bronquite crónica, doença pulmonar obstrutiva crónica e diabetes.

Os microrganismos mais frequentemente valorizados são Staphylococcus aureus,

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinobacter baumannii, Bordetella spp. e

Mycobacterium tuberculosis. Nos doentes imunodeprimidos, os agentes mais comuns de isolar

são os bacilos Gram negativo (Klebsiella. pneumoniae, E. coli, Pseudomonas spp.)

Pneumocistiis carinii (em HIV positivos) e Aspergillus spp.

Um dos principais sintomas de infeção do trato respiratório inferior é a tosse produtiva,

sendo o exame microbiológico da expetoração uma ferramenta essencial para o diagnóstico.



Leticia de Bastos

179

Por vezes, esse diagnóstico é dificultado pela contaminação das amostras pela flora comensal

da orofaringe durante a colheita, por isso, o laboratório deve processar apenas as amostras de

boa qualidade.

Colheita

Expetoração: a colheita deve ser efetuada em jejum, após lavar a boca e

gargarejar apenas com água. Colher a expetoração através de tosse profunda para

contentor estéril. Amostras com mais de 24h, saliva e amostras contaminadas com

restos alimentares, são rejeitadas.

Secreções Brônquicas;

Lavado Bronco-Alveolar.


Colher para um recipiente estéril, seco e de boca larga. O transporte para o laboratório

deve demorar menos de 2h, se não for possível, refrigerar até 24h.


Exame Direto:

Coloração de Gram.

Exame Cultural:

Se a amostra estiver muito diluída centrifugar a 1500rpm 20 minutos e semear o

sedimento.

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e HAE2. As porções da amostra que

devem ser utilizadas para o efeito são aquelas que contenham pus ou sangue. Incubar 18-24h,

a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2.

Na suspeita de infeção fúngica ou a pedido do médico semear também em SGC2, e

incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h ou 5 dias, a 25+2ºC, na suspeita de

Aspergillus.




Nota:

Avaliação qualitativa da uma amostra de expetoração, a partir do Gram: observar ao

microscópio ótico (cerca de 10 campos) com objetiva 10x e verificar a presença de células

epiteliais pavimentosas (da orofaringe) e leucócitos. São consideradas amostras de boa

qualidade as que tiverem menos de 10 células epiteliais e cerca de 25 ou mais leucócitos por

campo.

Não deve ser aplicado este critério em doentes neutropénicos e na pesquisa de outros

agentes específicos, tais como Mycobacterium sp., Legionella sp. e Mycoplasma sp. que não

fazem parte da flora normal da orofaringe e não a colonizam.


Teste screening para RSV em secreções brônquicas (Pediatria).

9.16.3. Exsudado Ocular

As infeções oculares incluem infeções das estruturas externas do olho (blefarites,

conjuntivites e queratites), estruturas internas do olho (endoftalmites) e infeções do sistema

lacrimal (canaliculites, dacriocistites, dacrioadenites).

A conjutivite bacteriana é a infeção ocular mais frequente, sendo os principais agentes

responsáveis o Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catarrhalis. No recém-nascido,

os agentes infeciosos mais frequentes são Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae,

Staphylococcus aureus e bacilos Gram negativo.

Colheita

Com uma zaragatoa seca ou humedecida com soro fisiológico e passá-la ao longo da

conjuntiva tarsal inferior do olho, rodar e pressionar suavemente a zaragatoa perto do canal

lacrimal. Enviar sempre e em separado, amostras dos dois olhos, devidamente identificados,

indicando também o lado da infeção.



Leticia de Bastos

181


Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies).


Exame Direto:


Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX (ou HAE2) e de seguida inocular

em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS

e PVX (ou HAE2), e em atmosfera de aerobiose o BHI.


incubar a 35±2°C, em atmosfera de aerobiose, 18-48h.

9.16.4. Exsudado Auricular

A infeção auricular pode localizar-se no ouvido externo e no ouvido médio.

A otite média é uma infeção muito comum em bebés e crianças, uma vez que a trompa de

Eustáquio ainda está muito aberta, sendo normalmente causada por Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae. No entanto também pode ser causada pelo

Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Enterobacteriaceae e microrganismos

anaeróbios, embora sejam menos frequentes [168].

As infeções do ouvido externo são tipicamente causadas por Staphylococcus aureus ou

Pseudomonas aeruginosa (“ouvido de nadador”) [168].

Colheita

Exsudado do ouvido externo: Introduzir uma zaragatoa, humedecida com soro

fisiológico estéril, no canal auricular tendo o cuidado de não tocar nas paredes, retirar

o pus com movimentos de rotação suaves;




Exsudado do ouvido interno: Timpanocentese.


Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), permitindo manter a

viabilidade das bactérias cerca de 24h se conservada de 2-8°C, sendo rejeitadas as colheitas

enviadas em zaragatoa sem meio de transporte colhidas há mais de 1h.

Se a colheita for por timpanocentese o produto deverá vir em recipiente estéril.


Exame Direto:


Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX (ou HAE2) e de seguida inocular

em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS

e PVX (ou HAE2), e em atmosfera de aerobiose o BHI.



9.16.5. Exsudados Purulentos

As secreções purulentas provenientes de supurações superficiais e de abcessos são

heterogéneas tanto pela fisiopatologia da infeção como pelos agentes bacterianos envolvidos,

nomeadamente Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e outros β-hemolíticos,

pneumococos, Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa,

Candida spp., bem como microrganismos anaeróbios [170].

Colheita

Superficial: Proceder à limpeza do local de colheita com uma zaragatoa

embebida em soro fisiológico estéril para retirar o excesso de pus em contacto com o



Leticia de Bastos

183

penso e, se necessário, limpar também o pus seco. De seguida, com uma zaragatoa

estéril, colher uma porção de pus, pressionando levemente no local da lesão ou na

fístula;

Profundo: Descontaminar a pele, colher a amostra por aspiração.

Todas as amostras têm de ser identificadas com os dados demográficos do doente, data

e hora da colheita, identificação do produto e local anatómico da colheita.


Superficial: Zaragatoa colocada em meio de transporte (Meio Amies). Rejeitar

colheitas com mais de 1h caso não venham em meio de transporte;

Profundo: Recipiente seco, esterilizado, de boca larga, enviar a própria seringa

sem agulha, mas devidamente fechada, ou em frasco Portagerm Amies Agar se não se

pretender estudo micológico ou micobacteriológico. A amostra tem de ser enviada o

mais rápido possível ao laboratório, no máximo até 2h após a colheita.


Exame Direto:


Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e MCK de seguida inocular em BHI.

Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, o meio COS e em

atmosfera de aerobiose o BHI e o meio MCK.



Nota:

Tem de ter em consideração o local da punção, a história clínica, nomeadamente dados

epidemiológicos, o tipo de infeção e o modo de colheita.




9.16.6. Biópsias Cirúrgicas e Material de Próteses


Amostra enviada em contentor seco, estéril, de boca larga.


Exame Direto:

Coloração de Gram, dependendo da consistência da amostra.

Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS e PVX e de seguida inocular em BHI.

Incubar 18-24h, a 35±2°C, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, os meios COS e PVX,

e em atmosfera de aerobiose o BHI.



No caso das amostras sólidas ou materiais de próteses, colocar BHI dentro do contentor

das amostras, agitar no vórtex e incubar a 35±2ºC em atmosfera de aerobiose, 18-24h.

Posteriormente, semear os meios COS e PVX.

9.16.7. Líquido Biliar e Líquidos de Serosas: Ascítico, Pleural, Sinovial e Pericárdico.

Os líquidos orgânicos são normalmente estéreis e qualquer microrganismo encontrado

deve ser investigado. A interpretação final deve ter em conta o estado clínico do doente e o

microrganismo isolado.

Colheita

Colheita por aspiração e os volumes mínimos recomendados são:

Exame bacteriológico: 1mL;

Exame micológico: 2mL;



Leticia de Bastos

185

Exame micobacteriológico: 3mL.


Colocar a amostra em recipiente seco e esterilizado ou em frasco Portagerm Amies Agar

se não se pretender estudo micológico ou micobacteriológico.

Eventualmente, quando indicado os produtos podem ser inoculados em frascos para

hemocultura (segundo procedimento idêntico ao das hemoculturas).

Excecionalmente, para a colheita de líquido biliar, colher para um contentor contendo

100mg de carbonato de sódio de modo a alcalinizar o meio e manter a viabilidade dos

microrganismos.


Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação (20 minutos a 1500rpm)

sendo necessário aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando cerca de 1 ml

de líquido no qual se ressuspende o sedimento, que irá ser processado.

As amostras purulentas podem ser inoculadas diretamente nos meios de cultura.

Exame Direto:


Exame Cultural

Semear, por inundação ou em quatro quadrantes dependendo do aspeto do líquidos os

meios COS e PVX, e de seguida inocular em BHI. Incubar 18-24h, a 35±2ºC em atmosfera

enriquecida com 5% de CO2, os meios COS e PVX, e em atmosfera de aerobiose o BHI.






9.16.8. Líquido Cefalorraquidiano

Sempre que existe uma suspeita de meningite é fundamental efetuar-se a análise

laboratorial do LCR, permitindo nos casos de meningite infeciosa determinar qual o agente

responsável, a fim de se iniciar um tratamento apropriado, o mais rapidamente possível [171].

A meningite pode ser purulenta ou asséptica. Na meningite purulenta, o LCR é turvo,

pela presença de grande número de leucócitos, na sua maioria polimorfonucleares, e geralmente

é causada pela Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae,

que atingem as meninges a partir do trato respiratório, pela corrente sanguínea. Em recém-

nascidos e crianças pequenas a meningite pode ser provocada pelo Streptococcus agalactiae, e

menos frequentemente pela Escherichia coli, Pseudomonas spp., Salmonella spp. e Listeria

monocytogenes [171].

Na meningite asséptica, o LCR é límpido ou ligeiramente turvo, e contém um número

moderado de leucócitos, com predomínio de linfócitos, exceto na fase inicial, sendo a maioria

dos casos de origem viral [171].

Colheita

Punção lombar, sendo recomendado colher 3 tubos esterilizados de fundo cónico,

devidamente numerados, sendo o último utilizado para exame bacteriológico por ser o mais

estéril e menos sujeito a contaminação.

Volumes mínimos recomendados:

Exame bacteriológico: 1mL;

Exame micológico: 2mL;

Exame micobacteriológico: 3mL.


Enviar de imediato ao laboratório para ser processado. Nunca refrigerar, a não ser que

seja pedido a pesquisa de vírus.



Leticia de Bastos

187


Antes de ser processado, avaliar o volume da amostra e o aspeto macroscópico. Se o

volume de amostra for superior a 1mL centrifugar 20 minutos a 1500rpm. Remover o

sobrenadante, que deverá ser refrigerado, deixando cerca de 1mL para ressuspender o

sedimento. O LCR geralmente é um produto estéril e a carga microbiana pode ser baixa.

Exame Direto:


Exame Cultural:

Semear, por inundação, os meios COS e PVX e de seguida inocular em BHI. Incubar

18-24h, a 35±2ºC, em atmosfera enriquecida com 5% de CO2 os meios COS e PVX, e em

atmosfera de aerobiose para o BHI.



Nota:

Pela observação do Gram, qualquer resultado positivo deve ser comunicado

imediatamente ao clínico.


Teste screening para Streptococcus pneumoniae.

Exame direto a fresco com contraste negativo por Tinta da China, para pesquisa

de Cryptococcus spp.

9.16.9. Urina Asséptica

As infeções do trato urinário são as mais frequentes, sendo geralmente causadas pela

flora intestinal saprófita que invade o aparelho urinário por via ascendente através da uretra. As

infeções do trato urinário são mais frequentes nas mulheres, devido, sobretudo às diferenças

anatómicas da uretra feminina.




Os microrganismos mais frequentemente responsáveis por infeções urinarias são as

enterobactérias, como é o caso da Escherichia coli e do Proteus mirabilis.

No entanto, os doentes internados, crianças/ idosos que usam fralda, doentes algaliados,

doentes com patologias do trato urinário ou que estão sob antibioterapia, são mais propensos a

infeções urinárias, podendo ser causadas por um leque de agentes etiológicos, tais como

Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus

spp. e fungos.

Colheita

Podem chegar ao laboratório amostras colhidas do “jato intermédio”, saco coletor

(crianças sem controlo dos esfíncteres), punção de catéter urinário (algália) e punção supra-

púbica.

Colheita do “jato intermédio”:

1. Lavar bem as mãos;

2. Com uma compressa esterilizada embebida em água e sabão,

disponibilizada pelo laboratório, lavar os genitais externos (na mulher,

sempre da frente para trás e, no homem, afastando o prepúcio);

3. Repetir o procedimento anterior utilizando uma compressa esterilizada

embebida em água;

4. Com uma das mãos afastar os grandes lábios ou prepúcio mantendo-os

nessa posição durante o processo, e com a outra segurar no recipiente

esterilizado próprio para a recolha de urina;

5. Rejeitar as primeiras gotas e colher o jato intermédio para o recipiente,

desperdiçando a restante urina.

A urina é um fluido biológico habitualmente estéril, mas a sua passagem através da

uretra durante a micção arrasta os microrganismos que usualmente a colonizam, podendo

induzir a erros na interpretação da urocultura, daí a importância de colher o “jato intermédio”.

Preferencialmente, deve ser colhida a primeira urina da manhã, pois é a mais concentrada, ou

efetuar a colheita após uma retenção de 3h.



Leticia de Bastos

189

Colheita do saco coletor:

1. Lavar as mãos;

2. Lavar os genitais externos com água e sabão, com auxílio de uma

compressa esterilizada e, posteriormente, repetir o procedimento com

uma compressa esterilizada embebida em água;

3. Colar o saco coletor em torno do meato urinário;

4. Mudar o saco de 30 em 30 minutos caso a criança ainda não tenha urinado.

5. Transferir a urina para recipiente esterilizado.


As urinas assépticas, vindas do Hospital de Abrantes e de Torres Novas, chegam ao

Laboratório Central em contentores contendo um estabilizador (ácido bórico), que permite

manter a viabilidade dos microrganismos até 48h, à temperatura ambiente, sendo necessários

10mL de urina para obedecer à proporção urina-conservante. Se o volume de amostra for

inferior a 10mL, ou no caso de se querer pesquisar a presença de Mycoplasma, Mycobacterium

tuberculosis, Leptospira e Chlamydia, a urina deve ser armazenada em contentor estéril,

refrigeradas (2-4ºC) e processadas até 24h após a colheita, pois o ácido bórico iria inibir o seu

crescimento.

As urinas do Hospital de Tomar, tanto do ambulatório como das enfermarias, chegam

ao laboratório em contentor estéril e são processadas de imediato.


Exame cultural:

Homogeneizar a urina e semear para o meio CLED com uma ansa calibrada de 1µL,

utilizando a técnica de sementeira semi-quantitativa.

Uroculturas pedidas pela consulta de obstetrícia ou urinas obtidas por punção supra-

púbica, semear também em meio COS.

Incubar a 35±2ºC em atmosfera de aerobiose, 18-24h.




Nota:

Após incubação, observam-se as culturas e faz-se a contagem do número de colónias. O

cálculo da concentração bacteriana é efetuado tendo em conta a densidade das colónias

presentes na placa:

Nº de UFC/mL = 0: cultura negativa;

Nº de UFC/mL < 104: contaminação provável, uretral ou vaginal;

Nº de UFC/mL entre 104 e 105: a urina deve ser avaliada segundo critérios clínicos;

Nº de UFC/mL > 105: provável infeção urinária.

A valorização dos resultados deverá ter em conta uma série de parâmetros tais como:

método de colheita da urina, tipo de doente (por ex. urológico, geriátrico, etc.), sintomatologia

e resultados de exames bacteriológicos anteriores.

Considera-se contaminação a presença de 2 ou mais colónias diferentes num Nº de

UFC/mL < 104. No caso de haver uma colónia predominante com um Nº de UFC/mL > 105

deverá ser investigada, tendo em conta a história clínica do utente, presença de sintomatologia,

sistema imunitário, entre outros.

No caso das urinas colhidas por punção supra-púbica, deve-se valorizar todos os

microrganismos isolados com exceção das bactérias comensais da pele. Em relação às urinas

que foram colhidas do saco coletor, a sua avaliação deve ser mais cuidadosa, pois a

probabilidade de contaminação pela flora do períneo é elevada. Se necessário recorrer a nova

colheita.

Nas grávidas, uma gelose COS é semeada em paralelo com o CLED para despiste de

Streptococcus do grupo B de Lancefield (Streptococcus agalactiae).


Teste screening para Legionella spp.

Teste screening para Streptococcus pneumoniae

Para a execução dos testes mencionados, a amostra de urina deve ser colhida em

recipiente estéril.



Leticia de Bastos

191

9.16.10. Esperma e Exsudado Vaginal, Endocervical e Uretral

O esperma e os exsudados genitais são solicitados com o objetivo de diagnosticar

infeções sexualmente transmissíveis ou agentes causadores de desequilíbrio da flora normal,

sendo de grande importância na escolha do tratamento e na prevenção da infeção de recém-

nascidos durante o parto.

É importante que haja informação sobre o tipo de amostra, data de colheita, idade e uma

breve história clínica.

Infeções do Trato Genital Feminino

O aparelho genital feminino baixo, encontra-se colonizado por uma flora saprófita rica

em bacilos de Döderlein. No entanto, na infância e após a menopausa, dada a ausência de

estrogénios, o pH vaginal é mais neutro e a sua microbiota altera-se passando a ser constituída

por outras espécies microbianas. O aparelho genital alto geralmente é estéril.

As infeções do aparelho genital feminino geralmente são devidas a microrganismos

endógenos cuja patogenicidade é ativada por fatores do hospedeiro ou por desequilíbrio da flora

saprófita [172].

Na vulvo-vaginite aguda, há invasão do epitélio escamoso da parede vaginal e

inflamação, sendo frequentemente provocada pela Trichomonas vaginalis ou Candida albicans.

Quando causada pela Trichomonas vaginalis ocorrem secreções vaginais espumosas

amarelada, com irritação da vulva, dor ao urinar e durante o coito. Quando causada pela

Candida albicans, além do corrimento espesso e esbranquiçado, verifica-se a existência de

prurido e dor. A candidose geralmente ocorre devido a antibioterapia ou toma de contracetivos

orais que alteram a microbiota vaginal [172].

Na vaginose, geralmente causada pela Gardnerella vaginalis ou pelo Mobiluncus,

observa-se uma leucorreia acinzentada, com cheiro pútrido [172].

A cervicite, com ou sem uretrite, geralmente assintomática, pode ser causada por

diversos microrganismos, sendo os principais agentes etiológicos a Neisseria gonorrhoeae e

Chlamydia trachomatis, podendo originar corrimento vaginal [172].




A salpingite pode ser ou não acompanhada de descarga vaginal e geralmente é causada

pela Neisseria gonorrhoeae ou por Streptococcus spp [172].

A ulceração genital pode ser causada pelo Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi

ou Chlamydia trachomatis [172].

A gonorreia, doença sexualmente transmissível, causada pela Neisseria gonorrhoeae,

pode infetar as mucosas da uretra, colo do útero, garganta e conjuntiva ocular (principalmente

nos recém-nascidos durante o parto). As mulheres geralmente são assintomáticas, e quando

apresentam sintomas são ligeiros [172].

Infeções do Trato Genital Masculino

De um modo geral, as infeções no homem são causadas pelos mesmos microrganismos

que determinam as da mulher, mas raras vezes são assintomáticos [172].

A uretrite gonocócica, causada pela Neisseria gonorrhoeae, leva ao aparecimento de

secreções purulentas provenientes do pénis, dor ao urinar, mas com grande necessidade de

urinar. A uretrite não gonocócica pode ser causada pela Chlamydia trachomatis, Ureaplasma

urealyticum, Mycoplasma hominis ou Trichomonas vaginalis. Na uretrite causada pela

Trichomonas vaginalis, os homens são, normalmente, assintomáticos, mas quando sintomáticos

podem apresentar secreção uretral, dor e ardor ao urinar, dor testicular, irritação da uretra e

infeção da próstata [172].

As úlceras genitais são essencialmente causadas pela Chlamydia trachomatis,

Haemophilus ducreyi e Treponema pallidum. A epididimite pode ser causada pela Chlamydia

trachomatis ou Neisseria gonorrhoeae, a orquite e a prostatite por Enterobacteriaceae ou

Pseudomonas spp [172].

Colheita

O utente não deverá ter efetuado qualquer tratamento local nos 3 dias anteriores à

colheita e, no próprio dia, pode efetuar a sua higiene, só não pode é utilizar soluções

antissépticas. É importante questionar o utente sobre a sintomatologia.



Leticia de Bastos

193

Exsudado vaginal: Colocar a utente em posição ginecológica, introduzir um

espéculo17 e colher o exsudado das paredes vaginais com recurso a uma zaragatoa

dacron seca em movimentos rotativos.

Exsudado endocervical: Colocar a utente em posição ginecológica, introduzir

um espéculo e colher com zaragatoa dacron uma amostra do fundo de saco vaginal

posterior e endocolo.

Exsudado uretral: Se possível colher o exsudado uretral antes da primeira micção

da manhã, caso não seja possível esperar pelo menos 1h após a última micção. Para se

proceder à colheita é necessário limpar cuidadosamente a mucosa circundante com

uma compressa esterilizada e, de seguida, introduzir uma zaragatoa flexível na uretra,

cerca de 1 cm para a mulher e 2cm para o homem, e com movimento rotativo recolher

o exsudado.

Esperma: Lavar as mãos e o pénis retraindo o prepúcio com uma gaze

esterilizada humedecida com sabão e depois passar com uma gaze esterilizada

humedecida só com água; colher o sémen por masturbação e todo o volume ejaculado

deve ser colocado no frasco fornecido. A colheita deve ser feita no Serviço de

Patologia Clínca e entregue de imediato. Se tiver também pedido de urocultura,

primeiro colher a urina e só depois o esperma.

No caso da colheita do exsudado vaginal, endocervical e uretral, sempre que possível,

repetir a operação com uma segunda zaragatoa para a realização de exame direto.

A pesquisa de Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. e

Trichomonas vaginalis devem ser orientadas. Para a pesquisa de Mycoplasma hominis e

Ureaplasma urealyticum, limpar primeiro o excesso de muco do exocolo com uma zaragatoa

estéril e de seguida introduzir nova zaragatoa de dacron estéril para efetuar a colheita, com um

movimento de rotação durante 5 a 10 segundos, arrastando cuidadosamente as células.

17 O espéculo é colocado sem lubrificante ou humedecido com soro fisiológico estéril e apenas deve ser utilizado em mulheres

não-grávidas ou que já tiverem iniciado a sua vida sexual.





Colocar a primeira zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), que será utilizada

para a sementeira, e a segunda em meio seco, que será utilizada para exame direto. Manter

ambas as zaragatoas à temperatura ambiente até serem processadas.

O esperma deve ser colhido para um recipiente estéril, seco e de boca larga. A colheita

tem de ser feita no Serviço de Patologia Clínca e entregue o mais rapidamente possível.


Exame Direto:

Exame a fresco e após coloração de Gram.

Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios COS, VCA3 e CAN2. Incubar a 35±2°C em

atmosfera enriquecida com 5% de CO2 os meio COS e VCA3, e em atmosfera de aerobiose o

meio CAN2, 18-24h, excepto o meio VCA3 que deverá incubar até 72h.

Nota:

O exame a fresco deverá ser feito logo após a colheita, caso não seja possível guardar a

zaragatoa na estufa a 35+2ºC. Este exame permite a pesquisa de Trichomonas vaginalis

(observação da mobilidade), elementos leveduriformes, contagem de células epiteliais,

leucócitos e eritrócitos.

A coloração de Gram é utilizada para a observação semi-quantitativa de Lactobacillus

spp., pesquisa de “clue cells” (células epiteliais cobertas de bactérias Gram variável), que são

sugestivas de Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, e avaliação da flora ou de outras estruturas

que possam auxiliar no diagnóstico.

9.16.11. Exsudado Vaginal/Rectal

O exsudado vaginal/retal é particularmente utilizado para a pesquisa de Streptococcus

agalactiae (estreptococo β-hemolítico do grupo B) no caso das grávidas entre as 35 e 37



Leticia de Bastos

195

semanas de gestação, a fim de evitar a contaminação perinatal de recém-nascidos. Esta bactéria

está particularmente associada a septicémia, pneumonias e meningite do recém-nascido, com

uma taxa de mortalidade entre 20-25%.

Colheita

Com a mesma zaragatoa fazer a colheita do exsudado da porção distal vaginal e da

região anal-retal, introduzindo a zaragatoa suavemente através do esfíncter anal e deixar 10-30

segundos para fixar os microrganismos e retirar.


Colocar a zaragatoa em meio de transporte (Meio Amies), mantida à temperatura

ambiente.


Exame Cultural:

Semear por espalhamento com zaragatoa o meio STRB e incubar a 35±2ºC em

atmosfera de aerobiose, 18-24h.

9.16.12. Hemoculturas

A cultura de sangue (hemocultura) representa um dos meios mais importantes para a

deteção de uma septicémia ou bacteriémia, que pode ser transitória, intermitente ou contínua.

O isolamento de um microrganismo a partir duma hemocultura é geralmente o agente etiológico

da infeção, sendo urgente a sua identificação para o estabelecimento de uma terapêutica

adequada [173].

As hemoculturas são pedidas essencialmente em caso de febre, choque, sintomas

associados à suspeita de infeção de um determinado local, ou quando se está perante um quadro

de febre de origem desconhecida [173].




Colheita

O sangue deve ser sempre colhido por punção venosa de veia periférica, após uma

correta desinfeção da pele com solução antissética deixando-a secar. É importante desinfetar

também as tampas dos frascos de hemoculturas, tendo o cuidado de deixar evaporar o

desinfetante antes de puncionar a borracha. Após a colheita inocular os frascos, sem mudar de

agulha, respeitando as proporções recomendadas pelo fabricante.

Para cada frasco de hemoculturas de adulto e pediátricas são necessários 8-10 mL e 1-3

mL de sangue total, respetivamente [174, 175]. Uma vez colhidas as hemoculturas, homogeneizar

cuidadosamente os frascos por inversão.

Para cada utente, colher 2 pares de hemoculturas (cada par é constituído por uma garrafa

de aerobiose e uma de anaerobiose). O ideal será colher cada par de hemoculturas em braços

opostos e antes de ser ter iniciado a antibioterapia. Na suspeita de endocardite, colher 3 pares

de hemoculturas.

Para a pesquisa de micobactérias no sangue ver secção 9.14.2.


Enviar as hemoculturas de imediato ao laboratório, mantendo os frascos à temperatura

ambiente até serem colocados no BACT/ALERT®, que possui um sistema automatizado de

incubação (37ºC), homogeneização e monitorização das hemoculturas.

Incubação

Equipamento: BacT/ALERT®, da bioMérieux

Os frascos de hemocultura contêm um meio de cultura com condições nutricionais e

ambientais adequadas aos microrganismos. Na presença de microrganismos, estes irão

metabolizar os substratos existentes no meio com produção de CO2, que irá alterar a cor do

sensor colorimétrico presente no fundo da garrafa, mudando de verde-azulado para amarelo. A

reflectância dos frascos é monitorizada e registada pelo sistema a cada 10 minutos. Se os níveis

de CO2 não se alterarem significativamente durante a incubação, a amostra é considerada

negativa [174, 175].



Leticia de Bastos

197

Por norma, o tempo de incubação no caso de uma hemocultura negativa é de 5 dias, à

exceção da suspeita de Brucella em que a incubação é prolongada para 21 dias, na suspeita de

endocardite a incubação é de 12 dias e para a pesquisa de fungos a incubação é de 11 dias.

As amostras consideradas negativas são retiradas do equipamento e este é o resultado

que sairá para o clínico. Se alguma hemocultura positivar é feito o exame microbiológico.


Retirar as hemoculturas positivas do equipamento, desinfetar a tampa de borracha com

solução antisséptica e deixar secar. Posteriormente, perfurar a tampa com uma agulha que tem

um dispensador permitindo retirar o conteúdo da garrafa. Depois de processadas, desinfetar

novamente a tampa dos frascos das hemoculturas, que serão armazenadas um mês na estufa.

Exame Direto:


Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, o meio COS e incubar a 35±2ºC em atmosfera

enriquecida com 5% de CO2, 18-24h.



Nota:

Caso se observe no Gram microrganismo e não crescer nada em cultura, significa que o

microrganismo necessita de meios mais nutritivos que o COS, como o Haemophilus, por

exemplo, ou colocar a hipótese de ser um microrganismo anaeróbio. Caso se suspeite de um

microrganismo anaeróbio, enviar os frascos para o INSA, para identificação e eventual TSA.

Para valorizar o crescimento numa hemocultura é suficiente o crescimento de um

microrganismo potencialmente patogénico. No caso de se ter isolado um microrganismo

comensal da pele, valorizar apenas se houver crescimento em pelo menos duas hemoculturas

de punções diferentes.




9.16.13. Catéteres

A presença de um catéter constitui uma porta de entrada para muitos microrganismos e

por vezes, encontram-se colonizados ou podem até mesmo ser um foco de infeção e levar a

bacteriémias ou septicémias. O envio de catéter para exame bacteriológico só é aconselhado se

existirem sinais de infeção relacionados com o catéter.

O principal agente responsável pela infeção dos catéter é o Staphylococcus epidermidis.

Contudo, também podem ser provocadas por Staphylococcus Coagulase negativa,

Staphylococcus aureus, Enterobacteriáceas, Candida spp., Bacilos Gram negativo e

Enterococcus spp.

A probabilidade de um catéter ficar colonizado é tanto maior quanto maior for a sua

permanência no organismo.

Colheita

Antes de retirar o catéter, colher hemoculturas de uma veia periférica, pois só assim será

possível valorizar o exame cultural. De seguida, desinfetar a pele em redor do catéter com um

antisséptico e retirar o catéter. Cortar cerca de 3-5cm da sua porção terminal para um recipiente

esterilizado, mantendo as condições de assepsia em todo o procedimento.


Recipiente seco e esterilizado de boca larga. Manter à temperatura ambiente até ser

processado.


Exame Cultural:

Semear, pelo método de Maki, em meio COS e incubar a 35±2ºC em atmosfera

enriquecida com 5% de CO2, 18-24h.



Leticia de Bastos

199

Nota:

Caso se desenvolvam menos de 15 colónias o resultado é lançado como negativo. Se se

observarem mais de 15 colónias só valorizar se a hemocultura for positiva.

9.16.14. Fezes

As causas mais frequentes de diarreia, em adultos e crianças com idade superior a 2-3

anos, é a infeção por Campylobacter spp., algumas espécies de Salmonella e Shigella,

Staphylococcus aureus [176] e Clostridium difficile. No entanto, um pequeno número de casos

pode ser provocado pela Giardia lamblia, Yersinia enterocolitica e E. coli O157:H7 [176].

Nas crianças com idade inferior a 3 anos são numerosos os casos de gastroenterite viral,

assim como por estirpes intestinais de Escherichia coli enteropatogénica [176].

Os indivíduos que viajam para o estrangeiro podem ser contaminados por diversos

microrganismos patogénicos intestinais, tais como Escherichia coli enterotoxinogénica,

Shigella dysenteriae, Aeromonas hidrophyla e parasitas como Entamoeba histolytica, entre

outros. Dai a importância de se saber se o utente esteve recentemente no estrangeiro e em que

país [176].

Nos doentes tratados com antibióticos, ocorre um desequilíbrio da flora normal, que

predispõe a infeção por diversas bactérias resistentes, Candida albicans, Cryptosporidium,

podendo ainda ocorrer uma enterocolite grave devida a uma estirpe de Staphylococcus aureus

resistente ou colite pseudomenbranosa por Clostridium difficile [176].

Colheita

O tipo de fezes de interesse para análise bacteriológica são as fezes diarreicas. Colher 3

amostras em dias sucessivos, pois a libertação dos microrganismos para as fezes pode não ser

contínua.

Colher uma porção equivalente a uma noz ou, no caso de fezes líquidas, um terço do

frasco.





As fezes devem ser colhidas para um recipiente limpo e seco e enviadas ao laboratório

até 2h após a colheita. Caso não seja possível, manter as amostras refrigeradas.

Nos laboratórios de Torres Novas e Abrantes, as amostras destinadas a coprocultura são

transferidas para o meio de transporte Cary Blair para serem enviadas para o Laboratório

Central, à temperatura ambiente, podendo ser conservada até 24h. As fezes recebidas do

ambulatório e internamento do Hospital de Tomar são processadas de imediato, não

necessitando da transferência para o meio de transporte.


Exame Cultural:

Semear, em quatro quadrantes, os meios YER, MCK e HEK e de seguida inocular em

Selenito. Incubar a 35+2ºC em atmosfera de aerobiose, 24h.

Em todas as unidades do CHMT sempre que são recebidas fezes para coprocultura é

feito o teste de screening para Campylobacter spp. Se o teste for positivo, para além dos meios

habituais, semear também o meio CAM e incubar em atmosfera de microaerofilia, 5 dias a

35+2ºC.

Exame Parasitológico

Teste Comercial: Concentrador Easy-Copros para Parasitas Intestinais, da Iberkit

Em caso de suspeita clínica de parasitose intestinal, é fundamental a análise

parasitológica das fezes como a forma de proceder à identificação correta de ovos de helmintas,

quistos ou trofozoítos de protozoários e / ou vermes intestinais [177].

Objetivo: Concentrar a amostra de fezes para pesquisa de parasitas ao microscópio

ótico, de forma a aumentar o número de quistos, trofozoítos, ovos ou larvas na preparação;

remover a maior parte da matéria fecal orgânica; e preservar os microrganismos, num estado

inalterado, para que possa ser mais fácil a sua deteção e identificação [177].

Método: Método de sedimentação por centrifugação [177].



Leticia de Bastos

201

Procedimento: Colocar uma pequena porção da amostra num tubo contendo formalina

a 10% e homogeneizar no vórtex. Adicionar 1,25 ml de acetato de etilo. Colocar o tubo com

fundo cónico no tubo primário, e filtrar todo o conteúdo, por inversão. Por fim, centrifugar a

suspensão 10 minutos a 1500rpm e decantar sobrenadante, para se poder obter o sedimento, que

é onde se encontram as estruturas parasitárias. O sedimento é observado “a fresco”, entre lâmina

e lamela. É necessário também fazer-se um esfregaço a partir do sedimento para corar com

coloração de Kinyoun para pesquisa de Cryptosporidium, Isospora belli e Microspora [177].

Outros Testes que podem ser pedidos pelo Clínico:

Teste screening para Clostridium difficile;

Teste screening para Adenovírus e Rotavírus;

Pesquisa de sangue oculto.

Para a execução dos testes mencionados, as amostras de fezes devem vir em recipiente

estéril e refrigerado.




9.17. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Negativos

Figura 30.Fluxograma para identificação de cocos Gram negativos.

Cocos Gram Negativos

Neisseria spp.

Moraxella spp.

Haemophilus spp.

Positivo Negativo

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux

Prova da Oxidase



Leticia de Bastos

203

Figura 31. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram negativo.

Bacilos Gram Negativos

Positivo Negativo

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux

Pseudomonas spp.

Amostra de Fezes,

em HEK: não

fermentadoras da

lactose e H2S

positivas

Positivo Negativo

Flora saprófita E. coli

Salmonella spp. ou

Shigella spp.

.

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux

Serologia para E.coli

O157:H7 em

crianças com idade

inferior a 2 anos

Prova da Urease

Prova da Oxidase




9.18. Fluxograma para Identificação de Bactérias Gram Positivos

Figura 32.Fluxograma para a identificação de cocos Gram positivo.

Staphylococcus spp. Streptococcus spp.

Staphylococcus

coagulase negativos

S. pneumoniae

Cocos Gram Positivos

Positivo Negativo

Prova da Catalase

Prova da Coagulase

Positivo Negativo

S. aureus

β-hemólise γ-hemólise α-hemólise

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux

Prova da Sensibilidade à

Optoquina ou Teste

rápido para identificação

de S. pneumoniae

Sensível/Positivo Resistente/Negativo



Leticia de Bastos

205

Figura 33. Fluxograma para a identificação de bacilos Gram positivo.

9.19. Fluxograma para Identificação de Leveduras

Figura 34. Fluxograma para identificação de leveduras.

Leveduras

SGC2 CAN2

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux

Bacilos Gram Positivos

Identificação +

TSA VITEK® 2,

da bioMérieux




9.20. Fluxograma para Identificação de Fungos Filamentosos

9.21. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes

Teste Comercial: Teste FOB da Chemtrue®

O cancro colo-rectal é o terceiro carcinoma mais frequente em Portugal [178], sendo o

seu rastreio fundamental, para ajudar na deteção precoce, reduzindo deste modo a mortalidade.

Amostra: Três amostras de fezes, colhidas em dias sucessivos.

Objetivo: Deteção qualitativa da hemoglobina em amostras fecais, para auxiliar no

diagnóstico de perturbações gastrointestinais inferiores, tais como cancro colorectal, pólipos e

adenomas [179].


Cor da frente e do

verso da colónia

Observação

macroscópica da

colónia

Fungos

Filamentosos

Observação

microscópica da

colónia

Micélio aéreo ou

rasteiro

Aspeto/Textura

Hifas septadas ou

não septadas

Hifas pigmentadas

ou hialinas

Crescimento

rápido ou lento

Estruturas

reprodutoras

Figura 36. Fluxograma para identificação de fungos filamentosos.



Leticia de Bastos

207

Procedimento: Retirar uma porção da amostra com um bastão e introduzi-la no tubo

que contém tampão salino, fornecido pelo kit. Homogeneizar e pipetar 2 gotas desta suspensão

na cassete. Na presença de hemoglobina, complexa-se com o conjugado (anticorpo anti-

hemoglobina humana) e irá mover-se por capilaridade até à zona de teste que ao complexar-se

com os anticorpos anti-imunoglobulina humana adsorvidos na membrana de nitrocelulose irão

formar uma linha visível. Independentemente da presença de hemoglobina, a migração continua

até à zona de controlo, formando uma linha visível, sendo indicador de um desempenho

adequado do procedimento. Cinco minutos depois ler o resultado do teste. Resultados negativos

não excluem sangramento, uma vez que alguns pólipos ou cancros da região cólon-retal podem

sangrar intermitentemente ou não sangrar e quando o fazem o sangue pode não se encontrar

distribuído uniformemente nas fezes [179].




10. Fase Pós-Analítica

A fase pós-analítica compreende a validação dos resultados. Para tal, é necessário ter

em consideração informações obtidas no ato da colheita (jejum, medicação), as condições de

transporte e acondicionamentos das amostras, bem como o resultado de outros parâmetros

laboratoriais, para além da idade, sexo, história clínica do doente e contexto clínico no qual

foram solicitadas as análises.

Os resultados obtidos pelos equipamentos são enviados para o sistema informático do

Serviço de Patologia Clínca. Posteriormente, é feita a validação biopatológica dos resultados

pelos Especialistas em Patologia Clínica ou Análises Clínicas.

Durante a validação, caso se verifique alguma discrepância nos resultados, é necessário

verificar as condições da amostra (hemólise, presença de fibrina, coágulo), e se a amostra

estiver conforme, repetir as análises, para confirmação de resultados lançados pelo

equipamento, no entanto, em determinadas situações, pode ser necessário solicitar uma nova

colheita.

Depois de validados, os resultados são disponibilizados ao clínico podendo ser uteis no

diagnóstico, prognóstico, monitorização e/ou planeamento da terapêutica de um utente.



Leticia de Bastos

209

11. Conclusão

O Mestrado em Análises Clínicas (MAC), bem como o Estágio profissional que integra

o Curso constituem uma excelente oportunidade para a aquisição de competências e

experiência, bem como de novos conhecimentos e consolidar outros adquiridos aquando da

licenciatura.

O estágio da valência de bioquímica foi efetuado no Hospital Dr. José de Almeida, onde

me encontrava a trabalhar há 4 anos. Foi uma experiência bastante enriquecedora, a nível

profissional, motivando para o aperfeiçoamento do trabalho laboratorial e desenvolvimento do

espirito crítico, uma vez que a validação técnica era feita pelos TSDT, bem como a validação

biopatológica da urgência, o MAC pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa foi

sem dúvida uma mais-valia.

Por motivos pessoais, comecei a trabalhar no Centro Hospital Medio Tejo, E. P.E, e no

Hospital de Tomar realizei o estágio das valências de hematologia e microbiologia. Foi uma

grande mudança, desde a integração, à dinâmica e organização laboratorial e, principalmente,

quanto ao tipo de trabalho executado e à multiplicidade de tarefas realizadas diariamente.

Contudo, consegui uma boa integração, tendo a possibilidade de adquirir novos métodos de

trabalho e conhecimentos em diversas áreas, assim como a possibilidade de interligá-los com

os adquiridos no MAC.

De um modo geral, durante o período de estágio, tive a possibilidade de demonstrar e

desenvolver tarefas de forma autónoma, bem como em equipas multidisciplinares, mas também

adquirir, aplicar e partilhar conhecimentos teórico-práticos.

A realização destes estágios proporcionou-me uma formação extra, atualizada e

consistente nas várias valências descritas no presente documento, que só foi possível de

alcançar em contexto real de trabalho, permitindo desse modo, consolidar os ensinamentos

recebidos no Curso. Para finalizar, considero que os objetivos propostos foram alcançados.




12. Referências Bibliográficas

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Leticia de Bastos

Dissertação orientada pela Professora Doutora Isabel Antolin Rivera.


2018


Abordagem Genética da Doença de Alzheimer Familiar: do Diagnóstico ao Tratamento

Leticia de Bastos

225

Índice

Índice ...................................................................................................................................... 225

Índice de Figuras .................................................................................................................... 227

Índice de Tabelas .................................................................................................................... 228

Siglas e Abreviaturas .............................................................................................................. 229

1. Introdução ....................................................................................................................... 231

1.1. Objetivos .................................................................................................................. 233

2. Doença de Alzheimer Familiar ....................................................................................... 234

2.1. Proteína Precursora Amilóide .................................................................................. 235

2.1.1. Mutações no gene APP .................................................................................... 237

2.2. Presenilinas 1e 2 ...................................................................................................... 241

2.2.1. Mutações no gene PSEN1 ................................................................................ 243

2.2.2. Mutações no gene PSEN2 ................................................................................ 246

2.3. Apolipoproteína E.................................................................................................... 248

2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1 .................................................................................... 249

3. Em Portugal .................................................................................................................... 250

4. Diagnóstico ..................................................................................................................... 251

4.1. História Clínica do Doente ...................................................................................... 253

4.2. Entrevista a Informante Informado .......................................................................... 254

4.3. Testes Cognitivos Breves ........................................................................................ 255

4.4. Investigação Laboratorial ........................................................................................ 256

4.5. Testes Neuropsicológicos ........................................................................................ 256

4.6. Testes Genéticos ...................................................................................................... 256

4.7. Neuroimagem .......................................................................................................... 257

4.8. Outros Biomarcadores ............................................................................................. 259

5. Hipóteses Terapêuticas ................................................................................................... 261




5.1. Tratamento Sintomático .......................................................................................... 261

5.1.1. Inibidores da Acetilcolinesterase ..................................................................... 261

5.1.2. Antagonista do Recetor N-Metil-D-Aspartato ................................................. 261

5.2. Tratamento Baseado na Etiologia ............................................................................ 262

5.2.1. Inibidores das Secretases .................................................................................. 264

5.2.2. Imunoterapia Aβ ............................................................................................... 264

5.2.3. Inibidores da Agregação do Péptido Aβ .......................................................... 266

5.2.4. Inibidores da Fosforilação da Proteína Tau ...................................................... 266

5.2.5. Inibidores da Agregação da Proteína Tau ........................................................ 268

6. No futuro… ..................................................................................................................... 269

7. Materiais e Métodos ........................................................................................................ 272

8. Discussão e Conclusão .................................................................................................... 273

9. Referências Bibliográficas .............................................................................................. 275



Leticia de Bastos

227

Índice de Figuras

Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA

(direita). .................................................................................................................................. 231

Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar. ....................... 232

Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não

amiloidogénica (à esquerda) e da via amiloidogénica (à direita). .......................................... 237

Figura 4. Mutações no gene APP. Representação da sequência proteica da APP do aminoácido

647 ao 730. ............................................................................................................................. 238

Figura 5. Apresentação esquemática da estrutura das proteínas PSENs. ............................... 241

Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada. ............ 243

Figura 7. Variantes PSEN1. Representação da sequência proteica da presenilina 1 ............. 244

Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2. ............ 247

Figura 9. Resumo dos principais alvos dos fármacos na DA e como monitorizar a terapêutica.

................................................................................................................................................ 263




Índice de Tabelas

Tabela 1. Indicadores de mortalidade pela DA em Portugal no ano 2015 ............................. 250

Tabela 2. Fatores que influenciam o risco da DA .................................................................. 254

Tabela 3. Testes Cognitivos Breves, aplicação e respetiva sensibilidade e especificidade. .. 255

Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o péptido Aβ

................................................................................................................................................ 265

Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da DA.

................................................................................................................................................ 270



Leticia de Bastos

229

Siglas e Abreviaturas

Aβ Beta-Amilóide

AICD (Amyloid Intracellular Domain) Domínio Intracelular Amilóide

APP (Amyloide Percursor Protein) Proteína Precursora Amilóide

ApoE Apolipoproteína E

AVC Acidente Vascular Cerebral

BACE-1 (β-Site Amyloid Precursor Protein Cleaving Enzyme 1) β-secretase 1

CTFα (C-terminal Fragment α) Fragmento C-terminal α

CTFβ (C-terminal Fragment β) Fragmento C-terminal β

DA Doença de Alzheimer

FDG 2-desoxi-2-[18F]fluoro-D-glucose

GSK-3 glicogénio sintase cinase 3

iRNAs (interfering RNAs) RNA interferente

LCR Líquido Cefalorraquidiano

MCI (Mild Cognitive Impairment) Comprometimento Cognitivo Ligeiro

miRNAs Micro-RNAs

NMDA N-Metil-D-Aspartato

PET (Posítron Emission Tomography) Tomografia de Emissão de Positrões

PSEN1 Presenilina 1

PSEN 2 Presenilina 2

p-tau Proteína Tau Hiperfosforilada

RM Ressonância Magnética

sAPPα Proteína Precursora α-Amilóide Segregada




sAPPβ Proteína Precursora β-Amilóide Segregada

SORL1 Recetor Ligado a Sortilina 1

TC Tomografia Computadorizada



Leticia de Bastos

231

1. Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa complexa e devastadora,

constituindo um importante problema de saúde pública a nível mundial [1-3]. Estima-se que 50-

75% dos doentes com demência apresentam DA, o que corresponde a cerca de 23 a 35 milhões

de pessoas em todo o mundo [3], sendo mais comum nos países desenvolvidos [1]. Esta doença

ocorre principalmente ao nível da população idosa [1,3,4], e, embora não seja uma consequência

normal do envelhecimento, a idade constitui um dos principais fatores de risco, seguido da

história familiar [5].

A Doença de Alzheimer (DA) resulta de perda irreversível de neurónios,

particularmente no córtex e no hipocampo [6] com atrofia cortical bruta e dilatação ventricular

[1,3]. Clinicamente, define-se por um início insidioso com perda progressiva de memória, das

funções cognitivas, dependência e morte [2,5,7]. Neuropatologicamente, é caracterizada pela

presença de placas neuríticas extracelulares (placas senis18), que resultam da deposição do

péptido β-amilóide (Aβ), sendo as formas oligoméricas de Aβ cruciais para iniciar a patogénese

da doença [1,3,6], levando à morte celular e consequentemente à demência (Figura 1 e 2) [8, 9].

Esse péptido também reveste as paredes dos vasos cerebrais, levando à angiopatia amilóide

cerebral [10].

18 Placas neuríticas, senis ou amilóides: Depósitos extracelulares esféricos que possuem um núcleo fibrilar rodeado por

microglia, astrócitos reativos e neurites distróficas resultantes do processo neurodegenerativo neuronal. O principal

componente é o péptido Aβ [12].

Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA (direita) [11].

Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar [9].

Corte histológico do neocórtex de um doente que morreu de DA, corado pelo método de Bielschowsky modificado. À esquerda,

placa amilóide extracelular e à direita, emaranhado neurofibrilar que circunda o núcleo do neurónio.

Figura 1. Representação esquemática de um cérebro sem DA (esquerda) e um cérebro com DA (direita) [11].




Também se verifica a acumulação intraneuronal de emaranhados neurofibrilares19

compostos por proteína tau hiperfosforilada (p-tau) [1,3,6]. Estes eventos levam à disfunção

sináptica que está intimamente relacionada com a duração e gravidade da doença (Figuras 1 e

2) [13].

Uma vez que os sintomas clínicos da DA se sobrepõem substancialmente a outros

distúrbios do sistema nervoso central, o diagnóstico definitivo desta patologia só pode ser

obtido com o exame neuropatológico post-mortem dos tecidos cerebrais [2,5].

A DA é uma doença multifatorial e heterogénea, que pode ser classificada em dois

subtipos tendo em conta a idade em que surge: DA de início precoce, que normalmente surge

antes dos 65 anos de idade; e DA de início tardio, ou Alzheimer “esporádico”, que se

desenvolve nos indivíduos com mais de 65 anos [1,2,14]. Ambos os subtipos possuem

manifestações clínicas semelhantes, principalmente nos estádios finais, sendo por vezes a idade

um dos únicos critérios que permitem fazer esta distinção [3].

A DA de início precoce é uma forma relativamente rara da doença, correspondendo a

5-10% dos casos diagnosticados [14]. A história familiar está presente em cerca de 35-60% dos

casos de DA de início precoce e aumenta em 15% quando existe uma hereditariedade

autossómica dominante [15].

A forma predominante da DA é a de início tardio [1], que corresponde a mais de 95%

dos casos [5,6]. Esta apresenta uma associação familiar menos evidente, embora 60-80% dos

19Emaranhados neurofibrilares: A proteína tau é uma proteína de ligação aos microtúbulos, quando hiperfosforilada acumula-

se em agregados intracelulares conhecidos como emaranhados neurofibrilares [16].

Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado neurofibrilar [9].



Figura 3. Representação esquemática dos processos proteolíticos da APP e ilustração da via não amiloidogénica (à

esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].Figura 2. Fotomicrografia da placa neurítica e do emaranhado

neurofibrilar [9].





Leticia de Bastos

233

casos possam ter origem hereditária; a etiologia dos casos esporádicos é mais complexa devido

a interações entre componentes ambientais e genéticos, existindo outros fatores que contribuem

para o início, progressão e gravidade da doença [2,5,14]. O alelo ε4 do gene que codifica a

apolipoproteína E (ApoE) é o principal fator de risco para a patogénese de DA de início tardio,

aumentando em 3,7 o risco para a doença nos indivíduos heterozigóticos e 14 vezes nos

indivíduos homozigóticos [1-3,5,17]. Diversos investigadores identificaram inúmeras mutações e

polimorfismos associados ao aumento do risco de desenvolvimento da DA esporádica, estando

a maioria localizados em genes ligados ao metabolismo lipídico, resposta inflamatória e

endocitose. Contudo, o envelhecimento continua a ser considerado o principal fator de risco,

seguida da hipertensão, dislipidémia, síndrome metabólica e diabetes [17].

Com o avanço da genética molecular, a pesquisa de genes responsáveis por ambas as

formas de Alzheimer tem sido amplamente realizada [6]. Embora a maioria dos doentes

desenvolva a doença em idade avançada, é principalmente a investigação realizada sobre a

forma rara que levou a um maior conhecimento acerca da patogénese da doença [2].

1.1. Objetivos

O objetivo desta dissertação é conhecer um pouco mais acerca da DA, nomeadamente

da sua forma familiar, quais as alterações genéticas com maior relevância clínica, a

fisiopatologia, o diagnóstico e as possíveis opções terapêuticas.




2. Doença de Alzheimer Familiar

Em 1906, Alois Alzheimer relatou o caso de uma mulher que apresentava uma demência

peculiar aos 51 anos, correlacionada com a função cognitiva, características comportamentais

e achados histopatológicos no córtex cerebral característicos da doença [6], nomeadamente a

presença de placas senis e de emaranhados neurofibrilares [7]. Posteriormente, Emil Kraeplin

nomeou esta demência pré-senil (início <65 anos) de "Doença de Alzheimer". O Alzheimer

familiar foi relatado pela primeira vez por Sjogren et al. em 1952, e a partir de 1980, vários

casos começaram a ser reportados [6].

Os indivíduos que desenvolvem Alzheimer familiar de inicio precoce apresentam os

primeiros sintomas entre 30 e os 65 anos, sendo a maioria diagnosticados entre os 45 e os 60

anos. Como esta doença atinge pessoas que ainda se encontram com uma vida ativa, o impacto

é mais devastador. A progressão clínica da doença é mais rápida, ocorrendo sintomas

comportamentais intensos e psicóticos. Alguns estudos relataram uma maior carga

neuropatológica ou uma deterioração da conectividade funcional das redes neurais mais

extensa, não se encontrando confinada à região temporal mediana, podendo envolver também

o neocórtex [4]. Para além da apresentação clínica típica, os doentes apresentam com maior

frequência manifestações atípicas como sintomas corticais focais, disfunção visual, apraxia,

discalculia, afasia e disfunção executiva [3].

A DA familiar é essencialmente causada por mutação raras, altamente penetrantes, em

genes que codificam para a proteína precursora amilóide (APP), a presenilina 1 (PSEN1) e a

presenilina 2 (PSEN2). Mutações nestes genes resultam na alteração da formação do péptido

Aβ [5,6,17].

A execução de estudos funcionais levou ao desenvolvimento da “hipótese da cascata

amilóide” [18]. Este é o modelo mais influente da patologia molecular da DA desenvolvido ao

longo dos últimos 25 anos [8]. Nas formas genéticas da doença com transmissão autossómica

dominante, esta hipótese pressupõe que a deposição dos péptidos Aβ é o evento patológico

inicial para o desenvolvimento da doença [17], sendo o péptido Aβ42, a variante insolúvel e auto-

agregante, que leva à formação de placas senis e emaranhados neurofibrilares [1,8,19], levando à

destruição de sinapses, morte neuronal [3,17] e consequentemente à demência [8].



Leticia de Bastos

235

As variantes genéticas da APP estão localizadas na sequência Aβ, perto desta e/ou na

proximidade dos locais de clivagem das secretases, ao passo que as variantes das presenilinas

podem ser encontradas em qualquer local da proteína [3].

A frequência estimada para as mutações nos genes APP, PSEN1 e PSEN2 são 14%, 81%

e 6%, respetivamente, as quais podem explicar até 71% do padrão de transmissão autossómico

dominante da DA familiar [18].

Durante muitos anos, estes genes foram descritos como sendo os únicos responsáveis

pela DA familiar de início precoce e o gene que codifica a ApoE como o único gene de

suscetibilidade confirmado para a DA esporádica. Contudo, desde o início dos anos 90, centenas

de genes têm sido implicados no aumento do risco da doença [20].

Atualmente, sabe-se que a ApoE e variantes raras no recetor relacionado com a sortilina

1 (SORL1) podem estar também relacionadas com o aparecimento da DA de início precoce,

nomeadamente com a DA familiar [1,15]. Ainda assim, muitos casos apresentam origem

geneticamente inexplicada ou desconhecida [18].

2.1. Proteína Precursora Amilóide

A proteína precursora amilóide (APP) é uma glicoproteína transmembranar e ubíqua

constituída por 770 aminoácidos [1,12]. Este polipéptido encontra-se nas membranas celulares e

de uma forma abundante no cérebro. A proteína APP atua como uma proteína chaperone

exercendo funções citoprotetoras e, aparentemente, também se encontra envolvida nas

reparações sinápticas, sinalização celular, podendo ainda mediar as interações que facilitam o

transporte de substâncias sintetizadas no corpo celular dos neurónios para as sinapses distais

[17].

O gene APP, localizado no cromossoma 21q21.1 - 21q21.3 [1], possui 18 exões que após

transcrição e splicing alternativo originam pelo menos cinco isoformas da APP designadas de

acordo com o seu comprimento em aminoácidos. As únicas formas presentes no cérebro são a

APP695, APP714, APP751 e APP770, sendo a APP695 expressa em maior quantidade [1,12].

A APP é clivada por duas vias proteolíticas independentes, não-amiloidogénica ou

amiloidogénica, pela ação de três enzimas denominadas α-, β-, e y-secretases [19].




Na via não-amiloidogénica, a proteólise da APP ocorre pela ação das enzimas α- e y-

secretases dando origem a fragmentos não patogénicos [1]. A α-secretase cliva a proteína APP,

libertando a proteína precursora α-amilóide (sAPPα) para o meio extracelular. Em seguida, um

fragmento carboxi-terminal com 83 resíduos de carbono (C83) é digerido pela γ-secretase,

libertando o domínio intracelular amilóide (AICD, do inglês Amyloid Intracellular Domain –)

(Figura 3) [19].

A via amiloidogénica combina ações sequenciais das enzimas β- e y-secretase, gerando

péptidos Aß ao nível do complexo de Golgi e em menor extensão no retículo endoplasmático

[13]. Este péptido é codificado pelos exões 16 e 17 do gene APP [12].

A enzima β-secretase, também designada por BACE-1 (β-site amyloid precursor

protein cleaving enzyme 1), cliva a APP libertando para o meio extracelular a extremidade N-

terminal da proteína precursora β-amilóide (sAPPβ) (Figura 3) [19]. O péptido C-terminal com

99 resíduos de carbono (C99) é inicialmente clivado pela ε-secretase, produzindo o péptido

Aβ48 ou Aβ49 e o AICD. Posteriormente, o péptido Aβ resultante é clivado consecutivamente

pela γ-secretase a cada três ou quatro aminoácidos levando à formação dos péptidos Aβ42, com

42 aminoácidos, e Aβ40, com 40 aminoácidos, respetivamente [9,21], podendo, no entanto, ser

observadas pequenas quantidades de outros fragmentos [22]. Quando a proteólise da APP

catalisada pela γ-secretase é normal, a espécie predominante é o péptido Aβ40, sendo que o

péptido Aβ42 representa apenas 5-15% do total dos péptidos amilóides produzidos [22]. No

entanto, o fragmento que se encontra mais associado à DA é o Aβ42, pois é o mais neurotóxico

e propenso à agregação [9,23].

O AICD, gerado por ambas as vias, é libertado no citoplasma após clivagens sucessivas

e transportado para o núcleo, onde passa a influenciar os processos de transcrição [19].



Leticia de Bastos

237

2.1.1. Mutações no gene APP

Diversos estudos têm demonstrado que doentes com DA familiar, portadores de

mutações no gene APP, apresentam alterações nas características neuropatológicas centrais e

nas autópsias tendem a apresentar maior quantidade de placas senis neocorticais do que

indivíduos com DA esporádica. Estes dados, apesar de terem sido observados em poucos casos,

confirmam uma ampla sobreposição de resultados [9]. Outra característica comum nestes

doentes é a existência de angiopatia amilóide cerebral, que muitas vezes ocorre em simultâneo

com hemorragias cerebrais [25].

A primeira mutação no gene APP foi descoberta por Goate et al., em 1991, (p.Val717Ile,

exão 17) [6,12]. Com o avanço das metodologias de genética molecular, diversos investigadores

começaram a identificar mutações no gene APP, relacionando-as com a possibilidade de serem

a causa da DA (Figura 4) [9].


esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].

APP: proteína precursora amilóide; sAPPα: proteína precursora α-amilóide segregada, AICD: domínio amilóide intracelular;

sAPPβ: proteína precursora β-amilóide segregada; Aβ: péptido β-amilóide; APH-1, anterior pharynx-defective 1; CTFα:

fragmento C-terminal α; CTFβ: fragmento C-terminal β; PEN-2, presenilin enhancer 2.


esquerda) e da via amiloidogénica (à direita) [24].

APP: proteína precursora amilóide; sAPPα: proteína precursora α-amilóide segregada, AICD: domínio amilóide intracelular;

sAPPβ: proteína precursora β-amilóide segregada; Aβ: péptido β-amilóide; APH-1, anterior pharynx-defective 1; CTFα:

fragmento C-terminal α; CTFβ: fragmento C-terminal β; PEN-2, presenilin enhancer 2.




Figura 4. Mutações no gene APP. Representação da sequência proteica da APP do aminoácido 647 ao 730 [3].

Verde: sequência do domínio extracelular; Laranja: sequência do domínio transmembranar; Azul-escuro: sequência do domínio

intracelular. Púrpura: mutações patogénicas conhecidas; duplicações genómicas não estão representadas na figura; Vermelho:

duas mutações recessivas patogénicas; Cinza: mutações não patogénicas. Um círculo envolve o p.A673: porque a mudança

para T está descrita como protetora contra a DA, bem como a mudança para V no estado heterozigótico. =: marca uma mutação

silenciosa não patogénica em p.G708; Delta: indica uma eliminação. Os locais de clivagem das secretases estão marcados com

linhas a tracejado preto.

Até à data, 54 mutações no gene APP foram associadas à DA, sendo a maioria do tipo

missense, podendo, no entanto, também ocorrer deleções parciais ou duplicações do gene [3].

Até à data, 52 variantes patogénicas da APP foram relatadas em 119 casos índex de famílias

que apresentam um padrão de hereditariedade autossómico dominante; contudo, foram

reportadas duas mutações apresentando transmissão recessiva, p.A673V e p.E693D, capazes de

causar DA familiar [1,3].

A maioria das mutações está localizada nos exões 16-17, que codificam o domínio

transmembranar onde se encontram os locais de reconhecimento das secretases. De um modo

geral, estas mutações alteram o processamento da APP levando à acumulação de fragmentos

Aβ42 [14,12].

A mutação APP Swedish (p.LysMet670/671AsnLeu), identificada em duas famílias

suecas [6], é a única dupla mutação pontual localizada na extremidade N-terminal do domínio

Aß, adjacente ao local de clivagem da β-secretase, em que os aminoácidos lisina-metionina são

substituídos por asparagina-leucina [1]. Esta variante está associada ao aumento da deposição

do péptido Aβ42 no cérebro [12], uma vez que a quantidade do péptido Aβ produzido a partir da

APP mutada é 2-3 vezes superior á que é produzida pela APP não mutada (wild-type). Embora

haja um excesso de produção, a sequência de aminoácidos é normal pois a mutação ocorre fora

da região codificante do péptido Aβ, sendo o excesso de produção suficiente para causar DA

[9].

Curiosamente, diversos estudos têm demonstrado que os doentes com Síndrome de

Down (trissomia 21) desenvolvem DA com alterações neuropatológicas extensas que podem



Leticia de Bastos

239

ocorrer desde muito cedo, a partir dos 40 anos de idade, devido à sobre-expressão do gene APP

que conduz à acumulação de péptido Aβ [14].

Outras mutações APP responsáveis pela DA ocorrem na ou após a região codificante do

C-terminal do domínio Aβ. Exemplos de mutações localizadas junto à extremidade distal C-

terminal do domínio Aβ adjacente ao local de ação da γ-secretase são as mutações Iranian

(p.Thr714Ala), Australian (p.Thr714Ile), French (p.Val715Met), German (p.Val715Ile),

Florida (p.Ile716Val) e London (p.Val717Ile). As mutações Flemish (p.Ala692Gly), Italian

(p.Glu693Lys), Dutch (p.Glu693Gln), Arctic (p.Glu693Gly) e Iowa (p.Asp694Asn) estão

localizadas dentro da sequência de codificação do Aβ [6].

A mutação London (p.Val717lle), a mais comum a nível mundial, altera a atividade

funcional da γ-secretase levando ao aumento da razão Aβ42/Aβ40, devido ao incremento do

péptido Aβ42 e à diminuição dos níveis do péptido Aβ40, não ocorrendo necessariamente uma

mudança na quantidade total de péptido Aβ produzido [9]. Achados neuropatológicos numa

família Inglesa revelaram corpos de Lewy20 a nível cortical e angiopatia amilóide suave, e numa

família Americana foram encontradas placas senis e emaranhados neurofibrilares, com ausência

de angiopatia amilóide ou corpos de Lewy [1].

A mutação Flemish (p.Ala692Gly) ocorre dentro da região do domínio Aβ, afetando a

atividade da γ-secretase e levando ao aumento de duas a quatro vezes a produção dos péptidos

Aβ42 e Aβ40. Esta mutação origina a deposição do péptido Aβ nas paredes dos vasos

sanguíneos cerebrais e nas placas senis, formando grandes placas densas [9], não se observando

emaranhados neurofibrilares. Clinicamente, os doentes apresentam, por volta dos 40 anos de

idade, sintomas relacionados com alterações cerebrovasculares ou disfunção cognitiva [6].

Os portadores da mutação Dutch (p.Glu693Gln) apresentam angiopatia amilóide

cerebral com deposição de raras placas amilóides, podendo ocorrer hemorragias cerebrais [2,3].

Clinicamente, são caracterizados por sintomas focais relacionados com alterações

cerebrovasculares recorrentes, a que geralmente se segue uma demência entre os 40 e 50 anos

[6]. Nestes indivíduos, o declínio cognitivo progressivo está relacionado com a lesão vascular

cerebral [9].

20 Corpos de Lewy: achados histológicos, localizados no interior ou fora dos neurónios, com forma ovóide ou alongada [26].




A mutação Arctic (p.Glu693Gly) é uma mutação missense que ocorre na região

codificante do domínio Aβ. Esta mutação aumenta a taxa de agregação do péptido mutado, com

presença marcada de angiopatia amilóide cerebral acompanhada por abundantes placas

neuríticas em anel e emaranhados neurofibrilares [1,9]. Contudo, imagens do cérebro mostram

que não há sinais de acidentes vasculares cerebrais ou lesões vasculares. Indivíduos portadores

desta mutação apresentam um fenótipo puramente cognitivo aos 50 anos de idade [1,9,6].

Portadores da mutação Iowa (p.Asp694Asn) desenvolvem demência progressiva com

comprometimento da fala, sem quaisquer sintomas aparentes de alterações cerebrovasculares

[6]. Tanto a mutação Iowa como a mutação p.Ala713Thr estão associadas a angiopatia amilóide

cerebral grave, no contexto das características neuropatológicas centrais da DA [9].

Diversas mutações foram identificadas nos aminoácidos Val717 e Glu693, tornando

ambos os locais hotspots de mutações no gene APP [6].

As mutações no gene APP geralmente apresentam um padrão de transmissão

autossómico dominante. No entanto, existem duas mutações de transmissão autossómica

recessiva, uma deleção do aminoácido ácido glutâmico na posição 693 (p.Glu693del) que em

homozigotia pode levar à DA, e a mutação missense na posição 673, com substituição de uma

alanina por uma valina (p.Ala673Val), que em heterozigotia apresenta propriedades anti-

amiloidogénicas, sugerindo portanto um efeito protetor [3], mas que em homozigotia pode levar

ao surgimento da doença. Curiosamente, no mesmo local, a mutação p.Ala673Thr demonstrou

um forte efeito protetor contra DA, observando-se in vitro a redução da produção dos péptidos

amilóides em cerca de 40% [19].

Diversos estudos apontam para o papel dos péptidos Aβ com propriedades alteradas

como sendo a chave da patogénese da DA [1]. No entanto, os processos neurodegenerativos são

consequência de um desequilíbrio entre a sua produção e depuração, sugerindo a existência de

outros genes envolvidos que contribuem como fatores de risco para DA [2].



Leticia de Bastos

241

2.2. Presenilinas 1e 2

Os genes PSEN1 (cromossoma 14) e PSEN2 (cromossoma 1), que codificam para as

presenilinas 1 e 2 respetivamente, são dois genes altamente homólogos (67%) em que 10 dos

seus exões (exões 3-12) codificam uma proteína com aproximadamente 450 aminoácidos [8].

As duas proteínas diferem apenas na região N-terminal e na região hidrofílica. A região

hidrofóbica é altamente conservada [24]. As presenilinas possuem 9 domínios transmembranares

[24] e são expressas em vários tecidos, nomeadamente no cérebro, principalmente ao nível dos

neurónios, estando presentes no complexo de Golgi, retículo endoplasmático, membranas

plasmáticas e mitocôndrias (Figura 5) [12].

Durante o desenvolvimento, a presenilina 1 é expressa no sistema nervoso central em

níveis mais elevados e encontra-se em maior quantidade do que a presenilina 2. No entanto,

num cérebro adulto as presenilinas são expressas e distribuem-se de modo semelhante [12].

A função das presenilinas foi descrita pela primeira vez por Wolfe et al. em 1995 [36],

que propôs que dois resíduos de aspartato transmembranar (257 e 385) em PSEN1 eram críticos

para a atividade da γ-secretase [14]. Atualmente, é sabido que as presenilinas em conjunto com

nicastrina, APH1 (anterior pharynx-defective 1) e PEN2 (presenilin enhancer 2) [23] formam o

complexo catalítico γ-secretase [8,27].

As presenilinas, para além de estarem envolvidas na proteólise intramembranar da APP

e de outras proteínas, intervêm na homeostasia do cálcio ao nível celular, na libertação de

Figura 5. Apresentação esquemática da estrutura das proteínas PSENs [3].

A região com topologia variável encontra-se enquadrada: inclui um domínio intermembranar com C-terminal intracelular ou

um nono domínio transmembranar com C- terminal extracelular. Os pontos pretos nos domínios transmembranares indicam a

localização dos aspartatos catalíticos. Os locais de clivagem da α, β e γ- secretase estão indicados esquematicamente.

Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].Figura 5. Apresentação

esquemática da estrutura das proteínas PSENs [3].

A região com topologia variável encontra-se enquadrada: inclui um domínio intermembranar com C-terminal intracelular ou

um nono domínio transmembranar com C- terminal extracelular. Os pontos pretos nos domínios transmembranares indicam a

localização dos aspartatos catalíticos. Os locais de clivagem da α, β e γ- secretase estão indicados esquematicamente.




neurotransmissores [8,12], assim como estão envolvidas em diversas vias metabólicas essenciais

[27], necessárias para o desenvolvimento e manutenção das funções do cérebro, da função

sináptica, sobrevivência neuronal, sendo também importantes para a memória e a aprendizagem

[28,12].

Múltiplos substratos da γ-secretase intervêm direta ou indiretamente em muitos

processos celulares, tais como regulação da transcrição, controlo do ciclo celular [27], via de

sinalização Notch21 [8], angiogénese, oncogénese, adesão celular, e modulação dos canais de

sódio/potássio que intervêm na geração e propagação dos potenciais de ação [27].

Mutações ao nível dos genes PSEN são um importante fator de risco para a DA [24], pois

conduzirão inevitavelmente a alterações na conformação da proteína resultante, o que levará à

alteração das interações alostéricas com a γ-secretase, afetando a afinidade de ligação ao

substrato e a taxa de hidrólise. Estas alterações físico-químicas irão levar à perda ou ganho de

atividade enzimática e especificidade, com graves consequências sobre a homeostasia do

cérebro [27].

Existem fortes evidências de que mutações ao nível das presenilinas afetam várias vias

de sinalização e aumentam a vulnerabilidade do cérebro para a toxicidade devido ao aumento

do péptido Aβ [36]. Mutações ao nível do complexo γ-secretase podem levar a um aumento dos

níveis de péptido Aβ42 [1] ou ocorrer a uma diminuição da formação do péptido Aβ40,

sugerindo um mecanismo de perda de função [2], podendo ser parcial ou total [8,28].

As mutações, em qualquer um dos dois genes, podem estar na origem da DA familiar

[9]. Contudo, as que ocorrem no gene PSEN1 constituem um maior fator de risco [6]. As

mutações podem localizar-se em toda a sequência do gene, ocorrendo, no entanto, a maioria

nos domínios transmembranares [12] e em algumas das ansas hidrofílicas [2].

O espectro de mutações ao nível dos genes PSEN inclui mutações missense, as quais

constituem a grande maioria [19], mas também pequenas inserções e deleções têm sido relatadas,

como por exemplo deleções genómicas específicas em PSEN1 que levam à eliminação in frame

do exão 9 [3].

Existe uma grande heterogeneidade fenotípica entre os portadores destas mutações. A

variabilidade clínica e neuropatológica pode estar relacionada com o mecanismo de ação das

21 A via de sinalização Notch é um regulador crucial de inúmeros processos, nomeadamente inflamação, stress oxidativo,

apoptose, proliferação, crescimento e diferenciação celular [37].



Leticia de Bastos

243

diferentes variantes ou com co-morbidade de outras doenças neurodegenerativas. É possível

observar-se uma grande quantidade de emaranhados neurofibrilares, assim como achados

neuropatológicos distintivos, incluindo placas “algodão-lã22” (Figura 6), corpos de Lewy,

alterações da substância branca com aglomerados atípicos de placas amilóide e um grau

variável de micro-hemorragias [38].

2.2.1. Mutações no gene PSEN1

O gene PSEN1 está localizado no cromossoma 14q24.3 [1] e possui 12 exões; contudo,

a região codificante situa-se entre os exões 3-12, originando uma proteína com 467 aminoácidos

[24].

Até à data, 227 mutações patogénicas foram identificadas no gene PSEN1 (Figura 7),

das quais apenas 23 foram classificadas como não estando associadas, ou associadas de uma

forma não clara, à DA [27]. Das mutações patogénicas associadas à DA, 70% ocorrem nos exões

5, 6, 7 e 8 [1]. As mutações observadas são essencialmente do tipo missense, pequenas inserções

ou deleções [3].

Os doentes com mutações PSEN1 podem desenvolver sintomas de DA na faixa dos 30

aos 50 anos [14]. Apesar de algumas exceções, a penetrância da doença é completa na presença

de mutações no gene PSEN1 [3,19], isto é, todos os portadores da mutação desenvolvem a doença

[9].

22 Placas “algodão-lã”: Muitas vezes associadas a uma variante morfológica das placas Aβ, ocorrem nas mesmas regiões do

cérebro que as placas senis [9] e tendem a ser mais imunorreativas para o péptido Aβ42 do que para o Aβ40 [1].

Figura 6. Placas "algodão-lã" coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].

Placas de Aβ sem um núcleo denso ou distrofia neurítica.

Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].Figura 6. Placas "algodão-lã"

coradas com coloração de Bielschowsky modificada [9].

Placas de Aβ sem um núcleo denso ou distrofia neurítica.




Cinco mutações diferentes no resíduo 143 do gene PSEN1

(p.Ile143Val/Phe/Asn/Thr/Met, codificado pelo exão 5) foram identificadas, tornando este

resíduo um hotspot mutacional [6].

Figura 7. Variantes PSEN1. Representação da sequência proteica da presenilina 1 [3].

Azul: domínios citoplasmáticos; Amarelo: domínios transmembranares; Vermelho: domínios luminais; Verde: domínio

intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: variantes patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:

variantes com patogenicidade pouco clara; Cinza: variantes não patogénicas. Delta: deleções; •: 2 aspartatos (D) localizados

nos domínios transmembranares (TM) VI (D257) e VII (D335); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de

cada domínio topológico.

Outras mutações são responsáveis pela DA familiar, tais como a mutação p.Ala431Glu

encontrada em famílias mexicanas, e a mutação p.Leu166Pro encontrada numa adolescente

com a doença a desenvolver-se muito precocemente comparativamente ao que é considerado

normal. Estudos in vitro indicaram que esta mutação induz níveis extremamente elevados de

Aβ42, bem como alterações na via de sinalização Notch [19].

A mutação de transmissão autossómica dominante p.Glu280Ala, com penetrância

completa, tem sido alvo de diversas investigações. Clinicamente, os indivíduos portadores desta

mutação apresentam um declínio cognitivo com grau variável de défices neurológicos,

distúrbios da marcha, e transtornos psiquiátricos e comportamentais [27].



Leticia de Bastos

245

Uma mutação missense no exão 8 do gene PSEN1 (p.Leu271Val) resulta na falta de

transcrição deste mesmo exão. Esta mutação não tem sido associada ao aumento das placas

senis, mas sim ao aumento da acumulação da proteína tau e outras alterações neurofibrilares [9].

Uma deleção de três pares de bases no exão 12 do gene PSEN1 foi associada a corpos

de Lewy difusos e a placas “algodão-lã”. Embora as placas “algodão-lã” sejam características

da mutação do gene PSEN1 também foram observadas em casos de DA esporádica [9].

Mutações ao nível do gene PSEN1 levam a um comprometimento da memória e de

múltiplos domínios cognitivos. Além de sintomas cognitivos, no início da doença os indivíduos

também podem apresentar sintomas menos comuns, nomeadamente mioclonia e convulsões [6],

bem como cefaleias [25]. Também foram observados sinais extrapiramidais, comportamentais,

bem como alterações psiquiátricas (agitação, depressão, desilusão e alucinações) e afasia.

Embora não sejam sintomas exclusivos da DA familiar, são significativamente mais frequentes

em portadores de mutações no gene PSEN1 [6].

Dois perfis histopatológicos distintos foram identificados na DA familiar causada por

mutações no gene PSEN1, sendo que o tipo de patologia parece estar relacionado com a

localização da mutação no gene. As mutações que ocorrem antes do codão 200 são mais

frequentemente associadas a um padrão de patologia tipo 1, com presença de muitas placas

difusas e poucas de matéria branca. A angiopatia amilóide é apenas ligeira a moderada e é

geralmente confinada aos vasos leptomeníngeos e, de um modo geral, assemelha-se à patologia

observada na DA esporádica. As mutações situadas além do codão 200 tendem a apresentar

uma distribuição das placas difusa muito mais extensa e concentrada em torno das artérias,

sendo a angiopatia amilóide quase sempre grave [22].

No entanto, esta distribuição não é absoluta, pois algumas mutações que ocorrem antes

do codão 200 já foram associadas à angiopatia amilóide generalizada, tal como p.Glu184Asp e

as deleções p.Ile83/Met84del. E do mesmo modo, mutações que ocorrem após o codão 200,

como é o caso da mutação p.Asn405Ser, podem apresentar uma angiopatia amilóide limitada

[22].




2.2.2. Mutações no gene PSEN2

O gene PSEN2 encontra-se localizado no cromossoma 1q31-q42 [3] e possui 12 exões

[24], apenas 10 dos quais são traduzidos para gerar uma proteína com 448 aminoácidos [12].

Após transcrição e splicing alternativo resultam duas isoformas da proteína PSEN2: a

isoforma 1, que está presente ao nível da placenta, músculo-esquelético e coração, e a isoforma

2, que não possui os aminoácidos 263-296, encontra-se essencialmente no cérebro, coração,

placenta, fígado, músculo esquelético e rim [24].

Tal como a presenilina 1, a presenilina 2 é um dos principais componentes do complexo

γ-secretase; no entanto, embora haja uma grande homologia entre as duas proteínas, menos

péptidos amilóides são produzidos a partir da presenilina 2 [1]. As mutações associadas ao gene

PSEN2 são mais raras [1], tendo sido descritas apenas 38 mutações (Figura 8), das quais 16 estão

relacionadas de uma forma clara à DA [27] e são maioritariamente do tipo missense [3].

A primeira mutação no gene PSEN2 associada à DA foi descrita em 1995 por Levy-

Lahad et al. [14,18].

A maioria das mutações associada ao gene PSEN2 foram descobertas na Europa e em

África. Até agora, apenas 2 mutações missense foram associadas a DA familiar em populações

asiáticas: a mutação p.Asn141Tyr numa família chinesa e a mutação p.Arg62Cys descrita num

doente coreano [24].

O grupo mais bem estudado para uma mutação no gene PSEN2 é a família Volga alemã,

portadora da mutação p.Asn141Ile. O início dos sintomas começa por volta dos 40 anos de

idade, podendo estender-se até à sétima ou oitava década de vida [6,18]. Estes doentes têm

tendência a desenvolver corpos de Lewy [9].

As mutações p.Met239Ile, p.Met239Val, p.Ser130Leu e p.Met239Ile também são

responsáveis pelo aparecimento da DA familiar, levando ao aumento da quantidade do péptido

Aβ42 e, consequentemente, ao aumento da razão Aβ42/Aβ40. As mutações p.Ser130Leu e

p.Met239Ile também alteram a homeostasia do cálcio a nível celular [24].



Leticia de Bastos

247

Os portadores de mutações no gene PSEN2 apresentam uma idade mais tardia para o

aparecimento do início dos sintomas quando comparados com os portadores de mutações no

gene PSEN1, podendo a sintomatologia surgir entre os 39 e os 75 anos [1]. A nível

neuropatológico, observa-se essencialmente a vasta formação de placas neuríticas, acumulação

de emaranhados neurofibrilares e angiopatia amilóide cerebral que pode ser proeminente,

podendo mesmo resultar em acidente vascular cerebral hemorrágico. Quanto aos aspetos

clínicos, apresentam alterações precoces e progressivas na memória e nas funções executivas.

A ocorrência de convulsões verifica-se em cerca de 30% dos indivíduos portadores destas

mutações [6]. A penetrância da doença entre os membros da família também é mais baixa e

variável, pois menos famílias foram relatadas como sendo portadoras de mutações neste gene

e a faixa etária para o aparecimento da doença é muito mais alargada [3,9,14].

Diversos estudos verificaram que mutações ao nível do gene PSEN2 podem estar

associadas a outras patologias, nomeadamente à DA esporádica, assim como à demência

frontotemporal, demência com corpos de Lewy e doença de Parkinson, o que sugere que fatores

ambientais podem ser significativos para o desenvolvimento da doença [27].

Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].


intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: mutações patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:

mutações com patogenicidade pouco clara; Cinza: mutações não patogénicas. •: 2 aspartatos (D) localizada nos domínios

transmembranares (TM) VI (D263) e VII (D366); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de cada domínio

topológico.

Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da DA

(Adaptado de [50]).Figura 8. Variantes PSEN2. Representação da sequência proteica da presenilina 2 [3].


intertransmembranar ou IX domínio transmembranar. Roxo: mutações patogénicas ou possivelmente patogénicas; Laranja:

mutações com patogenicidade pouco clara; Cinza: mutações não patogénicas. •: 2 aspartatos (D) localizada nos domínios

transmembranares (TM) VI (D263) e VII (D366); numeração árabe: indicam o último resíduo de aminoácido de cada domínio

topológico.




2.3. Apolipoproteína E

Em 1991, Pericak-Vance et al. identificaram uma ligação genética entre a DA e uma

região do cromossoma 19 que alberga o gene codificante da apolipoproteína E (ApoE).

Posteriormente, diversos investigadores verificaram que polimorfismos dentro do gene APOE

estavam fortemente associados à doença [9].

O gene APOE, localizado no cromossoma 19q13.2, é um dos maiores fatores de risco

genético associado à DA de início tardio. Esta lipoproteína é a principal transportadora de

colesterol no cérebro, estando também envolvida em diversos outros mecanismos,

nomeadamente, controle da inflamação, metabolismo do colesterol, função sináptica,

neurogénese, depuração, agregação e deposição do péptido Aβ [1], regulação imunológica e

sinalização intracelular [9].

Existem três alelos comuns no gene APOE denominados ε2, ε3 e ε4, e que codificam as

isoformas da proteína. Os polimorfismos situados no exão 4 [19] mostram a associação existente

entre esses três alelos [9]. O alelo ε2 codifica para uma cisteína tanto na posição 112 como na

posição 158, o alelo ε3 codifica uma cisteína na posição 112 e para uma arginina na posição

158, enquanto o alelo ε4 codifica uma arginina, tanto na posição 112 como na 158 [9].

A variante codificada pelo alelo ε2 está associado a uma diminuição do risco da DA,

tendo sido demonstrado o seu efeito protetor [3], pois apresenta uma grande afinidade para o

péptido Aβ, sendo eficiente na sua remoção a partir do meio extracelular [1]. Em contrapartida,

a variante ε4 é a forma de alto risco para a doença, possuindo uma menor afinidade para o

péptido Aβ e portanto sendo menos eficiente na sua remoção do meio extracelular, podendo

mesmo inibir a sua depuração. O alelo ε3 é o que codifica a variante mais comum no ser humano

e é considerado um alelo neutro [1]. A nível populacional, indivíduos que possuem o alelo ε4 da

ApoE desenvolvem DA muito mais cedo do que aqueles que possuem o alelo ε2 [9,19],

observando-se também níveis aumentados da proteína tau [1].

A presença do alelo ε4 da ApoE em heterozigotia aumenta o risco de DA de início

precoce apenas em indivíduos com história familiar; em contrapartida, a presença deste alelo

em homozigotia é suficiente para aumentar significativamente o risco da doença

independentemente de outros fatores genéticos [3].



Leticia de Bastos

249

O mecanismo subjacente entre o genótipo ApoE ε4 e a DA é complexo [1]. O alelo ε4

da ApoE não tem um efeito direto na doença, contudo parece modificar a expressão de outros

fatores genéticos que contribuem para a doença [3].

2.4. Recetor Ligado à Sortilina 1

O recetor ligado a sortilina 1 (SORL 1), codificado pelo gene SORL1 localizado no

cromossoma 11q23.2-q24.2 [1], é uma proteína transmembranar [15] que se encontra altamente

expressa no cérebro [29], estando associada à sinalização intracelular e possui uma atividade

semelhante à chaperone [1,9,15]. Também atua como recetor da ApoE, participando no

metabolismo lipídico, e interage com a proteína tau. No entanto, o seu papel principal prende-

se com o processamento e transporte da proteína APP, impedindo o seu processamento

amiloidogénico [20].

Atualmente existem várias hipóteses que tentam elucidar a relação entre as vias de

processamento da proteína APP e o SORL1; contudo, todo este processo ainda está longe de

estar completamente esclarecido [20], embora existam evidências de que a SORL1 exerce um

papel protetor na DA [15]. Diversos investigadores têm observado níveis diminuídos de SORL1

no LCR de indivíduos com a doença, os quais se correlacionam positivamente com a

acumulação do péptido Aβ [1].

Existe uma forte evidência de que o gene SORL1 está implicado no risco DA [9], tanto

familiar como esporádica, podendo levar à doença pela alteração de qualquer uma das vias

acima mencionadas [20].




3. Em Portugal

Segundo o Instituto Nacional de Estatística, os dados mais recentes existentes em

Portugal sobre a DA são de 2015. Nesse ano observaram-se 1 753 mortes por DA, atingindo

principalmente as mulheres (66%). Para idades inferiores a 55 anos, não se registaram mortes

por esta causa [30].

As mortes provocadas por DA representaram 1,6% da mortalidade no país, observando-

se um maior número de óbitos na Área Metropolitana de Lisboa (29.2%), enquanto na Região

Autónoma dos Açores e Alentejo Litoral se registaram as menores percentagens, 1.3% e 0.7%,

respetivamente [30].

A taxa bruta de mortalidade pela DA, nesse mesmo ano, foi de 16.9 óbitos por 100 000

habitantes. A taxa de mortalidade padronizada para as idades de 65 e mais anos foi de 63.4

óbitos, e de 0.3 para idades inferiores a 65 anos. A idade média de morte foi de 83.7 anos (82.8

para os homens e 84.2 para as mulheres) (Tabela 1) [30].

Tabela 1. Indicadores de mortalidade pela DA em Portugal no ano 2015 (Adaptado de

[30]).

Indicadores de Mortalidade Total Sexo

Masculino

Sexo

Feminino

Idade (anos) média de morte 83.7 82.8 84.2

Proporção de óbitos (% em relação ao total de

óbitos por DA para o total)

1.6 1.1 2.1

Taxa total de mortalidade padronizada por 100000

habitantes

7.2 6.4 7.8

Taxa total de mortalidade padronizada com menos

de 65 anos por 100000 habitantes

0.3 0.3 0.3

Taxa total de mortalidade padronizada com 65

anos e mais anos por 100000 habitantes

63.4 55.8 68.3



Leticia de Bastos

251

4. Diagnóstico

Um diagnóstico preciso é o pré-requisito para a terapia ideal [31]. Os critérios publicados

em 1984, pelo Instituto Nacional de Neurologia e Distúrbios Comunicativos e Acidentes

Vasculares Cerebrais e a Associação de DA e Distúrbios Relacionados (NINCDS-ADRDA, do

inglês National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the

Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association), têm sido bastante bem-sucedidos e

foram utilizados por mais de 27 anos apresentando uma sensibilidade e especificidade de 81%

e 70%, respetivamente [32]. No entanto, quando estes critérios foram enunciados, acreditava-se

que os sintomas clínicos tinham sempre uma correspondência estreita com a patologia

subjacente, de modo que apenas os indivíduos que apresentavam demência tinham

desenvolvido DA, não entrando em linha de conta com o facto dos défices cognitivos evoluírem

gradualmente e de a demência representar o estádio final da doença, podendo surgir ao fim de

muitos anos. Atualmente é sabido que essa correspondência clínico-patológica nem sempre é

consistente, podendo mesmo apresentar manifestações atípicas [33].

Em 2009, o Instituto Nacional de Envelhecimento (INE) e a Associação de Alzheimer

(AA, antigo NINCDS-ADRDA) propuseram uma revisão dos critérios da DA [33] incorporando

inovações no diagnóstico, com grandes avanços na avaliação neuropsicológica, na

neuroimagem e compreensão patológica, bioquímica e genética desta doença [47].

A demência, nomeadamente a demência secundária à fisiopatologia da DA, é

diagnosticada quando existem sintomas cognitivos ou comportamentais (neuropsiquiátricos)

que interfiram com a capacidade de funcionamento no trabalho, nas atividades habituais, ou

quando há um declínio dos níveis anteriores de funcionamento e desempenho, que não seja

explicado pelo delírio ou transtorno psiquiátrico maior [32].

Para ser considerada a existência de comprometimento cognitivo ou comportamental,

tem de se verificar pelo menos dois dos seguintes itens [32]:

Alteração da capacidade de adquirir e lembrar-se de novas informações -

perguntas ou conversas repetitivas, esquecer eventos ou compromissos, perder-se em

rotas familiares;

Alteração do raciocínio e da capacidade de executar tarefas complexas - má

compreensão dos riscos de segurança, incapacidade de gerir finanças, má capacidade




de tomada de decisão, incapacidade de planear atividades complexas ou atividades

sequenciais;

Alteração das capacidades visuoespaciais - incapacidade de reconhecer rostos

ou objetos comuns, incapacidade de fazer coisas simples ou orientar a roupa para usar;

Alteração das funções de linguísticas - dificuldades na fala, leitura e escrita;

Alterações de personalidade ou comportamento - flutuações de humor pouco

características, agitação, apatia, perda de movimentação, retirada social, perda de

interesse por atividades anteriores, comportamentos obsessivos ou compulsivos,

comportamentos socialmente inaceitáveis.

A diferenciação entre demência e comprometimento cognitivo ligeiro (MCI, do inglês

Mild Cognitive Impairment) só pode ser feita por um clínico qualificado, com base nas

circunstâncias individuais do doente e na descrição das tarefas diárias fornecidas pelo doente

ou informante [32].

Para a classificação da DA é proposta a seguinte terminologia: DA provável, DA

possível, DA provável ou possível com evidência do processo fisiopatológico da doença. As

duas primeiras são destinadas ao uso clínico, enquanto a terceira está atualmente destinada para

fins de pesquisa [32].

A DA provável é diagnosticada quando o doente atende aos critérios de demência

descritos anteriormente, apresentando um início insidioso (podendo levar meses a anos) e

história clara de declínio da função cognitiva, podendo ser amnésica (mais comum) ou não. As

alterações não-anamnésica podem ter uma apresentação visuoespacial, em que os défices mais

proeminentes estão na cognição espacial, incluindo agnosia de objetos, reconhecimento de

rostos e alexia, alterações ao nível da linguagem, ou disfunção executiva. Em qualquer uma das

situações, défices noutros domínios podem estar também presentes [32].

A doença é diagnosticada com maior grau de certeza quando acompanhada de mutação

nos genes APP, PSEN1 ou PSEN2 e quando o declínio cognitivo é documentado com avaliações

subsequentes baseadas em informações de familiares e testes cognitivos, no contexto da

avaliação neuropsicológica formal ou exames de estado mental padronizados [32].

O seu diagnóstico não pode ser aplicado quando há evidência de doença cerebrovascular

concomitante, definida pela história de acidente vascular cerebral (AVC) associado

temporariamente ao início ou agravamento do comprometimento cognitivo, presença de



Leticia de Bastos

253

enfartes múltiplos ou extensos, Demência de Corpos de Lewy, Demência Frontotemporal,

afasia progressiva primária, outra doença neurológica ativa, co-morbidade médica não

neurológica ou uso de medicação que possa ter um efeito substancial na cognição [32].

Um diagnóstico de DA possível deve ser feito caso se verifique qualquer das

circunstâncias mencionadas anteriormente, podendo apresentar um decurso atípico, em termos

da natureza dos défices cognitivos para demência da DA. Contudo, verifica-se um

comprometimento cognitivo de inicio súbito, detalhes históricos insuficientes ou documentação

cognitiva objetiva de declínio progressivo. Pode ainda apresentar uma etiologia mista, isto é,

embora se observem os critérios clínicos fundamentais para a DA, também existe evidência de

doença cerebrovascular concomitante [32].

O diagnóstico da DA é feito através da combinação da história clínica do doente, exames

neuropsicológicos, testes cognitivos, neuroimagem estrutural e estudos laboratoriais [32], sendo

essencialmente um diagnóstico de exclusão, permitindo excluir outras causas de demência [35].

O acompanhamento longitudinal também pode ajudar a confirmar o decurso típico de DA [35].

Um diagnóstico definitivo da DA ainda só pode ser feito por neuropatologia, sendo

considerado o gold-standard e baseia-se na deteção post-mortem de lesões patológicas

específicas: placas Aβ no espaço extracelular e vasos sanguíneos, emaranhados neurofibrilares

intracelulares, perda neuronal e sináptica em regiões específicas do cérebro [35,36].

4.1. História Clínica do Doente

A história clínica deve focar-se na doença e na sua relação com eventos

cerebrovasculares concomitantes e outros possíveis fatores de risco de demência, tais como

abuso de álcool, insuficiência renal, hipertensão, diabetes mellitus, tabagismo, antecedentes

familiares de AVC, obesidade e dislipidémia [31,34]. A história familiar de demência,

traumatismos cranianos repetitivos, assim como fatores protetores, como o alto nível de

escolaridade, também devem ser determinados (Tabela 2) [31].




Tabela 2. Fatores que influenciam o risco da DA (Adaptado de [34]).

Antecedentes Efeito na

doença Possível mecanismo

Doença cardiovascular Aumenta Destruição do parênquima e aumento da deposição

do péptido Aβ.

Tabagismo Aumenta Efeitos cerebrovasculares e stress oxidativo.

Hipertensão Aumenta Doença microvascular.

Diabetes mellitus Aumenta Efeitos cerebrovasculares e a insulina e péptido Aβ

competem pela depuração.

Obesidade Aumenta Aumenta o risco de diabetes mellitus.

Lesão traumática na

cabeça

Aumenta Aumento da deposição do péptido Aβ e de proteínas

percursoras amilóides.

Educação Diminui Fornece reserva cognitiva.

Atividades de lazer Diminui Melhora o metabolismo lipídico e estimula a mente.

Dieta mediterrânica Diminui Antioxidante e anti-inflamatória.

Atividade física Diminui Promove a vascularização cerebral.

O clínico também deve prestar atenção aos potenciais sinais de AVC, incluindo

hiperreflexia, reflexo de Babinski, apraxia frontal e paralisia pseudobulbar, pois a doença

cerebrovascular isquémica de pequenos vasos com presença de placas senis e emaranhados

neurofibrilares aumenta o risco de demência em 20 vezes [31].

A maioria dos doentes com doença neuropatológica possui outras patologias, sendo que

apenas uma pequena percentagem apresenta exclusivamente patologia associada à DA [38].

4.2. Entrevista a Informante Informado

A história vinda de um informante informado, podendo ser ou não um membro da

família, é obrigatória na ausência do doente, pois relatos de "comportamentos embaraçosos" ou

deficiências funcionais muitas vezes só serão mencionadas nestas circunstâncias. O

comprometimento funcional deve ser avaliado questionando o informante sobre o desempenho

independente do utente nas suas atividades diárias, como alimentação e higiene. Na demência



Leticia de Bastos

255

precoce, o comprometimento funcional é mais provável que surja em funções mais

diferenciadas, como na gestão financeira, utilização de transportes públicos, direcionamento da

atenção normal para passatempos e aprendizagem do uso de novas máquinas ou aparelhos [31].

4.3. Testes Cognitivos Breves

Os testes cognitivos breves são necessários para auxiliar na confirmação de uma

suspeita de demência e apresentam uma boa correlação com a doença [39]. No entanto, todos

eles têm menor sensibilidade e especificidade do que a avaliação neuropsicológica completa,

mas têm a vantagem de serem muito mais rápidos (5-30minutos) e acessíveis, do que os testes

mais especializados. Consoante o resultado do teste, é dada uma pontuação que será útil para

avaliar o estado de demência [31].

Existem muitos outros testes que permitem avaliar múltiplos domínios cognitivos,

alguns estão representados na Tabela 3 [31].

Tabela 3. Testes Cognitivos Breves, aplicação e respetiva sensibilidade e especificidade

(Adaptado de [39]).

Breves Testes Cognitivos Doença Sensibilidade

(%)

Especificidade

(%)

Addenbrooke’s Cognitive Examination

Revised Demência 84 100

Mini-Cog Demência 76 89

Memory impairment screen DA 80 96

Cognitive Assessment Screening Test Demência 88 100

Mini-Mental State Examination Demência 87 82

Addenbrooke’s Cognitive Examination DA 93 100

Brief Alzheimer Screen DA 96 98

Abbreviated Mental Test Demência 91 75

Seven Minute Screen Test DA 92 96

Short Test of Mental Status Demência 86 92




De uma avaliação para outra, a pontuação obtida pode variar. As barreiras linguísticas,

a idade avançada e a baixa escolaridade também podem confundir os resultados e fornecer

pontuações falsamente positivas [31].

4.4. Investigação Laboratorial

Os testes laboratoriais são necessários para descartar causas de demência tratáveis [35].

Para tal, devem ser realizados testes que permitam excluir causas de encefalopatia metabólica

crónica, anemia, défices de vitamina B12 e ácido fólico, insuficiência renal, hipotiróidismo,

hiponatrémia, hipercalcémia e diabetes. Com base na história clínica do indivíduo, outros

exames laboratoriais podem ser selecionados [31].

4.5. Testes Neuropsicológicos

O teste neuropsicológico fornece uma avaliação detalhada e padronizada numa ampla

gama de domínios cognitivos [32], ajudando a obter sinais objetivos de distúrbios da memória

[35], permitindo a distinção entre MCI e alterações cognitivas subjetivas [40]. O teste

neuropsicológico tem maior sensibilidade e especificidade do que os testes cognitivos breves.

Há evidências de que os testes neuropsicológicos podem contribuir para determinar a

probabilidade de futuras demências nos grupos de risco, tendo ainda utilidade na distinção entre

diferentes tipos de demência [31]. No entanto são mais caros e demorados (2-4h) [31], só devendo

ser realizados quando as avaliações anteriores não fornecerem um diagnóstico preciso [32].

4.6. Testes Genéticos

A presença de mutações genéticas APP, PSEN1 e 2 está na base da fisiopatologia da DA

familiar, levando à produção de péptido Aβ42. Na DA esporádica o principal fator de risco é o

alelo ε4 do gene APOE que está envolvido na diminuição da depuração do péptido Aβ [33].



Leticia de Bastos

257

No entanto, os testes genéticos não podem ser utilizados no diagnóstico definitivo da

DA, pois os valores preditivos positivos e negativos são baixos [31].

4.7. Neuroimagem

A neuroimagem, obtida por Tomografia Computadorizada (TC) e Ressonância

Magnética (RM), ajuda no diagnóstico da DA, excluindo outras causas de demência, como

tumor cerebral, hematoma subdural, doença cerebrovascular, como enfartes cerebrais e lesões

de substância branca [35], e identificam atrofia cerebral pela observação de ventrículos

aumentados e sulcos corticais. No entanto, a sobreposição com o envelhecimento normal e

outras formas de demências limitam seu valor no diagnóstico [38].

Na RM funcional, as anomalias podem ser observadas numa fase pré-clínica da DA,

sendo considerado por alguns autores o primeiro biomarcador a manifestar alterações [41].

Também podem ser realizadas técnicas de imagem molecular, como a Tomografia de

Emissão de Positrões (PET, do inglês Posítron Emission Tomography) e a Tomografia

Computadorizada por Emissão de Fotões Únicos (SPECT, do inglês Single-Photon Emission

Computed Tomography) [38].

A imagem cerebral é uma ferramenta promissora para a deteção precoce da DA,

particularmente graças à sua capacidade de caracterizar a sucessão temporal do envolvimento

anatómico, juntamente com a progressão da doença. Durante anos, a PET foi o único método

utilizado para medir efeitos funcionais indiretos da neurodegeneração da DA [35], recorrendo ao

2-[18F] fluoro-2-Deoxy-D-glucose (FDG), um análogo da glucose, para avaliar a taxa de

metabolismo da glucose, refletindo a atividade neuronal [38]. Atualmente, estão disponíveis

diversos biomarcadores para a PET-amilóide, permitindo visualizar o processo fisiopatológico

da doença in vivo, ao ligar-se às formas fibrilares de Aβ, sendo os mais conhecidos o N-metil-

[11C] 2- (4'-metilaminofenil) -6-hidroxibenzotiazole, também conhecido como composto-B de

Pittsburgh (PIB), 4-N-[11C-metil] amino -4'-hidroxistilbeno (SB13), 2-(1-96-(2-18F-fluoroetil)

(metil) amino) -2-naftil) etildeno) malono nitrilo (FDDNP) e mais recentemente o trans-4- (N-

metil-amino) -4'- {2- [2- (2- [18F] fluoroetoxi) -etoxi] -etoxi} -stilbeno (BAY94-9172) [35]. A

PET-amilóide apresenta alta especificidade para a patologia da DA [35], permitindo avaliar a




densidade das placas neurítica, observando-se uma retenção anómala nos indivíduos com DA

[33].

Na PET-FDG, a DA caracteriza-se por um padrão regional específico com redução do

metabolismo da glucose nas áreas parietotemporais, córtex cingulado posterior e no lobo

temporal médio [38], existindo uma relação entre a extensão das áreas atingidas e a gravidade do

comprometimento cognitivo. Este padrão de hipometabolismo encontra-se em mais de 85% dos

casos de DA confirmados patologicamente [35]. Esta técnica apresenta uma alta sensibilidade

(cerca de 90%) para o diagnóstico precoce, apresentando, no entanto, uma baixa especificidade

71-73% [38]. O aumento da especificidade pode ser conseguido através da combinação com a

PET-amilóides [35].

Relativamente à PET-amilóide, o biomarcador PIB é o mais amplamente utilizado e

melhor caracterizado em termos cinéticos e analíticos. Vários estudos demonstraram que

indivíduos com DA apresentavam uma retenção significativa de PIB ao nível do córtex frontal,

parietotemporal, córtex cingulado posterior, lobos occipitais e tálamo, consistente com o padrão

de deposição de placas Aβ observadas post-mortem. Apesar de fornecer informações espaciais

sobre a localização do péptido Aβ no cérebro, um resultado positivo não é suficiente para o

diagnóstico da doença [33,38], pois uma retenção significativa do PIB é encontrada em mais de

90% dos doentes diagnosticados com DA, mas também em cerca de 60% dos MCI e até 50%

em indivíduos idosos, podendo ser também observada noutros distúrbios neurodegenerativos

[35]. O recurso a esta técnica parece ser adequado para excluir a DA na presença de uma retenção

negativa do PIB [35].

A PET-PIB apresenta uma correlação mais fraca com os sintomas clínicos, quando

comparada com a PET-FDG, o que pode ser justificado pelo facto do PIB não ser específico

para placas Aβ densas. Segundo um estudo publicado, o PIB liga-se a uma família de substratos

amilóides variando de placas difusas a placas no sistema vascular [35].

Em portadores de mutações genéticas autossómicas dominantes associadas à DA

familiar, num estado pré-sintomático, a PET-FDG apresentam um padrão típico de

hipometabolismo e as anomalias foram observadas até 13 anos antes do início dos sintomas em

portadores de mutação APP e PSEN2. Com o PET-PIB, observou-se uma maior carga de

péptido Aβ em indivíduos portadores de mutações PSEN1 e APP em relação aos controles [35].



Leticia de Bastos

259

Atualmente, embora nenhuma destas tecnologias seja recomendada para o diagnóstico

de rotina da DA, podem auxiliar no diagnóstico precoce [31] e ajudar a melhorar a sensibilidade

e a especificidade na discriminação de outras demências neurodegenerativas primárias [35].

Estudos adicionais de validação são necessários antes que a PET possa entrar na prática clínica,

bem como a determinação do seu valor preditivo e o estabelecimento das limitações e vantagens

de ambos os biomarcadores para o diagnóstico precoce da DA [35].

4.8. Outros Biomarcadores

Atualmente, os biomarcadores encontram-se divididos em duas grandes categorias:

podendo ser de acumulação do péptido Aβ, mais dinâmicos antes do aparecimento dos

sintomas, cerca de 10 a 20 anos antes, ou de degeneração neuronal/lesão, mais dinâmicos pouco

antes do aparecimento dos sintomas clínicos, estando a sua progressão intimamente relacionada

com o agravamento dos biomarcadores neurodegenerativos [33].

Os biomarcadores mais amplamente estudados incluem a determinação do péptido Aβ

e da proteína tau no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a PET-PIB. A PET-FDG é considerada

como um biomarcador da disfunção sináptica (geralmente observada na fase sintomática da

DA) [42].

O doseamento do péptido Aβ42 no LCR constitui um biomarcador sensível da

deposição do péptido Aβ no cérebro, encontrando-se os seus níveis geralmente diminuídos em

indivíduos com DA, não se correlacionando com a duração ou gravidade da doença. No entanto,

esta diminuição também foi relatada noutras doenças neurodegenerativas e pouco se sabe sobre

a sua depuração no envelhecimento normal. Um estudo comparou o doseamento do péptido

Aβ42 no LCR com a neuroimagem obtida por PET-PIB e verificou uma forte correlação entre

os resultados obtidos [42].

Relativamente aos biomarcadores de degeneração/lesão neuronal, verifica-se o aumento

dos níveis das proteínas tau total e p-tau, no LCR [33]. Contudo, este aumento não se verifica

apenas na DA, mas também noutras doenças neurodegenerativas [42]. A proteína p-tau apresenta

maior especificidade para DA [32], pelo facto de existirem vários epitopos fosforilados que

podem ser eficazes no diagnóstico diferencial [42].




A diminuição dos níveis do péptido Aβ42 e níveis aumentados de proteína p-tau são

atualmente os biomarcadores químicos mais precisos e reprodutíveis para a DA de início

precoce [31,36]. As proporções da proteína tau/Aβ42 e p-tau/Aβ42 no LCR em indivíduos com

cognição normal predizem fortemente a progressão para o estado clínico de DA. Um estudo

seguiu durante 3-4 anos indivíduos com proporções elevadas de tau/Aβ42 e 70%

desenvolveram a DA [42].

Em pessoas que atendem aos critérios clínicos centrais para DA provável, a utilização

de biomarcadores pode aumentar o grau de certeza do diagnóstico. Para o diagnóstico de DA

possível em pessoas que atendem critérios clínicos para uma demência não-DA, mas que

apresentam evidência de biomarcadores para o processo fisiopatológico de DA ou que cumprem

os critérios neuropatológicos da doença, não exclui a possibilidade de que uma segunda

condição fisiopatológica também esteja presente [32].

Uma observação sequencial de eventos relacionados com os processos fisiopatológicos

da doença é fundamental para a caraterização da situação clínica do doente, implicando uma

classificação hierárquica dos biomarcadores. São necessários mais estudos para priorizar os

biomarcadores e determinar o seu valor e validade na prática [32].



Leticia de Bastos

261

5. Hipóteses Terapêuticas

A terapêutica está direcionada para a melhoria e alívio dos sintomas, sendo baseada em

inibidores da acetilcolinesterase e antagonistas do glutamato. Tratamentos baseados na

etiologia ainda estão em estudo [43].

5.1. Tratamento Sintomático

5.1.1. Inibidores da Acetilcolinesterase

O aumento da produção do péptido Aβ reduz a eficácia da transmissão colinérgica do

cérebro [43]. Assim, o tratamento efetuado com inibidores da enzima acetilcolinesterase, como

é o caso da Rivastigmina, Donepezil e Galantamina, promove níveis mais elevados de

acetilcolina (neurotransmissor que desempenha um papel crucial na aprendizagem e memória),

ao inibirem a acetilcolinesterase e a butirolcolinesterase (enzimas responsáveis pela hidrólise

da acetilcolina), melhorando a função colinérgica do cérebro [44]. Embora estes fármacos não

exibam diferenças notáveis na sua eficácia clínica, possuem diferentes mecanismos de atuação,

dependendo da especificidade para o alvo proteico [45].

Na maioria dos estudos, as melhoras encontradas são frequentemente subtis e, por vezes,

simplesmente consistem na estabilização temporária, ou num desenvolvimento mais lento da

patologia quando comparado com doentes não tratados [44].

De um modo geral, os inibidores da acetilcolinesterase são bem tolerados e os efeitos

adversos são leves, sendo principalmente gastrointestinais [43,44].

5.1.2. Antagonista do Recetor N-Metil-D-Aspartato

A excitotoxicidade mediada pelo glutamato é conhecida por levar à sobrecarga de

cálcio, disfunção mitocondrial e aumento da produção de oxidantes que levam à apoptose de

neurónios. Esta super-estimulação pode ser bloqueada por antagonistas do recetor do N-Metil-

D-Aspartato (NMDA) [43]. A Memantina possui um mecanismo que permite proteger os




neurónios da excitotoxicidade causada pela estimulação excessiva do glutamato, bem como da

sobre-ativação direta ou indireta dos recetores NMDA [45], sendo recomendada para o

tratamento da DA moderada a grave; pode ser administrada sozinha ou combinada com um

inibidor da acetilcolinesterase, embora existam poucas alterações significativas favoráveis

resultantes da terapia combinada [43].

A Memantina bloqueia o canal recetor do NMDA na presença de uma estimulação

prolongada de intensidade moderada pelo glutamato (o que se verifica em condições

patológicas); no entanto, na presença concentrações elevadas, mas transitórias, deste

aminoácido (na chegada de um sinal fisiológico), a Memantina dissocia-se do recetor e

prossegue a neurotransmissão. Assim, este fármaco reduz o "ruído de fundo", o que leva a uma

reversão das deficiências de aprendizagem induzidas pela sobre-ativação dos recetores de

NMDA [45].

De acordo com alguns autores, o péptido Aβ também pode estimular os recetores

NMDA, quer como agonista, quer como resultado de interações secundárias com outras

proteínas [45].

Foram relatados efeitos significativos da Memantina em funções cognitivas específicas

de utentes com DA moderada a grave, incluindo linguagem, memória e praxis. Por outro lado,

existe falta de evidências para o tratamento da DA leve a moderada [44].

De um modo geral, a Memantina é bem tolerada e os efeitos colaterais geralmente são

leves e de baixa incidência, sendo a tontura o mais comum [44].

Em estudo encontram-se outros sistemas de neurotransmissores envolvidos na memória

e cognição, que podem ser utilizados para possíveis tratamentos da DA ao melhorar a

neurotransmissão [43].

5.2. Tratamento Baseado na Etiologia

Os ensaios clínicos para novos fármacos para o tratamento do DA enfrentam pelo menos

dois grandes desafios. O primeiro está relacionado com a capacidade destes novos

medicamentos atacarem os processos que estão na base da doença, sendo provavelmente mais



Leticia de Bastos

263

eficazes em estádios iniciais, e o segundo prende-se com a possibilidade de retardarem o

processo degenerativo [46].

Existem três processos patológicos fundamentais que se pensa estarem envolvidos na

DA e sobre os quais irá incidir a terapêutica: a cascata amilóide, a hiperfosforilação da proteína

tau e a ativação da micróglia com neuroinflamação. Alguns biomarcadores permitem a deteção

e monitorização da terapêutica (Figura 9) [46].

Figura 9. Resumo dos principais alvos dos fármacos na DA e como monitorizar a terapêutica [46].

Os inibidores da β-secretase devem reduzir os níveis das isoformas Aβ no LCR. Os inibidores da γ-secretase reduzem os

péptidos Aβ40 e Aβ42 no LCR e no plasma, aumentando os péptidos Aβ14/15/16 e 37 no LCR. Tanto a imunoterapia Aβ como

os agentes anti-agregação podem ser monitorizados pela determinação dos níveis Aβ40 e Aβ42, no LCR. A degradação dos

péptidos Aβ induzida pela terapêutica pode ser monitorada pelo doseamento dos diferentes péptidos Aβ, no LCR, dependendo

da via proteolítica utilizada para a degradação. O efluxo do péptido Aβ para o sangue pode ser monitorizado pela sua

determinação no LCR e plasma. Os marcadores inflamatórios, tanto no plasma como no LCR, bem como os marcadores da

atividade da microglia podem mudar em resposta à terapêutica direcionada. O tratamento com inibidores da hiperfosforilação

da proteína tau podem ser monitorizados através do doseamento da proteína p-tau no LCR. Efeitos da degeneração axonal

poderiam ser monitorizados com o doseamento da proteína tau total.




5.2.1. Inibidores das Secretases

Desde o reconhecimento do seu papel central no processamento da proteína APP, as

secretases foram identificadas como um possível alvo para a terapêutica da DA [47]. Os

inibidores das secretases devem prevenir a acumulação do péptido Aβ no cérebro [46].

A regulação da atividade da α-secretase com Gemfibrozil ou com Melatonina, previne

a formação do péptido Aβ, por estimulação do processamento não-amiloidogénico da APP [43].

Inibidores da BACE1 também foram propostos; no entanto, poucos compostos

chegaram a ensaios clínicos. Os mais promissores foram os modelos NCT01739348 (ensaios

clínicos de fase II) e NCT02245737 (ensaios clínicos de fase III) [43].

Houve muitos estudos com inibidores da γ-secretase, no entanto, como induziam muitos

efeitos secundários, nomeadamente alterações gastrointestinais e o aumento do risco de cancro

da pele, pois um dos seus substratos é a proteína Notch [43].

5.2.2. Imunoterapia Aβ

A imunização ativa e passiva tem sido utilizada em ensaios para o tratamento da DA [48]

e para a prevenção da formação de placas senis [43]; no entanto, a imunização ativa tem

apresentado muitos efeitos colaterais [48]. As imunoterapias atualmente utilizadas em ensaios

clínicos foram descritas em detalhes por Goure e seus colaboradores (2014) [48].

As imunoterapias dependem da alta seletividade dos anticorpos para um determinado

antigénio-alvo relacionado com a doença. No entanto, todas as imunoterapias direcionadas

contra o péptido Aβ, que se encontram em desenvolvimento clínico, são baseadas em anticorpos

não seletivos que se ligam a múltiplas espécies do péptido Aβ, reduzindo os seus níveis totais

para baixo do limiar tóxico. No entanto, no caso dos doentes com toxicidade sináptica aguda,

se a terapia com anticorpos anti-Aβ tiver afinidade seletiva para as formas oligoméricas solúveis

poderia proporcionar mais benefícios terapêuticos [49].

Existem diversas terapêuticas relevantes em estudo, com diversos anticorpos

monoclonais viáveis contra o péptido Aβ (Tabela 4) [49].



Leticia de Bastos

265

Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o

péptido Aβ (Adaptado de [49]).

Anticorpos Aβ Afinidade do

Anticorpo Observações

Solanezumab/

266

Liga-se a formas

monoméricas e

oligoméricas do

péptido Aβ.

Com o tratamento repetido verificaram um

abrandamento do declínio cognitivo em cerca

de 34% dos doentes com DA leve, apoiando a

hipótese que a terapia pode ser mais eficaz

quando aplicada em estágios iniciais da doença

ou antes do aparecimento dos sintomas visíveis

[48].

Bapineuzumab/

3D6

Liga-se de forma não

seletiva mas com

afinidade semelhantes

a monómeros,

oligómeros e formas

fibrilares do péptido

Aβ.

Liga-se as placas de amilóide vascular e placas

Aβ em cérebros de ratos transgênicos com

mutação APP e humanos com DA, removendo-

as.

Ponezumab/

2H6

Liga-se de formas não

seletiva a formas

monoméricas,

oligoméricas e


Aβ40.

Após a injeção intracraniana de ratos

transgénicos, com 20 meses, na análise

histológica verificaram uma redução

significativa da placa amilóide no hipocampo e

córtex frontal, comparando com os tecidos

controlo.

BAN2401/

mAb158

Liga-se a agregados

de péptido Aβ de

maior peso molecular

com alta afinidade,

incluindo formas

oligoméricas e

fibrilares e ligações de

baixa afinidade com .

Após injeção intracraniana num modelo de

ratos transgénicos com mutação APP

verificaram uma redução significativa na placa

amilóide em 72H. Contudo, noutro estudo

realizado com ratos transgénicos com a mesma

mutação, após 4 meses de injeções semanais

intraperitoneais houve uma redução

significativa de formas protofibrilares de Aβ




Tabela 4. Algumas terapêuticas que recorrem a anticorpos monoclonais contra o

péptido Aβ (Adaptado de [49]). Continuação.

formas monoméricas. (74%), mas não ocorreu uma redução

significativa dos níveis totais de péptido Aβ no

córtex cerebral ou hipocampo. As diferenças

podem dever-se ao modo de administração.

Gantenerumab

Ligação não seletiva,

com alta afinidade

para formas

oligoméricas e


Aβ e com um menor

grau de afinidade para

formas monoméricas.

Levou a uma redução significativa, dose-

dependente, das placas amilóides em humanos

com DA.

Um estudo de tratamento de 5 a 6 meses em

ratos transgénicos com doença crónica, levou a

uma redução significativa das pequenas placas

pré-existentes, no entanto, houve um aumento

das placas maiores, o que sugeriu que este

fármaco causa uma redistribuição do péptido

Aβ, desagregando placas menores e menos

maduras.

5.2.3. Inibidores da Agregação do Péptido Aβ

Entre os inibidores da agregação do péptido Aβ que se encontram em ensaios clínicos,

foram utilizados Tramiprosato (ensaios clínicos de fase III), Clioquinol, Scylloinositol (ambos

em ensaios clínicos de fase II) e Epigallocatechin-3-galatte (ensaios clínicos de fase II/III) que,

embora tenham levado à estabilização dos monómeros Aβ, têm demonstrado efeitos colaterais

importantes [43].

5.2.4. Inibidores da Fosforilação da Proteína Tau

A proteína tau é expressa essencialmente ao nível dos neurónios e desempenha um papel

importante na manutenção da estrutura e estabilidade dos microtúbulos, bem como no



Leticia de Bastos

267

transporte intracelular de proteínas motoras. Em condições fisiológicas normais, o equilíbrio

entre a fosforilação e desfosforilação da proteína tau coordena a adesão dos microtúbulos, sendo

que quando hiperfosforilada a capacidade de ligação aos microtúbulos diminui, resultando num

aumento anómalo da proteína tau livre, aumentando a probabilidade de formação de oligómeros

e agregados. A fosforilação da proteína tau é dependente da atividade das proteínas cinases e

fosfatases, sendo que a inibição das cinases e a ativação das fosfatases representam possíveis

alvos terapêuticos para o tratamento da DA [41].

A glicogénio sintase cinase 3 (GSK-3) e a cinase dependente de ciclina 5 (CDK5) foram

considerados os melhores alvos terapêuticos, pois encontram-se envolvidos na fosforilação da

proteína tau, num grande número de locais, e apresentam uma elevada expressão no cérebro

[41].

O Tideglusib, um inibidor irreversível da GSK-3β [43], foi administrado em ratos

transgénicos que co-expressavam mutantes humanos APP e tau, resultando numa diminuição

de fosforilação da proteína tau, bem como na diminuição da deposição de péptido Aβ,

prevenindo a morte celular [41]. No entanto, em ensaios posteriores verificou-se que os

benefícios observados não eram estatisticamente significativos [43].

Embora outras proteínas cinases estejam em estudo, ainda nenhuma entrou em ensaios

clínicos, pois o desenvolvimento de inibidores específicos para as cinases envolvidas na

fosforilação da proteína tau tem sido um desafio. Estas enzimas possuem múltiplos substratos,

e a inibição de outros substratos, que não os desejados, pode causar efeitos colaterais [41].

A desfosforilação da proteína tau é regulada pela fosfoproteína fosfatase 2A (PP2A) que

está envolvida na transdução de múltiplos sinais que mantêm a homeostasia celular; no entanto,

a ativação indiscriminada da PP2A é suscetível de levar a muitos efeitos colaterais indesejáveis.

A desfosforilação da proteína tau induzida pelo selenato de sódio é dependente da PP2A e levou

à redução da fosforilação de proteína tau em ratos reduzindo a insolubilidade bem como os

défices comportamentais, além de evitar a perda neuronal [41].

A Memantina, um antagonista do recetor NMDA, possui a capacidade de atenuar a

fosforilação da proteína tau através da diminuição da atividade da GSK-3β [43] e de melhorar a

função da PP2A, de forma indireta [41]. Tratamentos com este fármaco, durante 1 ano, revelaram

uma diminuição significativa no nível de proteína p-tau no LCR em indivíduos com DA [41].




5.2.5. Inibidores da Agregação da Proteína Tau

Várias moléculas mostraram ser bons inibidores da agregação da proteína tau. O

Leucometiltionínio (ensaios clínicos de fase III) e o Cloreto de Metiltionínio (ensaio clínico de

fase II) demonstraram reduzir a agregação de proteína tau e reverter défices em modelos de

ratos transgénicos e retardar a progressão da doença em indivíduos com DA. No entanto, os

mecanismos exatos dos efeitos neuroprotetores in vivo ainda não estão completamente

esclarecidos [43].

Outros inibidores promissores da agregação da proteína tau são N-Fenilaminas,

Antraquinonas, Rodaninas, Benzotiazoles e Fenotiazinas [43].



Leticia de Bastos

269

6. No futuro…

Para o diagnóstico precoce da DA é necessária a existência de um método que tenha alta

sensibilidade e especificidade. Recentemente, os micro-RNAs (miRNAs) emergiram como uma

nova classe de elementos reguladores da expressão de genes que desempenha um papel

importante no cérebro, estando envolvidos no desenvolvimento e diferenciação neuronal [50].

Os miRNAs são pequenos RNAs endógenos conservados, não codificantes, que

modulam a expressão de genes ao nível da pós-transcrição [51].

Vários estudos têm demonstrado que uma expressão alterada de miRNAs em indivíduos

com DA pode ser responsável pela expressão de genes relacionados com a doença e

subsequentes manifestações fenotípicas. Um único miRNA pode atingir centenas de genes.

Assim, pequenas alterações na sua expressão podem afetar múltiplas vias de sinalização

envolvidas em diversas funções fisiológicas celulares [50].

Os miRNAs também são considerados potenciais biomarcadores precoces da DA e

miRNAs específicos podem facilitar a distinção e identificação de diferentes processos

neurodegenerativos, bem como a sua monitorização [50]. Os seus níveis podem ser facilmente

detetados por técnicas de biologia molecular, no LCR e no sangue [38], sendo transportados nos

fluídos biológicos em exossomas, lipoproteínas de alta densidade e outras proteínas que os

protegem da degradação [51].

Numerosos estudos foram realizados nos últimos anos que levaram à identificação de

mais de 50 miRNAs, que podem estar associados à DA [38].

Em 2007, Schipper et al. relataram a expressão aumentada de 9 miRNAs no sangue

periférico de indivíduos com DA, ao nível das células mononucleares. Mais tarde, Cogswell et

al. (2008) examinaram LCR post-mortem e verificaram alterações na expressão de 60 miRNAs

em indivíduos com DA comparando com os controlos normais. No entanto, no LCR livre de

células, ante-mortem, a maioria dos miRNAs selecionados foram praticamente indetectáveis,

produzindo resultado altamente variáveis quando comparado com estudos anteriores [50].

Em 2012, Geekiyanage et al. descobriram que o miR-137, o miR-181c, o miR-9 e o

miR-29 apresentavam valores diminuídos no soro de indivíduos com a doença [50]. O miR-29




encontra-se associado à BACE1 e a diminuição da sua expressão está associada a um aumento

concomitante de enzima e, portanto, a níveis elevados de péptido Aβ [38].

Posteriormente, em 2014, Tan et al. identificaram o miR-342-3p como um potencial

biomarcador sérico com sensibilidade e especificidade de 81,5% e 70,1%, respetivamente; no

entanto, mais estudos serão necessários, bem como a validação desses resultados [50].

Vários outros miRNAs estão associados à DA, podendo estar envolvidos na fosforilação

da proteína tau, diferenciação neuronal, processamento de APP, neuroinflamação e ciclo celular

(Tabela 5) [38].

A potencial desvantagem da deteção destes biomarcadores no LCR é a possível

contaminação da amostra com sangue, devido a punções traumáticas, na medida em que seus

níveis estão fortemente correlacionados com o número de células sanguíneas presentes na

amostra [38].

O estudo dos miRNA também se mostrou útil na terapêutica da DA, sendo mais evidente

nas formas hereditárias do que em distúrbios esporádicos. Em indivíduos com DA, o

silenciamento da via amiloidogénica, recorrendo a pequenos RNA interferentes (iRNAs, do

Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da

DA (Adaptado de [50]).

Tabela 5. Revisão sistemática dos miRNA, com a desregulação ligada à patogénese da

DA (Adaptado de [50]).



Leticia de Bastos

271

inglês, interfering RNAs) levou a melhorias fenotípicas. O principal desafio desta terapia é o

fornecimento de iRNAs aos neurónios apropriados e esta questão pode ser superada pelo

desenvolvimento de plasmídeos com expressão melhorada, mas a segurança da sua utilização

a longo prazo permanece incerta. Estudos in vivo usando modelos animais com DA pode

fornecer a respostas a essas questões [38].

Os resultados obtidos por diversos investigadores são promissores e sugerem que os

miRNAs e as tecnologias baseadas em iRNA podem abrir novos caminhos para o tratamento

da DA [38].




7. Materiais e Métodos

O presente estudo consiste numa revisão da literatura de trabalhos científicos que

estudaram a DA, nomeadamente a forma familiar, bem como a forma de diagnóstico precoce

da doença e possíveis opções terapêuticas existentes e em estudo. A pesquisa de artigos

realizou-se entre janeiro e dezembro de 2017, essencialmente na base de dados da PUBMED.

Como estratégia apenas se procurou artigos com menos de 10 anos, e preferencialmente com

menos de 5 anos, e as palavras chave utilizadas foram: “alzheimer’s disease”; “EOAD” (do

inglês, early onset alzheimer's diseases); “diagnostic alzheimer’s disease”; “criteria for the

diagnosis of alzheimer’s disease”; “treatment alzheimer’s disease”.

Também foi consultado o site do instituto nacional de estatística a fim de se obter dados

relativos à DA em Portugal e no motor de busca Google, na secção das imagens, pesquisou-se

“placa amilóide” para se obter uma ilustração da doença.



Leticia de Bastos

273

8. Discussão e Conclusão

Embora tenham sido feitos progressos na identificação de genes associados à DA, as

causas ainda não são totalmente compreendidas. A DA familiar de início precoce é rara e tem

origem essencialmente em mutações de transmissão autossómica dominante nos genes PSEN1,

PSEN2 e APP, que levam ao aumento do péptido Aβ42 associado à perda de função e morte

neuronal. O principal determinante genético da DA de início tardio foi identificado como sendo

o alelo ε4 da APOE, que aumenta o risco global de desenvolver a doença em 5-20%. Estas

descobertas sustentam a "hipótese da cascata amilóide", em que o processamento incorreto da

proteína APP ou a redução da eficácia da depuração do péptido Aβ42 pelo alelo ε4 da APOE

são os principais eventos responsáveis pelo desencadear da cascata que levam à DA [38]. Apesar

do papel fulcral do péptido Aβ na DA, o processo é multifacetado [3]. À luz dos achados

recentes, o péptido Aβ não é o principal promotor da degeneração neuronal, mas sim os

oligómeros Aβ é que conferem a neurotoxicidade, interrompendo as vias de sinalização nervosa

[35].

O diagnóstico precoce e preciso da DA é crucial para que seja feita uma intervenção

terapêutica precoce e retardar da progressão da doença [51]. Contudo, é complicado pois apenas

alguns doentes apresentam patologia exclusivamente associada à DA [38].

Os biomarcadores começam a ser integrados em critérios diagnósticos para DA, com o

objetivo de se passar de uma abordagem de diagnóstico diferencial de exclusão para um

diagnóstico positivo. Permitindo um diagnóstico mais precoce e preciso do que a avaliação

clínica tradicional, no entanto, o uso de um teste de diagnóstico com desempenho fraco ou

validade insuficiente pode levar a falsos resultados e, portanto, os médicos devem estar

conscientes das implicações clínicas e éticas do uso dos biomarcadores [40]. Embora tenha

havido progressos, ainda não existe um biomarcador ideal [31,36] e a combinação de

biomarcadores apenas tem sido útil para melhorar a precisão do diagnóstico [40]. É muito

importante que os biomarcadores capturem não só a extensão da patologia como os seus efeitos

sobre a função cerebral e, portanto, a cognição [35]. No entanto, estudos adicionais serão

necessários para determinar o valor de cada biomarcador e a sua validade na prática clínica [32].

Quanto à terapia, atualmente está direcionada para a melhoria e alívio dos sintomas; no

entanto, tratamentos baseados na etiologia encontram-se em estudo [43]. A falta de eficácia




observada nas imunoterapias Aβ não é inesperada, devido à falta de seletividade dos anticorpos

[49]. Alguns autores defendem que terapias direcionadas para a diminuição do péptido Aβ podem

exercer efeitos apenas nos estados iniciais da DA, e que depois do declínio cognitivo surgir,

podem ser necessárias terapêuticas mais direcionadas para a proteína tau, a fim de modificar o

decurso natural da doença [41].

Recentemente, encontraram-se evidências de que os miRNA desempenham um papel

crítico no envelhecimento e desenvolvimento neuronal, estando também associados à

neurodegeneração, e à patogénese da DA, tanto de origem genética como esporádica, sendo

considerados importantes na regulação da expressão génica e por isso poderem vir a ser

considerados possíveis biomarcadores úteis para o diagnóstico precoce da doença, bem como

em tratamentos futuros. No entanto, estudos adicionais deverão ser realizados, pois os

resultados ainda não são consistentes, sendo necessário esclarecer melhor a interação

fisiopatológica dos miRNAs com as proteínas relacionadas com a DA [38,50].

No futuro, estudos de comparação/combinação de biomarcadores e uma validação mais

completa dos resultados com estudos post-mortem serão necessários, bem como a padronização

de biomarcadores antes de serem recomendados para o diagnóstico com um amplo consenso

sobre a sua interpretação. Relativamente ao tratamento baseado na etiologia, mais estudos

deverão ser feitos, nomeadamente acerca dos possíveis efeitos adversos a longo prazo.



Leticia de Bastos

275

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ANEXOS

Leticia de Bastos


2018


Anexos

Leticia de Bastos

283

Anexo I

Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do

Hospital de Cascais.

Equipamento

CQI Parâmetros

controlados Periodicidade

Au

tion

Max,

da A

.

Men

ari

ni

Dia

gn

ost

ics

Nível normal e

patológico

Cor, densidade, pH,

leucócitos, bilirribina,

urobilinogénio, corpos

cetónicos, sangue, nitritos,

glucose e proteínas.

Diariamente, no inicio do

turno da manhã

Dim

ensi

on

® E

XL

TM

wit

h L

M, d

a S

iem

ens

Liquid Assayed

Multiqual

(Níveis 1,2 e 3)

Ferro, ferritina, ureia,

creatinina, ácido úrico,

amílase, lípase,

transaminase, gama-glutamil

transferase, fosfatase

alcalina, bilirrubinas,

glucose, HDL, triglicéridos,

colesterol, ionograma,

proteínas totais, albumina,

desidrogenase láctica,

creatina cinase, fosforo,

magnésio, cálcio e drogas

terapeuticas*

O equipamento da rotina

é controlado 1 vez por

dia pelo tuno da manhã e

apenas nos dias úteis. O

da urgência é controlado

todos os dias, 2 vezes por

dia, no inicio do turno da

manhã e passado 12h.

Cardiac Markers Plus

Control LT

(Níveis 1,2 e 3)

Mioglobina, troponina I,

isoenzima MB da Creatina

Cinase, N-terminal pro-

péptido natriurético cerebral

Liquichek

Immunology Control

(Níveis 1,2 e 3)

PCR e transferrina

Immunoassay Quality

Controls*

(Níveis 1,2 e 3)

Vancomicina e β-HCG Diarriamente,1 vez por

dia pelo turno da manhã.


Anexos


Tabela 15. Plano CQI da secção de Bioquímica do Serviço de Patologia Clínica do

Hospital de Cascais. Continuação.

Urine chemistry

Quality Controls*

(Níveis 1 e 2)

Ionograma, cálcio

Microproteinas, albumina,

ureia, creatinina, magnésio,

fosforo, glucose, ácido úrico

e amílase.

Nos dias uteis, passar

controlos 1 vez por dia

pelo turno da manhã.

Fins de semana e

feriados se houver

pedidos.

LiquichekTM

Spinal Fluid Quality

Control*

(Níveis 1 e 2)

Microproteínas e glucose Apenas quando há

pedido.

LiquichekTM

Ethanol/Ammonia

Control*

(Níveis 1 e 2)

Etanol e amónia Apenas quando há

pedido.

Drogas de abuso

positivas e Drogas de

abuso negativas*

Drogas de abuso Apenas quando há

pedido

*Paramentros apenas doseados no equipamento da urgência.


Anexos

Leticia de Bastos

285

Anexo II

Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do

Hospital de Tomar.

Equipamento CQI Parâmetros

controlados Periodicidade

Sysm

ex X

N-

1000

TM

XN CHECKTM

(Níveis 1, 2 e 3)

Hemogramas

Diariamente no início do turno

da manhã

XN CHECKTM BF

(Níveis 1 e 2)

Líquidos biológicos Quanto há pedido

Ali

fax

Tes

t 1

TH

L Latex Test Tube

(Níveis 1, 2 e 3)

VS 1 vez por semana à quinta-

feira

ST

A C

om

pact

Max

®

System Control

(Níveis 1e 2)

TP, aPTT, INR


da manhã

Fibrinogénio

Só quando há pedido

Coagulação especial

Controlo TT (Nível 1) +

Nível normal do System

Control

TT

Control LA

(Níveis 1 e 2)

Anticoagulante Lúpico

Liatest Control

(Nível normal e

patológico)

D-Dímeros


da manhã

Ark

ray

Ad

am

s A

1c

HA

-81

60, d

a

A. M

enari

ni

Dia

gn

ost

ics 2 níveis de controlo HbA e HbF No inicio do turno:

2ª, 4ª e 6ªf.

Eurotrol

2 níveis

Doseamento de Hb Só quando há pedido


Anexos


Tabela 16. Plano CQI da secção de Hematologia do Serviço de Patologia Clínica do

Hospital de Tomar. Continuação.

HYDRASYS,

da Sebia

Hb AFCS

HbA2

Eletroforese das

hemoglobinas Só quando há pedido

VS: velocidade de sedimentação; TP: tempo de protrombina; aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada; TT: tempo de

trombina; Hb: hemoglobina.


Anexos

Leticia de Bastos

287

Anexo III

A) Manipulação das estirpes ATCC:

*Só quando não houver culturas de armazenamento.

B) Calendário do CQI da Microbiologia

Tabela 17. Estirpes bacterianas disponíveis manipuladas semanalmente segundo a

ordem estabelecida, e respetivo teste de identificação e TSA executados no equipamento

automático.

Estirpes Bacterianas Cartas Vitek®2

Enterococcus faecalis

ATCC29212

Carta GP

TSA para Enterococcus

Escherichia coli

ATCC25922

Carta GN

TSA para Enterobactérias

Streptococcus pneumoniae

ATCC49619

Carta GP

TSA para S. pneumoniae

TSA para Streptococcus spp.

Staphylococcus aureus

ATCC29213

Carta GP

TSA para Staphylococcus spp.

Pseudomonas aeruginosa

ATCC27853

Carta GN

TSA para Pseudomonas

ATCC: American Type Culture Collection; TSA: teste de suscetibilidade aos antimicrobianos; GP: Gram positivo; GN: Gram

negativo.

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Cultura de

armazenamento

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Estirpe ATCC

nova*

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Passagem da

cultura de

trabalho

Equipamento

Equipamento

Equipamento

Equipamento

Equipamento

Equipamento

Equipamento

Equipamento

1º dia

1º dia

1º dia

1º dia

1º dia

1º dia

1º dia

1º dia

2º dia

2º dia

2º dia

2º dia

2º dia

2º dia

2º dia

2º dia

3º dia

3º dia

3º dia

3º dia

3º dia

3º dia

3º dia

3º dia


Anexos


Anexo IV

A) Planos de Controlo de AEQ em que o Serviço de Patologia Clínca do Hospital

de Cascais participa:

Sociedade Espanhola de Química Clínica (SEQC): Química Clínica para

sangue e urina e drogas na urina;

RIQAS: etanol/amónia, marcadores cardíacos, gases no sangue e

Coagulação;

Asociación Española de Hematología y Hemoterapia: Hematologia;

Programa de Garantia de la Calidad para Laboratórios Clínicos:

Microbiologia;

UKNEQAS: Microbiologia.

B) Planos de Controlo de AEQ em que o Serviço de Patologia Clínca do C.H.M.T

participa:

RIQAS: Coagulação, Hematologia, hemoglobina glicada, Química

Clínica, imunoensaio, gases no sangue, marcadores cardíacos,

etanol/amónia, grupo TORCH, anticorpos EBV, líquido

cefalorraquidiano;

Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA): eletroforese

das proteínas, hemoglobinopatias, morfologias de sangue periférico,

velocidade de sedimentação, reticulócitos, imunologia (proteínas

específicas), urina químicas quantitativa, alergologia, morfologia

parasitária.

UKNEQAS: Microbiologia.

http://www.sehh.es/


Anexos

Leticia de Bastos

289

Anexo V

Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL (Adaptado de [90]).

Método Unidades Valores de alerta dos índices

“H” “I” “L”

Ácido úrico mg/dL 0 0 4ª

Ácido valpróico µg/mL 0 0 0

Albumina g/dL 0 0 5a

ALP U/L 6ª 5 4ª

ALT U/L 6ª 0 4ª

Amónia µg/dL 2b 4ª 3ª,b,c

Amilase U/L 6 0 6ª

AST U/L 3 4 4

CK U/L 3 0 0

CKMB U/L 2b 3b 3b

Cloro mmol/L 6 0 6

Colesterol mg/dL 6 3 5ª

Creatinina mg/dL 0 5 4ª

Bilirrubina direta mg/dL 2b n.a 3

Bilirrubina total mg/dL 0 n.a 4

Digoxina ng/mL 0 0 6ª

Etanol mg/dL 0 0 0

Ferritina ng/dL 0 6 0

Gentamicina µg/mL 0 0 6ª

GGT U/L 5ª 5 3

Glucose mg/dL 5 4 3

HCG mIU/mL 0 6 0

HDL mg/dL 0 0 0

Fenitoína µg/mL 0 0 5ª

Fenobarbital µg/mL 0 0 4

Ferro µg/dL 3 0 0


Anexos


Tabela 18. Valores de alerta do indice HIL (Adaptado de [90]). Continuação.

Fosforo mg/dL 3 3 4

LDH U/L 2b 6 6ª

Lipase U/L 0 0 0

Magnésio mg/dL 4 5 6

Mioglobina ng/mL 0 6 6

NTP ng/mL 0 6 0

PCR mg/dL 6 5 6

Potássio mmol/L 2b 0 6

Proteínas totais g/dL 5 3 4ª

Sódio mmol/L 6 0 6

Teofilina µg/mL 0 0 6ª

Transferrina mg/dL 0 0 5ª

Triglicéridos mg/dL 5 3 D

Troponina ng/mL 6 5 0

Ureia mg/dL 0 0 4

Vancomicina µg/mL 0 0 3ª

n.a: não aplicado; a: acima deste nível a Siemens não pode determinar interferência real, surgindo a mensagem de relatório de

teste de "reação anormal"; b: resultados demonstraram interferências significativas; c: não determinar a amónia em amostras

com este índice de lipémia; d: devido ao método utilizado e ao teste em si não foi possível determinar a interferência.


Anexos

Leticia de Bastos

291

Anexo VI

Figura 36. Representação esquemática da hematopoiese [180].