6.8 Metodologia do LAPETOX (Laboratório de Pesquisas

Toxicológicas): [49]

A metodologia utilizada no Laboratório de Pesquisas Toxicológicas é baseada

na metodologia de Meyer et al.

Obtenção de matanáuplios de Artemia salina L. / Incubação:

Colocar cerca de 20 mg de cisto de Artemia salina L. em um estudo

dos lados da incubadora;

Cobrir esse mesmo lado da incubadora com papel de alumínio;

Deixar o sistema sob luz artificial por 48 horas para que haja a

eclosão das larvas (metanáuplios).

Dissolução da substancia em estudo:

Pesar 50 mg da substancia em um vidro de penicilina;

Adicionar 2 gotas de Cremophor. Com a extremidade plana de uma

espátula metálica homogeneizar a mistura;

Adicionar à mistura 1mL de Tween 80 à 5 % utilizando uma pipeta

graduada de maneira que o solvente escorra pelas paredes do tubo.

Homogeneizar a mistura e verificar se há material acumulado na

espátula;

Transferir a solução para um balão volumétrico de 5mL utilizando um

funil pequeno. Completar os 5 mL com água salina. Em soluções

translúcidas, a curvatura do menisco deve coincidir com traço da

aferição. Já em substancias coloridas, é a borda do menisco que

deve coincidir com o traço de aferição. A fim de se evitar perdas de

solução, a água salina utilizada para completar o volume de 5 mL

deve ser antes utilizada para “lavar” o funil e o vidro de penicilina

que continha a substancia. Ao retirar o funil verificar se há gotas de

solução aderidas a ele;

Tampar o balão, agitar e transferir novamente a solução para o vidro

de penicilina. Verificar se há gotas de solução aderidas ao balão.

Preparação do controle:

Em um vidro de penicilina, adicionar 2 gotas de Cremophor e 1 mL

de Tween 80 a 5 %. Com a extremidade plana de uma espátula

metálica homogeneizar a mistura;

Transferir a solução para um balão volumétrico de 5 mL utilizando

um funil pequeno;

Completar o volume de 5 mL com água salina, a qual, antes de ser

adicionada à solução, deve ser utilizada para “lavar” o funil e o vidro

de penicilina utilizado;

Tampar o balão, agitar e transferir a solução para o vidro de

penicilina. Verificar se há gotas de solução aderidas ao balão.

Teste de toxicidade / Exposição:

O teste de toxicidade é feito em triplicata para cada concentração. As

concentrações utilizadas no teste são: 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250

μg/mL, 100 μg/mL e 50 μg/mL obtidas a partir de diluições da solução inicial

em água do mar. Caso não seja possível determinar a CL50 nestas

concentrações é feito um diluição para: 100 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30

μg/mL, 20 μg/mL e 10 μg/mL.

Utilizando pipetas automáticas, adicionar os volumes de 500 μL, 375 μL,

250 μL, 125 μL, 50 μL e 25 μL da solução inicial aos tubos de ensaio ou 50μ,

25 μL, 20 μL, 15 μL e 10 μL para as menores concentrações, sendo 3 tubos

para cada concentração. Certificar-se de que não há bolhas na pipeta e de que

a solução está sendo colocada na parte de baixo do tubo;

Com uma bureta adicionar 5 mL de água salina filtrada e com pH entre 8

e 9. Com uma pipeta de Pasteur adicionar de 10 a 13 matanáuplios de Artemia

salina Leach em cada tubo de ensaio. Certificar-se de que nenhuma larva está

aderida à parede da pipeta ou do tubo de ensaio. Após adição das larvas aos

tubos de ensaio, deixar o sistema sob luz artificial por 24 horas.

Preenchimento da Ficha Cumulativa / Leitura:

Media dos vivos, em ordem decrescente de concentrações;

Media dos mortos, em ordem crescente de concentrações;

Vivos acumulados, em ordem decrescente de concentração;

Mortos acumulados, em ordem crescente de concentração;

A porcentagem de vivos é dada pela regra de três, onde total acumulado

corresponde a 100 % e os vivos acumulados correspondem a X.

As concentrações e as porcentagens de vivos foram então analisadas

pelo método estatístico Probitos para determinação da CL50.