METODOLOGIAS DE AVALIAÇÃO CITOTÓXICA: ESTUDO COMPARATIVO

SEGUNDO TEMPO DE EXPOSIÇÃO

Anand O. Masson1, Christiane B. Lombello1 1Centro de Engenharia, Matemática e Ciências Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, São

Bernardo do Campo (SP), Brasil

E-mail: anand.masson@aluno.ufabc.edu.br

Resumo. A realização de ensaios de citotoxicidade in vitro é essencial na caracterização inicial da biocompatibilidade de biomateriais que visam aplicação clínica. Porém, a sensibilidade dos diferentes ensaios é variável e influenciada por inúmeros fatores, relacionados às próprias condições de ensaio e parâmetros avaliados, bem como à natureza do biomaterial em análise. Esse estudo busca analisar comparativamente ensaios de citotoxicidade por contato direto e indireto via extrato, segundo norma ISO 10993:5(2009), utilizando materiais reconhecidamente citotóxicos (látex) e não citotóxicos (papel filtro e poliHEMA). A morfologia, proliferação e viabilidade celular da linhagem Vero foram avaliadas após tempos de 24 h, 48 h e 120 horas de exposição, direta ou ao extrato dos materiais. A estabilidade morfológica foi avaliada qualitativamente, enquanto ANOVA e teste de Tukey (P < 0,05) foram usados para os resultados de viabilidade e proliferação celular, permitindo comparar a sensibilidade dos ensaios, permitindo comparar a sensibilidade dos ensaios. Ambos os ensaios foram eficazes na avaliação de citotoxicidade. Porém, verificou-se que para o maior tempo de exposição há alterações morfológicas e redução na viabilidade das células para todos os materiais de referência, inclusive não citotóxicos, sendo o efeito mais acentuado para o contato direto. Nesse sentido, acredita-se que ao avaliar a presença e severidade da citotoxicidade de biomateriais, o uso de mais de um tipo de ensaio ou parâmetro celular, quantitativo e qualitativo, confere maior segurança aos resultados.

Palavras-chave: Biomaterial, Técnicas de Cultivo Celular, Testes de Citotoxicidade

INTRODUÇÃO

A caracterização da citotoxicidade in vitro é uma prática comum na avaliação

biológica de produtos para a saúde e fundamental para a análise inicial da

biocompatibilidade dos mesmos. Pela exposição de uma cultura celular a

determinado biomaterial de interesse, é possível caracterizar reações adversas de

citotoxicidade resultantes.

Segundo norma ISO 10993-5 (2009)(1) há três categorias de ensaios de

citotoxicidade, a saber: contato direto, por extrato e difusão em ágar, os quais

diferem quanto à forma pela qual as células são expostas ao material em análise.

Além disso, enquanto os ensaios de contato direto e por extrato possibilitam a

avaliação qualitativa e quantitativa da presença e severidade de efeito citotóxico, o

teste de contato indireto permite apenas a avaliação qualitativa da citotoxicidade

após ensaio.

Estudos relacionados à comparação de sensibilidade dos diferentes tipos de

ensaios de citotoxidade são escassos na literatura, especialmente quando produtos

para saúde, como biomateriais, são alvos de análise (2-4).

Vale ressaltar, no entanto, que a variedade de produtos e novos biomateriais,

bem como sua finalidade de aplicação gera uma demanda pelo estudo de novas

metodologias de avaliação biológica e um melhor entendimento e/ou

aperfeiçoamento das já existentes (5-6), para que se possam escolher os ensaios que

irão resultar na melhor resposta quanto à presença de possíveis elementos

citotóxicos, por exemplo (4,6).

Assim, o estudo comparativo desses ensaios e de suas variações

metodológicas contribui para o melhor entendimento dos protocolos empregados

atualmente. Ademais, a tendência de ampliação e aprimoramento dos testes in vitro

é uma realidade, em função das questões éticas envolvidas no uso de animais em

ensaios biológicos, cujo controle é cada vez mais rigoroso e restritivo (7-8).

Esse estudo busca, portanto, analisar comparativamente a influência, que o

tempo e forma de exposição ao material de interesse, podem ter sobre a

sensibilidade dos respectivos ensaios de citotoxicidade, de contato direto e por

extrato, e avaliar a correlação entre os resultados desses ensaios.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras

Como controle negativo, não-citotóxico, foram utilizados papel de filtro (2-3) e

poliHEMA (9). Esse tiveram suas dimensões padronizadas, com aproximadamente

0,25 cm2 de área superficial. Como controle positivo utilizou-se amostras de látex de

borracha natural (elástico ortodôntico, Morelli), por sua resposta citotóxica (10-11).

Essas foram utilizadas na sua forma original de cilindros ocos com cerca de 3,25

mm de diâmetro interno e 1,15 mm de espessura, segundo fabricante. Todos os

materiais foram previamente esterilizados em autoclave (SP205-13 - Sppencer) a

121 oC por 20 min para uso nos ensaios de citotoxicidade.

Cultura Celular Nesse estudo foi utilizada a linhagem celular Vero, células epiteliais de rim de

macaco-verde africano adulto (CCIAL 057 - Instituto Adolfo Lutz) e recomendadas

pela norma ISO 10993:5 (2009) para realização dos dois ensaios de citotoxicidade.

As células foram cultivadas em meio Ham F-10 (Sigma-Aldrich) suplementado com

10% de soro fetal bovino (SFB) da Cultilab e 100 µg/mL de penicilina/estreptomicina,

e mantidas em estufa a 37 oC e 5 % de CO2.

Ensaios de Citotoxicidade Para realização dos ensaios foram obtidas suspensões celulares por

tripsinização (solução tripsina/EDTA - 0,25%, Cultilab), a uma densidade de 2x104

células/mL, semeadas em placas de cultura de poliestireno de 24 poços (Corning).

Após 24 horas do inóculo celular, as monocamadas em subconfluência foram

submetidas aos ensaios de citotoxicidade de contato direto e por extrato (1,10).

Previamente, foram preparados ainda extratos dos materiais de acordo com

normas ISO 10993:5 (1) e 10993:12 (10), utilizando como veículo de extração o meio

de cultivo Ham F-10 com 10% SFB, na condição de extração de 24 horas à 37 oC. A

determinação da citotoxicidade para ambos os ensaios foi realizada após 24 h, 48 h

e 120 horas de incubação com a amostra ou respectivo extrato para efeito

comparativo dos resultados obtidos.

As placas foram analisadas através de parâmetros qualitativos e quantitativos

para determinação da citotoxicidade. A avaliação qualitativa foi feita por meio de

inspeção geral da morfologia celular por contraste de fase em microscópio de luz

invertido (AxioVert.A1, ZEISS), atentando também para a presença de vacuolização,

destacamento e lise celular. Baseado nas alterações encontradas foram atribuídos

graus de reatividade (presença e severidade de citotoxidade), em escala crescente

de 0 a 4 (atóxico, leve, moderada e severa citotoxicidade, respectivamente), sendo

um grau superior a 2 (dois) considerado como efeito citotóxico (1).

Já para a análise quantitativa foi realizada contagem das células com azul de

tripan. As células foram primeiramente submetidas à tripsinização e em seguida,

contadas com azul de tripan - 0,2% (Sigma-Aldrich) em câmara de Neubauer (12),

para a obtenção da densidade de células viáveis (células/mL), a qual foi expressa

como a média ± erro padrão da média para os diferentes tempos. A viabilidade

celular foi expressa em porcentagem, em função do tempo, sendo a linhagem celular

(controle não tratado) considerada como 100% de viabilidade.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata e os dados obtidos foram

tratados com teste estatístico ANOVA de uma via para comparação entre os grupos

e as diferenças avaliadas pelo pós-teste de Tukey (P < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Figura 1 são apresentadas as fotomicrografias das culturas celulares da

linhagem Vero após 24 h e 120 horas de ensaio, para o controle não tratado (A-B), e

após exposição direta a uma amostra de papel de filtro (C-D, seta) ou seu respectivo

extrato (E-F).

Figura 1 - Fotomicrografias das monocamadas da linhagem celular Vero, obtidas por contraste de fase após 24h e 120 horas de ensaio para a linhagem sem tratamento (A e B) e para as amostras de papel de filtro, pelo ensaio de contato direto (C e D) e por extrato (E e F). Localização da amostra no ensaio por contato direto (seta).

O papel de filtro não afetou a integridade da monocamada. Além disso, a

morfologia celular resultante foi similar ao da linhagem (controle) para os mesmos

tempos de análise. Em termos gerais, para 24h e 48 horas (não representado) havia

monocamadas de células aderidas, de formato tipicamente alongado, com pouca

granulação citoplasmática e núcleo íntegro de forma ovóide, e nucléolo evidente. Já

para o 120 horas, evidenciou-se alterações morfológicas, destacamento e

aglomerações celulares. Tal modificação fenotípica pode ser explicada pela alta

confluência da monocamada (13).

Em contrapartida, para o poliHEMA foi observado dano à monocamada celular,

com áreas da placa não povoadas, após ensaio de contato direto (Fig 2.A-B,

asterisco). A ausência desse mesmo efeito após ensaio por extrato com o mesmo

material (Fig. 2.C-D), leva a crer que houve dano mecânico à monocamada, não

pelo peso, mas provavelmente pela movimentação da amostra. A utilização do

ensaio de difusão em ágar(1) pode ser uma alternativa nesse caso.

Figura 2 - Fotomicrografias das monocamadas da linhagem celular Vero, obtidas por contraste de fase após 24h e 120 horas de ensaio para amostra de poliHEMA, pelo ensaio de contato direto (A e B) e por extrato (C e D). Localização da amostra no ensaio por contato direto (A, seta) e dano mecânico da monocamada (B, seta).

Nesse sentido é importante que a natureza do material e sua finalidade de

aplicação sejam consideradas na escolha do ensaio de citotoxicidade, pois algumas

de suas características podem causar interferência nos ensaios e influenciar a

interpretação dos resultados. Assim, é importante que se avalie o método de menor

interferência dependendo do biomaterial de estudo(4,14), atentando também para

escolha dos controles.

O caráter citotóxico do elástico de látex de borracha natural,(3,10,11) por outro

lado, foi corroborado pela alteração e comportamento e morfologia celular das

monocamadas resultantes da exposição ao contato direto (A-B) ou ao extrato da

respectiva amostra (C-D), como pode ser observado na Figura 3.

Visualmente, houve dano muito difundido, e de aparente maior severidade para

o ensaio por extrato. Para ambos identifica-se diminuição no número de células, a

morfologia é distinta daquela descrita anteriormente para a linhagem Vero. Para o

contato direto, o núcleo das células é de difícil visualização, e muitas delas se

mostram arredondadas ou em destacamento (Fig.3B, setas). Já no ensaio por

extrato, fica mais evidente a ocorrência de lise celular, e acúmulo de fragmentos ou

debris (Fig.3C-D, setas).

Figura 3 - Fotomicrografias das monocamadas da linhagem celular Vero, obtidas por contraste de fase após 24h e 120 horas de ensaio para amostra látex, pelo ensaio de contato direto (A e B) e por extrato (C e D). Localização da amostra no ensaio por contato direto (A, seta) e alterações morfológicas em ambos ensaios (B - D, setas).

A quantificação da proliferação celular e viabilidade celular relativa, Figuras 4 e

5, respectivamente, reforçou a adequabilidade do papel de filtro como referência de

caráter não citotóxico para ambos os ensaios(2-3), dado a similaridade morfológica já

apresentada e de padrão proliferativo para com o da linhagem controle. Após 24

horas de ensaio nenhum dos materiais utilizados como referência não citotóxica

(papel de filtro e poliHEMA) apresentou diferença significativa, quando comparados

ao controle (linhagem), ou seja, não houve indicativo de efeito citotóxico.

Figura 4 - Gráfico de densidade celular (células/mL) após 24 h, 48 h e 120 horas de ensaio de citotoxicidade para a linhagem celular Vero sem tratamento e exposta ao contato direto (A), ou respectivo extrato (B), das amostras de papel de filtro, látex de borracha natural e poliHEMA. Os pontos correspondem à média ± desvio padrão de triplicatas.

Após 48 horas, uma diminuição significativa (P < 0,05) de densidade, e

correspondente viabilidade celular, foi observada para o poliHEMA em ensaio de

contato direto, o que não ocorreu para o ensaio por extrato Conforme ISO 10993:5

(2009), amostras em teste que reduzem a viabilidade celular para valores inferiores

a 70% devem ser considerados citotóxicos. Assim, baseado apenas no parâmetro

de viabilidade para o ensaio de contato direto, o poliHEMA poderia ser

precipitadamente considerado como citotóxico.

No entanto, o mesmo apresentou resultados comparáveis ao da linhagem

(controle) e papel de filtro (referência negativa de citotoxidade) para o ensaio por

extrato para os tempos de 24h e 48h de ensaio, sem qualquer variação

estatisticamente significativa (P > 0,05). Acredita-se que a movimentação da

amostra durante ensaio de contato direto pode ter contribuído para a menor

densidade celular, mas trabalhos futuros serão realizados a fim de elucidar essa

diferença. E a alteração para o último tempo de ensaio (i.e. 120 horas) é pouco

confiável em vista da modificação fenotípica apresentada inclusive para o controle

(linhagem), conforme observado por contraste de fase.

Figura 5 - Viabilidade celular após 24 h, 48 h e 120 horas de ensaio de citotoxicidade de contato direto (A) e por extrato (B), das amostras de papel de filtro, látex de borracha natural e poliHEMA. A diferença de viabilidade celular para com o controle (linhagem) foi identificada (*P < 0,05).

Como esperado, diferença significativa (P < 0,05) foi evidenciada para o

elástico de látex quando comparado com o todas as amostras e controle, tanto em

densidade celular quanto em porcentagem de viabilidade relativa, e para todos os

tempos analisados. Não houve diferença significativa entre os ensaios para a

amostra de látex, ainda que para a análise em 24 horas tenha sido observada

diferença morfológica.

CONCLUSÕES

Ambos os ensaios foram de maneira geral eficazes na avaliação de

citotoxicidade, apresentando resultados comparáveis. Porém, verificou-se que para

o maior tempo de exposição há alterações morfológicas e redução na viabilidade

das células, inclusive para os materiais de referencia não citotóxicos. Reforçando a

influência que condições de ensaio como densidade de inóculo e tempo de análise

podem ter sobre os resultados. Além disso, as variações entre resultados para o

biomaterial de poliHEMA e dano mecânico pelo contato direto, são um indicativo de

que a própria natureza do biomaterial em análise é um fator importante de influência.

Sendo assim, argumenta-se que na avaliação de citotoxicidade, a utilização de mais

de um tipo de ensaio ou análise de mais de um parâmetro celular, quantitativo e

qualitativo, indicativo da presença e severidade de efeito citotóxico deve ser

considerado, pois confere maior segurança aos resultados.

AGRADECIMENTOS

À UFABC e CAPES pela estrutura e apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

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CYTOTOXIC EVALUATION METHODS: A COMPARATIVE STUDY

BASED ON EXPOSURE TIME

Anand O. Masson1, Christiane B. Lombello1

1Centro de Engenharia, Matemática e Ciências Sociais Aplicadas, Universidade Federal do ABC, São

Bernardo do Campo (SP), Brasil E-mail: anand.masson @aluno.ufabc.edu.br

Abstract. Carrying out in vitro cytotoxicity assays is essential for primary biocompatibility characterization of biomaterials, which are intended to clinical application. However, the sensitivity of the tests is variable and influenced by many factors related to test conditions and parameters evaluated, as well as the nature of the biomaterial under review. This study aims to compare cytotoxicity assays of direct and indirect contact on extract, according to ISO 10993: 5 (2009), using known cytotoxic materials (latex) and non-cytotoxic (filter paper discs and polyHEMA). The morphology, cell proliferation and viability of Vero cell line were evaluated after 24 h, 48 h and 120 hours of exposure, either directly or to the material extract. Morphological stability was qualitatively assessed, while ANOVA and Tukey test (P <0.05) were used for the results of cell viability and proliferation, allowing one to compare the sensitivity of the tests. Both assays were effective in assessing

cytotoxicity. However, it was found that for the longer exposure time there is morphological alterations and reduction of cell viability for the control and all reference materials, including non-cytotoxic, with the most pronounced effect on direct contact. Therefore, it is our belief that when evaluating the presence and severity of cytotoxicity of biomaterials, the use of more than one type of assay or cell parameter, quantitative and qualitative, provides more reliability to the results. Key-words: Biomaterials, Cell Culture Techniques, Cytotoxicity Tests