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Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Aula 2: Purificação de Proteínas
(revisão) e Determinação de Estruturas
(difração de raio-X)
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Trabalhando com Proteínas
• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais.
• Separadas de outras de forma pura considerando suas propriedades.
• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.
A280
• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos.
• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.
Métodos de Quantificação Proteica
Principais ensaios de quantificação de proteínas
Fonte: http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html
Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)
• Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico.
• Não é utilizado para purificar proteínas porque afetam sua estrutura e a função.
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
Eletroforese de Proteínas
SDS-PAGE
• SDS (sodium dodecyl sulfate)
• 1 molécula de SDS para cada 2
resíduos de aminoácidos.
• Contribui com grande carga negativa.
• SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.
Eletroforese de Proteínas
• Método analítico: útil tanto para separar quanto para visualizar proteínas.
• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.
• Permite determinação da
massa molecular
aproximada.
Eletroforese de Proteínas
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.
• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína
Métodos clássicos
Diferença de propriedades das proteínas: carga,
tamanho, ligantes.
Métodos modernos
Clonagem de DNA, sequenciamento
genômico, proteínas recombinantes, etc.
Trabalhando com Proteínas
• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.
• Mais de um método de purificação utilizado.
• Escolha do método: empírico.
• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.
• Iniciar com métodos de baixo custo.
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
• Extração Isolamento
1. Material de Partida ------ Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
•Solubilidade
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Separação
Diálise
Ultra filtração
Coluna Cromatografica
Métodos Cromatográficos
• Poderoso método de fracionamento.
• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.
• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.
Cromatografia em Coluna
Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:
o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);
o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;
o Afinidade;
o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).
Blue-Sepharose
C+ Ind S FT W1
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN
Fosfocelulose
S FT W1 W2
Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4
1 2 3 4
Coloração com Prata
Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646
©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Western Blot
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
6 códons para His (CAT ou CAC)
ou
Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:
1 - Abundância
2 - Especificidade pela Coluna
Cromatográfica
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante
Expressão em Sf9
Extrato Celular
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de Ni-NTA
Quilos de ovos de D. melanogaster
Centrifugação diferencial
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de DNA-celulose
Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose
Coluna de Blue-agarose
Estrutura proteica
• A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos
• A função depende da estrutura
• Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis
• As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes
Estrutura tridimensional
• Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação
• As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes.
• Porém, poucas são as conformações nativas.
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
Determinação da estrutura
tridimensional proteica
• O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas.
• Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.
Mas...o que são cristais?
• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional.
• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.
Sólidos cristalinos
• Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.
Como observar os cristais?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.
Como observar os cristais?
• Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
Cristalografia de raios-x
• Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-X.
• O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!!
• Segundo, obter cristais!!!
Cristalografia de raios-x
• Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);
Cristalografia de raios-x
• Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem.
• Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.
Cristalografia de raios-x
• A difração de raios-X aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.
Cristalografia de raios-x
• A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra.
• Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados.
• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.
Cristalografia de raios-x
• O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva.
• Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.
A partir da cristalografia de raios-x, é
possível...
• Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.