Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Métodos de Purificação

de Proteínas Recombinantes

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Agradecimentos à Flávia

(Depto. Tecnologia) por alguns slides

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Estratégia Geral para Obtenção da

Proteína Purificada

• Extração Isolamento

1. Material de Partida ------ Extrato Bruto

2. Desintegração celular

Fracionamento

•Solubilidade

•Tamanho

•Carga

•Afinidade Ligação

Separação

Diálise

Ultra filtração

Coluna Cromatografica

Cromatografia em coluna

Gel-Filtração • A separação é feita de acordo com o tamanho molecular

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia de

Afinidade

Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada

Proteínas ligadas

podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes

Blue-Sepharose

C+ Ind S FT W1

0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN

Fosfocelulose

S FT W1 W2

Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4

1 2 3 4

Como analisar o resultado da

purificação?

(como visualizar proteínas e determinar a

pureza da amostra?

Absorbância

280nm

SDS-PAGE

Como analisar o resultado da

purificação?

(como visualizar proteínas e determinar a

pureza da amostra?

Western Blot

Coloração com Prata

Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646

©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Western Blot

Cromatografia de Afinidade

Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA

Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA

Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA

Coloração com

Coomassie Blue Western Blot

Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA

Coloração com

Coomassie Blue Western Blot

Anticorpos que

reconhecem

Poli-histidina!!!

Como produzir a proteína contendo

a cauda de poli-histidina?

Como produzir a proteína contendo

a cauda de poli-histidina?

Representação Esquemática de um

Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

Representação Esquemática de um

Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

Representação Esquemática de um

Vetor de Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

6 códons para His (CAT ou CAC)

ou

Inclusão dos códons de His

Expressão

Heteróloga de

Proteínas

Representação Esquemática de um

Vetor de Expressão para Células Sf9

Representação Esquemática de um

Vetor de Expressão para Células Sf9

Representação Esquemática – Vetor de

Expressão para Células Humanas

Representação Esquemática de um Vetor

de Expressão Procariótico – pET SUMO

Promotor forte IPTG induzido

Operador lac

Repressor lac Proteína

fusionada à sequência de SUMOilação

Sítio de clonagem

Representação Esquemática de um Vetor

de Expressão Procariótico – pEX-C-GST

Proteína fusionada à

Glutationa S-Transferase

Purificação usando cromatografia de

afinidade (glutationa-agarose)

Tags de Fusão de Proteína Comuns

Representação Esquemática de um Vetor

de Expressão Procariótico – pEX-C-GST

Sítio para a TEV protease

Eliminação da cauda de GST após

purificação...

Eliminação da

cauda (nem sempre

necessário)

Proteínas Recombinantes então

resolvem dois problemas comuns da

purificação de proteínas nativas:

1 - Abundância

2 - Especificidade pela Coluna

Cromatográfica

Exemplo: a DNA polymerase γ de

Drosophila melanogaster

Nativa Recombinante

Expressão em Sf9

Extrato Celular

Coluna de Fosfocelulose

Precipitação com (NH4)2SO4

Sedimentação em Gradiente de Glicerol

Coluna de Ni-NTA

Quilos de ovos de D. melanogaster

Centrifugação diferencial

Coluna de Fosfocelulose

Precipitação com (NH4)2SO4

Sedimentação em Gradiente de Glicerol

Coluna de DNA-celulose

Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose

Coluna de Blue-agarose

Exemplo: a DNA polymerase γ de

Drosophila melanogaster

Nativa vs

Recombinante

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Fonte?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Fonte? Extração de humanos?

Voluntários? Ética?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos

Que tecido? Por quê?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos

Cérebro (Substância negra)

Que tipo de extração?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos

Cérebro (Substância negra)

Tampão hipotônico e

homogenizadores para tecidos moles

Onde parkin se encontra nas

células?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos

Cérebro (Substância negra)

Tampão hipotônico e

homogenizadores para tecidos moles

Onde parkin se encontra nas

células? Qual sua função?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Animais modelos

Cérebro (Substância negra)

Tampão hipotônico e

homogenizadores para tecidos moles

Componente do proteassomo –

degradação de proteínas

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Centrifugação diferencial?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

Gel filtração? Separação por

tamanho?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa

Cromatografia de troca iônica?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa

pI = ~6.9

Cromatografia de afinidade?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa

pI = ~6.9

E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys

Troca iônica? Uma ou duas colunas?

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

Citoplasmática, em sua maioria

~52 KDa – média proteínas: 53 KDa

pI = ~6.9

E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys

Duas colunas aniônicas: forte e fraca

Exercícios

Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as

propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene

parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em

humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

E isso tudo será que é suficiente?

Exercícios

Situação hipotética: Considerando que a purificação da Parkin

nativa tem se mostrado extremamente trabalhosa, monte uma

estratégia para expressar e purificar uma versão recombinante da

Parkin humana.

Para casa...

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de Proteínas