Micotoxinas y uso de atrapantes

Alvaro Garcia DVM PhD

Hongos y micotoxinas

•Tres géneros: Aspergillus, Fusarium, y Penicillium

• Aspergillus: aflatoxina B1, B2, G1, and G2; ocratoxina A (Aspergillus ochraceus, carbonarius y niger; Penicillium verrucosum); patulina

• Fusarium: zearalenona, fumonisinas (B1), deoxynivalenol (DON), tricotecenos (T-2 y HT-2, diacetoxiscirpenol, nivalenol).

• Penicillium: P. verrucosum (Ocratoxina A); P. patulinum (patulina), toxina PR, acido micofenólico y roquefortina C

PROBLEMAS EN LAS AMERICAS

• Centro América FUM y DON más frecuentes (84% y 75%). Maíz, FUM en 98% de muestras; promedio de 2,426 ppb.

• América del Sur FUM (84%) promedio de 2,331 ppb. DON es problema en trigo, promedio de 3,122 ppb.

• Norteamérica. DON con 82% prevalencia seguido de FUM y ZEN (52% y 48%). En maíz prevalencia similar y promedios de 2,345 ppb FUM, 767 ppb DON y 390 ppb ZEN.

Fuente: BIOMIN

FUSARIUMASPERGILLUM

PENICILLIUM

Micotoxinas

• Esporas de hongos en aire, tierra y equipo

• Oportunistas; aprovechan estrés, daño, debilidad.

• Del crecimiento a la cosecha, transporte y almacenaje.

• Pre-cosecha (Aspergillus y Fusarium)

• Post-cosecha almacenamiento y transporte (Ocratoxina A)

Hongos y micotoxinas en alimentos

•Más alimentos en raciones: positivo y negativo

•Efectos:

1. Aditivos

2. Antagonistas

3. Sinergísticos

EFECTOS

•Específicos crónicos (hepatotóxico, genotóxico,

nefrotóxico, neurotóxico, reprotóxico, inmunotóxico, etc).

•No-específicos negativos sobre salud animal, susceptibilidad

a enfermedades y desempeño pobre.

• Inhibidores (ej. Ác. Propiónico, 5-10 kg/ton en maíz alta humedad) Eficaz al almacenaje no tiene sentido después.

• Inhibidores no tienen efecto contra micotoxinas.

•Evitar exposición al aire (almacenaje y suministro)

•Potenciar fermentación (ej. Inoculantes bacterianos)

Prevenir contaminación

• Separadores: aire, tamizado y densidad.

• Reduce toxinas (hasta 89%!).

• Cuanto más arriba en la tolva más toxinas (Muestreo!!!)

• Se pierde 8% del material o más

El uso de alimentos contaminados

PASOS

1. Reducir polvillo, mezclar grano limpio (FÁBRICAS DE RACIONES NO!)

2. Determinar hongos y micotoxinas presentes y concentración.

3. Reducir estrés animal:

*confort animal

*vitaminas A, E y Se.

*agentes atrapantes

Análisis de micotoxinas

Análisis rápidos y más lentos

• Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)

• Prueba de flujo lateral

• Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

• HPLC acoplado a espectrometría de masa (LC-MS) o

espectrometría de masa en tándem (LC-MS/MS)

• Espectrometría de infrarrojo cercano (NIRS)

Opción a seleccionar?

• Métodos rápidos analizan pocos alimentos.

• Raciones es mejor usar análisis más completo.

• Test rápido resultados no concluyentes aún con síntomas.

• Analizar con HPLC o LC-MS/MS.

• Hay micotoxinas que aún no tienen análisis concluyentes.

ELISA(Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas)

• Hasta 6 micotoxinas con una sóla extracción.

• Ideal para medir múltiples muestras en paralelo.

• Tiempo de incubación: 15’ hasta 42 muestras.

• Ventajas: rapidez, costo; bueno para estimación primaria.

• Desventajas: sólo detecta materias primas y principales micotoxinas.

Mínimo de 30 muestras por kit.

ELISA

Micotoxina en solución compite con cantidad conocida de toxinamarcada y añadida a la reacción (pasos 1 y 2). Después de lavarlos elementos acoplados, se añade solución que excita la toxina ycambia de color (paso 3).

Fuente: BIOMIN

Prueba de flujo lateral

• Análisis rápido in situ, varios alimentos; menos de 10’.

• Sólo materias primas. Analiza: AFLA, DON, ZEN y FUM.

• Kits convencionales usan solvente orgánico

• Kits que usan agua (costo; mantener y prod. químicos)

Fuente: BIOMIN

Prueba de flujo lateral

Almohadilla absorbente

membrana

Positivo Negativo

Almohadilla dorada

Tubo de muestra

Almohadilla filtro

Línea de test

Línea de control

HPLC“Cromatografía líquida de alto rendimiento”

• Solvente y muestra pasan a presión por columna de material adsorbente.Toxinas interactúan con adsorbente de la columna a diferentes velocidades,separándolas. Detector cuantifica micotoxinas y compara su señal con la deestándares preestablecidos.

• Varios detectores disponibles: espectrofotómetros, refractómetros,detectores de fluorescencia y espectrómetros de masa.

• Alta sensibilidad, pequeña cantidad de muestra, fiabilidad y precisión. Llevatiempo, es costosa, necesita técnicos calificados.

HPLC acoplado a espectrómetro de masa (LC-MS y MS-MS)

LC-MS Combina separación HPLC condetección de masa y característicasestructurales de la muestra. En HPLCy masa en tándem (MS-MS) iones decomponentes individuales se miden,luego se fragmentan y cada fragmentose vuelve a medir en un segundo paso. Fuente: BIOMIN

NIRS“Espectrometría de infrarrojo cercano”

• Mide interacción entre radiación infrarroja y enlaces químicos. La radiaciónreflejada por la muestra determina las vibraciones de enlaces químicos.

• Requiere curva de correlación compleja. Las muestras de calibración paracualquier método NIRS deben obtenerse mediante HPLC o HPLC/MS.

• Mide cambios en la matriz analizada y no las micotoxinas (muy baja masamolecular). Metabolitos fúngicos muy tóxicos a bajas concentraciones.

Niveles de acción

ZEA: No hay niveles de acción de la FDA

aCondiciones favorables para toxinas? Analizar. Evaluar síntomas. Limitar alimento sihay efectos moderados en rendimiento; retirarlo si son severos o hay síntomas.

bPotencialmente nocivo –Puede afectar rendimiento o producir síntomas.Interrumpir alimento temporalmente si hay síntomas. Observar los animales decerca en ausencia de síntomas y analizar más alimentos o RTM.

cMSRT - materia seca de ración total.

Zearalenona (ppb) Concentración a Bovinos b Suinos b

Alimento mayoritario base MS 560 5,600-10,000 1,100-5,600MSRT c 560 3,900 7,000

Alimentos más peligrosos

• Contribución de cada alimento al total de micotoxinas de la dieta no bien descrita en la literatura.

• Función de contaminación individual de cada alimento y su % de inclusión en la dieta.

• Alimentos más propensos a tener concentraciones mayores rara vez plantean problema por la cantidad incluida.

• Ingredientes múltiples diluyen toxinas haciendo la dieta más segura. • Efecto aditivo: ingredientes múltiples contaminados.

Uso de atrapantes en dietas y alimentos

Agentes atrapantes o anti-apelmazado

• Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA):

No considera seguros los agentes atrapantes (“binders”). Petición de aprobación para comercializarlos con ese fin. De base arcillosa como anti-apelmazantes (GRAS; 2% máximo).Adsorción uniforme? Que sucede con diferentes pHs?

• Comisión Europea (2009) amplió definición incluyendo:

“Materiales que suprimen o reducen la absorción de micotoxinas, promueven la excreción de micotoxinas o modifican su modo de acción y, por lo tanto, mitigan

los posibles efectos adversos de las micotoxinas sobre la salud animal".

Alternativas del nutricionista

• Objetivo principal: prevenir efecto de las toxinas.

• Intervenciones nutricionales para estimular inmunidad.

• Prácticas de manejo para reducir el estrés.

• Aditivos para neutralizar o bloquear las toxinas.

• Atrapantes para ligar la toxina y que no se absorba.

Propiedades “ideales” del atrapante

1. No afecta la salud ni a la producción animal

2. Produce adsorción estable con la toxina

3. Eficaz bajo diversos porciones del tubo digestivo

4. No afecta el medio ambiente al ser excretado

Modos de acción de los atrapantes

1. Ligar las toxinas para disminuir su absorción.2. Inactivarlas.3. Modificar enzimas del animal para que reduzcan la toxicidad

de las toxinas.

Clasificación de atrapantes

1. Inorgánicos 2. Orgánicos

Clasificación de atrapantesInorgánicos (compuestos de sílice)

• Aluminosilicatos• Filosilicatos

BentonitasMontmorillonitasHSCAS (Alimunosilicato hidratado de Na y Ca) Smectitas Kaolinitas Illitas

• Tectosilicatos Zeolitas

• Carbón activado• Polímeros sintéticos

Fibra dietética Polivinilpirrolidona Colestiramina

Orgánicos (compuestos de carbono)

• Saccharomyces cerevisiaeLevadura vivaParedes celulares de levadura/glucomananos

• LactobacilosLactococcusLactobacillusLeuconostocPediococcus

Atrapantes Orgánicos

• Fracción-d-glucano participa de la unión con las toxinas

• Su estructura modula la fuerza de los enlaces de H

• Dosis de levadura activa 1-2 kg/ton ó 20 g/día por vaca

• Contra más amplia gama de toxinas que inorgánicos

• Ventaja adicional: biodegradabilidad

• Reconocidos como atrapantes eficientes de toxinas agregados al 1% de la MS de la dieta.

• Eficacia contra toxinas de fusarium es casi nula (zearalenona, fumonisinas y trichotecenos).

• Adsorción 40 al 60 %. Fuerza del enlace depende de estructura química del atrapante (ej. carga eléctrica, porosidad) y de la toxina (ej. carga, solubilidad, forma).

Atrapantes Inorgánicos

Efecto de los Atrapantes

• Inorgánicos: redujeron AFM1 en leche sin afectar producción.

• 1er exp.: Aluminosilicato hidratado de Na y Ca (HSCAS) al 0,56% redujo AFM1 46%.

• 2º exp.: Aluminosilicato (HSCAS) al 1% MS redujo AFM1 51,9%

• 3er exp.: Aluminosilicato (HSCAS) al 2% y 4% MS redujeron AFM1 82,2% y 86,9%.

• Bentonita al 1,2% redujo AFM1 58% con un producto y 65% con otro.

• Orgánico (glucomanano de levadura) al 0.05% resultado inconsistente: un exp.

redujo AFM1 58,5% otro 4%!

Efecto de varios atrapantes comerciales sobe aflatoxinas

Nombre comercial Ingrediente activo % MS % Adsorción

Flow Guard 1 Bentonita de sodio 1.0 65

Astra-Ben-20 1 Bentonita de sodio 0.05 61

Mycosorb 1 Bentonita de sodio 1.0 50

RedCrown 1 Bentonita de calcio 0.25 31

MTB-100 1 Glucomanano esterificado 1.0 59

Solis 2 Aluminosilicato Na Ca 0.5 45

NovasilPlus 2 Aluminosilicato Na Ca 0.5 46

1 Diaz et al. 2004; 2 Kutz et al. 2009

Atrapantes inorgánicos efectivos en experimentos publicadosGrupo Producto Compañía Toxina

Aluminosilicatos

Bentonitas

Astra Ben 20® (B. de Na)Prince Agri products

AFB1 AFM1

Red Crown® (B. de Ca)

Flow Guard® (B. de Na) Laporte Biochem, INC

Microsorb® (B. de Na) American Colloid Co.

Volclay FD-181 (B. de Na) Volclay Intern. PTY Ltd. AFB1

Bentonita de Na - AFB1 FB1

Bentonita Sigma Chemical FB1

Atrapantes inorgánicos efectivos en experimentos publicadosGrupo Producto Compañía Toxina

Montmorillonitas

Mont. Organophil modificado Sud-Chemie AFB1; ZEAMont. de sodio y calcio Engelhart Chem. Corp. DON; ZEA

Montmorillonita Aldrich Chem. AFMont. modif. nanocompósito Feed Science Inst. China AF

MilbondTX. Mont. base arcilla Milwhite Inc. AFB1

ZeolitasCinoptilolita Engelhart Chem. Corp. AFAluminosilicato hidrat. Ca K Na Silver and Byte Ores Mining

Co.AF

HSCASNovaSil Engelhart Chem. Corp. AFB1;AFM1Myco-Ad®Zeolex®

Special nutrients Toxina T-2

Carbón activadoCarbón activado SIGMA

F.I.S.AFB1, AFM1; ZEA;

FB1, FB2; OTA; DON

Atrapantes orgánicos efectivos en experimentos publicados.Grupo Producto Compañía ToxinaParedes celulares de levadura

Paredes celulares de levadura AlltechLesaffre

AF; ZEA; OTA; Toxina T-2

MTB-100® (polímero de glucomananoextraído de pared celular de levadura)

Alltech

AFB1, AFM1; ZEA; OTA; Toxina T-2, DAS, moniliformina, FB1; ác.

fusáricoMycosorb® (basado en glucano de levadura, polímero de glucomanano

AFB1, AFM1; ZEA; DON; FB1; OTA; Toxina T-2, NIV

Glucomanano esterificado AFB1; OTA; Toxina T-2

EX16® (vinasa conteniendo 16% de pared celular de levadura)

Lesaffre

OTABETA® (beta glucano purificado de pared celular de levadura)

Lesaffre

LEC® (pared celular de levadura seca) Lesaffre

Atrapantes orgánicos efectivos en experimentos publicados.Grupo Producto Compañía Toxina

LevadurasTrichosporon mycotoxinivorans ZEA; OTA; DONPhaffia rhodozyma y xanthophyllomyces dendrorhous OTA

AFMycotox® (Oxicinol, tymol, levadura micronizada)

Mycofix Plus® (desactiva toxinas; contiene lalevadura Trichosporon mycotoxinivorans (poder deadsorción) y actividades de epoxidasa y lactonasa.

Biomin

FB1; ZEA; DON; NIV;

DAS; toxina T-2, OTA

Enzymas FUMzyme® Estearasa de fumonisina. Transforma fumonisinas en metabolitos no tóxicos.

FUM

Mensajes para llevar a casa

1. Analizar la ración completa y/o los ingredientes riesgosos

2. No almacenar mucho tiempo grano partido, no usar

barridos de molinos y eliminar contaminantes

3. Agregar atrapantes a la TMR o a alimentos riesgosos

4. Fortalecer Vitaminas A, E y Selenio

5. Evitar estrés y estar atento a sintomatología inespecífica

Preguntas?

Metabolismo en rumiantes

• ASPERGILLUS: AFB1 (rumen aflatoxicol AFM1 (hígado) leche

• FUSARIUM:

ZEA rumen α-zearalenol (estrogénico) y β-zearalenol (tóxico para endometrio)

TRIdiacetoxiscirpenol (DAS), toxinas T-2 y HT-2, nivalenol, and deoxinivalenol (DON) lesiones gastrointestinales, inmunidad

• PENICILLIUM: Ocra-A degradación ruminal daño hepático y renal (terneros)

Rumiantes

•AF B1 (42% degradada) AFM1 en leche (1-2% de AFB1

ingerida)

•En vacas de alta producción puede llegar al 6%.

•Concentración máxima de M1 en leche 0,05 g/kg (UE).

Alimentos mas peligrosos en Ganado lechero

• Contribución de AFB1 y DON a la dieta de vacas lecheras. • Toxinas de muestras de 6 años de análisis del Dairy One

(2000-2016). • Número de muestras: mínimo 20 para h. de soya máximo

1.480 para silo de maíz. • RTM de vaca lechera: silo de maíz (27,7%), maíz grano

(21,0%), DDGS grasa reducida (20%), heno alfalfa (19,3%), harina de soy (4,1%), heno hierba (3 %), otros aditivos (4,9%).

Maíz seco

• Muestras promediaron 17,4 ppb de AFB1 (toxina presente en concentración más alta). Valor máximo: 146 ppb.

• AFB1: Maíz al 21% contribuiría 3,7 ppb y 36,5 ppb con concentraciones de toxina medias y máx. respectivamente.

• DON: valor medio casi 1 ppm, máximo 3,6 ppm.

• Maíz al 21% DON sería 0,21 ppm y 0,8 ppm para concentraciones medias y altas, respectivamente.

Silo de maíz

• AFB1: 1 ppb promedio y máximo de 8,5 ppb.

• DON: valor medios de 1,6 ppm y máx. de 4,7 ppm.

• A la tasa de inclusión del ejemplo DON sería de 0,44 ppm y 1,3 ppm para valores medios y altos, respectiv.

• El silo de maíz contribuye menos AFB1 a la dieta que el grano, pero podría ser significativo para DON.

Granos de Destilería (DDGS)

• Muestras (n = 346) menor riesgo a AFB1 y DON que maíz o silo de maíz.

• AFB1: promedio de 0,5 ppb (menor al del maíz).Máx. 3,5 ppb, por debajo de 146 ppm del maíz, media y

máx. de AFB1 fue la mitad del silo de maíz.

• DON: promedio de 2,4 ppm con máximo de 4,8 ppm.

• Medidas de control de calidad en biorrefinerías.

Harina de soya

• H. de soja a baja inclusión (4,1 %), contribuye poco.

• AFB1: Promedio 6,2 ppb. Casi 6 veces más que silo de maíz y 12 veces más que DDGS. Máx. 24,6 ppb, 3 veces más que silo de maíz y mayor que DDGS.

• AFB1 0,37 ppb y 1 ppb para concen. medias y altas, respectiv.

• Terneros y monogástricos?

Pepa de algodón

• No incluida en esta dieta; proteína, energía y fibra eficaz

• AFB1: Muestras (62) promedio 26 ppb y máx. 188 ppb.; 29% más que el máx. del maíz.

• Al 6% (1.6 kg/d) de la MS, añadiría 1,6 ppb y 11 ppb para la concentración media y alta de AFB1 respectivamente.

• Puede inclinar la balanza cuando los valores generales están al límite de la toxicidad.

Maíz de alta humedad

• AFB1: Promedió la mitad (8,7 ppb) del maíz seco (17,4 ppb).

• AFB1: Valor máx. 42% menor que máx. del maíz (145,9 ppb vs. 102,8 ppb).

• DON tendencia opuesta; mayor en maíz alta humedad (2,63 ppm prom., 6,40 ppm máx.) vs. maíz seco (0,96 ppm promedio; 3,63 ppm máx.).

Gluten feed húmedo

• AFB1: segunda después del silo para el promedio y para los valores máx.

• DON: mayor de todos los alimentos húmedos, prom. 3,8 ppm y máx. 13,1 ppm.

• Buena fuente de proteína (alrededor del 24%) y altamente palatable.

• AFB1 y DON valores bajos comparado con otros alimentos húmedos.

Grano húmedo de cervecería

Ración total mezclada

• Pepa de algodón se incluyó al 6% de la MS en la evaluación final con fines ilustrativos.

• AFB1 El ingrediente más riesgoso a concentraciones medias y máx. Fue el maíz, luego pepa de algodón, y silo de maíz.

• El más seguro harina de soya (baja inclusión en la dieta).

• Con DDGS al 20% de la MS su contribución de toxinas fue insignificante incluso a su concentración máx.

Contribución de toxinas de los alimentos

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Maiz Silo maiz DDGS H. de soya Pepa algodon

AFB1 Promedio AFB1 Alta DON Promedio DON Alto