Oliveira, R.C. M.; Nunes, P. H. M. Biofsica para Cincias Biolgicas

4.3. ELETROFORESE 4.3.1. INTRODUO A eletroforese uma tcnica de separao baseada na migrao de molculas carregadas eletricamente, numa soluo, quando submetidas ao de um campo eltrico externo. A eletroforese de protenas foi realizada pela primeira vez em 1937 por Arne Tiselius, que idealizou um mtodo denominado eletroforese livre, o qual lhe rendeu um prmio Nobel. Essa tcnica tem grande utilidade na anlise qualitativa de misturas homogneas. Na rea biomdica, sua aplicao bastante ampla, indo desde pesquisas mais simples sobre a composio de sistemas ou lquidos biolgicos at como mtodo auxiliar no diagnstico e prognstico de diversas patologias humanas. Na clnica mdica, por exemplo, a eletroforese um dos exames fundamentais no estudo de alteraes das protenas plasmticas do organismo. Desde 1937 essa tcnica tem passado por vrias modificaes, precisas. possibilitando anlises cada vez mais

Equipamentos utilizados para eletroforese: cubas, eletrodos, fonte, aplicadores

Fonte das figuras: ALBERTS et. al., 2004;

4.3.2. PRINCPIO DO MTODO uma lei geral de Eletricidade, o fato de que cargas eltricas de sinais opostos se atraem e cargas eltricas de mesmo sinal se repelem. Assim, partculas com carga eltrica livre, quando submetidas a um campo eltrico, sero atradas pelos plos opostos s suas cargas, ou seja, as partculas carregadas positivamente (ctions) sero atradas pelo plo negativo (CTODO) e as partculas carregadas negativamente (nions) sero atradas pelo plo positivo (NODO). Se no existir algum fator que impea o livre deslocamento das partculas, a ao do campo eltrico far com que elas migrem em direo aos respectivos plos de atrao. Isto pode ser conseguido, por exemplo, colocando-se as partculas em soluo ou suspenso, como mostra o esquema abaixo:

+ - A BB + A+ - A B B

A+

A+ A+ + A A+

BB- B B-

Aps algum tempo de aplicao do campo eltrico, as partculas positivas estaro mais concentradas em torno do CTODO e as partculas negativas em torno do NODO. Obtm-se assim, uma separao entre partculas de cargas opostas. A velocidade de migrao das partculas em direo aos plos de atrao diretamente proporcional fora eltrica exercida pelo campo eltrico sobre cada partcula e inversamente proporcional viscosidade e fora inica do meio. A lei de Coulomb estabelece que a fora eltrica exercida sobre cada partcula depende da intensidade do campo eltrico e da quantidade de carga eltrica livre da partcula. So, portanto, trs os fatores que determinam a velocidade de migrao de uma partcula num experimento eletrofortico: - a viscosidade e fora inica do meio; - a intensidade do campo eltrico (voltagem); - a quantidade de carga eltrica efetiva da partcula. Na prtica, as partculas analisadas por eletroforese, so submetidas a um campo eltrico constante e se deslocam num meio de fora inica e viscosidade tambm constantes. Nessas condies, a velocidade de migrao vai depender fundamentalmente da quantidade de carga

eltrica efetiva das partculas.

Consequentemente, a

eletroforese pode ser usada, no somente para separar partculas de cargas eltricas opostas, mas tambm, para separar partculas de cargas eltricas de mesmo sinal, desde que as mesmas estejam em quantidades diferentes.

C= BC= BA+ BA+ BA+ A+ C= BC=

A+ A+ A+ A+

C= B- = B- C = B - C B = C

Note que no esquema acima, as partculas C= se deslocaro com uma velocidade maior que as partculas Be, num determinado instante, podero estar totalmente separadas. O volume, a forma e a massa molecular das partculas so outros fatores menos importantes, que tambm podem influir na velocidade de migrao. 4.3.3. TIPOS DE ELETROFORESE Basicamente so dois: Livre e em Suporte. 4.3.3.1. Eletroforese Livre Nesta tcnica eletrofortica, as partculas se

deslocam livremente no meio condutor; da porque chamada eletroforese livre. A eletroforese livre tem aplicao no estudo analtico de macromolculas, mas apresenta algumas desvantagens:

permite a ampla difuso das partculas e dificulta a obteno isolada das fraes separadas. Alm disso, a passagem da corrente eltrica, aquecendo o lquido condutor, promove movimentos de conveco que interferem na migrao das partculas. Hoje essa tcnica est em desuso. 4.3.3.2. Eletroforese em Suporte Neste caso, a migrao das partculas se faz sobre um suporte slido ou semi-slido, embebido no lquido condutor e mergulhado pelas extremidades em cubas que contm os eletrodos. O esquema a seguir mostra um modelo de eletroforese em suporte:

(-)

(+)

A mistura de substncias (amostras) coletada na parte central do suporte. De acordo com as cargas efetivas das partculas, estas migraro para os plos positivo ou negativo e, aps algum tempo, estaro localizadas em pontos diferentes do suporte, constituindo as chamadas fraes ou zonas.

(-)

A eletroforese em suporte tambm denominada eletroforese de zona, eletroforese zonal ou anticonvectante.Saiba mais... A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e bisacrilamida.

Como suporte, foram empregadas inicialmente, tiras de papel de filtro. Em seguida vieram o acetato de celulose e os gis de gar, amido e acrilamida. O papel permite a separao de cinco (5) fraes de protenas do soro humano, aps cerca de dezesseis (16) horas de aplicao de um campo eltrico apropriado. Com os gis de amido e acrilamida, chega-se a obter at vinte (20) fraes em uma ou duas horas. Hoje, utilizando-se a eletroforese bidimensional ao combinar dois processos distintos de separao (primeiro pelo ponto isoeltrico (pI) e depois pelo peso molecular (PM) de cada cadeia polipeptdica), possvel separar mais de 1000 protenas em um nico gel. O poder de separao to grande que duas protenas que diferem em apenas um aminocido carregado podem ser distinguidas. Uma grande vantagem da eletroforese em suporte que, aps a migrao, as fraes permanecem isoladas e podem ser retiradas separadamente ou fixadas ao suporte. Substncias incolores podem ser reveladas, no prprio suporte, por meio de reaes caractersticas com corantes adequados. Alm disso, a colorao das fraes permite uma avaliao quantitativa da amostra por meio da densitometria e, atualmente, utilizando-se tcnicas mais modernas, a espectrometria de massa. Um grande passo no uso da eletroforese 2D ocorreu com o progresso nas tcnicas analticas de deteco e identificao. As protenas separadas eletroforeticamente podem ser visualizadas por mtodos gerais de colorao, tais como azul brilhante de coomassie, nitrato de prata, fluorescncia ou autoradiografia, ou por mtodos especficos

Fonte das figuras: ALBERTS et. al., 2004; http./www.goo gle.com

como a colorao de glicoprotenas ou deteco com imunoqumicos.

Fonte da figura: ALBERTS et. al., 2004; Art Paint e http./www.google. comAplicao da tcnica em laboratrio no auxlio diagnstico de doenas: Eletroforese de protenas sricas em gel de agarose, (1) hipergamaglubulinemia em processo inflamatrio; (2) e (3): fracionamento normal; (4) g ama monoclonal no mieloma mltiplo.

Aps a corrida eletrofortica, o suporte retirado da cuba e corado com corantes especficos por tempos variveis, e descorados a seguir. As anlises podem ser qualitativas ou quantitativas estas ltimas por densitometria ou eluio Existem ainda outros processos derivados da

eletroforese ou mtodos especiais como: Eletroforese em Gel, Focalizao Isoeltrica, Eletroforese Desnaturante em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE), Imunoeletroforese e Eletroforese Bidimensional (2D). Esta ltima, desenvolvida inicialmente em 1975 por OFarrel e Klose. Essa tcnica passou por grandes evolues e passou a ser uma das principais tcnicas utilizadas na separao de protenas. 4.3.3.3. ELETROFORESE DE PROTENAS Atualmente, todos os tipos de substncias podem ser separadas por eletroforese. Mesmo as que no possuem carga natural, podem adquiri-la por meio de reaes com grupamentos ou radicais ionizados. ento ser analisados por eletroforese. Os glicdios, por exemplo, formam complexos com o on borato e podem

, no entanto, no estudo das protenas que a eletroforese se constitui num mtodo fsico-qumico valioso para separar e analisar misturas dessas macromolculas, determinar suas mobilidades e caracteriz-las. Alm disso, a composio protica quantitativa de um sistema biolgico, como o soro sanguneo, por exemplo, revela importantes dados sobre o estado geral do animal. As protenas so heteropolmeros (macromolculas) constitudas por centenas a milhares de monmeros chamados aminocidos, que obedecem frmula geral:

Os aminocidos apresentam, portanto, um radical amina ( -NH2 ) e um radical carboxila ( -COOH ) ligados a um mesmo tomo de carbono. Na formao das protenas, a carboxila de um aminocido reage com o grupamento amina do aminocido seguinte, formando as chamadas ligaes peptdicas:

No esquema anterior, a letra b mostra a formao de uma ligao peptdica, e a letra a mostra uma ligao j formada. Os diversos aminocidos existentes na natureza diferem entre si pelo radical lateral R. De acordo com o carter cido-bsico desse grupamento, os aminocidos podem ser classificados em trs categorias: I - Monocido-monobsico, quando R neutro II - Dicido-monobsico, quando R tem carter cido III- Monocido-dibsico, quando R tem carter bsico. Uma nomenclatura mais simples, embora no muito correta, poderia classific-la em aminocidos neutros, cidos e bsicos, respectivamente. O esquema a seguir, apresenta exemplos de aminocidos de cada uma das categorias:

Devido presena na sua estrutura de, pelo menos, um grupamento bsico (-NH2) que pode captar prtons (H+), e um grupamento cido (-COOH ) que pode doar prtons (H+), os aminocidos se comportam como substncias anfteras, isto , podem doar ou captar prtons na dependncia do meio em que se encontram. Tudo depende da oferta: uma soluo que oferece uma alta concentrao de H+, isto , um baixo pH, dificulta a liberao de prtons (H+) pelo grupo carboxila que permanece na forma de -COOH, e facilita a captao dos mesmos pelo grupo amina (-NH2) que passa para a forma de -NH3+. Elevando-se gradativamente o pH, isto , diminuindose a concentrao de H+, o grupo carboxila (-COOH) comea a liberar prtons, passando para a forma -COO-, mas o grupo amina continua protonado (-NH3+). Por fim, em

concentraes hidrogeninicas ainda baixas, o grupamento - NH3+ comea a perder prtons para a soluo, passando para a forma desprotonada (-NH2). Ao liberar prtons (H+), o grupo carboxila (-COOH) adquire carga negativa (-COO-) enquanto o grupo amina (-NH2), ao captar prtons, adquire carga positiva (-NH3+). Desse modo, os aminocidos podem apresentar carga eltrica efetiva nula, negativa ou positiva, dependendo da oferta de H+ pela soluo onde so colocados. Um aminocido neutro, como a glicina, poderia adquirir trs configuraes dependendo do pH, ou seja, da concentrao de H+ da soluo onde colocado:

Quando a glicina colocada em soluo de pH muito baixo (A), ou seja, em uma alta concentrao de H+, tanto o radical amina como o radical carboxila esto protonados. Nessas condies, o aminocido adquire carga eltrica positiva, pois o grupo carboxila apresenta carga nula, mas o grupo amina est carregado positivamente. Em pH muito alto (C), devido carboxilao de H+, tanto o grupo amina quanto o grupo carboxila liberam prtons (H+) para a soluo. O aminocido adquire ento carga eltrica negativa, pois, agora, o grupo amina apresenta carga nula mas o grupo carboxila est carregado negativamente.

Num

pH

intermedirio

(B),

a

concentrao

hidrogeninica ser o suficiente para permitir a liberao de prtons pelo grupo carboxila, mas mantm o grupo amina protonado. Nessa situao, o aminocido apresenta-se sob a forma dipolar (ZWITTERIONICA) com carga eltrica efetiva nula, pois o grupo carboxila est carregado negativamente e o grupo amina positivamente. A formao do zwitteron possvel porque o grupamento -NH3+ um cido mais fraco que o -COOH, de modo que a ionizao completa de cada um se efetua em diferentes valores de pH. O pH no qual o aminocido adquire a forma dipolar, isto , apresenta cargas eltricas negativas e positivas equivalentes, denominado PONTO ISOELTRICO (pI) desse aminocido. Cada aminocido tem um pI especfico. Quando colocado em uma soluo de pH igual ao seu pI e submetido a um campo eltrico, o aminocido no sofre migrao para nenhum dos plos pois, nessas condies, apresenta carga eltrica efetiva nula. O ponto isoeltrico (pI) funciona como um pH neutro para o aminocido, isto , equivale concentrao de H+ na qual as foras cidas e bsicas do aminocido so equivalentes. Se o aminocido colocado num pH maior que seu pI, ou seja, num pH bsico, ele funciona como cido, libera (perde) prtons (H+) e adquire carga eltrica negativa. Quando colocado em um pH menor que seu pI, ou seja, num pH mais cido, o aminocido funciona como base, capta (ganha) prtons (H+) e adquire carga eltrica positiva. Os aminocidos neutros (monocido-monobsico) apresentam pI prximo de 7, geralmente menor. o caso da glicina que tem pI = 6,1. Os aminocidos cidos (dicido-monobsico) devem apresentar pI baixo (menor que 7) porque a concentrao hidrogeninica deve ser alta o suficiente para manter um dos dois grupos carboxilas na

forma protonada (-COOH). O cido asprtico, por exemplo, tem pI = 2,0. Com os aminocidos bsicos (monocidodibsico) ocorre o inverso: o pI deve ser maior que 7, isto , a concentrao hidrogeninica da soluo deve ser baixa o suficiente para permitir que um dos grupos amina esteja na forma desprotonada. O pI da lisina, por exemplo, vale 10. O esquema a seguir mostra as configuraes que podem ser adquiridas pelos aminocidos glicina (GLI), o cido asprtico (ASP) e lisina (LIS), relacionadas com uma escala de pH de 0 a 14:

As setas indicam o pH no qual, cada aminocido adquire a forma zwitterinica.

Se colocssemos uma mistura de glicina, cido asprtico e lisina no centro de um suporte embebido em um tampo de pH igual a 6,1 e aplicssemos um campo eltrico s extremidades do suporte, teramos as seguintes ocorrncias: - a glicina permaneceria no ponto de aplicao, pois est exposta a um pH igual ao seu pI (carga nula) - o cido asprtico migraria para o plo positivo, pois est exposto a um pH maior que o seu pI, no qual funciona como cido (perde H+, adquirindo carga negativa) - a lisina migraria para o plo negativo, pois est exposta a um pH menor que o seu pI, no qual funciona como base (ganha H+, adquirindo carga positiva) O esquema abaixo mostra a localizao que teriam os aminocidos, aps a aplicao do campo eltrico por um tempo apropriado:

pH = 6,1

pH = 6,1

(-)GLI / ASP / LIS

ponto de aplicao

(-) pH = 6,1 pH = 6,1LIS+ GLI0 ASP-

(+)

Utilizando-se um tampo de pH = 10, em vez de 6,1, a lisina teria carga nula e no migraria para nenhum dos plos. A glicina e o cido asprtico migrariam ambos para o plo positivo, pois esto colocados em um pH maior que seus pontos isoeltricos. No entanto, a separao entre eles

ainda seria possvel visto que a glicina teria uma carga negativa enquanto o cido asprtico teria duas, de modo que suas velocidades de migrao seriam diferentes. esquema abaixo mostra o resultado que seria obtido: O

pH = 10

pH = 10

(-)GLI / ASP / LIS

(+)

ponto de aplicao

(-) pH = 10LIS0 GLI- ASP=

(+)

De um modo geral, a velocidade de migrao (v) diretamente proporcional diferena entre o pI do aminocido e o pH da soluo tampo, e inversamente proporcional massa molecular (MM) do aminocido:

O comportamento eletrofortico das protenas semelhante ao dos aminocidos. cadeia protica, so os grupamentos Apesar de que, na amnicos de um pelos numa formao das ligaes peptdicas, isto , na formao da aminocido dois neutralizados definitivamente grupo amina

grupamentos carboxlicos do aminocido seguinte, sobram grupamentos terminais: um extremidade e um grupo carboxila na outra. Alm disso, os

radicais laterais (R) dos aminocidos cidos ou bsicos ficam livres para doar ou receber prtons (H+) da soluo e fornecer diferentes qualidades e quantidades de cargas eltricas protena. Como os aminocidos, as protenas apresentamLembre-se... Protenas carregadas negativamente (nions) quando submetidas ao de um campo eltrico, sero atradas pelo plo oposto s suas cargas (plo positivo NODO).

tambm pontos isoeltricos.

A diferena apenas

quantitativa: enquanto os aminocidos apresentam apenas uma carga negativa e uma positiva, no ponto isoeltrico (pI), uma protena pode apresentar, por exemplo, quarenta (40) cargas positivas e quarenta (40) negativas. No ponto isoeltrico, a oferta (concentrao) de H+ pela soluo faz com que a quantidade de grupamentos bsicos protonados (carga positiva) seja igual quantidade de grupamentos cidos desprotonados (carga negativa), de modo que a carga eltrica efetiva da protena seja nula. Nessa situao, a protena no migra para nenhum dos plos. Colocando-se em um pH maior que seu pI, ou seja, com uma oferta menor de H+, a protena perde H+ para a soluo. Perder H+ significa perder cargas positivas e, assim, a protena fica com carga residual negativa. Quanto mais distante estiver o pI do pH da soluo, mais fraca ser a oferta de H+ e mais prtons (H+) a protena perder para a soluo. Consequentemente, maior ser sua carga negativa e maior sua velocidade de migrao em direo ao nodo. Em valores de pH menores que o pI, a oferta de H+ pela soluo ser cada vez maior. A protena, ento, captar cada vez mais prtons, adquirindo carga positiva cada vez maior. A velocidade de migrao, por sua vez, ser tambm cada vez maior. A diferena entre o pI da protena e o pH da soluo (pI - pH) pode ser usada como regra simples para se avaliar

Lembre-se... Protenas carregadas positivamente (ctions) quando submetidas a ao de um campo eltrico, sero atradas pelo plo oposto s suas cargas (plo negativo CTODO).

a qualidade (se negativa ou positiva) e a quantidade relativa de cargas eltricas adquiridas pela protena. Suponhamos quatro protenas X, Y, V e Z, de pontos isoeltricos respectivamente iguais a 4, 6, 7 e 9, colocadas em um tampo de pH = 7. As diferenas pI - pH valero: X ( pI - pH = 4 - 7 = -3 Y ( pI - pH = 6 - 7 = -1 V ( pI - pH = 7 - 7 = 0 Z ( pI - pH = 9 - 7 = +2 As protenas X e Y apresentariam cargas negativas, porm, a quantidade de cargas presentes na protena X seria maior que na protena Y. A protena V teria carga nula e a protena Z teria carga positiva. A velocidade de migrao das protenas tambm influenciada pela massa molecular (MM), mas depende fundamentalmente da quantidade de carga eltrica efetiva da protena. Assim, a diferena pI - pH tambm serve para se avaliar a velocidade de migrao das partculas e sua localizao no suporte. Nas condies citadas anteriormente, as protenas X, Y, V e Z, submetidas a uma eletroforese, apresentariam a seguinte disposio:

pH = 7

pH = 7

(-) X/ Y / VeZ

(+)

ponto de aplicao

(-) pH = 7 pH = 7

(+)

Z

V

Y X

Colocadas em pH = 10, todas as protenas migrariam para o plo positivo (nodo), mas com diferentes velocidades, proporcionais s diferenas pI - pH de cada um.

4.3. 3.4. APLICAES BIOMDICAS Apesar da multiplicidade de protenas existentes no plasma humano, a eletroforese permite classific-las em fraes principais que apresentam propriedades fsicoqumicas semelhantes. Comumente, a classificao efetuada com base na eletroforese em papel ou acetato de celulose, que separa as protenas plasmticas em seis fraes principais. A tabela apresentada a seguir, relaciona as seis principais fraes proticas do plasma, juntamente com seus pontos isoeltricos:

Utilizando-se o soro sanguneo, em lugar do plasma, obtm-se apenas cinco fraes, pois o fibrinognio no est. Dependendo das condies da eletroforese, o acetato de celulose permite a subdiviso da frao em (1 - globulina e (2 globulina). Para fins de anlise clnica, a eletroforese de protenas do soro efetuada utilizando-se o acetato como

suporte, equilibrado com um tampo de pH = 8,6. Nessas condies, todas as fraes proticas apresentaro carga negativa e migraro para o NODO (plo positivo). A velocidade de migrao, como vimos, ser proporcional diferena pI - pH, para cada frao, e estar decrescente da albumina para a -globulina. Aps colorao apropriada, um eletroforegrama de soro humano normal, apresenta o seguinte aspecto: em ordem

Por

meio

de pode-se

aparelhos analisar e

denominados registrar a

DENSITMETROS,

intensidade relativa de cor de cada frao. Com isto, obtmse o perfil eletrofortico do soro (esquema anterior), que possibilita o clculo da proporo percentual de cada frao em relao ao total. protenas, que Sabendo-se a concentrao total de ser obtida facilmente por pode

fotoabsorciometria, pode-se fazer uma avaliao qualitativa e quantitativa bastante segura do estado geral do paciente.

Em condies normais, a concentrao total de protenas no soro humano de 6 a 8 g %. apresentadas na tabela a seguir: As concentraes reais (em g %) de cada frao so

As protenas plasmticas so responsveis por diversas funes: manuteno da presso onctica do compartimento sanguneo, transporte de substncias, coagulao, defesa imunitria e outras. A concentrao

dessas protenas no plasma determinada principalmente pelo estado nutritivo do animal e pelas funes heptica e renal. Assim, indivduos acometidos por processos Essas patolgicos que alterem estes parmetros, apresentam modificaes nos seus perfis eletroforticos. quantitativa. Desnutrio, glomerulonefrites, insuficincia heptica e doenas neoplsicas, so processos patolgicos que provocam diminuio da frao albumina. As globulinas encontram-se elevadas nos processos infecciosos agudos e diminudas em decorrncia de desnutrio e leucemia. As alteraes nas globulinas podem ser de natureza geral ou seletiva. modificaes podem ser de natureza qualitativa e/ou

4.3.3.5. Eletroforese Mtodos Especiais 4.3.3.5.1. Focalizao Isoeltrica ou eletrofocalizao Esta tcnica consiste em uma separao

eletrofortica, na qual as protenas so separadas de acordo com as diferenas de seus pontos isoeltricos (pI). Uma vez submetidas a um campo eltrico, a protenas migraro at encontrar uma faixa de pH referente ao seu pI e neste ponto ficaro com carga total neutra (carga efetiva nula), interrompendo a migrao no gel como mostrado no esquema a seguir:

pH = 10

pH = 4Gradiente de pH

G r a d i e n t e d e p H

Em pH baixo a protena adquire carga positiva Em pH alto a protena adquire carga negativa

Ao atingir o pI a protena para de migrar Para a protena mostrada, o pI alcanado em pH 6,5

Figura retirada e modificada de ALBERTS et al., 2004. Focalizao isoeltrica

4.3.3.5.2.

Eletroforese

Desnaturante

em

Gel

de

Poliacrilamida (SDS-PAGE) Esta tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilsulfato de sdio (SDS)

utilizada para a anlise de massas moleculares de protenas oligomricas. Essa tcnica foi desenvolvida nos anos 60 por Laemmli, revolucionando a rotina de anlise deSaiba mais... As protenas se classificam em Monomricas e Oligomricas quanto ao N de Cadeias Polipeptdicas. ALBERTS et al., 2004.

protenas. O gel preparado pela polimerizao de monmeros, com ligaes altamente cruzadas como uma matriz inerte, atravs da qual as protenas migram. O tamanho do poro do gel pode ser ajustado de maneira que seja suficientemente pequeno para retardar a migrao das molculas de interesse. As protenas ficam em soluo com o detergente forte (SDS).

Eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS (SDS-PAGE). Figura retirada de ALBERTS et al., 2004.

Uma das variaes do mtodo consiste em tratar as protenas a quente com SDS ou com um agente redutor como o ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol. As protenas perdem a carga e adquirem carga negativa constante em relao ao peso molecular e com isso so atradas para o nodo, podendo-se determinar a sua massa molecular atravs da filtrao pelos poros do gel. Dependendo do seu tamanho, cada protena se mover diferentemente: as menores migraro mais rpido, enquanto as maiores mais

lentamente, pois tero mais dificuldade em atravessar a malha do gel.

SDS-PAGE

Gel de poliacrilamida em polimerizao. Pente ainda inserido no sistema. Gel corado com Coomasie, onde se visualiza protenas de diferentes PM.Figuras retiradas de ALBERTS et al., 2004, e do Site: http./www.google.com.

4.3.3.5.3. Eletroforese Bidimensional (2D)Saiba mais... O termo protemica foi proposto em 1995 por Wilkins como sendo todo o contedo de protenas expressas por um genoma. ROCHA et al., 2005.

A eletroforese 2D uma tcnica quantitativa e qualitativa. Apesar de conhecida na dcada de 70, s passou a ter grande notoriedade na dcada de 90, aps o surgimento da protemica (1995). Inicialmente (1975) consistia na preparao de gis cilndricos de poliacrilamida. As protenas eram submetidas a uma focalizao isoeltrica (IEF - Isoelectric Focusing) e, posteriormente a uma eletroforese na presena de SDS. Dessa forma, as protenas eram separadas na primeira dimenso de acordo com seus pIs (IEF) e na segunda dimenso em funo de sua massa molecular (SDS-PAGE). A metodologia era muito trabalhosa e de difcil reprodutibilidade. Com o desenvolvimento dos gis em forma de tiras com gradiente de pH imobilizado (IPG immobilized pH gel), feitas pela polimerizao da acrilamida com o reagente ImmobilineTM (Amershan Biosciences/GE Heathcare), contendo grupos tamponantes cidos e bsicos, alm do aperfeioamento dos mtodos de

preparao de amostra proticas, a eletroforese 2D passou a ser a principal tcnica de separao de protenas utilizada. Com os dois mtodos de separao unidimensionais combinados, pode resolver at 2 mil protenas na forma de um mapa bidimensional de protenas. A tcnica tem tanta resoluo que pode distinguir entre duas protenas que diferem em apenas um nico aminocido carregado.

A

Mistura de protenas Focalizao isoeltrica

B

Focalizao isoeltrica

Separa em 1 dimenso por pI

P M Aplicar 1 gel no topo do 2

S D S Separa em 2 dimenso por massa (PM)

Eletroforese em gel bidimensional (2D), ALBERTS et al, 2004.

Importante lembrar... Cada protena tem um pI especfico.Saiba mais... Eletroforese Embrapa, 2005. Bidimensional Tcnico. e anlise ISSN de proteomas. BrasliaDF. Rocha,T.L.Comunicado 9192-0099,

Aps a separao, as podem ser determinadas ou detectadas por tcnicas de espectrometria de massa e Immunoblotting ou Western Blotting.

Deteco: Immunoblotting ou Western Blotting

4.3.3.5.4. Imunoeletroforese Nessa tcnica, aps a separao eletrofortica, faz-se uma reao antgeno-anticorpo, lava-se a preparao para retirar as protenas solveis, restando apenas os componentes insolveis antgeno-anticorpo (NA-Ac).

LEITURA COMPLEMENTAR Caracterizao: espectrometria de massa Aps a deteco das protenas, o procedimento subseqente consiste em identificar as macromolculas de interesse. Nas ltimas dcadas grandes avanos foram obtidos nessa identificao por meio da espectrometria de massa. As duas principais tcnicas para anlise de molculas biolgicas grandes so: espectrometria de massa com base na ionizao das protenas com laser, auxiliado por uma matriz, que analisa a massa atravs do tempo de vo dos ons no tubo de anlise, chamada MALDI-TOF (MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION-

TIME-OF-FLIGHT SPECTOMETRY) e a espectrometria de massa baseada na ionizao por pulsos eltricos em meio lquido (ESI Electro Spray Ionization).

Saiba mais... A Espectrometria de Massa pode ser utilizada para sequenciar fragmentos de peptdeos e Identificar protenas. In: ALBERTS et al. 2004.

Glossrio: - Protenas Monomricas protenas formadas por apenas uma cadeia polipeptdica. - Protenas Oligomricas protenas formadas por mais de uma cadeia polipeptdica; Estas so as protenas de estrutura e funo mais complexas.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Livro Texto HENEINE, I. F. Biofsica Bsica. Ed. ATHENEU, So Paulo, 2000. Bibliografia Complementar ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, A., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. Biologia Molecular da Clula. Ed. ARTMED, Porto Alegre, 2004. VANDER, I., SHERMAN, J.H., LUCIANO, D. Fisiologia Humana os mecanismos das funes corporais. Ed. GUANABARA KOOGAN, Rio de Janeiro, 2006. Web - Bibliografia http://www.google.com