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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃOUNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DOS ALIMENTOSCURSO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
PRODUÇÃO DE CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE POR MICRORGANISMOS
Fabiane Zwirtes CavalheiroPelotas/2008
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃOUNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DOS ALIMENTOSCURSO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
PRODUÇÃO DE CICLODEXTRINA GLICOSILTRANSFERASE POR MICRORGANISMOS
Relatório final de estágio apresentado à
Universidade Federal de Pelotas, sob a
orientação da Profª. Rosane da Silva Rodrigues,
como parte das exigências da disciplina de
Estágio Supervisionado, do Curso de Química de
Alimentos, para obtenção do título de Bacharel
em Química de Alimentos.
Fabiane Zwirtes CavalheiroPelotas/2008
ALUNAFabiane Zwirtes Cavalheiro
CONCEDENTERazão social: Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Setor de realização do estágio: Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Laboratório de Enzimologia
Endereço: Av. Bento Gonçalves, 9500
Fone: (51) 3308-7094
Web-site: www.ufgrs.com.br/icta
Supervisor de estágio: Plinho Francisco Hertz – Professor
ESTÁGIOÁrea de atuação: Enzimas
Período do termo de compromisso: 12 de agosto de 2008 a 07 de novembro de
2008
Número de horas de estágio: 512 horas
Nome do professor orientador: Rosane da Silva Rodrigues
Semestre e ano que o relatório foi apresentado: Relatório apresentado no 8º
semestre do Curso de Bacharelado em Química de Alimentos, referente ao 2º
semestre letivo de 2008.
3
Banca examinadora:Profª Mirian Ribeiro Galvão Machado
Profª Rosane da Silva Rodrigues
Msc. Taís Letícia Bernardi
4
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus pelo dom da vida.
Aos meus pais, por todo amor e carinho que sempre tiveram comigo e por
todo apoio e compreensão que demonstraram durante minha faculdade. Amo vocês
mais que tudo!
Ao meu irmão, pelo incentivo, dicas e socorro na hora de escrever o relatório.
Saudade de ti maninho!
Aos meus avós, pela “hospedagem”, respeito e amor que tiveram comigo
nesse período em que morei em Pelotas.
As minhas melhores amigas do mundo (Quarteto Fantástico!), sem vocês a
faculdade não teria a mínima graça!!! Obrigada pelo carinho, pelas palavras de apoio
e pela amizade incondicional. Amo muiiito vocês!
As minhas amigas de infância, Vá e Mai, por me mostrarem que a amizade
vai além de qualquer distância.
As “guerreiras”, Joh, Rê e Ana, que fizeram Porto Alegre bem mais divertida
pra mim!
Ao “pessoal” do ICTA e em especial ao laboratório 210, Manu e Cris, obrigada
por me acolherem tão bem! Com vocês aprendi que um bom ambiente de trabalho é
fundamental. Sentirei saudade da hora do cafezinho...
A minha irmã, chefa e amiga Van, não tenho palavras para agradecer tanta
dedicação e carinho comigo! Só posso agradecer a Deus por ter colocado um anjo
que nem tu na minha vida, das nossas risadas lembrarei pra sempre! Amo tu
negrinha!
Ao Profº Plinho, pela oportunidade e confiança depositada em mim e acima
de tudo pela amizade.
A Profª Rosane, pelo incentivo e orientação nesse trabalho.
Enfim, agradeço a todos os familiares e amigos que de alguma forma
ajudaram a vencer mais essa etapa da minha vida!
5
Sumário
Lista de Tabelas...........................................................................................................7
Lista de Figuras............................................................................................................9
Resumo ....................................................................................................................10
1 Introdução...............................................................................................................11
2 Objetivo...................................................................................................................13
2.2 Específicos..........................................................................................................13
3 Atividades Desenvolvidas.......................................................................................14
3.1 Cultivo dos microrganismos da coleção amazônica e do solo do estado do Rio
Grande do Sul............................................................................................................14
3.2 Ciclodextrinas.......................................................................................................15
3.3 Ciclodextrina glicosiltransferase...........................................................................17
3.4 Atividade enzimática.............................................................................................18
3.5 Purificação de CGTase........................................................................................22
3.5.1 Quantificação protéica (método de Lowry)........................................................24
3.5.2 Atividade enzimática antes da purificação........................................................26
3.5.3 Quantificação protéica (método de Lowry) antes da purificação......................27
3.5.4 Atividade enzimática após purificação..............................................................28
3.5.5 Quantificação protéica (método de Lowry) após purificação............................30
3.5.6 Atividade específica..........................................................................................31
3.5.7 Fator de purificação..........................................................................................31
3.5.8 Rendimento......................................................................................................32
3.6 Imoblização de CGTase.......................................................................................33
4 Sugestões...............................................................................................................35
5 Conclusão.......................................................................................................... .....36
6 Referências.............................................................................................................37
Apêndice.....................................................................................................................39
6
Lista de Tabelas
Tabela 1 Concentração de β-ciclodextrina para obtenção da curva
padrão........................................................................................................................19
Tabela 2 Valores de absorbância encontrados para bacilo de solo do Rio Grande do
Sul (amostra nº143)....................................................................................................20
Tabela 3 Valores de absorbância encontrados para bacilo de solo do Rio Grande do
Sul (amostra nº143) para diluição
1:20............................................................................................................................20
Tabela 4 Diluições utilizadas para curva padrão para proteína com Albumina de
Soro Bovino (BSA).....................................................................................................24
Tabela 5 Valores de absorbância encontrados para extrato enzimático de
ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) obtida de Bacillus circulans antes da
purificação..................................................................................................................26
Tabela 6 Valores de absorbância encontrados para o extrato enzimático de CGTase
produzida por Bacillus circulans diluído 20 vezes antes da
purificação..................................................................................................................26
Tabela 7 Valores de absorbância encontrados para quantificação protéica em
extrato enzimático de CGTase produzida por B. circulans antes da
purificação..................................................................................................................27
Tabela 8 Valores de absorbância de atividade enzimática encontrados para extrato
enzimático de CGTase produzida por B. circulans diluído 200 vezes após a
purificação..................................................................................................................28
Tabela 9 Valores de absorbância de atividade enzimática encontrados para extrato
enzimático de CGTase produzida por B. circulans diluído 2000 vezes após a
purificação..................................................................................................................29
7
Tabela 10 Valores de absorbância encontrados para quantificação protéica do
extrato enzimático de CGTase produzido por B. circulans após a
purificação..................................................................................................................30
Tabela 11 Rendimento da purificação do extrato enzimático de CGTase produzido
por B. circulans...........................................................................................................33
8
Lista de Figuras
Figura 1 Organograma parcial da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.......12
Figura 2 Estrutura da α, β e γ-ciclodextrina...............................................................15
Figura 3 Formação de complexo por encapsulação de molécula de p-xileno por β-
ciclodextrina................................................................................................................16
Figura 4 Perda proporcional de cor através do encapsulamento da fenoftaleína pela
ciclodextrina................................................................................................................18
Figura 5 Gráfico da curva padrão de β-ciclodextrina.................................................19
Figura 6 Fluxograma da purificação da enzima CGTase .........................................23
Figura 7 Gráfico da curva padrão de BSA.................................................................25
Figura 8 Fluxograma de imobilização de CGTase....................................................34
9
Resumo
CAVALHEIRO, Fabiane Zwirtes. Produção de ciclodextrina glicosiltransferase por microrganismos, 2008, 40f. Trabalho acadêmico apresentado ao curso de
Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas – UFPel.
Este trabalho objetiva apresentar as atividades desenvolvidas durante o
estágio curricular realizado no Laboratório de Enzimologia do Instituto de Ciência e
Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS.
Diferentes bactérias provenientes de uma coleção amazônica e do solo do RS foram
cultivadas para verificar a produção de ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase),
onde apenas a bactéria nº 143 proveniente do solo do Rio Grande do Sul apresentou
atividade enzimática. Devido ao achado tardio dessa bactéria não se pode realizar
testes para identificá-la. Os resultados apresentados neste trabalho referem-se a
valores encontrados pela equipe do laboratório de Enzimologia que realiza a
produção, purificação e imobilização de CGTase, através da bactéria Bacillus
circulans. A purificação da enzima chega a resultados positivos, uma vez que se
obtém 34,62 de fator de purificação (ou seja, a enzima fica 34 vezes mais pura).Os
objetivos desse estágio foram cumpridos deixando ainda portas abertas para a
realização de novos estudos referente a bactéria nº 143.
Palavras-chave: CGTase; produção; purificação; imobilização.
1
1. Introdução
O Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA) foi instituído pelo
Conselho Universitário da Universidade Federal do Rio Grande do Sul em 29 de
dezembro de 1958, tornando-se o primeiro Instituto de pesquisas científicas em
alimentos no Brasil. O ICTA compõe-se dos Departamentos de Ciências dos
Alimentos e de Tecnologias dos Alimentos, os quais atuam na áreas de ensino,
pesquisa e extensão em que são atendidos os cursos de graduação de Engenharia
de Alimentos, Nutrição, Farmácia, Agronomia, Engenharia Química, Química e
Biomedicina, e os cursos de pós-graduação de Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Engenharia Química, Veterinária, Agronomia, Bioquímica e Biotecnologia. A fig. 1
apresenta o organograma parcial da Universidade Federal do Rio grande do Sul.
O Laboratório de Enzimologia tem como linha de pesquisa principal a
produção de metabólitos microrgânicos de interesse alimentar, com ênfase no
desenvolvimento de técnicas de produção, purificação e utilização de enzimas.
Sendo assim, o Laboratório mantém uma coleção de microrganismos e busca,
através de pesquisas, novos metabólitos e enzimas provenientes de microrganismos
ambientais.
1
Figura 1. Organograma parcial da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Reitoria Pró Reitoria Superintendências
Secretarias Associações Unidades Universitárias e Institutos especializados
Conselho superior
Diretórios acadêmicos
Órgãos suplementares ICTA
1
2. Objetivos
2.1 Geral
O objetivo geral do estágio foi a aplicação e o aprimoramento dos
conhecimentos adquiridos no Curso de Química de Alimentos para a realização de
técnicas de microbiologia e de enzimologia e posterior avaliação do potencial de
produção da ciclodextrina glicosiltransferase em uma coleção de bactérias isoladas
de ambientes amazônicos e de solos do Rio Grande do Sul.
2.2 Específicos
- Realização de técnicas de microbiologia para manter e multiplicar os
microrganismos de interesse;
- Realização de técnicas de enzimologia para detectar e quantificar a
atividade de ciclodextrina glicosiltransferase;
- Realização de técnicas de purificação e análise de proteínas.
1
3. Atividades Desenvolvidas
Durante o estágio foram realizadas técnicas de microbiologia para o cultivo
dos microrganismos a serem testados; de produção da enzima ciclodextrina
glicosiltransferase (CGTase) e técnicas para quantificação e purificação do extrato
enzimático produzido.
3.1 Cultivo dos microrganismos da coleção amazônica e do solo do estado do Rio Grande do Sul
O laboratório de Enzimologia possui duas coleções de bactérias, uma é
proveniente de ambiente amazônico e a outra proveniente de solos do Rio Grande
do Sul. A coleção de ambientes amazônicos é composta por 100 bactérias, das
quais foram testadas 76. Já a coleção do solo é composta por 500 bactérias, das
quais foram testadas apenas 100 bactérias que já estavam identificadas como sendo
do gênero Bacillus,
Para a realização da inoculação, primeiramente é feito o preparo do meio de
cultura caldo BHI (Brain heart infusion – Infusão de cérebro e coração) onde foi
adicionada a quantidade de 25 mL de água mili-Q para 0,925g de caldo BHI,
seguindo as especificações do fabricante (Merck). Mistura-se a água e o extrato,
sendo este meio armazenado em um erlenmeyer para posterior autoclovagem. A
escolha do caldo BHI para o cultivo de microrganismos deve-se ao fato desse meio
ser, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), rico em
nutrientes de coração e cérebro, peptona e dextrose, além de ser fonte de
nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. Na autoclavagem os materiais ficam
expostos a uma temperatura de pelo menos 121ºC e uma pressão de 1atm durante
15 minutos. Após este tempo o ciclo é interrompido e espera-se baixar
temperatura/pressão para retirar o material de dentro da autoclave.
1
Para que haja segurança e evite-se contaminação, a inoculação é realizada
em capela de fluxo laminar vertical. As culturas estoque de bactérias amazônicas e
do solo são mantidas congeladas em suspensão de glicerol 20%. Utilizando uma
alça de platina estéril, são retiradas duas alçadas de cada cultura estoque e
colocadas no erlenmeyer com caldo BHI que é devidamente identificado de acordo
com o número da amostra.
Em seguida os erlenmeyers são levados para a incubadora de bancada
CONTEMP, durante 24 horas com agitação constante de 160rpm e temperatura de
37ºC. A leitura é realizada após esse período observando-se a cor do caldo BHI,
cuja cor original do meio é amarelo claro e límpido, o que indica que não houve
crescimento bacteriológico e o crescimento é detectado quando o caldo fica com
aspecto turvo, como pode ser visto no Apêndice A.
Após crescimento em BHI, retira-se uma alíquota (1mL) para inocular em um
meio contendo amido afim de estimular a produção de CGTase, conforme será
descrito mais adiante.
3.2 Ciclodextrinas
As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos, compostos de seis,
sete ou oito unidades de glicose unidas por ligações α-1,4, denominadas
respectivamente de α, β, γ-CD (Figura 2). Em razão da ciclização, as extremidades
redutora e não redutora se ligam, de forma que todas as ciclodextrinas são não
redutoras (CEREDA, 2003).
α- ciclodextrina β- ciclodextrina γ-ciclodextrina
Figura 2. Estrutura da α, β e γ-ciclodextrina.
Fonte: FIELDER; PAJATSCH; BÖCK, 1996.
1
As ciclodextrinas apresentam uma cavidade interna hidrofóbica e a região
externa hidrofílica. Tal característica favorece sua interação com uma variedade de
substâncias, formando complexos de inclusões (Figura 3) que alteram as
características físicas e químicas da molécula hóspede (GOMES APUD ALLEGRE E
DERATINI,1994; BENDER, 1986, SZEJTLI, 1997). Segundo Pszczola (1988), a
complexação ocorre quando uma molécula hospedeira preenche totalmente ou em
parte a cavidade interna da ciclodextrina. Um dos critérios para a complexação é o
tamanho da molécula a ser encapsulada, que deve ser compatível com a cavidade
da CD. Outro critério é a polaridade da molécula encapsulada e sua competição com
os demais compostos presentes no meio. Segundo Bertolini, Cereda e Chuzel
(1998), alguns dos efeitos da encapsulação de compostos por CDs são a proteção
contra oxidação, degradação pela luz, calor, perdas por volatilidade, redução ou
eliminação de gostos ou odores desagradáveis, estabilização de cores, vitaminas,
aromatizantes e saborizantes.
Na indústria alimentícia, as CDs podem ser utilizadas especificamente para:
extrair componentes específicos através de separação líquido-líquido favorecendo a
extração de componentes amargos de frutas cítricas ou proteínas hidrolisadas;
extração de cafeína do café ou chá; compostos de aroma oleosos podem ser
extraídos diretamente de fontes naturais, como alho e cebola, sem a necessidade da
utilização de solventes ou de processo de destilação; remoção de colesterol da
gordura do leite ou da gema de ovos; remoção de ácidos graxos livres de gorduras
para melhorar as propriedades de frituras; encapsulação de vitaminas lipofílicas e
vitaminas do complexo B para proteção contra oxidação, degradação térmica e
reações com outros componentes e para estabilização de óleos essenciais voláteis
de chá (CEREDA,2003).
Figura 3. Formação de complexo por encapsulação de molécula de p-xileno
por β- ciclodextrina.
1
Fonte: Pszczola, 1988.
3.3 Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase)
A ciclodextrina glicosiltransferase [CGTase; 1,4- α-D-glucana: 1,4-α-D-
glicopiranosil transferase; EC 2.4.1.19] é uma enzima extracelular da família 13 das
α-amilases. É produzida por microrganismos em sua maioria do gênero Bacillus
(também podendo seu produzida pelos gêneros Pseudomonas, Klebsiella,
Clostridium, Brevibacterium e Micrococcus), e possui a habilidade de converter o
amido e seus substratos em ciclodextrinas. Um aspecto característico das enzimas
da família das α-amilases é que todas utilizam o mecanismo de α-conservação,
porém seu substrato ou especificidade do produto é largamente variável (PINTO
apud VAN DER MAAREL et al., 2007).
O substrato mais freqüentemente utilizado para a produção de CGTase é o
amido solúvel, sendo também utilizadas outras fontes de amido como farelo de trigo
e caldo de maceração de milho (VAN DER MAAREL et al., 2002). Para que o amido
seja utilizado, tanto pelo homem como por bactérias e fungos, é necessária a
presença de enzimas que possuam a habilidade de degradação e síntese.
Os microrganismos que apresentaram crescimento em caldo BHI, conforme
descrito anteriormente, são utilizados em uma fermentação submersa a qual é
realizada em erlenmeyers de 500mL contendo 100mL de meio. Cada erlenmeyer é
inoculado com 1mL de um pré-inóculo de 24horas (meio BHI), incubado à 37°C sob
agitação de 150rpm. O meio utilizado tem como composição 0,5% de extrato de
levedura; 0,5% de peptona; 0,1% de K2HPO4; 0,02% de MgSO4; 1% de amido
solúvel. Para regular o pH do meio (9,7-10, que é o mais indicado para a produção
CGTase por Bacillus circulans segundo estudo prévio do grupo de pesquisa do
laboratório) utiliza-se Na2CO3 estéril na concentração de 150g.L-1 – adicionando-se
aproximadamente 1mL do carbonato de sódio para cada 50mL de meio de amido. O
turvamento do meio de cultivo após 18 horas de incubação À 37ºC e 180rpm (ver
Apêndice B) indica a presença de enzima amilácea, não sendo necessariamente
ciclodextrina glicosiltransferase.
1
3.4 Atividade enzimática
A confirmação de atividade enzimática é realizada através do método de
fenolftaleína (KANEKO et al., 1987), modificado por PINTO et al. (2007). Em tubos
de ensaio contendo 350μL de meio de cultivo (extrato enzimático), são adicionados
650μL de uma solução de amido solúvel em tampão fosfato (pH 6,0 – 0,1M) à 4%.
Os tubos são, então, incubados a 60°C por 15 minutos. A reação é interrompida com
a adição de 4mL de fenolftaleína diluída em Na2CO3 (13,5 g.L-1), na proporção de
1:100. É feita a leitura das amostras em espectrofotômetro Ultrospec 3100 pro na
faixa de 550nM. O método baseia-se no fato de que a fenolftaleína é encapsulada
em presença de ciclodextrina, com perda proporcional de cor como mostrado na
figura 4.
Figura 4. Perda proporcional de cor através do encapsulamento da
fenoftaleína pela ciclodextrina
A curva padrão (Figura 5) é feita a partir de uma solução 0,02g de β-
ciclodextrina em 50mL de tampão fosfato 0,1M pH 6, a partir dessa solução são
feitas diluições de 40 a 400μg.mL-1 (Tabela 1), obtendo assim uma curva com dez
pontos da seguinte maneira: 1mL de solução de cada diluição é colocado em tubo
1
de ensaio e adiciona-se 4mL de fenolftaleína (diluída em Na2CO3 13,5g.L-1) em cada
tubo. Procede-se a leitura em espectrofotômetro à 550nM.
Tabela 1. Concentração de β-ciclodextrina para obtenção da curva padrão
Μg.mL-
1
Absorbância550nM
Absorbância550nM
Absorbância550nM
Absorbância média
%= (branco – amostra)/
branco *100
400 0,654 0,651 0,661 0,6553 35,3
360 0,677 0,670 0,670 0,3723 32,6
320 0,711 0,699 0,719 0,7096 28,9
280 0,732 0,760 0,749 0,747 25,1
240 0,781 0,778 0,779 0,7793 21,9
200 0,807 0,800 0,818 0,8083 19,0
160 0,868 0,855 0,811 0,8446 15,3
120 0,890 0,896 0,932 0,906 9,2
80 0,928 0,926 0,937 0,9303 6,7
40 0,970 0,979 0,970 0,9733 2,5
Curva padrão de β-ciclodextrina
y = 0,0919x - 0,5801R2 = 0,9948
0,05,0
10,015,020,025,030,035,040,0
0 100 200 300 400 500Concentração (μg/mL)
% c
iclo
dext
rina
Figura 5. Gráfico da curva padrão de β-ciclodextrina.
1
Tanto a curva padrão, como o protocolo de atividade são desenvolvidos em
triplicata para verificar a reprodutividade dos resultados. Para identificar a
interferência de algum reagente é feito um “branco”, onde a enzima é inativada
através de fervura durante 4 minutos antes da adição de amido.
Dentre as bactérias analisadas somente foi encontrada produção enzimática
em uma amostra, identificada com o nº 143, sendo um bacilo proveniente de solo do
Rio Grande do Sul rico em matéria orgânica. Essa produção enzimática foi
comprovada pelo protocolo de atividade enzimática onde foi encontrada uma
absorbância média de 0,254 à 550nM. Esse valor (tabela 2) foi enquadrado dentro
da curva padrão realizada com β-ciclodextrina.
Tabela 2. Valores de absorbância encontrados para bacilo de solo do Rio Grande do
Sul (amostra nº143)
Amostra Absorbância (550nM)
Branco 0,995
1 0,253
2 0,251
3 0,257
Média das Absorbâncias 0,254
Os valores encontrados (tabela 3) na leitura em espectrofotômetro não
permitiram que os valores fossem enquadrados na curva padrão. Então fez-se
diluições até que o valor ficasse da faixa delimitada pela curva padrão, que
correspondeu a diluição de 1:20.
Tabela 3. Valores de absorbância encontrados para bacilo de solo do Rio Grande do
Sul (amostra nº143) para diluição 1:20
Amostra Absorbância (550nM)Branco 0,995
1 0,702
2 0,701
3 0,711
2
Média das Absorbâncias 0,705
Considerando que uma unidade de atividade da CGTase (U) é definida como
a quantidade de enzima que forma 1μg de ciclodextrina por minuto, fez-se os
seguintes cálculos para os valores encontrados:
% de ciclodextrina formada durante a reação
Absorbância branco – média absorbância da amostra x 100
Absorbância branco
0,995 – 0,705 x 100 = 29,1%
0,995
Calculando a equação da reta para o valor encontrado
y = 0,0919x – 0,5801
29,1 = 0,0919x – 0,5801
x = 322,96
Considerando que o tempo de reação à 60°C é de 15 minutos, e que a unidade de
atividade é dada em μg de ciclodextrina formada por minuto
322,96 ÷ 15 = 21,53U.mL-1
Multiplicando pelo valor de diluição
21,53 x 20 = 430,61U.mL-1
O valor de atividade da enzima produzida pela amostra 143 foi de
430,61U.mL-1. Resultado esse muito satisfatório uma vez que o último resultado
obtido pela equipe do laboratório que utiliza Bacillus circulans para produção da
enzima foi de 503,2U.mL-1.
2
3.5 Purificação de CGTase
A purificação da enzima (Figura 6) foi feita de acordo com Rosso (2005), o
qual utiliza amido como meio de adsorção. Primeiramente a enzima produzida foi
colocada em “falcon” (15mL) e centrifugada à 3000g por 15 minutos, para a retirada
de células e sólidos interferentes. Do sobrenadante foram retiradas alíquotas para
realizar a atividade enzimática e quantificação protéica pelo método de Lowry, que
será descrito mais adiante. Em seguida, 10mL do extrato enzimático (sobrenadante
da amostra) foi colocado em banho gelado e adicionado de 1,1g de amido de milho
e 0,16g de (NH4)2SO4. Solução que homogeneizada e novamente centrifugada a
3000g/10min. O sobrenadante dessa centrifugação foi descartado e o precipitado
(complexo enzima-amido) submetido a duas lavagens com 1mL de solução de
(NH4)2SO4 (1,6%) à 0°C cada, entre as quais a amostra foi centrifugada sob as
mesmas condições anteriores. A lavagem foi realizada para retirar impurezas que
ainda pudessem estar presentes na amostra assegurando o estabelecimento da
ligação amido – enzima. Segundo Scopes (1994) este fenômeno é denominado
salting out ou precipitação por sais, onde os sais desidratam as proteínas atraindo
as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as
moléculas protéicas. A solubilidade de uma proteína depende da quantidade de
água disponível ao redor de seus grupos iônicos (quanto menor for o número de
moléculas de água, menor será a solubilidade). Após a lavagem o sobrenadante foi
novamente descartado e ao precipitado adicionado 1mL de α-CD 10mM esta mistura
foi homogeneizada e colocada em shaker à 40°C durante 30 minutos, em seguida,
realizada a centrifugação à 8rpm por 15 minutos. O sobrenadante (enzima livre de
amido) foi colocado em tubos Amilcon Ultra (ultrafiltração) até o máximo de 4mL por
tubo, os quais foram novamente centrifugados durante 10 minutos à 5000g. O
material filtrado foi descartado e à enzima aderida a membrana adicionados 4mL de
tampão fosfato 0,1M pH 6 e submetido a nova centrifugação nas condições
anteriores para eliminar qualquer impureza ainda existente. A enzima extraída e
purificada ficou retida na membrana e novos testes de atividade e quantificação
protéica foram realizados para calcular o rendimento do procedimento de
purificação.
2
Figura 6. Fluxograma da purificação da enzima CGTase
12-13mL do cultivo
Centrifugação 3000g/15min
Adição de 1,1g de amido de milho e 0,16g
de (NH4)2SO4
Centrifugação 3000g/10min
Lavagem com (NH4)2SO4 1,6% 0°C
Centrifugação 3000g/10min
Lavagem com (NH4)2SO4 1,6% 0°C
Centrifugação 3000g/10min
Shaker 40°C/30min
Centrifugação 8rpm/15min
Atividade enzimática
Ultrafiltração
Quantificação protéica (método de Lowry)
2
3.5.1 Quantificação protéica (método de Lowry)
A quantificação de proteína nas amostras foi realizado pelo método de Lowry
que consiste em duas reações colorimétricas: a reação de biureto, na qual os íons
Cu2+ interagem com as ligações peptídicas originando uma coloração azul intensa; E
a reação que envolve a adição do reagente de Follin-Ciocalteau em uma mistura
complexa de sais inorgânicos cuja reação com a tirosina e o triptofano resultam em
uma coloração azul esverdeada intensa. A combinação dessas duas reações
fornece um teste muito mais sensível que as duas reações isoladamente (LOWRY et
al., 1951). Para a realização desse método é necessário primeiramente preparar os
reagentes: A- sulfato de cobre pentahidratado CuSO4 . 5H2O 0,5%; B – hidróxido de
sódio 0,1N acrescido de carbonato de sódio 2% e tartarato de sódio e potássio
0,1%; C – Follin- Ciocalteau, diluído 1:1 com água destilada. Estes reagentes são
armazenados em geladeira.
Preparados os reagentes foi obtida uma curva padrão (Figura 7) para proteína
utilizando BSA (Albumina do Soro Bovino) com diluições de 0,1 a 1mg.mL-1 (Tabela
4).
Tabela 4. Diluições utilizadas para curva padrão para proteína com Albumina de
Soro Bovino (BSA)
Diluição
Reagente 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sol. Alcalina
(mL)
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
H2O
(μL)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Albumina (μL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Follin-
Ciocalteau
(μL)
300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300
2
Como mostrado na Tabela 4, 100μL de cada diluição são adicionados de
2,5mL de uma solução alcalina (reagente A + reagente B, na proporção de 1:50) e
armazenados por 10 minutos à 37°C. Decorrido esse tempo adicionou-se 300μL do
reagente C e após homogeneização as amostras são armazenadas em local escuro
por 30 minutos. Em seguida procedeu-se a leitura em espectrofotômetro à 750nM. A
leitura das absorbâncias dessas diluições são plotadas em gráfico através do
programa Excel® (Figura 5), cujo intervalo deve abranger os valores de proteína
encontrados para a amostra analisada. Para o extrato enzimático proveniente do
cultivo faz-se o mesmo procedimento, substituindo 100μL de BSA por 100μL da
amostra.
y = 0,4172x + 0,0049R2 = 0,992
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentração
Abso
rbân
cia
0
Figura 7. Gráfico da curva padrão de BSA.
Mesmo tendo encontrado uma bactéria produtora de CGTase durante a
varredura realizada, não foi possível purificar e nem quantificar a proteína dessa
amostra devido ao término do estágio. Sendo assim, os resultados apresentados
neste relatório referem-se à CGTase produzida pela equipe do laboratório, através
da bactéria Bacillus circulans.
Antes da purificação foram realizadas análises de atividade (Tabela 5) e
quantificação protéica para o extrato enzimático (sobrenadante do cultivo) obtendo
os seguintes resultados:
2
3.5.2 Atividade enzimática antes da purificação
Tabela 5. Valores de absorbância encontrados para extrato enzimático de
ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) obtida de Bacillus circulans antes da
purificação
Amostra Absorbância (550nM)
Branco 1,005
1 0,296
2 0,291
3 0,296
Média das Absorbâncias 0,294
Como esse valor (0,294) não fica enquadrado na curva padrão, faz-se
diluições até encontrar um valor adequado, neste caso a diluição foi de 1:20 (tabela
6).
Tabela 6. Valores de absorbância encontrados para o extrato enzimático de CGTase
produzida por Bacillus circulans diluído 20 vezes antes da purificação
Amostra Absorbância (550nM)
Branco 0,995
1 0,662
2 0,656
3 0,650
Média das Absorbâncias 0,656
% de ciclodextrina formada durante a reação
Absorbância branco – média absorbância da amostra x 100
Absorbância branco
0,995 – 0,656 x 100 = 34,1%
0,995
2
Calculando a equação da reta para o valor encontrado
y = 0,0919x – 0,5801
34,1 = 0,0919x – 0,5801
x = 377,4
Considerando que o tempo de reação à 60°C é de 15 minutos, e que a unidade de
atividade é dada em μg de ciclodextrina formada por minuto
377,96 ÷ 15 = 25,15U/mL
Multiplicando pelo valor de diluição, obtem-se:
25,15 x 20 = 503,15U/mL
Esse valor mostra que antes da purificação há 503,15 unidades de
ciclodextrina por mili litro de amostra.
3.5.3 Quantificação Protéica (método de Lowry) antes da purificação
Os valores obtidos das leituras em espectrofotômetro para a quantificação
protéica estão expressos na tabela 7.
Tabela 7. Valores de absorbância encontrados para quantificação protéica em
extrato enzimático de CGTase produzida por B. circulans antes da purificação
Amostra Absorbância (750nM)
1 0,169
2 0,169
3 0,167
Média das Absorbâncias 0,168
Confrontando este resultado com a equação da curva padrão, percebe-se que o
mesmo está enquadrado no gráfico, obtendo-se o seguinte resultado:
2
y = 0,4172x + 0,0049
0,168 = 0,4172x + 00049
x = 0,39mg/mL de proteína
O valor encontrado indica que antes da purificação há 0,39 mili gramas de
proteína por mili litro de amostra.
Após a purificação são realizadas novas análises de atividade enzimática e
quantificação protéica para a enzima purificada, obtendo os seguintes resultados:
3.5.4 Atividade enzimática após a purificação
A atividade enzimática após a purificação é realizada com a amostra diluída
200 vezes (Tabela 8), isso se deve ao fato de o produto da purificação ser obtido em
quantidade muito pequena e, para que possam ser analisados os parâmetros
desejados (atividade enzimática e quantificação de proteína), faz-se necessário diluir
ainda mais a amostra com adição de tampão fosfato (0,1M pH 6), na proporção de
1:10 (portanto a análise é feita com a enzima diluída 2000 vezes, como mostrado na
tabela 9). Devido a alta taxa de purificação, a enzima torna-se mais concentrada,
portanto realiza-se a verificação da atividade já com a enzima diluída.
Tabela 8. Valores de absorbância de atividade enzimática encontrados para extrato
enzimático de CGTase produzida por B. circulans diluído 200 vezes após a
purificação
Amostra Absorbância (550nM)
Branco 0,937
1 0,245
2 0,259
3 0,246
Média das Absorbâncias 0,250
Entretanto, esse valor ainda não se enquadra na curva, tornando necessário
realizar mais diluições, até encontrar um valor adequado (tabela 9).
2
Tabela 9. Valores de absorbância de atividade enzimática encontrados para extrato
enzimático de CGTase produzida por B. circulans diluído 2000 vezes após a
purificação
Amostra Absorbância (550nM)
Branco 0,998
1 0,705
2 0,698
3 0,698
Média das Absorbâncias 0,700
% de ciclodextrina formada durante a reação
Absorbância branco – média absorbância da amostra x 100
Absorbância branco
0,998 – 0,700 x 100 = 29,9%
0,998
Calculando a equação da reta para o valor encontrado
y = 0,0919x – 0,5801
29,9 = 0,0919x – 0,5801
x = 331,7
Considerando que o tempo de reação à 60°C é de 15 minutos, e que a unidade de
atividade é dada em μg de ciclodextrina formada por minuto
331,7 ÷ 15 = 22,11U/mL
Multiplicando pelo valor de diluição
22,11 x 2000 = 44222,12U/mL
2
3.5.5 Quantificação protéica (método Lowry) após purificação
Os valores obtidos das leituras em espectrofotômetro para a quantificação
protéica da amostra diluída 10 vezes estão expressos na tabela 10.
Tabela 10. Valores de absorbância encontrados para quantificação protéica do
extrato enzimático de CGTase produzido por B. circulans após a purificação
Amostra Absorbância (750nM)
1 0,052
2 0,046
3 0,040
Média das Absorbâncias 0,046
Confrontando este resultado com a equação da curva padrão, percebe-se que
o mesmo está enquadrado no gráfico, obtendo-se o seguinte resultado:
y = 0,4172x + 0,0049
0,046 = 0,4172x + 00049
x = 0,099mg/mL
Multiplicando pelo fator de diluição
0,099 x 10 = 0,99mg/mL de proteína
Na tabela 11, além dos parâmetros analisados (atividade e proteína), podem
ser encontrados os valores de atividade específica – valor de atividade enzimática
por concentração de proteína, sendo que quanto maior o valor de atividade
específica menor quantidade de outras proteínas, portanto mais purificada está a
enzima. Isto pode ser comprovado pelo fator de purificação, que mostra que a
enzima está trinta vezes mais purificada.
3
3.5.6 Atividade específica
A atividade específica é realizada para medir a quantidade de atividade
enzimática por concentração de proteína, e é calculada antes e depois da
purificação para comparação dos resultados
Antes da purificação
Atividade (U/mL) = 503,15 =1290,13
Proteína (μg/mL) 0,39
Após a purificação
Atividade (U/mL)
Proteína (μg/mL)
44222,12 = 44668,81
0,99
Os valores encontrados mostram que a atividade específica aumentou de
1290,13 para 44668,81, significando que a enzima está realmente mais purificada,
livre de outras proteínas interferentes.
3.5.7 Fator de purificação
O fator de purificação mostra quantas vezes a enzima está purificada, neste
caso o valor obtido mostra que a CGTase ficou 34,62% mais pura.
Atividade específica antes da purificação
Atividade específica pós purificação
44668,81 = 34,62%
1290,13
3
3.5.8 Rendimento
Para esse cálculo é necessário considerar o volume do qual se retirou
alíquota para realizar o ensaio de atividade, uma vez que o resultado encontrado é
proporcional a esse volume. Ou seja, para medir atividade enzimática antes da
purificação (bem como a proteína contida), partiu-se de 90mL de extrato enzimático
(sobrenadante da centrifugação do meio de cultura para eliminar células e outros
interferentes). Já após a purificação, foi obtido um total de 0,225mL de enzima, a
qual foi diluída para poder realizar as análises desejadas.
Volume x atividade (antes purificação) = 100%
90 x 503,15 = 45283,5
Volume x atividade (depois purificação) = X
0,225 x 44222,12 = 9949,98
45283,5 ------------ 100%
9949,98 ------------ X
X= 21,97%
Sendo assim, o rendimento final da purificação foi de 21,97%. Esse valor
representa que após a purificação, foi possível recuperar aproximadamente 22% da
atividade enzimática. A equipe de pesquisa se mostrou satisfeita com o valor obtido
e procura repeti-lo para que este resultado tenha reprodutibilidade. A tabela 11 é um
resumo de todos os resultados obtidos.
3
Tabela 11. Rendimento da purificação do extrato enzimático de CGTase produzido
por B. circulans
Purificação
Volume (mL)
Atividade (U. mL-1)
Proteína (μg/mL)
Atividade específica
Fator de purificação
(%)
Rendimento (%)
Antes 90 503,15 0,39 1290,13 ---- 100
Depois 0,225 44222,12 0,99 44668,81 34,62 21,97
3.6 Imobilização de CGTase
Visando o reaproveitamento de resíduos de polietileno tereftalato (PET) e a
reutilização da enzima na indústria alimentícia, a equipe do laboratório de
Enzimologia utiliza para a imobilização (Figura 8) a metodologia de OLIVEIRA
(1989), onde fragmentos de PET (10g) segmentados nas proporções de 5x5x1mm
são incubados com 30mL de metanol contendo 3mL de hidrazina hidratada à 40°C
por 17 horas. Logo após o PET é lavado com metanol e metanol 90%v/v
sucessivamente por duas vezes cada. Decorrida a lavagem, é adicionado 24mL de
HCl 0,6N e 3mL de NaNO2 5% 0,7M aos PET’s, que são expostos à 25°C durante 4
horas sob agitação 120rpm. Depois desse período faz-se uma nova lavagem água
destilada (duas vezes) e NaCl 0,1M (duas vezes). Antes de colocar os fragmentos
em contato com a enzima, lava-se os mesmos com água destilada. Os PET’s são
colocados em contato com 30mL de enzima diluída em tampão fosfato 0,1M pH 6,
sob refrigeração em agitador magnético por 24 horas.
Após esse procedimento de imobilização, faz-se cinco lavagens consecutivas
dos PET’s com 30mL de água destilada cada, sendo que as águas de lavagens são
armazenadas em recipientes diferentes procedendo-se as análises de atividade e
quantificação protéica para cada uma delas com o intuito de verificar o quanto de
enzima foi perdida durante a lavagem e para analisar a eficácia da imobilização
realiza-se o método de atividade enzimática para os PET’s. Essa técnica esta sendo
padronizada no laboratório, portanto, não há resultados para serem apresentados
até o presente momento.
3
Figura 8. Fluxograma de imobilização de CGTase
10g de PET(5x5x1mm)
Adição de 30mL de metanol + 3mL de hidrazina hidratada
Shaker 40°C/ 17 horas
Lavagem com metanol(2x)
Lavagem com metanol90%
(2x)
Adição de 24mL de HCl 0,6N + 3mL NaNO2 5%
0,7M
Shaker 25°C/ 120rpm/ 4horas
Lavagem com NaCl 0,1M (2x)
Lavagem com água destilada (4x)
Imobilização 4ºC em agitador magnético
3
4. Sugestões
Sugere-se à equipe do Laboratório de Enzimologia que sejam realizados
testes para identificar o gênero e espécie da bactéria 143 proveniente de solo do Rio
Grande do Sul, para que estudos mais aprofundados possam ser desenvolvidos.
Ao Curso de Bacharelado em Química de Alimentos, sugere-se que seja
inserida na grade curricular uma cadeira específica sobre enzimas, devido a
importância deste tema na indústria alimentícia.
3
5. Conclusão
O estágio curricular permitiu colocar em prática os conhecimentos adquiridos
durante o Curso, bem como aprofundar assuntos que não foram enfatizados na
grade curricular.
Com o desenvolvimento desse trabalho foi possível participar da rotina de um
laboratório de pesquisa e, através de contato/convivência com doutorandos e
mestrandos acompanhar os trabalhos e expandir conhecimentos em outras áreas
que não a do estágio.
Os objetivos foram alcançados deixando portas abertas para seguirem os
estudos nessa área.
3
6. Referências
ALVES-PRADO, H. F.; CUCOLO, G.; GOMES, E.; SILVA, R. Estudo da produção de
ciclodetrina glicosiltransferase (CGTase) pela linhagem bacteriana termofilica 69. In:
XIV Simpósio Nacional de Fermentações (SINAFERM), Florianópolis. Anais do SINAFERM, 2003. v. 1. p. 1-1.
ANVISA. Descrição dos meios de cultura empregados nos exames microbiológicos,
disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf>.
Acesso em 24 set. 2008.
CEREDA, M.P. Tecnologias, usos e potencialidades de tuberosas amiláceas Latino Americanas. São Paulo: Fundação Cargill, v.3, 2003. 711p.
FIEDLER, G.; PAJATSCH, M.; BÖCK, A. Genetics os a novel raw starch utilization
pathwat present in Klebsiella oxytoca. Journal of Molecular Biology London,
v.256, p. 279-291, 1996.
KANEKO, T; KATO, T.; NAKAMURA, N.; HORIKOSHI, K. Spectrophotometric
determination of cyclization activity of β-cyclodextrin-forming cyclodextrin
glucanotransferase. Journal of Japanese Society of Starch Science, Tokyo, v.34,
p.44-48, 1987.
LOWRY, O. H.; ROSENBOUGH, N. J.; FARR, R. L.; RANDALL, R. J.; Protein
measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry.
v.193, p.265–275, 1951.
3
OLIVEIRA, E.A; SILVA, M.P.C; FIGUEREDO, M.B.Z; CARVALHO, L.B Jr.
Imobilization od proteins on plates of Dacron. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.22, p.109-114, 1989.
SCOPES, Robert K. Protein Purification: principles and practice. 3ed. New York:
Springer, p.76-85, 1994.
PINTO, Flávia S. T. Produção de ciclodextrina glicosiltransferase pela bactéria alcalófica Bacillus circulans ATCC 21783: cultivo em batelada, batelada alimentada e estado semi-sólido, Brasil. 2007. 70f. Tese (Mestrado em Ciência e
Tecnologia de Alimentos)- Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
PSZCZOLA, D.E. Production and potential food applications of ciclodextrins. Food Technology, Chigago, v.42, n.1, p.96-100, 1988.
ROSSO, A.; FERRAROTTI, S.; MIRANDA, M.V; KRYMKIEWICZ, N; NUDEL, B.C;
CASCONE, O.;Rapid affinity purification processes for cyclodextrin
glycosyltransferase from Bacillus circulans. Biotechnology Letters, Buenos Aires,
v.27, p.1171-1175, 2005.
VAN DER MAAREL, M.J.E.C.; VAN DER VEEN, B.; UITDEHAAG, J.C.M.;
LEEMHUIS,H.; DIJKHUIZEN, L. Properties and applications os starch-converting
enzymes of the α-amylase family. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v.94, p.
137-155, 2002.
3
APÊNDICE
3
APÊNDICE A – Fotos da produção dos microrganismos
Meio de cultura BHI translúcido, antes de ser inoculado.Fonte: Arquivo do autor
Meio de cultura BHI turvo, após 24 horas de incubação.Fonte: Arquivo do autor
4
APÊNDICE B – Fotos da produção e atividade enzimática de CGTase
Meio de amido translúcido, antes de ser inoculadoFonte: Arquivo do autor
Meio de amido turvo, após 18 horas de incubaçãoFonte: Arquivo do autor
4
APÊNDICE B – Fotos da produção e atividade enzimática de CGTase
Shaker utilizado para incubação dos microrganismosFonte: Arquivo do autor
Tubos de ensaio imersos no banho-maria à 60°C durante a atividade enzimática
Fonte: Arquivo do autor
4
APÊNDICE C – Fotos da purificação da CGTase
Falcons após a primeira centrifugação durante a purificação da CGTaseFonte: Arquivo do autor
Tubos de ultrafiltração Amilcon Ultra, após centrifugação, durante a purificação de CGTase
Fonte: Arquivo do autor
4
