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o
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
BRUNO SILVA ANDRADE
MODELAGEM POR HOMOLOGIA DAS DNA E RNA POLIMERASES DO PLASMÍDEO MITOCONDRIAL DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA E SUAS RELAÇÕES
FILOGENÉTICAS COM OUTRAS POLIMERASES FÚNGICAS E VIRAIS
Feira de Santana, BA
Fevereiro de 2008
2
BRUNO SILVA ANDRADE
MODELAGEM POR HOMOLOGIA DAS DNA E RNA POLIMERASES DO PLASMÍDEO MITOCONDRIAL DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA E SUAS RELAÇÕES
FILOGENÉTICAS COM OUTRAS POLIMERASES FÚNGICAS E VIRAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto
Co-orientadores: Prof. Dr. Alex Guterres Taranto
Profa. Dra. Alessandra S. Schnadelbach
Feira de Santana, BA
Fevereiro de 2008
3
LISTA DE FIGURAS
Figura Legenda Página
1
Ciclo de vida de Moniliophthora perniciosa. A parte azul e a parte laranja correspondem respectivamente às fases biotrófica e saprofítica do fungo durante a sua interação com o cacaueiro (Theobroma cacao). Adaptado de LOPES (2005).
28
2 Estrutura dos plasmídeos mitocondriais encontrados em espécies de fungos. Adaptado de KENNEL (2007). 30
3 Tipos de plasmídeos mitocondriais encontrados em fungos filamentosos. Adaptado de GRIFFITHS (1995). 31
4
Estrutura do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa, mostrando as regiões codificantes para DNA e RNA polimerases e os terminais invertidos repetitivos (TIR). Fonte: FORMIGHIERI et al., 2007.
35
5
Evolução endossimbiótica e árvore dos genomas. A. Hospedeiro que adquiriu a mitocôndria; B. Proteobacteria ancestral; C. Origem da mitocôndria; D. Diversificação inicial das linhagens eucarióticas e transferência de genes para o hospedeiro; E. Cianobactéria ancestral; F. Protozoário ancestral; G. Origem dos plastídios; H. Diversificação inicial de plantas e algas e transferência de genes para o hospedeiro. Adaptado de TIMMIS et al. (2004).
39
6
Vírus e outros elementos genéticos móveis: as estratégias de replicação, tamanho do genoma, ecologia global, e proteínas típicas. Tr, transcrição; T, tradução; R, replicação; E, encapsulação; A, Archaea; B, Bacteria; F, Fungi; Mz, Metazoa; P, plantas; UE, eucariotos unicelulares. RdRp, RNA dependente de RNA polimerase; JRC, proteína de encapsulamento; RT, transcriptase reversa; RCRE, endonuclease presente no ciclo de replicação. Adaptado de KOONIN (2006).
41
7
Esturura da RB69 DNA polimarese, homóloga da Φ29 DNA polimerase, apresentando os três subdomínios funcionais – Palma, Dedos e Polegar, e mostrando o processo de ligação ao molde de DNA e aos nucleotídeos. Adaptado de TRUNIGER et al. (2003.).
47
8 Estrutura do Motivo B da RB69 DNA polimerse, homóloga da Φ29 DNA polimerase, apresentado sua relação no processo de polimerização do DNA. Adaptado de TRUNIGER et al. (2003).
47
9 Estrutura da T7 RNA polimerase, mostrando os três subdomínios: Palma, Polegar e Dedos. Adaptado de JERUZALMI; STEITZ (1998).
50
4
10 Relação entre a resolução obtida para um determinado modelo protéico e suas aplicações. Adaptado de BAKER; SALI (2001). 59
11 Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de torção e interação entre átomos não ligados. 61
12 Superfície de Energia Potencial. 63
13 Etapas realizadas no processo geral de Modelagem por Homologia. 68
14 Etapas realizadas nos processos de refinamento e Dinâmica Molecular das estruturas 3D. 69
15
Região conservado no alinhamento entre a seqüência primária da DPO do plasmídeo de M.perniciosa e o molde 1XHX, apresentando o motivo B. B. Parte conservada no alinhamento entre a seqüência primária da RPO do plasmídeo de M.perniciosa e o molde 1ARO, apresentando o domínio palma. A coloração vermelha em determinadas regiões indica um alinhamento de boa qualidade.
80
16 Predição da estrutura secundária da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa. 81
17 Predição da estrutura secundária da RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa. 82
18 Estrutura secundária da DNA polimerase do plasmídeo de M.perniciosa. 83
19 Sítio ativo da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa, mostrando os motivos conservados. 84
20 Motivo B, responsável pela ligação da DPO à fita de DNA molde e seleção das dNTPs. 85
21 Motivo Dx2SLYP, importante no processo da polimerização da fita de DNA. 85
22 Motivo YxDTDS, constituinte do sítio ativo da DPO do plasmídeo de M. perniciosa. 86
23 Motivo Tx2A/GR, constituinte do sítio ativo da DPO do plasmídeo de M. perniciosa. 86
24 Motivo KxY, presente na região C-terminal da DPO do plasmídeo de M. perniciosa, participante do processo de polimerização do DNA.
87
25 Estrutura secundária da RNA polimerase do plasmídeo de M. 88
5
perniciosa.
26 Sítio ativo da RNA polimerase do plasmídeo de M.perniciosa, presentes nos domínios Palma (verde) e Dedos (vermelho). 88
27
A. Gráfico relacionando os valores de cutoff por energia relativa da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa. B. Gráfico relacionando os valores de cutoff por energia relativa da RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa.
89
28 Gráfico de Ramachandran, gerado pelo PROCHECK, para a estrutura inicial da DPO do plasmídeo de M. perniciosa. 90
29
Validação por resíduo da 1DPO. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
91
30
Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1DPO. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam as áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
92
31
Qualidade da cadeia principal do modelo 1DPO: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
93
32
Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1DPO. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
94
33
Gráfico de validação da estrutura inicial da DPO, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto que as regiões verdes representam valores baixos.
95
34 Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK, para a estrutura inicial da RPO do plasmídeo de M. perniciosa. 96
35
Validação por resíduo da 1RPO. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
96
6
36
Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1RPO. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
97
37
Qualidade da cadeia principal do modelo 1RPO: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
98
38
Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1RPO. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
99
39
Gráfico de validação da estrutura inicial da RPO, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto que as regiões verdes representam valores baixos.
100
40 Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK para o modelo da DPO, após o refinamento e Dinâmica Molecular a 300 e 300 ps do plasmídeo de M .perniciosa.
101
41
Validação por resíduo da 1DPOC. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
102
42
Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1DPOC. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
103
43
Qualidade da cadeia principal do modelo 1DPOC: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; N: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: - energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
104
44 Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1DPOC. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional
105
7
Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
45
Gráfico de validação do modelo da DPO, após refinamento e Dinâmica Molecular, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto regiões verdes, valores baixos.
106
46 Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK para o modelo da RPO, após o refinamento e Dinâmica Molecular a 300 K e 300 ps do plasmídeo de M. perniciosa.
107
47
Validação por resíduo da 1RPOC. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
107
48
Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
108
49
Qualidade da cadeia principal do modelo 1RPOC: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
109
50
Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1RPOC. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
110
51
Gráfico de validação do modelo da RPO, após refinamento e Dinâmica Molecular a 300 K e 300 ps, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto regiões verdes, valores baixos.
111
52 Estrutura do plasmídeo mitocondrial de Neurospora intermedia. Fonte: http://www.ncbi.nih.gov (2007). 112
53 Estrutura do plasmídeo mitocondrial de Spizellomyces punctatus. Fonte: http://www.ncbi.nih.gov (2007). 112
54 Filograma de consenso de maioria, de uma análise de Parcimônia dos contigs DPO/RPO de seqüências nucleotídicas de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos
114
8
correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
55
Filograma gerado a partir de análise de Distância, utilizando contigs de DNA de DPO/RPO de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
115
56
Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências nucleotídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
116
57
Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, para os contigs DPO/RPO, utilizando seqüências de aminoácidos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
117
58
Filograma de consenso de maioria, por Distância, utilizando seqüências de aminoácidos dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
118
59
Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
119
60
Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
120
61
Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
121
62
Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
122
63
Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
123
64 Filograma de consenso de maioria, por Distância, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte
124
9
dado por valores percentuais de bootstrap.
65
Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
125
66
Filograma de consenso de maioria gerado por análise Bayesiana, utilizando seqüências de DNA dos contigs DPO/RPO de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
126
67
Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, utilizando seqüências aminoacídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos mitocondriais fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
127
68
Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, para as DNA polimerases de plasmídeos fúngicos mais polimerases virais, utilizando seqüências de aminoácidos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.1
128
69
Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, para seqüências aminoacídicas das RNA polimerases de plasmídeos fúngicos mais RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
129
70 Estrutura secundária da 1DPOC. 148
71 Estrutura secundária da 1RPOC. 148
72 Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, para as DNA polimerases de plasmídeos fúngicos, utilizando seqüências nucleotídicas.
149
73 Filograma gerado a partir de Distância, utilizando seqüências nucleotídicas das DNA polimerases dos plasmídeos fúngicos. 150
74 Filograma das DPOs de plasmídeos fúngicos, utilizando seqüências de DNA, gerado a partir de inferência por Máxima Verossimilhança.
151
75 Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia para as seqüências aminoacídicas das DNA polimerases de plasmídeos fúngicos.
152
76 Filograma gerado por Distância, para as seqüências 153
10
aminoacídicas das DPOs de plasmídeos fúngicos.
77 Filograma de Máxima Verossimilhança para as seqüências aminoacídicas de DPOs dos plasmídeos fúngicos. 154
78 Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências de DNA das RPO dos plasmídeos fúngicos. 155
79 Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências de DNA das RPOs de plasmídeos fúngicos. 156
80 Filograma de Máxima Verossimilhança para as seqüências nucleotídicas das RPOs dos plasmídeos fúngicos. 157
81 Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando as seqüências de aminoácidos das RNA polimerases de plasmídeos fúngicos.
158
82 Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências de aminoácidos das RPOs de plasmídeos fúngicos. 159
83 Filograma de Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas das RPOs de plasmídeos mitocondriais fúngicos. 160
84 Filograma Bayesiano de consenso de maioria, para as seqüências nucleotídicas das DNA polimerases dos plasmídeos mitocondriais de fungos.
161
85 Filograma Bayesiano de consenso de maioria, das DPOs de plasmídeos mitocondriais de fungos, utilizando seqüências de aminoácidos.
162
86 Filograma Bayesiano de consenso de maioria para as seqüências nucleotídicas das RPOs dos plasmídeos mitocondriais de fungos. 163
87 Filograma bayesiano de consenso de maioria, para seqüências aminoacídicas das RNA polimerases dos plasmídeos mitocondriais de fungos.
164
11
LISTA DE TABELAS
Tabela Legenda Página
1 Moldes selecionados através de BLASTP. 79
2 Moldes selecionados através de Threading. 79
3 Plasmídeos mitocondriais lineares do clado fúngico completamente seqüenciados. 112
4 Polimerases virais utilizadas nas análises filogenéticas. 113
12
Aos meus Pais, minha razão de existir. Ao
meu irmão, meu verdadeiro amigo. A
Paloma, meu verdadeiro amor. Vocês
contribuíram muito para realização de tudo
isso.
13
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me ter permitido chegar até aqui.
Ao Dr. Alex Taranto, pela amizade, e pela excelente orientação não só na
modelagem molecular, mas também em como se tornar um pesquisador mais
competente e eficiente.
A Dra. Alessandra Schnadelbach pela amizade e excelente (e exigente) orientação.
A Dra. Shaila Roessle, pela orientação, pela amizade e por ter me auxiliado nos
primeiros passos na modelagem molecular.
Ao Dr. Luciano Paganucci, pela amizade e pelas orientações que sempre me deu ao
longo dos anos, e pela ajuda quanto à parte de filogenia.
A minha amiga Catiane Souza, por ter se mostrado sempre prestativa, auxiliando no
meu crescimento como profissional e como pessoa, pelas horas perdidas (ou não) à
frente do computador discutindo assuntos da biotecnologia e me trazendo muito de
sua experiência, por ter me encaminhado na Biologia Molecular.
Ao meu amigo Anderson Rocha, pelo companheirismo e pelas várias atividades
complementares.
Ao meu “irmão” Wagner Soares, por ter me ajudado no momento que mais precisei,
pela amizade, pelos momentos de descontração, e pela honestidade que sempre
demonstrou.
Ao meu amigo Cristiano Villella, pelas orientações na Biologia Molecular, por ter me
dado força sempre que precisei estar na UESC.
Ao meu amigo Helton Ricardo, por cuidar tão bem do curso e dos alunos do
PPGBiotec, pela confiança, e pelos inúmeros momentos de descontração.
A Adriana Estrela, pela amizade e pelos momentos de descontração.
A todos os meus amigos do PPGBiotec: Indira Nobre, Rafaela Galante, Lidiane
Oliveira, Carlos Líverton, Viviane Galvão, Gisele Rocha, Marcelo Diniz, Geruza
Ceita, Manoelito Coelho e Rodrigo Queiroz.
A todos aqueles que fazem parte do LAPEM, por terem auxiliado direta ou
indiretamente para realização deste trabalho.
A Teo e a Zezé (HUEFS), por estarem sempre presentes na minha vida, como
amigas e como “orientadoras”.
A todos do LMM (UEFS), pelas inúmeras vezes que cederam seus computadores
para submissão dos meus cálculos de modelagem molecular.
14
Ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da UEFS/FIOCRUZ, pelo
excelente suporte para realização deste trabalho.
A FAPESB, pela concessão da minha bolsa de mestrado. Ao CNPq/FINEP, pela
logística, e em especial ao Mississipi Center for Supercomputing Research pelo
acesso ao Amber.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu amigo, Dr. Aristóteles Góes Neto, por estar sempre presente como
orientador, como amigo, e pela confiança que me deu me deixando caminhar com as
próprias pernas; não teria chegado até aqui sem sua excelente orientação e sem
seu apoio sempre que precisei. Obrigado pelo muito que me ensinou por todo esse
tempo.
15
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho
original”.
Albert Einstein.
16
RESUMO
O fungo filamentoso Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora é um
Basidiomycota hemibiotrófico responsável pela doença vassoura-de-bruxa no
cacaueiro e vem provocando perdas significativas nas lavouras cacaueiras no sul da
Bahia. Os plasmídeos mitocondriais de fungos podem ser circulares ou lineares do
tipo invertron com as terminações 5’ invertidas e repetitivas (TIR) que, em sua
maioria, codificam DNA e RNA polimerases. As funções atualmente conhecidas
desses plasmídeos nos hospedeiros fúngicos são alterações no tempo geracional
(senescência precoce ou aumento de sobrevida). Uma melhor compreensão da
estrutura e função dessas enzimas pode contribuir para a busca de uma nova
alternativa para o controle da doença. A partir dos dados de seqüenciamento
gerados pelo projeto genoma do M. perniciosa foi identificado e completamente
seqüenciado um plasmídeo mitocondrial que codifica DNA e RNA polimerases. Este
trabalho teve como objetivos: (i) realizar análises comparativas e filogenéticas
(parcimônia, distância, máxima verossimilhança e bayesiana) das DNA e RNA
polimerases de plasmídeos mitocondriais lineares do tipo invertron, utilizando
seqüências de aminoácidos e nucleotídeos, de todas as espécies de fungos que
possuem essas moléculas, testando a hipótese de transferência horizontal de genes
entre espécies fúngicas e entre essas espécies e vírus; e (ii) obter as estruturas
tridimensionais, através de modelagem por homologia, das polimerases do
plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa. Um total de 13 espécies do clado fúngico
apresentam plasmídeos mitocondriais do tipo invertron completamente
seqüenciados, cinco ascomicetos, sete basidiomicetos e um quitridiomiceto. Todas
as análises filogenéticas, independentemente do método e do conjunto de dados
utilizado, apresentaram topologias das árvores semelhantes. DNA e RNA
polimerases foram inseridas, provavelmente, em eventos distintos, por Transferência
Horizontal de Genes no genoma mitocondrial das 13 espécies de fungos
hospedeiros utilizadas nesse estudo. As estruturas tridimensionais obtidas para as
DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M. perniciosa apresentam todos os
domínios característicos das famílias dessas polimerases. Após Modelagem por
Homologia, refinamento e Dinâmica Molecular (300K por 300ps), os modelos finais
dessas polimerases mostraram alta similaridade estrutural com seus respectivos
moldes (1XHX e 1ARO, respectivamente), sugerindo que essas moléculas estejam
ativas dentro da mitocôndria de M. perniciosa. A realização desse trabalho foi de
17
fundamental importância para o entendimento da filogenia molecular de plasmídeos
mitocondriais em fungos, e também no auxílio ao desenvolvimento de novas
alternativas para o controle do fungo causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro.
Palavras-Chave: Moniliophthora perniciosa, Plasmídeos Mitocondriais, Fungos,
Modelagem por Homologia, Filogenia Molecular.
18
ABSTRACT
The filamentous fungus Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora is a
hemibiotrophic Basidiomycota that causes witches' broom disease of cocoa
(Theobroma cacao L.). It has been claimed as one of the most important
phytopathological problem of cocoa that has afflicted the Southern Hemisphere in
recent decades. Fungal mitochondrial plasmids are usually invertrons encoding DNA
and RNA polymerases with terminal inverted repeats with 5'-linked terminal proteins.
Plasmid insertion into mitochondrial genomes of their hosts are probably associated
to modifications in host generation time, and a better understanding of these
structures and functions could help to elucidate processes involved in fungal aging,
and, thus, contribute to a new alternative for the control of witches’ broom disease of
cocoa tree. During the accomplishment of M. perniciosa genome project, a plasmid
encoding both DNA and RNA polymerases was identified and completely sequenced
in mitochondria of this fungus. The aims of this project were: (i) to carry out
comparative and phylogenetic analyses of DNA and RNA polymerases of all linear
mitochondrial plasmids in fungi, at both gene and protein levels, and between fungal
and viral polymerases, testing the hypotesis of horizontal gene transfer; and (ii) to
perform the protein homology modeling of both DNA and RNA polymerases of
recently discovered M. perniciosa mitochondrial plasmid. A total of 13 species of the
fungal clade presents mitochondrial plasmids of invertron type completely
sequenced, five Ascomycota, seven Basidiomycota, and one Chitridiomycota. All the
phylogenetic analyses, regardless of both the method and data set used, showed
similar tree topologies. DNA and RNA polimerases were probably inserted during
different events by Horizontal Gene Transfer in mitochondrial genomes of the 13
fungal host species used in our study. The three-dimensional structures obtained for
both DNA and RNA polimerases from M. perniciosa mitochondrial plasmid have all
the characteristic domains of the families of these polimerases. After Molecular
Homology Modeling, refinement and Molecular Dynamics (300K and 300ps), the final
models of these polymerases showed high structural similarity with their respective
templates (1XHX and 1ARO, respectively), and suggesting that these molecules are
biologically active inside M. perniciosa mitochondria. The accomplishment of this
project was importannt for a better understanding of evolutionary relationships of
19
mitochondrial plasmids of the fungal clade, and for the development of new
alternatives to control the fungal agent of witches' broom disease.
Key words: Moniliophthora perniciosa, Mitochondrial Plasmids, Fungi, Homology
Modelling, Molecular Phylogeny.
20
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 25
2 REVISÃO DA LITERATURA 27
2.1 MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: O AGENTE CAUSADOR DA VASSOURA DE BRUXA DO CACAUEIRO (THEOBROMA CACAO)
27
2.2 PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS 29
2.3 PLASMÍDEO MITOCONDRIAL DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA
35
2.4 TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES 36 2.5 ADENOVÍRUS E RETROVÍRUS 41
2.6 DNA E RNA POLIMERASES TIPO VIRAIS 45
2.7 FILOGENIA E EVOLUÇÃO MOLECULAR 50
2.8 MODELAGEM POR HOMOLOGIA 54
2.8.1 Química Computacional 60
2.8.2 Emprego da Química Computacional na Modelagem por Homologia
64
3 METODOLOGIA 67
3.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA 67
3.1.1 Busca de Moldes para as DPO e RPO do plasmídeo de M. perniciosa
70
3.1.2 Alinhamento das seqüências com os moldes 70
3.1.3 Threading e predição de estrutura secundária 71
3.1.4 Construção dos modelos tridimensionais 71
3.1.5 Refinamento e Dinâmica Molecular 71
3.1.6 Validação das estruturas tridimensionais das DNA e RNA Polimerases do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
73
3.2 FILOGENIA MOLECULAR 74
3.2.1 Alinhamento das seqüências de DNA 74
3.2.2 Alinhamento das seqüências de aminoácidos 75
21
3.2.3 Análises filogenéticas tradicionais 75
3.2.3.1 Análises das seqüências de nucleotídeos 75
3.2.3.2 Análises das seqüências de aminoácidos 76
3.2.4 Análise bayesiana 77
4 RESULTADOS 78
4.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA 78
4.1.1 Moldes selecionados para construção das DNA e RNA polimerases do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
79
4.1.2 Confirmação dos moldes através de Threading 79
4.1.3 Alinhamento das proteínas alvo com os seus respectivos moldes
80
4.1.4 Predição de estrutura secundária 81
4.1.5 Modelos tridimensionais das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M. perniciosa
83
4.1.5.1 Estrutura tridimensional da DNA polimerase do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
83
4.1.5.2 Estrutura tridimensional da RNA polimerase do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
87
4.1.6 Determinação dos valores de cutoff para os cálculos de refinamento e Dinâmica Molecular das estruturas das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M. perniciosa
89
4.1.7 Validação das estruturas tridimensionais das DNA e RNA polimerases do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
90
4.1.7.1 Validação das estruturas iniciais das DPO e RPO do plasmídeo de M. perniciosa
90
4.1.7.2 Validação dos modelos tridimensionais das DPO e RPO do plasmídeo de M. perniciosa, após refinamento e Dinâmica Molecular
101
4.2 ESTRUTURA DOS PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS DO CLADO FÚNGICO
112
4.3 FILOGENIA MOLECULAR 113
4.3.1 Filogenia tradicional 113
22
4.3.2 Filogenia Bayesiana 126
5 DISCUSSÃO 130
5.1 ANÁLISE SEQÜÊNCIA – ESTRUTURA DOS MODELOS DAS DPO E RPO DO PLASMÍDEO DE M. PERNICIOSA COM OS SEUS MOLDES VIRAIS
130
5.2 RELAÇÕES ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS ENTRE PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS LINEARES DE FUNGOS
131
5.3 FILOGENIA E EVOLUÇÃO DAS DNA E RNA POLIMERASES DOS PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS DE FUNGOS E VÍRUS
132
6 CONCLUSÕES 136
6.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA 136
6.2 FILOGENIA MOLECULAR 136
REFERÊNCIAS 138
APÊNDICES 148
ANEXOS 165
23
GLOSSÁRIO 1 % – Percentagem
2 3D – Tridimensional
3 BLAST – Basic Local Alignment System Tool.
4 cDNA – DNA complementar.
5 Conídios – Células reprodutivas presentes nos ciclos de vida de espécies de fungos.
6 DM – Dinâmica Molecular
7 DNA – Ácido desoxirribonucléico
8 DPO – DNA polimerase.
9 dsDNA – DNA de fita dupla.
10 E/kT – Fator de Boltzmann
11 Heterocariose – presença de dois ou mais núcleos geneticamente diferentes dentro de uma única célula.
12 K – Graus Kelvin
13 Kb – Kilobases.
14 Kcal – Quilolocaloria
15 kDa – Kilodaltons.
16 MCMC – Monte Carlo Markov Chain
17 mtDNA – DNA mitocondrial.
18 ORF – Open Reading Frame.
19 Pb – Pares de bases
20 PDB – Protein Data Bank.
21 Protein-primed – Processo iniciador na replicação do DNA pelas DNA polimerases virais e algumas polimerases procarióticas e eucarióticas.
22 Ps – Picossegundo
24
23 QM/MM – Quantum-Mecanical/Molecular-Mecanical
24 RMS – Rout mean square
25 RPO – RNA polimerase.
26 SEP – Superfície de energia potencial
27 THG – Transferência Horizontal de Genes.
28 TIR – Terminal Inverted Repeats.
25
1 INTRODUÇÃO
O agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao
L.), Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, é um fungo patógeno
hemibiotrófico, pertencente à ordem Agaricales e à família Tricholomataceae. Esse
fungo é endêmico da Bacia Amazônica, sendo o único patógeno do cacau que se
desenvolve concomitantemente com o cacaueiro (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005).
O projeto genoma do Moniliophthora perniciosa identificou genes muito
importantes relacionados ao metabolismo do fungo, como o da oxidase alternativa
(AOX) e genes associados à interação patógeno-hospedeiro, os quais podem estar
relacionados a processos de morte celular programada (PCD). Além disso, um fato
muito interessante foi a presença de um um plasmídeo linear integrado
covalentemente ao genoma mitocondrial. Esse plasmídeo apresenta uma estrutura
típica do tipo invertron codificando DNA e RNA polimerases (DPO e RPO) em fases
de leitura opostas (ORFs), relacionadas com polimerases virais de adenovírus e
retrovírus (FORMIGHIERI et al., 2008).
Plasmídeos são fragmentos de DNA ou RNA que têm a capacidade de se
replicar independente do genoma do hospedeiro (KENNEL, 2007; GRIFFITHS,
1995). Essas moléculas podem ser encontradas em vários tipos de organismos
como bactérias, fungos e plantas, sendo a presença dessas estruturas em animais
desconhecida. Em seus hospedeiros, esses plasmídeos podem estar envolvidos
com aumento da virulência ou resistência a antibióticos (bactérias), alteração do
tempo geracional (fungos) e resistência a algum patógeno (plantas). Plasmídeos
mitocondriais em fungos apresentam geralmente uma estrutura típica do tipo
invertron, codificando DNA e RNA polimerases em fases de leitura opostas, e os
terminais das fitas de DNA apresentam seqüências invertidas e repetitivas (TIR) com
uma proteína de ligação ao terminal 5’, a qual pode estar envolvida com o processo
de transcrição dessas moléculas. Na maioria dos hospedeiros fúngicos que possuem
plasmídeos associados à mitocôndria há uma alteração no tempo de vida desses
organismos (GRIFFITHS, 1995). Polimerases codificadas por plasmídeos
mitocondriais fúngicos são homólogas de DNA e RNA polimerases virais, estando
envolvidas nos processos de replicação de DNA de fita dupla e nos processos de
transcrição de DNA em RNA mensageiro, respectivamente (ROKYTA et al., 2006).
Por esse motivo é bem provável que esteja ocorrendo um processo de Transferência
26
Horizontal de Genes (THG) entre seqüências virais e de plasmídeos fúngicos
(VILLARREAL; DEFILIPPIS, 2000).
No presente trabalho foram analisadas seqüências de DNA e de proteína
(aminoácidos) das enzimas DNA e RNA polimerases codificadas por todos os
plasmídeos mitocondrais do tipo linear conhecidos em fungos, totalizando 13
espécies, sendo sete ascomicetos, cinco basidiomicetos (incluindo M. perniciosa) e
um quitridiomiceto, com o objetivo de definir a filogenia molecular baseada em dados
moleculares, testando a hipótese de transferência horizontal de genes dessas
polimerases dentro do próprio clado fúngico, e entre essas polimerases e
polimerases virais. A realização da modelagem por homologia das duas enzimas
(DNA e RNA polimerases) codificadas pelo plasmídeo do M. perniciosa fornece
dados para que, em uma etapa posterior, seja feito um estudo com os prováveis
ligantes que possam inibi-las. Portanto, os estudos de filogenia das DNA e RNA
polimerases codificadas por plasmídeos mitocondriais lineares de fungos, bem como
a modelagem por homologia das DNA e RNA polimerases do plasmídeo mitocondrial
de Moniliophthora perniciosa, poderão auxiliar no controle da vassoura-de-bruxa do
cacaueiro.
27
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA: O
AGENTE CAUSADOR DA VASSOURA DE BRUXA DO CACAUEIRO
(THEOBROMA CACAO)
O fungo filamentoso Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora é
um basidiomiceto hemibiotrófico responsável pela doença vassoura-de-bruxa no
cacaueiro, doença que vem provocando perdas significativas nas lavouras
cacaueiras no Sul da Bahia (SANTOS, 2005), inicialmente denominado de
Marasmius perniciosus e posteriormente renomeado para Crinipellis perniciosa
(Stahel) Singer, após a revisão do gênero Marasmius por Singer (GRIFFITH, 2003;
PURDY; SCHMIDT, 1996). Outra modificação na nomenclatura foi realizada quando
Aime e Phillips-Mora (2005) sugeriram a alteração do gênero de Crinipellis para
Moniliophthora baseado em dados moleculares. M. perniciosa está dentro da ordem
Agaricales, a qual possui poucos patógenos conhecidos (AIME; PHILLIPS-MORA,
2005), família Tricholomataceae, e é endêmico da Bacia Amazônica, sendo o único
patógeno do cacau que se desenvolve concomitantemente com o cacaueiro
(PURDY; SCHMIDT,1996).
O entendimento do ciclo de vida deste patógeno, bem como sua propagação,
é de fundamental importância para a retomada da produção de cacau e da
economia da região sul da Bahia. Dentre as estratégias de controle, a manipulação
genética é uma das estratégias mais promissoras. O seqüenciamento de bibliotecas
genômicas do M. perniciosa permitiu a identificação de genes importantes desse
patógeno e de seu patosistema (SANTOS, 2005).
Vários biótipos de M. perniciosa foram descritos (LOPES, 2005), sendo que o
biótipo C afeta o Theobroma cacao e outras espécies dos gêneros Theobroma e
Herrania (Malvaceae) (HORA-JUNIOR, 2006).
Os basidiósporos, liberados pelos basidiomas formados na superfície externa
dos hospedeiros, são as únicas estruturas em condições naturais capazes de
infectar o cacaueiro, sendo responsáveis pela disseminação da doença. Ao atingir a
superfície dos órgãos de plantas sadias, os esporos produzem tubos de germinação
monocarióticos que penetram no hospedeiro e atingem os tecidos meristemáticos.
Apenas o micélio biotrófico está presente nos tecidos infectados verdes e, nesta
28
fase, o fungo induz à hipertrofia e à hiperplasia das células apicais, resultando em
múltiplos ramos nitidamente mais grossos que o único ramo original, formando uma
estrutura anômala denominada de vassoura verde. Após um período de três a nove
semanas ocorre o processo de dicariotização, no qual o micélio entra na fase
saprofítica, possuindo hifas mais finas, que invadem as células do tecido hospedeiro,
culminando com a morte dos ramos e formando assim a vassoura seca. As
vassouras necrosadas possuem coloração amarronzada, podendo permanecer
presas à planta ou cair no solo. O micélio presente nessas vassouras secas produz
os basidiomas que irão liberar novos basidiósporos e assim fechar o ciclo de vida do
fungo (PURDY; SCHMIDT,1996; LOPES, 2005; HORA-JUNIOR, 2006) (Figura 1).
Figura 1. Ciclo de vida de Moniliophthora perniciosa. A parte azul e a parte laranja correspondem respectivamente às fases biotrófica e saprofítica do fungo durante a sua interação com o cacaueiro (Theobroma cacao). Adaptado de LOPES (2005).
29
2.2 PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS
Plasmídeos são pequenas moléculas de DNA (ou RNA) que possuem a
capacidade de se replicar no interior de células vivas, independente do genoma do
hospedeiro (KENNEL, 2007). Estas estruturas podem, algumas vezes, integrar-se
covalentemente ao genoma das células ou organelas e se replicar como parte dele.
Os plasmídeos foram originalmente descobertos em bactérias, mas posteriormente
moléculas semelhantes foram também encontradas em organismos eucariotos.
Essas moléculas podem apresentar dois tipos de conformação, circular e linear
(GRIFFITHS, 1995). De fato, a maioria dos plasmídeos em eucariotos é linear
(ESSER et al., 1986).
A ocorrência de plasmídeos foi verificada em diferentes compartimentos das
celulares – no citoplasma de algumas leveduras, e nas mitocôndrias (Figura 2) de
alguns fungos filamentosos (ROSEWICH; KISTLER, 2000). Vários plasmídeos
mitocondriais foram encontrados em plantas (KIM et al., 2000). Contudo, em
animais, nunca foi reportada a ocorrência dessas estruturas (GRIFFITHS, 1995).
Plasmídeos fúngicos foram encontrados em culturas diretamente isoladas de
populações naturais de várias espécies, incluindo Absidia glauca Hagem
(HAENFLER et al., 1992), Agaricus spp (ROBINSON et al., 1991)., Ascobolus
immersus Pers. (LIM; HOWLETT, 1994.), Ascosphaeria apis (Maasen ex Claussen)
L.S. Olive & Spiltoir (QIN et al., 1993), Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (SHEPHERD
1992), Claviceps purpurea (Fr.) Tul. (TUDZYNSKI; ESSER, 1986.), Epichloë typhina
(Pers.) Tul. & C. Tul. (MOGEN et al., 1991.), Erysiphe graminis DC. (GIESE et al.,
1990), Fusarium solani (Mart.) Sacc. (SAMAC; LEONG, 1988.), Fusarium oxysporum
Schltdl. (HIROTA et al., 1992), Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. & De Not.
(LIM; HOWLETT, 1994), Morchella vulgaris (Pers.) Boud. (MEINHARDT; ESSER,
1984), Haematonectria haematococca (Berk. & Broome) Samuels & Rossman
(SAMAC; LEONG, 1988.), Neurospora spp., Podospora pauciseta (Ces.) Traverso
(HERMANNS; OSIEWACZ, 1992), Pytium spp. (Marcinko-Kuehn et al., 1994.),
Rhizoctonia solani J.G. Kühn (MIYASAKI et al., 1990), Tilletia spp (Kim et al., 1990),
e Trichoderma viride Pers (MEINHARDT et al., 1990). Todos os plasmídeos
encontrados nesses fungos são mitocondriais, com a possível exceção dos
plasmídeos de Alternaria (GRIFFITHS, 1995).
30
O impacto da inserção ou presença de um plasmídeo ao fenótipo do
hospedeiro, de maneira geral, continua não sendo claro. Todavia, essas moléculas
podem conferir algumas vantagens seletivas para o hospedeiro, alterando, em
alguns aspectos, o metabolismo e a divisão mitocondrial. Porém, em muitos estudos
de fisiologia, nenhuma alteração na taxa ou padrão de crescimento foi observada,
pois até o momento, ainda não existem testes sensíveis a ponto de identificar
alterações bastante pequenas no crescimento, respiração ou taxa reprodutiva
(GRIFFITHS, 1995). Por outro lado, foi descrito em algumas espécies do gênero
Neurospora um fenômeno conhecido como síndrome da senescência fúngica
(MARCOU, 1961; CHAN et al., 1991), o qual inclui perda progressiva das funções
mitocondriais, perda da fertilidade das estruturas ascogênicas, declínio da taxa de
crescimento das hifas com uma paralela perda de viabilidade dos conídios e,
eventualmente, morte do micélio (ESSER et al., 1986; CHAN et al., 1991).
Grande parte dos plasmídeos conhecidos estão distribuídos em espécies de
fungos parasitas e, para algumas dessas espécies, foi sugerida a hipótese que
essas estruturas seriam responsáveis por propriedades patogênicas específicas
Figura 2. Estrutura dos plasmídeos mitocondriais encontrados em espécies de fungos. Adaptado de KENNEL (2007).
31
quando comparados com espécies sem plasmídeos ou com plasmídeos diferentes
(LIM; HOWLETT, 1994; JABAJI-HARE et al., 1994; HIROTA et al., 1992; MOMOL;
KISTLER, 1992; GIESE et al., 1990; MIYASHITA et al., 1990; ). Em outras espécies,
como as do gênero Neurospora (Ascomycota), o que ocorreu foi um fenômeno de
senescência, com a entrada dos plasmídeos na mitocôndria e alteração da taxa de
respiração com conseqüente morte do micélio (CHAN et al, 1991).
De uma maneira geral os plasmídeos naturais encontrados em fungos são do
tipo linear, apresentando um tamanho entre 1kb a 21kb (ROSEWICH; KISTLER,
2000). Mesmo assim, vários tipos de aberrações de DNA mitocondrial têm sido
encontrados em diferentes fungos, por exemplo, em espécies de Cochliobolus e
Claviceps. Plasmídeos naturais circulares parecem ter sido encontrados
exclusivamente em Neurospora. Plasmídeos lineares kalilo e maranhar são os mais
tipicamente encontrados. A estrutura geral típica possui um terminal invertido
repetitivo, no qual o tamanho é característico de um plasmídeo individual. Ao final de
cada extremidade existe uma proteína de ligação ao nucleotídeo 5’ (Figura 3).
Figura 3. Tipos de plasmídeos mitocondriais encontrados em fungos filamentosos. Adaptado de GRIFFITHS (1995).
32
A presença dessa proteína foi sugerida através da resistência a digestão por
exonucleases, mas a proteína pode ser visualizada a partir de eletromicrografia
(VIERULA et al, 1990). Começando dentro dos TIR da molécula, existem duas
grandes fases de leitura (ORFs) em sentidos opostos, em direção a porção medial
do plasmídeo. Essas fases de leitura são abertas se considerarmos o uso do códon
mitocondrial. ORFs menores estão presentes em outras fases de leitura, mas
provavelmente sem significância (GRIFFITHS, 1995). Seqüências presumíveis de
aminoácidos codificados por esses plasmídeos sugerem DNA e RNA polimerases
tipo viral similares a alguns bacteriófagos e mitocôndrias de leveduras (COURT;
BERTRAND, 1992; CHAN et al., 1991). Ambas as ORFs são transcritas (COURT;
BERTRAND, 1993; VICKERY; GRIFFITHS, 1993).
Plasmídeos mitocondriais estão amplamente distribuídos em fungos
filamentosos e compartilham características como a presença de elementos TIR e
genes codantes para DNA e RNA polimerases. Esses plasmídeos estão presentes
em diferentes gêneros e espécies de fungos, incluindo saprófitas e patógenos de
plantas (GIESE et al., 2003), Basidiomycota e Ascomycota, principalmente do
gênero Neurospora (XU et al., 1999). Em muitos casos esses são transmitidos da
mesma maneira que as mitocôndrias e o DNA mitocondrial. Em cruzamentos
sexuais, o plasmídeo do parente maternal é transmitido para a maioria ou toda a
progênie (GRIFFITHS, 1995).
De acordo com a teoria da endossimbiose, os plasmídeos mitocondriais de
fungos são de origem procariótica e acredita-se que podem ter sido herdados de
fagos virais bacterianos (GRIFFTHIS, 1995). O grau de relação entre plasmídeos de
diversas espécies tem sido estimado a partir de seqüências dos genes das DNA e
RNA polimerases (RPOs). A transmissão de plasmídeos mitocondriais durante
cruzamentos sexuais e o contato entre fungos têm sido objeto de muitos estudos
(GIESE et al, 2003), um dos quais atribui introgressão em Neurospora sp. (BOK et
al., 1999) e transmissão assexual em Cryphonectria parasitica (Murrill) M.E. Barr
(BAIDYAROY et al., 2000). De fato, foi demonstrado que plasmídeos podem ser
transmitidos entre isolados de espécies diferentes, através de anastomoses hifais.
Outros estudos demonstraram que, mesmo através de barreiras somáticas, a
transmissão ocorreu através desse processo (GIESE et al., 2003).
Os tipos de plasmídeos mais encontrados em fungos são os lineares
(GRIFFITHS, 1995), muitos desses possuem seqüências idênticas em orientações
33
invertidas nas suas terminações, e podem ocorrer em outros organismos. Essas
estruturas também foram encontradas no citoplasma de células de pólen de milho,
espécies da bacteria Streptomyces, leveduras e plantas. Esses elementos possuem
estrutura semelhante a alguns adenovírus, o bacteriófago Φ29 de Bacillus subtilis, e
vários elementos móveis como, Ac, Ds e Spm do milho, elementos Tam de
Antirrhinum majus, elementos P de células de Drosophila sp., e transposons de
Escherichia coli e outras bactérias (SAKAGUCHI, 1990). O modo de replicação
desse DNA tem sido estudado em alguns vírus e plasmídeos lineares (OESER,
1989; SAVILAHTI, 1993). Acredita-se que a replicação de plasmídeos mitocondriais
ocorra através de um processo similar ao protein-primed utilizado por adenovírus e
bacteriófago Φ29 (GIESE et al., 2003). Para adenovírus e fagos Φ29, foi evidenciado
que a DNA polimerase (DPO), proteínas terminais e fatores de alongamento eram
codificados pelo genoma viral (SAKAGUCHI, 1990).
Os adenovírus e os plasmídeos lineares S-1 e S-2 das células de pólen do
milho compartilham com outros elementos genéticos móveis, a habilidade de se
inserir ou se desligar ao DNA cromossomal ou mitocondrial (mtDNA) do hospedeiro
(SAKAGUCHI, 1990). Recentemente foi reportada a similaridade entre genes da
DNA polimerase desses plasmídeos lineares, vários vírus animais, e bacteriófagos.
Os genes das DNA polimerases em leveduras e plasmídeos lineares de DNA de
milho, pGKL1, pGKL2, e S-1, assim como em fagos Φ29 de B. subtilis PRD e T4,
adenovirus tipo 2, vaccinia vírus, herpesvirus, e Epstein-bar vírus, compreendem a
família DNA polimerase tipo B, possuindo três regiões-consenso, as quais são
características da família das polimerases (JUNG et al., 1987 A; JUNG et al., 1987
B; FUKUHARA, 1987). Tipos similares de plasmídeos lineares de DNA têm sido
encontrados nos fungos Ascobolus immersus Pers., Claviceps purpurea, Rhizoctonia
solani, Morchella vulgaris (Pers.) Boud., Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. e
Lentinula edodes (Berk.) Pegler, e nas plantas Sorghum bicolor (L.) Moench,
Brassica campestris L., e Brassica napus L (TUDZYNSKI; ESSER, 1983;
FRANCOU,. 1981; MEINHARDT; ESSER, 1984; YUI ET AL., 1988; SHISHIDO;
KATAYOSE, 1988; PALMER ET AL., 1983; ERICKSON ET AL., 1985). Todos esses
plasmídeos compartilham as duas características comuns de terminais invertidos
repetitivos (TIR) de DNA e proteínas ligadas à extremidade 5’. Outra característica
típica desse tipo de plasmídeo é o baixo número de cópias no citoplasma do
hospedeiro. Muitos elementos genéticos móveis e transposons compartilham
34
estrutura genética e funções básicas com adenovírus e plasmídeos lineares de DNA.
Esses elementos possuem TIR idênticos e são algumas vezes interrompidos por
regiões homólogas em orientação inversa das suas extremidades. Adenovírus e
plasmídeos lineares de DNA de milho, S-1 e S-2, compartilham com elementos
genéticos móveis a capacidade de se inserir ou se desligar do seu cromossomo
hospedeiro ou DNA mitocondrial. Essas características e as similaridades nas
estruturas terminais podem justificar o agrupamento desses elementos genéticos
dentro de um grupo estrutural, funcional, e evolutivo (SAKAGUCHI, 1990).
A família kalilo de plasmídeos mitocondriais está distribuída em todo o globo
terrestre em várias espécies de Neurospora como também no gênero relacionado
Gelasinospora. O plasmídeo prototípico kalilo foi encontrado em linhagens de
espécies heterotálicas de Neurospora intermedia F.L. Tai. Um plasmídeo derivado,
LA-kalilo, foi identificado em linhagens da espécie pseudohomotálica Neurospora
tetrasperma Shear & B.O. Dodge da Louisiana. Yuewang et al. (1996) encontraram
outro derivado em uma população 8-esporulada homotálica de Gelasinospora.
Arganoza et al. (1994) reportaram várias linhagens contendo plasmídeos com
homologia ao kalilo. Em uma investigação mais detalhada nas últimas linhagens, os
autores descobriram novas formas curtas em linhagens de espécies heterotálicas de
Neurospora da Tailândia e da Costa do Marfim, apresentando a existência de formas
prototípicas em N. tetrasperma de Moorea-Tahiti, e LA-kalilo em Neurospora crassa
do Haiti. É provável que o padrão de distribuição desses plasmídeos pelo mundo
seja devido puramente a um modo de transmissão vertical, através de um ancestral
comum de todas as espécies listadas, sendo que não existem testes diretos para
cada modelo. Em um teste indireto é possível gerar árvores filogenéticas das
seqüências dos plasmídeos e determinar se coincidem ou não com as árvores
filogenéticas dos seus hospedeiros fúngicos. Uma coincidência pode sugerir, mas
não provar descendência vertical. Outra possibilidade é que os plasmídeos tenham
sido distribuídos por transmissão horizontal utilizando algum tipo de fusão de hifas
geneticamente distintas (heterocariose) (BOK et al., 1999).
Terminais invertidos repetitivos (TIR), tipicamente possuem centenas de
pares de bases de comprimento, e vêm sendo encontrados em vários genomas
lineares de vírus bem como em plasmídeos lineares, ambos de origem procariótica e
eucariótica. Essas moléculas de DNA de fita dupla também contem proteínas
covalentemente ligadas ao terminal 5’. Sua replicação ocorre mediada a um
35
mecanismo de protein-primed, no qual a proteína serve como primer na iniciação. O
TIR possui as origens de replicação e, conseqüentemente, o mecanismo de protein-
primed inicia-se a partir de cada uma das extremidades. Os TIR também parecem
facilitar a ligação de outras proteínas acessórias que auxiliam no processo de
replicação (SAVILAHTI; BAMFORD 1993).
2.3 PLASMÍDEO MITOCONDRIAL DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA (STAHEL)
AIME & PHILLIPS-MORA
O plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa apresenta uma estrutura típica de
invertron, codificando genes para DNA e RNA polimerases em fases de leitura
opostas (Figura 4) (FORMIGHIERI et al, 2008).
Análises filogenéticas entre o plasmídeo de M. perniciosa e alguns
plasmídeos de Agaricales, utilizando seqüências das DPO e RPO, apresentaram um
grupo consistente formado por este plasmídeo, pFV1 de Flammulina velutipes
(Curtis) Singer e pMLP2 de Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm., indicando que a
presença desses genes segue uma herança vertical (FORMIGHIERI et al, 2008).
A presença desse plasmídeo integrado ao genoma mitocondrial do biótipo C
de M. perniciosa ocorreu independentemente da origem geográfica. Já para o biótipo
L foram encontradas seqüências similares, mas inseridas em regiões diferentes
(FORMIGHIERI et al, 2008).
A integração estável desse plasmídeo ao genoma mitocondrial de M.
perniciosa sugere um evento evolutivo recente, associado ao desenvolvimento de
alguns biótipos. Isso pôde ser verificado através de dados de conteúdo
Figura 4. Estrutura do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa, mostrando as regiões codificantes para DNA e RNA polimerases e os terminais invertidos repetitivos (TIR). Fonte: FORMIGHIERI et al., 2007.
36
Guanina/Citosina (G+C), nas regiões dos TIR, das ORFs hipotéticas e nas regiões
codificantes para as polimerases, além da interpretação bioestatística desses dados.
Essas análises também indicam que esse plasmídeo pode ter sido inserido por
completo em um único evento, e que essas seqüências estão em processo de
adaptação ao restante do genoma, indicado pela erosão dos terminais invertidos,
pois, enquanto um plasmídeo típico apresenta TIR com cerca de 1000 pares de
bases, o plasmídeo de M. perniciosa apresenta dois pares curtos de repetições
descontínuas, com 347 e 130 pares de bases, localizadas nas regiões 11284 e 6743
do genoma mitocondrial, respectivamente (FORMIGHIERI et al, 2008).
Considerando que o plasmídeo de M. perniciosa está integrado estavelmente
ao genoma mitocondrial, é provável que esteja envolvido no processo de
senescência. Entretanto, o fato desse plasmídeo estar integrado estavelmente
apenas ao genoma mitocondrial do biótipo C é intrigante (FORMIGHIERI et al.,
2008).
2.4 TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES
Transferência Horizontal de Genes (THG) implica na transferência de material
genético entre espécies (RICARD et al., 2006). Em contraste com a transmissão
vertical, na qual o material genético é trocado entre organismos da mesma espécie,
a THG refere-se ao intercâmbio horizontal de genes entre linhagens ou espécies
distantemente relacionadas (BROWN, 2003). A filogenia de genes horizontalmente
transferidos é caracteristicamente diferente da filogenia das espécies; essas
diferentes filogenias podem também trazer um outro significado, como aceleração no
processo de evolução dos genes, perda de genes, ou mesmo transferência de
genes de um eucarioto para um procarioto (HALL et al., 2005).
Genes adquiridos por THG podem conferir novas funções para o organismo
recipiente, particularmente quando o organismo não possui funções relacionadas
com o novo gene adquirido (RICARD et al., 2006). Conseqüentemente, a THG
possui o potencial de controlar uma importante via na exploração de novos nichos.
Transferência horizontal (ou lateral) tem sido inferida em muitos processos
biológicos, incluindo o surgimento e distribuição de fatores de virulência, resistência
a antibióticos, e a manutenção, em longo prazo, das organelas. A THG em larga
escala tem sido descrita principalmente em transferências de organelas para o
37
núcleo, entre espécies de Eubacteria e Archaea, e em menor escala de Eukarya
para Eubacteria (DOOLITTLE, 1998). Um caso bem documentado foi o destino do
DNA dentro de células eucarióticas. Exemplos individuais incluem transferência de
DNA de bactérias para fungos e protozoários ciliados no rúmen. A transferência de
16 genes de bactérias para nematóides e de 96 para Entamoeba histolytica são
apenas exemplos de transferência horizontal de genes de bactérias para eucariotos
que foram investigados em larga escala (RICARD et al., 2006).
O fenômeno de transferência horizontal de genes desempenha um grande
papel na evolução dos genomas de bacteriófagos. Em fagos, transferência
horizontal pode ocorrer via recombinação homóloga ou não-homóloga e parece ser
limitada primariamente por uma seleção contra o rompimento de interações
funcionais. O processo de evolução do genoma de bacteriófagos foi elucidado a
partir da caracterização de DNA de fita dupla (dsDNA) dos genomas desses fagos.
Os fagos com dsDNA das famílias Siphoviridae (ex. λ), Podoviridae (ex. T7), e
Myoviridae (ex. T4) têm recebido maior atenção por sua história como modelos
moleculares de sistemas biológicos e por seu impacto econômico em processos de
fermentação lática. Essas famílias compreendem os fagos caudados, os quais são
caracterizados por genomas relativamente grandes e, ocasionalmente, ciclos de vida
lisogênicos. Ambas as características parecem facilitar a transferência horizontal de
genes. A primeira minimizando obstáculos na aquisição ou perda de genes, e a
última por incluir oportunidades de recombinação entre fagos (ROKYTA et al., 2006).
Em eucariotos, poucos exemplos de transferência horizontal de genes têm
sido bem documentados. A transferência horizontal eucarioto-eucarioto de genes
mitocondriais foi recentemente reportada entre plantas parasitas e suas respectivas
plantas hospedeiras (HALL et al., 2005). Os casos de THG nesse grupo são restritos
a elementos genéticos móveis não-infectantes, plasmídeos e transposons
(ROSEWICH; KISTLER, 2000). Esse tipo de fenômeno também é encontrado entre
espécies animais, como por exemplo, entre espécies de Drosophila, nas quais foram
encontrados transposons transferidos horizontalmente (BROWN, 2003).
Exemplos de transferência horizontal interdomínios de procariotos para
eucariotos também são conhecidos – transferência de informação genética pela
Agrobacterium tumefaciens para sua planta simbionte, e a transferência de
informação genética de mitocôndrias e cloroplastos para o genoma nuclear. A
freqüência de transferência de informação genética de bactérias para eucariotos
38
continua sendo matéria de debate. O seqüenciamento de genomas de procariotos
tem revelado a transferência horizontal de genes como um importante mecanismo
evolutivo entre esses organismos (HALL et al., 2005).
Segundo Brown (2003) o fenômeno de THG vem ocorrendo desde o processo
de formação e diferenciação dos primeiros organismos vivos. Análises comparativas
de dados moleculares obtidos a partir de projetos genomas indicam que, ao longo da
história da vida, a THG pode ter sido a principal força responsável pela evolução das
formas celulares e pelo surgimento dos três grandes domínios conhecidos hoje –
Archaea, Bacteria, e Eukarya.
Diversas seqüências completas de DNA de vários plasmídeos fúngicos estão
disponíveis em bancos de dados e, dentre essas, cinco foram utilizadas para a
construção de árvores filogenéticas. Os cinco plasmídeos foram comparados com
eles mesmos, com outros plasmídeos lineares, e DNA de vírus e fagos. Ambas as
ORFs de DNA e RNA polimerases foram utilizadas, focando as regiões que
apresentavam regiões de aminoácidos mais conservadas. As seqüências foram
classificadas em cinco grupos gerais – adenovírus, fagos lineares procarióticos,
outros vírus e fagos, plasmídeos lineares citoplasmáticos, e plasmídeos
mitocondriais lineares. O grupo que aparece mais relacionado com os plasmídeos
mitocondriais lineares nas DNA polimerases é aquele que contém os fagos que
realizam replicação pelo processo protein-primed (Φ29, M2, e PRD1) (GRIFFITHS,
1995). Por outro lado, homólogos dessas polimerases são encontrados em genomas
de Archaea e Eucarya, ficando difícil considerar um monofiletismo para este grupo
de enzimas; entretanto, esse fato pode ser explicado pela rápida evolução dessas
polimerases em linhagens virais, o que pode obscurecer sua origem comum. O
monofiletismo dessas DNA polimerases que empregam um processo de protein-
primed para replicação de dsDNA (adenovírus animais e fagos caudados como
PRD1 e Φ29) vem sendo contestado (KOONIN et al., 2006). Na árvore das RNA
polimerases, o grupo mais relacionado possui os fagos T3 e T7, e seqüências de
genes codificantes de polimerases mitocondriais de leveduras. Devido a esses fatos,
muitos autores têm sugerido que os plasmídeos fúngicos possuem origem viral,
configurando assim um fenômeno de THG (GRIFFITHS, 1995). O domínio palma
encontrado nesse tipo de polimerase é altamente relacionado com a proteína
primordial que emergiu do mundo de RNA no qual a polimerização dos nucleotídeos
era catalisada por ribozimas. Isso não é suportado apenas pela ampla distribuição
39
desse domínio em formas modernas de vida, mas também pela relação desse
domínio com o motivo de reconhecimento de RNA (MRR). O domínio palma de RNA
polimerases RNA-dependentes e transcritases reversas foram excluídos dos ciclos
de vida de organismos celulares, entretanto, a maioria dessas células possui cópias
inativas desses elementos em seu genoma, sejam elas eucarióticas ou procarióticas
(KOONIN et al., 2006).
Mitocôndrias e plastídeos se originaram de procariotos ancestrais de vida livre
(TIMMIS et al, 2004). Essas organelas possuem genes com um modelo de herança
não-mendeliano (BAUR, 1909), e sua evolução é baseada na Teoria da
Endossimbiose (MERESCHKOWSKY, 1905; MARGULIS, 1970) (Figura 5).
Análises moleculares identificaram Proteobacteria e Cyanobacteria como
ancestrais das mitocôndrias e cloroplastos, respectivamente (GRAY, 1982). Essas
organelas apresentam genomas haplóides multicirculares, apresentando um
Cyanobacteria Proteobacteria Archaeabacteria
A C
F
G
D
H
Eucariotos Plantas
Figura 5. Evolução endossimbiótica e árvore dos genomas. A. Hospedeiro que adquiriu a mitocôndria; B. Proteobacteria ancestral; C. Origem da mitocôndria; D. Diversificação inicial das linhagens eucarióticas e transferência de genes para o hospedeiro; E. Cianobactéria ancestral; F. Protozoário ancestral; G. Origem dos plastídios; H. Diversificação inicial de plantas e algas e transferência de genes para o hospedeiro. Adaptado de TIMMIS et al. (2004).
B
E
40
conjunto de genes pouco relacionados com o genoma nuclear (TIMMIS et al., 2004).
A capacidade codificante dos genomas organelares varia dentre as linhagens
eucarióticas. Genomas de plastídios completamente seqüenciados revelaram que
essas organelas codificam aproximadamente entre 20 a 200 proteínas (MARTIN;
HERRMANN, 1998; SIMPSON; STERN, 2002), e mitocôndrias entre 3 a 67
proteínas (GRAY et al., 1999; LANG et al., 1999).
Evidências para a THG em fungos e outros eucariotos são apresentadas de
forma indireta. Na maioria dos casos, fenômenos de THG são inferidos quando
características de um elemento genético tornam-se evidentes em um determinado
organismo, incluindo uma inconsistência entre a filogenia do elemento genético em
questão e a filogenia tradicional aceita para os organismos; alta similaridade entre
seqüências de DNA ou aminoácidos desses elementos com elementos de
organismos distantes filogeneticamente; distribuição irregular de um elemento
genético em uma variedade de espécies ou linhagens; genes similares
compartilhados entre espécies dentro de uma área geográfica distinta ou habitat
específico independente das suas reações filogenéticas; e características de um
gene (conteúdo G+C, uso do códon, introns, etc.) inconsistente ao genoma residente
(ROSEWICH; KISTLER, 2000).
Existem muitas discussões sobre a origem de plasmídeos mitocondriais e
como provavelmente se deu a ampla distribuição dos mesmos em fungos
filamentosos (ROSEWICH; KISTLER, 2000). Um modelo propõe que esses
plasmídeos possam ter vindo de bacteriófagos da bactéria endossimbionte que se
tornou à mitocôndria (MEINHARDT et al., 1990; GRIFFITHS, 1995; KEMPKEN et al.,
1992). O processo de Transferência Horizontal de Genes tem sido proposto para
explicar a distribuição desses plasmídeos entre diferentes espécies e isolados
fúngicos, implicando que esses plasmídeos são parasitas moleculares altamente
transmissíveis (TAYLOR, 1986; MASEL et al., 1993; ARAGANOZA et al., 1994;
YANG et al., 1996). A alta distribuição de plasmídeos em populações naturais de
fungos pode ser uma evidência de que a THG seja um fator evolutivo mais
importante nesse grupo de organismos do que em outros eucariotos (ROSEWICH;
KISTLER, 2000).
41
2.5 ADENOVÍRUS E RETROVÍRUS
Vírus estão presentes em todos os tipos de formas celulares – como se cada
organismo tivesse o seu próprio vírus, ou até, elementos genéticos parasitas tipo
virais (Figura 6) (KOONIN, 2006).
Figura 6. Vírus e outros elementos genéticos móveis: as estratégias de replicação, tamanho do genoma, ecologia global, e proteínas típicas. Tr, transcrição; T, tradução; R, replicação; E, encapsulação; A, Archaea; B, Bacteria; F, Fungi; Mz, Metazoa; P, plantas; UE, eucariotos unicelulares. RdRp, RNA dependente de RNA polimerase; JRC, proteína de encapsulamento; RT, transcriptase reversa; RCRE, endonuclease presente no ciclo de replicação. Adaptado de KOONIN (2006).
42
Muitas espécies de fungos possuem vírus citoplasmáticos ou mitocondriais
(GHABRIAL, 1980). Recentemente estudos ambientais têm mostrado que vírus,
especialmente, bacteriófagos, são as mais abundantes entidades biológicas do
planeta. Vírus movem-se ativamente por biomas e são considerados os maiores
agentes de evolução em virtude de sua capacidade de operar veículos de
transferência horizontal de genes. A extraordinária diversidade de bacteriófagos de
DNA de fita dupla é um contraste em relação a sua ausência em plantas.
Contrariamente, vírus de RNA são extremamente abundantes em diversas plantas e
animais, mas são atualmente representados por apenas duas compactas famílias
em bactérias, e não possuem nenhum representante em Archaea. A genômica
comparativa não apresenta nenhuma evidência de origem monofilética para todos os
vírus, e muitos grupos de vírus simplesmente não compartilham de genes em
comum, efetivamente, descartando qualquer noção convencional de uma suposta
origem comum exclusiva. Genes podem ser compartilhados por diferentes grupos de
vírus, com apenas homólogos distantes em organismos celulares, e com forte
indicação de monofiletísmo para todos os membros virais da respectiva família
gênica. Notavelmente, bacteriófagos e vírus de Archaea com genomas de tamanho
moderado e grande apresentam genes denominados ORFans, que freqüentemente
compreendem mais de 80% dos genes nesses vírus. A rápida evolução dos ORFans
de fagos traz muitas fontes, senão a maior, de ORFans encontrados em genomas
procarióticos, desempenhando um importante papel na evolução dos organismos
procarióticos. A replicação de RNA-virus de fita positiva, RNA-virus de dupla fita,
RNA-virus de fita negativa, e retrovírus/elementos são catalisadas por uma outra
classe de enzimas virais, RNA dependente de RNA polimerases e transcriptases
reversas. Outro importante caso é a DNA polimerase família B que é a principal
enzima envolvida nos processos de replicação de numerosos vírus de DNA de dupla
fita de bactérias e eucariotos. Homólogos dessas DNA polimerases são encontrados
em todos os genomas de Archaea e eucariotos, mas o monofiletismo de todas essas
polimerases virais não foi demonstrado em análises filogenéticas. Entretanto, isso
potencialmente pode ser explicado pela rápida evolução das polimerases em várias
linhagens virais, o que pode mascarar essa origem comum. Além disso, é sugerido o
monofiletismo das polimerases de todos os vírus que empregam um mecanismo de
protein-primed na replicação do DNA de dupla fita (adenovírus animais e fagos com
“cauda” como o PRD1 ou Φ29) (KOONIN et al., 2006).
43
A divergência entre as linhagens bacterianas e eucarióticas parece
representar a mais profunda separação na árvore dos organismos atuais (SOGIN et
al., 1989). Como as proteínas de replicação do DNA desses grupos são de
fundamental importância e interagem através de mecanismos complexos, é provável
que o sistema de replicação do genoma, como o sistema traducional, pode conter os
genes co-evoluídos mais conservados dentre todas as linhagens relacionadas
(VILLARREAL; DEFILIPPIS, 2000). Homólogos de genes envolvidos com o processo
de replicação são encontrados em bactérias, eucariotos, e arqueas, incluindo
proteínas envolvidas no reconhecimento de origens de replicação, helicases,
proteínas de ligação ao DNA, síntese de DNA, braçadeiras, ligação, e remoção de
primers. Entretanto, existem claras diferenças entre a similaridade das seqüências
que separam proteínas de replicação de bactérias das outras de arqueas e
eucariotos (EDGELL et al., 1997). Os genes de replicação em bactérias parecem
não relacionados evolutivamente com aqueles de arqueas e eucariotos. Por
exemplo, a DNA polimerase III replicativa de E. coli está na família da DNA
polimerases tipo C e não tem nenhuma similaridade com alguma das duas DNA
polimerases família B de mamíferos (WANG et al., 1995). Análises filogenéticas
dessas DNA polimerases resultam em agrupamentos polifiléticos que são
incompatíveis com a árvore das espécies (BRAITHWAITE; ITO, 1993). Até a ampla
existência de genes não-ortólogos com funções idênticas apresenta um dilema
quando são usados para a inferência da árvore universal dos organismos atuais,
levando alguns autores a propor que o ancestral de bactérias, arqueas e eucariotos
possuía um genoma de RNA (EDGELL et al., 1997; MUSHEGIAN; KOONIN, 1996).
Entretanto, atualmente admite-se que, entre bactérias e eucariotos, centenas de
genes funcionais sejam homólogos, como os relacionados à síntese de DNA. Isso
sugere que os eucariotos e procariotos atuais herdaram muitos genes do ancestral
comum mais recente (LAKE et al., 1999; NICHOLAS et al., 1997). Vírus de DNA,
entretanto, também possuem um completo sistema de replicação e reparo
independente de DNA que inclui membros das famílias A e B das polimerases
(KNOPF, 1998). Vírus são geralmente impositores de seleção negativa a seus
hospedeiros. Além disso, a recombinação entre genoma do hospedeiro e viral é um
fenômeno comumente observado, até em retrovírus que adquirem protooncogenes
celulares (VARMUS 1984; BISHOP, 1983). Vírus são ainda raramente considerados
como fontes de genes dos hospedeiros e, desta forma, seqüências virais não são
44
consideradas na reconstrução filogenética de organismos celulares atuais.
Entretanto, um genoma viral pode evoluir até um milhão de vezes mais rápido que o
do seu hospedeiro. Se um vírus de DNA pode se estabelecer de maneira estável no
genoma de seu hospedeiro, ele realmente pode fornecer genes que interfiram na
evolução desse hospedeiro (VILLARREAL, 1999).
Micovírus geralmente apresentam genomas com RNA de fita dupla ou, em
menor quantidade, RNA de fita simples (MCCABE et al., 1999; VAN DIEPENINGEN,
1999). Esses vírus diferem dos vírus de outros organismos por não apresentar uma
fase extracelular, sendo considerado não-infectante (GHABRIAL, 1980; MCCABE et
al., 1999). Transmissão vertical em uma progênie assexual é geralmente bem
sucedida. Por outro lado, durante a reprodução sexual essa transmissão é
ineficiente ou inexistente. O processo de transmissão horizontal pode ocorrer através
de anastomose hifal e a transferência do vírus é eficiente entre indivíduos
somaticamente compatíveis (ROSEWICH; KISTLER, 2000).
Os micovírus mais conhecidos são aqueles que causam alteração no fenótipo
do hospedeiro, debilidade do fungo, a qual inclui redução da virulência, ou confere
alguma vantagem seletiva sobre outros vírus de vida livre (GHABRIAL, 1980;
MCCABE et al., 1999, MILGROOM, 1999; NUSS; KOLTIN, 1990). Entretanto, a
maioria dos micovírus é considerada neutra e não traz nenhuma conseqüência para
seus hospedeiros. Essa ausência de efeito fenotípico nos hospedeiros pode ser
resultado de um fenômeno de co-evolução entre os vírus e os hospedeiros fúngicos,
o qual inclui seleção contra virulência (ROSEWICH; KISTLER, 2000).
45
2.6 DNA E RNA POLIMERASES TIPO VIRAIS
A Φ29 DNA polimerase está incluída no grupo das α-DNA polimerases devido
a sua sensibilidade a afidicolina e a análogos de nucleotídeos (BuAdATP e
BuPdGTP), inibidores específicos de DNA polimerases tipo α de eucariotos
(TRUNIGER et al., 1998). Esta polimerase é a principal enzima de replicação em
vírus de DNA de dupla fita que ocorrem em bactérias e eucariotos (KOONIN et al.,
2006). Esta enzima Possui cerca de 66-kDa e está dentro da família de DNA
replicases do tipo eucarióticas, possuindo a habilidade de iniciar o processo de
replicação, utilizando uma proteína como primer (BLASCO et al., 1993a). Um fato a
se considerar é que essa polimerase contém alguns aminoácidos altamente
conservados na região C-terminal. Tem sido proposto que essas regiões
conservadas podem desempenhar um papel muito importante na função da enzima,
sendo parte do sítio ativo para atividades sintéticas (TRUNIGER et al., 1998).
A seletividade de nucleotídeos pela DNA polimerase depende primariamente
da polimerização da geometria do sítio ativo, o qual é desenhado para aceitar pares
de base de Watson-Crick e rejeitar pares de base de geometrias diferentes. A
ligação dos dNTPs induz alterações conformacionais na molécula de DNA
polimerase que precede alterações químicas sendo cerca de 10.000 vezes mais
lentas para dNTPs incorretos do que para os corretos. Essas alterações
conformacionais posicionam a entrada de nucleotídeos para catálise. Uma baixa
taxa de formação de ligação fosfodiéster pode adicionar dNTPs incorretos, nesse
caso, muitas polimerases possuem uma atividade de exonuclease 3’ – 5’, que
corrige esses erros. Enquanto esta atividade de polimerização do DNA possui uma
fidelidade bastante acurada (fator de discriminação entre taxas de nucleotídeos
corretos e incorretos de 104 a 106), o processo de iniciação por protein-primed de
tem se mostrado razoavelmente inacurado, com um fator de discriminação de
apenas 102. A iniciação ocorre opostamente ao resíduo 3’ terminal do molde de DNA
e consiste na formação de uma ligação covalente fosfodiéster entre o grupo hidroxila
da Ser232 do molde e 5’-dAMP catalisada pela Φ29 DNA polimerase na presença de
íons de metais divalentes. O produto, molde-dAMP, não é degradado pela atividade
de exonuclease 3’-5’. Por outro lado, a baixa fidelidade da Φ29 DNA polimerase
durante a iniciação pode produzir uma alta taxa da mutação no produto de iniciação.
A outra ponta do produto de iniciação na frente do resíduo 3’-terminal do molde
46
permite que o segundo nucleotídeo sirva, em um segundo momento, como molde
para um passo seguinte, a formação do molde-(dAMP)2. Esse mecanismo é
proposto para controlar a fidelidade da reação de iniciação. Após alguns passos de
transição, a Ф29 DNA polimerase replica cada fita de DNA. Devido a um processo
ativo e capacidade de descarte, essa DNA polimerase não necessita ajuda de
nenhuma helicase ou fator de processamento para replicar completamente seu
molde, o molde-DNA. Três subdomínios funcionais responsáveis pela polimerização
foram definidos por comparação com estruturas cristalográficas de várias DNA
polimerases das famílias A e B, de acordo com sua similaridade estrutural com a
mão direita: palma, dedos e polegar. A palma contém o sítio ativo de polimerização,
enquanto o polegar tem sido proposto por ser importante na ligação ao DNA e
processamento, e o subdomínio dos dedos mostrou sofrer alterações
conformacionais induzidas pelo substrato na ligação tanto do DNA como dos dNTPs,
girando além da palma e formando um bolsão de ligação ao dNTP (Figura 7). Em
concordância com isso, o motivo B (Figura 8) altamente conservado, localizado no
subdomínio dos dedos, está envolvido na ligação ao molde e ao primer e na seleção
de dNTPs em DNA polimerases tipos A e B (TRUNIGER et al., 2003). O papel do
motivo B (seqüência consenso “KLX2NSXYG” na família da DNA polimerase B)
(BLASCO et al., 1993a) foi primeiramente estudado através de mutação sitio-dirigida
em Φ29 DNA polimerase. Tyr390 está envolvido na ligação de dNTP dependente de
DNA e provaelmente desempenha função de checagem de pareamento de bases.
Mutações em Gly391 afetaram a ligação ao DNA, enquanto mutações nos
aminoácidos Asn387 e Ser388 causaram fenótipos intermediários. Além disso, a
Lys383, não alterada, mostrou ser um dos dois resíduos que interagem diretamente
com os grupos fosfato dos nucleotídeos que estão sendo adicionados na seqüência
(TRUNIGER et al., 1998). Outros motivos seqüenciais dentro das DNA polimerases
virais parecem estar envolvidos na formação do sítio ativo dessas enzimas, como o
motivo “Dx2SLYP” (BLASCO et al., 1993b), essencial no processo de polimerização
e os motivos “Tx2A/GR” (MÉNDEZ et al., 1994), “YxDSTS” (BERNAD et al., 1990),
“KxY” (BLASCO et al., 1995).
47
Figura 7. Esturura da RB69 DNA polimarese, homóloga da Φ29 DNA polimerase, apresentando os três subdomínios funcionais – Palma, Dedos e Polegar, e mostrando o processo de ligação ao molde de DNA e aos nucleotídeos. Adaptado de TRUNIGER et al. (2003.).
Figura 8. Estrutura do Motivo B da RB69 DNA polimerse, homóloga da Φ29 DNA polimerase, apresentado sua relação no processo de polimerização do DNA. Adaptado de TRUNIGER et al. (2003).
48
Dois mecanismos de fidelidade foram identificados durante o processo de
polimerização do DNA: 1) discriminação na inserção de nucleotídeos; 2) Prova de
leitura exonucleolítica: atividade de exonuclease 3’-5’ da DNA polimerase na
terminação 3’-OH do primer mais rapidamente do que nucleotídeos corretamente
pareados. A etapa de inserção de pares de base discriminada pode operar em dois
níveis: Primeiro, dNTPs pareados erradamente se ligam com menos afinidade do
que os corretos, provavelmente devido à rápida taxa de dissociação de nucleotídeos
pareados erradamente; Segundo, a taxa de catálise de ligações fosfodiéster pode
ser mais lenta para nucleotídeos pareados erroneamente do que para os corretos.
Isto se deve a alterações conformacionais intermediárias da DNA polimerase que
podem ser especialmente desfavoráveis. Por outro lado, a atividade exonucleolítica
é provavelmente baseada em dois mecanismos: Primeiro, um terminal 3’ mal
pareado é intrinsecamente mais fácil de ser corrigido e é, de certa forma, o melhor
substrato para a atividade de exonuclease, de acordo com o modelo “dissolver e
remover” para exonucleólise; Segundo, a adição de um nucleotídeo pareado
erroneamente ao terminal 3’ é um passo ineficiente, aumentando o tempo de
exposição da base mal pareada a atividade da exonuclease. Todos esses passos
vêm sendo analisados em diferentes DNA polimerases, e a importância relativa de
cada um é dependente de uma DNA polimerase específica (ESTEBAN, et al., 1992).
Um dos mecanismos de replicação de DNA linear é baseado no uso tanto de
proteínas quanto primers específicos. Uma interação estável e especifica dessas
proteínas com as DNA polimerases permite uma síntese a partir do terminal 3’ da fita
molde de DNA. Semelhantemente, como resultado desse mecanismo, alguns grupos
de vírus e plasmídeos lineares possuem proteínas covalentemente ligadas ao
terminal 5’ no final dos seus genomas lineares. Estudos da replicação de DNA linear
em adenovírus e vírus Φ29 tornaram mais fortes as evidências que proteínas e
primers desempenham um importante papel no processo de iniciação da replicação
desse tipo de DNA (BLANCO et al., 1991).
Mitocôndrias e alguns bacteriófagos codificam pequenas RNA polimerases de
subunidade simples. A RNA polimerase do bacteriófago T7 executa um processo de
transcrição promotor específica in vitro e in vivo como uma enzima de subunidade
simples de 99K, e foi a primeira da sua família de RNA polimerases estruturalmente
simples a ser identificada e superexpressada. O mecanismo de transcrição da T7
RNA polimerase compartilha algumas similaridades aparentes com as outras RNA
49
polimerases de multisubunidades. Como na RPO de E. coli, a T7 RNAP reconhece
um promotor específico na seqüência, abrindo a dupla fita de DNA e expondo a fita
codificante para molde (SOUSA et al., 1993). A homologia entre a T7 RNAP e a bem
estudada DNA polimerase da família I é importante para desvendar a base estrutural
da diferenças funcionais entre RNA e DNA polimerases (JERUZALMI; STEITZ,
1998).
A estrutura da T7 RNA polimerase (Figura 9) é altamente α-helicóide com
dimensões de 75 x 75 x 65 Å. Esta enzima consiste de um domínio de polimerase
(aa 326 – 883) e outro domínio N-terminal (aa 1 – 325). O domínio de polimerase
pode ser subdividido em polegar, dedos e palma, nomeado como uma estrutura
análoga à mão direita. Estes subdomínios têm sido observados em todas as famílias
de polimerases com proteínas depositadas em bancos de dados (JERUZALMI;
STEITZ, 1998 apud OLLIS et al., 1985; KOHLSTAEDT et al., 1992; PELLETIER et
al., 1994; WANG et al., 1997). O domínio palma é considerado a parte da enzima
que emergiu do “mundo de RNA”, onde o processo de polimerização era catalisado
por ribozimas, e isso é suportado não só pela ampla distribuição desse domínio nas
RPOs atuais, mas também pela ligação estrutural, por inferência, e evolutiva do
domínio palma e o domínio do motivo de reconhecimento de RNA (MRR), um antigo
domínio de ligação ao RNA que pode ter, inicialmente, facilitado a replicação das
ribozimas (KOONIN et al., 2006).
O sítio ativo da T7 RPO, o qual foi identificado através de mutações que
interromperam a atividade catalítica (BONNER et al., 1992), está localizado dentro
de uma profunda cavidade formada pelos três subdomínios: polegar, dedos e palma.
Os aminoácidos Asp537 e Asp812, presentes no domínio palma, estão envolvidos no
processo de catálise (STEITZ, 1994). No domínio dos dedos existem também dois
aminoácidos envolvidos no processo catalítico – Tyr639 e Lys631 (SOUSA et al.,
1993). A estabilização do processo de replicação é realizada através do domínio
polegar (BONNER et al., 1992). O domínio N-terminal está localizado à frente dos
subdomínios palma e polegar e confere a forma côncava à enzima (MULLER et al.,
1988; CHEETHAM et al., 1999; CHEETHAM; STEITZ, 1999). Regiões sensíveis a
proteases têm sido mapeadas entre os resíduos 170 – 180 (SOUSA et al., 1993).
50
2.7 FILOGENIA E EVOLUÇÃO MOLECULAR
A inferência de filogenias a partir de dados moleculares, como muitos outros
problemas quantitativos em ciência, é a mais poderosa dentro de um modelo
baseado em análises estatísticas (MAR et al., 2005). Para reconstruir relações
filogenéticas moleculares é necessário proceder hierarquicamente. Primeiramente é
necessário selecionar as seqüências (DNA ou aminoácidos) e alinhá-las, a fim de
detectar homologos a partir do DNA, ou diferenças nas seqüências de aminoácidos.
Outro passo consiste em criar modelos matemáticos que descrevam a evolução
dessas seqüências. Um modelo pode ser construído empiricamente, utilizando
propriedades calculadas através de comparações de seqüências observadas, ou
parametricamente, usando propriedades químicas ou biológicas do DNA e
aminoácidos, como por exemplo, valores de hidrofobicidade de cada aminoácido.
Cada modelo permite estimar a distância genética entre duas seqüências
Figura 9. Estrutura da T7 RNA polimerase, mostrando os três subdomínios: Palma, Polegar e Dedos. Adaptado de JERUZALMI; STEITZ (1998).
51
homólogas, medidas pelo número esperado de substituições de nucleotídeos por
sítio que tem ocorrido nas linhagens evolutivas entre elas e seus ancestrais comuns
mais recentes. Cada distância pode ser representada por um tamanho de ramo em
uma árvore filogenética; as seqüências homólogas formam as pontas dos ramos,
enquanto as seqüências do ancestral se localizam nos nós internos da árvore e são
geralmente desconhecidas. Aplicar um método estatístico apropriado é um passo
bastante importante para encontrar a topologia da árvore e o tamanho dos ramos
que melhor descrevem as relações filogenéticas das seqüências. O último passo é a
interpretação desses resultados. Qualquer comparação de mais de duas seqüências
relacionadas implicitamente assume uma abordagem filogenética. Para algumas
tarefas, a comparação por pareamento de seqüências é o bastante (por exemplo,
BLAST), mas também esses algoritmos podem ser aperfeiçoados quando se
consideram informações de mais de duas seqüências simultaneamente (por
exemplo, PSI-BLAST) (HOLDER; LEWIS, 2003).
Em 1965, Zuckerkandl e Pauling propuseram a teoria de relógio molecular, na
qual a taxa de evolução é aproximadamente constante durante todo o tempo para
todas as proteínas em todas as linhagens. De acordo com essa teoria, qualquer
tempo de divergência entre genes, proteínas ou linhagens, pode ser simplesmente
medido pelo numero de alterações entre as seqüências. Pouco tempo depois, em
1969, Jukes e Cator propuseram o modelo estocástico para substituição do DNA no
qual a substituição de todos os nucleotídeos ocorre numa taxa igual, e quando um
nucleotídeo é substituído, nenhum dos outros nucleotídeos é igualmente reposto.
Essas duas hipóteses de relógio molecular são consideradas extremamente simples.
Taxas de mutação podem variar dentro e entre genomas, sendo afetadas por
diversos fatores, tais como posição cromossomal, conteúdo G/C, bases vizinhas, e
eficiência de diferentes sistemas de reparo entre a forma e o tempo de utilização das
fitas de DNA nos processos de replicação e transcrição. Todos os relógios
moleculares parecem alcançar diferentes taxas para diferentes posições do DNA.
Entretanto, sabe-se que o processo de incorporação de pares de bases erradas
durante a replicação ou reparo é facilitado se a base é substituída por uma similar e,
por isso, transições ocorrem mais freqüentemente do que transversões: duas vezes
mais freqüentes, em média, mas a taxa pode ser mais alta. Diferenças nas taxas de
mutação tendem a decrescer para dímeros de TA e CG e produzir um excesso de
dímeros CT e TG (LIÒ; GOLDMAN, 2006).
52
Dentro das abordagens de reconstrução filogenética mais comuns,
encontram-se o algoritmo de Neighbor-joining (NJ) e a busca de árvores com
otimização de critério tais, como Parcimônia e Máxima Verossimilhança (Maximum-
likelihood – ML). A primeira abordagem é extremamente popular e relativamente
rápida e, como todos os métodos, a performance sai muito bem quando a
divergência entre os grupos é baixa. Antes da análise, o algoritmo de NJ converte as
seqüências de DNA e proteína em uma matriz que representa uma estimativa da
distancia evolutiva entre seqüências. Uma fraqueza potencialmente séria para
métodos de distância tais como NJ, é que as diferenças observadas entre as
seqüências não refletem muito bem a distância evolutiva entre elas. Múltiplas
substituições em um mesmo local tornam obscura a real distância e faz as
seqüências se tornaram mais relacionadas umas com as outras de uma maneira
artificial. O algoritmo de Neighbor-joining é uma ferramenta bastante rápida para
gerar árvores filogenéticas que divergiram recentemente, sendo pouco utilizável para
inferir relações antigas de parentesco.
Análises de parcimônia assumem que caracteres apomórficos compartilhados
por diferentes táxons (sinapomorfias) provêm de um ancestral comum exclusivo.
Grupos monofiléticos são formados com base em um ou mais carcteres apomórficos
compartilhados, e a explicação mais simples (ou a mais parcimoniosa) para a
evolução desses caracteres é considerada como a correta. Com múltiplos
caracteres, diferentes agrupamentos podem ser igualmente plausíveis, ou
igualmente parcimoniosos, e então múltiplas árvores podem ser geradas. Em cada
caso, uma árvore de consenso estrito pode ser obtida e deve incluir topologias que
não contradizem nenhuma das árvores iniciais. Se a árvore de consenso estrito não
é suficientemente resolvida (ausência de politomias), não existe congruência entre
as árvores iniciais, e então os dados utilizados para a construção da árvore não
possuem informação filogeneticamente válida. Uma árvore de consenso da maioria
apresenta nós que são consistentes em pelo menos metade de todas as árvores
mais parcimoniosas e as porcentagens de árvores em que cada topologia aparece
são apresentadas. Entretanto, por definição, todas as árvores mais parcimoniosas
são consideradas de boa qualidade, e caso haja incongruência, os nós em questão
devem colapsar (HARRISON e LANGDALE, 2006).
Aplicações baseadas em verossimilhança vêm se tornando especialmente
poderosas para inferir árvores filogenéticas, mas são computacionalmente lentas, e
53
necessitam de um espaço multidimensional de saídas possível para a geração das
árvores ótimas. Essa computação deve ser repetida, tipicamente entre 100 – 1000
vezes, se é utilizado um bootstrap não paramétrico que suportem sub-árvores
específicas. Como resultado, uma análise de máxima verossimilhança pode ser lenta
para problemas que envolvem um grande número de seqüências alinhadas, busca
compreensiva do espaço da árvore, e/ou muitas replicações no bootstrap (MAR et
al., 2005). Este método de inferência reconstrói muito bem relações entre
seqüências separadas por um longo período de tempo, ou que evoluíram muito
rapidamente, corrigindo eventos mutacionais múltiplos no mesmo sítio. Na máxima
verossimilhança, a hipótese é julgada pela melhor predição dos dados observados; a
árvore que possuir a maior probabilidade das seqüências observadas é a escolhida
(esta probabilidade é a verossimilhança da árvore). Para utilizar esta aplicação, é
necessário calcular a probabilidade de um conjunto de dados a ser apresentado por
uma árvore filogenética. Se há um modelo de evolução de seqüência que descreve
a probabilidade relativa de vários eventos (transição versus transversão), então uma
técnica padrão de equação diferencial pode ser utilizada para converter o modelo
em um estado de probabilidade de duas seqüências quaisquer em extremidades
opostas de um ramo (HOLDER; LEWIS, 2003).
A estatística bayesiana aplicada a análises filogenéticas é relativamente nova
quando comparada aos métodos tradicionais, mas bastante interessante, pois gera
tanto uma árvore estimada quanto o grau de incerteza de cada grupo naquela
árvore. Esse método estatístico é altamente relacionado com a Máxima
Verossimilhança. A hipótese ótima é aquela com a máxima probabilidade posterior.
A probabilidade posterior para uma hipótese é dada pela verossimilhança
multiplicada pela probabilidade a priori desta hipótese (HOLDER; LEWIS, 2003). A
inferência de filogenias por métodos bayesianos suporta modelos evolutivos
sofisticados, enquanto que os modelos de cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC),
particularmente com cadeias aquecidas, baseiam-se na distribuição da probabilidade
posterior de um exemplo com topologias nas quais as freqüências empíricas
relativas de uma dada topologia convergem para sua probabilidade marginal
posterior correspondente. A topologia com a mais alta freqüência relativa é
reportada, e a probabilidade posterior das subárvores pode ser estimada pelo
consenso das topologias (MAR et al., 2005). A análise filogenética bayesiana não
implementa apenas o algoritmo padrão de MCMC, mas também sua variante
54
chamada de Cadeia de Markov Monte Carlo Metropolis-conjugada ou MC3
(HUELSENBECK; RONQUIST 2001).
2.8 MODELAGEM POR HOMOLOGIA
O principal desafio dos projetos genomas é o conhecimento da estrutura de
novos alvos moleculares, principalmente proteínas e enzimas. O entendimento das
estruturas moleculares e fenômenos biológicos vêm adquirindo um papel cada vez
mais significativo no desenvolvimento de novos fármacos (SANTOS-FILHO,
ALENCASTRO, 2003). Para a melhor compreensão das funções de enzimas e
proteínas é necessário entender as interações que ocorrem entre essas
macromoléculas. A estrutura tridimensional de uma proteína traz informações sobre
a forma de interação e arrumação espacial dos aminoácidos e outras moléculas
(SÁNCHEZ; ŠALI, 1998; KUNDROTAS; ALEXOV, 2006).
A função bioquímica de uma proteína é definida por suas interações com outras
moléculas, sendo a função biológica conseqüência dessas interações. Desta forma,
a função de uma proteína é geralmente determinada por sua estrutura
tridimensional, que esclarece o mecanismo enzimático e a interação com inibidores,
mensageiros, receptores e transportadores. Por esta razão, é útil conhecer a
estrutura 3D das milhares de seqüências de proteínas que surgem de diversos
projetos genomas (SÁNCHEZ; ŠALI, 1998; FISER, 2004). Esse conhecimento
abrange desde descrições funcionais de baixo-nível, tais como confirmação da forma
da proteína e sua função geral, até descrições de alta-resolução com o
entendimento de especificidade de ligantes e desenho de inibidores no contexto de
descoberta de novos fármacos (FISER, 2004).
Apesar dos consideráveis avanços tecnológicos, sobretudo nas áreas de
cristalografia de raio-X, difração de nêutrons, e ressonância magnética nuclear
(RMN), muitos problemas básicos persistem. A obtenção de amostras necessárias
para um ensaio é, em muitos casos, muito difícil e os cristais obtidos nem sempre
possuem a qualidade necessária para o trabalho experimental. Além disso, em
certas classes de proteínas, como por exemplo, as proteínas da membrana celular, a
determinação da estrutura é um desafio. Essas proteínas raramente cristalizam e
dificilmente podem ser tratadas de modo satisfatório por RMN (SANTOS-FILHO;
ALENCASTRO, 2003). Em 1971 foi estabelecido o Protein Data Bank (PDB), pelo
55
Brookhaven National Laboratories, para arquivar as estruturas cristalinas de
macromoléculas biológicas, sendo iniciado com apenas sete estruturas. Na década
de 80, o número de deposições começou a crescer devido a melhorias na tecnologia
de processos cristalográficos e métodos de RMN. Grandes progressos vêm sendo
realizados no campo de estruturas experimentais por cristalografia de raio-X e RMN,
mas ainda consomem bastante tempo, sem a garantia de sucesso (BERMAN et al.,
2000). Atualmente existem cerca de 48.778 estruturas experimentais de proteínas
depositadas no PDB (Protein Data Bank) (acesso em 10 de fevereiro de 2008) , mas
quando comparadas às 5.072.048 seqüências protéicas depositadas no TrEMBL
(http://www.ebi.ac.uk/trembl/) observa-se que o número de estruturas resolvidas é
baixo (SCHWEDE et al., 2003).
Tendo em vista as dificuldades experimentais, a metodologia de modelagem
comparativa surgiu para contribuir para a elucidação de estruturas 3D de proteínas.
Esta técnica possui essencialmente três métodos: Ab initio1, enovelamento
(threading) e modelagem por homologia. A decisão de se optar por um ou outro
método baseia-se nas informações existentes sobre a proteína-problema,
principalmente na existência ou não de uma estrutura(s) homóloga(s) (GIBAS;
JAMBECK, 2001).
Modelar a estrutura de uma proteína requer uma grande habilidade em biologia
estrutural e o uso de programas altamente especializados para cada etapa individual
do processo de modelagem (SCHWEDE et al., 2003).
Os métodos de predição ab initio concentram-se na construção de uma estrutura
sem uma informação prévia. Estes métodos possuem pequenas bibliotecas de
segmentos a partir dos quais as estruturas podem ser construídas, e também
assumem que a estrutura nativa corresponde ao mínimo global de energia livre
durante o tempo de vida da proteína. Assim o espaço estrutural a ser buscado no
modelo é restrito. Desta forma, procura-se encontrar uma região de mínimo através
da exploração de várias conformações protéicas possíveis de existir. Ferramentas
para a modelagem por este método estão disponíveis online (
http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/i-sites/Isites/download.html e
http://www.bioinfo.rpi.edu/~bystrc/hmmstr/server.php). No entanto, pouco é
compreendido sobre o enovelamento de proteínas, o que torna esta metodologia
1 O termo ab initio utilizado para determinar a estrutura 3D de proteínas não está correlacionado com os métodos ab initio utilizado pela Química Computacional.
56
ainda insipiente (BYSTROFF; SHAO, 2002; BYSTROFF, et al., 2004; YUAN,
BYSTROFF, 2004).
A metodologia de enovelamento (threading) é recomendada quando a
similaridade é pequena, ou quando, embora haja a mesma topologia, ocorram
diferenças estruturais na região não-conservada, ou mesmo no tamanho das
seqüências (PANCHENKO et al., 2000). Diferente do método ab initio, em que todas
as conformações possíveis são exploradas, no threading o espaço de pesquisa
limita-se a conformação de estruturas conhecidas, podendo falhar para qualquer
proteína com uma seqüência completamente nova (BRYANT, 1996). Vários
exemplos destes métodos podem ser encontrados no site do Expert Protein Analysis
System – ExPASy oferecido pelo Swiss Institute of Bioinformatics
(http://ca.expasy.org/tools/#tertiary).
A Modelagem por Homologia é baseada principalmente no processo de evolução
biológica, obedecendo a padrões que mostram que: (a) homologia entre seqüência
de aminoácidos implica em semelhança estrutural e funcional; (b) proteínas
homólogas apresentam regiões internas conservadas (principalmente constituídas
de elementos de estrutura secundária: α-hélices e folhas-β); (c) as principais
diferenças estruturais entre proteínas homólogas ocorrem nas regiões externas
(loops) que ligam os elementos de estrutura secundária (SANTOS-FILHO;
ALENCASTRO, 2003). De maneira geral, a seqüência é menos conservada do que a
estrutura, porém, o sucesso desta metodologia depende da identidade entre as
proteínas-alvos e seus homólogos. A Modelagem por Homologia é a ferramenta de
predição com os resultados mais bem sucedidos até o momento (SANTOS-FILHO;
ALENCASTRO, 2003). Esta metodologia consiste em estudar a geometria e as
propriedades das moléculas com técnicas computacionais, contribuindo para
elucidar as interações intra e intermoleculares, mecanismos de reações químicas,
estrutura e função de proteínas difíceis de serem purificadas em larga escala,
utilizando dados experimentais (raio-X e RMN) (FIGUEIREDO et al., 2005).
A predição de estruturas tridimensionais de proteínas por comparação produz
um modelo de seqüência para todos os átomos, baseado em um alinhamento para
uma ou mais estruturas protéicas relacionadas. A construção dessas moléculas por
modelagem comparativa inclui modelos tanto simultâneos quanto seqüenciais do
núcleo da proteína, loops, e cadeias laterais. Na abordagem comparativa original,
um modelo é construído a partir de poucos moldes do centro da proteína, e de loops
57
e cadeias laterais obtidos tanto de alinhamentos quanto de estruturas não
relacionadas. Uma outra família de métodos de modelagem comparativa necessita
de posições aproximadas de átomos conservados dos moldes para calcular as
coordenadas dos átomos do modelo a ser criado. Um terceiro grupo de técnicas
utiliza tanto distâncias geométricas quanto técnicas de otimização para satisfazer
restrições espaciais obtidas do alinhamento seqüência-molde. Existem também
métodos que se especializaram em modelagem de loops e cadeias laterais com
ambiente controlado provido pelo restante da estrutura (BAKER; SALI, 2001).
O processo geral de Modelagem por Homologia possui alguns passos, como (i)
localizar a estrutura 3D de uma proteína conhecida; (ii) produzir o melhor
alinhamento global possível entre a seqüência desconhecida (seqüência-problema)
e o modelo; (iii) construir um modelo do arcabouço da proteína, tendo o arcabouço
da estrutura como molde; (iv) nas regiões onde há lacunas (alvo ou molde), realizar
a modelagem de alças para substituir os segmentos de extensão apropriada; (v)
acrescentar cadeias laterais ao arcabouço do modelo; (vi) otimizar as posições das
cadeias laterais e (vii) refinar a estrutura com minimização de energia (GIBAS,
JAMBECK, 2001) e finalmente, (vii) validar o modelo construído (GOLDSMITH-
FISCHMAN; HONIG, 2003; SANTOS-FILHO; ALENCASTRO, 2003; PATNY et al.,
2006).
Os moldes para a modelagem podem ser encontrados através de métodos de
comparação de seqüências, tais como PSI-BLAST, ou baseados em métodos de
Threading seqüência-estrutura que podem revelar, algumas vezes, relações mais
distantes do que puramente baseadas em seqüências. No último caso, a formação
das dobras e alinhamento são alcançadas através da montagem da seqüência
através de uma biblioteca conhecida para todas as dobras. Cada alinhamento
seqüência-estrutura é analisado pela energia de um modelo rugoso (coarse model),
mas não pela similaridade das seqüências como nos métodos de comparação de
seqüências (BAKER; SALI, 2001).
Programas como o Swiss Model, um servidor de modelagem por homologia
desenvolvido pelo Swiss Institute of Bioinformatics (SIB -
http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html), auxiliam na construção do
modelo, utilizando o programa Swiss PDB Viewer (GUEX; PEITSCH, 1997), que se
trata de um ambiente gráfico interativo que analisa tanto a proteína como a estrutura
58
do ácido nucléico e, combinado um processo automatizado, retorna a estrutura da
nova proteína modelada (GUEX; PEITSCH, 1997).
A confiança de um modelo comparativo está relacionada com a porcentagem
da identidade da seqüência no qual ele foi baseado, correlacionando com a
similaridade seqüência-estrutura de duas proteínas. Dentro de uma escala de
confiança podemos considerar modelos com alta confiança os que possuem
identidade acima de 50% com seus moldes; modelos de confiança intermediária os
que possuem entre 30 e 50% de identidade; e aqueles modelos com identidade
menor que 30% com seus moldes são considerados de baixa confiança. Os erros de
alinhamento aumentam significativamente quando a identidade das seqüências com
os moldes está abaixo de 30%, sendo uma das principais causas na geração de
modelos errados. Outros fatores tais como a seleção dos moldes e a qualidade do
alinhamento influenciam na qualidade do modelo, especialmente quando esses
modelos são baseados em moldes com menos de 40% de identidade. As aplicações
de estruturas protéicas geradas a partir de modelagem comparativa abrangem um
amplo espectro, principalmente no desenvolvimento de novos fármacos, estudos de
mutagênese sítio-dirigida e estabilidade de proteínas. Estas aplicações são
diretamente relacionadas com a resolução estrutural do modelo gerado (Figura 10)
(BAKER; SALI, 2001).
Embora existam três distintas metodologias disponíveis para a geração de
modelos moleculares tridimensionais, a confiabilidade dos métodos ab initio e
threading é muito pequena para problemas que requerem boa qualidade de
informação estrutural, como por exemplo, o desenho de fármacos baseado na
estrutura do alvo. Por outro lado, a Modelagem por Homologia é melhor sucedida em
relação às demais. No entanto, esta somente fornece modelos razoáveis quando o
grau de homologia entre as proteínas molde e alvo é acima de 25%. Esta conclusão
é baseada pela competição existente na área denominada de “Critical Assessment
of techniques for protein Structure Prediction” (CASP), a qual avalia as diferentes
metodologias existentes para a predição de estruturas (HÖLTJE et al., 2003).
59
Figura 10. Relação entre a resolução obtida para um determinado modelo protéico e suas aplicações. Adaptado de BAKER; SALI (2001).
60
2.8.1 Química Computacional
Devido à necessidade de se entender o comportamento de biomacromoléculas,
são criados modelos teóricos utilizando a Química Computacional. Essa ferramenta
simula estruturas e reações químicas matematicamente, através de modelos
baseados parcial ou completamente nas leis fundamentais da física. Estes modelos
possibilitam o estudo de fenômenos químicos por meio de cálculos realizados em
computador antes de examinar estes fenômenos experimentalmente. É possível,
portanto, simular fenômenos que geralmente não existem naturalmente, mudando o
conceito de que o processo de fazer ciência está relacionado diretamente ao estudo
de fenômenos dados pela natureza. Além da modelagem de moléculas estáveis,
alguns métodos podem ser usados também na modelagem de intermediários de
reações instáveis e também estados de transição, fornecendo informações sobre
moléculas e reações químicas impossíveis de serem obtidas através de estudos
puramente experimentais. Portanto, a Química Computacional é tanto uma área de
pesquisa independente quanto um importante complemento a estudos experimentais
(FORESMAN; FRISCH, 1996).
Existem várias metodologias dentro da Química Computacional, que são
utilizadas a depender do fênomeno físico-químico e dos recursos computacionais
disponíveis. Para biomacromoléculas, utilizam-se os métodos que combinam
mecânica quântica com mecânica molecular (QM/MM), e somente mecânica
molecular (MM).
A metodologia QM/MM foi descrita pela primeira vez por Warshel e Levitt (1976).
Estes métodos envolvem o tratamento de uma pequena região do sistema que pode
requerer um formalismo mecânico-quântico (QM), exigindo quebra e formação de
ligação, por exemplo, semi-empírico, ab initio ou, pela teoria do funcional de
densidade (DFT), tratando a região remanescente da proteína e do solvente com um
método de mecânica molecular, o qual possui menor custo computacional. Esta
metodologia híbrida tem sido desenvolvida devido ao alto custo computacional
requerido pelos métodos QM quando aplicados a grandes sistemas (MONARD;
MERZ, 1999). No presente trabalho, será dada ênfase aos métodos de Mecânica
Molecular, uma vez que os métodos híbridos não foram utilizados por não se
aplicarem ao problema em questão.
61
Os métodos de MM usam as leis da mecânica clássica para prever a energia
associada a uma dada conformação (estrutura) e propriedades moleculares. O
modelo considera os átomos como esferas de raios característicos e as ligações
como molas com diferentes elasticidades. A matemática relacionada à deformação
de molas pode ser usada para descrever os movimentos (estiramentos,
deformações e torções) e para calcular a energia potencial associada a eles (Figura
11) de modo a predizer a energia total associada a uma dada conformação
molecular (FORESMAN; FRISCH, 1996).
A energia total da molécula, Etotal, é dada pela soma de um conjunto de
equações, todas funções de energia potencial, que descrevem as características das
moléculas:
E total = Er + E + E + Enl + ....
Onde Er é a energia associada a uma ligação que está sendo estirada ou
comprimida em relação ao seu comprimento de ligação natural e, de modo similar,
em relação aos ângulos de ligação, ângulos torcionais e a energia relacionada a
interações entre átomos não ligados, E, E e Enl, respectivamente.
Todas estas funções de energia potencial requerem dados (parâmetros) para
descrever os diferentes tipos de átomos e ligações, geralmente obtidos
experimentalmente, e juntas definem o que é denominado de campo de força. As
Figura 11. Movimentos atômicos de estiramento de ligação, de deformação angular, de torção e interação entre átomos não ligados.
62
equações usadas são relativamente simples e são desenvolvidas para uma
determinada classe de compostos. Existem diferentes tipos de campos de forças
que se diferenciam de acordo com a forma matemática dos termos de energia e
caracterizam os diferentes métodos de mecânica molecular. Dependendo dos
objetivos de estudo, outros componentes de energia também podem ser incluídos
(FORESMAN; FRISCH, 1996).
Os métodos de mecânica molecular não consideram explicitamente os
elétrons em um sistema molecular (baseiam-se em interações entre núcleos),
embora os efeitos eletrônicos estejam implicitamente incluídos nos campos de força
através da parametrização.
Esta aproximação torna os cálculos de mecânica molecular
computacionalmente rápidos, permitindo seu uso em sistemas muito grandes,
contendo até milhares de átomos. Entretanto, estes métodos possuem várias
limitações, entre as mais importantes destacam-se as seguintes:
a) Cada campo de força permite que se alcance bons resultados somente
para uma classe limitada de moléculas relacionadas com aquelas as quais o
campo de força foi parametrizado.
b) Como não levam em consideração os elétrons, estes métodos não podem
ser aplicados em problemas químicos onde os efeitos eletrônicos são
predominantes, como, por exemplo, em processos que envolvam formação ou
quebra de ligações (BYSTROFF; SHAO, 2002; FORESMAN; FRISCH, 1996;
BYSTROFF et al., 2004; YUAN, BYSTROFF, 2004).
c) Propriedades moleculares que dependem de detalhes da estrutura
eletrônica também não são reprodutíveis pelos métodos de mecânica
molecular (FORESMAN; FRISCH, 1996).
Cálculos de mecânica molecular são preferencialmente usados no estudo de
moléculas grandes, tais como proteínas, enzimas, polímeros, DNA, etc., como, por
exemplo, em problemas que envolvam o reconhecimento molecular, processo
fundamental dos sistemas bioquímicos e importante ponto de partida para a
descoberta de novos fármacos (PATRICK, 2001). O modelo geral de interações
fármaco-alvo molecular é equivalente ao modelo chave-fechadura de interações
enzima-substrato. O alvo molecular ideal para um fármaco seria a de uma molécula
cuja superfície fosse exatamente complementar a superfície do referido fármaco, em
termos eletrônicos e estéricos. Esta metodologia é denominada de docking
63
(BYSTROFF, SHAO, 2002), que é o estudo da interação ligante-enzima por métodos
de mecânica molecular (MM) ou através de métodos híbridos, a qual fornece
informações da interação entre o fármaco e o seu alvo biológico. De posse destas
informações podem-se estudar as interações intermoleculares entre o ligante e a
enzima-alvo, possibilitando, em uma etapa posterior, a proposição de modificações
do composto protótipo2 (BARREIRO; FRAGA, 2001; BYSTROFF; SHAO, 2002).
Ambos os métodos descritos anteriormente calculam a energia de uma estrutura
molecular particular (arranjo espacial de átomos) e propriedades relacionadas a
energia; e também executam a otimização da geometria, localizando a estrutura de
menor energia próxima da estrutura de partida especificada. A otimização da
geometria depende primariamente do gradiente da energia - a derivada primeira da
energia em relação às posições atômicas (Figura 12), gerando assim a superfície de
energia potencial (SEP) (FORESMAN; FRISCH, 1996).
Existem vários métodos MM (campos de força) os quais diferem-se pela natureza
das equações, assim como detalhes de suas parametrizações. A lista a seguir são
exemplos de campos de força: SYBYL, MMFF94, MMX, MM3, FF99 (AMBER), UFF,
CVFF, CHARMM, GROMOS, dentre outros.
2 Composto orgânico com desejável atividade biológica. Esta atividade normalmente é otimizada por diferentes métodos utilizados pela Química Medicinal, incluindo docking.
Figura 12. Superfície de Energia Potencial.
64
Campos de força comuns utilizados em cálculos de mecânica molecular são
baseados, em princípio, no uso de funções de equações de energia potencial. Por
outro lado, campos de força usados em modelagem de proteínas diferem dos
campos de força utilizados na modelagem de pequenas moléculas. Em alguns
campos de força, hidrogênios não-polares não são representados explicitamente,
mas são incluídos na descrição dos átomos pesados (C, N, O) aos quais eles estão
ligados; os hidrogênios polares, os quais podem atuar como parceiros potenciais nas
ligações de hidrogênio, são tratados explicitamente (HÖLTJE et al., 2003). Esse
procedimento, chamado de modelo dos átomos unidos, é utilizado pelo campo de
força AMBER (WEINER et al., 1984; WEINER et al., 1986).
2.8.2 Emprego da Química Computacional na Modelagem por Homologia
Proteínas obtidas a partir de modelagem ou estruturas cristalográficas
necessitam de um refinamento, pois durante o processo de modelagem, a
conformação dos loops e das cadeias laterais, em geral, é escolhida arbitrariamente.
Devido a isso, as conformações dos modelos obtidos não correspondem a estruturas
energeticamente favoráveis (HÖLTJE et al., 2003). Estruturas cristalinas também
necessitam de refinamento para que possam se removidos comprimentos de ligação
muito extensos e interações atômicas não favoráveis (átomos muito próximos entre
si). Em ambos os casos, a desordem na posição dos átomos leva a formação de
forças que resultam em movimentos distantes da estrutura original quando o
processo de minimização se inicia. A metodologia geral para se eliminar isso é
“relaxar” o modelo de forma gradativa. Assim, os métodos de MM utilizam algoritmos
para otimizar a geometria encontrando a conformação de menor energia na SEP. Os
algoritmos aplicados para otimização de geometria normalmente encontram regiões
de mínimo nas SEP próximo as coordenas inicias (geometria de partida). Dentre os
métodos de minimização de energia mais utilizados estão o Steepest Descent e
Gradiente Conjugado. Esses dois métodos utilizam técnicas que calculam a primeira
derivada da energia (LIPKOWITZ; BOYD, 1990).
O algoritmo de Steepest Descent calcula a energia da geometria inicial, e
segue aplicando um pequeno movimento nos átomos, conforme parametrizado pelo
campo de força que está sendo utilizado, gerando assim uma nova geometria. Desta
forma, este processo é então repetido sempre buscando uma região de mínimo na
65
superfície potencial. O processo total somente para quando condições pré-
estabelecidas são alcançadas (valores de energia ou número de interações). Como
este método é muito lento próximo às regiões de mínimo, ele é utilizado somente
para gerar uma geometria mais adequada para um outro algoritmo de minimização
de energia mais sofisticado, como o Gradiente Conjugado (LIPKOWITZ; BOYD,
1990).
O Gradiente Conjugado acumula a informação da função de uma interação
anterior, calculando um novo vetor em direção à região de mínimo, gerando uma
nova estrutura que será continuamente refinada. O custo computacional deste
método é maior do que Steepest Descent. No entanto, isso é compensado pela sua
eficiente convergência para a região de mínimo (LIPKOWITZ; BOYD, 1990).
Dessa forma, para estruturas longe do mínimo são utilizados algoritmos como
Steepest Descent para as 10-100 primeiras interações, e a seguir, o processo de
refinamento é concluído com o método de Gradiente Conjugado ou com um método
que utiliza a segunda-derivada, como por exemplo, Newton-Raphson (LIPKOWITZ;
BOYD, 1990).
Se o modelo gerado é baseado somente em técnicas de modelagem
comparativa, os loops e as cadeias laterais necessitam de um refinamento mais
apurado. Isto se deve ao fato que a geometria obtida pelo processo de otimização
representa somente uma possível conformação encontrada pelo algoritmo na região
de mínimo local. Sendo assim é necessário investigar o comportamento
conformacional através da SEP para que se possa aproximar o máximo possível da
região de mínimo global, encontrando a estrutura 3D mais favorável
energeticamente. A metodologia utilizada para resolver esta questão é a Dinâmica
Molecular (DM), que é um processo sistemático de busca conformacional, sendo
uma ferramenta bastante útil para se encontrar várias regiões de mínimo da SEP
(HÖLTJE et al., 2003).
As simulações de DM usam como estrutura de partida a geometria previamente
refinada a qual aplica, de forma integrada, equações clássicas de movimento
durante um período de tempo para o sistema molecular, em uma determinada
temperatura. A trajetória resultante pode ser utilizada para observar o
comportamento da molécula durante este período de tempo, sendo este o objetivo
desta metodologia. Este método se baseia na MM, assumindo que os átomos
66
interagem entre si de acordo com a parametrização empregada pelo campo de
força.
Diferentemente dos processos de otimização, a dinâmica molecular é capaz de
ultrapassar barreiras torcionais entre diferentes conformações. Dessa forma, é
possível encontrar outras regiões de mínimo além da região próxima da estrutura de
partida. No entanto, se estas barreiras são muito altas ou a estrutura possui um
número muito grande de graus de liberdade, então algumas conformações podem
não ser encontradas devido a um curto tempo utilizado pela simulação. Uma
estratégia para contornar este problema é utilizar elevadas temperaturas. Os
protocolos de DM geralmente usam as temperaturas de 300 K, 400 K e 600 K,
fornecendo energia cinética suficiente para que as barreiras rotacionais de energia
possam ser ultrapassadas entre diferentes conformações, explorando melhor a SEP.
O Emprego de altas temperaturas em simulações de DM têm sido proposto, sendo a
metodologia de simulated annealing uma das mais empregadas.
Dinâmica Molecular representa uma ferramenta adicional que pode ser usada
para investigar as possíveis diferenças conformações de uma biomacromolécula. No
entanto, seu uso necessita de cuidados devido à escolha do método e as condições
de simulação para que se possa assegurar a completa busca conformacional e a
validação dos resultados (PATNY, et al., 2006).
67
3 METODOLOGIA
3.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA
O processo de Modelagem por Homologia das DNA e RNA polimerases do
plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa utilizou, para a construção das estruturas
tridimensionais, seqüências de aminoácidos dessas duas enzimas e moldes obtidos
a partir de buscas em bancos de dados especializados na Internet. Todos os
programas utilizados na construção dos modelos primitivos das DPO e RPO do
plasmídeo de M. perniciosa são de distribuição gratuita.
Para a determinação dos valores de cutoff foi utilizado o programa
BIOMEDCACHE 6.1 (FUJITSU, 2005). Para os cálculos de refinamento e Dinâmica
Molecular das estruturas tridimensionais das duas polimerases do plasmídeo de M.
perniciosa foi utilizado o campo de força AMBER 8.0 (WEINER et al., 1984; WEINER
et al., 1986), instalado no supercomputador REDWOOD da University of Mississippi
– USA. Esses cálculos foram submetidos através do programa cliente de FTP (File
Transfer Protocol) SSH Secure Shell Client.
A construção das estruturas tridimensionais das DNA e RNA polimerases do
plasmídeo de Moniliophthora perniciosa utilizou seqüências primárias (aminoácidos)
dessas proteínas (FORMIGHIERI et al., 2008). Inicialmente foram feitas as buscas e
seleções dos moldes no PDB (Protein Data Bank) para a construção dos modelos;
as seqüências aminoacídicas desses moldes foram alinhadas com as seqüências
das proteínas-alvo. Após o alinhamento, as seqüências alvo juntamente com seus
respectivos moldes foram submetidas aos softwares de construção e refinamento
dos modelos (Figura 13).
68
Os modelos 3D das proteínas-problema foram construídos através da
metodologia de corpos rígidos (SANTOS-FILHO; ALENCASTRO, 2003) e otimizados
pelo campo de força ff99 (CASE, et al., 2004; PEARLMAN et. al., 1995). Todos os
processos de construção dos modelos iniciais até a obtenção dos modelos finais
foram realizados pelos programas SwissPdb Viewer 3.7, BioMedCache 6.1
desenvolvido pela Fujitsu (2005), e pelo pacote AMBER 8.0, seguindo-se a rotina
representada na figura 14. Todos os programas foram instalados em computador
tipo PC em ambiente Windows, exceto AMBER 8.0.
Figura 13. Etapas realizadas no processo geral de Modelagem por Homologia.
Identificação dos moldes
Alinhamento das seqüências
Construção da cadeia principal das regiões conservadas
Modelagem das alças
Modelo primitivo
Otimização e validação
ok
Modelo final
Modelagem das cadeias laterais
Não
Sim
Identificação dos moldes
Alinhamento das seqüências
Construção da cadeia principal das regiões conservadas
Modelagem das alças
Modelo primitivo
Otimização e validação
ok
Modelo final
Modelagem das cadeias laterais
NãoNão
Sim
69
Arquivos de topologia e de saída da dinâmica gerados pelo AMBER foram
lidos pelo programa VMD (Visual Molecular Dynamics) (HUMPHREY et al., 1996) a
fim de se avaliar o comportamento termodinâmico e observar a estabilidade da
proteína.
Figura 14. Etapas realizadas nos processos de refinamento e Dinâmica Molecular das estruturas 3D.
Construção do Modelo
Determinação de cut-off
Swiss Model
Neutralização: tLEaP AMBER
BioMedCache
AMBER
Minimização
Steepest Decent
Gradiente Conjugado
Dinâmica
300 ºK/300 ps
M o d e l o P r o p o s t o
70
3.1.1 Busca de Moldes para as DPO e RPO do plasmídeo de M. perniciosa
Seqüências aminoacídicas das DNA e RNA polimerases do plasmídeo do M.
perniciosa foram submetidas a uma busca dos seus respectivos moldes em formato
PDB através do banco de dados BLAST, com a utilização dos algoritmos Blastp e
PSI-Blast (ALTSCHUL et al., 1997) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), utilizando a
matriz de alinhamento Blossum62 (HENIKOFF; HENIKOFF, 1992). A busca por
moldes foi configurada para utilizar apenas o banco de dados do Protein Data Bank
(http://www.pdb.org/), o qual detém todas as estruturas tridimensionais de proteínas
a partir de dados de cristalografia de raio-X ou por RMN já publicadas. Através da
modelagem automática pelo software Swiss PDB Viewer (GUEX; PEITSCH, 1997),
também foi possível visualizar os prováveis moldes para cada seqüência-alvo, as
quais também estavam depositadas no PDB. Para a construção dos modelos foram
considerados apenas modelos com identidade acima de 30% e E-value inferior a e-
10-5. A verificação de motivos (motifs) seqüenciais pertencentes ao sítio ativo das
moléculas, assim como a família protéica, foram também levados em consideração
na escolha dos moldes. 3.1.2 Alinhamento das seqüências com os moldes
Após a seleção dos moldes, suas seqüências primárias foram alinhadas com
as seqüências de aminoácidos das respectivas polimerases do plasmídeos
mitocondrial de M. perniciosa. Os alinhamentos foram feitos através do programa
TCOFFEE (http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi/)
(NOTREDAME et al., 2000), com o objetivo de se identificar os motivos seqüenciais
específicos de cada polimerase e verificar a qualidade do alinhamento em escalas
de cores. Uma vantagem de se utilizar esse software é a variedade de arquivos de
alinhamento que poderiam ser salvos.
71
3.1.3 Threading e predição de estrutura secundária
Para fins de confirmação dos moldes foi utilizado o software PSIPRED-
GenThreader (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html) (JONES, 1999 A;
JONES, 1999 B; MCGUFFIN; JONES, 2003; BRYSON et al., 2005), capaz de
predizer a estrutura secundária das polimerases dos plasmídeos do M. perniciosa e,
ao mesmo tempo, compará-las com um banco de dados de estruturas, identificando
os prováveis moldes.
3.1.4 Construção dos modelos tridimensionais
A construção dos modelos tridimensionais iniciais das DNA e RNA
polimerases do plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa utilizou o programa
SwissPdb Viewer v.3.7 (GUEX; PEITSCH, 1997), baseado em alinhamento
estrutural e satisfação de restrições espaciais
A utilização desse software consistiu em três etapas básicas: Visualização
dos moldes, alinhamento estrutural dos moldes com as seqüências-alvo e finalmente
o envio para o servidor do Swiss-Model para realização do processo de modelagem
automática (SCHWEDE et al., 2003). Para cada enzima, primeiramente foi feita a
entrada do arquivo-molde em formato PDB com a sua posterior visualização. Em
seguida, a seqüência-alvo em formato FASTA era lida. Posteriormente a rotina fit
alignment da seqüência alvo com o molde foi realizada, a fim de gerar um
alinhamento estrutural entre as duas seqüências. Os alinhamentos foram verificados
a fim de se identificar as regiões pertencentes aos motivos seqüenciais de cada
polimerase. As seqüências alinhadas com seus respectivos moldes foram
submetidas ao servidor do Swiss-model.
3.1.5 Refinamento e Dinâmica Molecular
O AMBER é um pacote de programas para realização de otimização e
dinâmica molecular de biomoléculas, proteínas e sistemas bioorgânicos. O programa
tLEaP (SCHAFMEISTER et al., 1995) foi utilizado para gerar os aquivos de topologia
e neutralização das cargas.dos modelos iniciais das DNA e RNA polimerases. Esses
72
arquivos foram utilizados como entrada nos programas de refinamento e dinâmica
molecular.
Após a neutralização de cada proteína, foi determinada a distância das
interações de Van der Walls para átomos não-ligados (cutoff) a ser utilizada nos
cálculos de refinamento e Dinâmica Molecular. A determinação dos valores de cutoff
é importante para o ajuste e/ou diminuição do custo computacional (tempo de
processamento e memória), e isto não se traduz necessariamente em uma alteração
significativa na geometria da molécula durante o processo de refinamento. Para isso,
variou-se o valor de cutoff entre 3 a 20 Ǻ através de cálculos single point utilizando-
se o campo de força MM3 do BIOMEDCACHE 6.1 (FUJITSU, 2005).
O processo de refinamento das moléculas iniciais das DPO e POR foi
realizado através do programa SANDER (PEARLMAN et al., 1995). Primeiramente,
as moléculas iniciais foram submetidas a uma minimização prévia, que consistiu em
encontrar a melhor conformação de cada molécula na superfície de energia
potencial através dos algoritmos Steepest Descent e, posteriormente, Gradiente
Conjugado. Esse processo utilizou os seguintes parâmetros: a) imin=1, realiza a
otimização da estrutura; b) maxcyc=200, número máximo de ciclos; c) ncyc=100,
números de ciclos necessários para a mudança de Steeptest Descent para
Gradiente Conjugado; d) cut=14, valor de cutoff; e) ntb=0, manter volume constante;
f) igb=0, não incluir modelo de solvatação. Em seguida foram realizados cálculos de
Dinâmica Molecular (DM) através de uma simulação na qual as moléculas foram
aquecidas a 300 K, por 300 ps, gerando cerca de 5000 estruturas diferentes pelo
AMBER 8.0 (WEINER et al., 1984; WEINER et al., 1986). As conformações de
menor energia, uma para DPO e outra para a RPO, foram submetidas novamente ao
processo de dinâmica descrito anteriormente, a fim de se obter os modelos finais.
Todos os cálculos de refinamento e Dinâmica Molecular utilizaram a
constante de Coulomb padrão do AMBER (edmeth=1).
Através dos arquivos de trajetória de cada dinâmica (.mdcrd), foram obtidos
dados necessários para confecção de gráficos RMS vs. tempo, utilizando-se a rotina
ptraj do Amber 8.0.
73
3.1.6 Validação das estruturas tridimensionais das DNA e RNA Polimerases do
plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
As estruturas iniciais das DPO e RPO, obtidas através de modelagem por
homologia, foram submetidas ao processo de validação, utilizando os programas
PROCHECK 3.4 (LASKOWSKI et al., 1993) e ANOLEA (Atomic Non-Local
Environment Assessment) (MELO et al., 1997; MELO; FEYTMANS, 1997; MELO;
FEYTMANS, 1998).
A validação através do PROCHECK permite tanto a verificação da qualidade
estereoquímica das estruturas das DPO e RPO, comparando-as com outras
estruturas bem refinadas a uma resolução de 2.0 Å, quanto à análise resíduo a
resíduo dessas estruturas. Nessas análises são gerados tanto gráficos de
Ramachandran (RAMACHANDRAN et al., 1963) como outros gráficos para a
validação por resíduo da estrutura 3D, gráficos representando os ângulos de torsão
chi1 e chi2 pra todos os resíduos, planaridade das ligações peptídicas, má interação
entre os átomos não-ligados, energia de ligação de hidrogênio na cadeia principal, e
propriedades das cadeias laterais (LASKOWSKI et al., 1994).
Através da validação pelo servidor ANOLEA, disponibilizado pelo servidor do
SwissModel no endereço http://swissmodel.expasy.org/anolea/, foram calculados os
valores de energia total das cadeias protéicas dos modelos das DPO e RPO do
plasmídeo de M. perniciosa. Esse programa avaliou o ambiente não-local de cada
átomo pesado dessas moléculas. A energia da interação de cada par de átomos em
seu ambiente não-local foi calculada através da força potencial dependente de
distância, dentro de um raio de 7Å para cada aminoácido, a qual foi comparada com
um banco de dados de 147 cadeias protéicas não-redundantes, com uma identidade
seqüencial acima de 25% e obtidas a partir de cristalografia de raio-X com resolução
inferior a 3 Å. Os resultados geram pontuções para cada aminoácido, que são
demonstradas graficamente (MELO et al., 1997).
Para efeitos de comparação, os modelos finais das DPO e RPO, após os
processos de refinamento e Dinâmica Molecular, também foram submetidos aos
programas de validação descritos acima.
74
3.2 FILOGENIA MOLECULAR
As análises filogenéticas foram realizadas a partir de seqüências de
aminoácidos e nucleotídeos das DNA e RNA polimerases de todos os plasmídeos
mitocondriais lineares existentes no clado fúngico, obtidas a partir de buscas no
banco de dados de genomas e proteínas do NCBI (http://www.ncbi.nih.gov) e
através de revisão de literatura, além das seqüências virais incluídas neste estudo
devido as suas prováveis relações evolutivas com as polimerases desses
plasmídeos As seqüências de polimerases virais utilizadas na análise foram
selecionadas a partir de buscas no banco de dados do NCBI, utilizando-se os
algoritmos Blastp e PSI-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (ALTSCHUL et
al., 1997), para procurar seqüências com maior percentual de identidade e E-value
variando entre e-10-5 e zero.
Sendo o alinhamento uma das principais etapas no processo de filogenia
molecular, todas as seqüências nucleotídicas e aminoacídicas foram alinhadas antes
de serem lidas pelos programas de filogenia.
3.2.1 Alinhamento das seqüências de DNA
Dois tipos de alinhamentos foram feitos utilizando as seqüências de DNA dos
13 plasmídeos fúngicos. Primeiramente as seqüências individuais de DNA de cada
polimerase dos plasmídeos fúngicos, foram alinhadas por códon com suas
seqüências de aminoácidos correspondentes, através do programa PAL2NAL
(SUYAMA et al., 2006) (http://coot.embl.de/pal2nal/index.cgi). Os resultados desses
alinhamentos foram lidos pelo programa BIOEDIT 7.0.5.2 (HALL, 1999) e salvos em
formato NEXUS, para serem utilizados pelos programas de filogenia. Posteriormente
as seqüências das DPOs e RPOs dos plasmídeos de cada espécie, já alinhadas,
foram combinadas em contigs, sendo separadas apenas por um gap, utilizando o
programa BIOEDIT 7.0.5.2. Todos os contigs foram salvos em formato NEXUS para
serem utilizados em análises filogenéticas combinadas. Seqüências nucleotídicas de
polimerases virais não foram utilizadas nas análises filogenéticas devido a
indisponibilidade de algumas seqüências nos bancos de dados.
75
3.2.2 Alinhamento das seqüências de aminoácidos
Os alinhamentos das seqüências de aminoácidos foram feitos de três
maneiras. Primeiramente as seqüências de cada enzima foram alinhadas
separadamente utilizando-se a matriz de alinhamento Blossum62 (HENIKOFF;
HENIKOFF, 1992) com um bootstrap igual a 1000, através do programa BIOEDIT
7.0.5.2 (HALL, 1999); os alinhamentos foram salvos em formato NEXUS a fim de
serem utilizados nas análises filogenéticas. Em seguida foram criados e salvos em
formato NEXUS, contigs DPO/RPO das seqüências aminoacídicas (cada seqüência
separada por um gap) previamente alinhadas, apenas dos 13 plasmídeos fúngicos.
Por último, foram alinhadas seqüências de DPOs e RPOs virais com as polimerases
dos plasmídeos fúngicos, sem a formação de contigs, uma vez que DPO e RPO não
ocorrem concomitantemente em uma mesma espécie viral. 3.2.3 Análises filogenéticas tradicionais
As análises filogenéticas de Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e
Distância utilizaram dados de seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos das
DPO e RPO de todos os 13 plasmídeos mitocondriais estudados, assim como
seqüências virais. Esses dados foram analisados de forma individual para cada
polimerase e de forma combinada, como contigs DPO/RPO, apenas em análises
que utilizaram somente seqüências de plasmídeos fúngicos.
3.2.3.1 Análises das seqüências de nucleotídeos
As inferências filogenéticas tradicionais, utilizando dados de nucleotídeos,
foram realizadas pelo programa PAUP 4.0 (SWOFFORD, 1998), com exclusão da
terceira base de cada códon, a fim de diminuir o ruído filogenético. As análises de
Parcimônia simples utilizaram busca heurística com 1000 pseudoreplicações de
bootstrap, algoritmo TBR (tree-bisection-reconnection) e adição simples de táxons, e
geração de até 100 árvores mais parcimoniosas. Nas análises de Distância foram
realizadas buscas heurísticas com 1000 pseudoreplicaçoes de bootstrap, utilizando-
se o algoritmo TBR. Após cada análise de Parcimônia e Distância, foram obtidos os
consensos de maioria das árvores geradas; os filogramas obtidos foram salvos e
76
editados pelo programa Treeview 1.6.6 (PAGE, 1996), gerando posteriormente
figuras no formato emf (enhanced metafile). O programa Modeltest (POSADA;
CRANDALL, 1998) foi utilizado a fim de se obter o melhor modelo evolutivo para
cada matriz utilizada nas análises de Máxima Verossimilhança, que utilizaram
seqüências de nucleotídeos. Nessas análises, foram utilizados 1000
pseudoreplicações de bootstrap para avaliar o suporte dos grupos formados. Os
filogramas gerados no PAUP foram então salvos e visualizados pelo programa
Treeview a fim de serem geradas figuras no formato emf.
3.2.3.2 Análises das seqüências de aminoácidos
As inferências tradicionais de Parcimônia e Distância, utilizando dados de
aminoácidos, foram realizadas através do programa PAUP 4.0 (SWOFFORD, 1998).
Nas análises de Parcimônia simples foram utilizadas buscas heurísticas com 1000
pseudoreplicações de bootstrap, algoritmo TBR (tree-bisection-reconnection), adição
simples de táxons, e geração de até 100 árvores mais parcimoniosas. As análises de
Distância utilizaram buscas heurísticas com 1000 psudoreplicações e algoritmo TBR.
Após cada análise de Parcimônia e Distância, foram obtidos os consensos de
maioria das árvores geradas; os filogramas de consenso obtidos foram salvos e
editados pelo programa Treeview 1.6.6, gerando posteriormente figuras no formato
emf (enhanced metafile). Para as inferências por Máxima Verossimilhança utilizando
matrizes protéicas com apenas seqüências de DPOs e RPOs fúngicas, ou fúngicas e
virais, foram utilizados os programas PROML e SEQBOOT, pertencentes ao pacote
PHYLIP 3.66 (FELSENSTEIN, 2004). O modelo evolutivo foi configurado
manualmente, baseado nos dados de taxas de substituição de aminoácidos em
genomas mitocondriais de mamíferos (PESOLE et al., 1999; YANG et al., 1998), já
que este modelo era o que havia de mais próximo em termos de taxas de
substituição e uso de códon dos genomas mitocondriais de fungos filamentosos. Em
todas as análises, foi utlizada a opção P (indicando o uso de seqüências protéicas),
com distribuição Gamma de 9 (nove) categorias e coeficiente de variação igual a
1,4142135. Assim como nas análises de seqüências de nucleotídeos, foram
utilizadas 1000 pseudoreplicações de bootstrap para avaliar o suporte dos grupos
formados. Os filogramas obtidos foram salvos, visualizados e editados através do
Treeview, e em seguida salvos em formato emf.
77
Em todas as análises foram definidos grupos externos. Nas filogenias que
utilizaram apenas as seqüências de plasmídeos mitocondriais do clado fúngico, o
grupo externo foi representado pelas seqüências (DPO e RPO) do plasmídeo
mitocondrial de Spizellomyces punctatus (W.J. Koch) D.J.S. Barr, devido a esta
espécie pertencer a um filo diferente (Chytridiomycota) e supostamente de origem
anterior ao das outras espécies, as quais pertenciam aos filos Ascomycota e
Basidiomycota. Para as análises que utilizaram seqüências virais, diferentes grupos
externos foram definidos de acordo com identidade e o respectivo E-value da
seqüência utilizada; quanto menor a identidade e quanto mais distante de zero fosse
o E-value dentre as seqüências virais escolhidas, maior a possibilidade dessa se
tornar grupo externo. Na análise das DPOs plasmidiais com as DPOs virais, foi
utilizada a DPO do bacteriófago Φ29 como grupo externo; e para a análise das
RPOs dos plasmídeos fúngicos com as RPOs virais, a T7 RNA polimerase foi
selecionada como grupo externo.
3.2.4 Análise bayesiana
As análises filogenéticas bayesianas, com seqüências de nucleotídeos, foram
feitas apenas para DPOs e RPOs dos plasmídeos mitocondriais de fungos, visto que
nem todas as polimerases virais possuíam seqüências de DNA depositadas no
NCBI. Antes da realização das análises pelo MRBAYES 3.1.2 (RONQUIST;
HUELSENBECK, 2003), foram selecionados os modelos evolutivos para cada uma
das seqüências através do programa MrModeltest (NYLANDER, 2004). Após isso,
os mesmos arquivos de alinhamento utilizados nas análises tradicionais foram
configurados manualmente com os modelos de evolução definidos, e submetidos ao
MrBayes.
Seqüências de aminoácidos das polimerases dos plasmídeos fúngicos e de
vírus foram utilizadas na análise bayesiana. Os arquivos de alinhamento,
previamente utilizados na filogenia tradicional, foram configurados manualmente
para utilizar o modelo de evolução mitocondrial de mamíferos (MTMAM) (YANG et
al., 1998), sendo este escolhido pelo fato de mitocôndrias de fungos e de mamíferos
apresentarem taxas de substituição semelhantes em seu genoma, e similaridades no
uso do códon quando comparados ao genoma nuclear padrão (OSAWA, 1992).
78
As análises bayesianas foram configuradas para utilizar uma freqüência de
amostragem igual a 100, quatro cadeias (três aquecidas e uma fria), aquecimento
das cadeias igual a 0,2 e 1.000.000 de gerações. As escolhas dos grupos externos
seguiram os mesmos critérios das análises tradicionais.
Após o final de cada análise foram gerados arquivos no formato Excel (xls),
contendo os dados de cada replicação. Com esses dados foram gerados gráficos
que indicaram os pontos de estabilização das cadeias aquecidas de cada análise, e
a partir desses pontos puderam-se sumarizar as estatísticas e se obter árvores com
os valores de credibilidade de cada clado. Todas as árvores foram salvas pelo
MrBayes no formato Treview, e posteriormente salvas como figuras no formato emf.
Para a análise dos resultados, utilizou-se o consenso da maioria das árvores
geradas.
4 RESULTADOS
Nesta seção são apresentados os resultados obtidos nas análises de filogenia
molecular das seqüências de DNA e RNA polimerases, codificadas por todos os
plasmídeos mitocondriais do clado fúngico e por alguns adenovírus e retrovírus,
pelos métodos tradicionais e bayesiano; além das estruturas tridimensionais das
DNA e RNA polimerases codificadas pelo plasmídeo mitocondrial de Moniliophthora
perniciosa.
4.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA
O processo de Modelagem por Homologia, permitiu a obtenção das estruturas
tridimensionais das DNA e RNA polimerases codificadas pelo plasmídeo de
Moniliophthora perniciosa.
79
4.1.1 Moldes selecionados para construção das DNA e RNA polimerases do
plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
Foram selecionados dois moldes a partir de resultados de BLASTP, obtidos
através do PDB, sendo um molde para DPO e outro molde para RPO (Tabela 1).
Molde Identidade E-value Tamanho (aa) Organismo Referência
DPO 1XHX 32% 8e-06 575 Fago Φ29 Kamtekar et al.,
2004
RPO 1ARO 25% 1e-33 883 Fago T7 Jeruzalmi; Steitz,
1998
4.1.2 Confirmação dos moldes através de Threading
A busca dos moldes através do Threading, utilizando o programa
Genthreader, permitiu a confirmação parcial dos moldes (Tabela 2) obtidos pelo
BLASTP. O molde obtido para a RPO foi um arquivo PDB diferente do obtido pelo
BLASTP, porém pertencente ao mesmo organismo.
Molde Identidade E-value Tamanho (aa) Organismo Referência
DPO 1XHX 30% 2e-05 899 Fago Φ29 Kamtekar et
al., 2004
RPO 1CEZ 20% 1e-10 1028 Fago T7 Cheetham et
al., 1998
Comparando-se os valores de identidade e probabilidade de alinhamento ao
acaso (E-value no BLASTP e p-value no Genthreader), foi escolhido como molde
definitivo da RPO, para as etapas de alinhamento e construção do modelo, aquele
obtido pelo BLASTP (1ARO).
Tabela 1. Moldes selecionados através de BLASTP.
Tabela 2. Moldes selecionados através de Threading.
80
4.1.3 Alinhamento das proteínas alvo com os seus respectivos moldes
O alinhamento realizado pelo programa TCOFFE permitiu a identificação de
regiões conservadas entre as polimerases do plasmídeo de M. perniciosa e os
moldes obtidos, além da identificação de motivos seqüenciais característicos dos
domínios protéicos de polimerases e dos sítios ativos dessas moléculas.
Através do alinhamento da seqüência primária da DPO do plasmídeo de M.
perniciosa com a seqüência do molde 1XHX, foi possível identificar o Motivo B,
responsável pelo sítio de polimerização nas DNAs polimerases tipo B (Figura 15 A).
Já o alinhamento entre a RPO e o molde 1ARO (Figura 15 B) apresentou o domínio
conservado do tipo palma, o qual possui os motivos seqüenciais responsáveis pelo
sítio de reconhecimento e polimerização de nucleotídeos nas RNAs polimerases de
cadeia simples.
A identificação dos motivos seqüenciais e domínios conservados permitiram
um melhor ajuste do alinhamento estrutural feito através do Swiss PDB Viewer, na
etapa de construção dos modelos.
Figura 15. A. Região conservado no alinhamento entre a seqüência primária da DPO do plasmídeo de M.perniciosa e o molde 1XHX, apresentando o motivo B. B. Parte conservada no alinhamento entre a seqüência primária da RPO do plasmídeo de M.perniciosa e o molde 1ARO, apresentando o domínio palma. A coloração vermelha em determinadas regiões indica um alinhamento de boa qualidade.
A B
Motivo B
Domínio palma
81
4.1.4 Predição de estrutura secundária
A predição das estruturas secundárias das DPO e RPO do plasmídeo de M.
perniciosa foi realizada através do programa Genthreader (JONES, 1999 A), e isso
foi importante para confirmar os dados obtidos através dos modelos construídos pelo
Swiss PDB Viewer.
A DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa apresenta uma estrutura
secundária composta de α-hélices e folhas-β de maneira equilibrada em sua
totalidade (Figura 16).
Já a RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa apresentou uma
estrutura secundária com o predomínio de α-hélices (Figura 17).
Figura 16. Predição da estrutura secundária da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa.
Motivo B
82
Figura 17. Predição da estrutura secundária da RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa.
Domínio palma
83
4.1.5 Modelos tridimensionais das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M.
perniciosa
Os modelos tridimensionais das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M.
perniciosa, obtidos através de Modelagem por Homologia, apresentaram uma
grande semelhança estrutural com os moldes escolhidos para o processo de
modelagem (1XHX e 1ARO, respectivamente). Nesse processo ocorreu a adição ou
a retirada de alguns aminoácidos das seqüências originais, causados pela
modelagem automática do servidor do Swiss Model, porém sem afetar as regiões de
domínios conservados ou sítios catalíticos desses modelos.
4.1.5.1 Estrutura tridimensional da DNA polimerase do plasmídeo mitocondrial de M.
perniciosa
O modelo inicial (1DPO) da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa
possui 543 aminoácidos, 9026 átomos unidos por 9133 ligações, e foi classificada
como integrante da família B de DNA polimerases, as quais podem ser encontradas
em organelas e vírus, e apresenta características de transferases, com estrutura
secundária alfa-beta, possuindo 15 α-hélices, 29 folhas-β e 42 turns (Figura 18). O
valor de rms de 1, 09 foi obtido entre 1DPO e 1XHX pela sobreposição dos C-α.
Figura 18. Estrutura secundária da DNA polimerase do plasmídeo de M.perniciosa.
84
Como nas demais polimerases da sua família, essa DPO apresenta também
os três domínios característicos desse grupo: Palma, Dedos e Polegar (TRUNIGER
et al., 2003). Em análise realizada pelo VMD 1.8.6, com um cutoff de 3,2 Å, o modelo
apresentou 61 ligações salinas, elementos que podem influenciar em sua
estabilidade.
O sítio ativo dessa enzima (Figura 19) apresenta o motivo B, conservado em
todas as polimerases da família B e responsável pela seleção de dNTPs e ligação à
fita molde de DNA.
Nesta polimerase o motivo B é representado pelos aminoácidos Lys380,
Leu381, Leu382, Leu383, Asn384, Ser385, Leu386, Tyr387, Gly388 (Figura 20). Esses
aminoácidos estão distribuídos nos três domínios característicos desse tipo de
polimerase: Palma, Dedos e Polegar.
Figura 19. Sítio ativo da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa, mostrando os motivos conservados.
85
Outros motivos indispensáveis ao processo de polimerização das cadeias de
DNA também foram encontrados, tais como o motivo Dx2SLYP (Figura 21)
representado pelos aminoácidos Asp247, Val248, Asn249, Ser250, Leu251, Tyr252, Pro253;
Figura 20. Motivo B, responsável pela ligação da DPO à fita de DNA molde e seleção das dNTPs.
Figura 21. Motivo Dx2SLYP, importante no processo da polimerização da fita de DNA.
86
o motivo YxDTDS (Figura 22), representado pelos aminoácidos Tyr 455, Ser456,
Asp457, Thr458, Asp459; o motivo Tx2A/GR (Figura 23), representado pelos
aminoácidos Thr309, Asp310, Lys311, Gly312, Tyr313, Arg314; e o motivo KxY (Figura 24),
representados pelos aminoácidos Lys494, Met495, Tyr496.
Figura 22. Motivo YxDTDS, constituinte do sítio ativo da DPO do plasmídeo de M. perniciosa.
Figura 23. Motivo Tx2A/GR, constituinte do sítio ativo da DPO do plasmídeo de M. perniciosa.
87
4.1.5.2 Estrutura tridimensional da RNA polimerase do plasmídeo mitocondrial de M.
perniciosa
A estrutura 3D inicial (1RPO) da RNA polimerase do plasmídeo de M.
perniciosa possui 766 aminoácidos, 12628 átomos unidos por 12764 ligações, e
encontra-se incluída na família das RNA polimerases de cadeia única, com função
de transferase de DNA. Essa molécula apresenta uma estrutura secundária do tipo
alfa-beta, com 37 α-hélices, 19 folhas-β e 54 turns (Figura 25). Quando submetida a
uma análise no VMD 1.8.6, com um cutoff de 3,2 Å, o modelo apresentou 97
ligações salinas. O valor de rms de 1,24 foi obtido pela sobreposição dos C-α entre o
molde 1ARO e o modelo 1RPO.
Foi possível identificar, nessa polimerase, uma estrutura semelhante às
polimerases virais, com cadeia simples, e a presença de domínios característicos
dessa família: Palma (resíduos 338 a 487 e 669 a 761), Dedos (resíduos 488 a 668)
Figura 24. Motivo KxY, presente na região C-terminal da DPO do plasmídeo de M. perniciosa, participante do processo de polimerização do DNA.
88
e Polegar (resíduos 292 a 337) (JERUZALMI; STEITZ, 1998 apud OLLIS et al.,
1985; KOHLSTAEDT et al., 1992; PELLETIER et al., 1994; WANG et al., 1997).
O sítio ativo da RPO do plasmídeo de M. perniciosa (Figura 26) é formado por
aminoácidos presentes nos domínios Palma (Asp457 e Asp695) e Dedos (Tyr537 e
Lys529). Esses aminoácidos encontram-se relativamente nas mesmas posições dos
aminoácidos Asp537 e Asp812 (Palma), Tyr639 e Lys631 (Dedos) da T7 RNA polimerase
(1ARO) utilizada como molde.
Figura 26. Sítio ativo da RNA polimerase do plasmídeo de M.perniciosa, presentes nos domínios Palma (verde) e Dedos (vermelho).
Figura 25. Estrutura secundária da RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa.
89
4.1.6 Determinação dos valores de cutoff para os cálculos de refinamento e
Dinâmica Molecular das estruturas das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de M. perniciosa
Os cálculos dos valores de cutoff para as duas enzimas, realizados através do
programa BIOMEDCACHE 6.1, revelaram valores semelhantes para as duas
estruturas. Os gráficos gerados a partir das energias relativas em cada molécula
indicaram o valor de 14 Å como confiável para os cálculos posteriores, tanto para a
DPO (Figura 27 A) quanto para a RPO (Figura 27 B), como indicado pelas quedas
bruscas das energias relativas nessas regiões dos gráficos e uma posterior
estabilização.
-120000000
-100000000
-80000000
-60000000
-40000000
-20000000
0
20000000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
CutoffDiferença de energia (Kcal/mol)
Figura 27. A. Gráfico relacionando os valores de cutoff por energia relativa da DNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa. B. Gráfico relacionando os valores de cutoff por energia relativa da RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa.
-140000000
-120000000
-100000000
-80000000
-60000000
-40000000
-20000000
0
20000000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
CutoffDiferença de energia (Kcal/mol)
A
B
90
4.1.7 Validação das estruturas tridimensionais das DNA e RNA polimerases do
plasmídeo mitocondrial de M. perniciosa
O processo de validação das moléculas construídas através de Modelagem
por Homologia, utilizando os programas PROCHECK 3.4 e ANOLEA, gerou dados
através dos quais foi possível verificar a qualidade dessas moléculas antes e depois
dos processos de refinamento e Dinâmica Molecular.
A qualidade dos modelos finais, obtidos após a dinâmica, permite inferir que
estes apresentam estruturas aceitáveis em níveis energéticos e conformacionais,
quando comparados com estruturas protéicas resolvidas.
4.1.7.1 Validação das estruturas iniciais das DPO e RPO do plasmídeo de M.
perniciosa
A validação através do programa PROCHECK, utilizando a estrutura inicial da
DNA polimerase, apresentou um gráfico de Ramachandran (Figura 28) com 80,3%
dos aminoácidos em regiões energeticamente permitidas, 16,5% em regiões
favoráveis, 1,8% em regiões generosamente permitidas e 1,4% em regiões não
permitidas. Portanto, podemos dizer que este modelo apresenta uma boa qualidade
geométrica, visto que 98,6% dos aminoácidos (535 resíduos) estão dentro das
regiões energeticamente favoráveis do gráfico.
Figura 28. Gráfico de Ramachandran, gerado pelo PROCHECK, para a estrutura inicial da DPO do plasmídeo de M. perniciosa.
91
Os gráficos de Ramachandran por resíduo (Figura 29), apresentaram sete
aminoácidos com conformações consideradas ruins (ou seja, em regiões não
permitidas), sendo estes: Thr188, Asn513, Glu239, Tyr343, Thr458, Lys465, Asp540. Estes
aminoácidos não fazem parte de nenhum motivo ou domínio conservado
responsável pelo sítio ativo, exceto Thr458 que faz parte do motivo YxDTDS.
Os gráficos que avaliam a qualidade estereoquímica dos ângulos de torção
das cadeias laterais do modelo 1DPO, apresentaram apenas Asp247 e Phe 141 fora
das áreas favoráveias para este tipo de gráfico (Figura 30).
Figura 29. Validação por resíduo da 1DPO. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
92
Figura 30: Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1DPO. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam as áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
93
Os resultados da validação da cadeia principal da estrutura inicial da DNA
polimerase apresentaram praticamente todos os parâmetros dentro do desvio
padrão esperado, em uma resolução de 2.0Å, exceto para o número de contatos
ruins entre átomos não-ligados (Figura 31).
Figura 31. Qualidade da cadeia principal do modelo 1DPO: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
94
A validação das cadeias laterais dos aminoácidos da estrutura inicial da DPO
apresentou todos os parâmetros fora do desvio padrão (Figura 32), a uma resolução
de 2.0Å.
A validação da estrutura inicial da DPO, utilizando o programa ANOLEA,
demonstrou através de um gráfico (Figura 33), que essa conformação apresenta um
Figura 32. Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1DPO. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
95
valor de energia bastante elevado, ou seja, uma conformação energeticamente
desfavorável, com energia total de 5473.689 E/kT.
O gráfico de Ramachandran do modelo inicial da RPO do plasmídeo de M.
perniciosa, apresentou um gráfico de Ramachandran (Figura 34) com 81,6% dos
aminoácidos em regiões energeticamente permitidas, 19,3% em regiões favoráveis,
3,1% em regiões generosamente permitidas e 1,4% em regiões não permitidas.
Sendo assim, podemos dizer que este modelo apresenta uma boa qualidade
geométrica, visto que 98,6% dos aminoácidos (755 resíduos) estão dentro das
regiões energeticamente favoráveis do gráfico.
Número do resíduo
Ener
gia
(E/k
T)
Figura 33. Gráfico de validação da estrutura inicial da DPO, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto que as regiões verdes representam valores baixos.
96
Os gráficos de validação por resíduo para o modelo inicial da RNA polimerase
(Figura 35) apresentaram 9 aminoácidos com conformações ruins, sendo estes:
Lys8, Phe171, Glu173 , Thr650, Lys652, Asn686, His694 , Leu718, Ile765 . Estes resíduos não
fazem parte do sítio ativo desta polimerase.
Figura 35. Validação por resíduo da 1RPO. Os pontos coloridos correspondem apenas aos
aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
Figura 34. Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK, para a estrutura inicial da RPO do plasmídeo de M. perniciosa.
97
A avalição da qualidade estereoquímica dos ângulos de torção das cadeias
laterais do modelo 1RPO, apresentou apenas Asp74, Leu23, Ile3 e Phe 38 fora das
áreas favoráveias para este tipo de gráfico, e estes aminoácidos não fazem parte do
sítio ativo dessa molécula (Figura 36).
Figura 36. Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1RPO. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
98
No processo de validação da cadeia principal do modelo inicial da RNA
polimerase, quase todos os parâmetros apresentaram-se dentro do desvio padrão
esperado, exceto o gráfico que representa o número de contatos ruins entre átomos
não ligados, a uma resolução de 2.0Å (Figura 37).
Figura 37. Qualidade da cadeia principal do modelo 1RPO: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
99
Os parâmetros de validação das cadeias laterais dos aminoácidos do modelo
inicial da RPO mostraram-se todos fora do desvio padrão esperado para uma
estrutura corretamente resolvida a uma resolução de 2.0Å (Figura 38).
Figura 38. Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1RPO. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
100
A análise de validação feita pelo ANOLEA, para a estrutura primitiva da RNA
polimerase, indica uma energia total dessa conformação de 3747.085 E/kT,
mostrando que essa conformação é energeticamente desfavorável (Figura 39).
Número do resíduo
Ener
gia
(E/k
T)
Figura 39. Gráfico de validação da estrutura inicial da RPO, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto que as regiões verdes representam valores baixos.
101
4.1.7.2 Validação dos modelos tridimensionais das DPO e RPO do plasmídeo de M.
perniciosa, após refinamento e Dinâmica Molecular
O modelo 3D da DNA polimerase gerado após refinamento e dinâmica
(1DPOC) no vácuo (300 K e 300 ps), apresentou um gráfico de Ramachandran com
54.6% dos resíduos em regiões energeticamente permitidas (271 resíduos), 38.5%
em regiões adicionalmente permitidas (191 resíduos), 4,4% em regiões
generosamente permitidas e 2,4% em regiões não permitidas (Figura 40). A
sobreposição dos C-α do molde 1XHX com o modelo 1DPOC resultou em um valor
de rms de 2,66.
Nos gráficos indicativos da qualidade dos resíduos do modelo 1DPOC (Figura
41), foram visualizados 21 aminoácidos considerados ruins (Met7, Arg12, Asp93,
Thr188, Ile313, Ile 319, Ile354, Thr458, His465, Lys526), a uma resolução de 2.0Å.
Figura 40. Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK para o modelo da DPO, após o refinamento e Dinâmica Molecular a 300 e 300 ps do plasmídeo de M .perniciosa.
102
A avalição da qualidade estereoquímica dos ângulos de torção das cadeias
laterais do modelo 1DPOC (Figura 42), apresentou vários resíduos fora das regiões
permitidas (Asn204, Asn123, Asn15, Asn375, Asn278, Asn144, Asn30, Asp93, Asp72, His483,
Leu95, Leu50, Leu25, Leu9, Phe137, Phe194, Phe111, Phe31, Phe342, Phe252, Tpr537, Tyr64,
Tyr332, Tyr363, Tyr338).
Figura 41. Validação por resíduo da 1DPOC. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
103
Figura 42. Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos da 1DPOC. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses, e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
104
A validação da cadeia principal do modelo 1DPOC, pelo PROCHECK (Figura
43), apresentou três gráficos com valores fora do desvio padrão, quando
comparados com gráficos de estruturas resolvidas corretamente a uma resolução de
2.0Å.
Figura 43. Qualidade da cadeia principal do modelo 1DPOC: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: - energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
105
Todos os gráficos de validação das cadeias laterais dos aminoácidos do
modelo da DNA polimerase (Figura 44), após o refinamento e Dinâmica Molecular a
300 k e 300 ps, apresentaram valores dentro do desvio padrão esperado para uma
estrutura completamente resolvida a uma resolução de 2.0Å.
Figura 44. Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1DPOC. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
106
A validação do modelo da DNA polimerase, após refinamento e Dinâmica
Molecular, utilizando o programa ANOLEA, demonstrou através de um gráfico
(Figura 45) que a conformação dessa molécula é energeticamente favorável, com
energia total de -3864.608 E/kT.
A estrutura tridimensional da RNA polimerase, após o refinamento e Dinâmica
Molecular no vácuo (300 K e 300 ps) (1RPOC), apresentou um gráfico de
Ramachandran com 62.5% (443 resíduos) dos aminoácidos dentro das regiões
energeticamente favoráveis, 32.6% (231 resíduos) dentro das regiões
adicionalmente permitidas, 3,1% (22 resíduos) dentro das regiões adicionalmente
Número do resíduo
Ener
gia
(E/k
T)
Figura 45. Gráfico de validação do modelo da DPO, após refinamento e Dinâmica Molecular, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto regiões verdes, valores baixos.
107
permitidas e 1,8% (13 resíduos) em regiões não permitidas (Figura 46). O valo de
rms de 1,94 foi obtido pela sobreposição do molde 1ARO e o modelo 1RPOC.
A validação por resíduo do modelo da RPO pós-dinâmica, apresentou 13
resíduos (Cys460, Val297, Lys8, Asn12, Phe724, Ile765, Leu155, Lys105, his86, His694,
Glu263, Ser568, Glu173) em regiões energeticamente desfavoráveis, a uma resolução
de 2.0Å, quando comparado com estruturas resolvidas corretamente (Figura 47).
Figura 46. Gráfico de Ramachandran gerado pelo PROCHECK para o modelo da RPO, após o refinamento e Dinâmica Molecular a 300 K e 300 ps do plasmídeo de M. perniciosa.
Figura 47. Validação por resíduo da 1RPOC. Os pontos coloridos correspondem apenas aos aminoácidos em regiões favoráveis, regiões generosamente permitidas e regiões não permitidas. (Fonte: Procheck 3.0).
108
A avalição da qualidade estereoquímica dos ângulos de torção das cadeias
laterais do modelo 1RPOC, apresentou os aminoácidos Asn291, Asn298, Asn379,
Asp190, Ile691, Ile644, Ile154, Ile128, Ile210, Ile69, Leu101, Phe401, Phe204, Phe508, Trp68,
Trp159, Tyr564, Tyr17, Tyr557, Tyr227 fora das áreas favoráveias para este tipo de
gráfico, e estes aminoácidos não fazem parte do sítio ativo dessa molécula (Figura
48).
Figura 48. Gráficos Chi-1 e Chi-2 dos resíduos. Os números de resíduos são mostrados entre parênteses e a coloração vermelha representa o resíduo que está com os ângulos desfavoráveis; as regiões sombreadas representam a áreas favoráveis (Fonte: Procheck 3.0).
109
De maneira semelhante a DNA polimerase, os parâmetros de validação da
cadeia principal do modelo 1RPOC, apresentaram dois gráficos (Figura 49) com
valores fora do desvio padrão, se comparamos com gráficos de estruturas resolvidas
corretamente a uma resolução de 2.0Å.
Figura 49. Qualidade da cadeia principal do modelo 1RPOC: A: avaliação do gráfico de Ramachandran; B: planaridade da ligação peptídica; C: interações ruins; D: distorção dos carbonos alfa; E: energia das ligações de hidrogênio. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
110
Novamente, de maneira semelhante ao modelo 1DPOC, o modelo 1RPOC
apresentou todos os gráficos de validação das cadeias secundárias dos
aminoácidos (Figura 50) dentro do desvio padrão esperado para uma estrutura
resolvida corretamente a uma resolução de 2.0Å.
Figura 50. Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para o modelo 1RPOC. A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).
111
A validação do modelo da RNA polimerase, após refinamento e Dinâmica
Molecular, utilizando o programa ANOLEA, mostrou-se semelhante ao ocorrido com
a DPO, na qual a sua conformação é energeticamente favorável, com energia total
de -4841.385 E/kT (Figura 51).
As estruturas 3D das DNA e RNA polimerases do plasmídeo mitocondrial de
M. perniciosa, após Diniâmica Molecular de 300 K por 300 ps, 1DPOC e 1RPOC
respectivamente, constam do Apêndice A.
Número do resíduo
Ener
gia
(E/k
T)
Figura 51. Gráfico de validação do modelo da RPO, após refinamento e Dinâmica Molecular a 300 K e 300 ps, gerado pelo ANOLEA. As regiões em vermelho representam valores altos de energia, enquanto regiões verdes, valores baixos.
112
4.2 ESTRUTURA DOS PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS DO CLADO FÚNGICO
Atualmente existem 13 plasmídeos mitocondriais do clado fúngico
completamente seqüenciados que apresentam estrutura linear com as extremidades
invertidas – cinco ascomicetos, sete basidiomicetos e um quitridiomiceto (Tabela 3).
Plasmídeo Fungo spp. Filo Tam. (bp)
DNA pol. (aa)
RNA pol. (aa)
Nº. Acesso Referência
pEM Agaricus bitorquis Basidiomycota 5810 797 1102 X63075 Robison; Horger
1999
pBgh Blumeria
graminis f. sp. hordei
Ascomycota 7965 1062 973 NC_004935 Giese et al., 2003
pClK1 Claviceps purpurea Ascomycota 6752 1063 963 X15648 Oeser;
Tudzynski 1989
pCP Moniliophthora perniciosa Basidiomycota 6743 899 1028 NC_005927 Formighieri et
al., 2008
pFV1 Flammulina velutipes Basidiomycota 7363 925 1168 AB028633 Nakai et al.,
2000
pG114 Gelasinospora sp. Ascomycota 8231 987 831 L40494 Yuewang et al.,
1996
pPK2 Pichia kluyveri Ascomycota 7174 1118 992 Y11606 Blaisonneau et al., 1999
pHC2 Hebeloma circinans Basidiomycota 3229 858 209 Y11504 Bai et al., 1998
pHarbin-3 Neurospora crassa Ascomycota 7050 1021 896 AF133505 Xu et al., 1999
pKalilo Neurospora intermedia Ascomycota 8642 969 811 X52106 Chan et al.,1991
pMLP2 Pleurotus ostreatus Basidiomycota 7005 900 993 AF355103 Kim et al., 2000
pAL2-1 Podospora pauciseta Ascomycota 8395 1197 948 X60707 Hermanns;
Osiewacz, 1992
- Spizellomyces punctatus Chytridiomycota 1775 361 218 AF404303 Forget et al.,
2002
O tamanho dos plasmídeos variou entre 1.7 a 8.6 Kb. O plasmídeo
mitocondrial de Spizellomyces punctatus apresentou o menor tamanho e o da
espécie Neurospora intermedia (Figura 52) o maior. A estrutura desses plasmídeos
sempre apresentou polimerases em fases de leitura opostas, exceto o plasmídeo da
espécie S. punctatus (Figura 53).
Tabela 3. Plasmídeos mitocondriais lineares do clado fúngico completamente seqüenciados.
Figura 52. Estrutura do plasmídeo mitocondrial de Neurospora intermedia. Fonte: http://www.ncbi.nih.gov (2007).
Figura 53. Estrutura do plasmídeo mitocondrial de Spizellomyces punctatus. Fonte: http://www.ncbi.nih.gov (2007).
113
Resultados de BLAST utilizando seqüências nucleotídicas e aminoacídicas
dos plasmídeos retroreferidos demonstraram homologia das DNA e RNA
polimerases desses plasmídeos com polimerases virais. O alinhamento feito pelo
BLAST com seqüências de DPO retornou DNA polimerases de adenovírus. As
buscas no BLAST utilizando seqüências de RPO retornaram resultados
apresentando seqüências de RNA polimerases de retrovírus (Tabela 4).
4.3 FILOGENIA MOLECULAR
Nesta seção são apresentados os resultados das filogenias tradicionais e
bayesiana das DNA e RNA polimerases dos plasmídeos mitocondriais apenas do
clado fúngico, e também dessas polimerases fúngicas com polimerases virais.
As análises filogenéticas entre as polimerases fúngicas agrupadas em
contigs, ou de maneira individual, apresentaram resultados bastante semelhantes.
Sendo assim, são apresentadas aqui apenas árvores filogenéticas referentes às
análises dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos fúngicos. Os resultados das análises
das DPOs e RPOs fúngicas mais as polimerases virais são apresentados de
maneira individual, para cada enzima, como descrito na metodologia. Todas as
árvores restantes constam do Apêndice B.
4.3.1 Filogenia tradicional
Inferências filogenéticas por parcimônia, distância e máxima verossimilhança,
revelaram um padrão filogenético bastante semelhante, tanto para nucleotídeos
Vírus Tipo Tipo Pol. Tam. (bp) Tam. (aa) Nº. Acess. Referência
Bacteriófago Bam35c Adenovírus DPO 2205 735 NP_943751.1 Ravantt et al., 2003 Fago GIL16c Adenovírus DPO 2259 753 YP_224103.1 Verheust et al., 2005
Adenovirus Hum. 12 Adenovírus DPO 3567 1189 AP_000112.1 Davison et al., 2003 Bacteriofago Phi29 Adenovírus DPO 1725 575 1XHX_A Kamtekar et al., 2004
Adenovirus Símio A Adenovírus DPO 3507 1169 YP_067908.1 Kovacs et al., 2004 Bacteriof. phiYeO3-12 Retrovírus RPO 2652 884 NP_052071.1 Pajunen et al., 2001
Bacteriófago T3 Retrovírus RPO 2652 884 NP_523301.1 Pajunen et al., 2002 Fago K1F Retrovírus RPO 2679 893 YP_338094.1 Scholl; Merril, 2005
Fago GH-1 Retrovírus RPO 2655 885 NP_813747.1 Kovalyova; Kropinski,
2003 BPK11 Retrovírus RPO 2718 906 P18147 Dietz et al., 1990
Vibriofago VP4 Retrovírus RPO 2649 883 YP_249577.1 Wang et al., 2005 Fago Berlin Retrovírus RPO 2649 883 YP_918986.1 Noeltin et al., 2006
Fago T7 Retrovírus RPO 2649 833 1CEZ Dunn; Studier, 1981
Tabela 5. Polimerases virais utilizadas nas análises filogenéticas.
114
como para aminoácidos, em que seqüências de plasmídeos de Ascomycota
formaram clados com seqüências de plasmídeos de Basidiomycota, assim como
seqüências de polimerases virais formando clados com seqüências fúngicas.
A análise de Parcimônia do contig DPO/RPO de plasmídeos fúngicos,
utilizando seqüências de nucleotídeos, apresentou índice de consistência (CI) igual a
0,6011, índice de retenção (RI) igual a 0,37 e índice de homoplasia (HI) igual a
0,3989. O filograma de consenso de maioria demonstrou que as polimerases dos
plasmídeos mitocondriais das espécies de Ascomycota formaram clados com
contigs DPO/RPO de Basidiomycota (Figura 54).
Figura 54. Filograma de consenso de maioria, de uma análise de Parcimônia dos contigs DPO/RPO de seqüências nucleotídicas de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
100
Spunctatus DPO
Hkluyveri DPO
Ncrassa DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Pleurotus ostreatus
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Ascomycota
Basidiomycota
Spizellomyces punctatus
100
100
63
100
81
100
81
66
115
A análise de Distância para o contig DPO/RPO de plasmídeos fúngicos, com
seqüências de DNA, apresentou um score de evolução mínima igual a 3,35814, o
filograma de consenso de maioria apresentou uma topologia bastante semelhante à
análise feita por Parcimônia (Figura 55).
0.1
Spunctatus DPO
Ncrassa DPO
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPOPodospora pauciseta
Figura 55. Filograma gerado a partir de análise de Distância, utilizando contigs de DNA de DPO/RPO de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Pleurotus ostreatus
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Ascomycota
Basidiomycota
Agaricus bitorquis
Spizellomyces punctatus
100
89
100
85
100
100
100
116
Para a inferência de filogenia por Máxima Verossimilhança utilizando contigs
DPO/RPO com seqüências nucleotídicas para todos os plasmídeos mitocondriais
fúngicos, foi selecionado através do Modeltest o modelo evolutivo GTR+G+I. Essa
análise revelou um filograma no qual seqüências de plasmídeos de Ascomycota
formaram clados com seqüências de plasmídeos de Basidiomycota. (Figura 56). O
maior escore de verossimilhança ou verossimilhança máxima (-lnL) apresentou valor
igual a 52104,56321.
0.1
Spunctatus DPO
Hkluyveri DPO
Ncrassa DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Ascomycota
Basidiomycota
Figura 56. Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências nucleotídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Pleurotus ostreatus
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Agaricus bitorquis
Spizellomyces punctatus
91
55
76
82
57
100
53
100
117
O contig DPO/RPO fúngico contendo seqüências aminoacídicas, quando
submetido à inferência por Parcimônia apresentou um filograma de consenso de
maioria onde seqüências dos plasmídeos de Ascomycota formaram clados com
seqüências de plasmídeos de Basidiomycota. Esta análise apresentou CI=0,8514,
RI=0,523 e HI=0,1486 (Figura 57).
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Hkluyveri DPO
Ncrassa DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
90
93
100
69
64
65
78
100 59
99
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 57. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, para os contigs DPO/RPO, utilizando seqüências de aminoácidos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Ascomycota
Basidiomycota
118
O resultado da inferência por Distância a partir dos alinhamentos de
seqüências de aminoácidos das DNA e RNA polimerases dos plasmídeos fúngicos,
formando contigs, apresentou um escore de evolução mínima igual a 4,61633. O
filograma de consenso de maioria mostou que contigs de DPO/RPO de ascomicetos
e basidiomicetos estão presentes conjuntamente em pelo menos dois clados (Figura
58).
0.1
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Ncrassa DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
Podospora pauciseta
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 58. Filograma de consenso de maioria, por Distância, utilizando seqüências de aminoácidos dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Ascomycota
Basidiomycota
99
100
82
100
100
100
99
60
53
88
119
O filograma de Máxima Verossimilhança, para seqüências de aminoácidos
para os contigs DPO/RPO apresentou seqüências de espécies de Ascomycota
agrupando-se com seqüências de Basidiomycota, de forma semelhante às análises
de Parcimônia e Distância. Esta análise apresentou –lnL igual a 54007,10946
(Figura 59).
1
Spunctatus
Nintermedi
Gelasinosp
Fvelutipes
Mpernicios
Hcircinans
Hkluyveri
Panserina
Cpurpurea
Bgraminis
Abitorquis
Ncrassa DP
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 59. Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Ascomycota
Basidiomycota
98
87
60
100 53
65
64
78
65
120
A filogenia tradicional por Parcimônia, utilizando seqüências de aminoácidos
das DNA polimerases dos plasmídeos fúngicos e virais, apresentou uma árvore de
consenso na qual o clado formado pelas seqüências de DPOs virais de Adenovírus
Humano tipo 12 e Adenovírus Símio mostrou-se mais relacionado com as
seqüências de DPOs fúngicas do clado formado por S. punctatus, P. ostreatus e P.
pauciseta. Nesta análise foram obtidos os índices CI=0,8228, RI=0,5948 e
HI=0,1772 (Figura 60).
100
Phi29
Ncrassa DPO
Hkluyveri DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Had12
SimadA
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
Bam35c
GIL16c
Phi 29
Aden. Hum. 12
Aden. Símio
Bam35C
GLI16C
Figura 60. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Chytridiomycota
Vírus
52
100
92
63
100
56
89
100
98
95
100
121
A inferência por Distância gerada a partir das seqüências aminoacídicas das
DPOs de plasmídeos fúngicos e virais apresentou uma árvore com seqüências de
DPOs virais formando clados com polimerases fúngicas. O score de evolução
mínima foi igual a 6,09202 (Figura 61).
0.1
Hkluyveri DPO
Phi29
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Bam35c
GIL16c
Ncrassa DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
Spunctatus DPO
Had12
SimadA
Postreatus DPO
Panserina DPO
Figura 61. Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Phi 29
Aden. Hum. 12
Aden. Símio
Bam35C
GLI16C
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Chytridiomycota
Vírus
100
100
75
99
57
100
100
60
99
100
100
100
122
A inferência por Máxima Verossimilhança para as seqüências de aminoácidos
das DPOs dos plasmídeos fúngicos e virais, apresentou -lnL=38243,63371 e um
filograma no qual seqüências de DPOs virais formaram clados com seqüências de
DPOs fúngicas (Figura 62).
1
Phi29
Ncrassa DP
Hcircinans
Abitorquis
Hkluyveri
GIL16c
Bam35c
Cpurpurea
Bgraminis
Fvelutipes
Panserina
Postreatus
Mpernicios
SimadA
Had12
Spunctatus
Nintermedi
Gelasinosp
Figura 62. Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas de DPOs de plasmídeos fúngicos e virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
Phi 29
Aden. Hum. 12
Aden. Símio
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Bam35C
GLI16C
88
60
57
100
100
71
98
92
67
73
98
86
66
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
123
A análise de Parcimônia para as seqüências aminoacídicas de RNA
polimerases dos plasmídeos mitocondriais de fungos e polimerases virais
apresentou um filograma de consenso de maioria onde o clado fúngico aparece
como um grupo monofilético e com suporte de 100% (Figura 63). Os índices obtidos
foram: CI=0,7955, RI=0,6282 e HI=0,2045.
100
T7
BPK11
PBerlin
K1F
gh1
VP4
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hcircinans RPO
Hkluyveri RPO
Postreatus RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Fvelutipes RPO
Mperniciosa RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
PhiYeO3
T3
Figura 63. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
BPK11
VP4
K1F
Fago Berlin
T7
GH1
PHIYe03
T3
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
100
61
97
100
64
72
100
73
100
79
60
100
124
A inferência por Distância das seqüências de aminoácidos das RPOs dos
plasmídeos fúngicos e virais relevou um filograma de consenso no qual, apenas
seqüências dos plasmídeos fúngicos formam um grupo monofilético com 100% de
valor de suporte (Figura 64). Nesta análise o escore de evolução mínima igual a
5,95105.
0.1
T7
PBerlin
BPK11
K1F
VP4
gh1
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
PhiYeO3
T3
Figura 64. Filograma de consenso de maioria, por Distância, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
BPK11
VP4
K1F
Fago Berlin
T7
GH1
PHIYe03
T3
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
100
100
100
58
94
57
89
88
100
99
78
100
100
100
125
Na análise por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências de
aminoácidos das RPOs de plasmídeos fúngicos e virais, o filograma resultante
mostrou que o clado fúngico, similarmente às análises de Parcimônia e Distância,
formou um grupo monofilético, com suporte de 92% (Figura 65). O valor de –lnL
obtido foi igual a 36254,72062.
1
T7
BPK11
Spunctatus
Postreatus
Fvelutipes
Mpernicios
Nintermedi
Gelasinosp
Ncrassa RP
Abitorquis
Hcircinans
Hkluyveri
Panserina
Bgraminis
Cpurpurea
T3
PhiYeO3
PBerlin
VP4
gh-1
K1F
Figura 65. Filograma gerado por Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas de RPOs de plasmídeos fúngicos e RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de bootstrap.
BPK11
VP4
K1F
Fago Berlin
T7
GH1
PHIYe03
T3
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
92
98
78
87
86
72
93
100
83
57
66
89
79
97
65
126
4.3.2 Filogenia Bayesiana
A inferência Bayesiana, utilizando seqüências de nucleotídeos e aminoácidos
das DNA e RNA polimerases virais, com o modelo de evolução mitocondrial de
mamíferos, apresentou árvores sem um padrão de monofiletismo para os grupos
utilizados nas análises – Fungos ascomicetos, fungos basidiomicetos e vírus.
O filograma de consenso de maioria, utilizando seqüências de DNA de contigs
de DPO/RPO apenas dos plasmídeos fúngicos, mostrou que contigs de ascomicetos
e de basidiomicetos ocorrem juntos em um mesmo clado, com valores de
probabilidade posterior acima de 95%.. Nesta análise o valor de –lnL foi igual a
76010,12 (Figura 66).
Podospora pauciseta 0.1
Spunctatus DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
1.00
Hkluyveri DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
1.00
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
1.00
1.00
0.94
0.96
Ncrassa DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
1.00
0.87
0.97
Postreatus DPO
0.73
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 66. Filograma de consenso de maioria gerado por análise Bayesiana, utilizando seqüências de DNA dos contigs DPO/RPO de plasmídeos mitocondriais de fungos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
Ascomycota
Basidiomycota
127
O filograma de consenso de maioria para as seqüências aminoacídicas dos
contigs DPO/RPO dos plasmídeos, apresentou seqüências de contigs de
Ascomycota formando clados com seqüências dos contigs de Basidiomycota. O
valor de –lnL foi igual a 56197,49 (Figura 67).
0.1
Spunctatus DPO
Ncrassa DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
1.00
Hkluyveri DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
1.00
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
1.00
0.82
0.98
0.72
1.00
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
1.00
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
1.00
0.99
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 67. Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, utilizando seqüências aminoacídicas dos contigs DPO/RPO dos plasmídeos mitocondriais fúngicos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
Ascomycota
Basidiomycota
128
A árvore Bayesiana de consenso para as seqüências aminoacídicas das DNA
polimerases de plasmídeos fúngicos e vírus, mostrou que as DPOs virais não
formaram um grupo monofilético, formando clados com DPOs fúngicas (Figura 68).
Esta análise apresentou –lnL=40025,03.
0.1
Phi29
Hkluyveri DPO
Bam35c
GIL16c
1.00
Ncrassa DPO
Abitorquis DPO
Hcircinans DPO
1.00
0.51
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
0.99
0.96
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
1.00
Fvelutipes DPO
Mperniciosa DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
1.00
0.67
1.00
Had12
SimadA
1.00
0.87
0.70
0.50
0.94
Podospora pauciseta
Phi 29
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Aden. Hum. 12
Aden. Símio
Bam35C
GLI16C
Figura 68. Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, para as DNA polimerases de plasmídeos fúngicos mais polimerases virais, utilizando seqüências de aminoácidos. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
129
A inferência Bayesiana para as seqüências aminoacídicas das RPOs dos
plasmídeos fúngicos e vírus, apresentou uma árvore de consenso de maioria onde
houve a formação de um clado fúngico monofilético com suporte de 74%,
semelhante às análises tradicionais (Figura 69). O valor de –lnL obtido foi igual a
38387,88.
Figura 69. Filograma de consenso de maioria, gerado por análise bayesiana, para seqüências aminoacídicas das RNA polimerases de plasmídeos fúngicos mais RPOs virais. Números acima dos ramos correspondem ao suporte dado por valores percentuais de probabilidade posterior.
Pleurotus ostreatus
0.1
T7
PhiYeO3
T31.00
BPK11
PBerlin
K1F
gh1
VP4
Hcircinans RPO
Postreatus RPO1.00
Spunctatus RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO1.00
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
0.69
0.99
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO1.00
1.00
0.74
0.90
0.50
0.54
1.00
0.74
1.00
1.00
1.00
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
BPK11
VP4
K1F
Fago Berlin
T7
GH1
PHIYe03
T3
Ascomycota
Basidiomycota
Chytridiomycota
Vírus
130
5 DISCUSSÃO
Nesta seção discutimos as relações evolutivas entre as DNA e RNA
polimerases do plasmídeo mitocondrial linear de M. perniciosa e todas as outras
polimerases codificadas por todos os outros plasmídeos fúngicos, também do tipo
linear, dentro do próprio clado fúngico e com as polimerases virais. Em uma outra
parte da discussão correlacionamos as estruturas das DPO e RPO do plasmídeo de
M. perniciosa com os moldes de polimerases virais selecionados para o trabalho,
destacando os domínios e motivos conservados encontrados nessas seqüências e a
qualidade dos modelos gerados pré e pós-refinamento e Dinâmica Molecular.
5.1 ANÁLISE SEQÜÊNCIA – ESTRUTURA DOS MODELOS DAS DPO E RPO DO
PLASMÍDEO DE M. PERNICIOSA COM OS SEUS MOLDES VIRAIS
O alinhamento da seqüência primária da DNA polimerase com a seqüência do
molde 1XHX, do vírus Φ29, revelou diversos motivos conservados entre essas duas
seqüências, como o motivo B, característico da família de DNA polimerases
organelares e virais, indicando que, provavelmente, essas seqüências foram
integradas ao plasmídeo em um único evento. A identificação desses motivos
conservados indica uma provável funcionalidade dessa polimerase na mitocôndria
de M. perniciosa, visto que todos os motivos descritos por Blasco et al.(1993a;
1993b; 1995), Méndez et al. (1994) e Bernad et al. (1990), como indispensáveis aos
processos de ligação à fita molde de DNA, identificação de dNTPs e sítio de
polimerização foram encontrados. Outro fato que sugere a funcionalidade dessa
molécula no genoma mitocondrial é a semelhança estrutural do modelo 3D
construído através de Modelagem por Homologia e o molde escolhido, apresentando
os três domínios conservados dentro dessa classe de polimerase: Palma, Dedos e
Polegar. Além disso, os sítios ativos do molde e do modelo inicial proposto para a
DPO do plasmídeo, no alinhamento estrutural, apresentam os mesmos aminoácidos
como constituintes (Lys380, Leu381, Leu382, Leu383, Asn384, Ser385, Leu386, Tyr387,
Gly388).
A RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa, deve, provavelmente,
apresentar funcionalidade dentro da mitocôndria, visto que o domínio Palma,
considerado por Koonin et al. (2006) como conservado entre todas as polimerases
131
de cadeia simples, foi identificado nos alinhamentos pelo TCOFFEE entre a
seqüência primária da RPO do plasmídeo com a do molde. Esse domínio apresenta,
nessa classe de RNA polimerases, aminoácidos responsáveis pelo sítio catalítico
dessa molécula. Outro fato importante para essa provável funcionalidade é a
presença dos outros domínios conservados: Dedos e Polegar, e a presença dos
mesmos aminoácidos componentes do sítio ativo dessa enzima, quando foi
realizado o alinhamento estrutural entre o molde (1ARO) e o modelo proposto.
De maneira geral os modelos das DNA e RNA polimerases do plasmídeo de
M. perniciosa, gerados após refinamento e dinâmica a 300 K e 300 ps, apresentaram
uma redução na qualidade geral do gráfico de Ramachandran, em relação aos
modelos iniciais (1DPO e 1RPO), pois de fato, gráficos de Ramachandran gerados a
partir de eventos de Dinâmica Molécula geralmente apresentam devios em relação a
moléculas modeladas apenas por homologia (FOGOLARI et al., 2003). Contudo,
ocorreram ajustes significativos nas conformações das cadeias laterais dos
aminoácidos desses modelos, sendo sua correta conformação indispensável para
futuros estudos de prováveis ligantes/inibidores para essas moléculas. Além disso,
foram obtidos valores de RMS finais mais baixos do que para as moléculas iniciais,
indicando um menor desvio estrutural entre o molde original e os modelos após o
refinamento e a Dinâmica Molecular. Outro ponto a ser ressaltado são os valores de
energia livre finais de cada modelo após a dinâmica que se apresentaram dentro do
esperado para moléculas biologicamente ativas, indicando que o processo de
refinamento por minimização de energia e a Dinâmica Molecular encontraram
conformações de mínimo provavelmente ativas biologicamente e com desvio entre
os moldes e modelos bastante reduzidos (CASE, et al., 2004; PEARLMAN et. al.,
1995).
5.2 RELAÇÕES ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS ENTRE PLASMÍDEOS
MITOCONDRIAIS LINEARES DE FUNGOS
Segundo Griffiths (1995) os plasmídeos mais encontrados dentro do clado
fúngico são do tipo linear, apresentando um processo de replicação semelhante ao
protein-primed dos adenovírus e fagos Φ29. Esse processo utiliza uma proteína
covalentemente ligada ao terminal 5’ dessas moléculas.
132
De acordo com Sakaguchi (1990), adenovírus e fagos Φ29 apresentam
características semelhantes a plamídeos de DNA, com um genoma apresentando
terminais invertidos e repetitivos e proteínas covalentemente ligadas ao terminal 5’
das moléculas.
Todos os 13 plasmídeos utilizados neste trabalho apresentam estruturas
lineares bastante semelhantes entre si, com as polimerases em fases de leitura
opostas e terminais invertidos repetitivos, exceto o plasmídeo de S. punctatus.
Resultados de BLASTP revelaram uma provável relação de ancestralidade das duas
polimerases codificadas por cada um desses plasmídeos e polimerases
virais,sugerindo que o processo de replicação desses plasmídeos utiliza o mesmo
sistema descrito por Griffiths (1995) para as polimerases virais e, desta maneira,
corroborando dados de Sakaguchi (1990).
Estruturalmente podemos sugerir uma classificação para esses plasmídeos
como elementos genéticos móveis dentro do grupo dos invertrons, como descrito em
Sakaguchi (1990).
5.3 FILOGENIA E EVOLUÇÃO DAS DNA E RNA POLIMERASES DOS
PLASMÍDEOS MITOCONDRIAIS DE FUNGOS E VÍRUS
Existem diversas abordagens para o surgimento e distribuição dos
plasmídeos nas mitocôndrias de fungos. Segundo Fukuhara (1995) é muito provável
que essas estruturas sejam derivadas de adenovírus e fagos de bactérias ancestrais
das atuais mitocôndrias. Essa hipótese é corroborada pelos dados de BLASTP e
BLASTN apresentados para os 13 plasmídeos estudados aqui, pois as seqüências
de DNA e RNA polimerases apresentaram homologia com as seqüências originadas
de adenovírus e retrovírus, respectivamente. Por outro lado, como descrito por
Fukuhara (1995), esses dados não trazem nenhuma hipótese de como teriam
surgido essas estruturas em citoplasmas de leveduras.
Rosewich e Kistler (2000) reportaram um grande número de fenômenos de
transferência horizontal de genes (THG) em fungos, em que elementos genéticos
móveis como plasmídeos, íntrons e transposons estariam envolvidos. Quando
observamos os dados obtidos a partir das filogenias combinadas ou individuais das
DNA e RNA polimerases dos 13 plasmídeos mitocondriais estudados neste trabalho,
verificamos que as polimerases de plasmídeos mitocondriais de Ascomycota e
133
Basidiomycota não formam grupos monofiléticos, ou seja, não possuem uma origem
comum. Outro fato curioso é que nem mesmo as polimerases de espécies
pertencentes a um mesmo gênero (Neurospora crassa e N. intermedia) apresentam
uma origem evolutiva comum, conforme sugerido pelas análises filogenéticas.
Um recente estudo de filogenia molecular realizado por James et al. (2006),
baseado em dados de seis genes nucleares de 199 espécies de fungos, apresentou
uma árvore na qual Ascomycota e Basidiomycota formaram grupos monofiléticos,
enquanto Chytridiomycota foi considerado polifilético. Baseado nesse fato
deveríamos esperar que as polimerases dos 13 plasmídeos mitocondriais estudados
formassem grupos monofilétcos representados pelos seus hopedeiros fúngicos,
ascomicetos e basidiomicetos, mas isso não ocorreu.
Resultados das filogenias das polimerases dos plasmídeos dos 13 fungos
juntamente com as polimerases virais corroboram a relação dos plasmídeos fúngicos
com seqüências de DNA de adenovírus e fagos bacterianos, como descrito
anteriormente. Os filogramas apresentados nos resultados mostraram que apenas
nas análises das RNA polimerases fúngicas em conjunto com as virais houve a
formação de grupos monofiléticos para os fungos, com valores de suporte estatístico
acima de 70%. Nas análises filogenéticas das DNA polimerases fúngicas e virais foi
possível observar em todas as árvores, o agrupamento das DPOs de Adenovírus
Humano tipo 12 e Adenovírus Símio com DPOs de um clado formado por DPOs de
plasmídeos de ascomicetos e basidiomicetos.
Os resultados de filogenia das polimerases dos plasmídeos mitocondriais
juntamente com polimerases virais apresentou dados semelhantes aos reportados
por Rosewich e Kistler (2000), em que análises filogenéticas entre seqüências de
aminoácidos de DNA polimerases de 11 plasmídeos lineares de fungos e plantas, 4
bacteriófagos e 8 vírus indicaram que grupos de plasmídeos relacionados aos
hopedeiros (plantas, fungos, vírus ou bacteriófagos), não necessariamente estariam
próximamente relacionados..
Uma provável explicação para a não-ocorrência de grupos monofiléticos que
reflitam a filogenia das espécies hospedeiras dentro das análises individuais das
polimerases dos plasmídeos fúngicos, e dessas polimerases com polimerases virais
é que essas seqüências podem ser originárias de um período pré-endossimbiose, no
qual os vírus e fagos tinham bactérias como hospedeiros, as quais posteriormente
deram origem às mitocôndrias. Essa hipótese é sugerida por Griffiths (1995), porém
134
é preciso considerá-la com cuidado. Por outro lado, poderíamos levar em
consideração, como uma explicação alternativa ao não-monofiletismo dessas
seqüências, que micovírus poderiam ter carreado essas polimerases dentro do clado
fúngico e as incorporado ao genoma mitocondrial. Essa afirmação se baseia em um
fato descrito por Rasewich e Kistler (2000), no qual a seqüência de uma RNA
polimerase de um vírus mitocondrial do ascomiceto Ophiostoma novo-ulmi Brasier
apresentou maior similaridade com a RPO do basidiomiceto Rhizoctonia solani do
que com a do ascomiceto Cryphonectria parasitica.
Todas as árvores filogenéticas geradas para as DNA e RNA polimerases
apenas para os 13 plasmídeos do clado fúngico e para fungos e vírus, apresentaram
topologias bastante semelhantes. Tanto nas análises combinadas em contigs quanto
nas análises indiduais, as polimerases do plasmídeo de M. perniciosa mostraram-se
mais próximas, na maioria das análises, das polimerases de F. velutipes. O clado
formado por esses dois basidiomicetos, na maior parte das análises mostrou-se mais
próximo das polimerases dos ascomicetos Gelasinospora sp. e N. intermedia.
Segundo Gaag et al. (1998), a transferência de plasmídeos mitocondriais
entre espécies de fungos pode ocorrer via transmissão sexuada ou assexuada. Um
exemplo dessa transferência foi identificado entre Ascobolus immersus e P.
pauciseta através de uma co-cultura, com a passagem do plasmídeo mitocondrial
pA12 da primeira espécie para a segunda. Considerando esse fato podemos sugerir
que a relação de proximidade filogenética, verificada em praticamente 100% das
análises realizadas, entre M. perniciosa e F. velutipes e o outro clado formado por
Gelasinospora sp. e N. intermedia seja resultado de uma passagem de material
genético em nível de gênero ou de espécie, porém isso precisa ser considerado com
cautela e estudos mais aprofundados precisam ser realizados pontualmente para
esse clado (M. perniciosa, F. velutipes, Gelasinospora sp. e N. intermedia). Uma
visão alternativa para a relação entre as polimerases desse clado seria a hipótese
dos micovírus descrita anteriormente, na qual um mesmo vírus, ou vírus muito
próximos, teriam infectado as mitocôndrias desses fungos em difrentes eventos. Por
outro lado, não foram identficados micovírus nas análises de BLASTP para a
seleção de polimerases virais que seriam submetidas às análises filogenéticas.
Quando comparamos as árvores geradas apenas para os plasmídeos
fúngicos, obtidas de análises utilizando seqüências de contigs DPO/RPO com as
árvores das seqüências individuais das DNA polimerases, para os métodos
135
tradicionais e bayesiano, utilizando seqüências de DNA e de aminoácidos, podemos
identificar uma topologia bem semelhante em todas as árvores. Entretanto, as
análises baseadas apenas nas seqüências de aminoácidos da RPO plasmidial
fúngica e viral sugerem uma origem única para estas enzimas em fungos. A
visualização de clados conservados em todas as árvores, como aquele formado
pelas polimerases dos plasmídeos de M. perniciosa e F. velutipes, nos leva a crer
que os eventos de inserção dessas seqüências, nas mitocôndrias das 13 espécies
do clado fúngico, podem ter ocorrido em períodos próximos, considerando uma taxa
de evolução do genoma mitocondrial de fungos igual para todas as espécies
estudadas.
Segundo Formighieri et al. (2008) a integração do plasmídeo de M. perniciosa
ao genoma mitocondrial foi um evento recente, que pode estar associado ao
desenvolvimento de alguns biótipos. Esse processo pode ter ocorrido através de
cruzamento entre linhagens não relacionadas evolutivamente, pelos mecanismos de
mitose ou meiose, como descritos anteriormente, ou através de micovírus, visto que
em algumas das árvores apresentadas para seqüências de polimerases virais e
fúngicas o clado formado por M. perniciosa e F. velutipes apresentou-se mais
próximo de seqüências virais do que das polimerases dos outros fungos. Por outro
lado, a formação de clados fúngicos monofiléticos para as RNA polimerases, quando
analisados juntamente com as seqüências virais, sugere que as seqüências
relacionadas com as RPOs tenham sido inseridas em eventos distintos das DPOs,
tanto em M. perniciosa como nos outros fungos.
As árvores filogenéticas para seqüências de DNA com exclusão das terceiras
bases dos códons, apenas no clado fúngico, obtiveram topologias bastante
semelhantes às das análises utilizando seqüências de aminoácidos, em todos os
métodos, com o agrupamento de seqüências de plasmídeos de ascomicetos e
basidiomicetos, além da formação de clados conservados como o de M. perniciosa e
F. velutipes. Esses resultados indicam a consistência filogenética dos dados
utilizados nas análises e a qualidade dos alinhamentos, como fatores indispensáveis
na realização de uma filogenia correta.
Considerando-se todas as hipóteses e resultados apresentados, obtidos de
análises das DPOs e RPOs apenas do clado fúngico, e entre fungos e vírus, sugere-
se que tenha ocorrido uma provável transferência horizontal de genes para as
seqüências de DNA e RNA polimerase do plasmídeo de M. perniciosa e os demais
136
plasmídeos fúngicos, corroborando a hipótese de que essas seqüências tenham
ancestrais virais. Não se sabe ao certo se essas seqüências têm origem pré ou pós-
endossimbiose e, para isso, é necessário uma investigação mais aprofundada, com
a utilização de análises de relógio molecular.
6 CONCLUSÕES
6.1 MODELAGEM POR HOMOLOGIA
Apesar da baixa identidade apresentada entre as seqüências primárias das
DPO e RPO do plasmídeo de M. perniciosa e seus respectivos moldes, os modelos
finais propostos para cada polimerase apresentam todos os domínios característicos
de cada grupo de enzima. Além disso, a alta similaridade estrutural entre os modelos
propostos e seus respectivos moldes sugere que, provavelmente, essas moléculas
estejam ativas dentro da mitocôndria de M. perniciosa. Os valores de RMS finais
entre os modelos propostos e seus respectivos moldes sugerem um futuro estudo de
ligantes baseado nos inibidores/ligantes dos seus respectivos moldes.
Os processos de refinamento e Dinâmica molecular alteraram
significativamente as conformações das cadeias laterais dos aminoácidos dos
modelos das DPO e RPO, reduzindo a qualidade dos gráficos de Ramachandran,
porém, melhorando os gráficos de validação das cadeias laterais, e apresentando
qualidades termodinâmicas e estereoquímicas aceitáveis para moléculas
biologicamente ativas.
6.2 FILOGENIA MOLECULAR
Todas as análises filogenéticas (parcimônia, distância, máxima
verossimilhança e bayesiana) apresentaram topologias das árvores semelhantes,
tanto utilizando seqüências de nucleotídeos como de aminoácidos. As RNA
polimerases dos plasmídeos fúngicos aparecem como monofiléticas em relação às
seqüências de RNA polimerases virais.
Podemos inferir a partir desse estudo que as DNA e RNA polimerases foram
inseridas, provavelmente, em eventos distintos, por Transferência Horizontal de
137
Genes no genoma mitocondrial das 13 espécies de fungos hospedeiras utilizadas
nesse estudo.
138
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150
APÊNDICES
APÊNDICE A- Estruturas tridimensionais das DNA e RNA polimerases do plasmídeo
mitocondrial de M. perniciosa, após Dinâmica Molecular de 300 K por 300 ps.
Figura 70. Estrutura secundária da 1DPOC.
Figura 71. Estrutura secundária da 1RPOC.
151
APÊNDICE B - Filogramas gerados pelas análises filogenéticas tradicionais e
bayesiana, das DNA e RNA polimerases dos plásmídeos fúngicos, utilizando
seqüências de nucleotídeos e aminoácidos.
100
Spunctatus DPO
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 72. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, para as DNA polimerases de plasmídeos fúngicos, utilizando seqüências nucleotídicas.
Ascomycota
Basidiomycota
100
100
97
100
100
54
94
99
152
0.1
Spunctatus DPO
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 73. Filograma gerado a partir de Distância, utilizando seqüências nucleotídicas das DNA polimerases dos plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
100
100
61
100
100
100
100
74
94
153
0.1
Spunctatus DPO
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Figura 74. Filograma das DPOs de plasmídeos fúngicos, utilizando seqüências de DNA, gerado a partir de inferência por Máxima Verossimilhança.
Ascomycota
Basidiomycota Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
99
72
85
64
100
99
61
93
154
100
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Ncrassa DPO
Hkluyveri DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 75. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia para as seqüências aminoacídicas das DNA polimerases de plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
98
66
84
56 98
95
100
100
155
0.1
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
Hkluyveri DPO
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 76. Filograma gerado por Distância, para as seqüências aminoacídicas das DPOs de plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
100
100
100
100
100
100
53
80
100
156
1
Spunctatus
Hkluyveri
Ncrassa DP
Abitorquis
Hcircinans
Fvelutipes
Panserina
Postreatus
Mpernicios
Nintermedi
Gelasinosp
Bgraminis
Cpurpurea
Figura 77. Filograma de Máxima Verossimilhança para as seqüências aminoacídicas de DPOs dos plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
93
100
100
87
78
100
85
79
66
95
157
100
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPOPleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 78. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando seqüências de DNA das RPO dos plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
92
96
66
100
79
69
100
158
100
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
Spizellomyces punctatus
Figura 79. Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências de DNA das RPOs de plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
84
91
80
100
85
100
159
0.1
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
Panserina RPO
Hkluyveri RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Figura 80. Filograma de Máxima Verossimilhança para as seqüências nucleotídicas das RPOs dos plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
74
71
99
58
82
160
100
Spunctatus RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Figura 81. Filograma de consenso de maioria, por Parcimônia, utilizando as seqüências de aminoácidos das RNA polimerases de plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Spizellomyces punctatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
73
96
60
100
93
55
73
100
161
0.1
Spunctatus RPO
Hkluyveri RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
Figura 82. Filograma gerado por Distância, utilizando seqüências de aminoácidos das RPOs de plasmídeos fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
81
68
90
89
100
91
100
Spizellomyces punctatus
162
1
Spunctatus
Postreatus
Nintermedi
Gelasinosp
Mpernicios
Fvelutipes
Ncrassa RP
Abitorquis
Hcircinans
Hkluyveri
Panserina
Bgraminis
Cpurpurea
Figura 83. Filograma de Máxima Verossimilhança, utilizando seqüências aminoacídicas das RPOs de plasmídeos mitocondriais fúngicos.
Ascomycota
Basidiomycota
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Spizellomyces punctatus
52
92
96
60
55
66
73
81
75
67
163
0.1
Spunctatus DPO
Postreatus DPO
Panserina DPO
1.00
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
1.00
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
1.00
1.00
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
1.00
0.95
Hkluyveri DPO
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
1.00
0.57
1.00
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 84. Filograma Bayesiano de consenso de maioria, para as seqüências nucleotídicas das DNA polimerases dos plasmídeos mitocondriais de fungos.
Ascomycota
Basidiomycota
164
0.1
Spunctatus DPO
Gelasinospora DPO
Nintermedia DPO
1.00
Mperniciosa DPO
Fvelutipes DPO
0.82
1.00
Bgraminis DPO
Cpurpurea DPO
1.00
Hkluyveri DPO
Ncrassa DPO
Hcircinans DPO
Abitorquis DPO
1.00
0.71
0.74
1.00
1.00
Postreatus DPO
Panserina DPO
1.00
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 85. Filograma Bayesiano de consenso de maioria, das DPOs de plasmídeos mitocondriais de fungos, utilizando seqüências de aminoácidos.
Ascomycota
Basidiomycota
165
0.1
Spunctatus RPO
Postreatus RPO
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
1.00
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
1.00
0.98
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hcircinans RPO
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
0.99
0.63
0.60
0.56
0.53
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 86. Filograma Bayesiano de consenso de maioria para as seqüências nucleotídicas das RPOs dos plasmídeos mitocondriais de fungos.
Ascomycota
Basidiomycota
166
0.1
Spunctatus RPO
Ncrassa RPO
Abitorquis RPO
Hcircinans RPO
Postreatus RPO
1.00
Hkluyveri RPO
Panserina RPO
Bgraminis RPO
Cpurpurea RPO
1.00
1.00
0.91
0.81
0.78
1.00
Gelasinospora RPO
Nintermedia RPO
1.00
Mperniciosa RPO
Fvelutipes RPO
0.89
0.60
Spizellomyces punctatus
Pleurotus ostreatus
Agaricus bitorquis
Podospora pauciseta
Moniliophthora perniciosa
Flammulina velutipes
Pichia kluyveri
Hebeloma circinans
Blumeria graminis
Claviceps purpurea
Gelasinospora sp.
Neurospora crassa
Neurospora intermedia
Figura 87. Filograma bayesiano de consenso de maioria, para seqüências aminoacídicas das RNA polimerases dos plasmídeos mitocondriais de fungos.
Ascomycota
Basidiomycota
167
ANEXOS
