Moléculas pequeñasbiotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads/2010/04/CEBI… · Cromatografía: • Técnica que permite separar los diferentes componentes de una mezcla

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Articulación CEBI_E1a

Técnicas de Análisis en Biotecnología –Moléculas Pequeñas

Docente a cargo: Marianela SANCHEZe-mail: [email protected]

CEBI_E1a

M. Sánchez-CEBI_E1a 2

Moléculas pequeñas:

• Compuestos orgánicos de bajo peso molecular (<800 Da, no poliméricos)

• Variedad de funciones biológica:– Comunicador celular,

– Drogas

– Pesticidas

• Pueden ser naturales (metabolitos secundarios) o artificiales (sintéticos)


Muestreo y análisis de las materias

primas

Análisis de productos

intermedios

Monitorización de la calidad de los

productos

Monitorización de la calidad de los

efluentes


• Técnicas cromatográficas:– HPLC

– CG

• Espectroscopía de RMN• Espectrometría de Masas


Cromatografía:

• Técnica que permite separar los diferentes componentes de una mezcla compleja.

• La separación se logra por diferencias en la movilidad relativa de los solutos (interacciones físicas y químicas entre los componentes).


Cromatografía:

– Fase estacionaria

– Fase móvil

– Soluto o muestra


Cromatografía:

Se pueden clasificar:

• De acuerdo al soporte• Al tipo de equilibrio que se establece

en la separación• Al estado de agregación de la fase

móvil


Cromatografía:

• Constante de distribución(Kc)= relaciona la concentración de un soluto entre la fase móvil y la estacionaria.

Kc = CsCm

Concentración del analito en fase estacionaria

Concentración del analito en fase móvil


Durante la migración de la muestra a través de la FE se produce la separación de los componentes.


k= Tr – TmTm

IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenidok entre 1 y 5 valor idealk 20 o mayor cromatografías muy largas

Factor de retención (k) = permite comparar la velocidad de migración de los diferentes solutos. Se puede determinar experimentalmente.


Ensanchamiento de banda: dispersión

Caminos múltiples•Empaquetamiento•Rango de tamaño de partícula•Diámetro de partícula


Dispersión Ensanchamiento a flujos bajos


DispersiónTransferencia de masa

Difusión del analito dentro y fuera de la FM estancada en el poro de la FE.

Diferentes profundidades de penetración causan diferentes ensanchamientos de banda


Ecuación de van Deemter:

Multiplicidad de caminos

Difusión longitudinal Transferencia de masa


Caudal: Volúmen transportado por unidad de tiempo.

Q = π r2 µ

Área de sección de la columna

Velocidad lineal media de flujo


Cromatografía líquida

• Principales mecanismos de interacción FM-FE:

– Adsorción superficial– Partición – Intercambio iónico– Exclusión molecular


Cromatografía:

• De adsorción: fenómeno superficial, partículas de soluto adsorbidas en la fase estacionaria


Cromatografía de Adsorción

• FE: Sólidos muy porosos con capacidad adsorbente– Sílica

– Alúmina

• FM:– Solventes orgánicos

Capacidad de cargaPresentaciones


• Solvente y soluto compiten por los sitios de adsorción en la fase estacionaria!





Cromatografía de Adsorción• La fuerza eluyente ε0 es la energía de adsorción del disolvente por

unidad de superficie (sílica).

Solvente Fuerza de EluciónFluorcalcanos -0.20N-pentano 0.00N-hexano 0.011-clorubutano 0.20Benceno 0.20Xileno 0.24Cloroformo 0.26Tolueno 0.28Cloruro de metileno 0.32Acetato de etilo 0.38Tetrahidrofurano 0.44Acetonitrilo 0.50Metanol 0.70 M. Sánchez-CEBI_E1a 22

• Tipos de rellenos:Esférico Irregular



Ejemplo


Separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm, sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano. Caudal 0.25 mL/min. Detector UV 254 nm.

La cromatografía de adsorción es mas adecuada para compuestos no polares (solubilidad limitada en solventes acuosos) con masas moleculares < 5000.

Que la diferencia de otros métodos??capacidad de diferenciar isómeros!


Q = π r2 µµ=0.06

Cromatografía de reparto

Los componentes de la mezcla se separan según su distribución entre dos líquidos inmiscibles.

FE

OJO!! soporte ≠ FE!!

Soporte:Sílica finamente particulada (<10 μ)Superficie completamente hidrolizada


Fase Unida (o Ligada)Fase Unida (o Ligada)


Cromatografía en fase reversa


Cromatografía en fase reversa

THF

i-PROPANOLACETONAETANOL

ACETONITRILOMETANOL

AGUA

LONGITUD DE ONDA MINIMA UV

212 nm

205 nm330 nm210 nm190 nm205 nm190 nm

INDICE DE REFRACCION

1.405

1.3841.3561.3591.3411.4571.333

FUERZA DE SOLVENTE

4.4

4.23.43.63.13.00.0

M. Sánchez-CEBI_E1a30

Fase Ligada

Fase reversa

Fase normal

C-18 Mas utilizada en RP-HPLC

C-8 menor retención que C18

C-3, C-4 Proteínas y péptidos

CN compuestos de polaridad intermedia

NH2 hidratos de Carbono


Ejemplo

Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de las columnas de siloxano en fase inversa empaquetadas con partículas de 5 µm. Fase móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 mL/min


A: H 2OB: MeOH

↑ % A


A: H 2OB: CH3CN

☹

↑ tiempo=solvente (=$)↓ resolución de picos mas retenidosSolución: GRADIENTE!

☺


Aplicaciones


Analitos ionizables(débiles)

pKa=4.6

Muy polar = menos retenidaMenos polar = más retenida

Variar pH de FM

Supresión de iones

Par iónico(IPC)


Supresión de iones

↑ proporción de ácido protonado (neutro)


Analitos ionizables

Para trabajar con las especies cargadas:

Cromatografía de:•Intercambio Iónico (IEC)•Par Iónico (IPC)


Cromatografía de Intercambio Iónico

• Sirve para separar compuestos iónicos (aniones y/o cationes)

• Soporte: poliestireno o sílica

• Solvente: buffer (control de pH y fuerza iónica)

• Mecanismo de separación: intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas.

Intercambiador de aniones

Intercambiador de cationes


Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)

Intercambiadores fuertes

Intercambiadores débiles


Cromatografía de Intercambio Iónico: Aplicaciones

• Cationes y anionesinorgánicos

• Acidos orgánicos, aminas, carbohidratos, proteínas, etc.

OJO: NO SON MOLÉCULAS PEQUEÑAS!!

M. Sánchez-CEBI_E1a 41 M. Sánchez-CEBI_E1a 42

Cromatografía de Par Iónico

• Utiliza una columna HPLC de fase reversa.• Se añade a la FM un reactivo que se aloja en la FE convirtiéndola

en un intercambiador iónico.• Los iones del analito se pueden unir a la fase estacionaria por

atracción electrostática con los iones del surfactante.• Mecanismo de retención: mezcla de interacciones con fase reversa

y de intercambio iónico.

SO3

SO3 N

R

R

R

H+

Na+

Fase unida Reactivo de par iónico

MuestraN+

N+

O C RO

H2PO4


Longitud de cadena del reactivo de par iónico


Cromatografía de exclusión molecular

• FE: geles porosos• Fundamento de separación: separación

en base a forma y tamaño del analito




Muy útil con macromoléculas,Aacs, péptidos,azúcares.


Instrumentación


Suministro de solventes:

Funciones básicas:• Proveer flujo constante y preciso• Proveer composiciones precisas de fase

móvil• Proveer la fuerza necesaria para empujar

la FM a través del empaquetamiento compacto de la fase de la columna


Suministro de solventes:

• Agua, soluciones buffer acuosas y solventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. Grado HPLC.

• FM sin elementos particulados. Evitar obstrucciones en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna muy empaquetada)


Bomba pistón

• Movimiento del pistón atrás-adelante

• Sello flexible alrededor de la periferia del pistón (impide la fuga de la FM)

• Válvulas de retención (flujo unidireccional de disolvente)

• Variación del flujo


Pistones en paralelo

• Mientras un cilindro se está llenando, el otro entrega FM.

Flujo Combinado

Pistón A Pistón B


Pistones en serie

• Mientras se llena el pistón grande llena el pequeño entrega FM. Cuando se llena el pequeño, el proporciona FM (para llenar tanto el pistón pequeño y proporcionar un flujo neto hacia la columna)


Amortiguador de pulsos

• Tubo en forma de “T”

• Fuelle flexible o gas compresible (absorbe energía de la pulsación)

• Cuando la bomba se esta llenando, esta energía se libera

• Reduce el ruido de la bomba


Inyector Manual

• Válvula de 6 vías, con loop de volumen conocido y una palanca con dos posiciones: llenado e inyección

• Llenado: la FM pasa a la columna y la muestra se introduce en el loop

• Inyección: la FM impulsa la muestra desde el loop hasta la columna


Inyección manual vs. automática

> precisión


Columnas

• Columnas analíticas: Ø interno: 4.6 mm, < 0.1 mg muestra

• Columnas semipreparativas: Ø interno: 1 a 3 cm, de 1 a 200 mg muestra

• Columnas preparativas: Ø interno: varios cm. Solo para uso industrial. Requieren equipo especial.

Cuidados físicos con la columna:

• No golpear la columna

• No dejar secar la columna


Detectores

• Basados en una PROPIEDAD física o físico-química DEL SOLUTO (no la presenta la FM). Bastante selectivos y muy sensibles.– UV– Fluorescencia– Electroquímicos

• Basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la FM con y sin soluto eluido. Responden a un conjunto amplio de solutos. Poco sensibles.– Índice de refracción– Conductividad


Propiedades del detector• Sensibilidad adecuada• Respuesta lineal amplia• Respuesta rápida y reproducible• Manejo sencillo

• Límite de detección: relación señal/ruido. No solo depende del detector!

• Límite de cuantificación: límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas


UV-VisibleLey de Beer: A = ɛ l c

Coeficiente de extinción

concentraciónlong. de la celda

ɛ sustancia

longitud de onda

Se analiza una longitud de onda por cada mediciónSolvente!!


Detector UV por arreglo de diodos

Va realizando barridos completos del espectro UV-Vis

Permite reprocesar el mismo cromatogramadetectando a diferentes λλλλ

Se puede obtener el espectro UV-Vis de cada pico del cromatograma y compararlo

con una base de datos

Rtλλλλ

Abs


Detector de fluorescencia

Muy sensibles y selectivos.Dos λ de trabajo:

-excitación-emisión

Para analitos fluorescentes (derivados)


Detectores de índice de refracción

• Miden variaciones en el RI del analito con respecto al de la FM

• Sólo se pueden usar si la elución es isocrática

• Son universales, pero tienen baja sensibilidad


Detectores de conductividad

•Aplicaciones: Iones, ácidos, bases y sales • Baja sensibilidad• Sensibles a impurezas de la fase móvil


Detectores electroquímicos• Se basan en la reacción redox entre el analito y

un electrodo

• El nivel de reacción es proporcional a la concentración del analito.

• Se mide y se compara con un electrodo de referencia.


Detectores por espectrometría de masas

• Introducción de la FM en cámara de vacío

• Vaporización previa de solvente

• Termovaporizador-ionizador

• Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles

• Espectros de impacto electrónico


Análisis cualitativo

• Permite identificar los compuestos individuales en la muestra– El parámetro más común es su tiempo de

retención

– Dependiendo del detector utilizado la identificación se puede basar en la estructura química, molecular, peso o algún otro parámetro molecular.


Análisis cuantitativo

• Detectores dan una respuesta proporcional a la cantidad de sustancia (m):

• Respuesta = a x m

a: característico para cada sustancia

Como el componente atraviesa el detector en un período de tiempo

Área

f: factor de respuesta. Cantidad de sustancia por unidad de área


Método del estándar externo• Se preparan soluciones del estándar de

concentración conocida.• Se grafica área vs. concentración

Debe verificarse el rango de linealidad de respuesta!!


Bibliografía

• The LC Handbook. Guide to LC columns andmethod development. Agilent. 2011.

Publication number 5990-7595EN.www.chem.agilent.com\Library\primers\public\LC-

Handbook-Complete-2.pdf• Agilent ZORBAX column guide selection.• Trends in universal detection in high performance

liquid chromatography. Joshi, P. B.; Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. www.sepscience.com

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