Montagens gênicas especiaisMontagens gênicas especiais

estratégias de clonagem de genesestratégias de clonagem de genes

Homem ou bactéria ?Homem ou bactéria ?

Isolamento do material Isolamento do material genéticogenético

Protocolo padrãoProtocolo padrão

uso do uso do CsCl CsCl –– 8M8M

Protocolo da lise alcalinaProtocolo da lise alcalinapreserva moléculas de preserva moléculas de plasmideos plasmideos por estarem por estarem superenrroladassuperenrroladas

comparação dos comparação dos protocolosprotocolos

ultracentrifugaçãoultracentrifugaçãolise alcalinalise alcalina

UltracentrifugaçãoUltracentrifugação

obtenção de uma obtenção de uma preparação preparação plasmidial plasmidial pelo protocolo do pelo protocolo do CsClCsCl

Transformação genética de Transformação genética de bactériasbactérias

linhagens receptoraslinhagens receptoras

mutantes não produtores das mutantes não produtores das enzimas de restrição e enzimas de restrição e metilaçãometilação

exemplos mais usados:exemplos mais usados:E. E. colicoli DH5DH5ααE. E. colicoli DH10BDH10B

Indução de competênciaIndução de competência

tratamentos feitos para aumentar a tratamentos feitos para aumentar a eficiência de transformaçãoeficiência de transformação

soluções de íons (CaClsoluções de íons (CaCl22))coquetel de íons coquetel de íons (CaCl(CaCl22, MnSO, MnSO44, COCl, COCl22, etc), etc)

choque térmicochoque térmicocéls céls mantidas a 0º mantidas a 0º →→ 4242ººC por 90C por 90””

Captação de material genéticoCaptação de material genético

Recombinação genética por Recombinação genética por transduçãotransdução

emprega vetores emprega vetores fágicosfágicosexemplos mais usados:exemplos mais usados:

fago M13fago M13fago fago λλfago fago φφ X 174X 174etcetc

vantagens no transporte do material vantagens no transporte do material genéticogenéticodesvantagens relativas ao tamanho dos desvantagens relativas ao tamanho dos insertosinsertos

Ciclo vital de um bacteriófago

Transformação Transformação ouou TransduçãoTransdução

Particularidade de colônias de bactériasParticularidade de colônias de bactérias

significado de 1 clone

conjunto de células genéticamente indênticas

Pareamento e ligação

Clonagem usando

cosmideos

Clonagem de genes em Clonagem de genes em YACsYACs

Opções de seleção de clones com inserto

• resistência à tetraciclina

• resistência à ampicilina

transferência de material genético de géis para membranas

hibridização molecular

com sondas radioativas

Detalhamento do uso de Detalhamento do uso de sondas molecularessondas moleculares

pareamento de pareamento de nucleotideos nucleotideos entre entre as moléculas das as moléculas das sondas e as do DNA sondas e as do DNA em estudoem estudo

hibridização (sonda radiativa)

Southern blot

Teste do DNA

Identificação de clones fágicos

Construção de bibliotecas de Construção de bibliotecas de genesgenes

escolha do tecido em que se expresse o escolha do tecido em que se expresse o gene de interessegene de interesseextração do extração do mRNAmRNAcópia em DNA (cópia em DNA (cDNAcDNA))inserção em um vetorinserção em um vetortransformação de bactériastransformação de bactériasestoque de clones bacterianosestoque de clones bacterianosanálise por análise por seqüenciamento seqüenciamento dos clonesdos clonescrescimento e isolamento do gene de crescimento e isolamento do gene de interesseinteresse

Mecanismo de produção

de cDNA

gene copiado

Separação de mRNA por oligo dT

Mutagênese sítio

dirigida