GUSTAVO SILVEIRA BREGUEZ

AVALIAÇÃO PROTEÔMICA E CARACTERIZAÇÃO DO POTENCIAL

ANGIOGÊNICO DO PEPTÍDEO PR-11 E ANÁLOGOS

Ouro Preto – MG, dezembro de 2016

UFOP – UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NUPEB – NÚCLEO DE PESQUISAS EM

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PPGCBIOL – PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO PROTEÔMICA E CARACTERIZAÇÃO DO POTENCIAL

ANGIOGÊNICO DO PEPTÍDEO PR-11 E ANÁLOGOS

AUTOR: Gustavo Silveira Breguez

ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

COORIENTADOR: Prof. Dr. William de Castro Borges

Ouro Preto – MG, dezembro de 2016

Tese submetida ao programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas do

Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de

Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do título de Doutor

em Ciências Biológicas, área de

concentração: Bioquímica Estrutural e

Biologia Molecular.

i

ii

Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E

PROTEÔMICA (LEP) – NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria

de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e

Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

iii

Dedico esta tese aos meus pais, irmãs,

sobrinha e minha esposa Waléria, por

todo o amor, carinho e apoio

incondicional perante todas as

dificuldades.

iv

“O período de maior ganho em

conhecimento e experiência é o

período mais difícil da vida de

alguém.”

Dalai Lama

v

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo privilégio de alcançar mais essa conquista.

Aos meus pais, Geraldo e Marúcia, minhas irmãs, Gerúcia e

Michele, e minha sobrinha Milena pelo amor, carinho e por todo o

apoio ao longo dessa jornada.

À minha querida esposa Waléria, que acompanhou este trabalho

desde o início. Obrigado por todo o companheirismo, apoio, dedicação e

paciência. Sua presença ao meu lado foi fundamental para esta

realização! Te amo, sempre e para sempre!

À todos familiares, que, mesmo distantes, sempre estiveram ao

meu lado.

Aos professores Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade e

William de Castro Borges, pela orientação, ensinamentos e confiança

depositados durante o desenvolvimento desta tese.

Aos amigos da República Cruz Vermelha e amigas da República

Namoradeiras, pela convivência e amizade ao longo de 12 anos vividos

em Ouro Preto.

Ao Leandro Neves (LEP), pelo auxílio essencial dedicado a este

trabalho.

Aos demais amigos do laboratório, agradeço todo o apoio e

incentivo desde o início da minha pesquisa ainda no mestrado.

Ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio/CNPEM -

Campinas), pelo suporte inicial durante a realização deste projeto.

Aos laboratórios do NUPEB, pela permissão e ajuda no uso de

diversos equipamentos.

Por fim, agradeço a todos que de maneira direta ou indireta

contribuíram para a realização deste trabalho.

vi

ÍNDICE

Resumo ................................................................................................................................... viii

Abstract .................................................................................................................................... ix

Lista de abreviaturas ................................................................................................................ x

Lista de figuras ....................................................................................................................... xii

Lista de tabelas ...................................................................................................................... xiii

1. Introdução ............................................................................................................................. 2

1.1. Proteólise intracelular .......................................................................................................... 2

1.2. O complexo proteolítico proteassoma 20S .......................................................................... 3

1.3. Reguladores do proteassoma 20S ........................................................................................ 5

1.4. Inibidores do proteassoma ................................................................................................... 7

1.5. Peptídeos antimicrobianos ricos em prolina e arginina: PR-39 e análogos ....................... 10

2. Justificativa ......................................................................................................................... 16

3. Objetivos .............................................................................................................................. 18

3.1. Objetivo geral .................................................................................................................... 18

3.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 18

4. Materiais e métodos ............................................................................................................ 20

4.1. Síntese de peptídeos .......................................................................................................... 20

4.1.1. Purificação dos peptídeos por cromatografia em fase reversa em sistema HPLC

.................................................................................................................................................. 22

4.1.2. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas LCMS-IT-TOF

electrospray ................................................................................................................. 22

4.2. Preparo de culturas primárias de fibroblastos de ratos Wistar e exposição ao PR-11....... 23

4.3. Extração de proteínas para análise proteômica.................................................................. 24

4.3.1. Extrato de proteínas totais para eletroforese bidimensional ............................... 24

4.3.2. Extrato de proteínas solúveis para digestão em solução ..................................... 24

4.3.3. Eletroforese uni e bidimensional em géis de poliacrilamida (1D/2D SDS-PAGE)

.................................................................................................................................................. 25

4.3.4. Digestão em solução de proteínas solúveis ........................................................ 26

4.3.4.1. Cromatografia líquida e análise em espectrômetro de massas: digestão

em solução .................................................................................................................... 27

4.3.4.2. Análise estatística e categorização das proteínas ................................. 27

vii

4.4. Imobilização do peptídeo PR-11 em coluna de afinidade ................................................. 28

4.4.1. Extração de proteínas e passagem da amostra em coluna de afinidade com o PR-

11 imobilizado ......................................................................................................................... 29

4.4.2. Digestão in gel .................................................................................................... 30

4.4.2.1. Cromatografia líquida e análise em espectrômetro de massas: digestão

in gel ............................................................................................................................. 30

4.5. Avaliação da angiogênese desencadeada pelos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 por meio

de implantes subcutâneos de esponjas em camundongos Swiss ............................................... 31

4.5.1. Implantação das esponjas, administração dos peptídeos e eutanásia dos animais

.................................................................................................................................................. 32

4.5.2. Análise histológica .............................................................................................. 33

4.5.3. Análise estatística ............................................................................................... 33

5. Resultados e discussão ........................................................................................................ 35

5.1. Síntese de peptídeos .......................................................................................................... 35

5.2. Análise proteômica ............................................................................................................ 37

5.2.1. Avaliação da expressão diferencial de proteínas por fracionamento em

eletroforeses bidimensionais..................................................................................................... 37

5.2.2. Digestão em solução de extratos solúveis de fibroblastos: análise proteômica

shotgun .................................................................................................................................... 40

5.2.2.1. Via HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α) ........................................... 53

5.2.2.2. Via NF-κB (nuclear factor kappa B) ................................................... 55

5.2.2.3. Processos tumorais ............................................................................... 56

5.3. Identificação de proteínas ligantes ao PR-11 .................................................................... 57

5.4. Avaliação da angiogênese desencadeada pelos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 por meio

de implantes subcutâneos em camundongos Swiss .................................................................. 62

6. Conclusões ........................................................................................................................... 67

7. Referências bibliográficas .................................................................................................. 69

8. Apêndice .............................................................................................................................. 81

Artigo publicado ........................................................................................................... 84

viii

RESUMO

O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu

envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante

entre as vias de degradação. A literatura demonstra que estruturas análogas ao peptídeo PR-11

(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do

peptídeo natural PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma 20S. Inicialmente

descoberto por suas propriedades antimicrobianas, os peptídeos desta classe desempenham

importantes efeitos anti-inflamatórios e angiogênicos. Apesar da ampla atividade biológica, os

estudos moleculares são predominantemente limitados à inibição do proteassoma por estes

peptídeos. Dessa forma, este trabalho teve como principais objetivos: avaliar o proteoma de

culturas de fibroblastos expostas ao PR-11; identificar possíveis alvos desse peptídeo por sua

imobilização em coluna de afinidade e caracterizar o perfil angiogênico do PR-11 e moléculas

análogas por meio de implantes subcutâneos de esponjas em camundongos. Os peptídeos PR-

11, F12 e C8C15 foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida,

purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. A estratégia

shotgun label-free foi utilizada para avaliar as alterações proteômicas causadas pela exposição

de culturas de fibroblastos ao PR-11 a 1 µM durante 2, 6 e 10 horas. Esta abordagem revelou

que mais da metade das proteínas diferencialmente expressas identificadas estão relacionadas

à sinalização celular, transcrição e tradução. Proteínas diretamente associadas à angiogênese

pela regulação ou interação com o HIF-1α foram significativamente alteradas. Além disso, ao

menos três proteínas diferencialmente expressas da via do NF-κB relacionam-se a uma

resposta anti-inflamatória. Em paralelo, a interação do PR-11 imobilizado com extrato solúvel

de fígado de ratos permitiu a identificação de novos ligantes ao peptídeo, destacando-se a

gC1qR. Esta proteína está envolvida na internalização celular do peptídeo CGKRK, o qual

assemelha-se ao segmento N-terminal do PR-11. Nossos resultados apresentam evidências

preliminares de que a proteína gC1qR possa mediar a internalização celular do PR-11. De

modo geral, a avaliação histológica das esponjas dos animais tratados com os peptídeos PR-

11, F12 e C8C15 demonstra um aumento do perfil proliferativo e maturação do processo

angiogênico. Por fim, os dados obtidos neste trabalho apresentam importantes informações

para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos nas atividades biológicas

promovidas pelo PR-11 e moléculas similares.

ix

ABSTRACT

The proteasome has been considered a potential pharmacologic target due to its participation

in various processes related to intracellular protein turnover. It was recently demonstrated that

analogues of the PR-11 peptide (RRRPRPPYLPR), which corresponds to the first 11 amino

acids of the PR-39 molecule, exhibit a potent inhibition over the 20S proteasome. It is known

to possess various biological effects including antimicrobial properties, angiogenic and anti-

inflammatory activities. Apart from its reported activity as a proteasome inhibitor, a more

comprehensive understanding of its function, at the molecular level, is still lacking. Thus, this

present work aimed to evaluate the proteomic alterations caused by exposure of cultured

fibroblasts to the peptide PR-11; to identify novel potential ligands of this peptide by affinity

chromatography and to characterize the angiogenic profile of PR-11 derived molecules using

subcutaneous implants of sponges in mice. The peptides PR-11, F12 and C8C15 were

synthesized through the Fmoc strategy in solid phase, purified by HPLC and identified by

mass spectrometry. A label-free shotgun strategy was used to analyze the proteomic

alterations caused by exposure of 1 μM PR-11 during 2, 6 and 10 hours. This approach

revealed that more than half of the identified molecules were related to signalling,

transcription and translation. Proteins directly associated to regulation of angiogenesis and

interaction with the hypoxia-inducible factor 1-α (HIF-1α) were significantly altered. In

addition, at least three differentially expressed molecules of the NF-κB pathway were

detected, suggesting an anti-inflammatory property of PR-11. In parallel, we demonstrated

novel ligands of PR-11, through its immobilization for affinity chromatography. Among the

eluted molecules, gC1qR, a known complement receptor, appeared markedly enriched. This

provided preliminary evidence of a PR-11 ligand possibly involved in the internalization of

this peptide. In general, the histological evaluation of the sponges of treated mice with PR-11,

F12 and C8C15 peptides demonstrates an increase in the proliferative profile and maturation

of angiogenesis. Altogether, our findings contributed to a better understanding of the cellular

pathways affected by PR-11 and similar molecules.

x

LISTA DE ABREVIATURAS

1D/2D SDS-PAGE – Eletroforeses uni e

bidimensional em gel de poliacrilamida

5AHQ – 5-amino-8-hidroxiquinolona

ACN – Acetonitrila

Acinus – Apoptotic chromatin

condensation inducer 1

ADP – Adenosine diphospate

ANOVA – Análise de variância

ARG1 – arginase 1

ASL – argininosuccinato liase

ASS – argininosuccinato sintase

ATP – Adenosine triphosphate

BCA – Bicinchoninic acid

CAP1 – Adenylyl cyclase-associated

protein 1

CEUA – Comissão de Ética no Uso de

Animais

CNPEM – Centro Nacional de Pesquisa

em Energia e Materiais

CPS1 – carbamoilfosfato sintase 1

Da – Daltons

DCC – Diclohexilcarbodiimida

DCM – Diclorometano

DIPC – diisopropilcabodiimida

DMEM – Dulbecco's Modified Eagle's

Medium

DMF – Dimetilformamida

DMSO – Dimetilsulfóxido

DTT – Ditiotreitol

E1 – Enzimas ativadoras

E2 – Enzimas conjugadoras

E3 – Enzimas ligases

ESI – Electrospray ionization

FDR – False Discovery Rate

FGF – Fibroblast growth factor

Fmoc – 9-fluorenilmetiloxicarbonil

gC1qR – Complement component 1, q

subcomponent binding protein

HE – Hematoxilina-eosina

HIF-1α – Hypoxia inducible factor-1α

hnRPN D – Heterogenous nuclear

ribonucleoprotein D

HPLC – High Performance Liquid

Chromatography

Hsp – Heat shock protein

ICAM-1 – Intercellular adhesion

molecule-1

IKK – IκB kinase

IL – Interleucina

ILK – Integrin-linked kinase

INF-γ – Interferon-gamma

kDa – KiloDaltons

LFQ – Label-Free Quantification

LCMS-IT-TOF – Liquid Chromatography

Ion Trap Time Of Flight

LNBio – Laboratório Nacional de

Biociências

mA – Miliampere

MDa – MegaDaltons

MEMO1 – Mediator of ErbB2-driven cell

motility 1)

MG132 – Cbz-Leu-leucinal

MHC – Major histocompability complex

MPTs – Modificações pós-traducionais

xi

MS – Mass spectrometry

MW – Molecular weight

NFκB – Nuclear factor kappa B

NHS – N-hidroxisuccinimida

NPI 0052 – Marizomib

ONX 0192 – Oprozomib

OTC – ornitina transcarbamilase

p23 – Prostaglandin E synthase

PA – Proteassome activator

PAM – Peptídeos antimicrobianos

PDCL3 – phosducin-like 3

pI – ponto isoelétrico

PIC – Protease inhibitor cocktail

PKA C-alpha – Protein kinase A catalytic

subunit

ppm – Partes por milhão

PSM – Peptide Sequence Match

PTGR2 – Prostaglandin reductase 2

RACK1 – Receptor for activated C kinase

1

RMN – Ressonância magnética nuclear

SDS – Dodecil sulfato de sódio

SH3 – SRC homology-3 domain

SPFS – Síntese de peptídeos em fase

sólida

TFA – Ácido trifluoracético

TNF-α – Tumor necrosis factor-αlpha

Tris – Tris-(hidroximetil)-aminometano

Ub – Ubiquitina

UniProtKB – UniProt Knowledgebas

UV – Ultravioleta

V – Volts

VCAM-1 – Vascular cell adhesion

molecule-1

VEGF – Vascular endothelial growth

factor

XPO-1 – Exportin-1

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura do proteassoma 20S em eucariotos ............................................................ 4

Figura 2: O sistema de ubiquitinação ........................................................................................ 6

Figura 3: Sítios de ação dos inibidores do proteassoma ........................................................... 9

Figura 4: Processamento geral de uma catelicidina ................................................................ 11

Figura 5: Regulação proteassomal do fator de transcrição NF-κB ......................................... 12

Figura 6: Peptídeos ricos em prolina e arginina afetam a conformação do proteassoma ....... 14

Figura 7: Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS) ............................... 20

Figura 8: Etapas realizadas para a obtenção de extrato proteico de fibroblastos controles e

tratados com o peptídeo PR-11 ................................................................................................. 25

Figura 9: Delineamento experimental da aplicação dos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 em

esponjas de poliéster-poliuretano implantadas em camundongos Swiss .................................. 32

Figura 10: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 ... 35

Figura 11: Recromatografias em sistema HPLC dos peptídeos PR-11, F12 e C8C15

purificados. ............................................................................................................................... 36

Figura 12: Espectros de massas obtidos por LCMS-IT-TOF electrosray das estruturas PR-11,

F12 e C8C15 ............................................................................................................................. 37

Figura 13: Géis 2D SDS-PAGE 12% representativos da extração de proteínas em tampão de

reidratação de células controle e expostas ao PR-11 a 1µM por 10 horas. .............................. 39

Figura 14: Análise da reprodutibilidade intragrupo através da plotagem das LFQ intensities

entre as triplicatas de cada grupo nos tempos de exposição 2, 6 e 10 horas ........................... 41

Figura 15: Distribuição similar de proteínas down- e upregulated entre os períodos de

exposição 2, 6 e 10 horas .......................................................................................................... 42

Figura 16: Proteínas diferencialmente expressas (p < 0,01) são características para cada um

dos tempos de exposição. ........................................................................................................ 43

Figura 17: Classificação funcional das proteínas diferencialmente expressas de fibroblastos

expostos a 1 µM do PR-11 por 2, 6 e 10 horas......................................................................... 44

Figura 18: Proteínas significativamente alteradas relacionadas à regulação da via HIF-1α .. 54

Figura 19: Proteínas diferencialmente expressas envolvidas na regulação negativa da via do

NF-κB ...................................................................................................................................... 56

xiii

Figura 20: SDS-PAGE 12% das frações da cromatografia de afinidade com o peptídeo PR-11

imobilizado .............................................................................................................................. 58

Figura 21: O ciclo da ureia ..................................................................................................... 62

Figura 22: Fotomicrografias de cortes histológicos de esponjas implantadas em animais

controles e tratados com os peptídeos PR-11, F12 e C8C15 .................................................... 64

Figura 23: Avaliação da angiogênese nas esponjas submetidas ao inóculo dos peptídeos PR-

11, F12 e C8C15 ....................................................................................................................... 65

Figura 24: Géis 2D SDS-PAGE 12% representativos da extração de proteínas em tampão de

reidratação de células controle e expostas ao PR-11 a 1µM por 2 horas. ................................ 82

Figura 25: Géis 2D SDS-PAGE 12% representativos da extração de proteínas em tampão de

reidratação de células controle e expostas ao PR-11 a 1µM por 6 horas. ................................ 83

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Diferentes classes de inibidores do proteassoma ...................................................... 8

Tabela 2: Peptídeos sintetizados com suas respectivas sequências ........................................ 21

Tabela 3: Classificação das proteínas diferencialmente expressas (p < 0,01) de acordo com a

função biológica (UniProtKB). ................................................................................................ 45

Tabela 4: Proteínas ligantes ao peptídeo PR-11 recuperadas por cromatografia de afinidade e

identificadas por espectrometria de massas .............................................................................. 59

1

1. Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Proteólise intracelular

A funcionalidade e viabilidade de uma célula são mantidas pelo seu conjunto de

proteínas denominado proteoma (Wilkins et al., 1996). O proteoma é dependente do turnover

proteico, definido como o estado dinâmico de equilíbrio entre os processos de síntese e

degradação. A síntese ocorre pela transcrição do DNA a RNA mensageiro acoplado a

tradução à proteínas, enquanto a degradação envolve diferentes vias de proteólise realizada

por um grupo heterogêno de enzimas denominadas proteases (Turk, 2006; Jung et al., 2009;

Bhattacharyya et al., 2014).

Proteases são moléculas capazes de promover a hidrólise de ligações peptídicas, tendo

ampla distribuição filogenética. De acordo com a posição da ligação a ser clivada, podem ser

classificadas em exopeptidases e endopeptidases. As exopeptidases clivam ligações peptídicas

nas extremidades amino- e carboxi-terminal das proteínas, enquanto as endopeptidases

realizam a clivagem no meio da cadeia polipeptídica. Considerando os diferentes mecanismos

catalíticos de hidrólise envolvendo o sítio ativo, as proteases podem ser divididas em seis

classes: metalo-proteases, serinil-proteases, cisteinil-proteases, aspartil-proteases, glutamil-

proteases e treonil-proteases (Neurath, 1994; Turk, 2006).

As células eucarióticas possuem ao menos três importantes vias proteolíticas, as quais

podem atuar de maneira coordenada e cooperativa. A via lisossomal constitui uma rota

segregada para degradação proteica, devido suas enzimas proteolíticas, principalmente

catepsinas, localizarem-se no interior de uma vesícula lipídica formando o lisossoma

(Lilienbaum, 2013). Um outro grupo de enzimas, de micro e macro calpaínas, refere-se a uma

via intracelular dependente de cálcio envolvida na degradação de proteínas do citoesqueleto,

de transdução de sinal e fatores de transcrição (Mykles, 1998; Dargelos et al., 2008). A

proteólise dependente do proteassoma é formada por uma partícula central (proteassoma 20S)

e várias proteínas reguladoras que podem alterar a atividade e a especificidade do complexo

(Glickman and Ciechanover, 2002; Jung and Grune, 2012).

3

1.2. O complexo proteolítico proteassoma 20S

O proteassoma recebeu diferentes nomes ao longo dos anos, sendo a nomenclatura

atual proposta por Arrigo et al. (1988) para indicar sua natureza proteolítica e particulada e,

desde então, essa denominação tem sido amplamente utilizada. O proteassoma é altamente

conservado, estando presente em todas as células eucarióticas (Voges et al., 1999) e em

diferentes espécies de arquéias (Rivett, 1993) e bactérias (Tamura et al., 1995). Apresenta

localização tanto citoplasmática quanto nuclear, podendo representar até 1% das proteínas

totais de uma célula (Coux et al., 1996). Particularmente no citoplasma, a degradação pelo

sistema proteassomal é a mais importante entre as vias de proteólise. Está envolvido nos mais

distintos processos: degradação de proteínas oxidadas e danificadas, regulação da meia-vida

proteica, regulação do ciclo celular, expressão gênica, stress, reposta imune, carcinogênese e

reparo de DNA (Jung et al., 2009).

O proteassoma 20S, o qual possui uma massa molecular aproximada de 750 kDa, pode

estar ligado ou não em suas terminações por partículas regulatórias, sendo formado por um

total de 28 subunidades. Estudos de microscopia eletrônica e cristalografia de raio-X

revelaram que esta estrutura é cilíndrica, possuindo dimensões aproximadas de 10 nm de

diâmetro e 16 nm de comprimento. O proteassoma 20S é composto por quatro anéis

superpostos com sete subunidades cada um, o que favorece a formação de um poro central por

onde passam as proteínas totalmente desenoveladas para serem degradadas. Os dois anéis

periféricos são compostos de 7 subunidades alfa e os dois centrais por 7 subunidades do tipo

beta, formando um arranjo (figura 1) (Löwe et al., 1995; Baumeister et al., 1998;

Tanaka, 2013).

4

Figura 1: Estrutura do proteassoma 20S em eucariotos. Quatro anéis heptaméricos superpostos mantêm a

estrutura cilíndrica ou em forma de barril do proteassoma 20S. Os anéis periféricos são compostos de 7

subunidades e os dois centrais por 7 subunidades , formando um arranjo . Em destaque, as subunidades

catalíticas 1, 2 e 5 responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase, tripsina e

quimotripsina, respectivamente. Fonte: Jung et al., 2009.

Além da manutenção estrutural em forma de cilindro, as subunidades controlam a

ligação de partículas regulatórias ao proteassoma 20S. No proteassoma 20S de eucariotos, ao

menos três subunidades demonstram importantes atividades catalíticas, sendo as

subunidades 1, 2 e 5 responsáveis pelas atividades proteolíticas semelhantes às de caspase

(peptidil-glutamil hidrolase), tripsina e quimotripsina, clivando ligações peptídicas após o C-

terminal de aminoácidos ácidos, básicos e hidrofóbicos, respectivamente. A cadeia lateral do

resíduo de treonina amino-terminal (Thr-1) das subunidades age como o nucléofilo

responsável pelo ataque catalítico ao carbono carbonil da ligação (Groll et al., 2000; Unno et

al., 2002). As subunidades proteolíticas são capazes de processar tanto a degradação de

proteínas quanto peptídeos, gerando sequências curtas de 3 a 15 aminoácidos. Uma vez

liberados no citosol, amino e carboxipeptidases podem atuar sobre estes oligopeptídeos,

reciclando, assim, aminoácidos para o meio celular (Tanaka, 2013).

5

1.3. Reguladores do proteassoma 20S

A degradação proteolítica pelo proteassoma é altamente eficaz, devendo ser

estritamente regulada para evitar a proteólise descontrolada das proteínas celulares. A

abertura ordenada do poro central do proteassoma 20S permite a entrada seletiva de substratos

específicos. Ao longo da evolução, vários reguladores surgiram a fim de controlar o

reconhecimento e a degradação das proteínas-alvo (Bhattacharyya et al., 2014).

O regulador do proteassoma melhor descrito na literatura é o complexo denominado

19S ou PA700 (Proteasome Activator 700 kDa) (DeMartino et al., 1994). O proteassoma 20S

associado aos complexos 19S formam o proteassoma 26S, sendo encontrado apenas em

eucariotos. O proteassoma 26S apresenta uma massa molecular aproximada de 2.5 MDa, com

um coeficiente de sedimentação entre 26-30S. Esse complexo enzimático é responsável pela

degradação de substratos alvos marcados com a proteína ubiquitina (Ub). A proteólise seletiva

envolve uma série de proteínas que podem estar relacionadas a vários processos regulatórios

(Tanaka, 2013).

A ubiquitina é uma proteína de 8.5 kDa composta de 76 aminoácidos altamente

conservada, utilizada na marcação ATP-dependente de substratos proteicos destinados à

degradação. O processo de ubiquitinação se dá através de sucessivas ligações isopeptídicas

envolvendo três classes de enzimas: enzimas ativadoras (E1), enzimas conjugadoras (E2) e

enzimas ligases (E3) (figura 2). Para que haja o reconhecimento e a degradação da proteína

alvo pelo proteassoma 26S, esta deve ser poliubiquitinada com ao menos quatro moléculas,

processo que envolve o resíduo de lisina 48 da ubiquitina (Glickman and Ciechanover, 2002;

Komander and Rape, 2012; Amm et al., 2014).

6

Figura 2: O sistema de ubiquitinação. Depois de uma ativação ATP-dependente da glicina C-terminal de uma

molécula de ubiquitina (Ub) por E1, a Ub é transferida para E2, e, finalmente, após a ligação do complexo E2-

ubiquitina a E3, a Ub é transferida diretamente para um resíduo de lisina do substrato alvo (A) ou primeiramente

para E3 e desta para o substrato (B). O substrato poliubiquitinado com ao menos quatro moléculas de Ub é

reconhecido e degradado pelo proteassoma 26S. Fonte: adaptado de Hoeller and Dikic, 2009.

Outros importantes reguladores do proteassoma 20S são as partículas denominadas

11S ou PA28, capazes de se ligarem aos anéis , aumentado a taxa de proteólise de proteínas

desenoveladas de maneira independente de ATP e ubiquitina (Rechsteiner et al., 2000; Finley,

2009). Os reguladores PA28 são encontrados como complexos heterogêneos de seis ou sete

subunidades (cadeias e ) ou complexos homogêneos de sete subunidades (cadeia γ). A

partícula PA28αβ associada ao proteassoma 20S está envolvida na apresentação de antígenos

via MHC de classe I, formando o complexo PA28αβ-20S-PA28αβ denominado

imunoproteassoma. Durante a formação do imunoproteassoma, as subunidades β

proteoliticamente ativas são substituídas por outras equivalentes (β1i, β2i e β5i) induzidas por

sinais celulares como o INF-γ, TNF-α e lipopolisacarídeos (Nelson et al., 2000; Rivett et al.,

2001; Lin et al., 2005). A literatura demonstra que o proteassoma 20S pode estar ligado em

uma extremidade pela partícula 19S e na extremidade oposta pela PA28αβ, formando o

proteassoma híbrido (Tanahashi et al., 2000), estrutura envolvida com o processamento de

antígenos e eficiência das taxas de proteólise (Hendil et al., 1998; Bhattacharyya et al., 2014).

Vários tipos de modificações pós-traducionais (MPTs) também regulam o

proteassoma 20S. Em resposta a diferentes estímulos biológicos, as MPTs modulam a

montagem, a meia-vida e a atividade do proteassoma 20S. Dentre outras modificações, a

7

fosforilação, defosforilação, glicosilação, nitrosilação, acetilação, glutationilação e ADP-

ribosilação do proteassoma já foram documentadas (Kimura et al., 2000; Iwafune et al., 2002;

Zong et al., 2008; Kikuchi et al., 2010).

1.4. Inibidores do proteassoma

O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo terapêutico em muitas

doenças, dado o seu envolvimento em várias vias fisiológicas através da clivagem de centenas

de reguladores do ciclo celular, remoção de proteínas danificadas e produção de antígenos

proteicos (Reinstein and Ciechanover, 2006; Inobe and Matouschek, 2014). Nos últimos 20

anos, investigações com inúmeros inibidores proporcionaram a descoberta de importantes

mecanismos celulares envolvendo o proteassoma (Kisselev et al., 2012).

A primeira consequência da inibição do proteassoma é uma diminuição global do nível

de proteólise celular, levando a um rápido acúmulo de proteínas de meia-vida curta, oxidadas

e/ou danificadas. Este acumulado de proteínas desencadeia um aumento na expressão de

proteínas heat shock como um mecanismo de proteção contra as condições tóxicas do

ambiente celular (Kisselev and Goldberg, 2001). Observa-se que, na maior parte das espécies,

apenas a inibição da atividade semelhante à quimotripsina já causa uma grande diminuição

nos níveis de degradação. Por outro lado, a inativação dos sítios das atividades semelhantes à

caspase e tripsina tem pouco efeito sobre a proteólise total. Os inibidores da atividade

quimotripsina-símile são hidrofóbicos, sendo mais permeáveis à membrana celular. De modo

contrário, os inibidores das atividades tripsina- e caspase-símile contêm resíduos carregados

que dificultam a captação pela célula (Heinemeyer et al., 1997; Kisselev et al., 1999).

Os inibidores do proteassoma são classificados como sintéticos ou naturais,

apresentando uma grande diversidade de estruturas químicas (tabela 1). Alguns inibidores

sintéticos são formados pela combinação de um peptídeo com um grupo farmacofórico

reativo como, por exemplo, aldeídos, boronatos, vinilsulfonas, epoxicetonas e β-lactonas

(Pevzner et al., 2013). Os peptídeos aldeídicos foram os primeiros inibidores a serem

identificados e, a partir destes, inúmeros outros têm sido desenvolvidos (Vinitsky et al.,

1992). Estes agentes são análogos de substratos e potentes inibidores da atividade semelhante

à quimotripsina do proteassoma (Rock et al., 1994).

8

Tabela 1: Diferentes classes de inibidores do proteassoma. Fonte: adaptado de Micale et al., 2014.

Classes de inibidores do proteassoma

Peptídeos aldeídicos Flavonóides

Peptídeos vinilsulfonas Triterpenóides

Peptídeos boronatos Derivados de enxofre

Peptídeos epoxicetonas Derivados TMC-95

Peptídeos semicarbazonas Peptídeos naturais

Sirbactinas Pseudopeptídeos

Beta-lactonas Compostos organometálicos

Existem inibidores do proteassoma que não agem diretamente sobre os sítios

catalíticos (figura 3). Como exemplos, a cloroquina e o 5-amino-8-hidroxiquinolona (5AHQ)

atuam sobre o proteassoma pelo seu lado externo, por meio da interação com a interface

formada entre as subunidades α e β (Sprangers et al., 2008; Ruschak et al., 2011). Já o

peptídeo natural PR-39 e a rapamicina ligam-se às subunidades α, dificultando a ligação de

partículas regulatórias às extremidades do proteassoma 20S (Gao et al., 2000; Osmulski and

Gaczynska, 2013). Estas pequenas moléculas com atividade alostérica sobre o proteassoma

podem se tornar uma geração de fármacos para o desenvolvimento de novas terapias contra o

câncer e diversas outras doenças (Kaffy et al., 2013; Gaczynska and Osmulski, 2014).

9

Figura 3: Sítios de ação dos inibidores do proteassoma. O inibidor reversível bortezomib e os inibidores

irreversíveis carfilzomib, ONX 0192 (oprozomib) e NPI 0052 (marizomib) ligam-se diretamente à subunidade

proteolítica β5. A cloroquina atua sobre o proteassoma pelo seu lado externo através da interação com a interface

entre as subunidades α e β. O peptídeo PR-39 liga-se às subunidades α dificultando a interação de partículas

regulatórias. Fonte: Ruschak et al., 2011.

Nos últimos anos, tem sido demonstrado que inibidores do proteassoma são capazes

de induzir a apoptose de algumas células malignas em cultura (Mitsiades et al., 2002; Poulaki

et al., 2007). Tal propriedade não é surpreendente, dado o importante papel do proteassoma

na regulação dos níveis de muitas proteínas necessárias para a manutenção da homeostase

celular. O que é intrigante é o fato da inibição ser preferencialmente tóxica para células

tumorais, por meio de um padrão específico e coordenado de transcrição gênica direcionado a

eventos pró-apoptóticos (Ruschak et al., 2011; Kisselev et al., 2012). Dessa forma, o

desenvolvimento de inibidores do proteassoma emergiu nos últimos 10 anos como uma das

estratégias mais promissoras na terapia antitumoral. Os fármacos bortezomib (Velcade®) e

carfilzomib (Kyprolis®) são inibidores aprovados para o tratamento de mieloma múltiplo

desde 2003 e 2012, respectivamente (Metcalf et al., 2014; Micale et al., 2014). Além destes

compostos, encontram-se em estudos de fases clínicas as seguintes moléculas: ixazomib,

oprozomib, marizomib e delanzomib (Teicher and Tomaszewski, 2015).

Dezenas de estudos em animais têm indicado que os inibidores do proteassoma podem

ser úteis no tratamento de outras neoplasias. Além disso, benefícios destes inibidores na

10

terapêutica experimental de doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, doenças

autoimunes, distrofias musculares, pancreatite aguda, artrites, disfunção renal aguda, dentre

outras doenças, já foram destacadas pela literatura (Meiners et al., 2008; Schmidt and Finley,

2014; Grigoreva et al., 2015).

1.5. Peptídeos antimicrobianos ricos em prolina e arginina: PR-39 e análogos

Peptídeos antimicrobianos (PAM) são moléculas biologicamente ativas produzidas por

uma grande variedade de organismos, sendo um importante componente da resposta

imunológica inata. A principal função destes peptídeos é a defesa do hospedeiro através da

ação citotóxica sobre microrganismos patogênicos invasores e como moduladores imunes em

organismos superiores (Veldhuizen et al., 2014) Os PAM são considerados potenciais

candidatos terapêuticos devido à sua ampla gama de atividades, menor toxicidade e

diminuição no desenvolvimento de resistência pelas células-alvo (Cruz et al., 2014).

Dentre os peptídeos antimicrobianos destaca-se o PR-39. Tal estrutura é um peptídeo

da família das catelicidinas rico nos aminoácidos prolina e arginina (49% e 24%,

respectivamente – RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP), tendo sido

originalmente isolado do intestino delgado (Agerberth et al., 1991) e posteriormente da

medula óssea de suínos (Storici and Zanetti, 1993). O PR-39 e homólogos são secretados

predominantemente por macrófagos e neutrófilos, sendo encontrados em diferentes locais de

processos inflamatórios (Li et al., 1997). Assim como as demais estruturas da família das

catelicidinas, este peptídeo catiônico é sintetizado como um precursor inativo e estocado em

grânulos celulares como um pré-pró-peptídeo. Sob ativação celular e degranulação, o PR-39

maduro é liberado por uma rápida clivagem do peptídeo sinal N-terminal (figura 4)

(Gudmundsson et al., 1995; Kosciuczuk et al., 2012).

11

Figura 4: Processamento geral de uma catelicidina. A pré-pró-proteína consiste de uma região conservada e uma

variável. Na porção conservada, encontra-se o peptídeo sinal e o domínio cathelin. A região variável contêm a

porção ativa da catelicidina. O processamento pode ser realizado por várias serino-proteases, dependendo do tipo

de célula ou tecido. Fonte: adaptado de Vandamme et al., 2012.

O PR-39 maduro é ativo contra um amplo espectro de bactérias, incluindo isolados

clínicos resistentes a múltiplas drogas (Linde et al., 2001; Ramanathan et al., 2002; Fan et al.,

2010). Semelhante a outros peptídeos ricos em prolina, o PR-39 não apenas promove a lise

celular através da perturbação da membrana, mas também a atravessa facilmente e interfere

em vários processos celulares como na síntese de DNA e proteínas (Boman et al., 1993; Chan

and Gallo, 1998; Scocchi et al., 2011). Além das propriedades antimicrobianas, o PR-39 é

capaz de estimular a cicatrização de feridas (Gallo et al., 1994), induzir a migração de

neutrófilos (Huang et al., 1997), inibir a apoptose celular (Ramanathan et al., 2004; Wu et al.,

2004; Ross et al., 2007) e suprimir a invasão e motilidade celular em modelo tumoral in vitro

(Ohtake et al., 1999; Tanaka et al., 2001).

O PR-39 e estruturas análogas destacam-se pela regulação do proteassoma, embora

possam interagir com outras proteínas intracelulares como a NADPH oxidase, p130Cas e PI3-

kinase p85α através de domínios SH3 (SRC homology-3 domain) (Shi et al., 1996; Chan and

Gallo, 1998; Tanaka et al., 2001). Diferentes grupos de pesquisa têm demonstrado os efeitos e

as bases moleculares da inibição do PR-39 sobre o proteassoma 20S, exibindo como

principais atividades a diminuição de danos inflamatórios e a indução da angiogênese. Estes

processos são parcialmente explicados pela inibição da degradação seletiva pelo proteassoma

12

dos fatores IκB e HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α), respectivamente (Gao et al., 2000; Li

et al., 2000; Bao et al., 2001).

O fator de transcrição NF-κB (nuclear factor kappa B) é regulador de uma série de

genes que codificam citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão

celular e receptores de superfície (Pando and Verma, 2000; Hayden and Ghosh, 2011). Em

células não estimuladas, o NF-κB está disperso no citoplasma como um complexo formado

pelas suas subunidades p50 e p65 ligados ao inibidor IκB. Quando as células são estimuladas

(por citocinas ou stress), a enzima IκB quinase é ativada, fosforilando duplamente o fator IκB.

Uma vez fosforilado, o IκB é reconhecido por uma E3 ligase, levando à ubiquitinação. O IκB

é então degradado pela via proteassomal, liberando o NF-κB que transloca-se para o núcleo e

desencadeia a transcrição de diferentes genes (figura 5) (Wu, 2002; Iwai, 2014). A inibição da

degradação proteassomal do IκB pelo PR-39 diminui a expressão de moléculas dependentes

do fator de transcrição NF-κB como as moléculas de adesão celular VCAM-1 (vascular cell

adhesion molecule-1) e ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1). Portanto, o PR-39 reduz

a lesão em estados inflamatórios por diminuir a adesão de leucócitos no endotélio e,

consequentemente, o fluxo destas para os tecidos (Gao et al., 2000; Bao et al., 2001).

Figura 5: Regulação proteassomal do fator de transcrição NF-κB. Após a fosforilação do IκB e sua degradação

pelo proteassoma 26S, o NF-κB, formado pelas subunidades p50 e p65, é liberado para o núcleo e ativa a

expressão gênica (VCAM: vascular cell adhesion molecule; ICAM: intercellular adhesion molecule). Fonte:

adaptado Jung et al., 2009.

13

O PR-39 é capaz de estimular a angiogênese tanto in vitro quanto in vivo. Estudos

demonstraram que a expressão transgênica do PR-39 em cardiomiócitos resultou no aumento

do número de vasos, redução da resistência coronariana e hipertrofia miocárdica (Li et al.,

2000; Muinck et al., 2007; Tirziu et al., 2007). Estes efeitos são explicados pela inibição da

degradação via ubiquitina-proteassoma da proteína HIF-1α, a qual regula a expressão de

muitos genes relacionados à angiogênese incluindo o VEGF (vascular endothelial growth

factor) e o seu receptor VEGFR-1 (Chan and Gallo, 1998; Li et al., 2000). Além disso, o PR-

39 aumenta a expressão de receptores do fator FGF (fibroblast growth factor) como os

receptores FGFR-1 e syndecan-4, sugerindo a atividade angiogênica do peptídeo também

através desta via (Li et al., 1997; Volk et al., 1999).

O PR-39 inibe as três atividades peptidásicas do proteassoma 20S de maneira dose-

dependente, sendo a atividade tripsina-símile a menos afetada (Gaczynska et al., 2003). O

mecanismo de inibição deste peptídeo sobre o proteassoma é alostérico através da interação

reversível com as subunidades α7. Dado que o peptídeo é positivamente carregado (pI – ponto

isoelétrico – teórico = 12.60), ligações iônicas entre os resíduos de arginina do PR-39 e a

porção ácida C-terminal das subunidades α7 (pI teórico = 3.45) são propostas como as

responsáveis pelo mecanismo de ação (Gao et al., 2000; Gaczynska et al., 2003). Estudos

utilizando microscopia de força atômica demonstraram que a ligação do PR-39 ou peptídeos

derivados ao proteassoma 20S altera sua forma cilíndrica (figura 6A). Além disso, o PR-39

também interfere na montagem do proteassoma 26S, sendo esses efeitos observados tanto em

proteassomas de leveduras quanto humanos (figura 6B) (Gaczynska et al., 2003).

Para definir a região do PR-39 envolvida diretamente na interação com o proteassoma

20S, Gaczynska et al. (2003) produziram variantes do peptídeo com progressivas deleções de

aminoácidos a partir de sua extremidade C-terminal. Estes pesquisadores demonstraram que o

peptídeo contendo os 11 primeiros aminoácidos da região N-terminal conservados da

sequência do PR-39 (PR-11 – RRRPRPPYLPR) inibe eficientemente o proteassoma in vitro

de maneira dose-dependente. Estes resultados observados in vitro estão de acordo com os

dados in vivo, uma vez que a indução da angiogênese pelo PR-11 foi similar à observada pelo

PR-39 (Li et al., 2000).

14

Figura 6: Peptídeos ricos em prolina e arginina afetam a conformação do proteassoma. Imagens de microscopia

de força atômica demonstram as alterações estruturais dos proteassomas 20S (A) e 26S (B) na presença dos

peptídeos PR-11 e PR-39, respectivamente. Fonte: adaptado de Gaczynska and Osmulski, 2014.

A partir de estruturas análogas de peptídeos sintéticos e estudos espectroscópicos de

ressonância magnética nuclear (RMN), Anbanandam et al. (2008) identificaram alguns

requisitos estruturais essenciais ao PR-11 para a inibição do proteassoma 20S de humanos. Ao

menos dois dos três resíduos da porção N-terminal carregados positivamente (arginina ou

lisina) e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal são imprescindíveis para a atividade

inibitória. As propriedades requeridas pelo PR-11 para a inibição do proteassoma 20S in vitro

também alteram a expressão de proteínas dependentes da via do NF-κB, mantendo-se, assim,

os efeitos anti-inflamatórios. Além disso, Anbanandam et al. verificaram que alguns análogos

ao PR-11 demonstraram ação inibitória superior sobre o proteassoma 20S, encorajando a

busca por moléculas mais ativas. Dessa forma, modificações estruturais sutis envolvendo

substituições por aminoácidos semelhantes poderiam gerar melhores inibidores e compostos

com potenciais terapêuticos.

15

2. Justificativa

16

2. JUSTIFICATIVA

Dado que o proteassoma está envolvido na regulação de uma série de funções,

qualquer perturbação desse sistema pode comprometer a homeostasia celular. Neste sentido, o

proteassoma tem sido considerado um alvo potencial na terapêutica de diversas doenças. A

descoberta de inibidores auxiliou na elucidação de importantes mecanismos celulares

envolvendo este complexo. Os tratamentos de mieloma múltiplo e linfoma com inibidores do

proteassoma são exemplos de sucesso terapêutico por meio da regulação desta via de

degradação proteica.

A literatura demonstra que análogos à porção N-terminal do peptídeo natural PR-39

(PR-11 - RRRPRPPYLPR) inibem intensamente o proteassoma 20S. Esta classe de peptídeos

apresenta importantes atividades anti-inflamatórias e angiogênicas que têm sido relacionadas

à inibição do proteassoma (Gao et al., 2000; Li et al., 2000; Bao et al., 2001). Entretanto, os

mecanismos moleculares propostos foram baseados principalmente nestas evidências, sem

aprofundar em outras possibilidades.

Apresentamos como proposta para a investigação dos mecanismos envolvidos nas

atividades biológicas mencionadas a avaliação da expressão diferenciada de proteínas em

culturas de células expostas ao peptídeo PR-11. Desta maneira, acreditamos que a

identificação de proteínas diferencialmente expressas e de proteínas com capacidade de

ligação ao PR-11, possa contribuir para um entendimento mais amplo dos mecanismos

farmacológicos e para identificação de possíveis novos alvos de ação deste peptídeo. Além

disso, a avaliação do potencial angiogênico de novas moléculas análogas ao PR-11 se faz de

grande importância a fim de se obter respostas mais efetivas na reparação tecidual.

17

3. Objetivos

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Identificar possíveis novos alvos e mecanismos moleculares do peptídeo PR-11 e

avaliar a atividade angiogênica de moléculas análogas em modelo de esponjas implantadas

em camundongos.

3.2. Objetivos específicos

1 – Sintetizar e purificar o peptídeo modelo PR-11 e as estruturas análogas F12 e C8C15;

2 – Avaliar o proteoma de culturas de fibroblastos controles e expostas ao PR-11;

3 – Identificar possíveis proteínas alvo do PR-11 através da imobilização do peptídeo em

coluna de afinidade e utilizando extratos proteicos de fígados de ratos Wistar como amostras;

4 – Caracterizar o perfil angiogênico do PR-11 e análogos F12 e C8C15 por meio de

implantes subcutâneos de esponjas em Mus musculus.

19

4. Materiais e métodos

20

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da

Universidade Federal de Ouro Preto e catalogado sob os protocolos de números 2013/09 e

2014/19.

4.1. Síntese de peptídeos

As sínteses dos peptídeos propostos (tabela 2) foram realizada sob a forma solúvel,

utilizando-se um protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1965), com

algumas modificações (figura 7). Utilizou-se a resina Rink Amide Resin HL (Merck,

Alemanha) a 0,78 mmol/g, partindo-se de um rendimento máximo de 40 µmoles de peptídeo

por síntese.

Figura 7: Esquema geral da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS). O primeiro aminoácido com o N-

terminal protegido é fixado pelo seu grupo carboxila ao suporte polimérico. Sucessivas etapas de desproteção e

acoplamento de aminoácidos são alternadamente repetidas até que a sequência requerida seja obtida. Por fim, o

peptídeo é clivado da resina e as cadeias laterais desprotegidas. Fonte: adaptado de Amblard et al., 2006.

21

Tabela 2: Peptídeos sintetizados com suas respectivas sequências.

Peptídeo Sequência

1 PR-11 RRRPRPPYLPR

2 F12 RRRPRPPYLPRF

3 C8C15 RRRPRPPCLPRWRPCG

Para a ativação da resina adotou-se o seguinte procedimento: 40 µmoles de resina

foram colocados em um tubo de síntese com DMF (dimetilformamida) suficiente para cobrir

toda a resina, permanecendo sob agitação constante por três horas à 37 ºC. Para a liberação do

seu grupamento Fmoc, a resina foi coberta com 3 mL de 4-metilpiperidina 20% em DMF e

lavada três vezes, por 20 minutos cada, sob agitação contínua à temperatura de 37 ºC. Em

seguida, lavou-se a resina por três vezes alternadamente com metanol e DMF com 2 mL de

solvente por lavagem. Todas as lavagens foram realizadas com auxílio de uma bomba de

vácuo.

Os aminoácidos e demais reagentes auxiliares foram adicionados em concentrações

quatro vezes superiores (160 µmoles) à quantidade de resina para favorecer o acoplamento.

Adicionou-se o primeiro aminoácido ao tubo de síntese em um volume de 2 mL de DMF,

acrescido de 25µL de DIPC (diisopropilcabodiimida) e 23 mg de oxyma pure [ethyl 2-cyano-

2-(hydroxyimino)acetate]. Após 2 horas de agitação à 37ºC, todo o sobrenadante do tubo de

síntese foi retirado, sendo então submetido a uma acetilação preventiva com 50 µL de uma

solução 1:1 de DIPC e anidrido acético adicionados em 1 mL de DMF, permanecendo sob

agitação à 37 ºC por 30 minutos. Ao final desta etapa, a resina foi lavada três vezes

alternadamente com metanol e DMF. O grupamento amino desse primeiro aminoácido

acoplado foi então desprotegido, lavando-se a resina com 3 mL de uma solução de 4-

metilpiperidina 20% em DMF, por três vezes de 10 minutos cada, com agitação contínua à

37°C. Os demais aminoácidos foram processados conforme descrito para o acoplamento do

primeiro aminoácido.

Após o término dos ciclos de acoplamento, o último grupamento Fmoc foi eliminado

com 4-metilpiperidina 20% em DMF e a resina lavada por quatro vezes, durante cinco

minutos, com 3 mL de diclorometano (DCM). As cadeias laterais foram desprotegidas e o

peptídeo dissociado da resina pelo uso de 5 mL de uma solução de clivagem contendo 95% de

ácido trifluoracético (TFA). Para o peptídeo contendo cisteína, a solução de clivagem

continha 2,5% de β-mercaptoetanol a fim de se evitar a formação de pontes dissulfeto. O tubo

de reação permaneceu sob agitação por quatro horas. A solução contendo os peptídeos foi

22

coletada, transferida para tubos de ensaio e os produtos de síntese precipitados com 50 mL de

éter etílico, permanecendo em repouso durante a noite a 4ºC. Posteriormente, os precipitados

foram lavados com éter etílico e centrifugados por três vezes a 1.500 x g por 5 minutos. Na

última etapa, desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o precipitado em 3 mL de água

milli-Q. Após a obtenção dos peptídeos, estes foram liofilizados, separados em sistema HPLC

(High Performance Liquid Chromatography) e caracterizados em espectrômetro de massas

LCMS-IT-TOF (Liquid Chromatography Ion Trap Time Of Flight) operando via

electrospray.

O peptídeo C8C15 foi submetido ao processo de ciclização, o qual permite a formação

de pontes dissulfeto entre as cadeias laterais de cisteínas por oxidação. Dissolveu-se o

peptídeo liofilizado em 50 mL de acetato de amônio 50 mM, pH 7,4, contendo 16% de

DMSO (dimetilsulfóxido). As soluções foram submetidas à agitação por 48 horas na ausência

de luz, liofilizadas e analisadas como os demais peptídeos.

4.1.1. Purificação dos peptídeos por cromatografia de fase reversa em sistema

HPLC

Os peptídeos sintetizados em fase sólida foram submetidos à cromatografia de fase

reversa para a análise de sua pureza. Realizou-se as cromatografias em colunas C18 em

tandem (colunas Shim-pack CLD-ODS(M)® - Shimadzu - 150 x 4,6 mm e LiChroCART® -

Merck - 250 x 10 mm) em sistema HPLC da Shimadzu®. As colunas foram previamente

equilibradas com uma solução de água mili-Q e TFA (ácido trifluoracético) 0,1%. Eluiu-se

alíquotas de 20 μL dos peptídeos em um gradiente de ACN (acetonitrila) e TFA 0,1% de 20 a

60% durante 60 minutos sob um fluxo de 1 mL/minuto. Após a purificação dos picos

principais dos cromatogramas, os peptídeos foram caracterizados e identificados por

espectrometria de massas.

4.1.2. Caracterização dos peptídeos por espectrometria de massas LCMS-IT-TOF

electrospray

Analisou-se os peptídeos purificados por espectrômetro de massas LCMS-IT-TOF,

que opera por ionização do tipo electrospray (Shimadzu®). O equipamento foi calibrado

utilizando trifluoroacetato de sódio. A voltagem capilar foi de 4500 V no modo positivo de

23

ionização, com tempo de acumulação de 10 ms. Aplicou-se as amostras através de injeções

diretas (alíquotas de 5 μL). A ferramenta ExPASy – Compute PI/Mw tool (disponível em

http://web.expasy.org/compute_pi/) foi utilizada para a predição das massas moleculares dos

peptídeos sintetizados.

4.2. Preparo de culturas primárias de fibroblastos de ratos Wistar e exposição ao

PR-11

Os ratos Wistar neonatos utilizados possuíam em média 2 dias de idade e peso de 5g.

Foram necessários 5 animais neonatos para cada cultura realizada. Após a esterilização com

algodão embebido em álcool 70%, decapitou-se os animais com o auxílio de tesoura cirúrgica

e fez-se a retirada dos pulmões. Estes órgãos foram lavados em tampão ADS 1X (NaCl 115

mM; Hepes 20 mM; Na2HPO4 1 mM; D-glicose 5 mM; KCl 5 mM; MgSO4 1,6 mM),

fragmentados e submetidos à digestão enzimática. Incubou-se o material em

aproximadamente 7 mL de pancreatina a 0,8 mg/mL (Sigma-Aldrich) em tampão ADS 1X a

37 ºC, permanecendo sob agitação de 200 x g por 10 minutos e descartando-se o sobrenadante

ao fim do processo. A etapa anterior foi repetida por mais 3 vezes, alterando-se o tempo de

agitação para 20 minutos e recuperando-se o sobrenadante. A cada sobrenadante, adicionou-se

1 mL de soro fetal bovino para interromper a digestão. Posteriormente, todo o material foi

reunido e centrifugado a 1.000 x g por 10 minutos. As células recuperadas foram ressuspensas

em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) suplementado com 15% de soro

fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina, plaqueadas em placas de 24 wells e incubadas

em estufa de CO2 a 5% a 37 ºC.

Para a exposição das culturas ao peptídeo PR-11, utilizou-se células de uma única

passagem e em confluência mínima de 90%. As culturas de fibroblastos foram expostas ao

PR-11 na concentração de 1 µM durante os tempos de 2, 6 e 10 horas. Dividiu-se cada placa

de 24 wells em 2 grupos (tratado e controle), resultando-se em 12 wells e um total aproximado

de 2 x 106 células por grupo.

Após a exposição ao PR-11, os fibroblastos foram desaderidos das placas com o

auxílio do reagente TrypLE Express® (GIBCO) e centrifugados a 2.000 x g por 5 minutos.

Ao fim, adicionou-se às células o tampão PIC 1X (protease inhibitor cocktail – Sigma

Aldrich) e estocou-as em freezer - 80ºC para posterior extração de proteínas. Os experimentos

foram realizados em triplicata biológica.

24

4.3. Extração de proteínas para análise proteômica

4.3.1. Extrato de proteínas totais para eletroforese bidimensional

Para extração de proteínas visando o preparo de géis bidimensionais, ressuspendeu-se

cada alíquota de células tratadas em 250 μL de tampão de reidratação (ureia 7 M, tioureia 2

M, CHAPS 2%, azul de bromofenol 0,002%) adicionando-se PIC 1X (Sigma-Aldrich). Em

seguida, submeteu-se às células ressuspensas a cinco ciclos de sonicação (25 W) de 20 pulsos,

com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson). Centrifugou-se a

suspensão resultante a 2.000 x g a 10 ºC por 15 minutos para remoção de debris celulares. O

sobrenadante foi novamente centrifugado, desta vez a 20.000 x g a 10 ºC por 1 hora. Ao

término do processo, recuperou-se o sobrenadante.

4.3.2. Extrato de proteínas solúveis para digestão em solução

Para a extração das proteínas solúveis, ressuspendeu-se os fibroblastos em 500 μL de

tampão Tris-HCl 25 mM pH 7,5; DTT (ditiotreitol) 1 mM e glicerol 1% acrescido de PIC 1X

(Sigma-Aldrich). A seguir, submeteu-se às amostras a quatro ciclos de sonicação (25 W) de

20 pulsos, com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson).

Centrifugou-se o material resultante a 46.000 x g a 4 ºC por 2 horas e 20 minutos em

centrífuga Sorvall 5C, recuperando-se o sobrenadante. Realizou-se a determinação da

concentração proteica destas alíquotas utilizando-se o método do BCA (Thermo Scientif,

EUA), segundo recomendações do fabricante.

25

Figura 8: Etapas realizadas para a obtenção de extrato proteico de fibroblastos controles e tratados com o

peptídeo PR-11 para o preparo de eletroforeses bidimensionais e digestão em solução de proteínas solúveis.

4.3.3. Eletroforeses uni e bidimensional em géis de poliacrilamida (1D/2D SDS-

PAGE)

A qualidade das extrações de proteínas foram analisadas por meio de eletroforeses

unidimensionais em condições desnaturantes (1D SDS-PAGE) segundo método descrito por

Laemmli (1970), utilizando géis de separação a 12% e de concentração a 5%.

As alíquotas foram diluídas (1:1) em tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M pH 6,8;

SDS 4%; glicerol 20%, azul de bromofenol 0,002%) e submetidas a 100oC por 5 minutos para

desnaturação das proteínas. Utilizou-se como padrão de peso molecular o Molecular Weight

Marker Kit (Sigma Aldrich) e adotou-se a corrente de 20 mA por gel. Após a corrida em

tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 0,19M e SDS 0,1%, o gel foi corado com Coomassie

Brilhant Blue G250 em 40% de etanol e 7% de ácido acético por 2 horas. Realizou-se a

descoloração do background com solução de ácido acético 7% e etanol 10%. Obteve-se as

imagens dos géis utilizando-se o scanner ImageScanner III (GE Healthcare).

A quantidade de proteínas a ser aplicada na eletroforese bidimensional foi

uniformizada por densitometria comparativa entre caneletas do grupo tratado e seu respectivo

controle, através da utilização do software Quantity One versão 4.6.9 (Bio-Rad). A seguir,

26

completou-se o volume das amostras com tampão de reidratação para 250 µL contendo DTT

1% e anfólitos pH 3-10 não-linear 0,8%. As amostras foram acondicionadas em sarcófagos de

porcelana (Strip Holder 13 cm, GE Healthcare) para incorporação e isoeletrofocalização das

proteínas no gel de primeira dimensão (Immobiline DryStrip Gels 13 cm pH 3-10 não-linear,

GE Healthcare). Após a focalização isoelétrica, as proteínas presentes nos géis de primeira

dimensão foram submetidas à redução com DTT 1% em tampão de equilíbrio (ureia 6 M,

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, Glicerol 30%, SDS 2%, Azul de Bromofenol 1%) e alquiladas com

iodoacetamida 4% no mesmo tampão.

A separação de proteínas por massa molecular (2D SDS-PAGE) foi realizada em gel

de poliacrilamida 12%. A eletroforese foi conduzida a 20 mA por gel. Para a coloração,

utilizou-se solução de Coomassie Brilhant Blue G 250 coloidal, que dispensa a etapa de

descoloração por não apresentar background. A análise entre os géis dos grupos controles e

tratados foi obtida através da sobreposição de imagens realizada pelo software Ludesi Redfin.

4.3.4. Digestão em solução de proteínas solúveis

Alíquotas das proteínas solúveis extraídas das culturas de fibroblastos controles e

tratadas com o peptídeo PR-11 foram submetidas à digestão em solução. Após a dosagem de

proteínas pelo método do BCA, completou-se para 45 µL com água mili-Q o volume

correspondente a 20 µg de cada amostra. Adicionou-se 5 µL de NH4HCO3 1M e 5 uL de DTT

45 mM, incubando-se a 56ºC por 15 minutos. Logo após, acrescentou-se 5 µL de

iodoacetamida 100 mM, mantendo ao abrigo da luz e em temperatura ambiente por mais 15

minutos. Em seguida, adicionou-se 125 µL de água mili-Q e 15 uL de NH4HCO3 1 M. Para a

digestão enzimática, utilizou-se 0,8 µg de tripsina (Promega), permanecendo sob incubação a

37ºC por 18 horas. Interrompeu-se a reação pela adição de 10 uL de ácido acético. A solução

contendo os peptídeos trípticos foi dessanilizada em mini-coluna Strata C-18-E (55 µm,

Phenomenex) e seca em speed vacuum. Manteve-se as amostras à 4 ºC até a análise por

espectrometria de massas.

27

4.3.4.1. Cromatografia líquida e análise em espectrômetro de massas: digestão em

solução

Para cada amostra, 3 µg de peptídeos trípticos foram separados no cromatógrafo

UltiMate 3000 (Thermo Scientific) em coluna C18 (Acclaim PepMap RSLC - 75 µm × 15

cm) sob um fluxo de fase móvel de 0,3 µL/minuto em gradiente não linear (4 a 90% de

acetonitrila 80% e ácido fórmico 0,1%) durante 180 minutos. A ionização dos peptídeos

ocorreu através da interface ESI-nanospray e esses foram analisados no espectrômetro de

massas Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Scientific) sob o modo de

aquisição Full MS seguido de MS/MS (top 12). Foram determinados os seguintes parâmetros

operacionais: resolução Full MS: 70.000; resolução MS/MS: 17.500; scan range: 300 a 2000

m/z; loop count: 10; isolation window: 2.0 m/z; íons exibindo carga +2, +3 ou +4; exclusão

dinâmica: 60 segundos; modo positivo de ionização.

Os softwares Xcalibur 3.0.63.3 e MaxQuant 1.5.2.8 (Luber et al., 2010) foram

utilizados para aquisição e análise dos dados, respectivamente. Realizou-se a busca de

proteínas contra o banco de dados contendo o proteoma de Rattus norvegicus (30091

sequências) depositado no UniProtKB (UniProt Knowledgebas) adotando-se os seguintes

parâmetros: perda de dois sítios de clivagem; modificação fixa: carbamidometilação;

modificações variáveis: oxidação de metionina e acetilação do N-terminal; tolerância de

massas: 4,5 ppm; isotope match tolerance: 2 ppm; minimum peak length: 2; False Discovery

Rate (FDR) and Peptide Sequence Match (PSM): 0.01; minimum ratio count: 2. A abundância

relativa das proteínas foi obtida a partir de dados de LFQ (Label-Free Quantification)

intensity utilizando unique + razor peptides.

4.3.4.2. Análise estatística e categorização das proteínas

A análise estatística foi realizada com o software Graph Pad Prism (versão 6.01). Para

cada proteína identificada, a análise da expressão diferencial entre os grupos para cada tempo

de exposição ao peptídeo PR-11 foi realizada com t test e nível de significância (p) < 0,01.

Foram consideradas como proteínas identificadas aquelas que exibiram um p value, obtido

com ao menos duas determinações de LFQ intensity para cada um dos grupos controle e PR-

11 ou em um único grupo para cada tempo de exposição. Proteínas diferencialmente

28

expressas foram categorizadas a partir de banco UniProtKB (disponível em www.uniprot.org)

de acordo com suas funções biológicas.

4.4. Imobilização do peptídeo PR-11 em coluna de afinidade

Para a obtenção da coluna de afinidade com o peptídeo PR-11 imobilizado,

realizaram-se as seguintes etapas de ativação/imobilização do suporte cromatográfico

sepharose 4B (Sigma-Aldrich): ativação com epicloridrina, aminação, succinilação, ativação

com N-hidroxisuccinimida (NHS) e diciclohexilcarbodiimida (DCC), imobilização do braço

extensor ácido ε-aminocaproico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização do PR-11 e

bloqueio dos grupos carboxílicos livres.

Para a etapa de ativação, lavou-se a resina Sepharose 4B em funil de vidro sinterizado

com água destilada e suspendeu-se a mesma em 4 volumes de NaOH 0,4 M contendo 5% de

epicloridrina (Matsumoto et al., 1979). Manteve-se a suspensão em banho-maria a 40 ºC por 2

horas sob agitação leve e procedeu-se lavagem com excesso de água destilada.

A sepharose epóxi-ativada foi aminada utilizando-se 1,5 volumes de solução de

hidróxido de amônio, onde foi suspensa a resina lavada. Manteve-se a suspensão por 90

minutos em banho-maria a 40 ºC sob agitação. Decorrido o período de espera, lavou-se a

resina aminada com água destilada em excesso e NaCl 0,1 M.

Suspendeu-se a resina aminada em 1,5 volumes de NaCl 0,1 M, sendo posteriormente

adicionados 0,08 g de anidrido succínico por g de resina para a succinilação. Manteve-se o pH

6,0 da suspensão através da adição gradual de NaOH 20%, e aguardou-se um tempo de espera

de cinco horas à temperatura ambiente. Realizou-se uma nova lavagem com NaOH 0,1 M e a

resina foi suspensa nesta mesma solução por 30 minutos.

A sepharose succinilada foi lavada com 3 volumes de dioxano e novamente suspensa

nesse reagente, adicionando-se NHS 0,1 M e DCC 0,1 M para ativação. A suspensão foi

mantida por 70 minutos sob agitação leve à temperatura ambiente, sendo então lavada com 8

volumes de dioxano, seguidos de 4 volumes de metanol e 3 volumes de dioxano.

Após a ativação, realizou-se uma lavagem rápida com 1 volume de água destilada e

transferiu-se a resina para um béquer com 3 volumes de solução NaHCO3 0,01 M, NaCl

0,9% pH 7,5 contendo ácido ε-aminocaproico na proporção de 2,6 g de ácido para 100 mL de

solução. Manteve-se a suspensão por 1 hora à temperatura ambiente para inserção do braço

extensor. Repetiu-se então a etapa de ativação com NHS e DCC como descrito anteriormente.

29

A uma solução de NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 7,5, adicionou-se o PR-11 na

proporção de 1 mg de peptídeo/mL para a qual transferiu-se a resina. Após 1 hora à

temperatura ambiente e 12 horas sob refrigeração, o PR-11 estava imobilizado. A etapa final

consistiu-se no bloqueio dos grupos carboxílicos livres com etanolamina 0,1 M pH 9,0 por 1

hora à temperatura ambiente. A seguir, procedeu-se nova lavagem com água destilada.

Manteve-se o produto a 4º C até o momento do uso.

4.4.1. Extração de proteínas e passagem da amostra em coluna de afinidade com

o PR-11 imobilizado

Obteve-se o extrato proteico para passagem em coluna de afinidade com o peptídeo

PR-11 a partir de fígados de ratos Wistar, utilizando-se 100 mg de tecido/1 mL de tampão de

extração (Tris-HCl 50 mM pH 7,5; NaCl 100 mM) adicionados de PIC 1X (Sigma-Aldrich).

Homogeneizou-se a amostra em tubo Potter por 10 minutos em banho de gelo, seguido por

cinco ciclos de sonicação (25 W) de 20 segundos cada com intervalos de 45 segundos entre os

ciclos (Sonifier 250 Branson). Centrifugou-se a suspensão resultante a 2.000 x g a 4 ºC por 15

minutos, recuperando-se o sobrenadante para uma nova centrifugação a 20.000 x g a 4 ºC por

1 hora. Utilizou-se este sobrenadante final para passagem na coluna imobilizada com o PR-

11, determinando-se a concentração proteica pelo método do BCA (Thermo Scientific, EUA),

segundo recomendações do fabricante.

Extrato contendo 10 mg de proteínas foi submetido à cromatografia de afinidade em

coluna de 1 mL com o PR-11 imobilizado. Previamente, equilibrou-se a coluna com tampão

Tris-HCl 50 mM pH 7,5; NaCl 300 mM e MgCl2 5 mM. Realizou-se o acompanhamento

cromatográfico em espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu® duplo feixe no comprimento de

onda de 280 nm.

Inicialmente, injetou-se a amostra de forma contínua na coluna por 10 vezes; em

seguida, lavou-se a coluna excessivamente com o tampão de equilíbrio. A eluição ocorreu

pelo uso de 1 mL de PR-11 a 50 µM solubilizado em tampão de equilíbrio. Após a passagem

contínua de 10 vezes na coluna, a solução eluída foi recuperada, dialisada em acetato de

amônio 0,01 M pH 7,4 e seca em speed vacuum. Ressuspendeu-se a alíquota eluída em

tampão de amostra e procedeu-se a análise em eletroforese unidimensional 12% corada por

prata. As bandas visualizadas foram excisadas para identificação por espectrometria de

massas.

30

4.4.2. Digestão in gel

Para remoção da coloração por prata, descorou-se as bandas excisadas da eletroforese

unidimensional (item 4.4.1) com 500 μL de uma solução de ferricianeto de potássio 0,5% e

tiossulfato de sódio 10%. Retirou-se a solução anterior e adicionou-se 500 μL de etanol 40% e

ácido acético 7% para remoção de SDS. Em seguida, lavou-se as bandas por 2 vezes com 1

mL de água mili-Q. As amostras foram reduzidas pela adição de 500 μL de DTT 50 mM e

incubadas a 65 ºC por 30 minutos. Removeu-se a solução de DTT e acrescentou-se 300 μL de

iodoacetamida 100 mM, permanecendo em incubação à temperatura ambiente por 1 hora.

Após este período, lavou-se e desidratou-se cada banda por 3 vezes de 20 minutos cada com

500 μL de solução NH4HCO3 20mM em ACN 50%.

As bandas foram desidratadas em speed vacuum durante 30 minutos e reidratadas com

20 μL de solução de tripsina 0,033 μg/μL (Promega) em NH4HCO3 20 mM. Após 20 minutos,

retirou-se o excesso de solução de tripsina e cobriu-se as bandas com 80 μL de NH4HCO3 20

mM. Os tubos foram mantidos a 37 ºC por 18 horas para digestão proteica. Recuperou-se o

sobrenadante da reação contendo peptídeos trípticos e adicionou-se 50 μL de TFA 0,1% e

ACN 50% às bandas que permaneceram nos tubos para a extração de peptídeos que ainda se

encontravam no interior do gel. Decorridos 30 minutos da adição de TFA/ACN, retirou-se o

sobrenadante e combinou-se com o primeiro sobrenadante obtido para secagem final em

speed vacuum. As amostras foram mantidas à 4 ºC para posterior análise por espectrometria

de massas.

4.4.2.1. Cromatografia líquida e análise em espectrômetro de massas: digestão in

gel

Após a digestão in gel das bandas excisadas, ressuspendeu-se as amostras em 10µL de

ácido fórmico 0,1%. Para cada amostra, injetou-se automaticamente 6 µL em coluna

cromatográfica C18 (Acclaim PepMap RSLC - 75 µm × 15 cm), sob um fluxo de fase móvel

de 0,3 µL/minuto em gradiente não linear (4 a 90% de ACN 80% e ácido fórmico 0,08%)

durante 45 minutos. Durante a separação no cromatógrafo UltiMate 3000 (Thermo Scientific),

manteve-se a coluna a 40°C.

Realizou-se a análise por espectrometria de massas no aparelho Q-Exactive Hybrid

Quadrupole-Orbitrap (Thermo Scientific) com fonte de ionização ESI-nanospray. Utilizou-se

31

o modo de aquisição Full MS seguido de MS/MS (top 10). Os demais parâmetros

operacionais foram os seguintes: resolução Full MS: 70.000; scan range: 300 a 2000 m/z;

resolução MS/MS: 17.500; loop count: 10; isolation window: 4.0 m/z; exclusão de carga:

indefinida e +1; exclusão dinâmica: 90 segundos.

Os softwares Xcalibur v.3.0.63.3 e Proteome Discoverer v.1.5.2.8 (Thermo Scientific)

foram utilizados para aquisição e análise dos dados, respectivamente. Realizou-se a busca de

proteínas contra o banco de dados revisado de Rattus norvegicus (9584 sequências)

depositado no UniProtKB (UniProt Knowledgebas) com os parâmetros: perda de apenas um

sítio de clivagem; modificação fixa: carbamidometilação; modificações variáveis: oxidação de

metionina e acetilação do N-terminal; tolerância de massas: 10 ppm e 0,1 Da para MS e

MS/MS; respectivamente; peptide mass: 300 a 4000 Da; peptídeos com high confidence e

proteínas identificadas com no mínimo 3 peptídeos únicos; quantificação pela area detector.

Um mínimo de 10% do total de área relativa detectada em cada banda foi requerido para

considerar-se a identificação da proteína.

4.5. Avaliação da angiogênese desencadeado pelos peptídeos PR-11, F12 e C8C15

por meio de implantes subcutâneos de esponjas em camundongos Swiss

Para avaliar o potencial angiogênico do PR-11 e dos análogos F12 e C8C15,

utilizamos o modelo de implantes subcutâneos de esponjas de poliéster-poliuretano em

camundongos Swiss (Andrade et al., 1987; Barcelos et al., 2004).

O delineamento experimental consistiu de 10 grupos (1 controle e 9 tratados) com 10

animais cada, os quais receberam diretamente sob os implantes os peptídeos PR-11, F12 e

C8C15 nas doses de 0,45; 4,5 e 45 ug (figura 9). Os camundongos Swiss utilizados possuíam

entre 6 a 8 semanas de idade e 25 a 35 g de peso. O número de animais do experimento

corresponde ao total empregado em dois períodos independentes.

32

Figura 9: Delineamento experimental da aplicação dos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 em esponjas de poliéster-

poliuretano implantadas em camundongos Swiss.

4.5.1. Implantação das esponjas, administração dos peptídeos e eutanásia dos

animais

Discos de esponjas de poliéster-poliuretano (8 mm de diâmetro x 5 mm de espessura e

4,6 mg de peso) foram cortados e colocados em etanol 70% por 24 horas. No dia da

implantação, as esponjas foram lavadas e fervidas em água destilada por 20 minutos. Após

anestesia intraperitonial dos animais com uma associação de quetamina e xilazina (80 mg/kg e

10 mg/kg, respectivamente), a região dorsal foi tricotomizada e a assepsia com etanol 70%

procedida. Realizou-se uma incisão de cerca de 1 cm de comprimento na pele da região

dorso-lombar. Divulsionou-se o tecido subcutâneo e inseriu-se a esponja a 2 cm acima da

incisão, a qual foi suturada em seguida.

Os camundongos Swiss foram divididos em 10 grupos contendo 10 animais cada de

maneira aleatória. Os tratamentos ocorreram pela injeção direta dos peptídeos PR-11, F12 e

C8C15 dissolvidos em salina nas doses finais de 0,45; 4,5 e 45 ug. Dividiu-se o regimento

posológico em três doses aplicadas no 4º, 7º e 11º dia após a implantação subcutânea. No 14º

dia pós-cirurgia, os animais foram eutanasiados com a administração de dose letal de

quetamina e xilazina (150 mg/kg e 30 mg/kg, respectivamente) e os implantes removidos para

a realização das análises histológicas.

33

4.5.2. Análise histológica

As esponjas coletadas 14 dias pós-implante foram fixadas em solução formol-salina

10% durante 48 horas e posteriormente processadas para inclusão em blocos de parafina.

Após estes procedimentos, os blocos foram cortados a 4 μm e corados com hematoxilina-

eosina (HE) para posterior análise histopatológica. As imagens foram digitalizadas utilizando-

se o microscópio Leica DM5000B com câmera acoplada, através do programa Leica

Application Suite (versão 2.4.0 R1, Leica Microsystems).

4.5.3. Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada com o software Graph Pad Prism

(Versão 6.01). Utilizou-se ANOVA seguido de pós-teste de Tukey para verificar as diferenças

entre o peso das esponjas nos diferentes tratamentos ao término dos 14 dias de experimento (p

< 0,05).

Para a contagem dos vasos sanguíneos nas lâminas histológicas, esses foram definidos

como estruturas com luz e presença de hemácias. Determinou-se o número mínimo de campos

avaliados pela técnica de estudo da variação da instabilidade de valores médios. Em lâminas

representativas do grupo controle, foi analisado o número de vasos em 50 campos no aumento

de 400x. Através de sorteio aleatório, foi determinado o número de vasos em grupos contendo

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos, obtendo-se o número representativo de campos

a serem analisados quando a diferença do desvio padrão entre os grupos foi < 5%. Este

procedimento estatístico determinou que 40 campos deveriam ser avaliados para cada grupo

de tratamento. Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis para analisar as diferenças estatísticas

entre os grupos (p < 0,05).

34

5. Resultados e discussão

35

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Síntese de peptídeos

As sínteses do peptídeo PR-11 e dos análogos F12 e C8C15 foram realizadas em fase

sólida via estratégia Fmoc, conforme descrito em materiais e métodos (item 4.1). O PR-11

corresponde aos 11 primeiros aminoácidos conservados da porção N-terminal do peptídeo

PR-39, o qual mantêm as atividades in vitro e in vivo observadas para a sequência completa

(Li et al., 2000; Gaczynska et al., 2003; Anbanandam et al., 2008). Os análogos F12 e C8C15

são estruturas derivadas do PR-11 patenteadas por nosso grupo de pesquisa por exibirem

atividade angiogênica superior ao peptídeo modelo em membrana corioalantóica de Gallus

domesticus (Depósito de Pedido de Patente: número BR1020130230979).

Após o processo de síntese, todos os peptídeos foram submetidos à cromatografia de

fase reversa em sistema HPLC para a análise de pureza (figura 10).

Figura 10: Perfis cromatográficos em sistema HPLC dos peptídeos sintetizados (fase estacionária: colunas C18

em tandem - Shim-pack CLD-ODS(M)® - Shimadzu - 150 x 4,6 mm e LiChroCART® - Merck - 250 x 10 mm).

As separações cromatográficas foram realizadas em gradiente de ACN de 20 a 60% e TFA 0,1% durante 1 hora

sob um fluxo de 1 mL/min. O pico correspondente ao componente principal de cada peptídeo (indicado pelas

setas vermelhas) foi recolhido para a caracterização em espectrômetro de massas.

36

Conforme observado na figura 10, os peptídeos sintetizados apresentaram diferentes

perfis cromatográficos, uma vez que o rendimento e a pureza de síntese são dependentes do

tamanho e da própria natureza da sequência de aminoácidos. As sínteses de peptídeos com um

número elevado de aminoácidos ou envolvendo sequências que geram agregações favorecem

o enovelamento das moléculas, podendo reduzir o rendimento e a pureza do produto final de

reação (Chan and White, 2000). Após o fracionamento de todos os peptídeos em fase reversa,

observa-se a predominância de um único componente principal (picos indicados pelas setas

vermelhas). A figura 11 apresenta os cromatogramas dos peptídeos submetidos à

recromatografia, indicando que as preparações possuem um alto grau de pureza.

Figura 11: Recromatografias em sistema HPLC dos peptídeos PR-11, F12 e C8C15 purificados (fase

estacionária: colunas C18 em tandem - Shim-pack CLD-ODS(M)® - Shimadzu - 150 x 4,6 mm