New Jacqueline Pereira Vistuba Maytenus ilicifolia (Espinheira-Santa) · 2016. 3. 5. · from Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contained in an active germplasm bank (BAG). The

Jacqueline Pereira Vistuba

Desenvolvimento de métodos analíticos em GC-FID, CE-UV e LC-MS/MS no estudo fitoquímico de triterpenos, flavonóis e taninos voltado para a obtenção de uma nova cultivar de Maytenus ilicifolia

(Espinheira-Santa)

Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química, do Departamento de Química, da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do grau de Doutor em Química na Área de concentração de Química Analítica.

Orientador: Prof. Dr. Gustavo Amadeu Micke Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina de Oliveira Costa

Florianópolis, SC 2014

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Catalogação na fonte pela Biblioteca Universitária da

Universidade Federal de Santa Catarina

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Jacqueline Pereira Vistuba

Desenvolvimento de métodos analíticos em GC-FID, CE-UV e LC-MS/MS no estudo fitoquímico de triterpenos, flavonóis e taninos voltado para a obtenção de uma nova cultivar de Maytenus ilicifolia

(Espinheira-Santa)

Esta tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Química, com ênfase em Química Analítica e aprovada em sua for-ma final pelo Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina

Florianópolis, 24 de outubro de 2014.

___________________________________ Prof. Hugo Alejandro Gallardo Olmedo, Dr.

Coordenador do Programa Banca examinadora:

____________________________ Prof. Gustavo A. Micke, Dr.

Orientador (DQ-UFSC)

____________________________ Profa. Ana Carolina O. Costa, Dra.

Co-orientadora (CAL-UFSC)

____________________________

Prof. Marcone A. L. de Oliveira, Dr. (DQ – UFJF)

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____________________________

Prof. Fernando G. Tonin, Dr. (FZEA – USP)

____________________________ Profa. Cristiane L. Jost, Dra.

(DQ – UFSC)

____________________________ Profa. Tatiane de A. Maranhão, Dra.

(DQ – UFSC)

___________________________ Prof. Eduardo C. da Rocha, Dr.

(DQ – UFSC)

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“O êxito da vida não se mede por aquilo conquistado, mas pelas dificuldades superadas no caminho.”

Abraham Lincoln

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AGRADECIMENTOS A Deus por todas as oprotunidades que Ele me deu e por estar

sempre mostrando o melhor caminho a seguir. Aos meus avós Leordette Pereira, José Pereira (in memoriam) e

Sibilla Vistuba (in memoriam) por serem exemplo e os melhores avós do mundo.

Aos meus familiares, principalmente, a minha mãe, Josimari, ao meu pai, Alcino e a meu irmão José Antônio, por todo o amor e incenti-vo.

Ao meu namorado, Luciano Vitali, pelo companheirismo, amiza-de, amor, compreensão e por toda alegria que sinto quando estou com você.

Aos professores, Dr. Gustavo A. Micke e Dra. Ana Carolina O. Costa, por toda amizade, orientação e contribuições.

Aos professores Dr. Marcone A. L. de Oliveira, Dr. Fernando G. Tonin, Dra. Cristiane L. Jost, Dra. Tatiane de A. Maranhão e Dr. Eduar-do C. da Rocha, por terem aceitado fazer parte da banca examinadora e por todas as sugestões.

Ao professor Dr. Ervim Lenzi, que abriu as portas do seu labora-tório e me deu a oportunidade de realizar a minha iniciação científica.

À Universidade Federal de Santa Catarina, em especial ao Pro-grama de Pós-graduação em Química, ao Conselho Nacional de Desen-volvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a Coordenação de Aper-feiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina (FAPESC) pela oportunidade e apoio financeiro.

Agradeço ao Jadir Carminatti e a Graça Höeller pelos auxílios prestados.

Agradeço a minhas queridas amigas de longa data, Larissa V. Bruno, Danielli Alves, Lídia B. S. Soares, Fabiana Cavalcante, Maiana Muricy que mostram que apesar da distância, existem amizades verda-deiras e para sempre!

Agradeço aos amigos que fiz nestes últimos quatro anos, Mônia Azevedo, Maressa Dolzan, Michelle Barcellos, Daniel Spudeit, Andres-sa Valese e Melina Heller, que ajudaram de forma direta e indireta para a realização deste sonho.

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RESUMO Esta tese tem como proposta principal o desenvolvimento de no-

vos métodos analíticos para a determinação de três subclasses de meta-bólitos secundários (triterpenos, flavonóis e taninos), presentes em 111 indivíduos de Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contidos em um Banco Ativo de Germoplasma (BAG). A determinação dos triterpenos, friedelan-3-ol e friedelin, em extratos de M. ililifolia , foi realizada em um cromatografo gasoso com detector de ionização em chama (GC-FID, do inglês gas chromatography with flame ionization detector) e teve como principal objetivo, aumentar a frequência instrumental empregan-do, pela primeira vez, injeções múltiplas em uma única corrida (MISER, do inglês multiple injections in a single experimental run). Foi possível realizar três injeções de indivíduos diferentes dos extratos de M. ilicifo-lia em uma mesma corrida, utilizando o método com MISER, cujo tem-po de análise foi inferior a dez minutos. Observou-se um aumento na frequência instrumental com um fator de 2,5 vezes quando comparado com o método de injeção simples. Este método empregando MISER apresentou resultados satisfatórios para os parâmetros de validação e a concentração de friedelan-3-ol variou entre 2,8-3,7 mg g-1 e para friede-lin entre 2,3-2,5 mg g-1. A determinação de flavonóis com o auxílio do planejamento de experimentos (DOE, do inglês design of experiment) foi realizada em um eletroforese capilar de zona com detector de ultravioleta-visível (CZE-UV/Vis, do inglês capillary zone electrophoresis with ultraviolet-visible detector). O método mostrou-se eficiente para a separação dos analitos com um tempo de análise inferior a três minutos. O emprego do DOE permitiu otimizar os procedimentos de preparo de amostra e de separação eletroforética. Os parâmetros de validação do método demonstraram bons resultados, e pela primeira vez, a determinação dos flavonóis glicosilados a partir das agliconas, querce-tina e canferol, permitiu avaliar as diferentes concentrações dos flavo-nóis em distintos indivíduos de M. ilicifolia , cujas concentrações varia-ram entre 0,29-0,33 mg g-1 para o canferol e 0,25 – 0,32 mg g-1 para a quercetina. A avaliação qualitativa dos taninos presentes em diferentes indivíduos de M. ilicifolia foi realizada utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em “tandem” (LC-MS/MS, do inglês liquid chromatography tandem mass spectrometry detector), a qual permitiu identificar 13 analitos quando comparados com dados apresentados na literatura. A fim de quantificar

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estes compostos, utilizou-se o método espectrofotométrico da vanilina e a concentração dos taninos nos diferentes indivíduos analisados variou entre 7,7 a 11,6 mg g-1. Os métodos desenvolvidos permitiram avaliar uma grande quantidade de amostras de M. ilicifolia , as quais foram submetidas às mesmas condições ambientais (climáticas e geográficas). Este trabalho permitiu ainda avaliar que os diferentes metabólitos se-cundários presentes em extratos de folhas de M. ilicifolia não apresenta-vam correlação com a morfologia foliar quanto à presença de acúleos (espinhos), facilitando a escolha de espécies para o desenvolvimento de uma nova cultivar. Palavras-chave: friedelan-3-ol, friedelin, MISER, GC-FID, canferol, quercetina, DOE, CZE-UV, taninos, LC-MS/MS, acúleos

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ABSTRACT

This thesis is mainly aimed at the development of new analytical me-thods for the determination of three subclasses of secondary metabolites (triterpenes, flavonols, and tannins) present in 111 different individuals from Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contained in an active germplasm bank (BAG). The determination of triterpenes, friedelan-3-ol and friedelin, in extracts of M. ililifolia were performed on a gas chro-matograph with flame ionization detector (GC-FID) and aimed to in-crease the frequency employing instrumental, for the first time, multiple injections in a single run (MISER). It was possible to perform three different injections of extracts of M. ilicifolia in the same run, using the method with MISER, whose analysis time was less than ten minutes. There was an increase in instrumental frequency by a factor of 2.5 times when compared to the single injection method. MISER employing this method has produced satisfactory results for the validation parameters and the concentration of friedelan-3-ol ranged from 2.8 to 3.7 mg g-1 and friedelin between 2.3-2.5 mg g-1. The determination of flavonols with assistance from design of experiments (DOE) was performed on a capillary zone electrophoresis with UV-Visible detector (CZE-UV/VIS). The method proved to be efficient for the separation of analytes with a analysis time of less than three minutes. The uses of DOE allowed op-timize procedures for sample preparation and electrophoretic separation. The validation parameters of the method showed good results and the determination of flavonol glycosides from the aglycones, quercetin and kaempferol, allowed to study different concentrations of flavonols in different individuals of M. ilicifolia , whose concentrations ranged from 0.29 to 0 33 mg g-1 for kaempferol and 0.25 to 0.32 mg g-1 for quercetin. Qualitative evaluation of tannins present in different individuals from M. ilicifolia was performed using liquid chromatography coupled to mass spectrometry in "tandem" (LC-MS/MS), which allowed the identi-fication of 13 analytes as compared to data shown in literature. In order to quantify these compounds, it was used the spectrophotometric me-thod vanillin and tannin concentration subjects ranged from 7.7 to 11.6 mg g-1. The developed methods allowed evaluating a large number of samples of M. ilicifolia , which were subjected to the same environmen-tal conditions (climate and geography). This study allowed evaluating the secondary metabolites present in extracts of leaves of M. ilicifolia

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showed no correlation with the leaf morphology and the presence of thorns, facilitating the choice of the species for the development of a new cultivar.

Key-words: friedelan-3-ol, friedelin, MISER, GC-FID, kaempferol, quercetin, DOE, CZE-UV, tannin, LC-MS/MS, thorns

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Maytenus ilicifolia ........................................................................... 29

Figura 1.2. Biossíntese dos compostos terpênicos a partir do ácido mevalênico. Os números 1X, 2X e 3X indicam as unidades de IPP. .................................... 32

Figura 1.3. Triterpenos encontrados na planta M. ilicifolia (a) friedelin e (b) friedelan-3-ol. ................................................................................................... 34

Figura 1.4. Rota biossintética para a origem de diferentes classes de compostos fenólicos. .......................................................................................................... 35

Figura 1.5. Estrutura base dos flavonoides e sua numeração. ........................... 37

Figura 1.6. Estrutura dos flavonóis majoritários na M. ilicifolia . (a) canferol e (b) quercetina. ................................................................................................... 38

Figura 1.7. Taninos condensados encontrados na M. ilicifolia . (a) epicatequina-(4β→8)-catequina (procianidina B1); (b) epicatequina-(4β→8)-epicatequina (procianidina B2). .............................................................................................. 39

Figura 2. 1 (a) Cromatograma de uma solução padrão (50 mg L-1) de friedelan-3-ol e friedelin, e (b) cromatograma de um extrato das folhas de M. ilicifolia . Condições experimentais: modo de injeção simples, temperatura do injetor 280°C, modo split (1:90), fluxo de 1,5 mL min-1, temperatura do forno 300°C (isoterma), FID: 320°C. Legenda: 1 - friedelan-3-ol (t1 = 8,76 min), 2 - friedelin (t2 = 9,19 min); D* - Desconhecido (tD = 8,47 min); tr A1- tempo de retenção do primeiro analito; tr An – tempo de retenção do último analito; tr interf 1 - o tempo de retenção do primeiro pico de interferência. .................................................. 62

Figura 2. 2 Etapas que envolvem o processo de injeção múltipla no GC-FID. Círculo branco interno indica o número de métodos programados no software do equipamento para o desenvolvimento do modo MISER. Círculo externo indica as etapas de cada método sequencial desenvolvido................................ 67

Figura 2. 3 Cromatograma do método analítico empregando o modo MISER para a separação dos triterpenos friedelan-3-ol e friedelin no extrato das folhas de M. ilicifolia . Condições experimentais: injeções múltiplas com um tempo de

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espera de 0,6 min entre injeções; temperatura do injector 280°C, modo split (1:90), taxa de fluxo de 1,5 mL min-1, temperatura do forno 300°C (isoterma), FID: 320°C. Legenda: 1 - friedelan-3-ol; 2 - friedelin; D* - Desconhecido. ..... 68

Figura 2. 4 Avaliação do procedimento de extração dos triterpenos da M. ilicfiolia . Variação de tempo de extração dos compostos friedelan-3-ol e friedelin (concentração total, mg g-1) com o auxílio de ultrassom a temperatura 25 ºC e a 60 ºC. .................................................................................................. 70

Figura 2. 5 Cromatograma com a injeção de três segmentos de amostra, repre-sentando três indivíduos diferentes de M. ilicifolia . .......................................... 76

Figura 2. 6 Concentração dos triterpenos friedelan-3-ol (a) e friedelin (b) em relação aos grupos de diferentes indivíduos de M. ilicifolia . ............................. 77

Figura 3. 1 Resposta do planejamento fatorial 22 com ponto central, para escolha do eletrólito de corrida, variando as concentrações de TBS e MeOH. Outras condições de separação: injeção hidrodinâmica, 50 mbar durante 3 s; tensão, 30 kV, polaridade positiva; capilar, 48,5 cm (Ltot), 40 cm (Ldet); temperatura, 25°C. ........................................................................................... 101

Figura 3. 2 Eletroferograma de um extrato da planta M. ilicifolia . Condições de separação: injeção hidrodinâmica, 50 mbar, 3 s; tensão, 30 kV, polaridade positiva; eletrólito de corrida, TBS 20 mmol L-1, MeOH 20%; capilar, 48,5 cm (Ltot) 40 cm (Ldet); pH 9,5; temperatura, 25°C; λ, 390 nm. ........................... 102

Figura 3. 3 Eletroferograma de um extrato da planta M. ilicifolia . Condições de separação: injeção hidrodinâmica, 50 mbar, 3 s (amostra) + 50 mbar, 5 s (água desionizada); tensão, 30 kV, polaridade positiva; eletrólito de corrida, TBS 20 mmol L-1, MeOH 20 %; capilar, 32 cm (Ltot) 23,5 cm (Ldet); pH 9,5; Temperatura, 25 °C; λ, 390 nm. (a) extrato hidroalcoólico hidrolisado; (b) mistura dos padrões canferol e quercetina (50 mg L-1); (c) adição de padrões de canferol e quercetina no extrato hidroalcoólico hidrolisado. ........................... 105

Figura 3. 4 Gráfico de cubo relacionando a resposta da análise do planejamento fatorial para a hidrólise ácida, cujo produto final é concentração total de agliconas (canferol e quercetina) em mg g-1. Parâmetros avaliados: T = 80 a 110 °C; [HCl] = 0,4 a 1,2 mol L-1 e tempo = 20 a 80 minutos................................ 107

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Figura 3. 5 Avaliação univariada para hidrólise ácida, mantendo-se temperatura (110 °C) e concentração de ácido (HCl=1,2 mol L-1) constantes e variando o tempo de aquecimento de 5 a 30 minutos. ...................................................... 108

Figura 3. 6 Estudo do efeito do pH na concentração dos flavonóis (a) canferol e (b) quercetina em função do tempo. ............................................................... 110

Figura 3. 7 Estudo da extração dos flavonóis mantendo-se a temperatura a 25°C e variando MeOH (20 - 100 %, v/v) e o tempo de sonicação de 2 a 30 minutos. ........................................................................................................................ 111

Figura 3. 8 Concentração de Canferol (a) e Quercetina (b) em relação aos grupos de diferentes indivíduos de M. ilicifolia . ............................................. 118

Figura 4. 1 Cromatograma do extrato hidroalcoólico de folhas de M. ilicifolia . Condições cromatográficas: coluna Gemini NX C-18 (250 mm x d.i. 4.6 mm x 5 µm); Fase móvel: (A) água desionizada em ácido fórmico pH 3,6 e (B) ACN:H2O (95:5). (A) 85% e 15% (B) por 10 min; 45% (A) e 55% (B) por 15 min; em 1 min, variou-se o gradiente para 5% (A) e 95% (B) e manteve-se por 4 min. O fluxo da fase móvel foi de 500 mL min-1, tempertura 30ºC. ............... 138

Figura 4. 2 Área relativa dos taninos em relação aos grupos de diferentes indivíduos de M. ilicifolia ............................................................................... 141

Figura 4. 3 Variação das concentrações de taninos nos extratos hidroalcoólicos de folhas de M. ilicifolia em função dos diferentes grupos. ............................ 145

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. 1 Alguns métodos analíticos de separação para a determinação de metabóliso secundários em Maytenus spp. ....................................................... 41

Tabela 2. 1 Parâmetros das curvas de calibração externa das soluções padrão de friedelan-3-ol e friedelin utilizando modo MISER. .......................................... 72

Tabela 2. 2 Resultados dos ensaios de recuperação dos analitos friedelan-3-ol e friedelin do extrato de M. ilicifolia usando o modo MISER. ............................ 73

Tabela 2. 3 Avaliação da adequabilidade do sistema para a determinação de friedelan-3-ol e friedelin utilizando o modo MISER. ....................................... 75

Tabela 2. 4 Teste de Kruskal-Wallis para comparação entre os diferentes grupos de M. ilicifolia em função da concentração de friedelan-3-ol e friedelin. ......... 79

Tabela 2. 5 Comparação entre o método proposto com outros métodos da literatura na determinação de friedelan-3-ol e friedelin. ................................... 81

Tabela 3. 1 Planejamento fatorial 22 como ponto central para o eletrólito de corrida. .............................................................................................................. 96

Tabela 3. 2 Fatorial 23 com ponto central para hidrólise ácida. ........................ 97

Tabela 3. 3 Dados do planejamento fatorial 22 com ponto central para a escolha da composição do BGE em função do número de picos. ................................ 100

Tabela 3. 4 Concentração total de agliconas a partir do planejamento fatorial 23 com ponto central para o procedimento de hidrólise. ..................................... 106

Tabela 3. 5 Valores obtidos para os coeficientes, erro padrão, teste-t e p-valores a partir do planejamento fatorial 23. ................................................................ 107

Tabela 3. 6 Parâmetros das curvas de calibração externa das soluções padrão de canferol e quercetina. ...................................................................................... 113

Tabela 3. 7 Resultados dos ensaios de recuperação dos analitos canferol e quercetina do extrato de M. ilicifolia usando o método proposto. .................. 114

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Tabela 3. 8 Avaliação de parâmetros do método proposto para a determinação de canferol e quercetina. .................................................................................. 116

Tabela 3. 9 Teste de Kruskal-Wallis para comparação entre os diferentes grupos de M. ilicifolia em função da concentração de canferol e quercetina. ............. 120

Tabela 4. 1 Compostos presentes nos extratos hidroalcoólicos de folhas de M. ilicifolia determinados a partir das análises em LC-MS/MS utilizando o modo negativo de ionização. ..................................................................................... 140

Tabela 4. 2 Teste de Kruskal-Wallis para comparação entre os diferentes grupos de M. ilicifolia em função da área dos taninos. ................................................ 143

Tabela 4. 3 Parâmetros da curva de calibração externa da solução padrão de catequina. ......................................................................................................... 144

Tabela 4. 4 Teste de Kruskal-Wallis para comparação entre os diferentes grupos de M. ilicifolia em função da área dos taninos. ................................................ 146

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LISTA DE ABREVIATURAS E SILGAS ANOVA - análise de variância ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária BAG – Banco Ativo de Germoplasma BGE - eletrólito de corrida (do inglês, “background eletrolyte”) CV – coeficiente de variação CZE-UV/Vis – eletroforese capilar de zona com detector de ultravioleta-visível

(do inglês capillary electrophoresis with ultraviolet-visible detector) DOE - planejamento de experimentos (do inglês, design of experiment) EPAGRI - Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa

Catarina GC – cromatografia gasosa (do inglês, gas chromatography) GC-FID - cromatografia gasosa com dectector de ionização em chama (do

inglês, gas chromatography with flame ionization detector) GC-MS - cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (do inglês,

gas chromatography with mass spectrometry detector) HPLC-MS - cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por

espectrometria de massa (do inglês, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry)

HPLC-UV/Vis - cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultra-violeta-visível (do inglês, high performance liquid chromatography with ultraviolet-visible detector)

HTGC-FID – cromatografia gasosa capilar de alta temperatura com detector de ionização em chama (do inglês, high temperature capillary gas chromatography)

ICH – International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

LC-MS/MS - Cromatografia líquida acoplada a espectrômetria de massas em “tandem” (do inglês, liquid chromatography – tandem mass spectrome-try)

LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação MISER - injeção múltipla em uma única corrida (do inglês, multiple injection in

a single experimental run) MRM - monitoramento de reações múltiplas (do inglês, multiple reaction moni-

toring) PI – padrão interno RDC – Resolução da Diretoria Colegiada RMN 13C – ressonância magnética nuclear de carbono RMN 1H – ressonância magnética de hidrogênio rpm – rotações por minuto

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SPE - extração em fase sólida (do inglês, solid phase extraction) TBS - tetraborato de sódio TRIS - tris(hidroximetil)aminometano

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SUMÁRIO

CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA .... ........ 27

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 27

2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................... 29

2.1 MAYTENUS ILICIFOLIA ............................................................................ 29 2.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ....................................................... 30

2.2.1 Terpenos ......................................................................................... 31 2.2.1.1 Triterpenos .............................................................................. 32

2.2.2 Compostos Fenólicos ...................................................................... 34 2.2.2.1 Flavonóis................................................................................. 36 2.2.2.2 Taninos .................................................................................... 38

2.3 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ............................................................. 40

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 43

CAPÍTULO 2. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DOS TRITERPENOS FRIEDELIN E FRIEDELAN- 3-OL EM FOLHAS DE M. ILICIFOLIA POR CROMATOGRAFIA GASOSA USANDO INJEÇÕES MÚLTIPLAS ........................................... 51

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 51

2 OBJETIVOS ................................................................................................ 55

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................... 55 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................. 55

3 EXPERIMENTAL ....................................................................................... 57

3.1 REAGENTES E SOLUÇÕES ................................................................ 57 3.2 INSTRUMENTAÇÃO ........................................................................... 57 3.3 PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DOS TRITERPENOS NAS AMOSTRAS DE M. ILICIFOLIA ................................................................... 57

3.3.1 Preparação do extrato hexânico ..................................................... 58 3.3.2 Avaliação dos volumes de extrato hexânico e clorofórmio para o procedimento de clean up utilizando cartucho de SPE Florisil® ............. 58 3.3.3 Isolamento e caracterização do pico desconhecido ........................ 59

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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................ 61

4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO ................... 61 4.1.1 Modo MISER ................................................................................... 64

4.2 PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DOS TRITERPENOS NAS AMOSTRAS DE M. ILICIFOLIA .................................................................... 69

4.2.1 Preparação do extrato hexânico ..................................................... 69 4.2.2 Avaliação dos volumes de extrato hexânico e clorofórmio para o procedimento de clean up utilizando extração em fase sólida ................. 70

4.3 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO DO MÉTODO MISER .......................................................................................................... 71 4.4 ANÁLISE DAS AMOSTRAS ................................................................ 76 4.5 COMPARAÇÃO DO MÉTODO PROPOSTO COM ALGUNS MÉTODOS DA LITERATURA ................................................................... 80

5 CONCLUSÕES............................................................................................. 83

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 85

CAPÍTULO 3. DETERMINAÇÃO DE FLAVONÓIS EM M. ILICIFOLIA POR ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA UTILIZANDO PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS .................................................. 89

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 89

2 OBJETIVOS ................................................................................................. 93

2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................ 93 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 93

3 EXPERIMENTAL ....................................................................................... 95

3.1 REAGENTES E SOLUÇÕES ................................................................. 95 3.2 INSTRUMENTAÇÃO ............................................................................ 95 3.3 PREPARO DE AMOSTRA .................................................................... 96

3.3.1 Planejamento de experimentos ........................................................ 96 3.3.1.1 Composição do BGE para a separação dos flavonóis glicosilados .......................................................................................... 96 3.3.1.2 Hidrólise ácida dos flavonóis glicosilados .............................. 97

3.3.2 Procedimento de extração ............................................................... 98 3.3.3 Estudo de estabilidade das agliconas .............................................. 98

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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................... 99

4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO .................. 99 4.1.1 Composição do BGE para a separação dos flavonóis glicosilados utilizando planejamento de experimentos ................................................ 99

4.2 PREPARO DAS AMOSTRAS ............................................................. 103 4.2.1 Otimização do procedimento de hidrólise ácida dos flavonóis utilizando planejamento de experimentos .............................................. 103 4.2.2 Estudo da estabilidade do pH nos flavonóis após a hidrólise ácida ............................................................................................................... 109 4.2.3 Extração dos flavonóis ................................................................. 110

4.3 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO DO MÉTODO ................................................................................................................... 112 4.4 ANÁLISE DAS AMOSTRAS .............................................................. 117 4.5 COMPARAÇÃO DO MÉTODO PROPOSTO COM ALGUNS MÉTODOS DA LITERATURA ................................................................ 121

5 CONCLUSÕES .......................................................................................... 123

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 124

CAPÍTULO 4 – DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA AVALIAÇÃO QUALITATIVA DE TANINOS EM FOLHAS DE M. ILICIFOLIA POR LC-MS/MS E QUANTIFICAÇÃO DE TANINOS TOTAIS POR ESPECTROFOTOMETRIA .............................................. 131

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 131

2 OBJETIVOS .............................................................................................. 133

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 133 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 133

3 EXPERIMENTAL ..................................................................................... 135

3.1 REAGENTES E SOLUÇÕES .............................................................. 135 3.2 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISE NO LC-MS/MS...... 135 3.3 INSTRUMENTAÇÃO ......................................................................... 135 3.4 MÉTODO DE SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO POR LC-MS/MS 136 3.5 MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO DA VANILINA ................. 136

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................. 137

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4.1 MÉTODO DE SEPARAÇÃO POR LC-MS/MS PARA ANÁLISE DE TANINOS ................................................................................................... 137 4.2 ANÁLISE DAS AMOSTRAS .............................................................. 141

5 CONCLUSÕES........................................................................................... 149

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 150

CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERPECTIVAS ....................................... 153

ANEXO A ....................................................................................................... 155

ANEXO B ....................................................................................................... 159

ANEXO C ....................................................................................................... 163

ANEXO D ....................................................................................................... 167

ANEXO E ....................................................................................................... 169

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CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 1 INTRODUÇÃO

O Brasil apresenta uma grande diversidade de plantas medicinais em sua flora, sendo uma das fontes mais ricas de material com atividade farmacológica crompovada, a qual é muito utilizada na medicina popu-lar. Além disso, é uma excelente matéria-prima para o mercado farma-cêutico.

Conforme o artigo 2, inciso XVI, da Resolução RDC nº 14 de 31 de março de 2010 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVI-SA), define-se “planta medicinal” como sendo uma “espécie vegetal, cultivada ou não, utilizada com propósitos terapêuticos” (BRASIL, 2010).

O desenvolvimento de pesquisas na área de plantas medicinais tem aumentado nos últimos anos, pois, além de apresentar menor custo de obtenção, são menos severos quando comparados aos medicamentos sintéticos (RIBEIRO; LEITE; DANTAS-BARROS, 2005). O potencial tera-pêutico das plantas medicinais e de alguns de seus constituintes, tais como flavonóides, alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos, taninos e cumarinas já foram comprovados em diversos ensaios pré-clínicos com animais (MAIORANO et al., 2005; RUDNICKI et al., 2007; CRESTANI et al., 2009). Nesse contexto, a Presidência da República assinou o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de 2006, referente à “Política Nacional de Plan-tas Medicinais e Fitoterápicos”, que visa o incentivo à pesquisa e desen-volvimento com relação ao uso de plantas medicinais e fitoterápicos, valorizando a biodiversidade do país (BRASIL, 2006).

Um exemplo de planta medicinal que vem sendo estudada é a Maytenus ilicifolia, popularmente conhecida como espinheira-santa devido à presença de acúleos foliares (espinhos) e sua propriedade me-dicinal gastroprotetora. Esta planta é nativa da região sul do Brasil e atualmente foi eleita pelo Governo do Estado de Santa Catarina median-te a Lei nº 15.674, de 15 de dezembro de 2011, como planta medicinal símbolo do Estado (SANTA CATARINA, 2011).

A crescente exploração de plantas em populações nativas desta espécie, sem critérios de manejo adequados, pode acabar promovendo a perda na variabilidade genética. Desse modo, faz-se necessário a gera-ção de critérios técnico-científicos para o manejo sustentável dessas populações, uma vez que seu cultivo visaria o aproveitamento econômi-

28

co, inclusive como matéria-prima para a indústria de medicamentos fitoterápicos (YARIWAKE et al., 2005; RIBEIRO et al., 2010).

A presença de diversos acúleos nas folhas da M. ilicifolia dificul-ta a colheita e o seu manuseio, o que também promove o extrativismo de forma errônea e destrutiva. Isso não está apenas ameaçando a extinção da espécie, como oportuniza a colheita de espécies inócuas ou tóxicas, tais como, Maytenus aquifolium, Maytenus obtusifolia, Maytenus robus-ta, Maytenus imbricata, Zollernia ilicifolia, entre outras muito seme-lhantes à M. ilicifolia (GONZALEZ et al., 2001; DE ANDRADE et al., 2007; DE SOUZA e SILVA et al., 2007). Desta forma, estudos estão sendo reali-zados a fim de se produzir uma nova cultivar de M. ilicifolia desprovi-das ou com menor quantidade de acúleos, para que seja de fácil manu-seio, estimulando o cultivo como importante fonte de renda e conse-quentemente redução do extrativismo atual.

O projeto de pesquisa intitulado “Seleção de Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) rica em princípios bioativos e atenuada de acúleos foliares para viabilizar o cultivo de variedades de fácil colheita” coordenado pela EPAGRI (Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina) – Estação Experimental de Itajaí, SC, em parceria com o Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina, tem como principal objetivo caracterizar cada indivíduo de M. ilicifolia desprovida dos acúleos foliares, mas plena dos princípios bioativos requeridos da espécie, para lançamento de uma nova cultivar. A EPAGRI apresenta um Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de M. ilicifolia e este projeto vigente ampliará o campo para estudos de melhoramento genético da espécie. Tal obtenção permitirá a expansão do cultivo de espinheira-santa, substituindo a prática do extrativismo; garantia de renda à propriedade rural; salvamento da espécie botânica e padronização da matéria-prima utilizada na indústria farmacêutica com consequente valorização do produto. Contudo, é ne-cessário o monitoramento de compostos marcadores desta nova cultivar a fim de verificar se as propriedades da mesma correspondem a planta nativa.

29

2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Maytenus ilicifolia

A diversidade de plantas presentes no Brasil, em termos de estru-

tura e propriedades físico-químicas e biológicas, permite o estudo de seus princípios ativos no tratamento de algumas doenças bem como o desenvolvimento de novos fármacos. Um caso representativo são as plantas da família Celastraceae, que apresenta uma grande variedade de atividades farmacológicas, tais como, antirreumática, antitumoral, anti-ulcerogênica e anti-inflamatória (PESSUTO et al., 2009; MOSSI et al., 2010).

Segundo Carvalho-Okano (1992), o gênero Maytenus (representante da família Celastraceae) é constituído por 225 espécies e está represen-tado, no Brasil, por 77 espécies e 14 variedades, incluindo representan-tes arbóreos, arbustivos e subarbustivos. A M. ilicifolia está enquadrada na seção Oxyphylla, cuja característica é a presença de acúleos no bordo foliar e muitas vezes pode ser confundida com M. aquifolium, cujo nome comum também é espinheira-santa, a diferença da primeira espé-cie em relação a segunda ocorre pela presença de estrias longitudinais em seus ramos (DE MAGALHÃES, 2002; MARIOT; BARBIERI, 2007). A Figura 1.1 ilustra os ramos da M. ilicifolia , bem como os detalhes do bordo foliar contendo os acúleos.

Figura 1.1 Maytenus ilicifolia

Fonte: Banco Ativo de Germoplasma (EPAGRI, Itajaí-SC).

30

O valor terapêutico da M. ilicifolia é atribuído aos metabólitos secundários, especificamente os triterpenos (friedelin e friedelan-3-ol), os quais são considerados marcadores químicos (VILEGAS; LANÇAS; CERVI, 1994), bem como aos polifenóis (flavonóis e taninos), compostos muito estudados e relacionados à atividade antioxidante da planta (SANTOS-OLIVEIRA; COULAUD-CUNHA; COLAÇO, 2009; NEGRI; POSSAMAI; NAKASHIMA, 2009). Um estudo realizado por Cipriani et al. (2009) concluiu que o ácido poligalacturônico presente na M. ilicifolia também apresentou ação antiulcerogênica. Jorge et al. (2004) também avaliaram a atividade antiulcerogênica e anti-inflamatória a partir dos extratos hexânico e de acetato de etila de M. ilicifolia e obtiveram os triterpenos friedelan-3-ona e friedelan-3β-ol e ainda alguns taninos con-densados e flavonóides como princípios ativos, respectivamente. Já Baggio et al. (2007) observaram que as frações etanólicas ricas em flavo-nóides (catequina e epicatequina) de espinheira-santa proporcionaram bons resultados na redução de úlcera gástrica. 2.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS

O metabolismo de uma planta compreende um conjunto de rea-

ções químicas que ocorrem no interior das células, podendo ser classifi-cado como primário, o qual ocorre em todas as plantas, cujas reações envolvem aminoácidos, lipídeos e carboidratos; e o metabolismo secun-dário, com reações químicas diferenciadas, características e intrínsecas de acordo com a espécie (DOS SANTOS, 2010).

Os metabólitos secundários tem uma importante função biológica, atuam no mecanismo de polinização e defesa contra predadores e doenças agindo como antibióticos, antifúngicos e antivi-rais, a fim de proteger as plantas de agentes patogênicos e na defesa contra o estresse abiótico, isto é, à exposição a radiação ultravioleta. Além de defesa química e física, algumas plantas usam as características mecânicas e morfológicas para a proteção, tais como os acúleos e pêlos urticantes (CUNICO et al., 2002; WINK, 2006; MAZID; KHAN; MOHAMMAD, 2011). Muitos desses compostos podem apresentar pro-priedades terapêuticas sendo denominados de princípios ativos, os quais são empregados em produtos farmacológicos. Além disso, vários metabólitos secundários, tais como, alcalóides, antocianinas, flavonoides, quinonas, lignanas, esteróides e terpenóides têm sido

31

empregado na indústria de corantes, aromas e fragâncias. (VERPOORTE; CONTIN; MEMELINK, 2002; FUMAGALI et al., 2008).

2.2.1 Terpenos

Os principais grupos de metabólitos secundários, das plantas em

geral, são os compostos terpênicos, fenólicos e os compostos contendo enxofre e nitrogênio, sendo que o primeiro compõe a maior classe dos metabólitos secundários.

Os compostos terpênicos comumente se encontram na forma de hidrocarbonetos cíclicos, podendo possuir ou não insaturações. A no-menclatura dos terpenos depende do número de carbonos presentes em sua estrutura, os quais podem ser divididos nas seguintes subclasses: monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e politerpenos ((C5)n). A biossíntese dos compostos terpênicos pode ser observada na Figura 1.2, onde a partir da condensação aldólica de acetil-coenzima A com acetoacetil-CoA obtém-se o intermediário 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), que sofre uma hidrólise for-mando o ácido mevalônico. Este último é convertido em isopentenil pirofosfato (IPP), que é a base da cadeia carbônica dos terpenos e esteróides. Esta molécula de IPP e seu isômero, o dimetilalil-pirofosfato (DMAPP) formam o composto trans geranil-pirofosfato (GPP), o qual origina os monoterpenos. Deste modo, é possível observar que a partir de duas unidades de IPP se obtém o composto farnesil-pirofosfato (FPP), intermediário dos sesquiterpenos, esqualenos e triterpenos. E ainda, com três unidades de IPP é possível obter o intermediário geranil-geranil-pirofosfato (GGPP) precursor dos di, tetra e politerpenos (MC-GARVEY e CROTEAU, 1995; DE AGUIAR, 2003).

32

Figura 1.2. Biossíntese dos compostos terpênicos a partir do ácido mevalênico. Os números 1X, 2X e 3X indicam as unidades de IPP.

IPP DMAPP

CH3

CH3

OPP

Hemiterpenos

CH3

CH3

CH3

OPP

GPP

Monoterpenos

CH3

CH3

OPP

CH3CH3

FPP

2X

Sesquiterpenos

Esqualeno

Triterpenos

CH3

CH3 CH3

CH3

CH3

OPP

Diterpenos

2XFitoenos

Tetraterpenos

PoliterpenosPoliprenóis

1X

2X

3X

GGPP

CH2

CH3

OPP

CH3 S

O

CoA

acetil-coenzima A

Ac-CoA

Acetoacetil-CoAS-CoA

O

HO2CH OH

HMG-CoA

HO2CH OH

OHÁcido Mevalônico

Ac-CoA

CH2

CH3

OPP

IPP

CondensaçãoAldólica

H2O

Fonte: adaptado de MCGARVEY; CROTEAU, 1995.

2.2.1.1 Triterpenos

Os triterpenos têm despertado um grande interesse em razão da

descoberta do seu potencial farmacológico, com inúmeras atividades terapêuticas, tais como: anticâncer, anti-inflamatório, antiviral, antibac-teriano, antifúngico, antioxidante e antiulcerogênico (JORGE et al., 2004; VELLOSA et al., 2006).

Estes compostos são sintetizados pelas plantas por meio dos precursores acíclicos de C30 ou do esqualeno e são formados por enzi-

33

mas denominadas de terpenos sintases. Estes compostos são abundantes no reino vegetal e podem ser aplicados comercialmente em polímeros, fibras, colas e ceras (YIN, 2012).

Muitos triterpenos são tetracíclicos ou pentacíclicos, porém com-postos acicíclicos, mono, bi, tri e hexacíclicos já foram isolados. As características estruturais dos triterpenos estão relacionadas aos grupos os quais os triterpenos pertencem. Nas diferentes espécies de Maytenus spp., encontram-se os friedelanos, oleananos, lupanos, taraxeranos e ursanos, muitos apresentam atividades farmacológicas, como antitumo-ral, antioxidante, espermicida e antiulcerogênica (XU; FAZIO; MATSU-DA, 2004; NUÑES et al., 2005). Destaque para a espécie M. ilicifolia , que segundo Vilegas, Lanças e Cervi (1994), os compostos friedelin e friede-lan-3-ol, além de apresentarem atividade antiulcerogênica, são denomi-nados os marcadores quimiotaxonômicos desta planta. Além destes triterpenos, Dos Santos et al. (2010) também encontraram os triterpenos quinonemetídeos maytenina e pristimerina. A Figura 1.3 apresenta a estrutura química dos principais triterpenos encontrados na M. ilicifolia .

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Figura 1.3. Triterpenos encontrados na planta M. ilicifolia (a) friedelin e (b) friedelan-3-ol.

HO

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3H3C

(b)

CH3

OCH3

CH3

CH3

CH3

CH3H3C

(a)

CH3

CH3

Fonte: Nossack et al., 2000.

2.2.2 Compostos Fenólicos

Outros compostos presentes em grande quantidade nas plantas

medicinais são os polifenóis, que agem como antioxidantes atuando na defesa contra os radicais livres em doenças como as cardiovasculares, o câncer e outras doenças degenerativas. Do ponto de vista fisiológico para a planta, os compostos fenólicos atuam no crescimento, reprodução das plantas e, além disso, contribuem para as características sensoriais e coloração de frutas e vegetais. Os compostos fenólicos podem ser classificados como ácidos fenólicos, estilbenos, lignanas e flavonoides (BEHLING et al, 2004; BIESAGA, 2011).

35

A Figura 1.4 ilustra a rota biossintética para a obtenção de algu-mas classes de compostos fenólicos, os quais são formados por algumas reações enzimáticas. Figura 1.4. Rota biossintética para a origem de diferentes classes de compostos fenólicos.

Fenilalanina 4-cumaroil-CoA Malonil-CoA

O1 H

OHOH

OH O

Narigenina chalcona

OOH

OH O

OH

OH

Narigenina

OOH

OH O

OH

OH

R

3-OH-flavanonas

(dihidroflavonóis)OOH

OH O

OH

OH

R

Flavonóis

OOH

OH O

OH

OH

R

R1

Flavan-3,4-dióis

OOH

OH

OH

OH

R

OOH

OH

OH

OH

R

OOH

OH O

OH

OH

R

Proantocianidinas

Taninos Condensados

OOH

O-Glc

O-Glc-O-Ra-pCumaroil

OH

OCH3

+

Antocianinas

2

3

4

5

6

7

Ácido chiquímico Ácido cinâmico Ácido malônico

NH2HOOCOH

OH

OH

COOH

COOH

COSCoA

OH

+COSCoA

COOHHH

3

OH OH

O O

Acetil-Coenzima A

* Os números sob as setas representam reações enzimáticas: 1-CHS (chalcona sintase); 2 – CHI (chalcona isomerase); 3 – F3H (flavanona-3-hidroxilase; 4 – F3’H (flavonoide-3-hidroxilase); 5 – FLS (flavonol sintase); 6 – DFR (dihidroflavonol redutase) e 7 – LDOX – leucoantocianidina dioxigense). Fonte: adaptado de BURBULIS; WINKEL-SHIRLEY, 1999.

De maneira geral, a biossíntese de compostos fenólicos, tais co-mo os flavonóis, flavanonas, taninos e antocianinas envolve a condensa-ção de uma unidade de 4-cumaroil-CoA e de três unidades de malonil–CoA. O produto desta reação é a narigenina chalcona, que sofre uma

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ciclização originando a narigenina. Com isso, a partir de reações de hidroxilação ou de seus derivados funcionais (ésteres, éteres, glicosí-deos, entre outros) é possível obter diferentes classes de compostos fenólicos (JOHANN, 2003; ZUANAZZI e MONTANHA, 2010). Uma importante classe dos compostos fenólicos é a classe dos flavonoides, os quais podem ser utilizados como marcadores quimiota-xonômicos, isto é, estão relacionados à especificidade em algumas espé-cies; e ainda, podem ser utilizados na determinação do parentesco de híbridos e em determinação de novas cultivares (MARKHAM, 1989). Dentro desta classe destacam-se duas subclasses: a dos flavonóis e tani-nos. 2.2.2.1 Flavonóis

Os flavonóis são uma subclasse dos flavonoides, cuja estrutura molecular é derivada dos anéis benzo-γ-pirona, na qual consiste na liga-ção entre os anéis fenólicos e pirona, conforme ilustra a Figura 1.5. Os flavonóis apresentam grupos hidroxila nas posições 3, 5, 7, 3’, 4’ e 5’. Dentre as substituições dos grupos hidroxilas podemos encontrar grupos metila, acetila, sulfatos ou grupos glicosídios, os quais são ligados por meio de uma ligação hemiacetal originada através da ligação O-glicosídeo (C-3), facilmente quebrada por uma hidrólise ácida ou C-glicosídeo (C-7). Várias são as moléculas de açúcar ligadas aos flavo-nóis, por exemplo, L-ramnose, D-glicose, glucoramnose, galactose, ou arabinose. Os flavonóis são denominados de flavonóis glicosilados quando esses contêm uma ou mais moléculas de açúcar (ou glicósidos, em caso de uma porção de glicose), ou ainda podem ser denominados de agliconas quando nenhum grupo açúcar está presente (HAVSTEEN, 2002; DANTULURI et al., 2005; RIJKE et al., 2006).

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Figura 1.5. Estrutura base dos flavonoides e sua numeração.

Fonte: adaptado de ZUANAZZI; MONTANHA, 2010.

Os flavonóis majoritários encontrados na espécie de M. ilicifolia

são os derivados mono-, di-, tri- e tetraglicosilados de quercetina, canfe-rol e miricetina (TIBERTI et al, 2007; DE SOUZA et al. 2008a). Estudos mostram uma correlação entre as atividades anti-inflamatória e antiulce-rogênica com a presença de flavonoides nos extratos das folhas de M. ilicifolia (JORGE et al., 2004). Assim como no estudo realizado por Leite et al (2010), que observaram a ação gastroprotetora do triglicosídio fla-vônico mauritianina e de um derivado tetraglicosilado de canferol. A Figura 1.6 ilustra a estrutura de dois flavonóis majoritários presentes na M. ilicifolia .

38

Figura 1.6. Estrutura dos flavonóis majoritários na M. ilicifolia . (a) canferol e (b) quercetina.

(a)

(b)

O

O

HO

OH

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

OH

Fonte: DE SOUZA et al., 2008b.

2.2.2.2 Taninos

Os taninos são moléculas de elevada massa molar e também per-tencem ao grupo dos flavonoides, e, assim como os flavonóis, estes possuem propriedades antioxidantes. Além disso, os taninos têm propriedades cicatrizantes, devido à sua capacidade para promover a precipitação de proteínas, o que dá origem a uma camada protetora que pode melhorar o processo regenerativo (DE SOUZA et al., 2008b).

Os taninos podem ser classificados como taninos condensados, os quais podem ser formados por cadeias oligoméricas ou poliméricas de unidades de flavan-3-ol, os quais são ligados entre os carbonos C4-C6 ou C4-C8 (proantocianidinas). Estes taninos são mais encontrados nas plantas na forma de procianidinas, que são derivados da catequina e epicatequina e pode conter ligações de ésteres de ácido gálico. Estes compostos apresentam atividade antimicrobiana, antialérgica e antioxi-dante. Além disso, devido à presença de inúmeros grupos hidroxila, esses compostos têm a capacidade de formarem complexos com íons

39

metálicos, proteínas e polissacarídeos (ROMANI et al., 2006; AL-JABER; AWAAD; MOSES, 2011). Ou ainda, podem ser classificados como tani-nos hidrolisáveis, que são formados por carboidratos, geralmente D-glicose, cuja hidroxila pode estar esterificada com os grupos fenólicos do ácido elágico (elagitaninos) ou ácido gálico (galotaninos) (BOSSU et al., 2006).

O trabalho realizado por Pessuto et al (2009) apresentou um estu-do sobre o potencial antioxidante da M. ilicifolia avaliando sua fração de acetato de etila e os resultados demonstraram que a sua capacidade anti-oxidante se deve também a presença dos taninos condensados epicate-quina-(4β→8)-catequina (procianidina B1) e epicatequina-(4β→8)-epicatequina (procianidina B2). A estrutura destes taninos condensados pode ser observada na Figura 1.7. Figura 1.7. Taninos condensados encontrados na M. ilicifolia . (a) epicatequina-(4β→8)-catequina (procianidina B1); (b) epicatequina-(4β→8)-epicatequina (procianidina B2).

O

O

HO

HO

OH

OH

HOOH

OH

OH

OH

OH

(a)

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

HO

(b)

Fonte: Pessuto et al., (2009).

40

2.3 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAÇÃO DE META-BÓLITOS SECUNDÁRIOS

A disponibilidade de métodos analíticos validados é de grande importância para a garantia e o controle da qualidade de fitoterápicos, e é exigido pelas autoridades sanitárias brasileiras para fins de registro. (BRASIL, 2004; NETTO et al., 2006).

Diversos métodos são descritos na literatura para análise de me-tabólitos secundários em diferentes plantas. Muitos dos métodos são complexos, laboriosos, e exigem uma demanda de recursos elevada. Mesmo assim, estes métodos já estabelecidos devem ser tomados como ponto de partida para a análise dos marcadores numa determinada plan-ta. Contudo, ainda existe a necessidade de desenvolvimento de novos métodos para fins de monitoramento desses marcadores e avaliação da qualidade de plantas, que combinem a obtenção de resultados satisfató-rios com procedimentos simplificados e de custo operacional reduzido. Dentre os métodos analíticos encontrados na literatura para a determina-ção destes marcadores, podemos citar alguns cromatográficos, eletrofo-réticos e espectrofotométricos, listados na Tabela 1. É importante ressal-tar que todos serão abordados separadamente nos capítulos posteriores.

Tabela 1. 1 Alguns métodos analíticos de separação para a determinação de metabóliso secundários em Maytenus spp.

PLANTA ANALITOS PREPARO DE AMOSTRA

TÉCNICA ANALÍTICA

(tempo de análise)

OBSERVAÇÕES REFERÊNCIA

M. aquifolium Friedelin

e Friedelan-3-ol

Extrato hexânico no ultrassom por 1 min); SPE (MgO-SiOH); Eluição com CHCl3.

HTGC-FID* (t=5 min)

Preparo de amostra simples; consumo excessivo de rea-gentes; análise instrumental

rápida.

NOSSACK et al., 2000.

M. ilicifolia Friedelin

e Friedelan-3-ol

Extração por fluido supercrítico com CO2

(t = 90 min).

GC-MS (t= 90 min)

Preparo de amostra sem degradação evidente, não

tóxico; tempo de preparo e análise instrumental longos.

MOSSI et al., 2010

M. ilicifolia Derivados de

canferol e querce-tina

Extrato hidrometanó-lico; maceração por

30 min a 50ºC; extra-to filtrado.

CE-UV/Vis* (t = 30 min)

Tempos de preparo de amos-tra e análise instrumental

longos. DIAGONE et al.,

2012.

M. ilicifolia Catequina e epi-

catequina

Extrato aquoso 10% (m/v); (t=15 min

infusão).

HPLC-UV/Vis*

(t=30 min)

Preparo de amostra simples; detectabilidade satisfatória; tempo de análise instrumen-

tal longo; baixa resolução.

SOARES et al., 2004.

*HTGC-FID (do inglês, high temperature capillary gas chromatography); CE-UV/Vis (do ingles, capillary electrophoresis with ultraviolet-visible detec-tor); HPLC-UV/Vis (do inglês, high performance liquid chromatography with ultraviolet-visible detector);

Com isso, esta tese tem como proposta principal o desenvolvi-mento de novos métodos analíticos para a determinação de três subclas-ses de metabólitos secundários (triterpenos, flavonóis e taninos), presen-tes em 111 indivíduos diferentes de M. ilicifolia contidos no BAG da EPAGRI de Iatajaí, SC. Estes metabólitos são considerados marcadores químicos importantes para o desenvolvimento de uma nova cultivar. Estas três subclasses são relevantes para a própria espécie, M. ilicifolia , uma vez que estão relacionados à sua autenticidade química, proteção contra a radiação ultravioleta e resistência a patógenos, além de apresen-tarem benefícios à saúde. Ainda, verificar se há correlação destes meta-bólitos com a presença de acúleos foliares.

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REFERÊNCIAS

AL-JABER, N.A.; AWAAD, A. S.; MOSES, J. E. Review on some antioxidant plants growing in Arab world. J. Saudi Chem. Soc., v. 15, p. 293–307, 2011. BAGGIO, C. H. et al. Muscarinic-dependent inhibition of gastric empty-ing and intestinal motility by fractions of Maytenus ilicifolia Mart ex. Reissek. J. Ethnopharm., v. 123, p. 385–391, 2009. BEHLING, E. B. et al. Flavonóide quercetina: aspectos gerais e ações biológicas. Alim. Nutr., Araraquara , v. 15, n. 3, p. 285-292, 2004. BIESAGA, M. Influence of extraction methods on stability of flavonoids. J. Chromatog. A, v. 1218, p. 2505–2512, 2011. BOSSU, C. M.; et al. Flow injection system for hydrolysable tannin determination. Microchem. J., v. 84, p. 88–92, 2006. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 14, de 31 de março de 2010/ Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: ANVISA, 2010. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitá-ria. Resolução RDC n. 48, Distrito Federal, 2004. BRASIL. Presidência da República. Decreto nº. 5.813 de 22 de junho de 2006. Aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápi-cos e dá outras providências. DOU. Poder Executivo, Brasília, DF, 23 jun. 2006. BURBULIS, I. E.; WINKEL-SHIRLEY, B. Interactions among en-zymes of the Arabidopsis flavonoid biosynthetic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., v. 96, n. 22, p. 12929–12934, 1999.

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CAPÍTULO 2. Desenvolvimento de método para determinação dos triterpenos friedelin e friedelan-3-ol em folhas de M. ilicifolia por cromatografia gasosa usando injeções múltiplas

1 INTRODUÇÃO

A cromatografia gasosa (GC, do inglês gas chromatography) tem

sido utilizada para a análise qualitativa e quantitativa de compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis e tem demonstrado vantagens em termos de sensibilidade e resolução em análise de misturas complexas, o que demonstra a seletividade da técnica (SANTOS; GALCERAN, 2001; LEHOTAY; HAJŠLOVÁ, 2002; BANICERU; MANDA; POPESCU, 2011). Algumas características notáveis desta técnica são uma boa separação dos analitos em misturas complexas, alta precisão, simplicidade instrumental e disponibilidade de vários sistemas de detecção, seja universal ou específico, contribuindo para o uso generalizado da técnica nas áreas acadêmica e industrial (LEHOTAY; HAJŠLOVÁ, 2002).

A procura por métodos que proporcionam um elevado rendimento instrumental, isto é, que aumentem a taxa de geração de dados em um curto período de tempo, é uma força motriz importante no desenvolvimento de métodos analíticos. Isto resulta em menores custos por análise, redução do tempo gasto pelo analista, além de operação mínima do equipamento (BEREZKIN; LAPIN; MALYUKOVA, 2001; MAŠTOVSKÁ; LEHOTAY, 2003; DONATO et al., 2007). Para laboratórios com um elevado número de análises diárias, a seleção dos métodos de análise deve levar em conta dois fatores essenciais: o método de separação e o preparo das amostras, com o objetivo de separar os componentes mais críticos e aplicar procedimentos eficientes para o preparo da amostra a ser analisada (MATISOVÁ; DÖMÖTÖROVÁ, 2003; TRANCHIDA et al., 2007).

Nos últimos anos, tem sido observado um avanço na instrumentação de cromatógrafos gasosos comerciais, com injetores automáticos de alta velocidade, controladores eletrônicos de pressão de gás, sistemas rápidos para aquecimento e arrefecimento do forno, sistemas de detecção mais rápidos e reprodutíveis e softwares dedicados para controlar estes dispositivos (BICCHI et al., 2005). Diante destes melhoramentos instrumentais, numerosos trabalhos foram publicados

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mostrando diferentes estratégias para reduzir o tempo das análises. Estes incluem o uso de rápidos programas de temperatura em colunas especiais (XU et al., 2008), os sistemas de injeção com válvulas especiais de injeção combinadas com um programa de temperatura rápido (REID; MCBRADY; SYNOVEC, 2007), injetor de canais de fluxo contínuo de multiplexação, no qual as amostras são injetadas continuamente de acordo com uma pseudo-sequência binária aleatória controlada por um computador (TRAPP, 2007), colunas cromatográficas com comprimento reduzido (KORYTÁR et al., 2002; MONDELLO et al., 2004) e dispositivos para o uso de várias colunas (HINZ, 2006; . SASAMOTO; OCHIAI; KAN-DA, 2007).

As estratégias para aumentar o rendimento instrumental também foram estudadas em relação a outras técnicas de separação, tais como electroforese capilar, em que métodos utilizando múltiplas injeções foram explorados (LODÉNA et al., 2008; VITALI et al., 2011). Neste modo de injeção é possível analisar duas ou mais amostras em uma mesma corrida, causando uma redução significativa no tempo de análise, quando comparado com os métodos convencionais, sem necessidade de qualquer modificação do instrumento. Recentemente, um estudo foi relatado por Welch et al., (2010) empregando a injeção múltipla em uma única corrida (MISER, do inglês multiple injection in a single experi-mental run) para o aumento da frequência analítica, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por espectrometria de massa (HPLC–MS, do inglês high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry). Contudo, em estudos que utilizam este tipo de injeção, geralmente as amostras analisadas não são complexas, uma vez que esta estratégia é geralmente aplicada para a análise de fármacos, os quais envolve, teoricamente, um menor número de analitos, o que facilita a aplicação deste modo de injeção (LODÉNA et al., 2008; VITALI et al., 2011). O modo de injeção múltipla também pode ser utilizado como uma estratégia para aumentar o rendimento instrumental nas análises por GC. Recentemente, Cho (2012) usou o modo de injeção múltipla com stacking em cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS, do inglês gas chromatography with mass spectrometry detector). Este método consistia na injeção da amostra (n vezes) entre as injeções do reagente de derivatização de forma a melhorar a detecção de compostos polares com baixa volatilidade.

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Em muitas metodologias analíticas publicadas na literatura, poucos picos de analitos são observados e em algumas regiões do cromatograma não apresentam eluição de picos, oferecendo uma maior oportunidade de aplicação para o uso do modo MISER. No entanto, numa matriz complexa o preparo da amostra é uma etapa determinante, limitando o número de compostos que possam ser introduzidos no cromatograma em uma única análise. Diante disso, um processo de pré-tratamento de amostras complexas, empregando a extração em fase sólida (SPE, do inglês solid phase extraction), poderia atuar como um filtro para a retenção, principalmente, dos analitos, gerando um cromatograma com menor número de picos. Portanto, o procedimento de preparo de amostra pode também contribuir para o aumento da capacidade de injeção utilizando o modo MISER.

Contudo, até o presente momento nenhum trabalho foi encontrado utilizando o modo MISER em cromatografia gasosa com dectector de ionização em chama (GC-FID, do inglês gas chromatography with flame ionization detector). Diante disso, têm-se os objetivos do presente estudo.

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2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e validar um método de separação usando, pela primeira vez, o modo MISER em um GC-FID, sem qualquer modificação instrumental, visando a análise dos triterpenos friedelan-3-ol e friedelin no extrato hexânico de folhas de M. ilicifolia . 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Desenvolver método analítico para a determinação de triterpe-

nos (friedelan-3-ol e friedelin) por GC-FID em M. ilicifolia se-lecionando condições de separação, a saber: fluxo gás de arras-te; temperatura do injetor e volume de injeção; tipo de coluna e temperatura do forno; temperatura do FID; entre outras;

� Desenvolver procedimento de extração assistida por ultrassom avaliando diferentes temperaturas (25 ºC e 60 ºC) para a extra-ção dos triterpenos a partir das folhas de M. ilicifolia, utilizando SPE;

� Avaliar qual o melhor volume de extrato de planta e eluente

para realizar o clean up no cartucho de SPE das amostras;

� Avaliar os parâmetros de validação do método: linearidade; limites de detecção e quantificação; precisão intra-ensaio e in-termediária e recuperação para o método de injeções múltiplas;

� Avaliar o perfil dos 111 indivíduos de M. ilicifolia em relação à

presença dos triterpenos e correlacionar com o número de acú-leos presentes contidos em cada planta;

57

3 EXPERIMENTAL

3.1 REAGENTES E SOLUÇÕES

Os padrões analíticos de friedelan-3-ol e friedelin foram obtidos da Sigma-Aldrich Fine Chemicals (St. Louis, MO, E.U.A.). As soluções estoque de 1000 mg L-1 foram preparadas em clorofórmio grau HPLC (Carlo Erba Reagents, Itália).

Para a preparação da curva de calibração externa utilizou-se a faixa de calibração de 5 - 70 mg L-1 para ambos os analitos, com seis níveis de concentração, empregando o modo MISER.

Para a preparação dos extratos de M. ilicifolia utilizou-se o sol-vente hexano P.A. (Synth, São Paulo). Para a extração em fase sólida dos triterpenos das amostras utilizou-se o cartucho de extração Florisil® contendo silicato de magnésio ativado (Applied Separations, E.U.A, FLO/Florisil, 500 mg/3 mL).

3.2 INSTRUMENTAÇÃO

As análises foram realizadas em um cromatógrafo gasoso (Agi-lent GC System 7890 A) com detecção por ionização em chama. As condições cromatográficas desenvolvidas para a separação dos triterpe-nos friedelin e friedelan-3-ol foram realizadas em uma coluna ZB-50 (30 m x 0,25 mm x 0,15 µm) com 50% fenil-50% metilpolisiloxano. O volume de injeção foi de 1,0 µL empregando o modo split (1:90) cuja temperatura de injetor e detector foi de 280 °C e 320 °C, respectivamen-te. Como programação de temperatura utilizou-se o modo isotérmico a 300 °C com um fluxo constante de gás de arraste, hélio, de 1,5 mL min-1.

3.3 PROCEDIMENTO DE EXTRAÇÃO DOS TRITERPENOS NAS AMOSTRAS DE M. ilicifolia Para a extração dos triterpenos foi necessário realizar a avalia-ção da relação solvente/planta (seca e moída) para o extrato hexânico, e em seguida, a avaliação do procedimento de clean up do extrato hexâni-co resultante com cartucho de SPE contendo Florisil® como fase extra-

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tora. Nestas duas etapas de desenvolvimento do método utilizou-se co-mo referência o trabalho descrito por Nossack et al., (2000) com algumas adaptações. 3.3.1 Preparação do extrato hexânico No procedimento de extração dos triterpenos, em 100 mg de planta seca e moída foram adicionados 5 mL de hexano e este foi sub-metido ao ultrassom (Cristofoli Ultrasonic Cleaner, 42 kHz). Para a otimização da extração se avaliou a influência do tempo de ultrassom empregado (t=1,5 a 9 minutos, com incrementos de 1,5 minutos), e ain-da, avaliou-se o efeito da temperatura no processo de extração (T=25 ºC e 60 ºC). Posteriormente, o extrato hexânico foi centrifugado por 3 mi-nutos a 3000 rpm. Em seguida, utilizou-se o cartucho Florisil®, o qual foi pré-condicionado com 1 mL de hexano, posteriormente, uma alíquo-ta de 4 mL do extrato hexânico foi percolada pelo cartucho e em segui-da, eluiu-se os analitos adsorvidos com 4 mL de clorofórmio. Uma alí-quota do eluato foi diluída com clorofórmio (1:1, v/v) para a injeção direta no equipamento de GC. 3.3.2 Avaliação dos volumes de extrato hexânico e clorofórmio para o procedimento de clean up utilizando cartucho de SPE Florisil® A partir de um extrato hexânico resultante do estudo realizado na etapa anterior, avaliou-se o procedimento de clean up em Florisil®. Inicialmente, verificou-se o volume de extrato hexânico a ser percolado no cartucho. O volume de extrato percolado variou entre 1 a 4 mL. Uma alíquota de cada volume percolado foi diluído com hexano (1:1 v/v) e analisado no GC-FID a fim de verificar a possível presença dos analitos em estudo. Em seguida, partiu-se para o estudo do volume de clorofórmio empregado para a eluição dos triterpenos adsorvidos no cartucho de Florisil®. Esta etapa procedeu-se com a aplicação inicial de 1 mL de CHCl3 e sucessivas adições de 1 mL a fim de verificar o volume ideal para a eluição total dos analitos. Uma alíquota de todas as eluições foi retirada e diluída com CHCl3 (1:1) para posterior injeção no GC-FID.

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3.3.3 Isolamento e caracterização do pico desconhecido

Em 100 gramas de planta seca e moída adicionou-se 20 mL de

hexano (P.A.) sendo submetida à maceração por um mês. A cada sema-na, o extrato hexânico foi rotaevaporado e o precipitado branco foi a-condicionado de maneira adequada em um frasco de vidro para posterior análise cromatográfica. O volume de hexano rotaevaporado era nova-mente colocado em contato com o resíduo sólido da planta para uma extração mais efetiva

Uma alíquota do precipitado branco foi retirada para análise por cromatografia em coluna flash para o isolamento do pico desconhecido. Cada fração isolada da coluna flash era submetida à análise por croma-tografia em camada delgada sendo comparada com os padrões analíticos dos triterpenos. Após o isolamento da fração contendo o pico desconhe-cido, esta fração foi submetida às análises de RMN 13C e 1H, cujos re-sultados se encontram no Anexo A.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE SEPARAÇÃO Inicialmente, as condições para a separação dos marcadores químicos friedelan-3-ol e friedelin por GC-FID foram utilizadas de acordo com Nossack et al., (2000). Este método foi reotimizado para o presente estudo e empregado na separação dos triterpenos de interesse a partir de uma mistura de padrões e de um extrato hexânico com posterior clean up utilizando SPE da planta de M. ilicifolia aplicando o modo de injeção simples, conforme ilustrado na Figura 2.1. O tempo necessário para a separação dos triterpenos foi inferior a dez minutos. Uma boa similaridade entre os cromatogramas dos padrões e das amostras foi observada. Além disso, o método mostrou uma boa resolução (Rs = 1,78) entre os diferentes analitos.

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Figura 2. 1 (a) Cromatograma de uma solução padrão (50 mg L-1) de friedelan-3-ol e friedelin, e (b) cromatograma de um extrato das folhas de M. ilicifolia . Condições experimentais: modo de injeção simples, temperatura do injetor 280°C, modo split (1:90), fluxo de 1,5 mL min-1, temperatura do forno 300°C (isoterma), FID: 320°C. Legenda: 1 - friedelan-3-ol (t1 = 8,76 min), 2 - friedelin (t2 = 9,19 min); D* - Desconhecido (tD = 8,47 min); tr A1- tempo de retenção do primeiro analito; tr An – tempo de retenção do último analito; tr interf 1 - o tempo de retenção do primeiro pico de interferência.

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 pA

1

2

(a)S

min1 2 3 4 5 6 7 8 9

(b)

S

12

D

janela de injeçãotr interf1

trA1

trAn

*D – Pico desconhecido (Friedelan-3β-ol, ver Anexo A)

63

A separação dos analitos foi realizada empregando o modo isotérmico, a fim de utilizar as mesmas condições de separação do modo de injeção simples para o desenvolvimento de um novo método empregando o modo MISER. O modo isotérmico permite a separação dos analitos de diferentes segmentos de amostras na mesma corrida utilizando o método MISER sob as mesmas condições de temperatura, evitando que haja interações diferentes do mesmo analito entre segmentos de amostras diferentes com a fase estacionária, possibilitando condições reprodutíveis em termos de resolução e tempos de retenção. Além disso, o uso do método MISER empregando o modo isotérmico em GC-FID permite que o sistema cromatográfico possa ser considerado como um sistema de injeção em fluxo. E ainda, o modo isotérmico evita a etapa de arrefecimento do forno entre as análises, que também contribui para uma melhoria no rendimento instrumental. Outro fator que influencia o emprego do método MISER é a complexidade da amostra a ser analisada. Neste caso particular, uma amostra do extrato das folhas de M. ilicifolia foi inicialmente injetada no equipamento para verificar os picos dos analitos e a presença de possíveis “interferentes”. No cromatograma da amostra (Figura 2.1b) a presença dos analitos foi observada juntamente com um pico desconhecido, porém, todos apresentaram boa resolução. Além disso, verificou-se que, entre o sinal do solvente e dos analitos existiam poucos picos que poderiam interferir na determinação dos analitos em estudo, definindo-se assim uma “janela de injeção” (Figura 2.1b) no cromatograma, indicando a possibilidade de se utilizar o modo de múltiplas injeções. Neste contexto, o procedimento de preparação da amostra demonstrou ser uma etapa crítica. Para isso, um processo de clean up da amostra foi necessário, não só com o objetivo de proteger a coluna de possíveis contaminantes advindos da amostra, mas também para gerar um cromatograma com menor número de picos. Assim, este conjunto de observações sugerem a possibilidade de introduzir o sinal dos analitos de outras amostras em uma mesma corrida utilizando o modo MISER. Deste modo, utilizou-se o procedimento de SPE com uma fase extratora denominada de Florisil®, o qual é composta por silicato de magnésio ativado.

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4.1.1 Modo MISER

O método MISER consiste em injetar vários segmentos de uma determinada amostra ou mistura de padrões em uma mesma corrida, obtendo-se um cromatograma único com maior quantidade de informações sobre os analitos, quando comparado com o modo de injeção simples. Assim, o método MISER pode proporcionar uma melhoria no rendimento instrumental. Para empregar o método MISER, a "janela de injeção" num cromatograma deve ser determinada a partir do método de uma única injeção (Figura 2.1b). Esta “janela” permite a inclusão de mais picos no cromatograma por meio de múltiplas injeções e do número de injeções (ninj), o qual pode ser estimado usando as seguintes Equações (VISTUBA et al.; 2013):

( )( )

+++−

−=

31int1

1

1int1

wwwrtrt

rtrtn

erfAnA

AAn

erfAinj

(Equação 1)

( )

( )

+++−

−=

32int1

1

2int

wwwrtrt

rtrtn

erfAnAAAn

Anerfinj

(Equação 2)

onde tr A1, tr An, são os tempos de retenção do primeiro analito e do último analito e tr interf 1 e tr interf2 são tempos de retenção dos picos “interferentes” antes do sinal do primeiro analito e depois do sinal do último analito, respectivamente; wA1 , wAn, winterf 1 e winterf 2, são as larguras de base dos respectivos picos mencionados anteriormente. Todos estes tempos de retenção e as larguras dos picos foram obtidos a partir de um cromatograma de uma amostra analisada pelo método de uma única injeção da amostra (Figura 2.1b). A Equação para calcular ninj selecionada depende do tempo da "janela de injeção", localizada entre o grupo de picos dos analitos e os picos vizinhos interferentes. Uma “janela” pequena irá limitar o número de injeções. Se a janela correspondente a tr A1 - tr interf 1 for menor do que

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a janela relacionada ao tr interf 2 - tr An, então o ninj deve ser calculado usando a Equação 1, e se tr A1 - tr interf 1 for maior que tr interf 2 - tr An a Equação 2 deve ser utilizada. Para calcular ninj, o pico desconhecido que aparece próximo dos picos dos triterpenos avaliados foi considerado como "primeiro analito” (A1), devido à proximidade dos picos dos analitos, formando um bloco de picos no cromatograma no intervalo de tempo. Neste estudo, existe apenas o pico tr interf 1 (tempo de corrida de 30 minutos, tr interf 2 não detectado - dados não mostrados), e, por conseguinte, ninj foi obtido a partir da Equação 1. Os valores médios para os tempos de retenção utilizados nos cálculos foram tr A1 = 8,473 min, tr interf 1 = 3,638 min e tr An = 9,190 min e os valores médios para a largura de base dos picos foram wA1 = 0,326, wAn = 0,364 e winterf 1 = 0,147. Assim, o número calculado de injeções possíveis foi de 4,85. No entanto, neste estudo, apenas foram realizadas 3 injeções, uma vez que a linha de base demonstrou um elevado ruído nos cromatogramas para os tempos de análise inferiores a seis minutos, e isso poderia comprometer a integração automática dos picos. Para empregar o modo MISER em GC-FID seria necessária uma modificação no software que controla o equipamento. O software do equipamento utilizado não apresenta a opção de injeção múltipla em uma mesma corrida e, portanto, foi necessário

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New Jacqueline Pereira Vistuba Maytenus ilicifolia (Espinheira-Santa) · 2016. 3. 5. · from Maytenus ilicifolia (espinheira-santa) contained in an active germplasm bank (BAG). The