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NEYZA EMILIA DE OLIVEIRA SALOMÃO
AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DE
ALDIMINAS E ADUTOS DE HANTZSCH
OURO PRETO - MG
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO - UFOP Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia
NEYZA EMILIA DE OLIVEIRA SALOMÃO
AVALIAÇÃO IN VITRO DO POTENCIAL LEISHMANICIDA DE DERIVADOS DE
ALDIMINAS E ADUTOS DE HANTZSCH
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Ouro Preto como requisito para
obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de
concentração de Biotecnologia aplicada à saúde humana e
animal.
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Coorientador: Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares – Laboratório de Imunopatologia, Núcleo
de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Coorientador: Dr. Diogo Garcia Valadares – Carver College of Medicine - University of Iowa –
USA.
Ouro Preto – MG
2016
Salomão, N.E.O. Agradecimentos
4
Salomão, N.E.O. Colaboradores
i
Dra. Cláudia Martins Carneiro1
Ms. João Filipe Vieira1
Dr. Ângelo de Fátima2
Dr. Cleiton Moreira da Silva2
Ms. Taniris Cafiero Braga2
Dra. Nádia das Dores Moreira3
Dr. Bruno Mendes Roatt4
1. Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais.
2. Grupo de Estudos em Química Orgânica e Biológica (GEQOB) Departamento de Química
do Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
Minas Gerais.
3. Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
4. Universidade Federal de Minas Gerais/COLTEC, Belo Horizonte, Minas Gerais.
Suporte Financeiro
Capes/CNPq– Bolsa de Pós-Graduação Institucional de Assistência ao Ensino
PRONEX – Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais
Apoio e Instituições Parceiras
Universidade Federal de Ouro Preto, UFOP/MG
Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG/MG.
Salomão, N.E.O. Epígrafe
ii
É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas mesmo expondo-se ao fracasso,
do que alinhar-se com os pobres de espirito, que nem gozam muito, nem sofrem muito,
porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.
(Theodore Roosevelt)
Salomão, N.E.O. Dedicatória
iii
Dedico,
Aos meus pais, Francisca e Nildo, pelo apoio, amor e exemplos de caráter, dos quais tenho
imenso orgulho de ser filha.
Aos meus sobrinhos Lucas e Albert, por fazer meus dias mais alegres. São a luz da minha
vida.
Ao meu irmão, Clayton, pelo incentivo e apoio durante essa fase.
Amo vocês
Salomão, N.E.O. Agradecimentos
iv
Ao meu orientador Dr. Alexandre Reis, pela oportunidade que me foi dada e importante
contribuição em minha formação acadêmica. Pelo acolhimento, atenção e ajuda prestada, pelo
exemplo de dedicação e comprometimento com a Ciência. Sempre terá minha admiração,
respeito e agradecimento.
Ao meu coorientador e eterno “chefinho” Dr. Rodrigo Dian, a quem não tenho palavras
suficientes para expressar o que fez por mim. Por todo suporte e paciência. Por me coorientar
e fazer isso com responsabilidade, seriedade e comprometimento. Aprendi muito com você.
Pelo apoio, risadas e palavras de incentivo, como: “Calma, que no fim tudo dá certo!”. Ao
respeito e educação nos momentos em que precisou chamar minha atenção. Tudo isso faz de
você um excelente profissional, um ser humano humilde e de coração gigante. Tem minha
eterna gratidão.
Ao meu coorientador Dr. Diogo Valadares, pela disponibilidade e pelos ensinamentos
científicos.
Ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia/NUPEB e ao coordenador Dr. William de
Castro, pela presteza nos serviços do programa e auxílio nos trâmites.
Ao secretário do programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Josino Barbosa, pela
prontidão e empenho em resolver nossas dúvidas.
A Capes/CNPq pela concessão da bolsa.
Ao Dr. Ângelo de Fátima, do Grupo de Estudos em Química Orgânica e Biológica da UFMG,
pelo fornecimento dos compostos químicos testados em nosso estudo e pela disponibilidade
em discutir e prestar informações sobre os mesmos.
À toda equipe do LIMP, pelos ensinamentos e convivência. Com vocês, aprendi que trabalhar
em uma equipe tão grande requer paciência, respeito e humildade. Parecemos uma família que
briga, discute, estressa, mas que sempre temos com quem contar. Muito obrigada por tudo!!
Salomão, N.E.O. Agradecimentos
v
À minha família. Em especial aos meus pais, pelo exemplo de força e perseverança. Por todo
amor.
À minha mãe, que é minha amiga e confidente, por ser tão presente e forte. Por nunca me
deixar desanimar, mesmo nos momentos mais difíceis desta nossa caminhada. Pelas vezes em
que deixou de realizar os seus sonhos para que eu conquistasse os meus. Eu jamais teria
conseguido sem você. Te amo!
À minha avó Francisca que, mesmo distante, acalmava-me com suas lindas palavras.
À Carolzinha, Gleise e Luciana, que me acolheram desde o primeiro momento e foram tão
presentes em minha vida, tanto acadêmica quanto pessoal, vocês foram essenciais. Não
poderia deixar de agradecer à Jamille, ao Fernando, ao Rory, ao Levi e ao João Português,
pelo auxílio no desenvolvimento da minha dissertação, pelas melhores risadas e tantos
apelidos que recebi. Jamais me esquecerei de vocês.
À Nádia Moreira, por todo apoio desde a seleção do mestrado, pela disposição em sempre
ajudar e pelas palavras de fé e incentivo. Tem meu eterno agradecimento.
Ao professor Wendel, pela atenção, colaboração e disposição em ajudar.
Aos alunos e ex-alunos de IC (Diogo Albert, Élcio, Jéssica, Luiza, Mariana Laiz, Marcelo,
Paula, Thaís Ostolin e Valéria) pela ajuda e disposição. Em especial, à Narjara pela
colaboração e comprometimento durante os meus experimentos. Muito obrigada a todos!
Aos meus amigos Edivan Jr., Kelly, Miura e Morgana que, mesmo distante, estão presentes
com a amizade, afeto e amor. Foi como se estivessem sempre ao meu lado. Amo vocês!
À Walerryne Same, pelo companheirismo, amizade e carinho. Por tentar me acalmar nos
momentos mais difíceis deste mestrado, por acreditar em mim e em meu potencial e por me
incentivar a alcançar meus objetivos. Com você, ficou mais fácil esta caminhada. Amo você!
Salomão, N.E.O. Agradecimentos
vi
Aos meus amigos colombianos, por todos os nossos momentos nessa cidade. Em especial à
minha amiga Ivon, que foi de extrema importância nesta caminhada em Ouro Preto. Sempre
presente em todos os momentos! Obrigada pela amizade sincera e por existir em minha vida!
À Maria Josiane, pela grande amizade, por ser tão presente nos momentos mais críticos e
alegres e ser uma pessoa de coração enorme. Tem meu eterno agradecimento.
Às meninas da “República Poucas & Boas”, pela convivência, paciência, amizade, risadas e
pelos “rocks”. Jamais me esquecerei dos momentos compartilhados. Vocês são ótimas!
A Deus, por me dar força e determinação para prosseguir na busca dos meus objetivos.
A todos aqueles que, de uma maneira ou de outra, colaboraram para que este trabalho se
concretizasse. Têm meus sinceros agradecimentos!
Salomão, N.E.O. Sumário
vii
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 4
2.1 Leishmanioses .............................................................................................................. 5
2.2 Leishmaniose Visceral ................................................................................................. 6
2.3 Quimioterapia Empregada no Tratamento da Leishmaniose Visceral ...................... 10
2.4 Antimoniais Pentavalentes ......................................................................................... 11
2.5 Anfotericina B ............................................................................................................ 13
2.6 Miltefosina ................................................................................................................. 16
2.7 Outras Drogas ............................................................................................................ 18
2.8 Terapia Combinada .................................................................................................... 21
2.9 Novas Formulações .................................................................................................... 22
2.10 aldiminas ................................................................................................................ 22
2.11 adutos de Hantzsch ................................................................................................. 24
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 27
4 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 29
4.1 Objetivo Geral ............................................................................................................ 30
4.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 30
1ª Etapa: Testes de drogas clássicos in vitro .................................................................... 30
2ª Etapa: Testes de drogas in vitro por citometria de fluxo .............................................. 30
5 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 31
5.1 Organismos e células ................................................................................................. 32
5.1.1 Cultivo de Leishmania infantum ........................................................................ 32
5.1.2 Cultivo dos macrófagos imortalizados ............................................................... 32
5.1.3 Transfecção das promastigotas de L. infantum cepa OP46 com o Gene Repórter
GFP...................................................................................................................................33
5.2 Compostos químicos: aldiminas, adutos de Hantzsch e Anfotericina B Desoxicolato
de Sódio ................................................................................................................................ 36
5.3 Delineamento experimental ....................................................................................... 36
5.4 Ensaio de citotoxicidade ............................................................................................ 38
5.4.1 Avaliação in vitro da citotoxicidade: Macrófagos Caninos DH82 e em
Macrófagos Murinos J774.A1 .......................................................................................... 39
5.5 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em
formas promastigotas ............................................................................................................ 40
Salomão, N.E.O. Sumário
viii
5.6 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em
formas amastigotas de L. infantum ....................................................................................... 41
5.6.1 Método clássico: microscopia ótica .................................................................... 41
5.6.2 Citometria de Fluxo ............................................................................................ 43
5.7 Análise estatística ...................................................................................................... 45
6 RESULTADOS ................................................................................................................ 46
6.1 Apresentação de resultados ........................................................................................ 47
6.2 Avaliação in vitro da citotoxicidade .......................................................................... 47
6.2.1 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de aldiminas em
culturas secundárias de macrófagos ................................................................................. 48
6.2.2 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de adutos de
Hantzsch em culturas secundárias de macrófagos ............................................................ 50
6.3 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em
promastigota de L. infantum da cepa OP46 .......................................................................... 52
6.4 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em
formas amastigotas de L. infantum ....................................................................................... 55
6.4.1 Método clássico: Microscopia ótica ................................................................... 55
6.5 Citometria de fluxo .................................................................................................... 60
6.5.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82)
infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP) ................. 60
6.5.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)
infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente
(GFP).................................................................................................................................63
7 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 65
8 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 78
9 PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 80
10 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 82
11 ANEXOS ....................................................................................................................... 94
Anexo 1: ............................................................................................................................... 95
Anexo 2: ............................................................................................................................... 99
Salomão, N.E.O. Lista de Abreviaturas
ix
AmB - D Anfotericina B desoxicolato de sódio
ANVISA Agência Nacional De Vigilância Sanitária
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FDA Food and Drug Administration
g Gramas
GFP Proteína verde fluorescente
IC50 Concentração Inibitória 50%
Kg Quilograma
LIT Liver infusion tryptose médium
LV Leishmaniose Visceral
LVC Leishmaniose Visceral Canina
LVH Leishmaniose Visceral Humana
mg Miligrama
mL Mililitro
MS Ministério da Saúde
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazólio
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS Phosphate buffer saline (tampão fosfato salina)
PVC - LV Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral
RFP Proteína vermelha fluorescente
rpm Rotação por minuto
RPMI Meio de Cultura com Vermelho de Fenol
Sb5+ Antimoniais pentavalentes
SDS Detergente dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
SUS Sistema Único de Saúde
WHO World Health Organization (OMS)
Μg Microgramas
µl Microlitros
Salomão, N.E.O. Lista de Figuras
x
Figura 1: Ciclo de vida das espécies de Leishmania causadoras de LV ................................... 6
Figura 2: Aspectos Epidemiológicos da leishmaniose visceral no mundo................................8
Figura 3: Estrutura química dos Antimoniais Pentavalentes (Sb5+) ........................................ 13
Figura 4: Estrutura química da Anfotericina B ....................................................................... 15
Figura 5: Estrutura química da Miltefosina............................................................................. 18
Figura 6: Outras drogas empregadas na terapia da leishmaniose ............................................ 21
Figura 7: Estrutura Geral das Aldiminas ................................................................................. 23
Figura 8: Síntese da 1,4-dihidropiridinas de Hantzsch ........................................................... 25
Figura 9: Avaliação da morfologia e fluorescência de promastigotas de Leishmania infantum
OP46 e OP46GFP por citometria de fluxo. .............................................................................. 35
Figura 10: Delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste
estudo. ....................................................................................................................................... 38
Figura 11: Sequencia de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de
macrófagos infectados com leishmania GFP+ após o tratamento in vitro com diferentes
compostos de aldiminas e adutos de Hantzsch. ........................................................................ 45
Figura 12: Avaliação da citotoxicidade das aldiminas em Macrófagos Murino (J774.A1) e
Macrófagos Canino (DH82) ..................................................................................................... 49
Figura 13: Avaliação da citotoxicidade dos adutos de Hantzsch em Macrófagos Murino
(J774.A1) e Macrófagos Canino (DH82) ................................................................................. 51
Figura 14: Avaliação da atividade Leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em
Promastigotas de L. infantum OP46 ......................................................................................... 54
Figura 15: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com
amastigotas de L. infantum (OP46) por microscopia óptica. .................................................... 57
Figura 16: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82)
infectados com amastigotas de L. infantum (OP46) por microscopia ópitica. ......................... 59
Figura 17: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com
amastigotas de L. infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo. ......................................... 62
Figura 18: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82)
infectados com amastigotas de L. infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo. ................ 64
Salomão, N.E.O. Lista de Tabelas
xi
Tabela 1: Valores de Concentração Inibitória de 50% (IC50) para os macrófagos, nos tempos
de 24, 48 e 72 horas de tratamento, de cada droga e da AmB-D. ............................................ 52
Salomão, N.E.O. Resumo
xii
A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave e devastadora da doença, que se não
diagnosticada e tratada a tempo leva a óbito. O tratamento convencional da LV é baseado
num repertório terapêutico restrito de fármacos como o antimoniato pentavalente e a
anfotericina B, que apresentam elevada toxicidade. Dessa forma, o desenvolvimento de novas
estratégias terapêuticas e a prospecção de novos fármacos é fundamental para o controle e
tratamento da doença. Uma possível alternativa para novos medicamentos são os compostos
sintéticos, e neste cenário encontram-se os derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch que
demonstraram prévia ação antifúngica e leishmanicida. Assim, nesse estudo propusemos
testar in vitro a ação leishmanicida destes derivados de aldiminas (n=7) e adutos de Hantzsch
(n=5) em diferentes células e por metodologias distintas. Avaliamos a citotoxicidade dos
diferentes compostos pelo método colorimétrico de Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-
difenil tetrazólio (MTT) em macrófagos murino (J774.A1) e canino (DH82) sendo observada
uma maior citotoxicidade nos compostos de Aldiminas 3I5 e 3D7 com IC50 de 15 e 10 μg/ml,
respectivamente. Ao contrário e de maneira satisfatória, os A. de Hantzsch demonstraram uma
baixa citotoxicidade em comparação às formulações de aldiminas. A ação leishmanicida em
promastigotas de L. infantum, cepa (OP46), dos diferentes compostos ocorreu logo após as 24
de tratamento com valores de redução inferiores a 25% da viabilidade, sendo mais
evidenciada, principalmente no tempo de 72 horas de contato com as aldiminas (3H8 e 3G2) e
com os a. Hantzsch (8B5 e 8B6) a viabilidade das promastigotas foi reduzida acima de 50%.
Para a avaliação in vitro da atividade leishmanicida em amastigotas do parasito foram
empregados macrófagos caninos DH82 infectados com promastigotas de L. infantum (OP46)
e tratados com os diferentes compostos químicos por 24, 48 e 72 horas, sendo avaliado por
análise microscópica bem como por citometria de fluxo empregando a L. infantum cepa
(OP46) transfectada com o gene repórter GFP e os resultados encontrados foram semelhantes
entre as duas metodologias empregadas (microscopia e citometria de fluxo). De um modo
geral foi observado redução no percentual de infecção principalmente após 48 horas de
tratamento para os compostos testados. No grupo das aldiminas, os compostos 3H8, 3H9 e
3D7 apresentaram reduções maiores na taxa de infecção dos macrófagos, chegando a
porcentagens de redução próximas ao controle positivo tratado com Anfotericina B. Nos
compostos do grupo de a. de Hantzsch destacam-se os compostos 8A2, 8B5 e 8B6, em que
principalmente o 8B6 mostrou redução significativa no percentual de infecção em relação ao
grupo controle em ambos os testes (microscopia e citometria de fluxo) em todos os tempos de
avaliação (24, 48 e 72 horas). Os resultados in vitro demonstram à baixa citotoxicidade e
satisfatória atividade leishmanicida tanto em promastigotas quanto em amastigotas de L.
infantum de alguns dos compostos químicos de aldiminas (3H7 e 3D7) e a. de Hantzsch (8A4
e 8B6) testados. O conjunto de dados obtidos sugere que os compostos aqui avaliados
possuem o potencial leishmanicida e merecem ser considerados bons candidatos para
prosseguirem em estudos de quimioterapia experimental in vivo para Leishmaniose Visceral.
Palavras-chave: aldiminas, adutos de Hantzsch, macrófagos, promastigotas e amastigotas de
Leishmania infantum GFP, citotoxicidade, atividade leishmanicida, citometria de fluxo.
Salomão, N.E.O. Abstract
xiii
Visceral Leishmaniasis (VL) is the most severe form of Leishmaniasis and when it’s not
diagnosed and treated in time, consistently leads to death. Conventional treatment for VL is
usually limited to a small group of drugs, like pentavalent antimonials and amphoterecin B,
which are known for their high toxicity. Due to this restrictions, it is essential to promote new
therapeutic strategies and drug screening studies for leishmaniasis treatment. A promising
alternative for treatment of VL are syntethic compounds, including Aldimine and Hantzsch
Adutes by-products, which have proved to have antifungal and antileishmanicidal hability. In
this study, we set out to study the in vitro leishmanicidal hability of by-products of Aldimine
(n=7) and Hantzsch Adutes (n=5) in macrophages from different origins using distinct
methodologies. The cytotoxicity of these compounds was evaluated, using (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium reduction assay (MTT) in
murine (J774.A1) and canine (DH82) macrophages and it was concluded that by-products of
Aldimine, 3I5 and 3D7, have the highest toxicity, with an IC50 of 15 and 10 μg/ml,
respectively. On the contrary and satisfyingly, Hantzsch Adutes, were generaly less toxic
compared with Aldimine derivates. The leishmanicidal activity of these compounds was also
evaluated, using L. infantum (OP46) strain promastigotes, and the it was concluded that there
was some leishmanicidal activity after 24 hours, with less than 25% drops in parasite
viability. In later time points (72h), more than 50% drops in parasite viability were apparent,
particularly with Aldimines (3H8 and 3G2) and Hantzsch Adutes (8B5 and 8B6). To evaluate
in vitro leishmanicidal activity in amastigote forms of L. infantum, DH82 macrophages
infected with L. infantum (OP46) promastigotes were used and subsequently treated with the
full spectrum of drugs for 24, 48 and 72 hours, for this purpose microscopical analysis and
flow citometry (using for this particular methodology the same L. infantum strain transfected
with the reporter gene GFP) were used and similar results were accomplished using both
methodologies. In general, a drop in infection rate was observed, mainly after 48 hours of
treatment. Specifically to Aldimine by-products, 3H8, 3H9 and 3D7 were capable of major
drops in infection rate and their performance was similar to that of Amphoterecin B. With
respect to the Hantzsch Adutes by-products, 8A2, 8B5 and 8B5 demonstrated a remarkable
hability to reduce infection rate, particularly 8B6 which was capable of reducing infection rate
in both methodologies used and through all time points (24, 48 and 72h). In this in vitro
results it becomes apparent that Aldimine by-products 3H7 and 3D7 and Hantzsch Adutes
8A4 and 8B6 demonstrate low toxicity and satisfying leishmanicidal activity, both in
promastigote and amastigote forms. Taking in consideration that some of the compounds
Salomão, N.E.O. Abstract
xiv
tested demonstrated leishmanicidal hability, it is believed that they deserve consideration for
future experimental chemoterapy in vivo studies, regarding Visceral Leishmaniasis.
Key words: Aldimines, adducts Hantzsch, macrophages, Promastigotes and amastigotes forms
from Leishmania infantum GFP, cytotoxicity, Leishmanicidal activity, Flow cytometry.
1 INTRODUÇÃO
Salomão, N.E.O. Introdução
2
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica causada por protozoários do
gênero Leishmania. É uma doença endêmica em todos os continentes, com exceção da
Oceania, responsável por cerca de 500 mil novos casos e 59 mil óbitos a cada ano. No
continente americano, a LV humana ocorre desde o México até países da América do Sul,
sendo o Brasil responsável por 90% dos casos registrados em todo o continente. A doença
atinge 26 unidades da federação brasileira e dentre as cinco regiões do país, sua maior
incidência ocorre na região nordeste (Secretaria de Vigilância em Saúde –MS, 2010a).
O controle das Leishmanioses é bastante complexo em função da diversidade de
agentes, reservatórios, vetores e situação epidemiológica, aliadas ao conhecimento
insuficiente sobre vários destes aspectos (MS, 2006a, 2007). Neste sentido, as medidas de
controle da LV existentes no país, estão baseadas em um tripé de medidas de ações que
preconiza o diagnóstico e tratamento imediato de pessoas doentes; controle vetorial através da
pulverização de inseticidas com efeito residual e eutanásia de cães soropositivos (Desjeux,
2004).
O tratamento das leishmanioses em pacientes humanos é feito através de
quimioterapia, que na maioria dos casos proporciona a sua cura (Seifert et al., 2011). No
entanto, quando o assunto são as doenças tropicais há pouca preocupação por parte da
indústria farmacêutica, devido aos grandes investimentos e baixo retorno (Trouiller et al.,
1999). Dessa forma, por se tratar de doenças atreladas a pobreza, o arsenal terapêutico
disponível para o tratamento da LV é bastante precário e restrito (Gil et al., 2008).
Os fármacos disponíveis para o tratamento da doença são os Antimoniais
Pentavalentes (antimoniato de meglumina e o estibogluconato de sódio), Anfotericina B,
pentamidina, miltefosina e paramomicina (WHO, 2010a). Porém, um fator de grande
preocupação no uso das drogas tradicionais é a presença de alta toxicidade e resistência dos
parasitos (Tempone et al., 2005). Outro ponto importante e crítico do tratamento com essas
drogas são as vias de administração que, com exceção da miltefosina (via oral), requerem
aplicações por via intramuscular ou endovenosa, que além de dolorosas, são administradas
por longos períodos, exigindo internação do paciente, acarretando em alto custo (Braga et al.,
2007) e muitas vezes no abandono do tratamento pelo paciente (Croft & Coombs, 2003).
Diante disto, o grande desafio ao longo dos anos tem sido o desenvolvimento de novos
medicamentos ou novas formulações das drogas já existentes. Mediante essa necessidade para
o tratamento de doenças parasitárias e negligenciadas, a OMS, incentiva o estudo de novos
compostos sintéticos ou naturais que visem perspectivas no desenvolvimento de drogas mais
Salomão, N.E.O. Introdução
3
eficazes (WHO, 1990). Isso leva a uma importante estratégia que é o desenvolvimento de
compostos sintéticos e seus derivados, que possibilitam maior viabilidade de produção e
redução de custos (Tiuman et al., 2011).
Nessa perspectiva, nesse porpôs-se a avaliar a ação leishmanicida de 12 compostos
químicos desenvolvidos a partir de dois grupos de compostos sintéticos - aldiminas e adutos
de Hantzsch – comparados a um grupo controle (não tratado) e a um grupo tratado com
Anfotericina B (AmB-D) (controle positivo de tratamento). Na tentativa de êxito na obtenção
de que estes compostos tenham atividade leishmanicida, as diferentes drogas foram avaliadas
por diferentes metodologias in vitro convencionais – para determinação da citotoxicidade
(IC50 pelo ensaio do MTT) e potencial leishmanicida em promastigotas (CC50 pelo ensaio do
MTT) e em amastigotas de L. infantum cepa OP46, (através da análise por microscopia óptica
da redução da infecção em macrófagos) bem como por metodologias in vitro empregando a
citometria de fluxo e a cepa OP46 L. infantum transfectada com gene repórter para GFP com
intuito de melhorar a rapidez e confiabilidade dos resultados.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
5
2.1 Leishmanioses
As leishmanioses são um grupo de doenças consideradas antropozoonoses, de
transmissão vetorial, cujos agentes etiológicos são protozoários pertencentes ao gênero
Leishmania (Família: Trypanosomatidae, Ordem: Kinetoplastida), nomeado por Ross em 1903
(Gontijo e Carvalho, 2003).
Entre as Doenças Tropicais Negligenciadas, a leishmaniose é uma enfermidade que
ocupa o segundo lugar em mortalidade e quarto lugar em morbidade no mundo. A doença está
fortemente atrelada à pobreza e as populações mais afetadas vivem em áreas rurais, periferias
urbanas e zonas de conflito, onde os recursos investidos para o tratamento, diagnósticos e
controle da doença são limitados (Yamey & Torreele, 2002). Nas últimas décadas, as
leishmanioses têm se expandido e estabelecido nas áreas urbanas e peri-urbanas, através da
adaptação de seus vetores e a presença de reservatórios aos ambientes artificiais (Ashford, 2000).
O gênero Leishmania possui ciclo biológico heteroxênico, cujas formas de
desenvolvimento alternam-se entre hospedeiros vertebrados e insetos vetores hematófagos que
transmitem o parasito durante o repasto sanguíneo (Killick-Kendrick, 1979). O hospedeiro
invertebrado é o inseto vetor da família Psychodidae, sub-Família Phlebotominae, do gênero
Phlebotomus (Velho Mundo) ou Lutzomyia (Novo Mundo) que se torna infectado durante o
repasto sanguíneo em indivíduos doentes (ciclo antroponótico da LV no Velho Mundo) ou em
reservatórios animais (ciclo zoonótico). O ciclo de vida da Leishmania é caracterizado por duas
diferentes formas: promastigota (células flageladas presente no intestino do vetor) e amastigota
(células imóveis, presente no interior de fagócitos de mamíferos domésticos, silvestres e do
homem), sendo responsável pela patologia da doença (Bates; Rogers 2004).
O ciclo biológico ocorre quando o protozoário na forma promastigota habita o
intestino do flebotomíneo (MS, 2006a). A infecção no hospedeiro vertebrado ocorre após a
picada da fêmea de flebotomíneos infectadas, que inocula a forma infectante – promastigotas
metacíclicas - durante o repasto sanguíneo (Bastien et al., 1992). Após a picada, a Leishmania é
depositada por meio da glândula salivar e juntamente com as secreções salivares que possui
abundancia de proteínas, que auxiliam no sucesso da infecção e na sobrevivência (Ribeiro et
al., 2010). Assim, os parasitos são internalizados por macrófagos, onde perdem os flagelos e
transformam-se em formas amastigotas dando inicio a sua multiplicação. Normalmente, os
macrófagos infectados se rompem e liberam as amastigotas, que serão fagocitadas por outros
macrófagos, gerando um ciclo repetitivo (Basano & Camargo, 2004). A multiplicação binária
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
6
das amastigotas destrói a célula hospedeira disseminando-se pelo sistema linfático e vascular,
infiltrando-se na medula óssea, fígado e baço. Quando um novo flebotomíneo alimenta-se,
ocorre a sua infecção por ingestão de formas amastigotas. Estas se diferenciam em
promastigotas no estômago dos insetos que após uma metacilogênese, evoluem para formas
metacíclicas que infectarão novo hospedeiro mamífero em um próximo repasto sanguíneo
(Chappuis et al., 2007).
Figura 1: Ciclo de vida das espécies de Leishmania causadoras de LV.
http://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html
A leishmaniose é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas,
principalmente leishmaniose visceral (LV) e cutânea (LC), sendo a última subdividida em
leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose difusa (LCDF), leishmaniose disseminada
(LCD) e leishmaniose muco-cutânea (LMC) (WHO, 2010a).
2.2 Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral (LV), manifestação clínica mais grave da doença, é endêmica
em todos os continentes, com exceção da Oceania. A LV é caracterizada por febre, perda de
peso, esplenomegalia, pancitopenia, hepatoesplenomegalia, anemia, dentre outras manifestações
mais grave que se não tratadas evoluem o paciente ao óbito (Gontijo & Melo, 2004). Os
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
7
parasitos atacam o sistema fagocitico mononuclear (SFM) principalmente fígado, baço e medula
óssea, sendo isto o responsável pelo aparecimento dos sinais e sintomas clínicos que
caracterizam a LV. A doença é letal em praticamente todos os casos não tratados (Herwaldt,
1999).
A LV, também conhecida como Calazar é uma doença sistêmica causada por
protozoários do complexo donovani: Leishmania (Leishmania) donovani e Leishmania
(Leishmania) infantum (Herwaldt, 1999). Na África e na Índia, o agente etiológico responsável
pela endemia é L. donovani. No Oriente Médio, Ásia, Mediterrâneo é a L. infantum. Nas
Américas a LV é causada pela espécie L. chagasi, sendo o Brasil responsável por 90% dos casos
registrados da doença no continente Americano (Silva et al., 2007). Sabe-se atualmente, que a
Leishmania chagasi é sinônimo de L. infantum, baseado em estudos bioquímicos e moleculares
(Leblois et al., 2011).
A LV é considerada uma doença endêmica em 88 países, aproximadamente 90% dos
casos notificados no mundo ocorre em Bangladesh, Índia, Nepal, Etiópia, Sudão e Brasil (Alvar
et al., 2012). Atrás da malária e da filariose, a LV é considerada a terceira doença mais
importante, mundialmente, transmitida por insetos vetores (Reithinger & Davies, 20b02).
Sabe-se que 59.000 pessoas morrem anualmente de leishmaniose visceral (LV), dentre
as quais 35.000 são homens e 24.000, mulheres. Porém, é importante entender que estes dados
são subestimados, devido às limitações no sistema de notificação de cada país onde a
enfermidade ocorre. Devido à ampla distribuição geográfica e a elevada mortalidade da LV,
especialmente nos países menos desenvolvidos, estima-se que anualmente a incidência é de
500.000 novos casos de LV, com 59 mil óbitos em vários países da Europa, Ásia, Oriente Médio,
África e Américas (WHO, 2010b).
No continente Americano a LV é encontrada desde o México até na Argentina. No
Brasil, a LV é uma doença endêmica, estando atualmente distribuídas em todas as unidades da
federação, atingindo as cinco regiões do país. Devido á grande distribuição, a LV apresenta
aspectos geográficos, climáticos e sociais diferenciados entre as regiões (MS, 2010a).
A primeira suspeita e identificação de LV no continente Americano ocorreu em 1911,
pelo brasileiro Carlos Chagas, que relatou uma esplenomegalia em crianças da Bacia Amazônica
(Chagas et al., 1938). Porém, o primeiro registro da doença no Brasil só ocorreu em 1913,
proveniente do material de necropsia de um paciente oriundo de Boa Esperança, Mato grosso,
descrito por Migone no Paraguai (Migone, 1913).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
8
Figura 2: Aspectos Epidemiológicos da leishmaniose visceral no mundo. (WHO, 2013).
A LV era considerada uma doença restrita às áreas rurais, sendo relatadas
principalmente no nordeste brasileiro. Até meados da década de 80, só ocorria em zonas rurais e
municípios de baixo nível sócio econômico. Porém, nos últimos anos, a doença avançou para
outras regiões e alcançou grandes centros urbanos (Costa et al., 2007). Esse processo de
periurbanização e urbanização da LV para os municípios de médio e grande porte resultaram em
vários surtos como, por exemplo, no Rio de Janeiro (RJ) (Marzochi et al., 2009) e Belo
Horizonte (MG) (Silva et al., 2001).
A incidência da LV relatada no Brasil vem crescendo consideravelmente. Enquanto
que, no ano de 1980 foram registrados 1500 casos por ano, no período de 2008-2013 o número
de casos era aproximadamente de 4000 casos por ano e a incidência de 1,6 casos por 100 mil
habitantes. A letalidade também aumentou, passando de 3,4% em 1994 para 7,1% com 231
óbitos em 2013 (MS, 2016).
Em 2009, a região nordeste representou 48% dos casos de LV registrados no Brasil.
Um ano mais tarde, o Estado de Minas Gerais passou a ser o Estado com maior incidência da
doença, contabilizando 692 casos no ano (Karagiannis-Voules et al., 2013). Seguido desse
aumento no número de casos, atualmente em várias cidades de Minas Gerais observa-se grande
prevalência de Leishmaniose Visceral Canina (LVC), bem como alta densidade do vetor Lu.
Longipalpis (França-Silva et al., 2003; França-Silva et al., 2005; Monteiro et al., 2005; Coura-
Vital et al., 2011). O principal reservatório doméstico do parasito, o cão (Canis familiaris) é um
importante destaque na transmissão da doença para o homem (Tesh, 1995). Devido o elevado
parasitismo cutâneo observado até mesmo nos animais assintomáticos, o cão torna-se o principal
reservatório domestico do parasito (de Queiroz et al., 2011).
Número de novos casos
registrados de LV, 2013.
> 1000
500-999
100-499
<100
0
Não foram notificados casos autóctones
Sem dados
Não aplicável
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
9
O controle das Leishmanioses é bastante complexo em função da diversidade de
agentes, reservatórios, vetores e situação epidemiológica, aliadas ao conhecimento insuficiente
sobre vários destes aspectos (MS, 2006). As medidas de controle da LV existentes no país estão
baseadas em uma tríade de ações que foram estabelecidas primeiramente por Deane (1956) e
posteriormente adotadas pelo Ministério da Saúde brasileiro, através do Programa de Vigilância
e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV) (MS, 2006a). O tripé de medidas de ações
preconiza o diagnóstico e tratamento imediato de pessoas doentes; controle vetorial através da
pulverização de inseticidas com efeito residual e eutanásia de cães soropositivos. Outras medidas
de controle incluem uma sistemática vigilância sanitária, acompanhada de atividades educativas
em saúde (MS, 2010b).
O Brasil é o único país de caráter endêmico que mantém e conduz de forma regular
um programa epidemiológico e profilático no combate à doença, baseado na integração das três
medidas de saúde pública do PCLV (Palatnik-de-Souza et al., 2001). No entanto, o controle da
doença é dificultado pela diversidade de situações epidemiológicas e insuficiência de
instrumentos eficientes, e isso influencia para que determinadas medidas não possam ser
aplicadas em algumas situações (Gontijo & Carvalho, 2003). Entretanto, mesmo com a aplicação
destas medidas em centros urbanos, os resultados são detectados apenas a médio ou longo prazo,
e sem garantia de sucesso na redução de LV humana e canina (Palatnik-de-Sousa et al., 2001).
Para que o controle da LV seja realmente eficaz, as medidas devem ser mantidas durante longo
período e, mesmo assim, é frequente a reativação dos focos, uma vez que o combate ao vetor não
tem logrado sucesso (Alvar et al., 2004).
Mediante o exposto, existem inúmeros desafios do controle da LV e o tratamento dos
casos humanos ainda constitui a principal ferramenta no controle da doença (Rocha, 2009).
Um grande problema no tratamento da LV em todo mundo é o crescente número de
casos humanos resistentes aos antimoniais pentavalentes e a anfotericina, drogas de primeira e
segunda escolha, respectivamente, para o tratamento da doença no Mundo. Até o momento,
poucas são as opções terapêuticas para o tratamento da LV, considerando a redução na eficácia
terapêutica e a necessidade de novas alternativas que apresentem necessariamente baixa
toxicidade e custo. Estes aspectos são fundamentais para que novas opções de tratamento possam
ser utilizadas por países pobres, onde a doença é mais prevalente (Roatt et al., 2014).
Outro grande problema no programa de controle da LV está no uso de fármacos
destinados ao tratamento de casos humanos no tratamento de cães com LV, já que
independentemente do protocolo de tratamento, o sucesso terapêutico nestes animais é
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
10
praticamente nulo, uma vez que, o parasito permanece após o tratamento, com grandes chances
de recidivas e possibilidade de surgimento de cepas resistentes aos fármacos no tratamento da
LV humana (MS, 2006a).
Além disso, até o momento não existe um protocolo terapêutico eficiente, capaz de
curar parasitologicamente um cão infectado (Neogy et al., 1994, Moreno et al., 1999, Rhalem et
al., 1999, Baneth & Shaw, 2002, Nieto et al., 2003, Noli & Auxilia, 2005, Saridomichelakis et
al., 2005, Pasa et al., 2005, Vouldoukis et al., 2006). Nesse sentido, foi proibido o tratamento de
cães com medicamentos de uso humano ou não registrados no Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), de acordo com portaria interministerial do Ministério da
Saúde (n° 1.426 de 11 de Julho de 2008). Considerando a falta de medicamento específico para o
tratamento da doença em cães, até então, os animais contaminados só tinham um destino: a
eutanásia. No entanto, mediante anos de discussão, o MAPA, por meio da Nota Técnica
Conjunta n° 001/2016 MAPA/MS, autoriza o registro do produto MILTEFORAN, sob o número
SP 000175-9.000003, de propriedade da empresa VIRBAC SAÚDE ANIMAL, indicado para o
tratamento da leishmaniose visceral de cães.
Diante dessa situação o desenvolvimento de novas formulações, estratégias
terapêuticas e pesquisas de novos fármacos, vacinas e imunoterápicos que possam ser
empregados no tratamento da LVH e/ou da LVC são imprescindíveis como novas alternativas
para controlar a crescente expansão da doença (Reis et al., 2010; Roatt et al., 2014).
2.3 Quimioterapia Empregada no Tratamento da Leishmaniose Visceral
O tratamento das leishmanioses é baseado em quimioterapia, e em pacientes humanos
proporciona cura clínica na maioria dos casos (Seifert et al., 2011). Entretanto, as doenças
tropicais têm sido negligenciadas ao longo de décadas frente ao desenvolvimento de fármacos
pela indústria farmacêutica. Esse fato ocorre devido à falta de investimentos e ao baixo retorno
financeiro refletindo em um pobre repertório terapêutico para tratar estas doenças (Trouiller et
al., 1999). O arsenal terapêutico disponível para o tratamento da LV, assim como de outras
doenças tropicais é bastante precário e restrito (Gil et al., 2008). Desde o século 20, as drogas
como os antimoniais, anfotericina B, alopurinol e outras, são amplamente utilizadas para o
tratamento contra a LV (Queiroz et al., 2004). Porém, um fator de grande preocupação no uso
das drogas tradicionais é a presença da alta toxicidade e resistência (Tempone et al., 2005) e os
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
11
fatores que também merecem destaque, são as vias de aplicações dessas drogas, que por serem
intramuscular ou endovenosa, geralmente são dolorosas, desconfortáveis e precisam ser
administradas diariamente por longos períodos e muitas vezes requer hospitalização do paciente,
o que acarreta alto custo ao governo (Braga et al., 2007). Outro obstáculo para o tratamento é a
coinfecção Leishmania/HIV, com maior frequência de falhas terapêuticas e a resistência em
larga escala ao antimonial pentavalente na Índia (Murray, 2001).
Embora, as três categorias da doença sejam causadas por parasitos da família
Trypanosomatidade, as doenças são tratadas com diferentes drogas e/ou protocolos terapêuticos
e os próprios parasitos apresentam sensibilidades diferentes a muitos compostos (Croft, 1997).
Para todos os fármacos utilizados na quimioterapia na LV já há relatos em todo mundo de
pacientes não responsivos ao tratamento e cepas resistentes do parasito (Croft et al., 2005).
Desta forma, uma das questões mais graves relacionadas ao tratamento da LV refere-
se à resistência dos parasitos às drogas convencionais, e um dos fatores que provavelmente
contribui para esta situação, é a limitada quantidade de medicamentos disponíveis para o
tratamento da doença (Croft et al., 2006a). Além disso, é importante mencionar que na LV a
possível contribuição nessa resistência dos parasitos está relacionada ao tratamento não efetivo e
esterilizante em cães (Noli & Auxilia, 2005; Pasa et al., 2005; Vouldoukis et al., 2006; Roatt et
al., 2014). Em países como o Brasil, os cães possuem características clínico-epidemiológicas
muito importantes como reservatório do parasito, uma vez que apresentam uma incidência da
doença maior que a doença humana, além de possuírem um elevado parasitismo cutâneo, sendo
os responsáveis pela manutenção da transmissão da LV em ambientes rurais e urbanos (Molina
et al., 1994; Giunchetti et al., 2006; MS, 2010b; Roatt et al., 2014).
2.4 Antimoniais Pentavalentes
O uso medicinal dos compostos de antimônio é conhecido desde o início do século XX
e já eram usados para fins terapêuticos, mas somente em 1912, Gaspar de Oliveira Viana
observou que o tártaro emético também era eficaz na terapêutica da leishmaniose tegumentar
americana (Braga, 2012). Após três anos, na Itália, esse medicamento foi introduzido no
tratamento da LV (Di Cristina, 1915).
O primeiro fármaco utilizado para o tratamento de LV dessa classe foi o antimonial
trivalente (SbIII). Somente após a década de 40 que as novas formulações dessa classe, os
antimoniais pentavalentes (Sb5+) foram introduzidas na terapêutica e assim obtendo a diminuição
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
12
no tempo de tratamento da Leishmaniose (Murray et al., 2005). Dessa forma, desde 1940, o
tratamento das leishmanioses inclui os derivados de antimoniais pentavalentes (Sb5+) nas suas
duas formulações disponíveis no mercado (Sundar, 2013). Os fármacos pertencentes ao grupo de
antimoniais pentavalentes (Sb5+) são: o estibogluconato de sódio (SGS) (Pentostam®) e o
antimoniato de N-metilmeglucamina (NMG) (Glucantime®), que são usados, em todo mundo,
até os dias atuais (Soto et al., 2004).
O fármaco de primeira escolha e mais empregado na terapêutica da LV no Brasil é o
Glucantime®, com distribuição gratuita na rede pública de saúde (SUS) (Santos et al., 2008; MS,
2010b), sendo essa classe de fármaco, a mais barata opção terapêutica disponível (Herwaldt,
1999). Apesar de ser um pilar no tratamento da LV, não tem sido utilizado como medicamento
de primeira escolha em alguns países, seja por sua elevada toxicidade, ou pela resistência do
parasito a essa droga. Por exemplo: devido a seus efeitos tóxicos graves, os antimoniatos não são
aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos da América (EUA)
para o tratamento da leishmaniose em pacientes (Buates & Matlashewski, 1999) tendo apenas a
anfotericina B lipossomal como medicamento aprovado para uso. Já em outros países, como por
exemplo, em Bihar, na Índia, quase 60% da população apresenta falha terapêutica com este
medicamento (Sundar, 2001; Guerin et al., 2002; Dube et al., 2009).
O composto referente ao Glucantime® é obtido sinteticamente a partir do ácido
antimônico e da N-metil-glucamina (Rath et al., 2003). Apesar do uso dos compostos no
combate às leishmanioses existir a cerca de um século, seus principais mecanismos de ação são
apenas conhecidos em parte ou totalmente desconhecidos (Frézard et al., 2005). Sabe-se apenas,
que a ação anti-parasitária dessas drogas devem-se á influencia na bioenergética do parasito, pela
inibição da glicólise, da β-oxidação dos ácidos graxos do parasito e da fosforilação do ADP
(Berman et al., 1987).
O esquema terapêutico para LV utilizando o Glucantime® é administrado com doses
de 20mg/kg/dia, via endovenosa juntamente com soro glicosado por um período de 20 dias,
podendo chegar a 30 dias e no máximo a 40 dias, com o limite máximo de três ampolas/diárias
(MS, 2010b; MS, 2014). Dessa forma, é necessário que a administração seja feita em doses
elevadas do fármaco, em regime continuo, a fim de garantir elevado teor de antimônio nos
tecidos e, assim, obter a eficácia do tratamento (Roberts, et al., 1998). Além de ser tóxica, a
administração via intravenosa do Glucantime® requer atendimento ambulatorial, o que dificulta
a adesão do paciente ao tratamento, aumentando o número de abandono dos casos e favorecendo
o surgimento de cepas resistentes (Croft et al., 2005).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
13
Dentre todas as drogas que são utilizadas para o tratamento das leishmanioses, os
antimoniais pentavalentes (Sb5+) são as que têm efeitos colaterais mais conhecidos (Rijal et al.,
2003). Alguns efeitos colaterais frequentes são: artralgias, mialgias, náuseas, vômitos, dores
abdominais, dor no local da aplicação, febre, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade,
nefrotoxicidade, pancreatite, além de toxicidade sobre o músculo-esquelético (MS, 2010b; MS,
2014). Estas alterações são observadas entre 10 e 50% dos casos (Navin et al., 1992).
Mesmo com todos esses fatores, a taxa de cura total com Sb5+ é maior que 90% na
maioria das áreas endêmicas do mundo onde não há resistência a este fármaco (WHO, 2010c).
Em casos de insucesso no tratamento com o antimonial pentavalente, como indicação restrita,
resistência ou falha terapêutica, opta-se por drogas de segunda escolha que são Anfotericina B e
Pentamidina, mesmo que estas também apresentem diversos efeitos colaterais (Tiuman et al.,
2011).
Figura 3: Estrutura química dos Antimoniais Pentavalentes (Sb5+) comercialmente disponíveis (Rath et al., 2003)
2.5 Anfotericina B
A anfotericina B (AmB) pertence ao grupo dos antibióticos poliênicos produzidos por
diferentes espécies de Streptomyces e foi obtida a partir do Streptomyces nodosus, isolado da
Bacia do rio Orinoco na Venezuela, em 1956 (Donovlick et al., 1955-1956). A anfotericina é
encontrada sob duas formas: A e B, sendo a B mais ativa e a única usada na terapêutica clínica.
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
14
Primeiramente, esse antibiótico foi usado no tratamento de infecções fúngicas (Vandeputte et al.,
1956). A primeira atividade leishmanicida da AmB foi demonstrada na década de 50, e a partir
daí vem sendo utilizada no tratamento da doença (Tiphine et al., 1999).
É um fármaco insolúvel em água e com pH neutro. A formulação licenciada para uso
na rotina clínica, produzida e comercializada pela Bristol-Myers Squibb desde 1958 como
Fungizon® é a mistura de anfotericina B com o detergente desoxicolato em tampão fosfato, que
promove a solubilidade da substância (Brajtburg & Bolard, 1996).
O mecanismo de ação deste fármaco decorre de sua ligação ao ergosterol, com
consequente alteração de permeabilidade de membrana e do equilíbrio osmótico do parasito
causando sua morte (Saha et al., 1986; Singh & Sivakumar, 2004). Nesse sentido, a AmB
apresenta grande afinidade pelo ergosterol, o principal esterol da membrana de fungos e dos
parasitos Leishmania spp, e menor afinidade pelo colesterol, o principal esterol da membrana de
mamíferos. A anfotericina B age formando micelas com o ergosterol e promovendo a formação
de canais transmembrana, que modificam a permeabilidade da membrana, com perda de íons e
outros componentes celulares levando a morte destes patógenos (Tiphine et al., 1999).
A descoberta de que Leishmania e fungos como Candida albicans possuem um esterol
substituído no carbono 24, geralmente sendo o ergosterol como produto final dos esteróis,
forneceu um motivo racional para se testar agentes antifúngicos contra esses protozoários
(Berman, 1992). Esse fato é o que provavelmente explica a eficácia da AmB contra Leishmania
spp. (Chappuis et al., 2007).
A AmB é a droga mais potente anti-Leishmania disponível, com efeito demonstrado
tanto in vitro quanto in vivo na destruição deste protozoário, tanto na forma promastigota quanto
amastigota (Thakur et al., 1994). No entanto, a AmB possui baixa capacidade de absorção
gastrointestinal e característica hidrofóbica, podendo também interagir em vias celulares de
mamíferos, causando disfunções, sendo seu principal efeito colateral a nefrotoxicidade (Motta &
Sampaio, 2012). Nesse sentido, o uso da Anfotericina B desoxicolato é limitado pela toxicidade,
em particular por cardiotoxicidade e nefrotoxidade cumulativas. Os efeitos colaterais mais
frequentes com o uso da Anfotericina B ocorrem principalmente durante a infusão venosa.
Dentre os efeitos colaterais que são demonstrados entre 70 a 90% dos pacientes durante o
tratamento, podemos destacar: febre, náuseas, vômitos, calafrios, hipotensão ou hipertensão,
comprometimento da função renal e redução de níveis séricos de potássio (Brajtburg & Bolard,
1996). Também pode-se observar hipopotassemia e flebite no local da infusão, que podem ser
atenuados ou evitados usando-se respectivamente antitérmicos, antieméticos, reposição de
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
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potássio e hidrocortisona. Porém, a presença dos sintomas descritos não contra indica a
administração da anfotericina B. Outros efeitos adversos menos frequentes, mas que
contraindicam seu uso são: anorexia, insuficiência renal, anemia, leucopenia e alterações
cardíacas (MS, 2007).
Por ser uma droga extremamente tóxica exige internação e monitoramento de funções
vitais, sendo uma terapia de alto custo (Kafetzis et al., 2005). A dose recomendada é de 0,5
mg/kg/dia com aumento gradativo até 1 mg/kg/dia conforme a tolerância do paciente. Deve ser
administrado via endovenosa com soro glicosado em dias alternados respeitando o limite
máximo de 3g para adultos e 15 a 15mg/kg de peso por criança (Brattacharya et al., 2004).
Figura 4: Estrutura química da Anfotericina B (Ganis et al., 1971)
Devido a grande atividade leishmanicida, a AmB tem se tornado alvo de intensas
pesquisas, com o objetivo de atenuar seus efeitos nefrotóxicos e aumentar seu poder terapêutico.
Sendo assim, a necessidade de redução dos efeitos colaterais com uso desse medicamento levou
ao desenvolvimento de formulações lipídicas com o fármaco (Murray, 2001).
Uma forma de tentar reduzir a toxicidade e resistência aos medicamentos
leishmanicidas, é desenvolver novas formulações com o objetivo de direcionar o medicamento
ao macrófago. A utilização de lipossomos vem sendo utilizada juntamente com a anfotericina B
objetivando a vetorização desta droga à célula alvo. Os lipossomos são sistemas carreadores de
fármacos, que são capazes de levar altas doses do medicamento até a célula alvo (Tempone &
Andrade, 2008). Dessa forma, a necessidade de excluir o desoxicolato como agente dispersante
abriu espaço às vesículas fosfolipídicas conhecidas como lipossomas. O objetivo, neste caso, era
encapsular o fármaco em sistemas lipídicos formando micelas que não o liberariam durante a
infusão e assim, as partículas lipídicas seriam removidas da circulação pelos fagócitos
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
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mononucleares, fornecendo grandes quantidades do fármaco nas células alvos infectadas
(Sundar, 2001b).
No final da década de 1990, novas formulações lipídicas de anfotericina B foram
desenvolvidas, visando diminuir sua toxicidade. A partir disso, vários estudos foram realizados e
novos nanofármacos foram desenvolvidos. Nas novas formulações, o desoxicolato foi
substituído por outros lipídios: Anfotericina B lipossomal - Ambisome® (Fujisawa, Deerfield,
IL/EUA), colesterol sulfato de Anfotericina B - Amphotec® (Sequs, MentoPark, CA/EUA) e
complexo lipídico de Anfotericina B -Albecet (Liposome Co, Princeton, NJ/EUA) (MS, 2006a).
A AmB lipossomal reduz os efeitos colaterais e apresenta excelentes índices de
eficácia terapêutica, inclusive em indivíduos sem resposta ao tratamento com antimoniais (Paula
et al., 2003). A partir de estudos conduzidos em centros de pesquisas de referência na Europa e
no Brasil, ambos supervisionados pelo FDA, foram obtidos dados suficientes que permitiram a
aprovação do Ambisome® em 1997 para o tratamento de pacientes imunocomprometidos com
LV (BRASIL, 2010b). A AmB lipossomal é considerada o melhor fármaco disponível para o
tratamento da LV e em muitos países da Europa e Estados Unidos é utilizada como a primeira
linha de tratamento (MS, 2006a). Apesar da elevada eficácia e menor toxicidade dessas novas
formulações lipídicas do fármaco no tratamento das leishmanioses, o alto custo inviabilizava seu
uso no sistema de saúde pública de países em desenvolvimento. No ano de 2007, a OMS
anunciou uma drástica redução do valor da droga, para que pudesse ser utilizada nos serviços de
saúde publica de países onde a LV é endêmica (Chappuis et al., 2007).
2.6 Miltefosina
Um importante avanço no tratamento das leishmanioses foi o desenvolvimento da
miltefosina, que foi o primeiro medicamento leishmanicida aprovado para administração por via
oral efetiva no tratamento da LV (Sundar & Murray, 2005; Dorlo et al., 2012). A Miltefosina
(hexadecilfosfocolina) é um alquifosfolipídeo e foi inicialmente desenvolvida como uma droga
para o tratamento do câncer (Unger et al., 1989). Porém, em 1987, Croft e colaboradores, pela
primeira vez, mostraram a atividade leishmanicida da miltefosina sobre L. donovani (Croft &
Coombs, 2003). O fármaco vem sendo utilizado na Índia para o tratamento de pacientes com
leishmaniose visceral refratária ao tratamento convencional com antimoniais, apresentando
resultados promissores (Sindermann et al., 2004).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
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A droga é comercializada pela empresa Paladin Labs, Inc., Montreal, Canadá, com o
nome comercial Impavido® (WHO, 2010c). Este fármaco ainda não está aprovado para uso
clínico no Brasil em humanos, principalmente pela sua baixa eficácia no tratamento da LVH
apresentado em um ensaio clínico norteado pelo Ministério da Saúde aqui no Brasil. No entanto,
alguns estudos têm revelado a eficiência desse fármaco em relação ao Sbv no tratamento de
Leishmaniose Cutânea na Bahia e Manaus, estados endêmicos para L. braziliensis e L.
guyanensis, respectivamente (Chrusciak-Talhari et al., 2011).
Recentemente, o Mapa e o MS publicaram uma Nota Técnica Conjunta n° 001/2016
MAPA/MS (NOTA TÉCNICA Nº 11/2016/CPV/DFIP/SDA/GM/MAPA, PROCESSO Nº
21000.042544/2016-94) autorizando o registro do produto MILTEFORAN, sob o número SP
000175-9.000003, de propriedade da empresa VIRBAC SAÚDE ANIMAL, para o tratamento da
leishmaniose visceral de cães. O licenciamento do medicamento foi emitido respeitando-se as
determinações da Portaria Interministerial n°1.426 de 11 de julho de 2008, que regulamenta o
tratamento de cães, proibindo tratamento da leishmaniose visceral canina com produtos de uso
humano ou não registrados no MAPA. O MS emitiu o Parecer Técnico favorável ao pleito, uma
vez que a Miltefosina, princípio ativo do medicamento, não é uma droga utilizada para o
tratamento da doença em humanos no Brasil e, de acordo com as evidências científicas geradas
até o momento, não apresenta eficácia para ser incorporada no protocolo terapêutico da
leishmaniose visceral humana. Cabe destacar que o tratamento de cães com LVC não se
configura como uma medida de saúde pública para controle da doença e, portanto, trata-se única
e exclusivamente de uma escolha do proprietário do animal, de caráter individual.
Apesar de mostrar resultados positivos para o tratamento da leishmaniose, seu uso é
limitado devido à eficácia variável em diferentes regiões geográficas do mundo, o que pode estar
intimamente relacionado as variações genéticas entre as cepas o que conferem diferentes graus
de resistência e suscetibilidade a este fármaco (Soto et al., 2008). Seu uso apresenta risco de
resistência devido ao seu longo tempo de meia vida, variando de 100 a 200 horas, no qual os
níveis do fármaco no plasma permanecem constantes após 26 dias de administração contínua
(Berman et al., 2006).
Os efeitos colaterais relacionados ao uso deste fármaco no tratamento da leishmaniose
são adversos, e entre os mais frequentes estão os gastrointestinais, tais como anorexia, náusea,
vômitos e diarreia, a maioria destes episódios é breve e o tratamento pode ser continuado. Ainda
apresenta efeitos como toxicidade hepática, renal e alergia na pele (WHO, 2010c). Outro fator
que limita o uso desse fármaco é o alto potencial teratogênico, dessa forma, o tratamento em
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
18
mulheres que não estejam gravidas é somente realizado nas pacientes que aceitem tomar
anticoncepcionais durante e três meses após o tratamento (Croft & Coombs, 2003). Além desses
problemas mencionados, ainda há a resistência facilmente obtida in vitro do fármaco em
linhagens de promastigotas de L. donovani, onde o aumento gradual da concentração de drogas
conduz a seleção de parasitos resistentes (Seifert et al., 2003). Esse fato indica que parasitos
resistentes, também podem ser selecionados durante o tratamento com a droga in vivo (Cojean et
al., 2012).
O mecanismo de ação da miltefosina ainda não foi completamente elucidado, mas em
células tumorais, o fármaco age induzindo apoptose e alterando as vias de sinalização celular
mediada por lipídios (Arthur & Bittiman, 1998). O mecanismo de ação sobre a Leishmania spp.
ainda não está bem esclarecido, mas sua atividade tem sido relacionada também a apoptose
celular do parasito (Verma & Dey, 2004). Outros estudos sugerem que o fármaco tem ação no
metabolismo de lipídeos do parasito (Rakotomanga et al., 2007).
Figura 5: Estrutura química da Miltefosina (Rath et al., 2003)
2.7 Outras Drogas
A pentamidina é uma substância com estrutura aromática derivada de diamidinas, que
apesar de ser tóxica para vários protozoários, mostra-se útil no tratamento de pacientes com
leishmaniose (Rath et al., 2003). Inicialmente, a atividade terapêutica era para o tratamento de
pacientes com pneumonia com infeção por Pneumocystis carinii, posteriormente mostrou-se
efetiva no tratamento da LV, passando a ser considerada uma droga no tratamento da doença, em
casos não responsivos aos antimoniais, mesmo que apresente efeitos colaterais adversos
significantes e sua administração seja parental (Singh & Sivakumar, 2004).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
19
Em relação às pentamidinas, dois sais são comercialmente utilizados no tratamento em
humanos: o Isotionato de pentamidina (Pentamidina®), disponível nos EUA e Europa, e o
Mesilato de pentamidina (Lomidine®), disponível apenas na Europa (Sands et al., 1985).
O uso deste medicamento como segunda opção para o tratamento da leishmaniose
visceral vem sendo abandonado devido a sua toxicidade e resistência do parasito na Índia, porém,
ainda pode ser usado para o tratamento de manutenção de co-infecção por HIV (Sundar, 2002).
Este fármaco apresenta diversos efeitos colaterais: dor, náuseas, vômito, tontura,
enrijecimento no local da aplicação, mialgias, toxicidade renal, supressão da medula óssea,
taquicardia, anorexia, distúrbios no metabolismo da glicose (hipoglicemia e hiperglicemia) entre
outros (Croft & Coombs, 2003). O efeito tóxico mais importante é o desenvolvimento de diabetes
insulino-dependente que ocorre em cerca de 10-15% dos casos, que pode se manifestar a partir da
administração total de 1g do fármaco. Outro problema do medicamento está relacionado às altas
concentrações encontradas nos rins, fígado e baço, meses após o tratamento (MS, 2014).
A paromomicina é um antibiótico aminoglicosídeo, também chamado aminosidina,
produzido pelo Streptomyces rimosus, utilizado em infecções bacterianas. Já demonstrou
capacidade de inibir o crescimento de diversos microrganismos, inclusive protozoários do gênero
Leishmania spp. (Iraji F & Sadeghinia, 2005). Inicialmente foi proposta como um tratamento
alternativo para a leishmaniose e testado em diversas preparações, associada com a gentamicina
ou com a monoterapia em diversos estudos para o tratamento de LC na Tunísia, Equador e
Panamá (Ben Salah, 2013). Para o tratamento de LV humana, o fármaco tem sido usado
principalmente na África e Europa (Chunge et al., 1989) e quando associado com o Pentostam®
obteve-se uma taxa de cura acima de 82% (Berman, 1997). Mesmo sendo uma medicação
administrada via intramuscular, a paramomicina ainda é considerada uma alternativa terapêutica
com grande eficiência em menor tempo de tratamento e menor custo que os demais medicamentos
disponíveis (Sundar et al., 2007).
Embora apresente baixa toxicidade comparada aos outros fármacos mencionados,
pode apresentar efeitos colaterais como nefrotoxicidade, ototoxicidade e hepatotoxicidade. O
fármaco também apresenta riscos de afetar o oitavo par de nervos cranianos, o que pode levar o
paciente a ter problemas de controle motor e de equilíbrio (Berman, 1998). Outro efeito colateral é
a possibilidade de causar surdez irreversível e uma desvantagem é a contra indicação durante a
gravidez (Maarouf et al., 1998).
O alopurinol, um análogo da hipoxantina, que inibe o catabolismo das purinas em
mamíferos e o anabolismo em patógenos do gênero Leishmania spp. (Soares-Bezerra et al., 2004).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
20
Este fármaco apresenta atividade citotóxica seletiva aos parasitos da Leishmania, que apresentam
deficiência de enzimas que sintetizam purinas, precisando assim, de purinas pré-formadas do
hospedeiro para que possam sobreviver (Singh & Sivakumar, 2004). Geralmente, este
medicamento possui baixa toxicidade, no entanto, é ineficaz no controle da infecção quando
usados de forma isolada (Rath et al., 2003), apresentando aumento da eficácia do tratamento
quando utilizado em combinação com outras drogas (Pasa et al., 2005), associado normalmente
com antimônio pentavalente (Blum et al., 2004).
A azitromicina foi desenvolvida no final dos anos 80 e utilizada no tratamento de
infecções bacterianas como tracomas, ateroscleroses, úlcera péptica, infecções gastrointestinais e
infecções do trato respiratório. Além disso, tem sido usada contra protozoários como Leishmania
sp, Plasmodium sp e Toxoplasma gondii (Pechère, 2001). A azitromicina apresenta a vantagem de
se concentrar nos tecidos, especialmente em macrófagos, com níveis 100 a 200 vezes maiores que
as concentrações encontradas no soro. Esse fármaco apresenta a possibilidade de ser administrado
tanto por via oral quanto injetável, além de ser considerado relativamente seguro para o tratamento
em crianças e mulheres gravidas, uma vez que, demonstra baixo perfil de toxicidade (Krolewiecki
et al., 2002). Mesmo sendo ativo para algumas Leishmanias, este fármaco apresenta atividade
inferior a do antimoniato de meglumina para o controle de lesões e ambos os fármacos
(azitromicina e antimoniato de meglumina) não promovem a esterilização dos parasitos da lesão
(Sinagra et al., 2007).
Os azóis pertencem à classe de antifúngicos e vem sendo testados e avaliados quanto a
sua atividade leishmanicida. Esse grupo tem demonstrado ser efetivo no tratamento das
leishmanioses cutâneas. São representados pelos imidazóis, que incluem o cetoconazol,
itraconazol, fluconazol e as alilaminas (terbinafina) (Alrajhi et al., 2002). O mecanismo de ação
dos compostos azóis baseia-se no bloqueio do metabolismo do ergosterol (Colombo et al., 2002).
Estudos demonstraram que o emprego de cetoconazol, fluconazol, itaconazol, terbinafina e
metronidazol no tratamento de LV por L. infantum apresentam-se com uma variação na
susceptibilidade aos fármacos. Nenhum desse azóis foi considerado mais efetivo que a terapia com
o antimoniato de meglumina (Gangneux et al., 1999). Durante o tratamento, os efeitos colaterais
observados foram náuseas e vômitos, e isso ocorria quando a dosagem era superior a 10mg/kg/dia
(Van Voorhis, 1990).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
21
Figura 6: Outras drogas empregadas na terapia da leishmaniose. (Rath et al., 2003; Silva, 2005; Pereira, 2007)
2.8 Terapia Combinada
O grande desafio ao longo dos anos tem sido o desenvolvimento de drogas mais
eficazes, menos tóxicas, com terapia curta e de baixo custo. Dentre as muitas tentativas que já
foram feitas, talvez uma das mais promissoras seja a terapia combinada, que desde a década de
80 vem sendo investigada com forte estímulo da organização mundial de saúde (Croft &
Coombs, 2003; Sesana, 2009).
Com o objetivo de melhorar a terapêutica da leishmaniose, a Organização Mundial da
Saúde – OMS, tem recomendado e incentivado a estratégia da associação de fármacos (WHO,
2012). Dessa forma, nos últimos anos, o uso da associação vem crescendo entre os especialistas
na área de quimioterapia da leishmaniose (Croft et al., 2006a). Uma das razões para o interesse
na combinação é que a associação de fármacos que pertencem a diferentes classes químicas pode
permitir um aumento na eficácia da terapia, acompanha da redução da dose e tempo de
tratamento, resultante de um efeito sinérgico destas associações, o que reflete na diminuição da
toxicidade e maior aceitação do paciente (Van Griensver et al., 2010).
Fórmula Estrutural Nome Químico/ Comercial
Isetionato de Pentamidina®
Lomidina
Paramomicina®
Humatin
Azitromicina
Cetoconazol
Azóis
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
22
A terapia combinada pode ajudar a evitar e/ou retardar o aparecimento de resistência e
aumentar a vida útil dos fármacos, como tem sido observado para o tratamento de algumas
doenças como tuberculose, malária e AIDS (Mitchison & Davies, 2012). Um dos pontos
considerados mais importantes para os pesquisadores no estudo das combinações é a busca por
resultados satisfatórios para casos mais complicados, como em pacientes co-infectados com
HIV, no qual o tratamento com a monoterapia tem sido inadequado (Alvar, et al., 2008)
Muitos estudos clínicos têm investigado a terapia combinada, principalmente na Índia
e África em pacientes com LV, utilizando os fármacos disponíveis para o tratamento da
leishmaniose, como SBv, anfotericina B, miltefosina, paramomicina e imunomoduladores
(Omollo et al., 2011). Apesar da proposta e recomendação pela OMS da combinação terapêutica
entre os fármacos leishmanicidas, antes de serem introduzidas na rotina prática, estas devem ser
confirmadas como seguras e eficazes em ensaios clínicos (WHO, 2012).
2.9 Novas Formulações
Com o aumento da resistência aos antimoniais pentavalentes e aos fármacos de
segunda geração aqui mencionados, a busca por novos fármacos leishmanicidas tem se
intensificado, além disso, o numero de quimioterápicos disponíveis, principalmente para
tratamento de doenças crônicas está abaixo do satisfatório (Vouldoukis et al., 2006). A ausência
de uma vacina eficaz contra a LV humana leva a uma necessidade urgente de fármacos mais
efetivos que sejam capazes de complementar ou até mesmo substituir as drogas de uso frequente
no tratamento da doença (Rocha et al., 2005). Frente à necessidade de novos fármacos para o
tratamento de doenças parasitárias, a OMS vem incentivando o estudo de novos compostos
sintéticos ou naturais que possam abrir novas perspectivas para o desenvolvimento de
medicamentos mais eficazes (WHO, 1990).
O desenvolvimento dos compostos sintéticos e seus derivados representam uma forte
estratégia na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que, estes compostos
nos disponibilizam maior viabilidade de produção industrial por meio de sínteses químicas, bem
como uma redução do custo (Tiuman, et al., 2011). Neste cenário, o presente estudo buscou
avaliar a citotoxicidade e a ação leishmanicida in vitro de diferentes derivados químicos
originados de duas classes de compostos sintéticos: as aldiminas e os adutos de Hantzsch.
2.10 Aldiminas
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
23
As aldiminas também são conhecidas como bases de Schiff, e compreendem uma das
classes mais valiosas de substâncias orgânicas (Schiff, 1864).
As aldiminas são compostos obtidos por meio de condensação entre aldeídos e aminas
primárias e apresentam diversas aplicações nos campos da Química. Estes compostos são
amplamente utilizados para fins industriais e possuem uma ampla gama de atividades biológicas
(da Silva et al., 2011a). Desde o primeiro relato da preparação das sínteses de aldiminas em
1864, feita por Hugo Schifft, diversos métodos têm sido estudados e descritos para a sua
obtenção (Zheng, et al., 2009). A síntese clássica desse composto, conforme descrita por Schifft,
consiste na condensação sob a destilação azeotrópica, possibilitando de maneira mais simples a
remoção da água residual, que é liberada durante a reação e consequentemente, deslocando o
equilíbrio no sentido de formação dos produtos. Essa estratégia permite a obtenção de Aldiminas
a partir de uma grande variedade de substratos (da Silva et al., 2011a).
A busca por novas metodologias sintéticas ambientalmente corretas tem recebido uma
forte atenção em laboratórios de pesquisas, possibilitando assim, o desenvolvimento de novas
técnicas para a obtenção de aldiminas. Com isso, o uso da radiação de microondas também
recebeu importante destaque, pois facilitou a obtenção de Aldiminas em rendimentos muitas
vezes superiores aos observados no aquecimento convencional e, principalmente uma
diminuição no tempo das reações (Rathelot et al., 1995).
As aldiminas são substancias conhecidas por apresentarem propriedades biológicas
notáveis, que incluem ação leishmanicida (Al-Kahraman et al., 2010), antifúngica (Magalhães et
al., 2013), antibacteriana (Shi et al., 2007), entre outras. Al-Kahraman e colaboradores, em
2010, testaram uma série de compostos químicos de azometinas, que são sintetizados a partir de
reações de aminas aromáticas primárias. As azometinas sintetizadas foram avaliadas quanto as
suas propriedades leishmanicida in vitro, utilizando cepas promastigotas de L. major. Os
R1, R
2 = Alquil ou Aril
R2
R1
H
C = N
Figura 7: Estrutura Geral das aldiminas (da Silva et al., 2011b)
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
24
resultados demonstraram que esses compostos sintetizados demonstraram atividade significativa
contra o parasito, pois inibiram o crescimento do parasito e apresentaram ação altamente potente
em relação às promastigotas de L. major. Dessa forma, a elevada atividade leishmanicida destes
compostos sintéticos demonstrados no trabalho de Al-Kahraman e colaboradores, torna-os
promissores para o desenvolvimento de agentes terapêuticos eficazes para a leishmaniose.
Dentre os vários compostos sintetizados a partir das aldiminas, utilizamos nesse
trabalho os compostos químicos que correspondem às siglas: 3H7, 3H8, 3H9, 3D7, 3G2, 3I4 e
3I5.
2.11 Adutos de Hantzsch
Durante as últimas décadas, em meio à comunidade científica, vem aumentando a
consciência ambiental em busca do desenvolvimento de novas metodologias que visem à
diminuição de energia que é usada no momento de produção e que haja menos desperdício, tanto
de matéria-prima quanto de solventes orgânicos (Horvath & Anastas, 2007).
A busca por novas sínteses orgânicas e novas metodologias que fossem capazes de
produzir moléculas inéditas, gastar menos tempo para atingir a molécula alvo, ter menor custo de
produção e menor impacto ambiental, possibilitou maior espaço ás Reações Multicomponentes
(RMC’s), em diversos laboratórios de pesquisas e na indústria farmacêutica, pois apresentavam
as devidas características, além da facilidade em procedimentos experimentais (Dömling & Ugi,
2000).
As primeiras reações multicomponentes foram feitas na segunda metade do século
XIX, com as reações de Strecker (1850), Hantzsch (1882) e Passerini (1921), porém, somente
em 1959, com o trabalho de Dömling e colaboradores, que o conceito de RMC’s apareceu como
uma ferramenta importante na área da química orgânica sintética (Dömling & Ugi, 2000).
Esta ferramenta de RMC’s tem mostrado uma nova possibilidade e nova alternativa
para a indústria farmacêutica relacionada à pesquisa e descobertas de moléculas, com ampliação
de variações estruturais de compostos químicos que apresentem possível atividade biológica
(Bienaymé et al., 2000). Atualmente, é conhecida uma gama de compostos químicos obtidos a
partir de RMC’s que tem como objetivo a obtenção de compostos com alto potencial de
atividade biológica, utilizados para sínteses de grupos farmacoforicos (Dömling & Ugi, 2000).
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
25
O protocolo dos adutos de Hantzsch foi reportado em 1882 na síntese de 1,4-
dihidropiridinas a partir da ciclocondensação do acetaldeído (1), amônia (2) e dois equivalentes
de acetoacetato de etila (3) (Wendler, 2010).
Figura 8: Síntese da 1,4-dihidropiridinas de Hantzsch (Wendler, 2010)
Pacheco et. al., em 2013, reportou a síntese de 1,4 dihidropiridinas catalisadas pelos
ácidos cítrico e lático, que são biodegradáveis e não apresentam toxicidade. Uma característica
importante na RMC’s de Hantzsch é que dependendo dos reagentes utilizados, o subproduto
formado é apenas água (de Souza, 2010). Os compostos derivados de 1,4 dihidropiridinas tem
ampla atividade biológica, incluindo medicamentos que contem o grupo farmacofórico, tais
como a Nifedina e Nicardina, entre outros (Gordeev et al., 1996), além de serem antidiabéticos
(Debache, et al., 2009), anti-leishmaniose (Reimão et al., 2010), antiviral (Hilgeroth, 2002) e
anti-Alzheimer (Edraki, et al., 2009).
Considerando as múltiplas atividades biológicas dos bloqueadores dos canais de cálcio
e a elevada versatilidade das 1,4 dihidropiridinas, Reimão e colaboradores, em 2010, realizaram
testes de citotoxicidade in vitro contra parasitos de leishmania e T. cruzi, com 8 compostos desse
grupo que já são utilizados (azelnidipina, amlodipina, cilnidipina, lercanidipina, nicardipina,
nifedipina, nimodipina e nitrendipina).
No estudo feito por Reimão, a citotoxicidade foi avaliada utilizando células de rim de
macaco (LLC-MK2) incubadas em microplacas de 96 poços, juntamente com os fármacos, com
concentração mais elevada de 200 µg/ml, por 48 horas. A viabilidade destas células foi avaliada
por MTT e confirmada por análise morfológica, por microscopia ótica comparando ao grupo
controle. Os resultados demonstraram que os compostos testados foram eficazes contra as formas
promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.)
chagasi, e Leishmania (L.) major e forma amastigota de L. (L.) chagasi, com valores de
concentração inibitória de 50% (IC50) na gama de 2,6-181 µM. As 1,4-di-hidropiridinas foram
ativas contra os promastigotas e amastigotas de L. (L.) chagasi, agente de Leishmaniose visceral
na América Latina.
H
O
O
OO O
O
NH
O
O
NH3
+
2
álcool 6-20h
(1)(2)
(3)
(4)
Salomão, N.E.O. Revisão da Literatura
26
Com base nas curvas dose-resposta, obtiveram valores de IC50 na gama de 2,61-146,41
µM após 24 horas de incubação com L. (L.) chagasi na forma promastigota. A atividade dos
compostos testados contra amastigotas intracelulares de L. (L.) chagasi resultou em valores de
IC50% próximos a promastigotas, na gama de 5,35-176,24 µM, confirmando a atividade anti-
Leishmania destes compostos. Utilizou-se antimônio pentavalente como fármaco de referência,
obtendo um valor IC50 de 82,32 µM contra amastigotas intracelulares.
Outro estudo que corrobora resultados de eficácia dos compostos químicos sintéticos
em atividades leishmanicidas, foi realizado por Palit e Ali, em 2008, no qual as 1,4-di-
hidropiridinas amlodipina e lacidipina demonstraram sucesso ao inibir a infecção in vitro de L.
donovani e em camundongos BALB/c. A amlodipina demonstrou atividade in vitro e in vivo
contra L. (L.) donovani, com um efeito oral promissor a 10 mg / kg num modelo de hamster,
mostrando assim, a versatilidade deste grupo de compostos sintéticos.
Com base em resultados já demonstrados anteriormente, utilizamos neste estudo,
vários compostos sintetizados a partir dos adutos de Hantzsch, que correspondem às siglas: 8A2,
8A3, 8A4, 8B5 e 8B6.
3 JUSTIFICATIVA
Salomão, N.E.O. Justificativa
28
A LV é uma doença negligenciada, considerada problema de saúde pública e
responsável por altos índices de óbitos em países da América Latina, África e Ásia. Não existe
um esquema terapêutico único aplicável a todas as formas de leishmaniose existentes ao redor do
mundo. Esquemas terapêuticos estudados em determinadas regiões costumam ser aplicados para
tratar populações residentes em outras áreas geográficas, com resultados variados (Vasconcellos,
2013). As intervenções terapêuticas nessa doença dependem de medicamentos altamente tóxicos
com diversos efeitos colaterais. Atualmente, um dos maiores desafios para minimizar a crescente
expansão e urbanização da doença está baseado na busca de novos fármacos que possam
substituir os já existentes empregados como primeira escolha, visto que um dos problemas é o
pequeno arsenal terapêutico disponível no mercado para uso na quimioterapia da LV, pois já
existe um grande número de pacientes não responsivos ao tratamento convencional e, para todos
os fármacos, há relatos de cepas resistentes do parasito. Dessa forma, a OMS tem incentivado o
desenvolvimento de novos compostos químicos abrindo diversas perspectivas para a pesquisa de
medicamentos mais eficazes contra a LV. Dentro da perspectiva de desenvolvimento de novos
fármacos ou compostos, temos um problema inerente aos testes inicias in vitro de seleção de
potenciais fármacos. Os testes in vitro para seleção de drogas leishmanicidas são muito
trabalhosos, caros e de difícil padronização, execução e reprodutibilidade, limitando ainda o
número de potenciais drogas que podem ser testadas simultaneamente. Uma nova aposta para
otimização dos testes in vitro de potenciais drogas leishmanicidas é o emprego de cepas de
Leishmania fluorescentes transfectadas com genes repórter para proteínas fluorescentes (GFP,
RFP, entre outras), que visam aprimorar e ampliar as técnicas de avaliação in vitro empregando
metodologias e ferramentas automatizadas, tais como a citometria de fluxo.
Nesse sentido, o presente estudo buscou avaliar a citotoxicidade e o potencial
leishmanicida dos compostos químicos dos grupos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch
através de metodologias de testes de drogas in vitro clássicas, bem como empregando a
citometria de fluxo. Acreditamos que os resultados gerados no estudo abrem novas perspectivas
para o avanço no desenvolvimento de novos fármacos para LV, além do desenvolvimento de
metodologias in vitro mais acuradas e dinâmicas para o reconhecimento e direcionamento de
potencias drogas anti-LV e que possam direcionar para o prosseguimento de quimioterapia
experimental in vivo.
4 OBJETIVOS
Salomão, N.E.O. Objetivos
30
4.1 Objetivo Geral
Avaliar a citotoxicidade e a atividade leishmanicida in vitro em promastigotas e
amastigotas de L. infantum dos diferentes compostos químicos de aldiminas e de adutos de
Hantzsch.
4.2 Objetivos Específicos
Os objetivos específicos deste estudo foram divididos em duas etapas, conforme descritos a
seguir:
1ª Etapa: Testes de drogas clássicos in vitro
• Avaliar a citotoxicidade dos diferentes compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch)
em macrófagos murinos da linhagem (J774.A1) e macrófagos caninos da linhagem (DH82),
através do ensaio de MTT;
• Avaliar a atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) na
forma promastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum, através do ensaio de MTT;
• Avaliar a atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) na
forma amastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum em macrófagos caninos (DH82) por
microscopia ótica;
2ª Etapa: Testes de drogas in vitro por citometria de fluxo
• Realizar a transfecção por gene repórter para GFP em promastigotas de L. infantum da cepa
OP46;
• Avaliar da atividade leishmanicida dos compostos químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch)
na forma amastigota da cepa OP46 de Leishmania infantum transfectada com gene repórter para
GFP em macrófagos caninos (DH82) por citometria de fluxo.
5 MATERIAL E MÉTODOS
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
32
5.1 Organismos e células
5.1.1 Cultivo de Leishmania infantum
No presente estudo foi utilizada a cepa Leishmania (Leishmania) infantum
(MCAN/BR/2008/OP46) isolada de cães procedentes de área endêmica (Governador Valadares,
MG) por nosso grupo de pesquisa. As células nas formas promastigotas foram inicialmente
criopreservadas em nitrogênio líquido no Laboratório de Imunopatologia/NUPEB-UFOP. Para
uso, as células foram descongeladas e cultivadas em meio líquido Liver Infusion Tryptose – LIT
(CAMARGO, 1964), em tubo de 15 mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA) e mantidas em
Estufa B.O.D. a temperatura de 25º C, durante sete dias para atingirem a fase estacionária de
crescimento. A cultura foi “repicada” para outros dois tubos de 15 mL (Falcon®, Becton
Dickinson, EUA) utilizando 1 mL de cultura contendo entre 107 a 108 promastigotas/mL e
adicionados a 3 mL de meio LIT. Após 7 dias foram “repicadas” novamente, adicionando 10ml
de meio LIT em cada tubo de 15 ml (Falcon®, Becton Dickinson, EUA). Após os sete dias de
cultivo, contendo entre 107 a 108 promastigotas/mL, as culturas foram novamente “repicadas” e
transferidas para Erlemeyer de 250 ml, na proporção de 10 ml de cultura de Leishmania para 30
ml de meio LIT, mantidas por mais sete dias nas mesmas condições até o momento do uso.
Durante esse período as culturas eram examinadas, e as promastigotas avaliadas ao microscópio
ótico quanto á sua morfologia, percentual de morte e ausência de contaminação, para que então
os parasitos fossem re-inoculados em um novo Erlemeyer de 250 mL, sendo feito um repique
semanal destas células, até no máximo de 10 passagens (P10) em meio de cultura.
5.1.2 Cultivo dos macrófagos imortalizados
As células de macrófagos caninos da linhagem DH82 (DS Pharma Biomedical, Osaka,
Japan) e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1 (Banco de Dados de Células do Rio de
Janeiro – BCRJ) estavam inicialmente preservadas em nitrogênio líquido no criobanco do
Laboratório de Imunopatologia/UFOP. Para uso, as células foram descongeladas e cultivadas em
garrafas de cultura de 160 mL (Nunc, Roskilde, Denmark) com 40 mL de meio RPMI 1640
Medium (SIGMA) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino - SFB (Vitrocel Embriolife,
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
33
Campinas, SP) mantidas em Estufa com 5% de CO2, a 37º C. Para a manutenção das células, a
cada três dias era realizada a troca do meio das garrafas e a cada sete dias as mesmas eram
“repicadas”.
5.1.3 Transfecção das promastigotas de L. infantum cepa OP46 com o Gene Repórter
GFP
5.1.3.1 Plasmídeo pIR1-SAT
O plasmídeo contendo o gene da proteína GFP (pIR1-SAT) foi transfectado seguindo
o protocolo do Dr. Stephen M. Beverley, da Washington University, St. Louis (USA). Para a
estratégia de seleção, utilizou-se o gene NAT, que codifica a acetil transferase em pIR1-SAT e
confere melhor resistência para diversas espécies de Leishmania. Existem dois locais de
expressão em pIR1-SAT, localizados nos sítios SmaI ou "a", e Bg/II ou "b". Ambas são
flanqueadas por regiões intergênicas de Leishmania fornecendo informação para trans-splicing e
poliadenilação e ambos os locais produzem altos níveis de expressão. Foi selecionado o sítio de
inserção usando SmaI, pois confere maior expressão em formas amastigotas. Durante o
procedimento, a reação plasmídica foi digerida com SwaI para obter, de forma linear, o
fragmento a ser incluído no genoma do parasito. A transfecção em Leishmania infantum e a
seleção para expressão SAT produz parasitos onde a construção substitui uma cópia do gene
SSU (small subunit RNA gene in rDNA locus– subunidade pequena do gene no locus do DNA
ribossomal) e adquiri o promotor RNA polI ribosomal, conduzindo à transcrição em níveis
elevados. Para a construção plasmídica pIR1-SAT foi utilizada a concentração de 235 ng/mL
volume necessário para fornecer plasmídeo suficiente para realização de duas transfecções. O
plasmídeo foi então incubado over night, a temperatura de 25°C. Posteriormente 200 ng (1 µL)
de plasmídeo digerido e 200 ng (x µL) de plasmídeo não digeridos foram colocados em gel de
agarose a 0,7% com brometo de etídio . Após análise para verificação se a digestão estava
completa, o plasmídeo digerido com SwaI foi armazenado a 4°C até estar pronto para a
transfecção.
Para a transfecção foram cultivadas cepas de L. infantum OP46, em volume de 10 ml
de cultura, em concentração de 106 células/mL, incubadas a temperatura de 26°C. Os parasitos
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
34
na forma promastigotas foram transfectados, cerca de 5 dias após a incubação, quando a cultura
atingiu a fase logarítmica de 8 x 106 células/mL.
5.1.3.2 Eletroporação de Leishmania infantum
Após as promastigotas atingirem a fase logarítmica na concentração ideal de 8 x 106
células/mL, as mesmas foram centrifugadas a 2600 rpm, 25°C durante 5 minutos. Em seguida o
sobrenadante foi retirado e adicionados 15 mL de Cytomix para nova centrifugação. O
sedimento foi ressuspendido novamente em Cytomix para uma concentração de 1x108 de
células/ml. Foram utilizadas 3 cubetas de eletroporação (com abertura de 0,4cm) para realização
do procedimento. Em uma cubeta foi adicionado 50 µL de Cytomix e em outras duas 50 µL do
plasmídeo digerido com 20 µg de SwaI . Em cada cubeta foram adicionados 500 µL (na
concentração de 1x108 de células/mL) de solução contendo L. infantum com Cytomix e agitadas
suavemente para homogeneização. Os parasitos foram então eletroporados a 1500 V por duas
vezes, com intervalos de 10 segundos entre cada eletroporação. Após 24 horas da eletroporaçcão,
cada amostra foi colocada em 10 mL de meio M199 contendo 100 ug/mL antibiótico
Nourseothricin (NTC, Nurseotricin, Nourseotricin, clonNAT, da USBiological) e incubada
durante a noite, em temperatura de 26°C (Ha et al., 1996). As culturas foram mantidas em
pressão em meio líquido por 15 dias, monitorando o controle sem DNA (Mock), até que o
mesmo demonstrou perda de viabilidade celular (analisado por microscopia ótica).
Seguinte a incubação, um volume de 1,8 mL das amostras foram retirados e
transferidos para microtubos com capacidade de 2 mL. As amostras foram centrifugadas a 2000
rpm durante 2 minutos e o sobrenadante descartado, assim o sedimento de células foi
ressuspendido em meio LIT, expandidas e levadas a análise por fluorescência.
5.1.3.3 Avaliação da fluorescência por citometria de fluxo
A avaliação da produção de fluorescência da proteína GFP dos parasitos L infantum
cepa OP46 transfectados foi realizada a partir confecção de lâminas a fresco, das culturas de
promastigotas de L.infantum OP46 GFP em meio LIT, para visualização em microscópio de
fluorescência Zeiss Imager. Z2 AXIO, sendo as imagens armazenadas em arquivo eletrônico
(imagens não mostradas).
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
35
Também para confirmação da fluorescência foi feita a análise em Citômetro de Fluxo
FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, EUA). Com o intuito de comparar a fluorescência
das promastigotas normais com as transfectadas com o gene repórter para GFP, um volume de
100 µL das culturas de promastigotas de L.infantum OP46 e OP46GFP foram transferidos para
tubos de poliestireno (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) de 12x75mm, adicionados 2mL
de PBS para lavagem, seguida de centrifugação a 3000 rpm, 10 minutos, 24ºC. Em seguida o
sobrenadante foi descartado e as leishmanias ressuspendidas em 200 µL de PBS para leitura e
análise no Citômetro de Fluxo.
Os parâmetros de tamanho e granulosidade na citometria de fluxo foram utilizados
para avaliação biológica da transfecção e verificação de alterações de sua morfologia. A emissão
de fluorescência da cepa normal e da cepa GFP foi comparada pela quantificação da intensidade
média de fluorescência (MFI) emitida no Citômetro de Fluxo, com intuito de confirmar o
sucesso da transfecção dos parasitos (Figura 9). O número de eventos da aquisição de
promastigotas no citômetro FACSCalibur foi de 100.000, e os dados gerados foram analisados
pelo software FlowJo.
Figura 9: Avaliação da morfologia e fluorescência de promastigotas de Leishmania infantum OP46 e
OP46GFP por citometria de fluxo. Na parte superior e inferior á esquerda da figura, estão representados os
gráficos de tamanho (FSC) x granulosidade (SSC), respectivamente, eixo x e y, para avaliação da morfologia das
promastigotas. No cento da figura estão representados os gráficos de histograma para a fluorescência FL-1, das
respectivas populações de promastigotas no “gate” R1 nos gráficos FSC x SSC, onde avaliamos a intensidade
média de fluorescência das populações (MFI) de promastigotas normais OP46 (MFI: 11,4) e transfectadas com
gene repórter Op46 GFP (MFI: 1021). Na direita da figura está representado o gráfico de histograma para FL-1
das duas populações simultaneamente, demonstrando a diferença de MFI e do deslocamento no eixo (FL-1) enre
as duas populações Op46 (cor vermelha) e a OP46 (cor azul).
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
36
5.2 Compostos químicos: aldiminas, adutos de Hantzsch e Anfotericina B Desoxicolato
de Sódio
Os compostos químicos avaliados (aldiminas e adutos de Hantzsch) foram gentilmente
cedidos pelo Prof. Ângelo de Fátima, do Instituto de Ciências Extas (ICEx) da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG). No presente estudo foram testados 12 compostos, sendo um
grupo (n=7) de derivados sintéticos de aldiminas, representados pelas siglas: 3D7, 3G2, 3H7,
3H8, 3H9, 3I4 e 3I5; e um grupo de derivados sintéticos de adutos de Hantzsch (n=5), sendo os
compostos representados pelas siglas: 8A2, 8A3, 8A4, 8B5 e 8B6. As informações referentes aos
compostos químicos, pertencentes a estes grupos, como desenvolvimento, composição química,
peso molecular, entre outras, estão demonstradas no Anexo 1.
Inicialmente os compostos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch foram
mantidos em freezer á temperatura de -20°C até o momento de uso. As diluições dos compostos
foram realizadas em meio RPMI 1640 com 10% de SFB e filtradas em filtro para seringa
0,22µm (Prolab), de modo a obter amostras nas concentrações: (C1: 500 µg/ml; C2: 400 µg/ml;
C3: 300 µg/ml; C4: 200 µg/ml; C5: 100 µg/ml; C6: 50 µg/ml; C7: 25 µg/ml; C8: 12,5 µg/ml; C9:
6,25 µg/ml; C10: 3,125 µg/ml; C11: 1,5625 µg/ml; C12: 0,78125 µg/ml; C13: 0,390635 µg/ml). As
diluições da Anfotericina B Desoxicolato de Sódio (AmB-D) também foram feitas, sempre
previamente antes dos experimentos, em meio RPMI 1640 com 10% de SFB afim de obter
amostras nas concentrações: (C3’: 250 µg/ml; C4: 200 µg/ml; C5: 100 µg/ml; C6: 50 µg/ml; C7:
25 µg/ml; C8: 12,5 µg/ml; C9: 6,25 µg/ml; C10: 3,125 µg/ml; C11: 1,5625 µg/ml; C12: 0,78125
µg/ml; C13: 0,390635 µg/ml). As diluições foram mantidas em geladeira á temperatura de 0°-
10°C durante o período de uso das amostras.
5.3 Delineamento experimental
O delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste trabalho
está representado na Figura 10.
Primeiramente foi realizado o ensaio de citotoxicidade empregando a técnica do MTT
em macrófagos caninos da linhagem DH82 e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1, com
intuito de determinarmos o valor da concentração do IC50% para cada um dos 12 compostos
químicos (aldiminas e adultos de Hantzsch) com potencial leishmanicida. O valor da IC50
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
37
encontrado para os diferentes compostos testados foi empregado nos testes subsequentes para
determinação do potencial leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas de L. infantum.
O potencial leishmanicida em formas promastigotas da cepa OP46 de L. infantum foi
determinado através do ensaio de MTT em placas de 96 poços, onde as culturas em fase
estacionária de crescimento foram encubadas com as diferentes drogas por tempos de 24, 48 e 72
horas.
Para determinação do potencial leishmanicida em formas amastigotas de L. infantum
foram empregadas duas metodologias: ‘‘clássico’’ e ‘‘citometria de fluxo’’. Na metodologia aqui
denominada ‘‘convencional’’, macrófagos caninos imortalizados da linhagem DH82 foram
incubados em lâminas do tipo chamber slide TM (Lab-Tek) com promastigotas de L. infantum por
24 horas (para internalização das formas promastigotas e diferenciação em formas amastigotas
no interior dos macrófagos). Após esse período, os poços foram lavados para retirar as formas
promastigotas não internalizadas e foi realizada a incubação com as respectivas concentrações
dos valores de IC50, previamente determinadas para cada um dos diferentes compostos testados,
durante o período de 24, 48 e 72 horas. Em cada um desses tempos avaliados, as Chamber
SlideTM (Lab-Tek), foram retiradas da estufa e a parte superior destacada para realizar a
coloração por Giemsa, fixação das lâminas para a contagem em microscópio ótico para
determinação do percentual de macrófagos infectados, além da frequência do número de
amastigotas por macrófagos infectados, tanto para os 12 compostos químicos testados, bem
como para o controle positivo sem tratamento e para o controle com Anfotericina B-
desoxicolato.
Com o intuito de aprimorarmos a capacidade de detecção do número de macrófagos
infectados e verificarmos com maior precisão a verdadeira contribuição na redução no número
de macrófagos infectados após incubação com os diferentes compostos testados, empregamos a
cepa OP46 de L. infantum transfectada com gene reporte para GFP juntamente com a citometria
de fluxo. Nesse sentido, macrófagos da linhagem DH82 foram incubados com a cepa OP46 de
L. infantum GFP em tubos de poliestireno por 24 horas (para internalização das formas
promastigotas e diferenciação em formas amastigotas dentro dos macrófagos), após esse período
as formas promastigotas não internalizadas foram retiradas por lavagem e centrifugação e então
foi realizada a incubação com as respectivas concentrações dos valores de IC50, previamente
determinadas para cada um dos diferentes compostos testados, durante o período de 24, 48 e 72
horas. Em cada um desses tempos avaliados foram retirados tubos para leitura em citômetro de
fluxo, para determinação do percentual de macrófagos infectados, tanto para os 12 compostos
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
38
químicos testados bem como para o controle positivo sem tratamento e para o controle com
Anfotericina B.
5.4 Ensaio de citotoxicidade
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados utilizando as células de macrófagos
caninos da linhagem DH82 e de macrófagos murinos da linhagem J774.A1, a partir do método
colorimétrico de MTT, conforme protocolo proposto por MOSMANN (1993) e adaptado por
Valadares et. al (2012). Esses testes permitiram a identificação do IC50 de cada droga testada
para que fossem posteriormente realizados os testes de atividade leishmanicida em formas
promastigotas e formas amastigotas (internalizadas em macrófagos).
L. Infantum OP46Promastigota
+
Compostos químicos [IC50]
MTT
Formas promastigotas
Delineamento Experimental
Atividade Leishmanicida
Infectividade in vitro(Clássica)
Infectividade in vitro(Citometria de Fluxo)
+
Avaliação in vitroda citotoxicidade
Mø J774.A1 / Mø DH82
+
aldiminas e a. Hantzsch –12 concentrações
MTT
Determinação do [IC50]
Formas amastigotas
Mø DH82 + L. Infantum OP46
Mø DH82 + L. Infantum OP46 GFP
+
Compostos químicos [IC50]
Compostos químicos [IC50]
Figura 10: Delineamento experimental referente aos experimentos desenvolvidos neste estudo. Avaliação in
vitro da citotoxicidade em macrófagos canino (DH82) e macrófagos murino (J774.A1) empregando a técnica de
MTT, para determinação de valores de IC50 de cada composto químico (Adultos de Hantzsch e Aldiminas).
Avaliação da atividade leishmanicida em formas promastigotas da cepa OP46 de L. infantum a partir do ensaio de
MTT. Para a avaliação do potencial leishmanicida em formas amastigotas de L. infantum foram empregadas duas
metodologias: ‘‘clássica’’ através de análise microscópica de amastigotas internalizadas em macrófagos caninos
(DH82) e por ‘‘citometria de fluxo’’ para análise de amastigotas da cepa OP46 de L. infantum transfectada com
gene reporte para GFP internalizadas em macrófagos caninos (DH82).
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
39
5.4.1 Avaliação in vitro da citotoxicidade: Macrófagos Caninos DH82 e em Macrófagos
Murinos J774.A1
Para a avaliação da citotoxicidade dos compostos a serem testados, foram utilizadas
células imortalizadas de macrófagos caninos da linhagem DH82 bem como em macrófagos
murinos da linhagem J774.A1.
Ambas as linhagem de células foram utilizadas no quinto dia após o repique, momento
em que apresentava confluência aproximada de 90%. O meio de cultura das garrafas contendo as
células foi desprezado, com objetivo de descartar as células não aderidas. Em seguida, 20 mL de
PBS + EDTA (2mM) (gelado, 4ºC) foi adicionado a garrafa de cultura para suspensão das
células, através da raspagem com o auxílio do Cell Scraper (SPL 90020 LIFE SCIENCES) para
desagregação das células do fundo das placas, sendo essas então transferidas para tubo de 50 ml
(Falcon®, Becton Dickinson, EUA), para centrifugação a 1400 RPM, durante 10 minutos em
temperatura de 18°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionado ao tubo
com 10 ml de RPMI 1640 com 10% de SFB e homogeneizado em vórtex. Para a contagem, em
microtubo Eppendorf Graduado Neutro – Volume de 1,5 ml, foi feita a diluição de 1:20, com
volume de 120 µL de Trypan Blue Solution 0,4% (SIGMA), 60 µL de PBS+EDTA e 20 µL da
suspensão de macrófagos, e em seguida 10 µL desta diluição foi adicionado em câmara de
Neubauer. Após a contagem, o volume contido no tubo foi ajustado de forma que as células da
linhagem DH82 ou da linhagem J774.A1 tivessem na concentração final de 2x106 de macrófagos
por ml, sendo plaqueados 1x105 de macrófagos por poço. Desta forma, em seguida foram
adicionados 50 μL de macrófagos (1x105) em placa de 96 poços de fundo chato (NUNCTM,
Roskilde, Dinamarca). Após a adição dos macrófagos, foi então adicionado 50 μL dos compostos
químicos, nas diferentes concentrações testadas (C1: 500 µg/ml a C13: 0,390625 µg/ml). Como
controle negativo foram utilizados 50 μL de macrófagos (1x105) + 50 µL de meio RPMI 1640
com 10% de SFB nos respectivos poços, de acordo com o desenho experimental da placa para
cada droga avaliada. Além do grupo controle negativo, foram feitas placas com os macrófagos
em contato com a AmB-D, nas concentrações entre C3’: 250 µg/mL a C13: 0,390625 µg/mL, para
comparação com os compostos químicos. As placas foram incubadas em estufa de CO2, pelos
tempos de 24, 48 e 72 horas. Após os determinados tempos, as placas eram retiradas para adição
de 150 µL da solução de MTT na concentração de 2µg/ml e incubada por mais 4 horas para que
então fosse feita a dição de 60 µL da solução de SDS 10% em HCL 0,01 M (SDS – HCl) em
cada poço e incubadas novamente. Posteriormente, após 16 horas de incubação foi realizada a
leitura das placas, em espectrofotômetro do tipo leitor de ELISA no comprimento de onda de
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
40
490 nm. Cada concentração dos compostos químicos, da AmB-D e dos grupos controles, foram
realizadas em triplicatas e o experimento foi repetido 3 vezes, em dias diferentes.
5.5 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch
em formas promastigotas
Após a análise e obtenção dos resultados dos experimentos de avaliação de
citotoxicidade, tanto em macrófagos caninos (DH82) quanto macrófagos murinos (J774.A1), foi
determinado o valor de IC50 de cada composto químico testado. Em seguida, foi realizado o teste
de avaliação leishmanicida com o objetivo de avaliar a capacidade de cada composto na
eliminação/morte da forma promastigota do parasito. Nesta etapa as formas promastigotas foram
expostas in vitro a diferentes concentrações dos compostos a serem testados e a taxa de
viabilidade dos parasitos foi determinada após 24, 48 e 72 horas de incubação pelo método de
MTT conforme protocolo proposto por Mosmann (1993) e descrito abaixo.
Para a realização desse experimento, foram utilizados parasitos de L. infantum da cepa
OP46. Os parasitos estavam com sete dias (em fase estacionária crescimento), sendo cultivados
em no máximo dez passagens (P10) de crescimento em meio de cultura LIT. Para esta etapa
foram utilizadas células cultivadas em Erlemeyer de 250 ml, na proporção de 30 mL de L.
infantum OP46 para 80 ml de meio LIT, a fim de obter volume suficiente para a realização do
experimento. Foram retirados 2 mL da cultura e colocada em tubo de 50 ml (Falcon®, Becton
Dickinson, EUA) para preparação da diluição de 1:50, sendo utilizado o volume de 490 µl de
formalina 4% e 10 µl de Leishmania, colocado em microtubo de 1,5 mL, homogeneizado e
adicionado em câmara de Neubauer para a contagem. Após a contagem, o volume contido no
tubo de 50 mL foi ajustado de forma que as células tivessem na concentração de 2x108 por mL e
na concentração de 1x107 /poço (50 μL) e então centrifugado para a retirada do excesso de meio
LIT e adicionado o volume necessário de RPMI 1640 com 10% de SFB para a realização do
experimento. Em placas de 96 poços de fundo chato foram adicionados 50 μL da Leishmania em
cada poço. Em seguida, foram adicionados 50 μL dos compostos químicos nas diferentes
concentrações (Tabela 1). Os poços referentes ao grupo controle das placas receberam 50μL
RPMI 1640 com 10% de SFB, de acordo com o desenho experimental. As placas foram vedadas
com parafilme e incubadas em Estufa B.O.D., em temperatura de 25ºC nos tempos de 24, 48 e 72
horas de tratamento. Após cada um dos tempos, as placas eram retiradas da estufa para adição de
150 µL de solução de MTT na concentração de 2µg/mL e em seguida lacradas, envolvidas com
papel alumínio e incubadas novamente. Seguido o tempo de incubação, foram adicionados 60 µL
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
41
de SDS 10% em HCL 0,01 M (SDS – HCl) em cada poço e novamente incubadas.
Posteriormente, após 16 horas foi feita a leitura das placas, em espectrofotômetro do tipo leitor
de ELISA em compimento de onda de 490 nm.
Também foram feitas placas com diferentes concentrações de AmB-D (250 µg/mL a
0,390625 µg/mL) como parâmetro de comparação (controle positivo de morte das formas
promastigotas) com os compostos químicos dos grupos de aldiminas e adutos de Hantzsch.
5.6 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch
em formas amastigotas de L. infantum
5.6.1 Método clássico: microscopia ótica
5.6.1.1 Infecção de macrófagos caninos (DH82) com Leishmania infantum cepa OP46
Com o objetivo de selecionar os compostos químicos com ação leishmanicida em
formas amastigotas, macrófagos caninos imortalizados da linhagem DH82 foram infectados com
Leishmania infantum OP46 e foram incubados com cada um dos compostos químicos dos grupos
das aldiminas e adutos de Hantzsch testados, além da droga AmB-D, ambos com as
concentrações previamente determinadas do valor do IC50 obtido do experimento anterior de
avaliação de citotoxicidade (Tabela 1). Neste experimento foi usado apenas uma concentração de
cada composto químico dos grupos estudados e para a droga AmB-D (Tabela 1).
Os macrófagos DH82 foram cultivados em garrafas de cultura de 160 mL (Nunc,
Roskilde, Denmark) com volume de 40 mL de meio de cultura RPMI 1640 sendo utilizados no
momento em que a confluência aproximada era de 90%. Para a transferência das células, o meio
RPMI 1640 da garrafa de cultura foi descartado e adicionado 15 mL de Solução de PBS + EDTA
(2 mM) para melhor desaderência das células do fundo da garrafa, com auxílio do Cell Scraper
para raspagem das células. Posteriormente as células da linhagem DH82 foram transferidas para
um tubo de 50 mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA). Em seguida o tubo foi submetido à
centrifugação em 1400 RPM, durante 10 minutos a 18°C. O sobrenadante foi desprezado e o
sedimento foi homogeneizado em vórtex e suspenso em meio RPMI 1640 com 10% de SFB.
Para a contagem as células foram diluídas em Trypan Blue Solution, seguindo o protocolo da
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
42
diluição de 1:20, onde foram utilizados 120 μL de Trypan Blue Solution, 70 μL de PBS + EDTA
e 10 μL da célula ressuspendida em meio de cultura para contagem em câmara de Neubauer.
Após a contagem, a concentração no tubo foi ajustada para 1x105 macrófagos/mL, de forma que
ao adicionar 100 μL em cada poço da placa de 16 poços em lâminas do tipo Chamber SlideTM
(Lab-Tek), houvesse 1x104 macrófagos por poço. Em seguida, as placas foram incubadas em
estufa de CO2 para fixação dos macrófagos por 1 hora, para posterior infecção com as formas
promastigotas.
As formas promastigotas de Leishmania infantum foram cultivadas em meio LIT,
como descrita anteriormente (item 5.1.1). Dessa forma, foram retirados 10 mL da cultura de
promastigotas de L. infantum do Erlemeyer, transferidos para tubo de 50 mL (Falcon®, Becton
Dickinson, EUA) e submetidos à centrifugação em 3000 RPM, durante 10 minutos a 18°C. Em
seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi homogeneizado em vórtex e suspenso
em 10 mL de meio RPMI 1640 com 10% de SFB e novamente homogeneizado em vórtex para a
contagem em câmera de Neubauer. Para a contagem foi feita a diluição de 1:50, sendo utilizados
490 μL de Formalina a 4% e 10 μL da cultura ressuspendida. Após a contagem, a concentração
foi ajustada para 1x106 promastigotas/mL.
Posteriormente, as placas com macrófagos foram retiradas da estufa de CO2 e sem
desprezar o sobrenadante foram adicionados 100 μL da cultura de Leishmania [1x106
promastigotas/ml], ou seja, 1x105 promastigotas em cada poço da placa Chamber SlideTM, com o
intuito de ocorrer a incubação na proporção 1 macrófago para 10 promastigotas (1:10) (poço -
1x104 macrófago: 1x105 promastigotas). Em seguida, as placas foram incubadas por 24 horas
para que ocorresse a internalização e infecção dos macrófagos com as formas promastigotas do
parasito e sua transformação em formas amastigotas. Após as 24 horas de infecção, o
sobrenadante das placas foi retirado e de acordo com o desenho experimental das placas
Chamber SlideTM, cada composto químico, foi adicionado em sua respectiva concentração do
valor de IC50, em um volume final de 200 μL/poço, bem como para os poços referentes a AmB-
D. O grupo controle positivo da infecção recebeu 200 μL de meio RPMI 1640. Em sequência, as
placas foram incubadas novamente em estufa de CO2 (37ºC com 5% de CO2), e foram retiradas
para avaliação do tratamento após os tempos de 24, 48 e 72 horas de contato com os compostos
químicos (Sesana, 2009). Para cada composto testado, AmB-D e controles foram feitos três
poços distintos na placa de Chamber SlideTM, e o experimento foi repetido três vezes (triplicata).
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
43
5.6.1.2 Preparo e análise das lâminas da infectividade in vitro
Após os respectivos tempos de tratamento 24, 48 e 72 horas, o sobrenadante de cada
placa foi desprezado e adicionados 50 μL de Corante nº 1 do Kit Panótico Rápido InstantProv
(Newprov®) permanecendo por 1 minuto. Após esse tempo, o corante foi retirado e a parte
superior da placa removida, bem como o silicone de aderência dos poços, ficando somente a
lâmina contendo as células aderidas e fixadas. As lâminas foram então coradas utilizando o
mesmo kit Panótico Rápido InstantProv (Newprov®), sendo emergidas por 30 segundos em cada
corante (2 e 3) do kit e em seguida lavadas em água. Depois do tempo de secagem das lâminas,
as mesmas receberam lamínulas que foram aderidas com Entellan® (Merck, Alemanha).
Posteriormente, foi realizada a análise e contagem das lâminas com o auxílio de
microscópio óptico (Olympus Optical, Japão), com auxílio de óleo de imersão na objetiva com
aumento de 100x. Foi então realizada a contagem total de 300 macrófagos por poço, sendo
discriminado o número de macrófagos infectados dos não infectados, além do número de
amastigotas encontradas dentro dos macrófagos infectados. Os resultados desta infecção foram
expressos em: porcentagem de macrófagos infectados, razão do número de amastigotas por
macrófagos infectados e porcentagem da redução de amastigotas intracelulares.
5.6.2 Citometria de Fluxo
5.6.2.1 Infecção de macrófagos caninos (DH82) com Leishmania infantum cepa OP46
transfectada com o gene repórter GFP
Os macrófagos DH82 e as promastigotas de Leishmania infantum cepa OP46 GFP
foram preparados seguindo as mesmas etapas do item 5.5.1.1, porém, após a contagem dos
mesmos, eles foram incubados em estufa de CO2 por 24 horas em tubos de poliestireno (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, USA) de 12x75mm, com capacidade para 5mL, para que não
ocorresse adesão dos macrófagos. A mesma proporção 1 macrófago para 10 promastigotas (1:10)
(tubo - 1x105 de macrófago DH82: 1x106 de promastigotas de L. infantum cepa OP46 GFP) foi
seguida para que ocorresse a infecção, internalização e diferenciação das formas promastigotas
em amastigotas.
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
44
Após o tempo de incubação (24horas), foi adicionado 1 mL de PBS 10% (Phosphate-
Buffered Saline) para lavar os tubos, centrifugando a 3000 rpm, durante 7 minutos, 23ºC, e
descartando o sobrenadante. Em seguida foi adicionado 300 μL das drogas e da AmB-D nos
respectivos tubos (respeitando o valor da concentração IC50% de cada composto, idem item
5.5.1.1 e Tabela 1) e 300 μL de RPMI com 10% de SFB nos tubos do grupo controle e
novamente incubados para posterior leitura nos tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. Após
os tempos de tratamento, os tubos foram lavados com 1 ml de PBS + EDTA (2mM) e
centrifugados a 3000 rpm, durante 7 minutos, 23ºC,, em seguida ao descarte do sobrenadante, os
tubos foram ressuspendido em 200 μL de PBS e procedeu-se a leitura (20.000 células/eventos
por tubo) em Citômetro de Fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, EUA).
5.6.2.2 Estratégias para análise da infecção dos macrófagos DH82 por cepa de L.
infantum transfectada com gene GPF por Citometria de fluxo
Os resultados referentes ao potencial leishmanicida de diferentes compostos de
Aldiminas e Adultos em formas amastigotas do parasito foram obtidos através da frequência (%)
de macrófagos DH82 fluorescentes (verde – GFP/FL1)
A análise da frequência (%) de macrófagos DH82 fluorescentes (verde – GFP+ – FL1)
foi realizada utilizando-se a estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu na
seleção da população celular de interesse, baseada em aspectos morfométricos, através de
gráficos de distribuição pontual de FSC (tamanho) versus SSC (complexidade) (Figura 11). Após
a seleção da região de interesse (R1) contendo células da cultura de macrófagos imortalizados
DH82, o percentual de macrófagos não infectados (GFP-) e infectados (GFP+), dentro da
população selecionada, foi obtido em gráficos unidimensionais do tipo histogramas para a
fluorescência GFP/FL1, como exemplificado na Figura 11. Na tentativa de mensurarmos
indiretamente a “carga parasitária” ou o número de amastigotas dentro dos macrófagos
infectados foi calculado a média da intensidade de fluorescência (MFI-FL1) dos macrófagos
infectados (GFP+). Os parâmetros descritos acima dos macrófagos (20 mil eventos/células)
foram determinados no citômetro de fluxo (FACScalibur® – Becton Dickinson). O programa
CELLQuest® foi utilizado para a aquisição de dados e para a análise dos resultados foi
empregado o software FlowJo® das estratégias descritas.
Salomão, N.E.O. Material e Métodos
45
5.7 Análise estatística
As análises estatísticas dos dados obtidos nos ensaios de viabilidade celular nas
avaliações in vitro de citotoxicidade dos macrófagos caninos DH82 e murinos J774.A1 e da
atividade leishmanicida com a cepa OP46 foram realizadas com o auxílio do software GraphPad
Prism 5 (Prism Software, Irvine, CA, USA), utilizando a análise de correlação entre os dados.
Nos experimentos com o teste clássico por microscopia de infectividade in vitro com as células
de macrófagos caninos DH82 infectados com as cepas de Leishmania OP46, os resultados foram
analisados no software GraphPad Prism 5 (Prism Software, Irvine, CA, USA), utilizando o teste
t não paramétrico (one-tailed) considerando estatisticamente significativos os resultados com os
valores de p <0.05. Para os experimentos de infectividade in vitro com as células de macrófagos
caninos DH82 infectados com as cepas de Leishmania OP46(GFP) os resultados foram obtidos a
partir do FACS Calibur (Becton Dickinson Mountain View, CA) e foram analisados no
programa FlowJo 7.6.4 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA).
Figura 11: Sequencia de procedimentos utilizados para quantificar o percentual de macrófagos infectados com
leishmania GFP+ após o tratamento in vitro com diferentes compostos de aldiminas e adutos de Hantzsch. No gráfico da
esquerda está representada a distribuição pontual FSC versus SSC utilizado para a seleção da população celular de interesse –
R1, macrófagos caninos imortalizados DH82. No gráfico da direita, do tipo histograma, temos a representação unidimensional
para a fluorescencia GFP/FL, contendo as células selecionadas na região R1, empregados para quantificar o percentual de
macrófagos não infectados (GFP-) e infectados (GFP+). Nesse tipo de análise tambpem verificamos a média de fluorescência
(MFI-FL1) dos macrófagos infectados (GFP+), para quantificarmos indiretamente o número de amastigotas dentro dos
macrófagos infectados.
6 RESULTADOS
Salomão, N.E.O. Resultados
47
6.1 Apresentação de resultados
O presente trabalho traz como resultados um conjunto de dados da avaliação
leishmanicida in vitro de novos composto sintéticos pertencentes ao grupo das aldiminas e
adutos de Hantzsch. Nossos resultados refletem um esforço focado em experimentos de
avaliação comparativa entre a metodologia in vitro da microscopia ótica
usualmente/tradicionalmente utilizada na avaliação leishmanicida de testes in vitro de drogas,
com uma nova metodologia empregando a citometria de fluxo conjuntamente com a tecnologia
de transfecção de um gene repórter fluorescente aos parasitos de L. infantum especificamente de
uma cepa isolada em nosso laboratório, com o intuito de aperfeiçoarmos os estudos de testes in
vitro de potenciais drogas leishmanicidas. Inicialmente serão descritos os resultados da
citotoxicidade in vitro através da técnica do MTT, para obtenção dos valores de IC50% dos
diferentes compostos testados. Na segunda parte, serão descritos os resultados da atividade
leishmanicida em formas promastigotas (ensaio de MTT) e amastigotas (microscopia ótica) do
parasito através de metodologias usualmente empregadas em testes in vitro. Na terceira parte,
serão descritos os resultados da ação leishmanicida avaliados por citometria de fluxo.
6.2 Avaliação in vitro da citotoxicidade
As figuras 12 e 13 contem os gráficos com os resultados obtidos pelo teste de
citotoxicidade, que representam o valor do percentual da redução de viabilidade dos macrófagos
murinos (linhagem J774.A1) e macrófagos caninos (linhagem DH82), após o tratamento durante
os tempos de 24, 48 e 72 horas. Estes resultados são apresentados, através das curvas com as
diferentes concentrações dos compostos químicos dos grupos das Aldiminas e dos Adutos de
Hantzsch testados (C1: 500 µg/mL; C2: 400 µg/mL; C3: 300 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100
µg/mL; C6: 50 µg/mL; C7: 25 µg/mL; C8: 12,5 µg/mL; C9: 6,25 µg/mL; C10: 3,125 µg/mL; C11:
1,5625 µg/mL; C12: 0,78125 µg/mL; C13: 0,390635 µg/mL) e da Anfotericina (AmB-D) (C3’:
250 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100 µg/mL; C6: 50 µg/mLl; C7: 25 µg/mL; C8: 12,5 µg/mL; C9:
6,25 µg/mL; C10: 3,125 µg/mL; C11: 1,5625 µg/mL; C12: 0,78125 µg/mL; C13: 0,390635
µg/mL). É importante salientar que cada concentração de cada droga foi testada em triplicata e
que cada experimento completo foi repetido por pelo menos três vezes, em dias diferentes.
Inicialmente, as diferentes concentrações foram testadas com o objetivo de estabelecer
a concentração inibitória de 50% (IC50) de cada composto, no qual, o valor de IC50 é o valor
padrão utilizado em testes de drogas e que permite encontrar um “valor ideal” que viabilize ou
Salomão, N.E.O. Resultados
48
cause a morte de 50% das células. Dessa forma, os valores de IC50 foram utilizados nos
experimentos seguintes de avaliação de atividade leishmanicida em promastigotas e amastigotas
(através dos testes de infecção de macrófagos caninos (linhagem DH82) infectados com L.
infantum OP46).
6.2.1 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de aldiminas em
culturas secundárias de macrófagos
Os resultados apresentados nos gráficos da figura 12 mostraram nos compostos de
aldiminas um perfil de citotoxicidade um pouco semelhante nas duas culturas secundárias de
macrófagos empregadas (caninos DH82 e murinos J774.A1), como podemos observar nos
valores obtidos do IC50 para cada droga ao longo dos tempos 24, 48,72h (Figura 12 e Anexo 2) e
a maioria das formulações de aldiminas testadas apresentou uma maior citotoxicidade ao longo
dos tempos avaliados, em ambos os sistemas de células macrofágicas imortalizadas empregadas,
como é o caso dos compostos 3I4 (DH82: 20µg/mL e J774.A1: 15 µg/mL), 3I5 DH82: 15 µg/mL
e J774 J774.A1: 1,5 µg/mL), 3H8 (DH82: 45 µg/mL e J774.A1: 15 µg/mL), 3H9 (DH82: 40
µg/mL e J774.A1: 10 µg/mL), 3D7 (DH82: 10 µg/mL e J774.A1: 20 µg/mL), 3G2 (DH82: 20
µg/mL e J774.A1: 5 µg/mL), que apresentaram assim um menor valor de concentração capaz de
matar 50% das células (IC50) (Figura 12 e Anexo 2). Podemos destacar o composto de Aldiminas
3H7 como o menos tóxicos, pois apresentou maiores valores de concentração de IC50 (DH82: 85
µg/mL e J774.A1: 40 µg/mL) em relação aos demais compostos (Figura 12 e Anexo 2) ao longo
dos tempos de avaliação. Para a determinação dos valores de IC50% em cada composto de
Aldiminas testada foi escolhido o menor valor de IC50 (maior citotoxicidade) encontrado nos 3
tempos de avaliação (24h, 48h e 72h) (Tabela1). O valor do IC50 obtido para a AmB-D foi de
aproximadamente 100 µg/mL em ambas células testadas ao longo dos tempos avaliados.
Salomão, N.E.O. Resultados
49
25
50
75
100
-1 0 1 2 3
25
50
75
100
-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3
24 Horas 48 Horas 72 Horas
Log da concentração [500 - 0,1953125 µg/ml]
MA
CR
ÓF
AG
O J
774
.A1
Via
bili
dade
(%)
MA
CR
ÓF
AG
O D
H82
Via
bili
dade (
%)
Figura 12: Avaliação da citotoxicidade das aldiminas em Macrófagos Murino (J774.A1) e Macrófagos Canino (DH82):
Porcentagem da viabilidade dos Macrófagos Murino (J774.A1) e Canino (DH82) tratados com diferentes concentrações das
aldminas e da AmB-D, durante os tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. O log das concentrações das aldiminas
correspondem a diluições entre 500 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. O log das concentrações da AmB-D correspondem a diluição
seriada entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. Legenda:
Salomão, N.E.O. Resultados
50
6.2.2 Determinação dos valores de IC50 das diferentes formulações de adutos de
Hantzsch em culturas secundárias de macrófagos
Os resultados apresentados nos gráficos da figura 13 não demonstraram nos
compostos de adutos de Hantzsch um perfil de citotoxicidade semelhante nas duas culturas
secundárias de macrófagos empregadas (caninos DH82 e murinos J774A.1), como podemos
observar nos valores obtidos do IC50 para cada droga ao longo dos tempos 24, 48 e 72h (Figura
13 e Anexo 2). De maneira geral, em todas as formulações de adutos de Hantzsch foi observada
uma baixa citotoxicidade ao longo dos tempos avaliados, com concentração capaz de matar 50%
das células (IC50), muitas vezes, acima da concentração máxima de 500 µg/ml (primeiro ponto
da curva de IC50) testadas, nos tempos de 24, 48 e 72 após o tratamento (Figura 13 e Anexo 2).
Desta forma os valores de IC50 nos macrófagos DH82 para os compostos de Adultos de Hantzsch
(considerando o menor valor foram: IC50 entre os tempos de 24, 48 e 72h): 8A2 (IC50:
>500µg/mL); 8A3 (IC50: >500µg/mL); 8A4 (IC50: 170µg/mL); 8B5 (IC50: >500µg/mL); 8B6
(IC50: >500µg/mL) (Tabela 1).
Já nos macrófagos murinos J774A.1, somente nas concentrações mais altas (C1: 500
µg/ml; C2: 400 µg/mL; C3: 300 µg/mL; C4: 200 µg/mL; C5: 100 µg/mL) que os adutos de
Hantzsch demonstram algum percentual de citotoxicidade considerável. Pode-se observar que
apenas a partir de 48 horas de tratamento, os compostos químicos de Adultos, em suas maiores
concentrações começam a matar mais de 50% dos macrófagos, chegando a um percentual de
morte em torno de 90% após 72 horas de tratamento. Nota-se, para estas células, que os
compostos químicos dos adutos de Hantzsch apresentaram um comportamento na curva de
citotoxicidade semelhante ao da AmB-D (IC50: 100 µg/mL). Desta forma os valores de IC50 para
os compostos de adultos (Considerando o menor valor foram: IC50 entre os tempos de 24, 48 e
72h): 8A2 (IC50: 125µg/mL); 8A3 (IC50: 60µg/mL); 8A4 (IC50: 50µg/mL); 8B5 (IC50:
140µg/mL); 8B6 (IC50: 115µg/mL) (Tabela 1).
Já para os macrófagos caninos da linhagem DH82 os resultados apresentados nos
gráficos da figura 13 do perfil de citotoxicidade demonstraram que nenhuma dos compostos de
Adultos atingiu o valor de IC50 na concentração máxima de 500 µg/mL, nos tempos de 24, 48 e
72 após o tratamento, demonstrando menor citotoxicidade quando comparadas a curva da AmB-
D. Com exceção do composto 8A4 que em 48h apresentou um valor de IC50 169,8 µg/mL.
Salomão, N.E.O. Resultados
51
MA
CR
ÓF
AG
O J
774
.A1
Via
bili
dade
(%)
MA
CR
ÓF
AG
O D
H82
Via
bili
dade (
%)
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-1 0 1 2 3
25
50
75
100
-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3
24 Horas 48 Horas 72 Horas
Figura 13: Avaliação da citotoxicidade dos adutos de Hantzsch em Macrófagos Murino (J774.A1) e Macrófagos Canino
(DH82): Porcentagem da viabilidade dos Macrófagos Murino (J774.A1) e Canino (DH82) tratados com diferentes concentrações
dos adutos de Hantzsch e da AmB-D, nos tempos de 24, 48 e 72 horas de tratamento. O log das concentrações dos adutos de
Hantzsch correspondem a diluições entre 500 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. O log das concentrações da AmB-D correspondem a
diluição seriada entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. (p ˂ 0,05). Legenda:
Salomão, N.E.O. Resultados
52
6.3 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch
em promastigota de L. infantum da cepa OP46
A figura 14 representa os valores do percentual da redução de viabilidade das
promastigotas de L. infantum cepa OP46, após o tratamento durante os tempos de 24, 48 e 72
horas, com os compostos químicos dos grupos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch. As
concentrações testadas dos diferentes compostos de aldiminas e dos adutos de Hantzsch foram os
valores ≤IC50 (curva de titulação feita a partir do valor de IC50 determinado para cada composto -
Tabela1 - previamente estabelecidos no experimento anterior de citotoxicidade - item 5.1). Os
gráficos da figura 14 também apresentam os resultados obtidos da atividade leishmanicida em
promastigotas da AmB-D nas concentrações entre C3’: 250 µg/mL e C13: 0,390635 µg/mL. É
importante destacar que da mesma forma que o experimento anterior, para determinação da
atividade leishmanicida em promastigotas através do teste de MTT, a concentração de cada
droga foi testada em triplicata nas placas e cada experimento completo foi repetido por pelo
menos três vezes, em dias distintos.
A redução da viabilidade em formas promastigotas nos diferentes compostos testados
ocorreu logo em 24 horas de tratamento, entretanto, com valores de redução inferiores a 25% da
viabilidade das promastigotas de L. infantum. Já nos tempos subsequentes de acompanhamento
(48 e 72h) foi mais evidenciado o potencial leishmanicida dos compostos, principalmente no
tempo de 72 horas após o tratamento.
De maneira geral, em 48 horas do tratamento foi observado uma redução entre 25% e
50% da viabilidade das formas promastigotas em todos os compostos estudados.
Interessantemente, essa redução, na maioria dos compostos, foi observada em todos os pontos de
ALDIMINAS ADUTOS DE HANTZSCH
DROGA AmB-D 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6
IC50[μg/mL](DH82)
100 20 15 85 45 40 10 20 >500 >500 170 >500 >500
IC50[μg/mL]
(J774.A1) 100 15 1,5 40 15 10 20 5 125 60 50 140 115
Tabela 1: Valores de IC50: Valores de Concentração Inibitória de 50% (IC50) para os macrófagos, nos tempos de
24, 48 e 72 horas de tratamento, de cada composto químico e da AmB-D.
Salomão, N.E.O. Resultados
53
diluição das concentrações testadas. Já para os compostos 3D7, 3H8 e 8B6, em 48 horas a
relação de diminuição da concentração das drogas com diminuição da atividade leishmanicida
foi mais evidenciado.
Já em 72 horas, foi possível observarmos valores de redução da viabilidade acima de
50%. No grupo das aldiminas, as drogas 3H8 e 3G2, após 72 horas mostraram um alto percentual
de morte dos parasitos, sendo de 64,52% na concentração mais alta da 3H8 e de 64,32% para o
composto 3G2.
Em relação ao grupo dos adutos de Hantzsch, pode-se observar que, mesmo estes
compostos não tendo demonstrado citotoxicidade aos macrófagos, a atividade leishmanicida
aumentou consideravelmente quando tratadas com os compostos 8B5 e 8B6, que após 72 horas
de tratamento, demonstraram um percentual de morte de 71,15% e 67,90%, respectivamente,
contra as formas promastigotas do parasito da cepa OP46 de L. infantum.
Em relação à AmB-D, foi possível evidenciar valores da atividade leishmanicida
próximos de 100%, nas concentrações mais altas empregadas em todos os 3 tempos avaliados.
Os resultados mostraram que os diferentes compostos de Aldiminas e dos Adutos de Hantzsch
apresentaram menor capacidade leishmanicida, empregando o teste de MTT em forma
promastigota do parasito, quando comparadas a atividade da AmB-D.
Salomão, N.E.O. Resultados
54
25
50
75
100
-1 0 1 2 3
25
50
75
100
-1 0 1 2 3 -1 0 1 2 3
Figura 14: Avaliação da atividade Leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch em Promastigotas de L. infantum
OP46: Redução da viabilidade celular da forma promastigota de L. infantum (cepa OP46) em razão do log das concentrações das
drogas com o valor ≤ ao valor de IC50 descritos na tabela 1 para cada composto químico. As concentrações da AmB-D
correspondem a diluição entre 250 µg/mL e 0,1953125 µg/mL. Resultados obtidos a partir de 24, 48 e 72 horas de tratamento.
(p ˂ 0,05). Legenda aldiminas: , adutos de
Hantzsch:
AL
DIM
INA
S
AD
UT
OS
DE
HA
NT
ZS
CH
Salomão, N.E.O. Resultados
55
6.4 Avaliação in vitro da atividade leishmanicida de aldiminas e adutos de Hantzsch
em formas amastigotas de L. infantum
6.4.1 Método clássico: Microscopia ótica
Para avaliar a ação leishmanicida em amastigotas de L. infantum, dentro de
macrófagos caninos DH82, dos diferentes compostos químicos de aldiminas e adutos de
Hantzsch testadas, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, foi realizada a contagem em
microscópio óptico dos macrófagos infectados, do número de amastigotas e dos macrófagos não
infectados para compararmos o percentual de infecção nos macrófagos expostos aos compostos
químicos testados, com o percentual de infecção do grupo controle (macrófagos infectados com
a cepa OP46 de L. infantum em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo de tratamento)
bem como ao grupo com macrófagos infectados com a cepa OP46 de L. infantum expostos ao
tratamento com AmB-D.
Para isto, foram usadas as concentrações de IC50, previamente estabelecidas no
experimento inicial de citotoxicidade (ver tabela 1), para cada um dos diferentes compostos
químicos. Igualmente aos demais experimentos, este também foi repetido por três vezes e as
concentrações feitas em triplicatas.
Após a contagem das lâminas e análise dos resultados, foram obtidos os dados
demonstrados na figura 15 e 16, o qual, para cada composto químico testado, está representado
na parte superior das figuras 15 e 16: percentual de infecção dos macrófagos (porcentagem de
macrófagos infectados, do total de 300 macrófagos contados); e na parte inferior das figuras 15 e
16: razão do número de amastigotas internalizadas por macrófago infectado (número de
amastigotas/número de macrófagos infectados – OP46/DH82).
6.4.1.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82) infectados
com L. infantum OP46
Nossos resultados do percentual de infecção dos macrófagos caninos DH82 pelas
formas amastigotas de L. infantum após 24 horas do tratamento com os compostos de Aldiminas
3I4 (41,33%); 3I5 (48,62%) e 3H8 (9,52%) demonstraram uma redução significativa (p<0,05)
Salomão, N.E.O. Resultados
56
quando comparados com o percentual de infecção do grupo controle (70,09%) (macrófagos
infectados com a cepa OP46 de L. infantum em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo
de tratamento) (figura 15). De forma interessante, o composto 3H9 apresentou menor percentual
de infecção (18,05%), estatisticamente significativo (p<0,05), quando comparado ao grupo
controle (70,09%) e ao percentual de infecção da AmB-D (63,11%).
Após o período de 48 horas de infecção e tratamento, o percentual de infecção teve
uma redução significativa (p<0,05) nos compostos 3H8 (5,26%), 3H9 (17,44%) e 3D7 (12,69%)
em relação ao controle (38,42%) e demonstraram uma taxa de infecção semelhante a da AmB-D
(5,69%).
No tempo de avaliação após 72 horas do tratamento, todos os compostos químicos do
grupo das aldiminas apresentaram redução significativa (p<0,05) no percentual de infecção (3I4:
41,45%; 3I5: 47,38%; 3G2: 38,16%) em relação ao grupo controle (73,72%). Importante
ressaltar que a redução do percentual de infecção nos compostos 3H8 e 3H9 foram ainda
maiores, 12,43% e 10,23%, respectivamente, demonstrando um resultado mais próximo ao
obtido no grupo tratado com AmB-D (3,52%).
Na figura 15, na parte inferior, temos os resultados referentes à razão do número de
amastigotas por macrófagos infectados. Não foi possível observamos diferenças significativas
(p<0,05) no tempo de 24 horas entre os diferentes compostos e os grupos controles. Após as 48
horas do tratamento os compostos químicos que tiveram redução significativa (p<0,05) no
número de amastigotas internalizadas foram: 3I4 (1,42), 3I5 (1,5), 3H9 (1,66) e 3G2 (1,19)
comparados ao grupo controle (2,17). O grupo controle da AmB-D apresentou valores médios
(da razão do número de amastigotas por macrófagos infectados) de 1,53, bem próximos aos
compostos acima [(3I4 (1,42), 3I5 (1,5), 3H9 (1,66)], entretanto, destacamos o comportamento
do composto 3G2 (1,19) que apresentou também uma redução significativa (p<0,05) em relação
ao grupo tratado com AmB-D(1,53). Já para o tempo de 72 horas de tratamento apenas o
composto 3H8 (0,43) apresentou redução significativa (p<0,05) no número de amastigotas
internalizadas em relação ao grupo controle (1,45).
Para os compostos de aldiminas 3H7 e 3D7 não foi possível obter três experimentos
diferentes, com contagem de 300 macrófagos, para o tempo de 72 horas (barras vermelhas).
Salomão, N.E.O. Resultados
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Figura 15: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L. infantum (OP46) por
microscopia óptica. Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 e tratados com aldiminas, nas concentrações
correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao grupo controle contendo somente
Leishamania, macrófgos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta). Analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte
inferior: Razão do número de amastigotas L. infantum OP46 internalizadas nos Macrófagos DH82 infectados, após 24, 48 e 72 horas de tratamento,
tratados com aldiminas, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao
grupo controle contendo somente Leishmania, macrófgos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).
Salomão, N.E.O. Resultados
58
6.4.1.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)
infectados com L. infantum OP46
Nossos resultados do percentual de infecção dos macrófagos caninos DH82 pelas
formas amastigotas de L. infantum após 48 horas e 72 horas do tratamento com os compostos de
adutos de Hantzsch demonstraram uma redução significativa (p<0,05) de todos os compostos
químicos (48h- 8A3: 18,54%; 8A4: 11,08%; 8B5: 24,81% e 8B6: 14,34%) (72h- 8A3: 20,54%;
8A4: 18,35%; 8B5: 29,60% e 8B6: 25,13%), com exceção do composto 8A2 (48h: 37,13%; 72h:
63,14%), em comparação ao grupo controle (48h: 38,42%; 72h: 73,72%) em ambos os tempos
(Figura 13). Não foi possível observamos diferenças significativas (p<0,05) no tempo de 24horas
entre os diferentes compostos e os grupos controles.
Na parte inferior da figura 16, estão os resultados obtidos da razão da contagem do
número de amastigotas internalizadas nos macrófagos infectados. Apenas a partir de 48 horas foi
possível observar a redução desta razão para todos os compostos químicos: 8A2 (1,61); 8A3
(1,75); 8A4 (1,90) e 8B6 (1,91); em relação ao controle (2,17) no mesmo tempo, com exceção do
composto 8B5 (1,95) que não apresentou diferença significativa. Não foi possível observamos
diferenças significativas (p<0,05) nos tempos de 24 horas e 72 horas entre os diferentes
compostos e os grupos controles em relação a razão da contagem do número de amastigotas
internalizadas nos macrófagos infectados
Salomão, N.E.O. Resultados
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Figura 16: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L.
infantum (OP46) por microscopia ópitica: Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 e tratados
com adutos de Hantzsch, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente
estabelecidos, comparados ao grupo controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo
tratado com AmB-D (barra preta), analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Razão do número de amastigotas L. infantum
OP46 internalizadas nos Macrófagos DH82 infectados, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com adutos de Hantzsch, nas
concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, previamente estabelecidos, comparados ao grupo
controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).
Salomão, N.E.O. Resultados
60
6.5 Citometria de fluxo
Os resultados da análise por citometria de fluxo da avaliação do percentual de infecção
dos macrófagos com a Leishmania infantum OP46GFP expostos aos diferentes compostos
químicos (concentrações de IC50%), também foram avaliados nos tempos de 24, 48 e 72 após o
tratamento e comparados com os resultados obtidos nos grupos controle positivos (macrófagos
infectados com OP46GFP em meio de cultura e não submetidos a nenhum tipo de tratamento) e
no grupo controle AmB-D (macrófagos infectados com OP46GFP expostos ao tratamento com a
droga de referência AmB na concentração - 4µg/mL).
Com o intuito de corroborar e comparar os resultados obtidos no experimento
convencional feito por microscopia do número médio de amastigotas nos macrófagos infectados
foi traçada a estratégia de análise por citometria de fluxo da avaliação da média da intensidade
de fluorescência (MFI) dos macrófagos infectados com os parasitos de L.infantum GFP.
6.5.1 Atividade leishmanicida de aldiminas em macrófagos caninos (DH82) infectados
com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP)
Na figura 17 está demonstrado o percentual de infecção nos macrófagos DH82
tratados com os diferentes compostos químicos do grupo das aldiminas. Após 24 horas de
tratamento, somente o composto 3D7 foi capaz de promover uma redução significativa (p<0,05)
na porcentagem da infecção (20,80%) em relação ao grupo controle (32,35%). No entanto, após
as 48 horas do tratamento, pode-se observar uma redução significativa (p<0,05) na taxa de
infecção promovida por diferentes compostos: 3H7 (18,6%), 3H8 (19,45%) e 3D7 (4,86%) em
comparação ao grupo controle (33%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,15%) que
também foi capaz de promover uma redução no percentual de infecção. De forma satisfatória,
como ocorreu com o grupo controle AmB-D (11,85%), o composto 3H7 conseguiu manter uma
redução significativa (p<0,05) no percentual de infecção (24,7%) após as 72 horas de tratamento,
em comparação ao grupo controle (36,8%).
Os resultados da parte inferior da figura 17 trazem os achados do MFI dos macrófagos
infectados com L.infantum GFP nos diferentes compostos de aldiminas e tempos avaliados. Não
foi possível observar uma diferença significativa (p<0,05) na estratégia de análise por citometria
de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados nos diferentes compostos de aldiminas,
Salomão, N.E.O. Resultados
61
nem no grupo AmB-D em relação ao grupo controle nos diferentes tempo estudados. Entretanto,
é possível observar uma tendência na diminuição do MFI nos macrófagos infectados em 24
horas de tratamento nos grupos AmB-D e 3H7, em 48h nos grupos AmB-D, 3H7 e 3H8, e em
72h no grupo AmB-D.
Salomão, N.E.O. Resultados
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Figura 17: Avaliação da ação das aldiminas em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L. infantum
(OP46 GFP) por Citometria de Fluxo: Parte superior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 GFP e
tratados com aldiminas, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, comparados ao grupo
controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra preta).
Analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Intensidade Média de Fluorescência (MFI) Razão do número de amastigotas L.
infantum OP46GFP internalizadas nos Macrófagos DH82, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com aldiminas.
Salomão, N.E.O. Resultados
63
6.5.2 Atividade leishmanicida de adutos de Hantzsch em macrófagos caninos (DH82)
infectados com L. infantum OP46 GFP – proteína verde fluorescente (GFP)
O resultado da infecção nos macrófagos DH82 com a L. infantum GFP e tratados com
os compostos químicos do grupo dos adutos de Hantzsch está representado na figura 18 Após 24
horas de tratamento, os compostos 8B5 (26,2%) e 8B6 (25,5%) foram capazes de promover uma
redução significativa (p<0,05) na porcentagem da infecção em relação ao grupo controle
(32,35%). Entretanto em 48 horas do tratamento foi observada uma redução significativa
(p<0,05) na taxa de infecção promovida pelos compostos 8A4 (22,65%) e 8B6 (19,5%) em
comparação ao grupo controle (33%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,15%). Já
em 72 horas do tratamento foi observada uma redução significativa (p<0,05) na taxa de infecção
promovida pelos compostos 8A2 (22,95%) e 8B6 (28,05%) em comparação ao grupo controle
(36,8%), semelhantemente ao grupo controle AmB-D (11,85%),. É importante destacar que o
composto 8B6 teve uma redução na taxa de infecção em todos os tempos de tratamento, 24, 48 e
72 horas (25,5%; 19,5% e 28,05%, respectivamente), quando comparado ao grupo controle,
respectivamente nos mesmos tempos (32,35%, 33% e 36,8%).
Os resultados da parte inferior da figura 18 trazem os demonstrados do MFI dos
macrófagos infectados com L.infantum GFP nos diferentes compostos de Adultos e tempos
avaliados. Mais uma vez não foi observar uma diferença significativa (p<0,05) na estratégia de
análise por citometria de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados nos diferentes
compostos de Adutos, nem no grupo AmB-D em relação ao grupo controle nos diferentes tempo
estudados. Entretanto, também foi possível observar uma tendência na diminuição do MFI nos
macrófagos infectados em 24 horas de tratamento nos grupos 8A4, 8B5 e 8B6, em 48h nos
grupos 8A4, e em 72h nos grupos 8A2 e 8B6.
Salomão, N.E.O. Resultados
64
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Figura 18: Avaliação da ação dos adutos de Hantzsch em Macrófagos canino (DH82) infectados com amastigotas de L.
infantum (OP46 GFP) por Citometria de Fluxo: Parte supeior: Percentual de Macrófagos infectados com L. infantum OP46 GFP
e tratados com adutos de Hantzsch, nas concentrações correspondentes ao valor de IC50 de cada composto químico, comparados ao
grupo controle contendo somente Leishmania, macrófagos e meio RPMI (barra listrada) e ao grupo tratado com AmB-D (barra
preta), analisados após 24, 48 e 72 horas. Parte inferior: Intensidade Média de Fluorescência (MFI) Razão do número de
amastigotas L. infantum OP46GFP internalizadas nos Macrófagos DH82, após 24, 48 e 72 horas de tratamento, tratados com
adutos de Hantzsch.
7 DISCUSSÃO
Salomão, N.E.O. Discussão
66
Em termos globais a leishmaniose é a terceira mais importante doença transmitida por
insetos hematófagos vetores, depois da malária e filariose (Reithinger & Davies 2002) e está
entre as seis maiores endemias mundiais (WHO, 2010). A leishmaniose visceral é uma das
doenças mais negligenciadas no mundo, que afeta principalmente os países menos
desenvolvidos, sendo que 59.000 pessoas morrem anualmente de LV, dentre as quais 35.000 são
homens e 24.000 mulheres, e mesmo com os avanços científicos relacionados ao diagnóstico,
tratamento e prevenção ocorridos nos últimos 10 anos, mostra taxas de morbimortalidade com
preocupante tendência ao crescimento (WHO 2010).
Um problema atual que tem agravado a situação da LV no mundo está associado ao
grande número de pacientes não responsivos a quimioterapia convencional com antimoniais,
sugerindo o aparecimento de cepas resistentes do parasito (Croft et al., 2006). Por estes motivos,
há uma variação regional na resposta ao tratamento em pacientes com LV, e as recomendações
no uso de medicamentos e esquemas terapêuticos, podem variar nas diferentes regiões do globo
acometidas por esta doença (Chakravarty et al., 2010). Estes e outros problemas enfrentados no
tratamento da LV têm levado pesquisadores a buscar por novos fármacos, bem como novas
estratégias de tratamento para a doença (terapias combinadas, imunoterapia e
imunoquimioterapia).
Outro grande problema é que a doença tem sido verificada como infecção oportunista
em pacientes com AIDS, semelhante ao que se observa no sul da Europa, onde cerca de 70% dos
casos de leishmaniose visceral em adultos estão associados com a infecção pelo vírus HIV. De
2001 a 2005 foram notificados 16.210 casos de LV no Brasil, sendo que, dentre estes casos, 315
(2%) apresentaram co-infecção com HIV (Elkhoury et al., 2007). Estima-se que a infecção
HIV/L. infantum aumenta o risco em 100 a 2.320 vezes de se desenvolver uma LV grave (MS,
2006).
Para agravar esses problemas de coinfecções e de resistência do parasito aos fármacos,
o tratamento da LV é baseado no uso dos fármacos de escolha (antimoniato de meglumina e
anfotericina) que apresentam elevada toxicidade, com diversos efeitos adversos, com difícil
administração (necessidade de internação), isso tudo faz com que os pacientes não tenham uma
adequada adesão ao tratamento, com altos índices de abandono ao protocolo terapêutico, além
disso, os efeitos adversos são mais fortes em crianças e se agravam em pacientes idosos, com
interações medicamentosas com outros medicamentos que esses já fazem uso (Sundar, 2001;
Oliveira et al., 2004; Thakur & Narayan, 2004; MS, 2013)
Salomão, N.E.O. Discussão
67
Uma das grandes limitações no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento
da leishmaniose visceral são as metodologias empregadas para o rastreamento e a seleção de
potenciais compostos nos ensaios pré-clínicos in vitro. Apesar da realização do teste in vitro ser
indispensável, estes apresentam variações consideráveis na maneira em que a citotoxicidade e o
potencial de ação/atividade das drogas são mensuradas (Feigal, et al., 1985; Nwaka & Hudson,
2006). A falta de padronização e consenso entre a melhor metodologia a ser empregada, além da
falta de reprodutibilidade dos resultados obtidos entre os grupos de pesquisas (Carrió et al., 2000;
Dey et al., 2002; Maia et al., 2013;) corroboraram para que nas últimas décadas tenham se
descoberto poucos fármacos com ação leishmanicida que apresentasse baixa citotoxicidade e alta
eficácia e que pudessem ser empregados na substituição dos tratamentos convencionais
(antimoniato de meglumina e a anfotericina).
Contudo os testes in vitro representam um passo importante e fundamental para testar
novos compostos e fármacos para o uso humano. Os estudos in vitro são realizados para avaliar
principalmente a toxicidade ou dano celular, a genotoxicidade (dano ao DNA) e a viabilidade
celular. Em comparação aos experimentos in vivo, estes testes apresentam vantagens como baixo
custo, condições experimentais controladas, rapidez na obtenção de resultados e não precisa de
aprovação de comitê de ética (Croft, et al., 2006). Os testes in vitro são métodos que podem
substituir e diminuir o uso de animais na experimentação, usando o principio dos 3Rs elaborados
por William Russel e Rex Burch, em 1959, que consiste em: refinamento (refinement), redução
(reduction) e substituição (replacement), visando a diminuição da quantidade de animais em
pesquisas e no desenvolvimento de sistemas experimentais que reproduzam as condições dos
organismos, dispensando modelos vivos (Petroianu, 1996). Por isso, o ideal é a identificação
primária utilizando um método in vitro eficiente para posterior avaliação in vivo.
Nesse sentido, nosso estudo buscou avaliar o potencial leishmanicida in vitro de
diferentes compostos derivados de aldiminas e de adutos de Hantzsch em um modelo
experimental empregando macrófagos imortalizados para estudarmos a citotoxicidade, bem
como ação leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas do parasito de L. infantum.
Para isto, um estudo em paralelo entre o ensaio do MTT, convencionalmente empregado em
testes de drogas e a citometria de fluxo. A seguir serão discutidos os resultados obtidos neste
estudo principalmente sob os aspectos da eficácia terapêutica in vitro.
Inicialmente, foram realizados os experimentos de testes de drogas in vitro
empregando o modelo de culturas secundárias de macrófagos, células que foram transformadas
Salomão, N.E.O. Discussão
68
ou originadas de tumor como modelo para a resposta celular, e que são empregadas na grande
maioria dos testes de drogas in vitro (Feigal, et al., 1985). Este modelo utilizando células
imortalizadas parece ser mais útil, pois é menos demorado e menos dispendioso em relação às
culturas primárias para obtenção dos macrófagos, tais como os originados do peritônio de
camundongos. Além disso, oferece as vantagens de proporcionar uma fonte ilimitada de células
hospedeiras homogêneas, adequadas para um teste de drogas in vitro que assegure a
reprodutibilidade dos resultados e tolere doses elevadas de fármacos testados, principalmente os
de primeira escolha para o tratamento da leishmaniose visceral (Maia et al., 2007).
Em nossa primeira abordagem investigativa, todos os 12 compostos pertencentes à
classe de aldiminas (7 compostos: 3I4, 3I5, 3H7, 3H8, 3H9, 3D7 e 3G2) e de adultos de
Hantzsch (5 compostos: 8A2, 8A3, 8A4, 8B5, 8B6) foram submetidos a avaliação de
citotoxicidade, pelo método colorimétrico de MTT, com construção de uma curva de diluição em
várias concentrações dos compostos e incubação por 24, 48 e 72 horas, com culturas secundárias
de macrófagos imortalizados (duas linhagens: canina DH82 e murina J774.A1), com intuito de
obtermos os valores de IC50 para cada um dos compostos testados. A utilização de testes in vitro,
por meio de ensaios de viabilidade celular, constitui o primeiro passo para a avaliação da
compatibilidade biológica de uma substância, além de que, estes estudos permitem predizer a
toxicidade, através do calculo do IC50, em modelos experimentais in vivo com a utilização de
micro-organismos como bactérias, fungos, enzimas, proteínas, culturas celulares, entre outras
(Rogero et al., 2003).
Interessantemente, de maneira geral nossos resultados mostraram nos compostos de
aldiminas e adutos de Hantzsch um perfil de citotoxicidade maior nas culturas secundárias de
macrófagos murinos J774.A1 do que nas culturas com os macrófagos caninos DH82, ou seja,
observamos menores valores de IC50, para cada droga ao longo dos tempos 24, 48, 72 h, para
macrófagos murinos J774.A1 do que para os caninos DH82. Esses resultados demonstram a
importância da realização dos experimentos para determinação de IC50 específico nas células que
serão empregadas nos ensaios subsequentes de testes de drogas.
De maneira geral, os compostos de aldiminas apresentaram uma maior citotoxicidade
ao longo dos tempos avaliados (compostos: 3I4, 3I5, 3H8, 3H9, 3D7 e 3G2). Podemos destacar o
composto derivado de aldiminas 3H7 (80 µg/ml) como menos tóxica, pois apresentou um maior
valor de concentração de IC50 em relação aos demais compostos deste grupo, com valor próximo
ao observado para a Anfotericina (100 µg/mL) pelo ensaio de MTT. Mediante esses resultados e
Salomão, N.E.O. Discussão
69
tomando como base o valor de IC50 obtido para o grupo controle Anfotericina B, podemos
considerar que os compostos de aldiminas foram muito tóxicos, apresentando valores de IC50
muito abaixo do esperado.
Diferentemente das aldiminas em que quase todos os compostos testados apresentaram
elevada citotoxicidade, no gurpo dos adutos de Hantzsch, foi observada uma baixa citotoxicidade
para todos os compostos ao longo dos tempos avaliados, com valores de IC50 acima da
concentração máxima de 500 µg/mL (primeiro ponto da curva de IC50) testadas nos tempos de
24, 48 e 72 após o tratamento, em macrófagos caninos DH82. Desta forma, para estas células, os
compostos químicos dos adutos de Hantzsch apresentaram um comportamento na curva de
citotoxicidade bem melhor que o grupo controle Anfotericina (AmB-D - IC50: 100 µg/mL). Já
nos macrófagos murinos J774.A1, somente nas concentrações mais altas, foi que os adutos de
Hantzsch demonstraram uma citotoxicidade considerável. Em macrófagos murinos o range
encontrado do IC50 foi entre 50-140 µg/mL, sendo o composto 8A4 (IC50: 50µg/mL) o mais
tóxico e o composto 8B5 (IC50: 140µg/mL) o menos tóxico.
Reimão e colaboradores (2010) avaliaram diferentes compostos derivados de 1,4
dihidropiridinas (obtidos através de Reações Multicomponentes de Hantzsch) e demonstraram
possuir ação Trypanosomatidea (T. cruzi e em diferentes espécies de Leishmania sp), além de
citotoxicidade aceitável in vitro, através de experimentos empregando o ensaio de MTT em
culturas secundárias de células de rim de macacos Rhesus (LLC-MK2) por 48 horas, com uma
variação do IC50% entre 33.48–588.73 µM. O composto pentamidina apresentou valor de
IC50% de 25,61 µM, sendo a maior citotoxicidade dentre os outros derivados das 1,4
dihidropiridinas testados. Esses achados corroboram com os nossos de citotoxicidade
demonstrando uma baixa/aceitável citotoxicidade dos compostos de Hantzsch através do ensaio
de MTT.
As possibilidades de fármacos obtidos de extrato natural ou composto sintético são
praticamente ilimitadas e qualquer um desses produtos pode ser candidato a fármaco para o
tratamento de uma doença. Em vista dessa vasta gama de candidatos, a triagem inicial requer
testes que sejam simples de manipular, reprodutíveis, fácil de quantificar (Sereno et al., 2007).
Nesse sentido, para verificação da citotoxicidade e “screening” de novas moléculas
farmacologicamente ativas (com ação direta contra protozoários) diferentes metodologias têm
sido empregadas: MTT, MABA, ODC, Vermelho Neutro, Citometria de Fluxo (fluoróforos
naturais - IP e 7-AAD).
Salomão, N.E.O. Discussão
70
Com os avanços da citometria de fluxo vários marcadores fluorescentes vêm sendo
desenvolvidos para os mais diversos estudos biológicos (Fouchet et al., 1993; Azas et al.,1997).
Alguns fluoróforos naturais, como o iodeto de propídio (IP) e o 7-amino-actinomicina D (7-
AAD), são os principais marcadores utilizados em testes de drogas contra Leishmania quando
realizados por esta tecnologia (Sereno et al., 2005, Rathelot et al., 2002). Estes compostos
fluorescentes ligam-se ao DNA das células intercalando-se inespecificamente entre as bases e
não atravessam a membrana celular por serem lipossolúveis. Portanto, quando isso ocorre é
indício de perda do potencial de membrana e assim da viabilidade celular.
A triagem inicial de compostos candidatos a drogas anti-Leishmania, de maneira
clássica, utiliza as formas promastigotas do parasito, devido à simplicidade e baixo custo do
cultivo durante os testes (Fumarola et al., 2004). Nesse sentido, nossa segunda abordagem
investigativa, uma vez determinado o valor de IC50 para cada um dos compostos estudados, foi
avaliar a eficácia terapêutica in vitro através da verificação do potencial leishmanicida em
formas promastigotas de L. infantum (cepa OP46) das drogas durante os tempos de tratamento de
24, 48 e 72 horas, através do ensaio de MTT.
A redução da viabilidade em formas promastigotas nos diferentes compostos testados
ocorreu logo em 24 horas de tratamento, entretanto, com valores de redução inferiores a 25% da
viabilidade das promastigotas de L. infantum. Já nos tempos subsequentes de acompanhamento
(48 e 72h) foi mais evidenciado o potencial leishmanicida dos compostos, principalmente no
tempo de 72 horas após o tratamento. Nos diversos trabalhos de testes de drogas contra
Leishmania sp não há um consenso sobre o quanto tempo ideal para avaliar o tratamento in vitro:
por 24 horas, 48 horas (Reimão et al., 2010; Maia et al., 2013) ou 72 horas (Rathelot et al., 2002;
Tasdemir et al., 2006; Palit & Ali, 2008). Neste estudo, o que se observa de maneira geral, em
48 horas após tratamento é uma redução entre 25% e 50% da viabilidade das formas
promastigotas em todos os compostos estudados. Se pensarmos que o valor de IC50 nos
macrófagos foi o primeiro ponto da curva sigmoide de dose-resposta construída para avaliação
da atividade leishmanicida em promastigotas, e que observamos resultados de valores de
percentual de inibição das promastigotas próximos ou igual a 50%, para as diferentes drogas,
temos um baixo índice de seletividade, ou seja, baixa ou nenhuma ação leishmanicida em 24 e
48 horas de tratamento (IC50 em células de mamíferos semelhante ao IC50 nas formas
promastigotas). O que nos chamou atenção, de forma interessantemente, é que o percentual de
redução das formas promastigotas, de maneira geral na maioria dos compostos, foi observado em
Salomão, N.E.O. Discussão
71
todos os pontos de diluição das concentrações testadas. Esse comportamento, diminuição da
concentração (<IC50) com permanência da redução da viabilidade em formas promastigotas, nos
evidencia um potencial leishmanicida em formas promastigotas dos compostos testados.
Já em 72 horas, foi possível observarmos valores de redução da viabilidade acima de
50%. No grupo das aldiminas, os compostos 3H8 (64,52%) e 3G2 (64,32%), e no grupo dos
adutos de Hantzsch, os compostos 8B5 (71,15%) e 8B6 (67,90%), após 72 horas mostraram um
alto percentual de morte contra as formas promastigotas do parasito da cepa OP46 de L.
infantum. Nossos resultados corroboram com outros ensaios in vitro que encontraram ação
leishmanicida de diferentes formulações de aldiminas e adutos de Hantzsch em promastigotas de
Leishmania (Palit & Ali, 2008; Al-Kahraman et al., 2010; Remião et al., 2010). Já Al-Kahraman
e colaboradores, em 2010, testaram uma série de compostos químicos de azometinas (que são
sintetizados a partir de reações de aminas aromáticas primárias) quanto as suas propriedades
leishmanicida in vitro e demonstraram inibição do crescimento do parasito com ação altamente
potente em relação às promastigotas de L. major. Palit & Ali, em 2008, testando 1,4-di-
hidropiridinas (amlodipina e lacidipina) demonstraram ser capaz de matar in vitro promastigotas
de L. donovani após 72 horas de tratamento. Já Reimão e colaboradores, 2010, demonstraram
que diferentes compostos testados de 1,4-di-hidropiridinas foram eficazes contra as formas
promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.)
major e Leishmania (L.) chagasi, bem como em forma amastigota de L. (L.) chagasi.
Diferente desse comportamento tardio de ação (72 horas) nas formas promastigotas
encontradas em alguns compostos das aldiminas e dos adutos de Hantzsch, na anfotericina
(AmB-D) foi possível evidenciar valores da atividade leishmanicida (próximos de 100%) em
todos os 3 tempos avaliados (24, 48 e 72 horas). Vale ressaltar que a AmB-D é a droga mais
potente anti-Leishmania disponível, com efeito demonstrado tanto in vitro quanto in vivo na
destruição de parasitos do gênero Leishmania tanto na forma promastigota quanto amastigota
(Thakur et al., 1994). Nossos resultados mostram claramente a importância de um maior tempo
de acompanhamento da ação dos fármacos (até 72 horas) para confirmação do real potencial
leishmanicida em formas promastigotas de diferentes drogas em testes in vitro (Tasdemir et al.,
2006; Palit & Ali, 2008; Sesana, 2009).
A maioria dos testes de drogas relatados na literatura quando não utilizam apenas a
avaliação sobre as formas promastigotas (Chan et al., 2003), empregam formas amastigotas
axênicas, cultivadas in vitro para avaliação da atividade leishmanicida in vitro (Shimony & Jaffe,
Salomão, N.E.O. Discussão
72
2008). Estes dois modelos de “screening” in vitro são válidos, mas não representam a forma do
parasito encontrada no hospedeiro vertebrado (amastigotas internalizadas em macrófagos).
Nesse sentido, nossa terceira abordagem investigativa contou com duas metodologias
(convencional por microscopia ótica e por citometria de fluxo) para a avaliação da eficácia
terapêuticas in vitro das drogas em formas amastigotas do parasito dentro de macrófagos. No
primeiro momento, discutiremos os resultados envolvendo a análises convencionais por
microscopia óptica.
Após 24 horas do tratamento, nossos resultados da análise por microscopia óptica
demonstraram uma redução no percentual de infecção nos macrófagos caninos DH82, com os
compostos de aldiminas 3I4, 3I5, 3H8 e 3H9, demonstrando “precocemente” um potencial
leishmanicida contra as formas amastigotas de L. infantum. De forma diferente, nenhum dos
compostos de adultos de Hantzsch testados e nem o grupo AmB-D apresentou redução no
percentual de infecção nas 24 horas de tratamento, demonstrando mais uma vez a importância de
ao desenharmos o delineamento experimental de avaliações de novos compostos com potencial
leishmanicida, para as diferentes condições e novas estratégias de experimentação, não devemos
escolher apenas um único tempo de avaliação.
Após o período de 48 horas de infecção e tratamento, observamos uma redução no
percentual de infecção nos compostos de aldiminas 3H8, 3H9 e 3D7 semelhante a redução
promovida pela AmB-D. No tempo de avaliação após 72 horas do tratamento, todos os
compostos químicos do grupo das Aldiminas apresentaram redução no percentual de infecção,
sendo importante destacar que a redução nos compostos 3H8 e 3H9 foram os maiores, com
resultados mais próximos ao obtido no grupo tratado com AmB-D. Nossos resultados
corroboram com os achados de Rathelot e colaboradores (2002) que também observaram através
de análises por microscopia optica a atividade leishmanicida in vitro em diferentes compostos
químicos derivados de azometinas, em macrófagos humanos imortalizados (THP-1) infectados
com L. infantum, após um período de 96 horas de tratamento.
Na avaliação do tratamento por microscopia óptica, todos os compostos de adultos de
Hantzsch (com exceção do composto 8A2) demonstraram reduzir a infecção nos macrófagos
caninos DH82, das formas amastigotas de L. infantum, após 48 horas e 72 horas. Palit e Ali, em
2008, também observaram após 48 horas de tratamento com 1,4-di-hidropiridinas (amlodipina e
lacidipina) uma inibição da infecção in vitro (bem como in vivo) em macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c infectados com promastigotas de L. donovani. Um perfil mais tardio de
Salomão, N.E.O. Discussão
73
ação dos compostos de adultos de Hantzsch também foi evidenciado por Reimão e
colaboradores, 2010, que demonstraram em diferentes compostos testados de 1,4-di-
hidropiridinas a sua eficácia contra as formas amastigota de L. (L.) chagasi em macrófagos
peritoneais, após 120 horas (5 dias) do tratamento e análise por microscopia óptica.
De maneira geral, nossos resultados da diminuição da “carga parasitária de
amastigotas dentro dos macrófagos” (referentes à razão do número de amastigotas por
macrófagos infectados) foi mais bem evidenciado no tempo após as 48 horas de tratamento em
quase todos os compostos testados de Adultos de Hantzsch (exceção para o composto 8B5) bem
como para a maioria das aldiminas (3I4, 3I5, 3H9 e 3G2), interessantemente, com valores
próximos da redução do grupo controle de AmB-D. Destacamos o comportamento do composto
de aldimina 3G2 que apresentou também uma redução em relação ao grupo tratado com AmB-
D. Esses resultados associados aos de redução no número de macrófagos infectados corroboram
entre si e intensificam a hipótese de que as aldiminas e adutos de Hantzsch tem ação
leishmanicida em formas amastigotas do parasito de L.infantum.
É importante ressaltar que para alguns compostos de aldiminas (3H7 e 3D7) não foi
possível obter três experimentos diferentes (com contagem de 300 macrófagos) para o tempo de
72 horas. Isso se deve as dificuldades operacionais da metodologia convencionalmente
empregada para avaliação e obtenção dos resultados dos testes de drogas in vitro. A contagem
manual das células em lâminas pela microscopia óptica é muito trabalhosa e demanda muito
tempo da obtenção do material pronto até a análise dos resultados. Durante o procedimento,
muitas vezes as células podem ser comprometidas ou perdidas, seja no momento da lavagem das
placas com o intuito de retirada das formas promastigotas que não infectaram os macrófagos, ou
no momento da coloração (emersão das lâminas nos corantes, tempo de fixação, corante velho,
etc). Trata-se de uma técnica que demanda muito tempo, trabalho e treinamento. Uma analise
importante que deve ser levada em consideração nas padronizações são a capacidade de volume
da placa, razão/proporção da quantidade de macrófagos e Leishmania, número de células que se
pretende contar ao microscópio óptico, o possível crescimento das células de culturas
secundárias no decorrer dos tempos de tratamento - podendo formar grumos ou rompimento das
mesmas - inviabilizando a contagem de um número celular ótimo e dificultando a
reprodutibilidade da técnica. Outro fator que deve ser levado em consideração é o tempo de
contagem das lâminas, que dependendo do número de compostos a serem testados e tempos de
avaliação, serão gerados um volume muito grande de lâminas podendo exigir que a contagem
Salomão, N.E.O. Discussão
74
seja feita por mais de uma pessoa, o que pode gerar um viés do observador/contador, devido ao
fator humano inserido na contagem das células, diretamente relacionado à experiência e treino
do contador (Sanches et al., 2007).
Ainda na terceira etapa das abordagens investigativa do estudo para a avaliação da
eficácia terapêuticas in vitro das drogas, em formas amastigotas do parasito, foi empregada como
ferramenta metodológica a citometria de fluxo. Para possibilitar a avaliação pela citometria de
fluxo, as promastigotas de L. infantum da cepa OP46 foram transfectadas com o gene repórter
para GFP. O intuito da produção da Leishmania infantum GFP e seu emprego na avaliação dos
testes de droga in vitro através da citometria de fluxo se faz necessário devido à carência de
testes mais rápidos e sensíveis que ajudaria na identificação de novos fármacos leishmanicidas.
Através da detecção do fenótipo de tais genes repórteres é possível detectar o parasito
indiretamente através da medida da fluorescência emitida em um aparelho (como o citômetro de
fluxo), o que removeria o sistema manual de análise (como convencionalmente é feita por
microscopia óptica), aumentando a sensibilidade, confiabilidade, reprodutibilidade e
conveniência, além de possibilitar a triagem em larga escala de novas drogas (Sereno et al.,
2007). Desta forma, a citometria de fluxo simplifica a etapa de triagem de drogas, possibilitando
a investigação da ação de drogas sobre as formas amastigotas de diferentes espécies de
Leishmania no interior dos macrófagos, além de ser facilmente reproduzível para descrever os
efeitos das drogas sobre os parasitos (Plock et al., 2001). A utilização de parasitos fluorescentes
(transfectados com GFP) associados à técnica de citometria de fluxo impulsiona o
desenvolvimento de testes de drogas mais rápidos e viáveis, tanto para drogas já conhecidas
como para novas moléculas e diferentes compostos químicos contra parasitos (Dube A & Gupta
R, 2009).
A proteína GFP que foi transfectada não possui atividade endógena e é auto
fluorescente em Leishmania, não necessitando de substrato, podendo ser facilmente detectada em
um fluorímetro ou citômetro de fluxo (Fouchet et al., 1993) e os parasitos mutantes não alteram
suas características morfológicas básicas (Chalfie, 1995; Rocha, 2009). Neste trabalho foi
demonstrado que a transfecção permitiu separar com sucesso a população de Leishmania
infantum cepa OP46GFP da população normal de Leishmania infantum cepa OP46. O forte sinal
da intensidade de fluorescência verde emitida pelos parasitos permitiu a análise pela citometria
de fluxo com separação completa entre a população transfectada (GFP) e a normal. Nossos
resultados demonstram que a transfecção não alterou o tamanho e a granulosidade dos parasitos
Salomão, N.E.O. Discussão
75
(gráficos FSC x SSC), bem como o perfil de crescimento e divisão celular (curva de crescimento
– dado não mostrado). Apesar de não termos avaliado se a transfecção do gene repórter para o
GFP promoveu alguma diferença na susceptibilidade a medicamentos, Rocha (2009) demonstrou
em um teste de droga in vitro empregando Glucantime e Anfotericina B, que a transfecção em
diferentes espécies de Leishmania não promoveu susceptibilidade as drogas, sendo semelhante
entre as espécies de Leishmania transfectadas (GFP) e seus respectivos controles não
transfectados.
Na avaliação por citometria de fluxo do percentual de infecção nos macrófagos
notamos uma maior ação dos diferentes compostos de Aldiminas no tempo de 48 horas do
tratamento, seja com uma maior redução na taxa de infecção dos macrófagos, seja no maior
número de compostos com atividade leishmanicida: aldiminas (3H7, 3H8, 3D7). Contudo,
também foi observada uma redução no percentual de infecção em 24 horas com o composto 3D7
e manutenção da redução em 72 horas pelo composto derivado de aldimina 3H7. Já na avaliação
por citometria de fluxo do tratamento in vitro com os diferentes compostos de adutos de
Hantzsch, destaca-se o composto 8B6 que apresentou e manteve uma diminuição no percentual
de infecção dos macrófagos em todos os tempos de tratamento, 24, 48 e 72 horas. Também foi
possível evidenciarmos redução promovida pela formulação do Aduto de Hantzsch em 24 horas,
além dos compostos 8A4 em 48 horas e 8A2 em 72 horas. Esses resultados obtidos confirmam o
potencial leishmanicida dos diferentes compostos de aldiminas e adultos de Hantzsch testados,
corroborando com nossos resultados de microscopia optica, bem como de outros trabalhos na
literatura (Rathelot et al., 2002; Palit & Ali, 2008; Reimão et al., 2010; Al-Kahraman et al.,
2010).
Não conseguimos obter resultados satisfatórios na estratégia de análise por citometria
de fluxo da avaliação do MFI dos macrófagos infectados com L.infantum cepa OP46 GFP nos
diferentes compostos de aldiminas e adultos nos diferentes tempos avaliados. De maneira geral
foi possível observar uma tendência de diminuição do MFI (dos macrófagos infectados) naquelas
drogas onde foi possível observar uma redução no número de macrófagos infectados. Nós
achamos que alterando a estratégia de análise dos dados da MFI, através de uma análise
específica do MFI dentro das subpopulações (high e low) de macrófagos infectados
(fluorescentes FL1- GFP) poderemos encontrar diferenças significativas entre os grupos nos
diferentes tempos.
Salomão, N.E.O. Discussão
76
Ao fazermos uma avaliação comparativa dos resultados entre as duas metodologias
empregadas para avaliação da atividade leishmanicida in vitro dos compostos contra formas
amastigotas do parasito internalizada em macrófagos, observamos algumas similaridade dos
resultados nas duas técnicas. Nossos resultados por citometria de fluxo demonstraram após 24
horas de tratamento que o grupo controle anfotericina (AmB-D) não foi capaz de promover uma
redução na porcentagem de macrófagos infectados, corroborando com nossos achados por
microscopia óptica, onde também não evidenciamos uma redução em 24 horas do tratamento
com a anfotericina AmB-D). Nesse sentido, em 48 horas de tratamento foi observada nas duas
metodologias uma redução do percentual de infecção para os compostos de aldiminas (3H8 e
3D7) e para os compostos de adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6), sendo em 72 horas também
observado a mesma redução para o composto de adutos de Hantzsch (8B6) entre as
metodologias.
A diferença dos resultados encontrados entre a microscopia convencional e a
citometria de fluxo estão diretamente relacionados às vantagens da técnica de citometria. Estudos
demonstraram que a citometria de fluxo melhora e simplifica o procedimento de triagem de
drogas (Plock et al., 2001), com maior rapidez e sensibilidade, permite a contagem mais rápida
de um número muito superior de células (centenas até milhares de células por segundo) quando
comparada à contagem em microscopia. Apesar do preparo do material/experimento da
citometria de fluxo ter um trabalho semelhante ao da microscopia, não exige que as células
sejam fixadas e coradas em lâminas, sendo a contagem feita em tubos que são retirados após os
tempos de tratamento determinados, lavados e levados direto para a leitura em citômetro de
fluxo. Uma grande vantagem é que independente do número de amostras testadas, a leitura
completa é feita no mesmo dia, após cada tempo de tratamento e os resultados são obtidos e
analisados de maneira rápida e dinâmica. É possível observar que a técnica fornece quantificação
mais exata e taxas de infecção mais precisas do que os resultados obtidos por microscopia
convencional (Azas et al.,1997; Di Giorgio, C. et al., 2000).
Uma dinâmica interessante na busca de novas drogas é o aproveitamento máximo de
uma molécula. Com esta finalidade, profissionais químicos trabalham em alterações estruturais
das moléculas na busca da melhor condição de solubilidade e potencial atividade contra
determinado microorganismo. As mais diversas mudanças podem ser realizadas como a troca de
radicais, mudança na polaridade, substituição, inserção ou deleção de uma estrutura. Com este
objetivo, as moléculas testadas neste trabalho sofreram modificações no intuito de melhorar a
Salomão, N.E.O. Discussão
77
atividade leishmanicida das mesmas. Após o teste de susceptibilidade das 12 moléculas
derivadas de aldiminas e adultos de Hantzsch verificamos que, principalmente, devido a
similaridade dos resultados em amastigotas na técnica de microscopia e citometria de fluxo, 4
delas (3H8, 3D7, 8A4 e 8B6) mostraram uma atividade leishmanicida comparadas a
Anfotericina uma das drogas de referência. Ao buscarmos drogas com ação em formas
amastigotas quanto em promastigotas do parasito de L.infantum podemos destacar o composto de
aldimina 3H8 e de adultos de Hantzsch 8B6 que apresentaram excelentes de redução da
atividade em ambas as formas do parasito.
Nossos resultados in vitro demonstram à baixa citotoxicidade e satisfatória atividade
leishmanicida tanto em promastigotas quanto em amastigotas de L. infantum, principalmente dos
compostos de aldiminas (3H8 e 3D7) e adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) testados. Nosso
conjunto de dados sugere que os compostos aqui testados possuem ação leishmanicida in vitro e
merecem ser considerados como candidatos para prosseguirem em estudos de quimioterapia
experimental in vivo para leishmaniose visceral. Acreditamos que os resultados gerados no
estudo abrem novas perspectivas para o avanço no desenvolvimento de novos fármacos para
leishmaniose visceral e tegumentar empregando as aldiminas e os adutos de Hantzsch, além do
desenvolvimento através da citometria de fluxo de metodologias in vitro mais acuradas e
dinâmicas para o reconhecimento de potencias drogas anti-Leishmania, e posterior
direcionamento para a quimioterapia experimental in vivo.
8 CONCLUSÃO
Salomão, N.E.O. Conclusão
79
O conjunto de dados obtidos neste estdo que realizou a avaliação in vitro do potencial
leishmanicida dos compostos sintéticos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch, através da
avaliação da citotoxicidade em macrófagos murino da linhagem (J774.A1) e macrófagos canino
da linhagem (DH82) pelo ensaio de MTT e da avaliação em formas promastigotas (ensaio de
MTT) e amastigotas de L. infantum da cepa OP46 e OP46GFP, por microscopia óptica e por
citometria de fluxo, respectivamente, nos permitiu estabelecer a seguinte conclusão:
Se levarmos em conta a similaridade encontrada nos resultados de microscopia óptica
e citometria de fluxo, na ação dos compostos contra as formas amastigotas de L. infantum, os
compostos 3H8 e 3D7 (aldiminas) 8A4 e 8B6 (adutos de Hantzsch) seriam selecionados para
continuação dos experimentos in vivo. Dentre estes compostos podemos destacar o 8B6 que foi
capaz de promover e manter a redução no percentual de infecção de macrófagos ao longo dos
três tempos de tratamento avaliados (24, 48 até 72 horas) pela técnica de citometria de fluxo.
9 PERSPECTIVAS
Salomão, N.E.O. Perspectivas
81
A partir da realização deste trabalho foi possível obter resultados promissores no
âmbito dos estudos in vitro de testes de drogas, utilizando compostos sintéticos para avaliação da
ação leishmanicida em formas promastigotas e amastigotas de L. infantum, com diferentes
técnicas. Avaliamos a ação dos compostos sintéticos derivados de Aldiminas e Adutos de
Hantzsch e os resultados obtidos nos permitem agregar novas perspectivas que contribuirão para
ampliar os conhecimentos no campo de testes de drogas in vitro. Nesse sentido, a continuidade
desse trabalho tem como principais perspectivas:
✓ Avaliar o potencial leishmanicida in vitro a partir da associação entre os compostos químicos
de Aldiminas (3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que apresentaram melhor
potencial leishmanicida;
✓ Avaliar a ação leishmanicida dos compostos derivados de Aldiminas e Adutos de Hantzsch
nas formas amastigotas fluorescentes de L. infantum da cepa OP46, transfectadas com o gene
repórter RFP, por citometria de fluxo;
✓ Prosseguir com experimentos de testes de drogas in vivo no modelo hamster, com os
compostos químicos de Aldiminas (3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que
apresentaram melhor potencial leishmanicida;
✓ Avaliar a susceptibilidade e o potencial leishmanicida dos compostos químicos de Aldiminas
(3H8 e 3D7) e Adutos de Hantzsch (8A4 e 8B6) que apresentaram melhor potencial
leishmanicida em diferentes espécies de Leishmania (L. braziliensis, L. guyanensis,
L.amazonensis) causadoras da leishmaniose tegumentar americana.
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11 ANEXOS
Salomão, N.E.O. Anexos
95
Anexo 1: Informação da síntese dos compostos derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch
SÍNTESE DE ALDIMINAS:
As aldiminas - bases de Schiff – avaliadas neste estudo (n=1-7) sendo: 1:3D7; 2: 3G2; 3: 3H7; 4:
3H8; 5: 3H9; 6: 3I4 e 7: 3I5; foram obtidas pela condensação assistida por micro-ondas entre os
correspondentes aldeídos e aminas aromáticas (Esquema 1). Os reagentes foram solubilizados em
etanol absoluto e as soluções resultantes foram irradiadas em reator CEM Discover® durante um
período de 2 minutos. Concluídas as reações, os produtos foram isolados por recristalização. Os
compostos sintetizados foram completamente caracterizados por IR (infravermelho), RMN
(ressonancia magnética nuclear) (1H and 13C) e espectros de massa (Pacheco et al., 2013).
Esquema 1: Síntese de bases de Schiff (compostos 1-7) utilizando irradiação por micro-ondas.
(Composto 1: 3D7): 2-(((1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)allylidene)amino)phenol
Mp (ponto de fusão): 127 ºC. IR (neat, cm-1) (banda do infravermelho): 3075, 2924, 2854, 1627, 1607, 1584,
1518, 1454, 1341, 1293, 1261, 1235, 1158, 1103, 1041, 991, 959, 802, 786, 756, 741, 696, 673. 1H NMR (RMN
ressonancia nuclear magnética ) (200 MHz, DMSO-d6): 6.74-7.26 (m, 5H), 7.51-7.68 (m, 2H), 7.75 (t, 1H, J
= 7.4 Hz), 7.92-8.08 (m, 2H), 8.55 (d, 1H, J = 8.7 Hz, CH=N), 9.13 (s, 1H, OH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-
d6): 116.1, 119.5, 124.6, 127.7, 128.4, 130.1, 133.2, 133.7, 130.2, 137.0, 137.9, 148.0, 151.2, 160.3. HRMS (ESI,
IT-TOF) calculado para: C15H13N2O3+: 269.0921; encontrado: 269.0811.
(Composto 2: 3G2): (1E,2E)-N,3-diphenylprop-2-en-1-imine
_
Salomão, N.E.O. Anexos
96
Mp (ponto de fusão): 105-106 ºC. IR (neat, cm-1) : 3049, 1623, 1599, 1571, 1482, 1446, 1148, 1073, 993, 982,
958, 747, 685. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 7.06-7.53 (m, 10H), 7.58-7.80 (m, 2H), 8.38 (d, 1H, J = 8.5
Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 120.9, 125.9, 127.6, 128.4, 129.0, 129.2, 129.6, 135.5, 144.2,
151.5, 162.0. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H14N+: 208.1121; encontrado: 208.1061.
(Composto 3: 3H7): (1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)-N-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine
Mp (ponto de fusão): 180 ºC (dec.). IR (neat, cm-1) : 3079, 3031, 1622, 1596, 1576, 1568, 1506, 1339, 1253,
1158, 1103, 996, 967, 857, 786, 755, 740, 695. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 7.23 (dd, 1H, J = 15.7, 8.9
Hz), 7.41 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.67 (td, 1H, J = 7.8, 1.3 Hz), 7.84-7.74 (m, 2H), 8.04-8.04 (m, 2H), 8.27 (d, 2H, J
= 8.9 Hz), 8.54 (d, 1H, J = 8.8 Hz, CH=N). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 121.8, 124.6, 124.9, 128.7, 129.6,
130.7, 132.1, 133.7, 140.2, 148.2, 157.0, 164.8. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H12N3O4+: 298.0822;
encontrado: 298.0614.
(Composto 4:3H8): (1E,2E)-N-(4-methoxyphenyl)-3-(2-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine
Mp (ponto de fusão): 97-98 ºC. IR (neat, cm-1) : 3055, 2939, 2842, 1607, 1568, 1523, 1504, 1469, 1444, 1343,
1300, 1294, 1247, 1157, 1105, 1032, 971, 945, 847, 833, 784, 743, 695, 676. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6):
3.76 (s, 3H, OCH3), 6.95 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.07-7.36 (m, 3H), 7.48-7.62 (m, 2H), 7.74 (t, 1H, J = 7.6 Hz)
7.94-8.08 (m, 2H), 8.51 (d, 1H, J = 8.7 Hz, CH=N) . 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 55.3, 114.4, 122.6, 124.6,
_
_
_
Salomão, N.E.O. Anexos
97
128.4, 130.0, 130.1, 133.1, 133.6, 136.4, 143.7, 148.0, 158.3, 158.9. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para:
C16H15N2O3+: 283.1077; encontrado: 283.0910.
(Composto 5: 3H9): 2-(((1E,2E)-3-(2-nitrophenyl)allylidene)amino)benzonitrile
Mp (ponto de fusão): 147-148 ºC. IR (neat, cm-1) : 3077, 2226, 1633, 1612, 1589, 1569, 1519, 1475, 1440,
1348, 1159, 1098, 989, 961, 849, 784, 771, 760, 742, 702, 676. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 7.16-7.52 (m,
3H), 7.56-7.93 (m, 5H), 7.95-8.20 (m, 2H), 8.57 (d, 1H, J = 8.9 Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6):
107.1, 117.4, 119.1, 124.6, 126.7, 128.8, 129.5, 130.7, 132.0, 133.3, 133.7, 134.4, 140.5, 148.2, 153.6, 165.3.
HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C16H12N3O2+: 278.0924; encontrado: 278.0745.
(Composto 6: 3I4): (1E,2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-imine
Mp (ponto de fusão): 145-146 ºC. IR (neat, cm-1) : 3106, 3033, 2902, 2841, 1625, 1595, 1568, 1504, 1331,
1250, 1152, 1102, 1020, 991, 958, 861, 852, 820, 805, 752, 695, 668. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): 3.80
(s, 3H, OCH3), 6.91-7.16 (m, 3H), 7.25-7.50 (m, 3H), 7.65 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 8.22 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.35 (d,
1H, J = 8.9 Hz, CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 55.3, 114.5, 121.7, 125.0, 125.6, 127.8, 129.7, 144.6,
146.8, 157.7, 160.9, 165.3. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C16H15N2O3+: 283.1077; encontrado:
283.0908.
(Composto 7: 3I5): 2-(((1E,2E)-3-(4-nitrophenyl)allylidene)amino)phenol
_
_
Salomão, N.E.O. Anexos
98
Mp (ponto de fusão): 158-160 ºC. IR (neat, cm-1) : 3349, 3025, 1610, 1589, 1506, 1483, 1416, 1377, 1334,
1317, 1243, 1149, 1101, 981, 830, 794, 754, 688. 1H NMR (200 MHz, CDCl3): 6.90 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.01
(d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.12-7.37 (m, 5H), 7.68 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 8.45-8.55 (m, 1H,
CH=N). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6): 115.4, 115.6, 120.3, 124.4, 128.1, 129.9, 132.6, 135.2, 140.5, 141.9,
148.1, 152.9, 156.7. HRMS (ESI, IT-TOF) calculado para: C15H13N2O3+: 269.0921; encontrado: 269.1110.
SÍNTESE DE ADUTOS DE HANTZSCH
Os adutos de Hantzsch avaliados nesse estudo, (n=8-12) sendo, 8: 8A2; 9: 8A3; 10: 8A4; 11:
8B5 e 12: 8B6, foram obtidos de acordo com Pacheco e colaboradores (2013). O aldeído (1
mmol), acetoacetato de etilo (1 mmol), acetato de amonio (1 mmol), e dimedona (1 mmol)
foram dissolvidos em 5 mL de etanol contendo ácido lático (10% molar) e a mistura foi
agitada à temperatura ambiente durante 6 horas. Depois da reação, o resíduo foi extraído com
acetato de etilo e o material foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica
(Pacheco et al., 2013)..
Esquema 2: Síntese de Adutos de Hantzsch 8-12 utilizando ácido láctico como catalisador.
IMPORTANTE: Os adutos de Hantzsch 8A2, 8A3, 8A4, 8B5 e 8B6 correspondem aos
compostos 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente, demonstrados no esquema acima.
_
Salomão, N.E.O. Anexos
99
Anexo 2: Tabela com valores de IC50 de cada composto químico derivado de aldiminas e
adutos de Hantzsch, avaliados nos macrófagos murino da linhagem J774A.1 e macrófagos
canino da linhagem DH82, nos tempos de 24, 48 e 72 horas de avaliação.
1) aldiminas - IC50 em macrófago canino (DH82)
Composto AmB 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2
24 Horas 430810 33.40 20.27 87.92* 49.92* 44.42* 36.60 20.87*
48 Horas 404 21.70* 17.81* 105.8 ˜ 88.07 78.41 27.21 39.06
72 Horas 105,1* 47,62 20.85 131.9 78.31 77.95 11.84* 79.66
2) aldiminas - IC50 em macrófago murino (J774.A1)
Composto AmB 3I4 3I5 3H7 3H8 3H9 3D7 3G2
24 Horas 224,2 14,89* 13,36 2358 22,38 18,49 20,87* 6,257*
48 Horas ~ 255.0 ~ 24.46 ~ 23.51 ~ 49.06 ~ 24.20 21,8 37,49 13,76
72 Horas 102,2* 4,13E-06 1,554* 45,5* 16,5* 14,13* 27,36 6,353
3) adutos de Hantzsch - IC50 em macrófago canino (DH82)
Composto AmB 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6
24 Horas 430810 290,1 1081 1633 318,3 7,86E+07
48 Horas 404 4,44E+14 456812 169,8 0 0,008002
72 Horas 105,1* 1,27E-09 não teve 0.0 5.110e- 008 7.265e- 007
4) adutos de Hantzsch - IC50 em macrófago murino (J774.A1)
Composto AmB 8A2 8A3 8A4 8B5 8B6
24 Horas 224,2 129,2 104,9 47,35 181,3 186,9
48 Horas ~ 255.0 1,45E+02 232,1 37,09 250,3 214,2
72 Horas 102,2* 125,1 61,52 51,71 142,9 115,2