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USO DE FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA E SISTEMATIZAÇÃO MATEMÁTICA
NO ESTUDO DOS SISTEMAS DE TRANSPORTE DE CÁTIONS EM FUNGOS E
PLANTAS
LUIZ CESAR ALI NOVAES FARIA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
NOVEMBRO 2006
USO DE FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA E SISTEMATIZAÇÃO MATEMÁTICA
NO ESTUDO DOS SISTEMAS DE TRANSPORTE DE CÁTIONS EM FUNGOS E
PLANTAS
LUIZ CESAR ALI NOVAES FARIA
Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em
Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
NOVEMBRO 2006
USO DE FERRAMENTAS DE BIOINFORMÁTICA E SISTEMATIZAÇÃO MATEMÁTICA NO ESTUDO DOS SISTEMAS DE TRANSPORTE DE CÁTIONS EM FUNGOS E
PLANTAS
LUIZ CESAR ALI NOVAES FARIA
Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 10 de novembro de 2006. Comissão Examinadora: _______________________________________________ Prof. Carlile Campos Lavor (Dr., Engenharia de Sistemas) – UNICAMP _______________________________________________ Prof. Carlos Jorge Logullo de Oliveira (Dr., Embriogênese de Invertebrados e Metabolismo Energético) – UENF _______________________________________________ Prof. Enrique Medina-Acosta (Dr., Parasitologia Médica e Molecular) – UENF _______________________________________________ Prof. Victor Martin Quintana Flores (Dr., Biociências e Biotecnologia) – UENF
(revisor) _______________________________________________ Prof. Arnoldo Rocha Façanha (Dr., Transporte Iônico e Bioenergética) – UENF
(orientador) _______________________________________________ Prof.ª Anna L. Okorokova-Façanha (Dra., Genética Molecular e Bioquímica de Eucariotos Inferiores) – UENF
(co-orientadora)
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus orientadores, Arnoldo e Anna, por todo o incentivo que
sempre me deram e, principalmente, por serem amigos que me apoiaram, me
criticaram e me elogiaram na hora certa, fazendo com que eu crescesse como
pessoa e como aluno.
À Mestre Inga Gonçalves, por ser sempre uma boa influência e uma boa
amizade. A ela e a Michele Catunda, obrigado pelos dados de cinética das bombas
de H+ em cana-de-açúcar.
Ao Doutor Alessandro Coutinho Ramos, pela amizade, pelo incentivo e pelo
companheirismo. Muito obrigado pelos dados dos fluxos de H+ em fungo micorrízico.
Que bons ventos te guiem nas terras d´além mar.
Ao Professor Tarcísio Thiebaut, pelos ensinamentos e pelo CD do Chico
Buarque.
Ao Professor Carlile Lavor, pela orientação e apoio no campo da matemática.
À Mestre Ana Cristina Dias Machado Lustozza pela colaboração nos estudos
comparativos de localização de transportadores na levedura de fissão.
Aos Professores Fábio Lopes Olivares e Gonçalo Apolinário de Souza Filho
por todo apoio no acesso ao banco de dados do projeto SUCEST.
Aos meus pais, por me apoiarem até mesmo nas coisas mais estranhas e por
me fazerem perseverar.
À minha madrinha, Maria, por tudo.
Aos meus irmãos de sangue: Emano, Mônica e Pim.
Aos meus irmãos de coração: Lucio, Alex, Paulo, Emílio, Lucas, Raul, Daniel,
Ygor, Eldo, Fabrízio, Predileta, Júnior, Gabriela, Amarelo, Antônio Leandro, João
Victor, Felipe, Luiz Cláudio, Sheylla, Rogato, Rubia, Ivana, João, Nelson e Mary.
Aos meus irmãos de insanidade: Ismael, Mariana, Luã, Tunay, Jão, Diogo,
Tonim, David, Rafael, Hamilton, Marcele, Guilherme, Dimas e Nunes.
Aos meus amigos da Equipe de Música do Projeto Túnel do Tempo e da
Banda “E Agora José?”.
À Aline, minha noiva, pela amizade, pelo amor e pelo carinho.
E obrigado a Deus, que me deu paciência. Pois se tivesse me dado força, eu
teria quebrado tudo.
"Entender a natureza é como aprender a
jogar xadrez somente assistindo a partida"
Richard Feynmann
vi
SUMÁRIO
Índice de Tabelas ...........................................…...............................................
Índice de Figuras ..............................................................................................
Lista de Abreviações ........................................................................................
RESUMO ..........................................................................................................
ABSTRACT ......................................................................................................
1- INTRODUÇÃO .............................................................................................
1.1- Sistematização matemática ............................................................
1.2- Utilização de ferramentas de bioinformática ..................................
1.3- Transportadores de membrana ......................................................
1.4- Estudo do transporte iônico em fungos e plantas ..........................
1.5- O modelo biológico: Schizosaccharomyces pombe .......................
1.6- Fungo Micorrízico como modelo para o estudo do fluxo de H+ ......
1.7- Estudos do transporte de H+ em cana-de-açúcar ..........................
2- OBJETIVOS .................................................................................................
3- MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................
3.1- Transportadores de cátions em S. pombe .....................................
3.1.1- Mineração de dados em bancos de dados .........................
3.1.1.1- Coleta de seqüências de transportadores de cátions
em Saccharomyces cerevisiae .................................................
3.1.1.2- Busca com a ferramenta BLAST .................................
3.1.1.3- Busca por meio de palavras-chave ..............................
3.1.1.4- Coleta de seqüências de transportadores de cátions
em outros organismos ...............................................................
3.1.2- Alinhamento de seqüências ................................................
3.1.3- Identificação de segmentos transmembrana .......................
3.1.4- Análises filogenéticas ..........................................................
3.1.5- Classificação da informação ................................................
3.2- Análise do fluxo de H+ em hifas de Gigaspora margarita ...............
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vii
3.2.1- Aplicação da Transformada Discreta de Fourier .................
3.3- Análise dos transportadores de H+ em Saccharum sp. L. ..............
3.3.1- Mineração de dados ............................................................
3.3.2- Ajuste do número de leituras por tecido ..............................
4- RESULTADOS .............................................................................................
4.1- Transportadores de cátions em Schizosaccharomyces pombe .....
4.2- Fluxo de H+ em hifas de Gigaspora margarita ...............................
4.3- Transporte de prótons em Saccharum sp. L. .................................
5- DISCUSSÃO ................................................................................................
5.1- Transportadores de cátions em Schizosaccharomyces pombe .....
5.1.1- Transportadores de sódio (Na+) ..........................................
5.1.2- Transportadores de potássio (K+) ........................................
5.1.3- Transportadores de cálcio (Ca2+) ........................................
5.1.4- Transportadores de magnésio (Mg2+) .................................
5.1.5- Transportadores de metais pesados ...................................
5.1.6- Visão geral sobre os Transportadores de cátions em
Schizosaccharomyces pombe .......................................................
5.2- Análise dos fluxos de H+ na interação micorrízica arbuscular ........
5.3- Expressão e Atividade dos Transportadores de H+ em
Saccharum sp. L. ..................................................................................
6- CONCLUSÕES ............................................................................................
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................
ANEXO I - Leitura dos fluxos de H+ por micro-sonda vibrátil
ANEXO II - Análise bioquímica das bombas de H+
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viii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1.1. Doenças de Homo sapiens ligadas à presença de
transportadores de cátions deficientes e os genes homólogos
correspondentes encontrados em S. pombe .................................................
Tabela 4.1. Transportadores de cátions no genoma de S. pombe e S.
cerevisiae .......................................................................................................
Tabela 4.2. Classificação (TC) dos produtos gênicos de S. pombe ..............
Tabela 4.3. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família
MIT, de transportadores de íons metálicos em S. pombe (Sp) e S.
cerevisiae (Sc) ................................................................................................
Tabela 4.4. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família
Trk, de transportadores de potássio em S. pombe (Sp) e S. cerevisiae (Sc).
Tabela 4.5. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família
CPA1 de S. pombe (Sp) e S. cerevisiae (Sc) .................................................
Tabela 4.6. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores de
Na+ de S. pombe (Sp) e H. sapiens (Hs) .......................................................
Tabela 4.7. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores de
Na+ de S. pombe (Sp) e A. thaliana (At) ........................................................
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ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 4.1. Alinhamento dos dois primeiros segmentos transmembrana dos
transportadores da família MIT de S. pombe .................................................
Figura 4.2. Dendograma construído com transportadores de Mg2+ de
espécies de fungos, plantas, mamíferos e uma bactéria ...............................
Figura 4.3. Dendograma construído com transportadores de Na+ de
espécies de fungos, mamíferos, um invertebrado e uma planta ......................
Figura 4.4. Análise de domínios transmembrana de transportadores CPA1.
Figura 4.5. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas
de Gigaspora margarita em meio com fosfato e sem adição de fluido
apoplástico (controle) .....................................................................................
Figura 4.6. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas
de Gigaspora margarita em meio com fosfato e adição de 10μL de fluido
apoplástico .....................................................................................................
Figura 4.7. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas
de Gigaspora margarita em meio com fosfato e adição de 20μL de fluido
apoplástico .....................................................................................................
Figura 4.8. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas
de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e sem adição de fluido
apoplástico (controle) .....................................................................................
Figura 4.9. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas
de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e adição de 10μL de fluido
apoplástico .....................................................................................................
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x
Figura 4.10. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em
hifas de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e adição de 20μL de
fluido apoplástico ............................................................................................
Figura 4.11. Ocorrência de Seqüências Expressas (ESTs) para a P-H+-
ATPase, V-H+-PPiase e as subunidades A e B da V-H+-ATPase
........................................................................................................................
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xi
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABC – “ATP-binding cassette”, domínio ligador de ATP ACMA – 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina ATP – adenosina trifosfato BLAST – “Basic Local Alignment Search Tool”, Ferramenta de Busca por
Alinhamentos Locais CaCA – “Ca2+:cation antiporter”, Tranportador antiporte Ca2+:cation CCC – “Cation-chloride cotransporter”, Co-transportador cátion-cloreto CDF – “Cation diffusion facilitator”, Facilitador de difusão de cátion CPA1 – “Monovalent cation:proton antiporter-1”, Transportador antiporte cátion
monovalente:próton-1 CPA2 – “Monovalent cation:proton antiporter-2”, Transportador antiporte cátion
monovalente:próton-2 Ctr2 – “Copper transporter-2”, Transportador de cobre-2 DNA – Ácido desoxirribonucléico EC – “Enzyme Commission”, Comissão de Enzima EST – “Expressed Sequence Tags”, Identificadores de Seqüências Expressas FeT – “Low-affinity Fe2+ transporter”, Transportador de Fe2+ de baixa afinidade GO – “Gene Ontology”, Ontologia gênica HMT – “Heavy Metal Transporter”, Transportador de Metal Pesado KUP – “K+ Uptake”, Influxo de K+
MDR – “multidrug-resistant”, resistência a drogas múltiplas MHP – “Metal homeostasis protein”, Proteína de homeostase de metal Mid1 – “The Yeast Stretch-Activated, Cation-Selective, Ca2+ Channel”, Canal de
Ca2+, cátion-seletivo, ativado por tensão das leveduras MIT – “CorA Metal Ion Transporter”, Transportador de íon metálico NCBI – “National Center for Biotechnology Information”, Centro Nacional para
Informação em Biotecnologia NiCoT – “Ni2+-Co2+ Transporter”, Transportador Ni2+-Co2+
NLM – “National Library of Medicine”, Biblioteca Nacional de Medicina NMR – nuclear magnetic resonance, ressonância magnética nuclear Nramp – “Metal ion (Mn2+-iron) transporter”, Transportador de íon metálico (Mn2+-
ferro) OFeT – “Oxidase-dependent Fe2+ transporter”, Transportador de Fe2+ dependente de
oxidase ORF – “Open Reading Frame”, Seqüência aberta de leitura P-ATPase – ATPase tipo P SIB – “Swiss Institute of Bioinformatics”, Instituto Suíço de Bioinformática SIT – “Siderophore-Iron Transporter”, Transportador Sideroporo-Ferro TC – “Transport Commission” Trk – “K+ transporter”, Transportador de K+
VIC – “Voltage-gated ion channel”, Canal iônico acoplado à voltagem ZIP – “Zinc (Zn2+)-iron (Fe2+) permease”, Permease zinco-ferro
xii
RESUMO
A conclusão de diversos projetos genoma tem gerado uma crescente
aplicação de ferramentas de bioinformática para ampliar o acesso e processar as
informações armazenadas em bancos de dados. Paralelamente, os avanços
científicos, principalmente na área biológica, têm possibilitado a geração de grandes
quantidades de dados e a configuração de sistemas cada vez mais complexos, os
quais demandam um nível de sistematização matemática capaz de explorar a
informação neles contida. Neste trabalho, estas duas visões foram empregadas no
estudo de sistemas de transporte transmembranar, na compilação de dados
experimentais obtidos anteriormente pela equipe. Os transportadores de membrana
são peças-chave no metabolismo celular, atuando nos processos de homeostase e
nutrição. Estas proteínas foram abordadas sob a ótica de três temas distintos neste
trabalho: i) classificação filogenética e funcional das proteínas transportadoras de
cátions presentes no genoma da levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe,
através de data mining em diferentes bancos de dados (Swiss-Prot, GeneDB S.
pombe, NCBI) e análises comparativas entre as seqüências obtidas, utilizando-se o
ClustalW e Phylodendron; ii) a análise dos fluxos de H+ em hifas do fungo micorrízico
Gigaspora margarita, por meio da aplicação de Transformadas Discretas de Fourier;
e, iii) estudo comparativo da expressão e atividade dos transportadores de H+ em
Saccharum sp. L., utilizando dados obtidos do banco de dados SUCEST e dados
relativos à atividade catalítica e ao transporte de prótons através da membrana. Os
resultados obtidos são discutidos tendo em vista o desenvolvimento de futuras
estratégias para investigação destes sistemas, que possibilitem a expansão do uso
destas técnicas, bem como a confirmação dos modelos e hipóteses formulados
neste campo.
Palavras-chave: Biologia computacional, H+-ATPase vacuolar, H+-pirofosfatase,
transporte iônico, FMA, cana-de-açúcar
xiii
ABSTRACT
The conclusion of various genome projects has generated an increasing need
for bioinformatics tools to extend the access and use of the information stored in
databases. Parallel to this, scientific advances, mainly in the biological area, have
generated data that delineate very complex systems which have demanded a higher
level of mathematical systematization to elaborate and explore the information hidden
in such complexity. In this work, these two approaches were used to study
transmembranar transport systems for the compilation of experimental data
previously obtained by our group. Membrane transporters are key protagonists of
cellular metabolism, as they play a key role in both homeostasis and nutrition
processes. Three distinct issues have been addressed in this work: i) a phylogenetic
and functional classification of cation transporters encoded in the genome of the
fission yeast Schizosaccharomyces pombe, by means of data mining in different
databases (Swiss-Prot, GeneDB S. pombe, NCBI) and comparative analysis
between the sequences using the ClustalW and Phylodendron softwares; ii) the
analysis of H+ fluxes from Gigaspora margarita mycorhizal fungal hyphaes by means
of the application of Fast Fourier Transforms; and, iii) a comparative study of the
expression and activity of H+ transporters from Saccharum spp. L., which used data
obtained from the SUCEST database and from catalytic activity and proton transport
across membrane vesicles. The results obtained are discussed in light of the
development of future strategies for investigation of these systems aiming to expand
the potential of these techniques as well as to confirm the models and hypotheses
formulated in this field.
Keywords: computational biology, vacuolar H+-ATPase, H+-pyrophosphatase, ion
transport, AMF, sugarcane
1
1- INTRODUÇÃO
1.1- Sistematização matemática
Tornam-se cada vez mais patentes os benefícios das colaborações entre
cientistas de diferentes áreas no desenvolvimento de projetos interdisciplinares e a
necessidade de que os pesquisadores resgatem a noção mais abrangente da
ciência. O que se observa atualmente é uma retomada, ainda que tímida, do
reconhecimento de que a utilização apropriada da matemática pode auxiliar na
interpretação de qualquer tipo de dado (Cohen, 2004). No estudo de mecanismos de
transdução de sinal, as aplicações incluem a modelagem da função de canais
mecanossensíveis, o cálculo do fluxo de cálcio em compartimentos subcelulares e a
predição computacional dos resíduos-chave em superfícies de interação de
proteínas (Ray et al., 2004). Além da utilização da matemática em outros campos da
biologia como ecologia, evolução e filogenia, podemos destacar ainda a aplicação
de modelos probabilísticos gráficos à organização de dados conflitantes gerados por
seqüenciamento automático em larga-escala de projetos genoma e proteoma
(Friedman, 2004), e o emprego de equações diferenciais para averiguar se
processos dinâmicos simples podem construir uma ponte sobre o presumido
“abismo de informação” entre a quantidade de informação nos genomas dos
organismos e a grande variedade de padrões encontrados na natureza (Cho, 2004).
Neste trabalho buscamos utilizar conhecimentos da área matemática e
computacional para o estudo de problemas biológicos relacionados aos
transportadores de cátions de fungos e plantas.
1.2- Utilização de ferramentas de bioinformática
O uso de uma abordagem bioinformática na apreciação de um problema é de
grande importância, visto que com o computador o pesquisador pode lidar com
grandes quantidades de dados mais facilmente, possibilitando sondar a complexa
dinâmica da natureza através de programas especiais (Luscombe et al., 2001),
2
gerando eletronicamente informação relevante que pode ser utilizada para melhor
formulação de novas hipóteses, experimentos e modelos.
A bioinformática é classicamente definida como o conjunto de abordagens
computacionais utilizadas no armazenamento e busca, bem como na análise ou na
simulação, da composição e/ou da estrutura das biomoléculas (Counsell, 1999). Em
outras palavras, é a aplicação da tecnologia de informática na organização e no
entendimento, em larga escala, da informação associada à biologia molecular
(Luscombe et al., 2001), bem como à bioquímica e à biologia celular. Existe uma
vasta quantidade de dados sendo gerados por meio de técnicas de seqüenciamento
de alta processividade, estimulando o surgimento de novos recursos computacionais
para o gerenciamento, manutenção e acesso aos bancos de dados, e novos
serviços que explorem a informação biológica nestes contida (Venkatesh, 1999).
A bioinformática não se limita apenas à análise de seqüências genéticas. Sua
utilização se expandiu e se diversificou no que se chama de era pós-genômica,
abrangendo outros aspectos das biomoléculas. Um desses avanços foi no sentido
de avaliar as funções e associações dos genes através da presença de domínios
específicos, campo da bioinformática conhecido como genômica funcional (Counsell,
1999). Ainda, alguns campos da biologia que precedem a bioinformática utilizam-se
dos novos recursos, como a genômica comparativa, que analisa as diferenças e
similaridades entre os genomas de múltiplas espécies e vem sendo utilizada na
construção de árvores taxonômicas e a transcriptômica, que estuda a expressão dos
genes de um organismo em diferentes estágios do seu desenvolvimento, nos
diferentes tecidos e em diferentes condições (Counsell, 1999). Além disso, diversas
destas disciplinas são utilizadas em conjunto com outras – bancos de dados sobre
diagnósticos e sintomas de doenças, bem como sobre tratamentos e efeitos
colaterais de drogas, entre outros experimentos biomédicos – para o
desenvolvimento e aperfeiçoamento de drogas utilizadas no combate a doenças.
Outro importante campo que surge destes estudos é a farmacogenômica, que
estuda como o perfil genético de um indivíduo afeta a resposta do corpo às drogas.
No presente trabalho, utilizamos a genômica funcional e a genômica
comparativa para identificar genes que codificam proteínas transmembranares que
atuam como transportadores de cátions.
3
1.3- Transportadores de membrana
A membrana plasmática define o limite entre a célula e o meio externo,
desempenhando funções de percepção do ambiente, manutenção da homeostase e
proteção da maquinaria celular. A membrana é constituída, basicamente, por uma
dupla camada de fosfolipídios, além de proteínas periféricas e integrais, e se
comporta como um ‘mosaico fluido’. Sua função de proteger o conteúdo celular
decorre tanto por constituir uma barreira físico-química, como da permeabilidade
seletiva, que permite criar e manter as condições adequadas para que as reações
metabólicas ocorram. Tal característica se deve à presença de proteínas que são
capazes de regular a entrada e saída de substâncias, bem como perceber as
condições do meio externo. Evolutivamente, essas proteínas sensoriais originaram
os mecanismos de sinalização celular e há evidências de que foi a partir de sensores
e sinalizadores transmembranares que surgiram os primeiros transportadores,
responsáveis pela aquisição de nutrientes através da membrana plasmática (Van
Belle e André, 2001). Os transportadores de membrana cumprem esta e outras
funções essenciais à vida, como o controle osmótico, indispensável à própria
manutenção da integridade da bicamada lipídica, e a exclusão ou
compartimentalização de substâncias indesejáveis. No contexto evolutivo, a
formação de endossomas, lisossomas, vacúolos e de outros compartimentos
intracelulares, como o retículo endoplasmático, que originou a carioteca que protege
o genoma nuclear, além de fenômenos endossimbióticos que originaram
mitocôndrias, cloroplastos e hidrogenossomos; elevaram as células proto-
eucarióticas a um nível de complexidade onde as trocas de íons e outras
substâncias passaram a ocorrer também entre estes compartimentos e o citoplasma.
Tal compartimentação do metabolismo se concretizou por meio de uma grande
diversificação nas proteínas transportadoras, nas células eucariontes, o que, por sua
vez, foi vantajoso para estes organismos por aumentar a eficiência de tarefas que
passaram a ficar organizadas espacialmente nas organelas.
A passagem de pequenas moléculas não carregadas através da membrana
pode ocorrer por simples difusão, através da bicamada lipídica. Contudo, o
transporte realizado por proteínas se faz necessário na maioria dos casos. O
transporte mediado por proteínas pode ocorrer na forma de transporte ativo, que é
4
dependente de energia e produz gradientes de concentração de substrato e/ou de
potencial elétrico. Estes gradientes produzidos por meio de sistemas de transporte
primarios são utilizados para a energização dos sistemas de transporte secundário.
Estima-se que no genoma de um dado organismo aproximadamente 10% dos
genes existentes codifiquem proteínas envolvidas no transporte transmembrana
(Saier, 1999). Isso que enfatiza a importância de sua caracterização para se
entender melhor os processos biológicos ligados ao metabolismo energético e à
estruturação da célula. Considerando-se, ainda, a importância do controle do pH
celular, bem como a requisição de íons específicos para o funcionamento de
determinadas proteínas, o transporte de cátions assume um papel de destaque
neste contexto. Cátions, como cálcio e potássio, têm papel central em diversas vias
de sinalização celular. As cascatas de sinalização desencadeadas por cálcio são
fenômenos ubíquos no mundo biológico. Este íon atua na regulação de diferentes
processos celulares, principalmente atuando como ‘segundo mensageiro’ nos mais
diversos organismos (Berridge, 2005; Plieth, 2005; Brette et al., 2006), em conjunção
com outras moléculas da cascata de sinalização (Patterson et al., 2005; Borodinsky
e Spitzer, 2006; Zhang e Li, 2006). Em algumas situações o cálcio também pode
assumir função de primeiro mensageiro (Breitwieser, 2006). Outro íon que possui
papel destacado é o potássio. Ele está associado ao controle do volume celular
(Strange et al., 2006) e, juntamente com o cloro, atua na sinalização do processo de
apoptose (Lang et al., 2005). Além disso, o potássio é um importante íon para
células excitáveis, como neurônios, músculos lisos e células beta do pâncreas
(Teramoto, 2006; Levitan, 2006; MacDonald et al., 2005), e também regula diversos
processos na célula vegetal (Ashley et al., 2006).
1.4- Estudo do transporte iônico em fungos e plantas
O estudo do transporte iônico em fungos e plantas tem possibilitado a
elucidação de mecanismos envolvidos em importantes fenômenos ecológicos como
a interação entre fungos micorrízicos e vegetais. O domínio do conhecimento desta
interação simbiótica mutualista é de relevância estratégica para o desenvolvimento
da maioria das culturas economicamente importantes (Peterson et al., 1984). As
5
micorrizas ocorrem em cerca de 90% das plantas terrestres (Bonfante, 2003) e
aumentam a potencialidade das plantas na aquisição de nutrientes no solo, o que
resulta em uma utilização menos freqüente de fertilizantes (Rengel e Marschner,
2005). Assim, vamos abordar neste trabalho três temas desta linha de pesquisa: os
transportadores de cátions da levedura Schizosaccharomyces pombe, a relação
entre expressão e funcionalidade de transportadores de H+ em cana-de-açúcar e a
análise matemática dos fluxos de prótons em raízes e hífas de fungos que
participam na interação micorrízica.
1.5- O modelo biológico: Schizosaccharomyces pombe
O arquiascomiceto Schizosaccharomyces pombe, conhecido como a levedura
de fissão, é um dos mais importantes modelos no estudo da biologia da célula
eucarionte. Foi na década de 1950 que a primeira chamou a atenção dos biólogos
em virtude do seu modo de divisão celular binária. A partir daí, métodos para a
manutenção das cepas, crescimento vegetativo, cruzamentos genéticos e
isolamento de mutantes foram estabelecidos e, ao longo dos anos, várias de suas
semelhanças com outros eucariontes – além de detalhes do processo de fissão
binária – foram descobertas, como a organização dos centrômeros e a presença de
um complexo protéico responsável pelo processo de “splicing” (Sunnerhagen, 2002).
O estudo de S. pombe apresenta ainda outras vantagens, como a sua ascendência
de uma cepa de laboratório monolítica, o que significa dizer que todas as cepas
desta levedura utilizadas em experimentos científicos derivam de um único isolado, o
que garante maior uniformidade nos resultados (Leopold, 1993 apud Sunnerhagen,
2002), enquanto as cepas da levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae,
comumente usadas possuem contribuições importantes em sua composição
genética de pelos menos três cepas bastante diversas (Mortimer e Johnston, 1986).
Deve-se ressaltar, também, que S. pombe separou-se dos demais representantes de
sua Classe há 330-440 milhões de anos (Wood et al., 2002) e conservou, ao longo
de sua evolução, alguns conjuntos de genes que foram perdidos ou são
significativamente divergentes em S. cerevisiae (Aravind et al., 2000). Isso faz de S.
pombe um alvo em estudos evolutivos. Esta levedura é, também, utilizada como um
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modelo eucariótico em estudos de sensibilidade a drogas, uma vez que a aparente
ausência de genes de resistência possibilita averiguar quais entidades protéicas são
alvos destas substâncias (Sunnerhagen, 2002).
Muitos aspectos celulares da levedura de fissão continuam pouco elucidados,
como seu metabolismo energético, a biossíntese de suas organelas, a classificação
de suas proteínas e o transporte membranar (Sunnerhagen, 2002). De acordo com
os dados armazenados em páginas disponíveis na Internet e gerenciadas pelo The
Wellcome Trust Sanger Institute (website:
http:/www.sanger.ac.uk/Projects/S_cerevisiae/FUNCAT/GO_0006810.shtml), sobre
transportadores em Saccharomyces cerevisiae das 266 proteínas transportadoras de
membrana existentes, somente 191 são caracterizadas (71.8%). Já em
Schizosaccharomyces pombe são caracterizados funcionalmente apenas 36 dos 167
(21,6%) transportadores catalogados por The Gene Ontology Consortium, no banco
de dados AmiGO (disponível em: http://www.genedb.org/amigo/perl/go.cgi).
O lançamento da seqüência completa de seu genoma em 2002, aliado à
disponibilidade de sofisticadas metodologias de manipulação genética e perfil de
expressão (expression profiling; técnica através da qual se averiguam os padrões de
expressão gênica de um organismo em uma dada situação), deu um novo impulso
aos estudos utilizando este fungo (Wood et al., 2002). A investigação dos
transportadores desta levedura através da bioinformática pode, portanto, ser útil na
sua caracterização e utilização como modelo biológico. Estudos sobre genes
regulados especificamente durante o ciclo celular têm utilizado recursos de
bioinformática com sucesso para elucidar detalhes da biologia celular desta levedura
(de Lichtenberg et al., 2005; Marguerat et al., 2006).
O primeiro passo neste sentido deve ser a análise do genoma de S. pombe
em busca de genes possivelmente ligados ao transporte de substâncias através da
membrana. Subseqüentemente, passa-se à obtenção das seqüências peptídicas
correspondentes a cada um dos ORFs encontrados, o que possibilita uma
abordagem de alinhamentos comparativos que visa determinar a que família de
transportadores pertencem. Assim, pode-se investigar e inferir características
relativas ao metabolismo das membranas biológicas deste microrganismo. Goffeau
et al. (1997) estabeleceram uma classificação para a sub-família de transportadores
MDR, em S. cerevisiae, baseados na homologia entre ORFs do fungo e seqüências
7
estabelecidas dessas proteínas em bactérias, e puderam estendê-la a bombas
desse tipo já caracterizadas em outros fungos. No estudo realizado com o genoma
completo de S. cerevisiae, as análises filogenéticas permitiram classificar 139
transportadores não-caracterizados da levedura em famílias com função conhecida,
além de possibilitar o estabelecimento de comparações com as proporções relativas
dessas proteínas na bactéria Escherichia coli, no que concerne às classes de
substrato e tipos de transportadores (Paulsen et al., 1998).
Um exame realizado em S. pombe revelou a presença de vários tipos de
ATPases similares aos de S. cerevisiae, mostrando, uma identidade geralmente
baixa nas do tipo P e diferenças quanto aos substratos transportados, o que pode
refletir as diferenças fisiológicas existentes entre esses dois fungos (Okorokova-
Façanha et al., 2003). No âmbito da genômica funcional, um problema interessante a
ser tratado é a indeterminação da função de alguns dos genes estudados,
principalmente no que tange ao substrato transportado por seus produtos protéicos.
A realização de análises comparativas entre diferentes fungos e entre fungos e
organismos de outros reinos abrange o aspecto da taxonomia molecular. Desta
forma, podemos substituir os padrões morfométricos celulares (que podem variar
amplamente numa mesma espécie, em função de condições ambientais diferentes)
por uma busca da definição de que genes são comuns a essas espécies e quais são
exclusivos para cada uma delas, traçando um perfil das peculiaridades gênicas de
cada uma dessas espécies.
Além disso, a busca por transportadores de cátions no genoma de S. pombe
oferece um meio de se apontar bons alvos para o estudo, em levedura, do
mecanismo de ação de proteínas homólogas que causam diversas doenças em
humanos (Wood et al., 2002). A Tabela 1.1 mostra algumas doenças metabólicas e
neurológicas de seres humanos relacionadas a problemas em determinados genes,
juntamente com genes de S. pombe que apresentam identidade aos genes de H.
sapiens. Tais genes podem ter sua função melhor caracterizada na levedura,
possibilitando, eventualmente, estudos de transferência e expressão de genes de
humanos em S. pombe para elucidar como esses genes afetam a célula eucarionte
de modo geral.
8
Tabela 1.1. Doenças de Homo sapiens ligadas à presença de transportadores
de cátions deficientes e os genes homólogos correspondentes encontrados em S.
pombe.
Tipo de Doença
Doença e gene relacionado Função Referência Gene de S.
pombe
Doença de Hailey-Hailey
(ATP2C1) Ca2+-ATPase Hu et al., 2000 SPBC31E1.02C
Doença de Wilson (ATP7B) Cu2+-ATPase Lutsenko et al.,
2002 SPBC29A3.01
Síndrome de Gitelman
(SLC12A3)
Schepkens et al., 2001
Metabólica
Síndrome de Bartter
(SLC12A1)
Cotranspor-tador Na+-K+-
Cl- Karolyi et al., 1998
SPBC18H10.16
Síndrome de Menkes (ATP7A)
Cu2+-ATPase Voskoboinik e Camakaris, 2002 SPBC29A3.01
Neurológica Ataxia medulo-cerebelar tipo 6
(CACNA1A)
Canal de Ca2+ sensível à voltagem
Ishikawa et al., 1999 SPAC6F6.01
1.6- Fungo Micorrízico como modelo para o estudo do fluxo de H+
Micorrizas arbusculares são o principal de tipo de relação simbiótica entre
fungos e plantas. Cerca de 6.000 espécies de fungos de todo o Filo Fungi colonizam
as raízes de mais de 240.000 espécies de plantas terrestres (Bonfante, 2003) em
associações mutualísticas, onde os açúcares fotossintetizados pela planta são
trocados por fosfato e outros minerais obtidos do solo pelo fungo (Smith e
Gianinazzi-Pearson, 1988; Smith et al., 2003). A sacarose é a principal forma por
meio da qual o carbono fixado pelos vegetais é transportado ao longo do floema até
as raízes, mas, uma vez no apoplasto da raiz, a sacarose é hidrolisada por
invertases exógenas, produzindo hexoses que podem ser utilizadas pelos fungos
9
micorrízicos (Shachar-Hill et al., 1995). Apenas as hifas intra-radiculares, formadas
pelo fungo em contato direto com as raízes do vegetal, exibem uma absorção
substancial de açúcar. Mas mesmo antes de seu primeiro contato com a raiz do
hospedeiro, no estágio assimbiótico quando o fungo apresenta apenas um
metabolismo basal de carbono, a absorção de glicose e frutose também foi
observada em seus tubos germinativos (Pfeffer et al., 1999; Bago et al., 1999, 2002).
Altas concentrações de sacarose podem surtir efeitos negativos no desenvolvimento
dos fungos micorrízicos tanto na fase assimbiótica, como na simbiótica (Mosse,
1959; Mugnier e Mosse, 1987). Similarmente, altas concentrações de fosfato no solo
inibem a interação micorrízica (Gianinazzi-Pearson e Gianinazzi, 1983). Desta forma,
fosfato e sacarose, os principais nutrientes trocados entre os simbiontes e plantas,
podem ser considerados como fatores que também controlam o crescimento das
hifas e a interação micorrízica. As bases fisiológicas e celulares deste fenômeno
ainda não foram bem elucidadas.
Há poucas evidências sobre os primeiros eventos de sinalização
responsáveis pelo desenvolvimento e reconhecimento dos fungos micorrízicos.
Hiper-polarização da membrana plasmática da hifa de Gigaspora margarita em
resposta a extratos de raiz do hospedeiro foi descrita, sugerindo que os primeiros
estágios da interação micorrízica ocorrem por meio de efeitos diretos na membrana
da hifa, e não por meio de expressão gênica (Ayling et al., 2000). Isto está de acordo
com a noção de que a ativação de fluxos iônicos é uma das primeiras respostas da
célula depois do reconhecimento inicial entre elicitor e receptor (Blumwald et al.,
1998). O envolvimento da dinâmica dos íons no crescimento e nutrição celular de
fungos e plantas está ligado à regulação dos gradientes elétricos e de pH gerados
em suas membranas pelas H+-ATPases tipo P (Serrano, 1989; Feijó et al., 1999;
Portillo, 2000). A expressão de diferentes isoformas de H+-ATPases de fungos pode
ser regulada pela condição simbiótica ou assimbiótica, bem como pela concentração
dos nutrientes fosfato e sacarose (Requena et al., 2003). Tais dados corroboram a
noção de que tanto os gradientes intracelulares como os extracelulares,
principalmente de íons H+ e Ca2+, estão associados com o crescimento polarizado
em células de fungos e vegetais (Harold e Caldwell, 1990; Jackson e Heath, 1993).
O estudo destes fluxos de H+ in vivo em hifas de fungo e em raízes vegetais
pode fornecer informações cruciais para a compreensão dos intricados mecanismos
10
que regem este fenômeno. O nosso propósito, de acordo com o que nos permitem
as técnicas disponíveis, é a sistematização matemática dos dados obtidos, por meio
da aplicação de técnicas como séries de Fourier, análise estatística de séries
temporais e análise de caos, que possibilitam uma maior compreensão dos padrões
intrínsecos destes fenômenos, bem como uma maior gama de informações
necessárias à modelagem matemática destes processos biológicos. Os possíveis
padrões intrínsecos das diferenças espaciais e temporais existentes nos fluxos de
prótons nas diferentes regiões das hifas fúngicas e das raízes vegetais medidos a
intervalos de tempo distintos podem, então, ser acessados e estudados.
A ocorrência de comportamentos oscilatórios nas células pode ser vista como
conseqüência dos ciclos responsáveis pela homeostase e pelo crescimento celular.
Desta forma, devemos buscar meios eficientes para se estudar as variações que
ocorrem dentro destas oscilações. A regressão em séries temporais pode ser linear
no tempo, para ajustar seqüencialmente os períodos de teste; ou linear na
freqüência, para ajustar seqüencialmente os componentes harmônicos desde um
período inicial fundamental. Assim, a aproximação do problema através de um
sistema linear pode restringir a análise a um pequeno número de freqüências que
correspondem a do estímulo controlado e a suas harmônicas principais. Uma
abordagem não-linear do problema, através do uso de Transformadas Discretas de
Fourier, poderia tornar possível estimar as correlações espaciais existentes e
combinar os resultados para deduzir a interferência espaço-temporal (Lange e
Zeger, 1997). E a aplicação da análise de caos permitiria analisar a natureza destes
padrões em dimensões fractais, aumentando a compreensão acerca de seu
comportamento. Tais padrões podem estar relacionados não apenas com a
alteração do pH da rizosfera, mas também a fenômenos ainda não elucidados de
sinalização entre fungo e vegetal no estabelecimento da interação micorrízica. Esta
sinalização, dependente de um íon, já tem sido caracterizada para o cálcio, Ca2+
(Wymer et al., 1997; Malhó et al., 1998; Sanders et al., 1999), onde a ocorrência de
oscilações, ondas e suas derivadas possuem uma gama de efeitos que são
sensivelmente percebidos pela célula. No caso do H+, sua importância na
sinalização já foi aventada (Zhou et al., 2000), mas ainda não tem sido amplamente
abordada ou reconhecida no meio cientifico.
11
1.7- Estudos do transporte de H+ em cana-de-açúcar
A produção de cana-de-açúcar é uma das mais importantes atividades
agrícolas de regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente em países em
desenvolvimento. Apesar da grande importância econômica desta cultura, que no
Brasil está diretamente relacionada à sua eficiência energética na produção em
larga escala de álcool combustível e açúcar, ainda existe relativamente pouca
informação sobre o metabolismo energético da cana-de-açúcar. Em uma busca por
artigos científicos no Google Scholar (disponível em: http://scholar.google.com)
encontra-se um número consideravelmente maior de artigos publicados sobre milho
(em torno de 8 vezes mais em relação à cana-de-açúcar), cultura em que se baseia
a produção de etanol e outros insumos nos Estados Unidos, por exemplo.
Em função dos aumentos sucessivos no preço do petróleo, além das
previsões de futura escassez e inexorável exaustão deste recurso, tem-se dado
grande importância ao desenvolvimento de fontes de energia renováveis. Neste
âmbito, uma tecnologia de produção de biocombustível já estabelecida como a do
etanol vem atraindo investimentos para o setor, em função do crescente interesse de
governos, empresas e investidores. Grupos empresariais como Mitsubishi, Mitsui e
Google estão entre os interessados na produção de álcool combustível no Brasil.
Recentemente, o investidor húngaro George Soros fechou um negócio de 200
milhões de dólares na compra de uma usina em Minas Gerais (Salomão e Onaga,
2006).
Uma vez que os processos de produção dos principais derivados da cana são
diretamente dependentes da quantidade de sacarose armazenada no vegetal.
Pesquisadores poderiam utilizar o conhecimento mais amplo acerca de sua
bioenergética na seleção de híbridos mais eficientes energeticamente, ou mesmo
fundamentar a criação de exemplares transgênicos, o que independentemente da
melhoria nas tecnologias de produção utilizadas, poderia gerar um novo salto
quantitativo e qualitativo na produtividade desta cultura.
A maior parte do transporte de íons e outros metabólitos em células vegetais,
relacionado com os processos fisiológicos de nutrição, é realizado por meio da
utilização da energia de gradientes eletroquímicos gerados nas membranas por
12
bombas de H+. Em função disto, uma considerável quantidade do ATP celular é
consumida por estes sistemas primários de transporte de H+, que constituem,
portanto, o principal dreno energético da célula vegetal (Roberts et al., 1997). Assim,
faz-se necessário um estudo mais profundo sobre o funcionamento e integração dos
transportadores de H+ com o metabolismo, para que se possa entender, mais
claramente, o balanço energético entre os sistemas de síntese e consumo de ATP
na célula vegetal. Quanto melhor for o acoplamento energético destas enzimas,
tanto menor será a quantidade de ATP necessária para sustentar o gradiente
eletroquímico mantido por esses sistemas de transporte necessário à homeostase
(Bunney et al., 2001). Por conseqüência, maior será a disponibilidade energética
excedente para regular a diminuição da quebra de glicose proveniente da
fotossíntese e o aumento do armazenamento do açúcar. Assim, uma variedade de
cana-de-açúcar com maior concentração de açúcar armazenada em seus tecidos
produziria um melhor rendimento na obtenção de açúcar e álcool a partir desta
cultura. Por outro lado, a pesquisa básica sobre estas proteínas é um caminho
importante no entendimento das relações existentes entre aspectos ainda pouco
conhecidos da fisiologia da cana-de-açúcar e de seu metabolismo e biologia celular.
O Projeto SUCEST (Sugar Cane EST Genome Project, disponível em:
http://sucest.lbi.dcc.unicamp.br/en/) vem, desde 1999, empreendendo esforços para
identificar, seqüenciar e anotar genes da cana-de-açúcar em larga escala. Contando
com uma rede de laboratórios distribuída por diversos estados brasileiros e o suporte
financeiro da FAPESP, este projeto conseguiu armazenar 300.000 EST (“expressed
sequence tags”) relativas a genes expressos em diferentes condições ambientais
nos diversos tecidos da cana (Vettore et al., 2003). Com a finalização do projeto
genoma da cana-de-açúcar uma grande quantidade de dados está disponível aos
pesquisadores associados, tornando o emprego de ferramentas de bioinformática o
método mais apropriado para a aquisição de informações biológicas relevantes.
Ainda, a integração entre os dados obtidos desta maneira e por meio de análises
cinéticas das proteínas transportadoras de H+ representa uma forma ainda mais
consistente de se estudar a distribuição, regulação e função desses sistemas de
transporte em diferentes tecidos da cana. Tendo em vista os diferentes níveis de
expressão dos genes que codificam transportadores de H+ em cada um dos tecidos
13
da cana-de-açúcar pode-se apontar alvos para estudos bioquímicos mais
aprofundados com estas proteínas (Ferreira, 2002).
14
2- OBJETIVOS
Objetivo Geral
Explorar a aplicação da matemática e de recursos de informática na análise das
características do transporte iônico em sistemas biológicos de fungos e plantas.
Objetivos Específicos
• Organizar dados genômicos em um inventário dos transportadores de
cátions de Schizosaccharomyces pombe, que facilite futuros estudos
relacionados tanto à caracterização da funcionalidade de tais
proteínas, quanto à filogenia desta e de outras espécies;
• Realizar uma análise teórica dos dados de fluxos de prótons em
Gigaspora margarita e Trifolium repens buscando construir modelos
que descrevam a participação dos sistemas de transporte de H+ na
energização de membranas e sinalização da interação micorrízica;
• Analisar comparativamente os dados de atividade das bombas de
prótons em vesículas de membrana isoladas de híbridos
intraespecíficos de Saccharum sp. L. (cana-de-açúcar) com os dados
do data mining realizado no banco de dados do SUCEST para a
validação desta técnica na previsão da distribuição e função dessas
enzimas nos diferentes tecidos da cana-de-açúcar.
15
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Transportadores de cátions em S. pombe
3.1.1- Mineração de dados em bancos de dados
As buscas em bancos de dados foram realizadas em computadores
conectados à internet por meio de programas disponibilizados em endereços web
que foram acessados com a utilização do software Internet Explorer.
Foram realizadas buscas no banco de dados do genoma de S. pombe por
genes relacionados ao transporte de cátions através da membrana.
3.1.1.1- Coleta de seqüências de transportadores de cátions em Saccharomyces cerevisiae
Primeiramente, foram coletadas as seqüências de aminoácidos codificadas
pelos genes da levedura S. cerevisiae previamente identificados como
transportadores de cátions (Paulsen et al., 1998) no banco de dados protéico Swiss-
Prot (disponível em http://www.swiss-prot.org).
3.1.1.2- Busca com a ferramenta BLAST As seqüências da levedura S. cerevisiae foram alinhadas utilizando a
ferramenta Quick BlastP search (Altschul et al., 1997), acessível na página de
visualização padrão de cada proteína do Swiss-Prot, a qual discrimina as seqüências
com os melhores alinhamentos locais feitos contra todas as seqüências disponíveis
neste banco de dados. Dentre estes ORFs foram selecionados aqueles pertencentes
à levedura S. pombe, com e-values inferiores a e-10. Estas computações foram
realizadas no SIB (Swiss Institute of Bioinformatics), utilizando os serviços da rede
BLAST.
Adicionalmente, o banco de dados GeneDB S. pombe (disponível em
http://www.genedb.org/genedb/pombe/index.jsp) hospedado por The Wellcome Trust
Sanger Institute, onde ficam armazenados os ORFs seqüenciados e anotados pelo
projeto genoma da levedura de fissão, foi consultado para obtenção de informações
de melhor qualidade sobre essas proteínas.
16
3.1.1.3- Busca por meio de palavras-chave Após esta etapa inicial da mineração de dados, foram acessadas as entradas
existentes para outros genes anotados como transportadores de cátions, a partir do
catálogo de busca AmiGO (disponível em http://www.genedb.org/amigo/perl/go.cgi),
na seção relacionada a transporte (GO:0006810 : transport), utilizando-se como
fonte de dados o GeneDB S. pombe (representado como GeneDB_Spombe).
A partir da página relativa a cada um desses genes, o hipertexto remete o
usuário à visualização das informações referentes ao número de acesso
correspondente, catalogado no Swiss-Prot, onde estão disponíveis as seqüências de
aminoácidos e informações suplementares.
3.1.1.4- Coleta de seqüências de transportadores de cátions em outros organismos
Foram obtidas por meio de buscas por palavras-chave as seqüências de
aminoácidos de transportadores de potássio, sódio e magnésio dos organismos
Arabidopsis thaliana e Homo sapiens, além de transportadores de sódio de Candida
albicans, Neurospora crassa, Caenorhabditis elegans, Rattus norvegicus e Mus
musculus e transportadores de Mg2+ de S. pombe, Saccharomyces cervisiae,
Escherichia coli, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Homo sapiens e Rattus
norvegicus para a posterior análise comparativa. Estas buscas foram realizadas no
banco de dados mantido pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information),
que é hospedado pela NLM (National Library of Medicine) pertencente ao National
Institute of Health do Governo Norte-Americano (disponível em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
A ferramenta BLAST (Atlschul et al., 1990) do NCBI foi utilizada, ainda, para
uma busca, restrita ao genoma humano, de proteínas homólogas às proteínas
transportadoras de K+ Trk1 e Trk2 de S. pombe.
17
3.1.2- Alinhamento de seqüências
As seqüências de aminoácidos, coletadas em formato FASTA (Pearson e
Lipman, 1988), de S. pombe e S. cerevisiae com alguma similaridade foram
comparadas, em sua extensão total, duas a duas utilizando a ferramenta ClustalW
(Thompson et al., 1994) disponível no servidor da Network Protein Sequence
@nalysis (Combet et al., 2000) hospedado pelo Pôle Bioinformatique Lyonnais (Lion,
França) com o objetivo de determinar a identidade total de seus aminoácidos através
de um método que retorna os dados com maior nível de precisão e, com isso,
permite consolidar a mineração de dados realizada.
Mais alinhamentos foram feitos utilizando as seqüências de duas a duas para
demonstrar as identidades totais entre seqüências pertencentes a S. pombe. Este
tipo de série de alinhamentos também foi realizado entre seqüências das leveduras
S. pombe e S. cerevisiae. Estes dados foram gerados com o intento de se inferir as
possíveis relações filogenéticas entre as seqüências.
De maneira análoga, seqüências de interesse dentre as de S. pombe foram
comparadas com as de A. thaliana e H. sapiens utilizando-se a mesma metodologia.
Apenas seqüências de aminoácidos foram utilizadas, pois estas oferecem
mais parâmetros de comparação que as seqüências de DNA na busca por proteínas
que compartilhem a mesma função.
3.1.3- Identificação de segmentos transmembrana
Domínios transmembranares hipotéticos das seqüências de aminoácidos
foram deduzidos com a utilização e comparação de resultados obtidos com os
softwares MEMSAT (McGuffin et al., 2000), disponível em
http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html, e TMHMM (Krogh et al., 2001),
disponível em http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/.
18
3.1.4- Análises filogenéticas
Foi usado o programa ClustalW versão 1.75, utilizando-se os valores padrão
de alinhamento, empregado pela ferramenta on-line “Graphical Phylogenetic Trees”
(disponível em: http://www.genebee.msu.su/clustal/basic.html). Esta versão do
algoritmo possibilita ao usuário o retorno de parâmetros que são utilizados com a
ferramenta on-line “Phylodendron” (disponível em:
http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/) para gerar gráficos de árvores filogenéticas ou
dendogramas.
3.1.5- Classificação da informação
Os transportadores de cátions identificados no genoma de S. pombe foram
classificados de acordo com os padrões estabelecidos pela TC, Transport
Commission, que podem ser encontrados on-line na página do TC-DB: Transport
Protein Database (disponível em http://www.tcdb.org). Para tal, foi utilizada a
ferramenta BLAST disponível em http://www.tcdb.org/progs/blast.php para identificar
a quais categorias de transportadores transmembrana pertencem cada uma das
seqüências de S. pombe identificadas.
3.2- Análise do fluxo de H+ em hifas de Gigaspora margarita
3.2.1- Aplicação da Transformada Discreta de Fourier
Esta análise conta com dados previamente obtidos pelo Dr. Alessandro
Coutinho Ramos durante o seu período de estágio de ‘doutorado-sandwich’ no
Instituto Gulbenkian de Ciência, em Portugal, de acordo com metodologia
apresentada no Anexo I e que foram cedidos para que tivessem seu estudo refinado
através da utilização de uma análise matemática.
Os dados apresentam a medição dos fluxos de H+ ao redor da membrana do
fungo micorrízico Gigaspora margarita e foram analisados por meio do uso de
19
Transformadas Discretas de Fourier (Fast Fourier Transforms - FFT), como descrito
em Zonia e Feijó, 2003.
Para isto foi utilizado o software Scilab 4.0 (disponível em http://
www.scilab.org). Primeiramente, os dados foram organizados e armazenados em
matrizes de duas colunas, uma para o tempo e outra para as leituras da intensidade
dos fluxos de prótons. Estas matrizes serviram de entrada para a função fft do
Scilab, que aplica a Transformada Rápida de Fourier (Fast Fourier Transforms -
FFT) a um conjunto de dados. Visto que o resultado desta função é simétrico,
pudemos utilizar apenas metade dos dados do resultado obtido e utilizamos a
função plot do Scilab para gerar os gráficos mostrando as potências das freqüências
presentes no sinal originado pela medição dos fluxos de prótons.
3.3- Análise dos transportadores de H+ em Saccharum sp. L.
3.3.1- Mineração de dados
A pesquisa em Saccharum sp. L. enfocou a relação entre os padrões de
expressão in silico de genes e a atividade protéica de três sistemas primários de
transporte de prótons (P-H+-ATPase, V-H+-ATPase e V-H+-PPiase). Foram utilizadas
as senhas de acesso ao projeto SUCEST fornecidas pelos colaboradores deste
projeto, Prof. Dr. Fábio Lopes Olivares e Prof. Dr. Gonçalo Apolinário de Souza
Filho, para acessar o banco de dados transcriptômico da cana-de-açúcar, onde as
seqüências que condificam as H+-ATPases de plasmalema e tonoplasto e a H+-
pirofosfatase vacuolar (H+-PPiase) foram coletadas para análise da expressão em
cada tecido.
Buscas por seqüências de cDNA foram realizadas utilizando a ferramenta
“Cluster by keyword” do SUCEST (disponível em
http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/cgi-bin/prod/blastkwsearch/blastkwsearch.pl) e
retornaram seqüências cujos nomes ou código de acesso são relacionados com
transportadores de prótons de membrana plasmática e vacuolar.
Seqüências de DNA que codificam proteínas caracterizadas de Arabidopsis
thaliana, Nicotiniana plumbaginifolia, Lycopersicon esculentum e Zea mays foram
20
obtidas do banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information,
disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Estas seqüências foram utilizadas no
software BLAST (Altschul et al., 1990) do SUCEST (disponível em
http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/cgi-bin/prod/blast/form_maker.pl) para uma busca
baseada em seqüências consenso.
3.3.2- Ajuste do número de leituras por tecido
Os dados de expressão gênica em cana-de-açúcar foram normalizados,
considerando um Fator Tecido Específico (F.T.E.). Durante o seqüenciamento dos
ORFs em diferentes tecidos e condições um número diferente de leituras foi obtido
para cada um deles. Estas leituras ou reads representam o aparecimento
redundante de um dado ORF durante o processo de seqüenciamento. Este Fator
Tecido Específico iguala a proporção das amostras analisadas e foi calculado
dividindo-se o número total de reads no tecido com maior número de reads, dentre
todos os tecidos analisados, pelo número total de reads no tecido analisado em
questão, de acordo com a seguinte fórmula:
F.T.E. = número total de reads no tecido com maior número de reads
número total de reads no tecido analisado
Os gráficos gerados para o número relativo de leituras para cada uma das
seqüências estudadas foram obtidos pela multiplicação do número absoluto de
leituras daquela seqüência pelo F.T.E. calculado.
21
4- RESULTADOS
4.1- Transportadores de cátions em Schizosaccharomyces pombe
Estima-se que Schizosaccharomyces pombe possua 4.940 genes (Wood et
al., 2002), enquanto que em Saccharomyces cerevisiae este número está em torno
de 6.256 genes. Foram descritos 56 transportadores de cátions em S. cerevisiae (De
Hertogh et al., 2002) e o número de proteínas deste tipo, descritas no presente
trabalho, em S. pombe foi de 39, como mostrado na Tabela 4.1.
Tabela 4.1. Transportadores de cátions no genoma de S. pombe e S. cerevisiae.
Organismo Nº total de genes N º de transportadores de cátions
% do genoma
S. pombe 4.940 39 0,77 %
S. cerevisiae 6.256 56 0,89 %
A Tabela 4.2 apresenta os diversos transportadores de cátions de S. pombe,
os quais foram classificados de acordo com o sistema da TC, a partir do alinhamento
com as seqüências de S. cerevisiae, que apresentaram identidade entre 25 e 45%.
O nome das famílias de transportadores foi repetido para que houvesse a indicação
do nome original em inglês, que determina as correspondentes abreviaturas. As
proteínas caracterizadas funcionalmente estão relacionadas às respectivas
publicações no campo “Referências”. No campo “Descrição/Substrato(s)”, para as
proteínas não-caracterizadas, a especificidade aos substratos foi inferida
eletronicamente, além de conter informações sobre o funcionamento das proteínas
homólogas que caracterizam aquela família de transportadores, como estabelece o
sistema da TC. Neste mesmo campo, as anotações marcadas com 1 foram as que
tiveram sua afinidade por substratos inferidas no presente trabalho e as marcadas
com 2 foram as que tiveram a sua localização celular determinada por Matsuyama e
colaboradores (2006).
22
23
24
25
Os transportadores de S. pombe e os genes relacionados, por pertencerem à
mesma família pelo sistema TC ou por possuírem afinidade pelo mesmo substrato,
foram selecionados para análises detalhadas devido a algumas de suas
peculiaridades. Os três genes da família MIT (Metal Ion Transporter) de S.
cerevisiae, ScALR1, ScALR2 e ScMNR2 transportam Mg2+, os dois primeiros
conferem resistência ao alumínio (MacDiarmid e Gardner, 1998) e o terceiro está
associado à resistência ao manganês, foram comparados aos dois genes de S.
pombe pertencentes à mesma família, conforme mostrado na Tabela 4.3.
Tabela 4.3. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família MIT, de
transportadores de íons metálicos em S. pombe (SP) e S. cerevisiae (Sc).
SPBC27B12.12c
SPAC17A2.14 ScALR1 ScALR2 ScMNR2
SPBC27B12.12c 100,00 28,92 29,77 28,41 23,61
SPAC17A2.14 100,00 26,56 27,98 28,69
ScALR1 100,00 69,53 21,18
ScALR2 100,00 22,08
ScMNR2 100,00
* o valor em negrito corresponde à maior identidade encontrada, em cada
linha.
A Figura 4.1 mostra um alinhamento dos segmentos transmembrana de três
transportadores de S. pombe cujo substrato inferido foi o Mg2+, ressaltando a
presença do domínio GMN, responsável pelo transporte de magnésio (MacDiarmid e
Gardner, 1998). Além disso, foi feito um dendograma, mostrado na Figura 4.2, com
transportadores de Mg2+ de algumas espécies representantes dos fungos, vegetais e
mamíferos, além da proteína ancestral dos transportadores de magnésio, a proteína
CorA de Escherichia coli.
26
Figura 4.1. Alinhamento dos dois primeiros segmentos transmembrana dos transportadores da família MIT de S. pombe. Os resíduos de aminoácidos GMN,
que compõe o motivo transportador de Mg2+, são conservados nos transportadores
da família CorA. Resíduos idênticos estão em vermelho, resíduos fortemente
similares são representados em verde, os fracamente similares em azul e os
resíduos diferentes estão em preto.
27
Figura 4.2. Dendograma construído com transportadores de Mg2+ de espécies de fungos, plantas, mamíferos e uma bactéria. (Sp) S. pombe, (Sc)
Saccharomyces cerevisiae, (Ec) Escherichia coli, (At) Arabidopsis thaliana, (Os)
Oryza sativa, (Hs) Homo sapiens e (Rn) Rattus norvegicus.
Os transportadores codificados pelos genes Trk1 e Trk2 de S. cerevisiae são
responsáveis pelo transporte de potássio através da membrana, com alta e baixa
afinidade, respectivamente, e possuem identidade de ~40% entre si. Os
transportadores da família Trk (K+ Transporter) em S. pombe (Calero et al., 2000)
possuem maior identidade com ScTRK2 do que com ScTRK1, conforme
apresentado na Tabela 4.4. Arabidopsis thaliana possui 13 transportadores de
potássio, muito bem caracterizados, pertencentes à família KUP e 1 transportador da
28
família Trk (Mäser et al., 2001). Entretanto, eles apresentam uma identidade muito
baixa com as proteínas da família Trk de S. pombe , variando entre 9 e 15%.
Tabela 4.4. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família Trk, de
transportadores de potássio em S. pombe (Sp) e S. cerevisiae (Sc).
SpTRK1 SpTRK2 ScTRK1 ScTRK2
SpTRK1 100 32,85 27,60 32,44
SpTRK2 100 23,72 30,02
ScTRK1 100 39,95
ScTRK2 100
* o valor em negrito corresponde à maior identidade encontrada, em cada
linha.
Outro grupo de seqüências utilizado neste tipo de comparação foi a família
CPA1 (Transportador cátion:próton antiporte), que engloba proteínas
transportadoras do íon sódio (Na+). Dentre elas, ScNHX1 (também designada
ScNHA2), que tem localização no compartimento pré-vacuolar da levedura (Nass e
Rao, 1998) e reconhecida homologia com o transportador mitocondrial de sódio de
H. sapiens, NHE6 (Numata et al., 1998), possui uma grande identidade com a
seqüência SPAC15A10.06 de S. pombe; enquanto a seqüência SPAC3A11.09 de S.
pombe, por sua vez, mostra maior identidade com ScNHA1, da membrana
plasmática de S. cerevisiae (Prior et al., 1996), como mostrado na Tabela 4.5.
Ao comparar os trocadores de Na+ de S. pombe e H. sapiens, mostrados na
Tabela 4.6, observou-se que na espécie humana os transportadores guardam um
bom nível de homologia entre si, com exceção de NHE6, que apresenta maior
identidade com SPAC15A10.06 de S. pombe do que com outras seqüências de H.
sapiens.
29
Tabela 4.5. Identidade de aminoácidos (%) entre os membros da família CPA1 de S.
pombe (Sp) e S. cerevisiae (Sc).
SpSOD2 SPAC15A10.06
SPAC3A11.09 ScNHX1 ScNHA1
SpSOD2 100 13,40 28,68 12,17 19,86
SPAC15A10.06 100 10,92 48,66 9,54
SPAC3A11.09 100 12,50 33,64
ScNHX1 100 12,49
ScNHA1 100
* o valor em negrito corresponde à maior identidade encontrada, em cada
linha.
Tabela 4.6. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores de Na+ de S.
pombe (Sp) e H. sapiens (Hs).
SpS
OD
2
SP
AC
15A
10.0
6
SP
AC
3A11
.09
HsN
HE
1
HsN
HE
2
HsN
HE
3
HsN
HE
5
HsN
HE
6
SpSOD2 100 13,40 28,68 11,53 11,89 11,58 9,62 12,15
SPAC15A10.06 100 10,92 17,37 18,16 17,75 16,63 29,14
SPAC3A11.09 100 13,92 11,18 12,47 13,29 13,14
HsNHE1 100 43,18 34,24 30,60 19,98
HsNHE2 100 39,10 35,70 21,26
HsNHE3 100 49,02 20,93
HsNHE5 100 18,60
HsNHE6 100
* o valor em negrito corresponde à maior identidade encontrada, em cada linha.
30
Ainda, ao comparar os trocadores de Na+ de S. pombe e A. thaliana pode-se
observar as maiores identidades dos trocadores do vegetal com SPAC15A10.06,
assinalando esta proteína como o transportador de Na+ da levedura de fissão mais
conservado em outros reinos, como mostrado na Tabela 4.7. Além disso, a grande
identidade apresentada entre AtNHX1 e AtNHX2 e entre AtNHX5 e AtNHX6
representa uma confirmação dos eventos de duplicação genômica ou de duplicação
de genes em larga escala pelo quais A. thaliana vem passando há mais de 70
milhões de anos atrás (Raes et al., 2003). Tais eventos levaram ao aparecimento de
genes parálogos, como os citados acima.
Tabela 4.7. Identidade de aminoácidos (%) entre os transportadores de Na+ de S.
pombe (Sp) e A. thaliana (At).
SpS
OD
2
SP
AC
15A
10.0
6
SP
AC
3A11
.09
AtN
HX
1
AtN
HX
2
AtN
HX
4
AtN
HX
5
AtN
HX
6
SpSOD2 100 13,40 28,68 15,07 15,55 15,23 16,64 17,07
SPAC15A10.06 100 10,92 23,97 23,97 25,39 28,30 27,43
SPAC3A11.09 100 13,55 14,04 11,21 11,30 15,26
AtNHX1 100 87,00 56,51 25,78 25,55
AtNHX2 100 56,18 26,68 25,63
AtNHX4 100 26,12 26,48
AtNHX5 100 77,49
AtNHX6 100
* o valor em negrito corresponde à maior identidade encontrada, em cada
linha.
As seqüências de transportadores de Na+ de alguns fungos, um invertebrado
modelo C. elegans, um vegetal e três mamíferos foram utilizadas na construção de
um dendograma, apresentada na Figura 4.3, que evidencia a localização intracelular
31
de SPAC15A10.06 em virtude da sua homologia com HsNHE6 e ScNHX1, que tem
sua localização já caracterizada em endomembranas.
Figura 4.3. Dendograma construído com transportadores de Na+ de espécies de fungos, mamíferos, um invertebrado e uma planta. Transportadores de Na+ de
S. pombe (Sp), S. cerevisiae (Sc), Candida albicans (Ca), Neurospora crassa
(CAF05976), Homo sapiens (Hs), Rattus norvegicus (Rn), Mus musculus (Mm),
Caenorhabditis elegans (Ce) e Arabidopsis thaliana (At). A ramificação I da árvore
contém a maior parte dos transportadores de mamíferos, juntamente com o de C.
elegans; a ramificação II é constituída por uma família específica de fungos; o ramo
IIIa possui membros com localização intracelular, que apresentam similaridade com
32
os transportadores de A. thaliana e em IIIb estão os outros transportadores de Na+
do vegetal.
Por fim, realizamos a análise de domínios transmembranares deste
transportador da família CPA1, SPAC15A10.06, para averiguar a presença de
resíduos de aminoácidos em sua seqüência que caracterizam os transportadores de
Na+ como tendo uma localização em endomembranas, obtendo-se a confirmação da
presença destes resíduos como mostrado na Figura 4.4.
Figura 4.4. Análise de domínios transmembrana de transportadores CPA1. Os
resíduos de aminoácidos marcados com uma ponta de seta são aqueles que
diferenciam estes transportadores como tendo localização intracelular. Resíduos
idênticos estão em vermelho, resíduos fortemente similares são representados em
verde, os fracamente similares em azul e os resíduos diferentes estão em preto.
4.2- Fluxo de H+ em hifas de Gigaspora margarita
Os gráficos obtidos através da aplicação da Transformada Rápida de Fourier
apresentam as freqüências (em Hz) dos sinais representados pelos fluxos de H+ em
função da potência do sinal, que é caracterizada pela amplitude da onda (unidade de
medida adimensional). Picos de freqüência indicam uma periodicidade do fluxo, o
que podem levar a caracterização de um padrão no transporte de H+ em uma dada
condição. As Figuras 4.5 a 4.7 mostram a análise do espectro de potência do fluxo
de prótons em meio com fosfato, inibidor da interação micorrízica.
33
Figura 4.5. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio com fosfato e sem adição de fluido apoplástico (controle). (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C) a
200 μm de distância da ponta.
34
Figura 4.6. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio com fosfato e adição de 10μL de fluido apoplástico. (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C)
a 200 μm de distância da ponta.
35
Figura 4.7. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio com fosfato e adição de 20μL de fluido apoplástico. (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C)
a 200 μm de distância da ponta.
As Figuras 4.8 a 4.10 mostram a análise do espectro de potência do fluxo de
prótons em meio sem fosfato, o que aumenta a velocidade de crescimento
polarizado das hifas e os fluxos de H+ na região apical.
36
Figura 4.8. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e sem adição de fluido apoplástico (controle). (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C) a
200 μm de distância da ponta.
37
Figura 4.9. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e adição de 10μL de fluido apoplástico. (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C)
a 200 μm de distância da ponta.
38
Figura 4.10. Análise do espectro de potência das oscilações de H+ em hifas de Gigaspora margarita em meio sem fosfato e adição de 20μL de fluido apoplástico. (A) TIP (ponta da hifa), (B) de 10 a 20 μm de distância da ponta, e (C)
a 200 μm de distância da ponta.
4.3- Transporte de prótons em Saccharum sp. L.
Com base em dados que demonstravam uma aparente expressão diferencial
de algumas proteínas transportadoras de H+ em diversos tecidos da cana-de-açúcar
(Ferreira, 2002), procedeu-se à investigação mais detalhada dos bancos de dados
genômicos da cana-de-açúcar do Projeto SUCEST. Tal busca, utilizando palavras-
chave e seqüências-consenso, permitiu a identificação de possíveis transportadores
de H+, bem como seus níveis de expressão em cada tecido, por meio de uma
39
normalização do número de leituras obtidas para a dada seqüência e o tecido como
um todo.
A mineração de dados (“data mining”) realizado no banco do SUCEST
mostrou uma maior expressão de genes relacionados ao transporte de prótons em
células da casca (“stem bark”) da cana-de-açúcar em comparação com as células do
colmo da cana na região dos entre-nós sem a casca (“stem devoid of bark from the
inter-node region”). A Figura 4.11 mostra o número de EST, corrigido por tecido,
correspondente às proteínas translocadores de prótons: H+-ATPase tipo P, H+-
PPiase vacuolar e as subunidades A e B da H+-ATPase do tipo V. Ocorre uma
expressão seis vezes maior da H+-PPiase nas células da casca da cana em relação
às células do colmo.
A análise cinética da hidrólise dos substratos e do transporte de H+ de
vesículas de plasmalema e tonoplasto isoladas da casca e do colmo (ANEXO II),
demonstrou que a quantificação da expressão das proteínas obtida in silico guarda
uma razoável correspondência com os estímulos verificados na atividade das
proteínas envolvidas no transporte de H+ através das membranas de células de
cana-de-açúcar.
40
Figura 4.11. Ocorrência de Seqüências Expressas (ESTs) para a P-H+-
ATPase, V-H+-PPiase e as subunidades A e B da V-H+-ATPase.
41
5- DISCUSSÃO
5.1- Transportadores de cátions em Schizosaccharomyces pombe
Os métodos utilizados resultaram na ampliação do número de transportadores
de cátions até então catalogados para S. pombe permitindo uma comparação mais
fidedigna entre os transportadores desta levedura com os dados existentes sobre os
transportadores de S. cerevisiae. Neste contexto, duas observações foram
evidenciadas inicialmente: o menor número de transportadores em S. pombe e a
ausência de alguns transportadores nesta levedura em relação a S. cerevisiae.
A primeira observação pode ser reflexo das amplas duplicações observadas
no genoma da levedura de brotamento, S. cerevisiae, as quais não ocorreram na
levedura de fissão ao longo do processo evolutivo. Diversas famílias de
transportadores possuem um maior número de representantes em S. cerevisiae do
que em S. pombe. Algumas das famílias, nas quais possivelmente, houve estas
duplicações, puderam ser apontadas, sendo elas as famílias ZIP, CDF, MIT, OfeT e
Nramp. Dentre estas, podemos ressaltar a família MIT, que foi utilizada em
comparações mais detalhadas para a averiguação desta possibilidade. ALR1 e
ALR2, duas proteínas transportadoras de Mg2+, que conferem resistência ao Al3+
(MacDiarmid e Gardner, 1998), podem ser consideradas um exemplo dos eventos
de duplicação do genoma de S. cerevisiae, pois apresentam identidade bastante
elevada, cerca de 70%.
Já a segunda observação tem conseqüências mais expressivas na fisiologia
da levedura de fissão, uma vez que a ausência de um tipo específico de
transportador implica a necessidade de vias alternativas para o transporte do
substrato em questão. Um exemplo é a ausência de uma proteína homóloga ao
canal TOK1 de S. cerevisiae (Ketchum et al., 1995) em S. pombe. Este membro da
família VIC regula a passagem de potássio de acordo com o potencial elétrico da
membrana numa dada situação. Apesar de não haver nenhuma seqüência anotada
com esta função na levedura de fissão, evidência da ocorrência deste tipo de canal
foi demonstrada por Vacata e colaboradores (1993). O outro exemplo é um
transportador da família CHP (Ca2+ Homeostasis Protein, proteína de homeostase
42
de cálcio), representado pela proteína CSG2 (Beeler et al., 1994) de S. cerevisiae,
que armazena cálcio no vacúolo.
Subseqüentemente, pode-se observar de maneira mais apurada os
transportadores caracterizados da levedura de fissão, bem como a representação
das proteínas em cada uma das famílias.
5.1.1- Transportadores de sódio (Na+)
O sódio é um íon que apresenta peculiaridades marcantes quando seu metabolismo
é comparado nas duas espécies de levedura. S. pombe não possui uma bomba de
transporte ativo de sódio (Benito et al., 2002; Okorokova-Façanha et al., 2003), ao
passo que S. cerevisiae possui de três a cinco P-ATPases com especificidade para
este íon (Catty et al., 1997); contudo, a primeira levedura possui três transportadores
antiporte Na+/H+, enquanto a outra possui apenas dois transportadores deste tipo
(Tabela 4.5). Estes dois são ScNHX1 localizado exclusivamente em compartimentos
pré-vacuolares, equivalentes aos endossomos tardios das células animais (Nass e
Rao, 1998) e ScNHA1 da plasmalema, que tem grande importância na regulação do
pH intracelular (Banuelos et al., 1998).
Parece haver uma relação direta entre ScNHX1 e SPAC15A10.06 (48,66% de
identidade entre suas seqüências de aminoácidos) e entre ScNHA1 e SPAC3A11.09
(33,64% de identidade), enquanto o único transportador de sódio caracterizado de S.
pombe, SOD2, possui maior identidade com SPAC3A11.09 (28,68%). Este trocador
pode realizar influxo ou efluxo de prótons em resposta à concentração externa de
sódio, sem ser afetado pelo potencial de membrana ou o gradiente de prótons da
membrana plasmática (Hahnenberger et al., 1996), tendo, portanto, importância na
tolerância ao sódio, na regulação do pH e no controle do volume celular, bem como
no crescimento polarizado da levedura de fissão, tendo em vista sua localização nos
pólos da célula (Dibrov et al., 1997).
Considerando-se as comparações com Homo sapiens, cujos transportadores
de antiporte Na+/H+ foram alinhados aos da levedura de fissão, dois genes, HsNHE6
e SPAC15A10.06, possuem um nível de identidade em torno de 30% (Tabela 4.6), o
que indica a possibilidade de seus produtos e apresentarem a mesma localização
celular (mitocôndria, como caracterizado para HsNHE6). Estes dados são
43
reafirmados pela localização dos transportadores de sódio na árvore filogenética que
indica o agrupamento destas duas proteínas, além de ScNHX1, que também tem
localização intracelular. Além disso, este transportador foi localizado através de
expressão de seu gene conjugado com uma proteína de fluorescência no complexo
de Golgi (Matsuyama et al., 2006), o que confirma nossa inferência.
5.1.2- Transportadores de potássio (K+)
A proteína SpTRK1 é expressa em altos níveis por células na fase
exponencial de crescimento (Soldatenkov et al., 1995) e juntamente com SpTRK2
definem o principal sistema de transporte de potássio na levedura de fissão. A
expressão de qualquer uma das duas proteínas é suficiente para garantir o
desenvolvimento normal da célula em níveis normais de potássio (Calero et al.,
2000).
S. pombe conta, ainda, com uma K+-ATPase, CTA3, de importância vital para
qualquer organismo de vida livre, por expulsar íons potássio da célula (Benito et al.,
2002).
Ambas as proteínas da família Trk em S. pombe possuem maior identidade
com ScTRK2 do que com ScTRK1. Entretanto, não parece haver nenhuma relação
entre os transportadores de K+ de Arabidopsis thaliana e S. pombe, por
apresentarem uma identidade muito baixa. Já no caso humano, não foram
encontradas seqüências de trocadores K+/H+ simporte em H. sapiens, apesar da
grande quantidade de Na+/K+-ATPases, de canais de potássio, cotransportadores e
transportadores inespecíficos Na+/K+ não relacionados à família Trk de S. pombe e
outras leveduras.
5.1.3- Transportadores de cálcio (Ca2+)
A família Mid1 corresponde a canais de cálcio ativados por tensão e SpEHS1
(YAM8) foi caracterizado como um possível homólogo de ScMID1 (Iida et al., 1994),
uma vez que está envolvido no influxo de cálcio e recupera o fenótipo de morte
44
induzida pelo feromônio de conjugação em S. cerevisiae, que é característico de
células mutantes para MID1 (Tasaka et al., 2000). Além disso, existe uma proteína
que foi classificada por homologia como pertencente à família VIC que possui um
domínio Na+/Ca2+ que merece maiores estudos, inclusive experimentais, que
elucidem melhor sua verdadeira função.
Ainda existem duas cálcio ATPases do tipo SPCA e PMCA, SpPMR1 e
SpPMC1. Uma P5 ATPase codificada pela levedura de fissão, CTA4, foi localizada
no retículo endoplasmático e demonstrada ser envolvida na homeostase de cálcio
(Okorokova-Façanha et al., 2002). Interessantemente, SpPMR1 foi também
localizada no retículo endoplasmático e não no complexo de Golgi, como seu
homólogo em S. cerevisiae, sugerindo que sinalização de cálcio pelo RE em
levedura de fissão seja mais complexa do que em S. cerevisiae.
5.1.4- Transportadores de magnésio (Mg2+)
Os transportadores de íons metálicos do tipo CorA, família MIT (homólogos
das proteínas CorA de bactérias), são proteínas bem caracterizadas, como ScALR1
e ScALR2, que conferem tolerância ao Al3+ e ao Ga3+, através do transporte de Mg2+
(MacDiarmid e Gardner, 1998). Outro representante desta família é ScMNR2, que
confere resistência ao Mn2+, transportando também o Mg2+.
As proteínas desta família em S. pombe apresentam níveis de identidade
muito próximos a estes três transportadores de S. cerevisiae, girando em torno de 26
e 30% (Tabela 4.3).
A presença de outro transportador deste íon na levedura de fissão foi
detectada. SPBC25H2.08c, pertencente à subfamília MRS2 que foi caracterizada a
partir de ScMRS2, que se localiza na membrana interna da mitocôndria e garante o
influxo de magnésio na organela, fundamental para o funcionamento das proteínas
envolvidas na retirada de introns (splicing), por exemplo (Kolisek et al., 2003).
Estes dados não permitem nenhuma conclusão determinante sobre o efeito
destas proteínas da levedura de fissão em seus mecanismos de resistência a íons, e
nem mesmo sobre qual seria o substrato destes transportadores. Assim, buscamos
outros meios de se avaliar estes transportadores e verificamos que eles possuem
45
homologia com os transportadores de Mg2+ de S. cerevisiae (Figura 4.2). Além disso,
as proteínas da família MIT em S. pombe possuem o motivo composto pelos
resíduos de aminoácidos GMN em seu primeiro domínio transmembrana, motivo
este que é responsável pelo transporte de Mg2+ e nos permite inferir que estas
proteínas de S. pombe são transportadores deste íon.
Destacamos, portanto, as proteínas desta família como um bom alvo para se
buscar um melhor entendimento dos mecanismos de resistência a alumínio em S.
pombe, pois os dados indicam homologia entre os transportadores da levedura de
fissão e outros transportadores de S. cerevisiae que desempenham esta função.
5.1.5- Transportadores de metais pesados
A levedura de fissão possui dois transportadores de Zn2+, SPBC16D10.06
(hipotético, família ZIP) e ZHF1 (família CDF). Este último é responsável também
pela tolerância ao Co2+ e Cd2+, acumulando estes metais no retículo endoplasmático
(Clemens et al., 2002). S. cerevisiae possui um sistema de tolerância ao zinco cujo
funcionamento pode ser estendido a S. pombe: ScZRT1 e ScZRT2 (família ZIP;
35,04 e 31,45% de identidade com SPBC16D10.06) transportam os íons para dentro
do citoplasma, enquanto ScZRC1 (Kamizono et al., 1989) e ScCOT1 – família CDF;
39,46 e 37,33% de identidade com SpZHF1 – armazenam zinco no vacúolo
(MacDiarmid et al., 2000). Esta diferença na organela onde estes metais são
armazenados, pode tem um grande significado biológico, na medida em que
possibilita uma maior elucidação dos mecanismos de toxicidade do Cd2+ em S.
pombe, bem como abre campo para estudos da importância do zinco na célula. Vale
a pena ressaltar que o Zn2+ é crucial para funcionamento de proteínas nucleares
como fatores de transcrição, RNA polimerase e histona deacetilase. Ainda em
respeito ao cádmio, existe um transportador da superfamília ABC, SpHMT1
(SPCC737.09c), que pode estar ligado a compartimentação deste metal no vacúolo
(Ortiz et al., 1992).
Existe um transportador de Ni2+ em S. pombe, que possui uma significante
similaridade com uma família de permeases de bactérias que realizam o influxo com
alta afinidade deste metal de transição através da membrana plasmática. Esta
46
proteína, SpNIC1 (SPCC1884.02), foi previamente caracterizada (Eitinger et al.,
2000) e aparentemente não possui ortólogo em S. cerevisiae.
O sistema de influxo de alta afinidade de Fe2+ é bastante conservado nas
duas leveduras, apresentando apenas uma oxidase (SpFIO1 e ScFET3,
respectivamente) e uma permease (SpFIP1 e ScFTR1). Estes genes apresentam
similaridade significativa e este sistema de transporte provavelmente está presente
em outros eucariontes (Askwith e Kaplan, 1997). Há ainda três carreadores deste
metal que funcionam como transportadores sideroporo-ferro (SpSTR1, SpSTR2,
SpSTR3), que possibilitam a assimilação do ferro a partir do ferro-cromo (Pelletier et
al., 2003).
Outro sistema relevante de transporte envolve o cobre, que é um importante
co-fator enzimático e atua diretamente na maquinaria de transporte de ferro,
possibilitando seu funcionamento correto, além de participar na proteção contra o
estresse oxidativo. Seu influxo, com alta afinidade, é mediado pelos transportadores
SpCTR4 (Labbe et al., 1999) e SpCTR5, que formam um complexo heteromérico na
membrana plasmática (Zhou e Thiele, 2001), além da presença de SpCTR6 que
disponibiliza Cu2+ armazenado no vacúolo em situações de baixa disponibilidade do
íon (Bellemare et al., 2002). Em S. cerevisiae, o transporte deste metal é realizado
por outros 3 carreadores: CTR1, CTR2 e CTR3. Entretanto, ScCTR1 e ScCTR3 têm
estrutura diferente das proteínas da levedura de fissão e de uma proteína hipotética
de humano (Labbe et al., 1999).
5.1.6- Visão geral sobre os Transportadores de cátions em Schizosaccharomyces pombe
A utilização de ferramentas de bioinformática em bancos de dados dos
projetos genoma de fungos, valeu-se da utilização de bancos de dados gratuitos
disponíveis na internet, como o do NCBI e do Sanger Institute. Ferramentas de
bioinformática disponíveis on-line foram utilizadas no alinhamento de seqüências e
construção gráfica de árvores filogenéticas. Desta forma, este trabalho classificou as
proteínas de membrana transportadoras de cátions da levedura
47
Schizosaccharomyces pombe, tanto as de função estabelecida, como as hipotéticas,
utilizando o sistema de classificação da Transport Commission.
Análises comparativas da identidade entre proteínas possibilitaram a
inferência de possíveis substratos para cinco carreadores que estão somente
anotados como transportadores de metais de um modo geral no banco de dados
GeneDB S. pombe, sendo elas SPAC17D4.03c (possivelmente um trocador de
Zn2+), SPBC29A3.01 (uma P-ATPase que pode estar envolvida no transporte de
Cu2+), SPBP26C9.03c (transportador de ferro) e SPAC17A2.14 e SPBC27B12.12c
(ambas homólogas a transportadores de Mg2+ da família MIT caracterizados em S.
cerevisiae). Ainda, foi verificada a possibilidade de que SPAC6F6.01 seja um canal
de Ca2+, e não de Na+ como anotado, além do caso de SPBC25H2.08c que
provavelmente transporta íons Mg2+ como seus homólogos em S. cerevisiae.
A análise da representação dessas proteínas nesta levedura, bem como a
comparação com outros organismos eucariontes, suscitou especulações acerca do
funcionamento dos seus sistemas de transporte de cátions, permitindo uma melhor
compreensão dos fatores envolvidos na homeostase destes organismos. Relações
de similaridade e divergência entre aspectos do funcionamento desses sistemas
puderam ser avaliadas, utilizando-se principalmente a levedura Saccharomyces
cerevisiae, o vegetal Arabidopsis thaliana e o homem. Relativamente ao K+, a
presença de uma P-ATPase ligada a seu transporte parece ser uma característica
presente nos outros reinos analisados, entretanto, outros carreadores de potássio de
S. pombe (os da família Trk), homólogos aos da levedura de brotamento, parecem
não estar representados no genoma humano e, apesar destes trocadores terem sido
observados na planta, suas seqüências se mostraram bastante divergentes nas
comparações realizadas. Os transportadores do íon Na+ apresentam-se, contudo,
como um alvo potencial para estudos comparativos entre estas espécies. O gene
SPAC15A10.06 codifica para uma proteína que é um possível transportador
intracelular, sendo relacionado com outros trocadores de sódio que possuem esta
localização na célula, como HsNHE6 e ScNHX1. Além disso, os dados indicam que
os outros dois carreadores de sódio desta levedura (SpSOD2 e SPAC3A11.09)
estão proximamente relacionados a outros transportadores deste íon de outros
fungos, o que aponta na direção da caracterização de uma nova subfamília de
transportadores de sódio característica deste reino.
48
Estes dados ilustram as diferentes estratégias de transporte adotadas por
estes organismos perante os desafios a que sua homeostase foi exposta. Os
eventos que afetaram cada uma das espécies estão ligados à evolução das famílias
de transportadores, o que remonta às adaptações que determinaram seu sucesso
evolutivo.
Outra abordagem possível é utilizar o banco de dados do ORFeome
(Matsuyama et al., 2006) de S. pombe, que contem a localização das proteínas
codificadas pelos ORFs deste fungo, para corroborar as inferências de localização
celular feitas neste estudo. Dados comparativos com este trabalho estão presentes
na Tabela 4.2 e confirmam nossa inferência no caso do transportador de Na+
SPAC15A10.06.
5.2- Análise dos fluxos de H+ na interação micorrízica arbuscular
O fungo Gigaspora margarita é uma das espécies que participa da interação
micorrízica arbuscular, uma das mais importantes relações de simbiose entre
microrganismos e plantas. Devido a intensa troca de substâncias entre os
simbiontes, temos estudado o fluxo de íons e as bombas de H+ presentes nas
membranas celulares de fungos e plantas buscando revelar o papel do gradiente
eletroquímico de H+ não só na energética da interação, mas também para a
sinalização do processo (Ramos, 2005).
No presente trabalho, os fluxos de H+ foram considerados como circuitos
oscilatórios e seu estudo foi feito por meio da aplicação de Transformadas Discretas
de Fourier, capaz de caracterizar as freqüências existentes em diferentes condições
e revelar possíveis freqüências harmônicas, sub-harmônicas ou super-harmônicas
ressonantes que possam conter informações relacionadas à sinalização celular
(Zonia e Feijó, 2003). A aplicação de Transformadas Discretas de Fourier pode ser
utilizada para caracterização dos circuitos oscilatórios compostos pelos fluxos de H+
ao longo do tempo para identificação de possíveis freqüências destes fluxos
características de cada condição ou estágio da interação. Um padrão destas
freqüências pode explicar em termos quantitativos a influência dos tratamentos no
comportamento das hifas fúngicas e células de raízes envolvidas nesta relação
49
simbiótica. As diferenças existentes entre os fluxos de H+, em termos das
freqüências apresentadas, nas diferentes condições (Figuras 4.5 a 4.10) teve sua
análise comprometida, pois não existia uma uniformidade no número de pontos de
leitura para as diferentes amostras. Como exemplo, temos o gráfico C da Figura 4.8
que possui o menor numero de pontos de leitura (19) e o gráfico B da Figura 4.5,
com o maior numero de leituras (268). Quanto maior o número de pontos de leituras
disponível, melhor é a capacidade da técnica em analisar as freqüências em que os
sistemas primários de transporte geram os fluxos de H+ para energizar o transporte
secundário de outros íons. Com base nos tratamentos com maior número de pontos
de leitura disponíveis, pudemos observar que as bombas de prótons trabalham em
variadas freqüências, o que é compatível com os ciclos de crescimento e nutrição
que devem se suceder em diferentes intervalos de tempo. Ou seja, as freqüências
verificadas devem corresponder à alternância de fluxos que descreve a energização
de diferentes transportadores secundários na membrana plasmática os quais
dissipam o gradiente eletroquímico de H+ durante o transporte de seus substratos, e
ao ciclo de crescimento celular dependente da manutenção deste mesmo gradiente
de H+ para a acidificação e distensão da parede celular. Corroborando esta hipótese,
ficou evidente neste estudo que as elevações de intensidade dos fluxos ocorrem na
região subapical correspondente a região de alongamento da hifa (de 10 a 20 μm de
distância da ponta da hifa). Compatível com um possível papel na sinalização dos
eventos que precedem a interação, os maiores estímulos do fluxo de H+ foram
verificados nas condições onde fora adicionado fluido apoplástico extraído de raízes
de plantas micotróficas, sugerindo que a planta secreta elementos de estímulo ao
crescimento da hifa que interferem primariamente nos sistemas de transporte de H+.
De maneira similar, mesmo no controle do meio sem fosfato, a região de
alongamento da hifa apresenta fluxos mais pronunciados em relação às outras
regiões, o que também está relacionado a um maior crescimento das hifas fúngicas
nesta condição (Ramos, 2005).
O fato de o nosso íon objeto de estudo ser o próton dificulta análises mais
detalhadas em virtude das dinâmicas e múltiplas interações em que este íon
participa em meio aquoso. Não existe ainda uma descrição molecular clara para o
comportamento de prótons hidratados (Headrick et al., 2005), de modo que estudos
no campo da mecânica quântica, da análise de espectro vibracional dos prótons e
50
da dinâmica molecular das proteínas e solutos em relação a suas conchas de
hidratação, precisam avançar mais para possibilitar uma modelagem precisa das
‘assinaturas de prótons’ que sinalizam diversos fenômenos celulares.
Tanto a classificação por similaridade das proteínas transportadoras em
levedura, como a exploração do banco de dados genômico e caracterização
funcional das bombas de prótons em cana-de-açúcar fornece um conjunto de
informações que podem ser utilizadas na construção de um cenário para o estudo
da interação simbiótica entre fungos micorrízicos e plantas. Para tanto um estudo
comparativo in silico com espécies que participam da interação micorrízica, como os
fungos Glomus mosseae e Gigaspora margarita e a planta Medicago truncatula,
poderia ser feito para se averiguar a similaridade entre os transportadores de H+
destes organismos modelo e os organismos utilizados em nossa pesquisa e
estabelecer parâmetros de comparação funcional, a fim de lançar bases para
estudos futuros de modelagem matemática da sinalização e da troca de nutrientes.
Entretanto, os bancos de dados genômicos destes organismos ainda não estão
disponíveis abertamente na internet, para possibilitar tal estudo.
Outra possível abordagem seria a análise de séries temporais, que é uma
área da Estatística dedicada ao estudo de observações que apresentam
dependência no tempo. Este tipo de abordagem possibilita diagnosticar e prever o
comportamento de variáveis em função do tempo possibilitando uma melhor
compreensão destes sistemas, bem como viabiliza a introdução de medidas de
intervenção, juntamente com a previsão dos possíveis resultados. A análise de
séries temporais busca possíveis padrões de repetição que podem ser
significativamente diferentes entres os diferentes tratamentos a que foram expostas
a hifas fúngicas e raízes vegetais.
A análise de caos poderia fornecer uma caracterização mais complexa do
comportamento do fluxo de prótons ao longo do tempo e em cada condição em
virtude da capacidade desta técnica em diferenciar condições de caos, semi-
periodicidade e periodicidade por meio da computação dos expoentes de Lyapunov,
que mede a taxa de divergência média em relação a uma condição inicial. Com base
nos valores dos expoentes dimensionais encontrados para o sistema, pode-se
determinar em que tipo de situação, caótica ou não, ele se encontra. Os fluxos de
prótons são considerados como um sistema dinâmico, onde o mapeamento de
51
expoentes de Lyapunov em dimensões fractais possibilita averiguar a ocorrência de
padrões não-lineares de caos ou semi-periodicidade em sistemas multi-dimensionais
onde uma perturbação foi inserida, baseado nas diferenças em relação a condição
inicial (Chirikov, 1979). O inconveniente desta técnica é que ela necessita de uma
quantidade muito grande de dados, em torno de 25.000 pontos de leitura
experimental seqüencial, para que possa fornecer informações confiáveis. Tal
quantidade de dados é simulada computacionalmente em experimentos mecânicos
que utilizam a técnica de Lyapunov. Por limitações técnicas do aparelho de sonda
vibrátil o tempo de leitura necessário para tal se obter tal coleção de dados torna
inviável, pois excede o tempo de crescimento da própria amostra biológica. Uma
possibilidade viável futuramente, a partir do melhor entendimento das interações
moleculares características dos prótons em solução num ambiente próximo à célula
e da dinâmica molecular das proteínas que os transportam, é a simulação
computacional dos dados dos fluxos de H+ para que os expoentes de Lyapunov
associados a esse fenômeno possam começar a ser estudados.
5.3- Expressão e Atividade dos Transportadores de H+ em Saccharum sp. L.
Analisamos a expressão de genes codificando proteínas transportadoras de
prótons da cana-de-açúcar por meio de ferramentas de bioinformática, uma técnica
conhecida como “in silico Northern”. Os resultados sugerem que a mineração de
dados em bancos genômicos pode ser útil na revelação de padrões inusitados da
expressão de proteínas específicas em diferentes tecidos, uma vez que possibilita a
visualização abrangente de várias seqüências representativas de uma dada
condição ou tecido. O estudo da atividade das proteínas transportadoras de prótons
em membranas de cana-de-açúcar permitiu averiguar a existência de uma relação
entre os níveis de expressão gênica avaliada in silico e a atividade cinética das
bombas de H+ nos mesmos tecidos.
A maior expressão destes sistemas transportadores primários de prótons nas
membranas de células da casca da cana-de-açúcar pode ser considerada como um
fato estranho numa análise superficial, mas que pode ser explicado pelo papel
desempenhado por essas proteínas no crescimento das células vegetais, não
52
apenas com relação à nutrição, mas, neste caso, existe uma relação com a Teoria
do Crescimento Ácido (Hager, 2003). Foi demonstrado que o alongamento de
células vegetais ocorre juntamente com um aumento na atividade da H+-ATPase de
membrana plasmática mediado pela auxina, o que aumenta a extrusão de H+ e, por
outro lado, faz com que a concentração intracelular de K+ cresça. Este transporte de
prótons faz com que o pH da parede celular baixe, ativando enzimas e proteínas
sensíveis ao pH que atuam no afrouxamento e no crescimento da parede celular.
Um mecanismo idêntico foi demonstrado para o crescimento cambial em brotos de
álamo, Populus nigra e Populus trichocarpa (Arend et al., 2002). Portanto, é possível
que estas proteínas estejam relacionadas ao crescimento do diâmetro do colmo da
cana-de-açúcar. E, ainda, é possível que esta maior quantidade de proteínas tenha
também ligação com o fato das células da casca serem a interface do vegetal com o
meio ambiente, necessitando, portanto, de uma barreira adicional de proteção. Isso
teria relação com a modulação da atividade da H+-ATPase em processos de
estresse e em respostas de defesa e hipersensibilidade, já demonstrada em outros
vegetais (Magnotta e Gogarten, 2002; Schaller e Oecking, 1999; Sugimoto et al.,
2004).
Contudo, os resultados de um “Northern” eletrônico de uma proteína
codificada por várias famílias de genes (como as H+-ATPases do tipo P) devem ser
analisados mais cuidadosamente, levando em consideração a ocorrência de várias
isoformas. Isto ocorre porque diferentes isoformas da P-H+-ATPase ficaram
agrupadas no nosso tratamento in silico, mas podem ter mecanismos de regulação
bastante diversos, afetando a atividade demonstrada nos experimentos bioquímicos
(Morsomme e Boutry, 2000), o que inspira estudos futuros abordando
especificamente estes transportadores e a participação de cada uma das isoformas
na bioenergética de Saccharum sp. L.
As medições de atividade das proteínas mostraram que as bombas de
prótons exibem maior atividade na casca da cana-de-açúcar do que nos tecidos
adjacentes mais internos com destaque para a H+-PPiase que também parece estar
mais ativa na casca do que no colmo. A participação da H+-PPiase no transporte de
H+ no tonoplasto faz com que o PPi seja um metabólito-chave nos sistemas vegetais,
permitindo a economia de ATP (Rea et al., 1992; Maeshima, 2000). Na cana-de-
açúcar, este transporte tem seu papel ressaltado, pois um menor gasto de ATP
53
significa um maior acúmulo de açúcar, alvo do interesse comercial nesta cultura.
Estes dados sobre a indução da expressão das bombas de H+ vacuolares também
pode estar relacionada com a Teoria do Crescimento Ácido segundo sua versão
mais recente que inclui a ativação destas bombas para possibilitar a entrada de K+ e
água necessários ao turgor celular e expansão do vacúolo central e da célula como
um todo (Zandonadi et al., 2007).
54
6- CONCLUSÕES
Este trabalho ressalta a importância da elaboração teórica e sistematização
dos dados obtidos em experimentos biológicos, bem como a utilização de diferentes
abordagens que empregam recursos de tecnologia da informação na busca da
integração do conhecimento sobre transporte iônico em membranas biológicas de
plantas e fungos.
Um inventário dos genes que codificam para proteínas transportadoras de
cátions da levedura de fissão, S. pombe, foi apresentado, bem como um estudo
funcional e filogenético de algumas destas seqüências, ressaltando a importância da
utilização da bioinformática para orientar a formulação de experimentos em
organismos com genoma seqüenciado.
A análise dos dados dos fluxos de H+ em hifas do fungo micorrízico Gigaspora
margarita ainda não possibilita a descrição de modelos consistentes para a
influência deste fluxo como sinalizadores do crescimento celular. Todavia, o
presente estudo apresenta alguns caminhos para a aplicação da sistematização
matemática em estudos de sistemas translocadores de íons, havendo testado o
potencial e revelado limitações que podem balizar futuras abordagens mais efetivas
no delineamento dos padrões existentes no fluxo de H+ para finalmente revelar o
que chamamos de assinaturas de prótons da sinalização celular.
Por fim, iniciamos um estudo de validação da avaliação da expressão gênica
in silico procedendo à comparação dos dados do banco SUCEST com as atividades
dos sistemas primários transportadores de H+ da cana-de-açúcar. A caracterização
de uma maior indução e ativação da H+-PPiase na casca do colmo em relação aos
tecidos mais internos, representa um passo inicial na revelação das particularidades
bioenergéticas envolvidas na alta eficiência desta espécie na produção de açúcar.
55
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i
ANEXO I
Leitura dos fluxos de H+ por micro-sonda vibrátil
Esta metodologia foi aplicada pelo Dr. Alessandro Coutinho Ramos durante o
seu período de estágio de ‘doutorado-sandwich’ no Instituto Gulbenkian de Ciência,
em Portugal (Ramos, 2005) e os dados por ele cedidos foram utilizados para o
estudo com Transformadas Discretas de Fourier apresentado neste trabalho.
Os dados detalhados temporalmente sobre o transporte de prótons nas hifas
foram obtidos por meio de micro-sondas vibráteis. A grande vantagem desta técnica
é que estas sondas são capazes de medir diferenças de potencial em meio líquido e,
desta forma, possibilitam o estudo de material biológico in vivo. O fluxo extracelular
de prótons foi medido usando uma micro-sonda vibrátil seletiva ao próton (Kühtreiber
e Jaffe, 1990; Kochian et al., 1992; Feijó et al., 1999), contendo um ionóforo seletivo
a este íon. Os sinais foram medidos através de um amplificador
(www.applicablelectronics.com), sendo que a vibração e o posicionamento do
eletrôdo foram obtidos através de motores posicionais (stepper-motors), que
permitem um movimento tridimensional, ajustados através de software. A aquisição
dos dados, o seu processamento preliminar, o controle de posicionamento
tridimensional do eletrodo e a focalização do microscópio foram feitos com o
software ASET (Science Wares [East Falmouth, MA] – www.sciencewares.com). A
sonda oscila com uma distância de excursão de 10μm, em ciclos de 2,33s. A
medição do potencial elétrico feita mais próxima a célula foi subtraída da medição
feita a 10μm de distância, ao fim do ciclo. Esta subtração representa a capacidade
de auto-referência da sonda e permite dizer se há influxo ou efluxo líquido de íons
numa dada região da membrana. Referências do meio foram tomadas a mais de
2mm do material analisado e subtraídas dos valores diferenciais, em mV, durante o
processamento dos dados. O tratamento posterior dos dados necessário para
calcular o fluxo iônico em um determinado ponto [x, y, z] do espaço, foi realizado
através da aplicação da lei de Fick (expressa pela equação: J = – D (Δc/Δx)), que
define um fluxo (J), em função da difusividade (D) e da relação entre as diferenças
de concentração (Δc) e distância (Δx).
ii
A dinâmica do processo de micorrização foi estimulada artificialmente por
meio de extratos radiculares. O transporte de prótons em hifas do fungo micorrízico
Gigaspora margarita foi estudado sob efeito de duas concentrações (10μL e 20μL)
de fluido apoplástico de raízes de trevo, Trifolium repens, para medir o estímulo
deste fluido no crescimento das hifas. Dois diferentes meios, com ou sem fosfato,
foram utilizados, para averiguar a inibição da interação micorrízica mediada por este
íon. Para cada um destes tratamentos, as medições dos fluxos foram realizadas em
três diferentes regiões da hifa: na ponta da hifa (TIP), de 10 a 20 µm de distância da
ponta e a 200 µm da ponta.
Feijó, J.A., Sainhas, J., Hackett, G. R., Kunkel, J.G. e Hepler, P.K. (1999) Growing
pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a
growth-dependent acidic tip. J Cell Biol. 144:483–496.
Kochian, L.V., Shaff, J.E., Kühtreiber, W.M., Jaffe, L.F., Lucas, W.J. (1992) Use of an
extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the
quantification of K+, H+, and Ca2+ fluxes in maize roots and maize
suspension cells. Planta. 188, 601-610.
Kühtreiber, W.M., Jaffe, L.F. (1990) Detection of extracellular calcium gradients with
a calcium-specific vibrating electrode. J Cell Biol. 110:1565-1573.
Ramos, A.C. (2005) Papel do fluxo de prótons na sinalização das diferentes fases da
interação micorrízica arbuscular. Tese (Doutorado em Produção Vegetal) –
Campos dos Goytacazes – RJ, Universidade Estadual do Norte Fluminense
– UENF.
i
ANEXO II
Análise bioquímica das bombas de H+
Os dados relativos à atividade catalítica e ao transporte de prótons através da
membrana foram obtidos e cedidos pela mestre Inga Gonçalves e pela doutoranda
Michele Catunda.
O material vegetal utilizado consistiu em amostras da casca do colmo e do
colmo destituído da casca da cana-de-açúcar coletadas de híbridos interespecíficos
da variedade SP80-3280 de Saccharum sp. L. Para a preparação das vesículas de
plasmalema e tonoplasto foi utilizado o método de centrifugação diferencial (Giannini
e Briskin, 1987), que emprega uma ultra-centrífuga (centrífuga HITACHI himac CP).
A purificação das vesículas de membrana plasmática e de tonoplasto foi realizada
através de um gradiente de sacarose (Serrano, 1989).
A determinação da concentração destas proteínas foi feita em
espectrofotometria a 595 nm (Bradford, 1976) utilizando-se um espectrofotômetro
SHIMADZU UV – 120. As atividades H+-ATPásica e H+-pirofosfatásica foram
determinadas colorimetricamente (Fiske e Subbarow, 1925), pela dosagem de
fosfato inorgânico (Pi) liberado durante a hidrólise enzimática de ATP ou PPi.
O monitoramento do gradiente de prótons foi feito pela medição da taxa de
decréscimo da fluorescência da sonda fluorescente metacromática ACMA (9-amino-
6-cloro-2-metoxiacridina), excitada com um feixe de λ= 415 nm e a emissão captada
a λ= 485 nm, em fluorímetro HITACHI F 4500. Em posse dos dados obtidos com a
curva de ΔpH, determinou-se a velocidade inicial da reação (V0) e a variação da
fluorescência máxima (ΔFmáx), através das seguintes equações:
V0 = [F0 / (Fmáx * T)] * 100 (eq. 1) onde:
F0 = fluorescência dependente de V0 em um tempo T qualquer, determinada
pela extrapolação de uma reta tangente à maior inclinação inicial da curva para o
eixo do tempo;
Fmáx = fluorescência máxima;
ii
T = tempo de reação em minutos.
ΔFmáx = Feq / Fmáx * 100 (eq. 2) onde:
Feq = fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência que reflete
o equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas, sendo determinada pela
equação 3:
Feq = Fmáx – FF (eq. 3) onde:
Fmáx = fluorescência máxima;
FF = fluorescência final.
Os ensaios contiveram aproximadamente 100μg de proteína da casca ou do
colmo sem casca da cana-de-açúcar, respectivamente, em 2mL de volume de
reação. Para as proteínas P-H+-ATPase (gráficos com a letra A) e V-H+-ATPase
(gráficos com a letra B) foi adicionado 0.1M ATP para iniciar sua atividade, e no caso
da V-H+-PPiase (gráficos com a letra C) houve a adição de 10mM PPi. Ao final do
tempo de medição, 20 mM NH4Cl foi usado para recuperar a perda da fluorescência.
As Figuras II.1 e II.2 mostram, respectivamente, dados sobre a atividade
hidrolítica e a velocidade inicial das enzimas H+-ATPase tipo P (P-H+-ATPase), H+-
PPiase vacuolar (V-H+-PPiase) e H+-ATPase do tipo V (V-H+-ATPase). Tanto a H+-
ATPase tipo P quanto a H+-PPiase tipo V tiveram uma atividade em torno de seis
vezes maior na casca em relação ao colmo, e a H+-ATPase do tipo V teve um
aumento menos destacado na casca, mas ainda assim com o dobro da atividade do
colmo.
O bombeamento de H+ através da membrana de vesículas extraídas de
células da casca e do colmo da cana-de-açúcar é mostrado na Figura II.3. A perda
de fluorescência da sonda ACMA ocorre à medida que os prótons vão sendo
bombeados através da membrana. Quanto mais acentuada a curva de perda de
fluorescência, maior estará sendo o transporte de H+ naquela vesícula. Confirmando
os dados obtidos nos outros experimentos, a principal diferença no transporte de H+
iii
quando se compara a casca (gráficos com o número 1) e o colmo sem a casca
(gráficos com o número 2), ocorre com a V-H+-PPiase (gráficos 1C e 2C).
Figura II.1. Comparação das atividades hidrolíticas da P-H+-ATPase, V-H+-
PPiase e V-H+-ATPase de Saccharum sp. L. As atividades foram medidas depois de
30 minutos de incubação a 30ºC.
Figura II.2. Velocidade inicial das enzimas P-ATPase, V-PPiase e V-ATPase
em vesículas de membranas das células da casca (stem bark) e do colmo (stem
devoid of bark) da cana-de-açúcar.
iv
Figura II.3. Bombeamento de H+ em vesículas de membranas da casca (1) e
do colmo (2) de cana-de-açúcar. A perda de fluorescência da sonda ACMA sensível
a H+ foi iniciada pela adição de 1mM ATP para a P-ATPase (A) e a V-ATPase (B) e
de 0,1mM PPi para a V-PPiase (C). Os ensaios contiveram ~100μg de proteína em
2mL de volume de reação. 20 mM NH4Cl foi usado para dissipar o gradiente de H+ e
recuperar a perda da fluorescência.
v
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