NOÇÕES DE CULTIVO E METABOLISMO

BACTERIANO

Cultivo de M.O. em condições

laboratoriais

• Todos organismos vivos requerem uma

fonte de energia

Alguns podem utilizar energia radiante – Fototróficos

Alguns dependem da oxidação de compostos

químicos para obter energia – Quimiotróficos

Pré-requisito: conhecimento de

exigências nutritivas e físicas requeridas

Todos organismos vivos requerem

uma fonte de carbono

• Autotróficos - podem usar o CO2 da atmosfera como

única fonte de carbono (bactérias fotossintéticas e

plantas), a partir da qual constrói todas suas

biomoléculas contendo carbono.

• Heterotróficos - não podem usar o CO2 da atmosfera,

obtém carbono a partir do ambiente na forma de

moléculas orgânicas complexas como a glicose (animais

superiores e muitos microrganismos).

Tipos Nutritivos:

Dos Microorganismos FOTOTRÓFICOS:

(luz como fonte de energia)

• As bactérias que utilizam CO2 como fonte de

carbono: fotolitotróficas.

• As bactérias que utilizam compostos orgânicos

como fonte de carbono: fotorganotróficas.

podem utilizar álcoois, ácidos graxos e

aminoácidos, além de outros compostos

orgânicos.

Dos Microorganismos QUIMIOTRÓFICOS:

(oxidam compostos químicos p/ obter energia)

• Quimiolitotróficos - m.o. capazes de oxidar

nitritos a nitratos (compostos inorgânicos) e

fixar o CO2 preenchendo, assim suas

necessidades de energia e de carbono.

• Quimiorganotróficos - m.o. requerem

compostos orgânicos de carbono, dos quais

obtêm energia por oxidação.

As bactérias

fotolitotróficas e quimiolitotróficas

são conhecidas comumente, como

autotróficas

ao passo que as espécies

fotorganotróficas e quimiorganotróficas

recebem a designação de

heterotróficas.

TIPOS NUTRITIVOS DAS BACTÉRIAS

Todos organismos vivos exigem alguma

forma de Nitrogênio

(bactérias – versáteis)

• Podem usar o nitrogênio da atmosfera

• Podem crescer na presença de compostos

nitrogenados inorgânicos

• Podem retirar o nitrogênio das ptns ou de praticamente

qualquer composto orgânico nitrogenado da natureza

As bactérias fixadoras de N2 fixam 193.000.000 toneladas de N2

Todos organismos vivos

necessitam de enxofre e fósforo

• Um grupo usa compostos orgânicos de S

• Outro grupo é capaz de usar compostos

inorgânicos de S

• Outro grupo pode utilizar S elementar

• O fósforo geralmente é suprido sob forma de

fosfatos

Todos organismos vivos exigem vários elementos

minerais para seu desenvolvimento normal

(Na, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, Cu, P, Co, etc.)

Em alguns casos as bactérias requerem apenas

traços destas substâncias, supridos como impurezas

dos demais componentes no preparo do meio

Todas as bactérias exigem vitaminas para

seus processos metabólicos normais

• Algumas sintetizam todas as vitaminas necessárias

• Outras necessitam de vitaminas pré-formadas

Alguns m.o. podem crescer num meio s/

vitaminas, ao lado de outros que exigem uma ou

mais vitaminas ou substâncias similares.

FATORES DE CRESCIMENTO

• Algumas bactérias são incapazes de

sintetizar determinado aminoácido, vitamina

ou outro composto essencial ao seu

metabolismo, necessitando da adição deste

fator de crescimento ao meio de cultivo.

FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O

CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS

• Além do conhecimento dos nutrientes

apropriados para a cultura das bactérias é,

preciso saber quais as condições físicas

ambientais para o seu melhor desenvolvimento.

• Assim como as bactérias variam no que diz

respeito as suas exigências nutritivas, também

demonstram respostas diversas às condições

físicas do ambiente.

1. TEMPERATURA

• Bactérias psicrófilas são capazes de crescer a

0C ou menos, embora seu ótimo esteja em

temperaturas mais elevadas 15C ou 20C. Diversas

espécies de bactérias isoladas na Antártica podem

crescer a -7C, mas seu desenvolvimento ótimo

ocorre entre 20C a 30C.

• Bactérias mesófilas crescem melhor de 25C a 40C.

• Bactérias termófilas crescem melhor

• entre 45C a 60C.

• O limite de crescimento de algumas bactérias termófilasse estende para a região mesófila recebendo adesignação termófilas facultativas ou euritermófilas.

• Outras espécies do grupo termófilo se desenvolvemmelhor em temperatura acima de 60C, não sedesenvolvendo na faixa mesófila: são chamadastermófilas verdadeiras, obrigatórias ouestenotermófilas.

• Temperatura ótima de crescimento

temperatura de incubação, que possibilita o

mais rápido crescimento, durante curto

período de tempo (12 a 24 horas).

A temperatura ótima de

crescimento pode não ser a

temperatura ótima de outras

atividades celulares.

2. EXIGÊNCIAS ATMOSFÉRICAS

As bactérias podem ser cultivadas em:

Aerobiose presença de oxigênio.

Anaerobiose ausência de oxigênio.

Bactérias aeróbias estritas são aquelas

que só crescem na presença de oxigênio por

utilizarem este composto como receptor final

de elétrons.

Bactérias anaeróbias facultativas ou apenas

facultativas podem crescer tanto em

anaerobiose como em aerobiose.

• No laboratório é muito simples cultivar

bactérias aeróbias ou facultativas, visto que o

oxigênio está sempre no ar.

Bactérias anaeróbias estritas só crescem

em anaerobiose, sendo inibidas ou mortas na

presença de O2, que não é utilizado em seu

metabolismo.

Bactérias microaerófilas só crescem em

atmosfera contendo concentrações de

oxigênio menores que as encontradas no ar

atmosférico.

• Para a obtenção de atmosferas isentas ou

pobres de oxigênio usamos jarras especiais:

Mas podemos usar técnicas simples também:

Para gerar uma atmosfera pobre em oxigênio ou rica em

CO2 pode-se proceder uma reação química, combinando

o O2 na formação de um novo composto

Pode ser conseguido

pela simples queima

de uma vela

O2 CO2.

Técnica da vela ou Candle jar (Macumba)

Ou mesmo através do uso de comprimidos

efervescentes, liberando CO2

• Indica-se o emprego de meios especiais contendo agentes

redutores, como o tioglicolato que contém um indicador de

presença de oxigênio como o azul de metileno.

• Ou a remoção mecânica do oxigênio de uma jarra,

contendo tubos ou placas com meios inoculados o ar é

aspirado e substituído por nitrogênio, hélio ou mistura de

nitrogênio e dióxido de carbono.

Câmaras de anaerobiose

3. pH

• A grande maioria das bactérias cresce bem em

meios com pH ao redor de 7,0 apesar de muitas

espécies tolerarem variações de pH entre 4,0 e 9,0.

• Os meios de cultura são geralmente tamponados

para evitar mudanças de pH decorrentes da

excreção de produtos do próprio metabolismo

bacteriano.

4. PRESSÃO OSMÓTICA

Meios c/ PO < interior da bactéria (hipotônicos), geralmentenão afetam sua viabilidade, a rigidez da parede celularimpede a entrada excessiva de água. (G -)

Meios c/ PO > que a do interior da bactéria (hipertônicos)causam perda de água intracelular bacteriostático oubactericida.

Obs:Halofílicos suportam uma quantidade maior de sais.

5. OUTROS FATORES

• HALOFILISMO

• Certas bactérias isoladas de salmouras, pacotes de

sal, alimentos e água do mar, chamadas bactérias

halofílicas obrigatórias, crescem apenas quando o

meio contém uma concentração inusitadamente

elevada de sal (10 a 15%). Isto representa uma

resposta à pressão osmótica

• LUMINOSIDADE

• Os organismos fototróficos devem ser expostos a

uma fonte luminosa, pois a luz é sua fonte de energia.

• MICROORGANISMOS

inoculadas em meio adequado

Incubadas sob condições apropriadas

• Aumento do número de células (reprodução)

FATORES NUTRICIONAIS E

AMBIENTAIS IDEAIS

POPULAÇÃO MÁXIMA

Algumas espécies atingem em 24hs

Outras exigem um período mais longo de

incubação p/ alcançar o crescimento máximo

REPRODUÇÃO:

• Alongamento da célula

• Invaginação da PC e migração do

material celular

Processo mais comum e mais importante:

FISSÃO BINÁRIA TRANSVERSAL

• Formação da PC transversa e distribuição

organizada do material celular para as duas

células filhas (ou divisão binária simples)

• desta forma ocorre o aumento populacional

• Separação das 2 novas células se faz em

progressão geométrica

1 2 22 23

24 25 ... 2n

TEMPO DE GERAÇÃO:

• tempo necessário p/ que a célula se divida

• tempo necessário p/ que a população se duplique

O tempo de geração varia de acordo com a bactéria:

CURVA HIPOTÉTICA DO CRESCIMENTO

BACTERIANO

CURVA TÍPICA DO CRESCIMENTO

BACTERIANO

AFase Lag ou inicial (1a estacionária)

População temporariamente inalterada as céls. não estão em repouso ou dormência

As células aumentam no tamanho (além do normal)

• Fisiologicamente são muito ativas podem estar deficientes em enzimas e/ou coenzimas precisam sintetizar.

• No final desta fase as céls. Se dividem e aumentam gradualmente a população até o término da fase.

B Fase Log ou exponecial

Pop. Passa a ter Capacidade de regularmente

As céls. Dividem-se em ritmo cte. e o logarítimo resultante é uma linha reta

O crescimento é máximo nesta fase

A população é uniforme nesta fase

C Fase estacionária (2a) ou Platô

A fase log começa a decrescer (gradualmente)

tendendo para o fim do crescimento.

Atribuída a uma série de circunstâncias:

exaustão de alguns nutrientes

produção de toxinas Espaço

A população permanece cte certo tempo

Resultado do equilíbrio reprodução X morte

D Fase de declínio ou de morte

As bactérias começam a morrer mais rápido do

que a produção de novas células

Ocorre devido ao agravo dos fatores já citados

MEDIDA QUANTITATIVA DO

CRESCIMENTO BACTERIANO

Contagem celular

(contagem direta ao microscópio ou em contadoreletrônico de partículas ou ainda contagem direta)

Determinação da massa celular

(diretamente por pesagem ou aferição do nitrogênioprotéico ( 14%) ou indiretamente por turbidimetria)

Avaliação da atividade celular

(indiretamente pela relação entre o grau de atividadebioquímica e o tamanho da população)

ex: ácido de glicose