DEPARTAMENTO DE CINCIAS DA VIDA

FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA

UNIVERSIDADE DE COIMBRA

Novas estratgias teraputicas para a

leishmaniose : Efeitos do p -cimeno e 2-

nitro-p -cimeno em Leishmania

Infantum

Mariana Vagos Ribeiro

2011

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DEPARTAMENTO DE CINCIAS DA VIDA

FACULDADE DE CINCIAS E TECNOLOGIA

UNIVERSIDADE DE COIMBRA

Novas estratgias teraputicas para a

leishmaniose : Efeitos do p -cimeno e 2-

nitro-p -cimeno em Leishmania

Infantum

Mariana Vagos Ribeiro

2011

Dissertao apresentada Universidade de Coimbra para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Biologia Celular e Molecular, realizada sob a orientao cientfica da Professora Doutora Maria do Cu Rodrigues de Sousa (Universidade de Coimbra) e do Professor Doutor Jos Barata Custdio (Universidade de Coimbra)

- 3 -

NDICE

- 4 -

NDICE

AGRADECIMENTOS Pag. 8

NDICE DE FIGURAS E TABELAS.... Pag. 10

ABREVIATURAS Pag. 13

I.- RESUMO..... Pag. 16

II - INTRODUO.................................................................................. Pag. 20

1.- Leishmania e a leishmaniose......

1.1- Classificao taxonmica de L. infantum....

1.2- Morfologia e ciclo biolgico.......

1.3- Fisiopatologia da leishmaniose....

1.3.1- Leishmaniose visceral....

1.3.2- Leishmaniose cutnea...

1.3.3 - Leishmaniose muco-cutnea

1.4- Epidemiologia..

1.5- Teraputica......

Pag. 20

Pag. 20

Pag. 21

Pag. 23

Pag. 24

Pag. 25

Pag. 26

Pag. 26

Pag. 28

2- Os leos essenciais e actividade biolgica Pag. 30

3.- Estrutura e funes da mitocndria......

3.1- Fisiologia, ultra estrutura e funes metablicas das mitocndrias

3.2- O sistema de transporte de electres e a fosforilao oxidativo....

3.3- Envolvimento da mitocndria nos mecanismos de morte celular...

3.3.1- Importncia da mitocndria nos processos apoptticos...

3.4 - Aco da mitocndria na homeostase do Ca2+ celular...

3.5- Permeabilidade transitria mitocondrial......

Pag. 31

Pag. 31

Pag. 33

Pag. 36

Pag. 37

Pag. 40

Pag. 43

- 5 -

III- OBJECTIVOS

Pag. 47

IV - MATERIAL E MTODOS..

Pag. 49

1- Susceptibilidade de Leishmania infantum ao 2-nitro-p-cimeno

e p-cimeno..

1.1- Origem das estirpes e manuteno das culturas..

1.2- Determinao do crescimento..

1.3- Estudos de viabilidade celular..

1.4- Estudos morfolgicos.....

2- Avaliao dos efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

bioenergtica mitocondrial....

2.1- Isolamento de mitocndrias de fgado de rato...

2.2- Determinao da concentrao de protena..

2.3- Determinao do consumo de oxignio..

2.4- Determinao do potencial de membrana das mitocndrias...

3- Avaliao dos efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

permeabilidade transitria mitocondrial....

4- Avaliao de efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

integridade das mitocndrias...

5- Estudo estatstico

Pag. 49

Pag. 49

Pag. 49

Pag. 50

Pag. 52

Pag. 53

Pag. 53

Pag. 54

Pag. 54

Pag. 56

Pag. 57

Pag. 58

Pag. 58

- 6 -

V RESULTADOS....

Pag. 60

1- Actividade anti-Leishmania do 2-nitro-p-cimeno e do p-

cimeno...................................................................................................

1.1- Estudo do crescimento de promastigotas de L. infantum.

1.2- Efeitos na viabilidade de promastigotas de L. infantum...

1.3- Efeitos na morfologia de promastigotas de L. infantum...

2- Efeitos na bioenergtica mitocondrial...

2.1- Efeitos do p-cimeno no consumo de oxignio e potencial de

membrana mitocondrial.

2.2- Efeitos do 2-nitro-p-cimeno no consumo de oxignio e potencial

de membrana mitocondrial....

3- Efeitos do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno na permeabilidade

transitria mitocondrial..

Pag. 60

Pag. 60

Pag. 61

Pag. 62

Pag. 64

Pag. 64

Pag. 70

Pag. 77

VI - DISCUSSO E CONCLUSES..

Pag. 81

VII - BIBLIOGRAFIA .

Pag. 86

- 7 -

AGRADECIMENTOS

- 8 -

AGRADECIMENTOS Professora Doutora Maria do Cu Sousa por tudo que me ensinou e

transmitiu, pelo apoio, pacincia, disponibilidade, incentivo e constante

acompanhamento ao longo deste trabalho.

Ao Professor Doutor Jos Custdio por me fazer ver mais alm a rea da

bioenergtica, pelo apoio, incentivo e disponibilidade pronta com que me

acompanhou ao longo de todo este trabalho.

Doutora Marisa Machado por me ter integrado na dinmica de

laboratrio, por toda a ajuda, disponibilidade, apoio e boa disposio com que

sempre me brindou. `

Ao Joo Vtor e Mariana Ponte Ribeiro pela ajuda e companheirismo

preciosos.

A toda a equipa dos laboratrios de Bioqumica e Microbiologia da

Faculdade de Farmcia pelo companheirismo, ajuda e momentos de boa

disposio.

A todos os meus amigos por estarem sempre ao meu lado quando

preciso.

Aos meus pais e irmo pela pacincia e motivao inesgotveis, por

continuarem a acreditar em mim mesmo quando eu tinha dvidas, sem vocs

seria muito mais difcil.

- 9 -

NDICES DE FIGURAS E TABELAS

- 10 -

NDICE DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Forma promastigota (A) e amastigota (B) (adaptado de Pace D et al

2011) de Leishmania infantumPag. 21

Figura 2 - Ciclo de biolgico de Leishmania sp. (adaptado de Marques et al

2007)Pag. 22

Figura 3 - Manifestao clnica de Leishmaniose Cutnea (adaptado de

Malekpour M et al 2010)Pag. 25

Figura 4 - Manifestao clnica de Leishmaniose muco-cutnea (adaptado de

www.who.int/leishmaniasis/mucocutaneous_leishmaniasis).....................Pag. 26

Figura 5 - Distribuio geogrfica mundial dos casos de leishmaniose, bem

como dos casos de co-infeco com VIH 1990 a 1998Pag. 27

Figura 6 - Mecanismos de aco dos frmacos anti-Leishmania.(adaptado de

Croft and Coombs, 2003)........................................................Pag. 28

Figura 7 - Estrutura qumica do p-cimeno e do seu derivado sinttico 2-nitro-p-

cimeno..Pag. 30

Figura 8 - Estrutura da mitocndria: modelo clssico e estrutura com locais de

contacto nas membranas mitocondriais..Pag. 32

Figura 9 - Representao esquemtica do sistema de transporte de electres

(complexos I, II, III, IV) e do sistema fosforilativo (complexo V).....Pag. 35

Figura 10 - Relao entre a mitocndria e a morte celular, evidenciando a

importncia da quantidade de ATP nos processos apoptticos e

necrticos.Pag. 39

Figura 11 - Representao esquemtica dos complexos respiratrios;

FoF1Sintetase; e dos componentes do poro de permeablidade transitria na

membrana mitocondrial interna (MMI) e membrana mitocondrial externa

(MME)...Pag. 44

Figura 12 - Cmara de Neubauer para contagem de clulas.Pag. 50

Figura 13 - Reduo do brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazlio (MTT) pelas desidrogenases mitocondriais..PAG. 50

Figura 14 Esquema de uma preparao em gota pendente usando a

lmina de Koch..PAG. 52

Figura 15 Representao esquemtica de um registo tpico obtido a partir de

experincias com elctrodo de TPP+..Pag. 57

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Malekpour%20M%22%5BAuthor%5Dhttp://www.who.int/leishmaniasis/mucocutaneous_leishmaniasis).....................Pag

- 11 -

Figura 16- Curva de crescimento de promastigostas de Leishmania

infantumPag. 60

Figura 17- Efeitos do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno na viabilidade celular de

promastigotas de L. infantumPag. 61

Figura 18. Observao das formas promastigotas de L. infantum a fresco por

microscopia de contraste de fases..Pag. 62

Figura 19 - Observao por microscopia ptica de promastigotas de L.

infantum incubadas durante 24 horas na presena e ausncia dos compostos

em estudo, aps colorao de Giemsa..Pag. 63

Figura 20 - Efeito do p-cimeno (PCy) nos estados 2, 3 e 4 da respirao de

mitocndrias de fgado induzido por glutamato/malatoPag. 64

Figura 21 - Efeito do p-cimeno (PCy) no ICR (A) e no quociente ADP/O (B).

Pag.66

Figura 22 - Efeitos do p-cimeno (PCy) no intumescimento mitocondrial..Pag. 67

Figura 23 - Efeito do p-cimeno (PCy) e do ATP (A) no estado 2 e no estado 4

da respirao, na presena de oligomicina (St4-olig) (B).Pag.68

Figura 24 - Efeito das vrias concentraes de 2-nitro-p-cimeno (NPCy) nos

estados 2, 3 e 4 da respirao de mitocndrias de fgado de ratoPag. 71

Figura 25. Efeito do 2-nitro-p-cimeno (NPCy) no ndice de controlo respiratrio

(IRC) (A) e no quociente ADP/O (B)Pag. 73

Figura 26 - Efeitos do 2-nitro-p-cimeno (NPCy) no intumescimento

mitocondrial..Pag. 74

Figura 27- Efeito do p-cimeno (NPCy) e do ATP (A) no estado 2 e no estado 4

da respirao, na presena de oligomicina (St4-olig) (B)Pag. 75

Figura 28- Efeitos do 2-nitro-p-cimeno (NPCy) no potencial de membrana ()

e na fosforilao oxidativa de mitocndrias de fgado de ratoPag. 76

Figura 29 - Efeitos do p-cimeno (PCy) nos fluxos de Ca2+ de mitocndrias

isoladasPag.78

Figura 30 - Efeitos do 2-nitro-p-cimeno (NPCy) nos fluxos de Ca2+ de

mitocndrias isoladas.Pag. 79

NDICE DE TABELAS

Tabela 1-Efeitos of p-Cymeno (pCy) em parmetros da fosforilao oxidativa

de mitocndrias de fgado de ratoPag. 69

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ABREVIATURAS

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ABREVIATURAS

Abs Absorvncia

ADP Adenosina 5- difosfato

ADP/O Razo entre as nanomoles de ADP fosforiladas e os

nanotomos de oxignio consumidos

AMP

ANT

Adenosina 5-monofosfato

Transportador de nucletidos de adenina

ATP Adenosina 5-trifosfato

BSA Albumina bovina srica

CoQ

CyA

Cyt.c

DMSO

DNA

p

pH

EDTA

EGTA

FCCP

F1

Fo

HEPES

ICR

MON-1

MPT

MTT

NAD+

NADH

NADP+

NADPH

Coenzima Q

Ciclosporina A

Citocromo c

Dimetilsulfxido

cido desoxirribonucleico

Potencial elctrico transmembranar

Fora protomotriz

Gradiente de pH

cido etilenodiaminotetractico

cido etilenoglicoltetractico

carbonildiciano-p-trifluoro-metoxifenil-hidrazona

Subunidade cataltica da ATP sintase

Subunidade da ATP sintase inibida por oligomicina

cido N-2-hidroxietil-piperazina-N-2-etanossulfnico

ndice de controlo respiratrio (definido como o quociente entre

os estados 3 e 4 da respirao

Monpellier-1

Permeabilidade transitria mitocondrial

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio

Dinucletido de nicotinamida adenina (oxidado

Dinucletido de nicotinamida adenina ( reduzido)

Dinucletido de fosfato de nicotinamida adenina (oxidado)

Dinucletido de fosfato de nicotinamida adenina (reduzido)

- 14 -

nAtg

NPCy

OMS

PCy

Pi

RNA

ROS

RPMI

SBF

SD

SDS

TPP+

UCPs

UQ

UV

Nano tomos grama

2-nitro-p-cimeno

Organizao Mundial de Sade

p-cimeno

Fosfato inorgnico

cido ribonucleico

Espcies reactivas de oxignio

Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute

Soro Fetal Bovino

Desvio padro

Dodecilsulfato de sdio

Catio tetrafenilfosfnio

Protenas dissociadoras (do ingls, uncoupling proteins)

Ubiquinona ou coenzima Q

Ultravioleta

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RESUMO

- 16 -

I - Resumo

A leishmaniose uma doena infecciosa parasitria que afecta cerca de

12 milhes de pessoas em todo o Mundo, bem como animais domsticos e

selvagens, ocorrendo, predominantemente, em regies tropicais e sub-

tropicais. O agente etiolgico um parasita intracelular obrigatrio do gnero

Leishmania e o hospedeiro infectado pode desenvolver leses cutneas, muco-

cutneas ou viscerais, dependendo da espcie infectante, bem como da

resposta imunitria do hospedeiro. O zimodemo de Leishmania infantum mais

frequente na zona mediterrnica o MON-1, sendo responsvel pela grande

maioria dos casos diagnosticados de leishmaniose visceral e por alguns casos

de leishmaniose cutnea. Em Portugal, as leishmanioses humana e canina tm

uma prevalncia significativa, estando as zonas de Trs-os-Montes e Alto

Douro, Bacia hidrogrfica do Mondego, Regio metropolitana de Lisboa e

Algarve identificadas como zonas endmicas.

Segundo a OMS a leishmaniose visceral tem vindo a surgir com uma

complicao associada a doenas que comprometem o sistema imunitrio,

como o VIH. Dos primeiros 1700 casos reportados de co-infeco at 1998, em

33 pases, 85% foram registados em Espanha, Itlia, Frana e Portugal, sendo

esta uma problemtica emergente e prioritria na procura de novas

teraputicas

Actualmente, a quimioterapia constitui a principal teraputica no controlo

da leishmaniose, no sendo, no entanto, suficientemente eficaz. Os frmacos

mais utilizados no tratamento das leishmanioses so os compostos antimoniais

pentavalentes, o alopurinol e a anfotericina B, mas estes, para alm de serem

caros, tm mostrado elevada toxicidade, resistncia dos parasitas aos

medicamentos e, na maioria dos casos, tm um sucesso limitado. , portanto,

necessrio desenvolver terapias alternativas e caracterizar novos alvos

teraputicos para obter tratamentos mais eficientes, especficos e menos

txicos.

Na procura de alternativas teraputicas, os leos essenciais e/ou os seus

componentes, tm vindo a ganhar visibilidade devido sua aco anti-

bacteriana, antiparasitria, antifngica e antiviral, representando um grupo de

molculas que podem ser altamente eficazes na leishmaniose. Estudos in vitro

- 17 -

demonstram que o monoterpeno p-cimeno tem uma aco antimicrobiana

contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli.

Com o objectivo de estudar a actividade anti-Leishmania do p-cimeno e

do seu derivado sinttico 2-nitro-p-cimeno, foram realizados ensaios de

viabilidade celular e de morfologia de promastigotas de L. infantum. O p-cimeno

no induziu perda de viabilidade celular nem alteraes morfolgicas. No

entanto, o 2-nitro-p-cimeno teve efeitos significativos na reduo da viabilidade

celular, com um IC50 de 145 g/ml. Estes resultados sugerem que a introduo

do grupo nitro na estrutura qumica do p-cimeno foi determinante na actividade

anti-Leishmania.

O modo de aco dos monoterpenos est relacionado com vrios alvos

na clula e embora os mecanismos especficos de actividade e os efeitos

citotxicos permaneam por caracterizar, estudos recentes sugerem que estes

compostos devero actuar promovendo perturbaes na permeabilidade de

membranas, ou at mesmo afectar a integridade membranar dos

microrganismos, interferindo com todas as suas funes.

A mitocndria tem uma importncia fundamental nos processos de

sobrevivncia e morte celular, dado que essencial para a produo de ATP,

atravs do processo de fosforilao oxidativa, sendo tambm o principal

organelo responsvel pela formao intracelular de espcies reactivas de

oxignio e mecanismo de regulao celular. Assim, as alteraes na estrutura

e funes mitocondriais induzidas pelo p-cimeno e pelo 2-nitro-p-cimeno foram

tambm avaliadas atravs de ensaios sobre a bioenergtica de mitocndrias de

rato, bem como na permeabilidade transitria mitocondrial. Os resultados

sugerem efeitos significativos de ambos os compostos na bioenergtica

mitocondrial, com maior actividade do 2-nitro-p-cimeno, induzidos por

mecanismos diferentes. Nas mitocndrias incubadas com o p-cimeno, a

estimulao induzida no estado 4 da respirao significativamente diminuda

na presena de oligomicina, indicativo de que as perturbaes na capacidade

fosforilativa e aumento do estado 4 da respirao se devem fuga de protes

ao nvel da fraco Fo da ATP sintase. A estimulao do estado 4 da

respirao induzido pelo 2-nitro-p-cimeno no foi significativamente alterada

por oligomicina, no ocorrendo tambm alteraes no intumescimento,

sugerindo que aumento do estado 4, a diminuio do estado 3 da respirao e

- 18 -

consequente diminuio do ndice de controlo respiratrio, bem como

diminuio do potencial de membrana se devem permeabilizao da

membrana interna mitocondrial a protes. Embora atravs de mecanismos

diferentes, ambos os compostos induzem perturbaes na permeabilidade

membranar, com consequente diminuio do potencial membranar e

diminuio da sntese de ATP. Todavia, ambos os compostos apresentam

diferentes efeitos na capacidade de regulao do Ca2+ pela mitocndria,

verificando-se alteraes apenas na presena de 2-nitro-p-cimeno.

Em concluso, os resultados sugerem que a presena do grupo nitro

fundamental na activao de mecanismos que interferem com a viabilidade

celular, homeostase do Ca2+ e bioenergtica mitocondrial. O grupo nitro,

conferindo um carcter anfiptico ao composto, permitir ao 2-nitro-p-cimeno

maior facilidade em partilhar e atravessar as membranas celulares podendo

afectar os vrios organelos intracelulares, incluindo o complexo mitocondrial.

Esta caracterstica poder explicar as diferenas observadas entre os dois

compostos e ser responsvel pela induo dos mecanismos de morte celular.

- 19 -

INTRODUO

- 20 -

II - INTRODUO

1 - Leishmania e a leishmaniose

A leishmaniose uma doena infecciosa parasitria que afecta cerca de

12 milhes de pessoas em 88 pases de todo o Mundo, bem como animais

domsticos e selvagens. Apesar de hoje ser considerada uma das principais

doenas parasitrias tropicais (Organizao Mundial de Sade, 2009), a

leishmaniose foi durante muito tempo uma doena negligenciada, com muitos

casos por diagnosticar. Com uma elevada taxa de mortalidade e de prevalncia

em zonas tropicais e sub-tropicais, esta doena causada por um parasita,

intracelular obrigatrio, do gnero Leishmania (Santos et al., 2008) e o

hospedeiro infectado pode desenvolver leses cutneas, muco-cutneas ou

viscerais. O desenvolvimento da doena depende do vector de transmisso,

vrias espcies de flebtomos, da espcie infectante e da resposta imunitria

do hospedeiro (Barral et al. 1991; Grimaldi et al. 1991; Liew and ODonnel

1993). Existem cerca de 350 milhes de pessoas expostas ao risco de infeco

por Leishmania, sobretudo em pases em vias de desenvolvimento, e os casos

de co-infeco com o vrus da imunodeficincia humana tm sido cada vez

mais evidentes e preocupantes.

Actualmente, a quimioterapia constitui a principal ferramenta no controlo

das leishmanioses, no entanto este tipo de teraputica , geralmente, muito

prolongado, caro e com elevados nveis de toxicidade.

1.1 - Classificao taxonmica de L. infantum

Em 1903, Leishman e Donovani descreveram, em separado, uma

protozorio agora designado de L. donovani em tecido de bao de pacientes

com uma doena crnica agora descrita como leishmaniose visceral

(Herdwaldt, 1999). Na bacia mediterrnica, L. infantum, espcie pertencente ao

mesmo gnero est descrita como sendo responsvel por 90% dos casos de

leishmaniose visceral.

A.espcie Leishmania infantum pertence ao reino Protista, sub-reino

Protozoa, filo Sarcomastigophora, sub-filo, Mastigophora, classe

- 21 -

Zoomastigophorea, ordem Kinetoplastidae, sub-ordem Trypanossomatina,

famlia Tripanossomatidae e ao gnero Leishmania.

Actualmente, a identificao e caracterizao dos sub-gneros e sub-

espcies dos isolamentos de Leishmania feita por tipagem isoenzimtica

(Marques et al., 2007) Neste contexto surge a designao de zimodemo,

unidades taxonmicas que agrupam estirpes com perfis enzimticos

semelhantes. O zimodemo de Leishmania infantum mais frequente na zona

mediterrnica o MON-1, sendo responsvel pela grande maioria dos casos

diagnosticados de leishmaniose visceral e por alguns casos de leishmaniose

cutnea (Cardoso et al., 2002)

1.2 - Morfologia e ciclo biolgico

Durante o seu ciclo biolgico, todas as espcies de Leishmania alternam

entre duas formas celulares morfologicamente bem distintas. A forma

promastigota encontra-se no tracto digestivo do vector de transmisso e

caracteriza-se por ser uma clula mvel, alongada e fusiforme, de tamanho

varivel, entre 10 e 20 m de comprimento, com um flagelo na regio anterior.

A forma amastigota oval ou redonda, intracelular, sem flagelo e sem

mobilidade diferenciando-se e multiplicando-se no sistema mononuclear

fagocitrio do hospedeiro vertebrado (Dedet et al., 1999)

Figura 1 - Forma promastigota (A) e amastigota (B) (adaptado de Pace D et al 2011)

de Leishmania infantum.

B A

- 22 -

Os vectores de transmisso da leishmaniose so pequenos insectos

pertencentes ordem Dptera, famlia Psychodidae e gnero Phlebotomus no

Velho Mundo e Lutzomia no Novo Mundo. Com uma distribuio disseminada

por climas temperados e tropicais, estes insectos de reduzidas dimenses

alimentam-se de sangue e so mais activos durante a noite, aproveitando o dia

para descansar em casas, adegas, caves e grutas (Hirotomo et al., 2010). Ao

contrrio dos mosquitos, os flebtomos voam de forma silenciosa em direco

ao alvo e somente as fmeas se alimentam de sangue necessrio para a

produo de ovos.

Figura 2 - Ciclo de biolgico de Leishmania sp. (adaptado de Marques et al 2007)

O ciclo de vida de Leishmania sp inicia-se com a picada da fmea do

flebtomo ao hospedeiro vertebrado infectado, ingerindo os parasitas na forma

amastigota. Uma vez no interior do vector, as amastigotas migram para o

intestino onde se diferenciam em formas promastigotas infectantes e se

multiplicam (Bates, 2006). Na prxima refeio sangunea, as fmeas

infectadas inoculam no hospedeiro vertebrado as formas promastigotas do

- 23 -

parasita. Sendo detectadas comp agentes invasores, as formas promastigotas

so rapidamente fagocitadas por macrfagos. J dentro dos macrfagos as

promastigotas diferenciam-se em amastigotas e proliferam, provocando a

ruptura do macrfago infectado e a libertao das amastigotas no organismo

do hospedeiro que vo ser fagocitados por outros macrfagos (Chang, 2005).

Os macrfagos infectados podem ento migrar para os tecidos

subcutneos ou atingir o fgado, bao, medula e gnglios linfticos, conduzindo

ao desenvolvimento de leishmaniose cutnea ou visceral, respectivamente.

Assim, o desenvolvimento da doena depende da eficincia do parasita no que

diz respeito sua diferenciao na forma amastigota, tal como, da espcie

infectante e da resposta imunitria do hospedeiro (Barral et al., 1991; Grimaldi

et al., 1991; Liew and ODonnel 1993).

Pensa-se que o Homem tenha comeado por ser um hospedeiro devido a

uma exposio acidental ao ciclo biolgico do parasita. Inicialmente a

leishmaniose visceral seria uma zoonose de animais selvagens que

funcionavam como reservatrios, permitindo a manuteno a longo prazo dos

parasitas na Natureza (Ashford, 1996). Com a quebra dos limites das zonas

endmicas devido a presses antropognicas, o Homem e o co domstico

tero ficado expostos ao ciclo de transmisso de Leishmania, passando o co

domstico a ser um reservatrio destes parasitas. A proximidade com o

Homem em zonas endmicas dos flebtomos permite a transmisso da doena

e o fecho do ciclo biolgico do parasita.

1.3 - Fisiopatologia da leishmaniose

No Homem, as espcies de Leishmania causam uma variedade de

doenas clnicas dependendo da capacidade do parasita proliferar em tecidos

profundos ou superficiais. As vrias manifestaes clnicas da leishmaniose

tm sido usadas pela OMS para classificar as leishmanioses em trs formas

clnicas distintas de acordo com a sintomatologia e sistemas fisiolgicos

afectados: leishmaniose cutnea, muco-cutnea e visceral.

Alm da exposio ao ciclo biolgico do parasita na presena do vector,

existem alguns outros factores que podem aumentar o risco de infeco e

- 24 -

agravar o prognstico, como a pobreza, a desnutrio e actualmente a co-

infeco com outras doenas, nomeadamente com o vrus da imunodeficincia

humana (VIH) (Desjeux, 2001). A leishmaniose , ainda, uma doena

associada pobreza em particular em pases em desenvolvimento e portanto a

disseminao real da doena permanece camuflada em grande parte porque

os mais afectados vivem em reas isoladas, mas tambm devido ao estigma

social que conduz a que os pacientes se resguardem, devido s cicatrizes e

deformaes fsicas que a doena pode causar.

1.3.1 - Leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral a forma mais grave da doena, sendo a que

apresenta maior taxa de mortalidade caso no seja devidamente tratada. A

forma visceral tem as consequncias mais severas e pode ser causada apenas

por trs das cerca de 20 espcie de Leishmania conhecidas: L. donovani na

ndia e na frica Oriental; L. infantum na Europa e na bacia do mediterrneo; L.

chagasi na Amrica Central e do Sul. O parasita atinge as clulas do sistema

mononuclear fagocitrio, especialmente do fgado, bao, medula e dos gnglios

linfticos. A infeco pode permanecer assintomtica ou desenvolver-se de

forma aguda, sub-aguda e crnica conduzindo ao aparecimento de febre,

hepatomegalia e esplenomegalia, perda acentuada de peso, cansao e anemia

(Hirotomo, 2010). Em indivduos no tratados, a morte ocorre maioritariamente

devida a infeces secundrias devido ao comprometimento do sistema

imunitrio e da desnutrio.

Segundo a OMS a leishmaniose visceral tem vindo a surgir com uma

complicao associada a doenas que comprometem o sistema imunitrio,

como o VIH. Dos primeiros 1700 casos reportados de co-infeco at 1998, em

33 pases, 85% foram registados em Espanha, Itlia, Frana e Portugal, sendo

esta uma problemtica emergente e prioritria na procura de novas

teraputicas (Marques et al., 2007).

- 25 -

1.3.2 - Leishmaniose cutnea

Leishmaniose cutnea pode ter vrios graus de severidade podendo no

manifestar-se durante um perodo varivel de tempo aps a infeco.

Geralmente as leses caracterizam-se pelo aparecimento de lceras simples

ou difusas na pele, deixando cicatrizes e, podendo mesmo, causar

desfigurao e mutilao do paciente A leishmaniose cutnea localizada

manifesta-se maioritariamente como um ndulo localizado que ulcera e

cicatriza de forma natural, mas acaba por deixar marcas e alteraes na

pigmentao da pele (Fig. 3). No caso da leishmaniose cutnea difusa, a leso

inicial no ulcera mas as formas infectantes migram para vrios pontos da

superfcie cutnea, acabando por se disseminar e ulcerar mais tarde,

apresentando um tempo de incubao que vai de alguns dias a vrios anos

Esta forma da doena pode regredir espontaneamente ou evoluir requerendo,

ento, de tratamento (Grimaldi et al., 1991).

Na bacia do mediterrneo 20% dos casos de leishmaniose cutnea esto

descritos como sendo causados pela espcie Leishmania infantum MON-1,

pelo que se coloca a questo da influncia da estirpe na manifestao clnica

exibida pelo paciente. As leses cutneas causadas por L. infantum podem ser

localizadas ou difusas e a sua evoluo crnica.

Figura - 3. Manifestao clnica de Leishmaniose Cutnea (adaptado de Malekpour M

et al 2010).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Malekpour%20M%22%5BAuthor%5D

- 26 -

1.3.3 - Leishmaniose muco-cutnea

As leses muco-cutneas resultam, geralmente, da disseminao dos

amastigotas desde a pele at mucosa naso-orofarngea. Na maioria dos

casos, as manifestaes muco-cutneas tornam-se evidentes alguns anos

aps o desaparecimento das leses cutneas, mas podem tambm aparecer

enquanto estas ainda no esto curadas, devido a uma metastizao

secundria pelo organismo. Pressupe-se, ento, que o tratamento adequado

das leses cutneas diminui o risco de aparecimento de leses muco-

cutneas. Geralmente, esta variante da doena torna-se evidente devido aos

sintomas nasais crnicos, que passam pela destruio da mucosa naso-

orofarngea devido a uma sobre-estimulao do sistema imunitrio (Fig. 4).

Figura 4 - Manifestao clnica de Leishmaniose muco-cutnea (adapatado de

www.who.int/leishmaniasis/mucocutaneous_leishmaniasis)

1.4 - Epidemiologia

A leishmaniose uma zoonose disseminada por todo o Mundo com uma

maior incidncia em zonas tropicais, sub-tropicais e temperadas em que as

diferentes combinaes de parasitas, reservatrios e vectores co-existam (Fig.

5).

De acordo com a OMS, existem cerca de 350 milhes de pessoas em 88

pases em risco de infeco, com uma incidncia anual de 12 milhes de casos

(Chang, 2005). Hoje em dia considerada umas das maiores doenas

- 27 -

tropicais, apesar de durante muitos anos ter sido negligenciada e muitos casos

no terem sido reportados e tratados. O aumento da incidncia de casos de

leishmaniose poder estar relacionado com o aumento dos factores de risco,

principalmente nos pases em vias de desenvolvimento.

A co-infeco de leishmaniose visceral com o VIH tem vindo a aumentar,

provavelmente devia alteraes no ciclo de transmisso da leishmaniose. A

partilha de seringas por indivduos toxicodependentes pode ser um importante

factor neste aumento dos casos de co-infeco. Este cenrio poder vir a

agravar-se rapidamente na sia e na frica, cujos dados de prevalncia e

deteco da co-infeco ainda no so conhecidos (Alvar et al., 2008)

No Sul da Europa, Leishmania infantum o agente etiolgico da

leishmaniose visceral, sendo o co o principal reservatrio do ciclo domstico

(Moreno e Alvar, 2002). Em Portugal, as leishmanioses humana e canina tm

uma prevalncia significativa, estando as zonas de Trs-os-Montes e Alto

Douro, Bacia hidrogrfica do Mondego, Regio metropolitana de Lisboa e

Algarve identificadas como zonas endmicas.

Figura 5 - Distribuio geogrfica mundial dos casos de leishmaniose, bem como dos

casos de co-infeco com VIH 1990 a 1998 (adaptado de WHO/NTD/IDM HIV/AIDS,

Tuberculosis and Malaria (HTM) World Health Organization, 2010)

Leishmaniose Co-infeco com VIH

- 28 -

1.5 - Teraputica

Actualmente, a quimioterapia constitui a principal ferramenta no controlo

das leishmanioses, no entanto este tipo de teraputica , geralmente, muito

prolongado, caro e com elevados nveis de resistncia e toxicidade.

As drogas mais utilizadas contra a leishmaniose so os compostos

antimoniais pentavalentes, o alopurinol, a anfotericina B, ou uma combinao

de antimoniato de meglumina e alopurinol (Croft e Coombs, 2003).

Compostos Mecanismos de aco

Antimoniais pentavalentes (Glucantime e Pentostam)

Tm estruturas moleculares pouco caracterizadas e a sua aco interfere directamente com a bioenergtica mitocondrial das formas amastigotas de Leishmania sp. Estes produtos ligam-se a diferentes protenas do parasita inibindo-as, especialmente a enzimas envolvidas na gliclise e no metabolismo dos cidos gordos

Pentamidina

Derivado aromtico da diamidina, txico para vrios protozorios atravs da sua ligao ao DNA cinetoplastidial e comportando, portanto, tambm efeitos secundrios mais graves.

Anfotericina B Agente antifungico com uma aco eficiente, este composto liga-se membrana plasmtica aumentando a sua permeabilidade

Paramomicina

Em bactrias inibe a sntese proteica atravs da sua ligao subunidade 30s dos ribossomas, causando erros de leitura e finalizao precoce da traduo do mRNA. Em leishmania a paramomicina tambm afecta a mitocndria

Miltefosina Possivelmente inibe ou modela a transduo de sinal e a homeostase do clcio

Imiquimod Estimula a produo de xido ntrico em macrfagos

Figura 6 Mecanismos de aco dos frmacos anti-Leishmania.(adaptado de Croft

and Coombs, 2003)

Os compostos antimoniais pentavalentes tm estruturas moleculares

pouco caracterizadas e actuam directamente na bioenergtica mitocondrial das

formas amastigotas de Leishmania. Estes compostos ligam-se a diferentes

protenas do parasita inibindo-as, especialmente a enzimas envolvidas na

gliclise e no metabolismo dos cidos gordos. Nos casos de leishmaniose

visceral em que o tratamento com os compostos antimoniais no suficiente

- 29 -

pode usar-se a pentamidina, derivado aromtico da diamidina, com alternativa.

A anfotericina B um agente antifungico com uma aco eficiente. Este

composto liga-se membrana plasmtica aumentando a sua permeabilidade

(Chan-Bacab M and Pea-Rodrguez L., 2001). Embora estudos recentes

tenham permitido desenvolver uma nova formulao de anfotericina B

incorporada em lipossomas que permite uma aco melhorada deste frmaco,

os feitos secundrios so ainda bastantes e os custos de produo desta nova

formulao so muito elevados. , portanto, necessrio desenvolver terapias

alternativas e caracterizar novos alvos teraputicos para obter tratamentos

mais eficientes, especficos e menos txicos.

Na procura de novos compostos leishmanicidas, os produtos derivados de

plantas tm ganho algum relevo e recentemente foi evidenciada a aco anti-

Leishmania de leos essenciais e de alguns dos seus constituintes (Rosa et al.,

2003; Monzote et al., 2007; Oliveira et al., 2009; Machado et al., 2010).

- 30 -

2 - Os leos essenciais e actividade biolgica

Vrias actividades biolgicas com potencial teraputico tm sido

atribudas aos leos essenciais e aos seus componentes, destacam-se a

actividade anti-espasmdica, anti-inflamatria, anti-convulsivante, anti-oxidante

(Sakurada, et al., 2009) e actividades biocidas como a antiviral, antibacteriana,

antifngica e antiparasitria (Edris, 2007; Bakkali, et al., 2008; Gutierrez, et al.,

2008 ; Hemaiswarya, et al., 2008).

A actividade antimicrobiana de leos essenciais, ricos em compostos

fenlicos, foi observada em fraces contendo timol e carvacrol (Lambert et al.,

2001) e estudos in vitro demonstram que o monoterpeno p-cimeno tem uma

aco antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli (Cristani

et al., 2007; Mimran Shapira, 2007). Foram tambm observados efeitos

sinrgicos entre os monoterpenos carvacrol e timol com o seu precursor p-

cimeno (Vardar-Unlu et al., 2003). Alm disso, diversos estudos tm

demonstrado que p-cimeno e seus derivados monoterpenos apresentam

actividade antioxidante e anti-cancergena, estando aprovados nos Estados

Unidos e na Europa para preservar e dar sabor aos alimentos (Burt, 2004).

Figura 7 - Estrutura qumica do p-cimeno e do seu derivado sinttico 2-nitro-p-cimeno.

O modo de aco dos monoterpenos est relacionado com vrios alvos na

clula, embora os mecanismos especficos de actividade e os efeitos

citotxicos permaneam por caracterizar. A actividade antimicrobiana est,

geralmente, associada presena de pequenas molculas oxigenadas,

capazes de estabelecer pontes de hidrognio, exemplos do timol, do carvacrol,

do eugenol, do linalol, do geraniol, do neral ou do geranial. Estes compostos

p-cimeno 2-nitro-p-cimeno

- 31 -

actuam por modificao da membrana dos microrganismos, muitas das vezes

com perda da integridade membranar que dever afectar todas as suas

funes.

3 - Estrutura e funes da mitocndria

3.1 - Fisiologia, ultra estrutura e funes metablicas das mitocndrias

As mitocndrias so organitos intracelulares com cerca de 2 m e

existentes nas clulas eucariticas. O seu nmero por clula encontra-se

relacionado com as necessidades energticas das clulas. Os rgos

metabolicamente activos, como o fgado, o crebro e os msculos cardaco e

esqueltico contm um maior nmero de mitocndrias, e apresentam maior

susceptibilidade ao efeito de frmacos que actuam nas mitocndrias e a

determinadas patologias, designadas como patologias mitocondriais (Szewczyk

e Wojtczak, 2002). De acordo com a imagem clssica, a estrutura da

mitocndria (Fig. 8 (A)) a membrana mitocondrial externa, que constitui uma

barreira de permeabilidade para as molculas existentes no citossol maiores

que 1500Da e separa o espao intermembranar do citossol; 2) o espao

intermembranar, cuja composio inica semelhante do citossol e contem

um distinto grupo de protenas incluindo o citocromo c; 3) a membrana

mitocondrial interna paralela membrana externa, apenas permevel ao

oxignio, dixido de carbono e gua, ou de pequenas pores desta membrana

invaginam para o interior da matriz como cristas, designadas por cristas

mitocondriais, onde est localizado o sistema de electres, o sistema

fosforilativo e os transportadores membranares; 4) a matriz mitocondrial que

contm as enzimas metablicas, o DNA e RNA mitocondrial. Este genoma tem

unicamente genes que codificam para algumas protenas envolvidas na

fosforilao oxidativa (Lesnefsky et al., 2001).

No entanto, e segundo outros estudos, a estrutura mitocondrial no

assim to simples, (Mannella, 2000) tendo sido demonstrado que as cristas no

so simples invaginaes da membrana mitocondrial interna, mas sim

estruturas independentes e que podem ou no estar ligadas membrana

mitocondrial interna (Fig.8-B). De salientar que as mitocndrias no tm uma

- 32 -

forma nica mas podem ter diferentes formas de acordo com o tecido onde se

localizam. Apesar das membranas mitocondriais interna e externa serem

estruturas bem definidas, cada uma delas possuindo diferentes conjuntos de

enzimas e desempenhando diferentes funes, foram identificados locais de

contacto ntimo entre as duas membranas quer a nvel morfolgico quer a nvel

funcional (Mannella, 2001).

Figura 8 Estrutura da mitocndria: modelo clssico e estrutura com locais de

contacto nas membranas mitocondriais.

(A)- Modelo clssico da mitocndria, a mitocndria constituda pela membrana

externa; pela membrana interna que forma invaginaes para o espao

intermembranar, originando as cristas e pela matriz mitocondrial.

(B)- Mitocndria visualizada por tomografia electrnica em que as cristas so

estruturas internas que podem ou no estar ligadas membrana mitocondrial interna

(Adaptado de Lesnefsky et al., 2001;Mannella, 2001)

A maior parte do ATP (aproximadamente 95%) que a clula necessita

produzida pelas mitocndrias, sendo conhecidas como as centrais energticas

da clula. A mitocndria est envolvida em vrios processos e vias

metablicas, nomeadamente: 1) a converso do piruvato a acetil-CoA,

processo este catalisado pelo complexo da desidrogenase do piruvato; 2) o

ciclo do cido ctrico; 3) fosforilao oxidativa que resulta do funcionamento

conjunto da cadeia respiratria acoplada sntese de ATP; 4) a oxidao

(degradao dos cidos gordos); 5) parte do ciclo da ureia; 6) o fornecimento

de intermedirios metablicos ao resto da clula; 7) o armazenamento de

Membrana mitocondrial externa

Membrana mitocondrial

interna

Cristas

Matriz Matriz

Membrana mitocondrial

externa

Membrana mitocondrial

interna

Cristas

A B

- 33 -

clcio, de forma a manter a concentrao de clcio citoplasmtico a um nvel

baixo e constante; 8) a sntese de DNA, RNA e protenas; 9) a reparao do

DNA; 10) a formao de espcies reactivas de oxignio e 11) nalguns casos a

termognese (Pedersen, 1999). A funo mais importante das mitocndrias

consiste na degradao de substratos energticos (cidos gordos, piruvato,

aminocidos), provenientes do citoplasma. Obtendo-se como produtos finais,

CO2, H2O e a sntese de ATP. As reaces do ciclo do cido ctrico levam

oxidao dos compostos de carbono, com formao de CO2 e tambm

fornecem equivalentes redutores, temporariamente ligados a coenzimas. A

maioria destes processos ocorrem a nvel da matriz mitocondrial na cadeia

respiratria que se encontra na membrana mitocondrial interna que se d a

reoxidao das coenzimas reduzidas. A cadeia respiratria utiliza compostos

redutores (NADH e ubiquinol), dadores de electres, para reduzir o O2 a H20. A

esta reaco est associado o transporte de protes (H+) da matriz mitocondrial

para o espao intermembranar, processo que origina a formao do gradiente

electroqumico de H+ atravs da membrana mitocondrial interna, o qual

aproveitado pela mitocndria para sintetizar ATP a partir de ADP e Pi, via

sintase do ATP.

3.2 - O sistema de transporte de electres e a fosforilao oxidativa

Nas clulas animais o processo de fosforilao oxidativa requer

numerosas protenas, verificando-se que mais de 60 protenas esto

associadas ao sistema de transporte de electres, 16 com o complexo da

sintase de ATP e 2 protenas constituem os transportadores do ADP/ATP e do

H+/Pi. A cadeia respiratria mitocondrial constituda por quatro complexos

enzimticos transmembranares o complexo I (NADH-desidrogenase), complexo

II (succinato desidrogenase), complexo III (citocromo redutase) e o complexo IV

(citocromo oxidase). Os dinucletidos de nicotinamida adenina (NADH) e o

succinato conduzem os electres para os complexos I e II da cadeia

respiratria, respectivamente, resultando na libertao de protes para o

interior da matriz e na transferncia de electres para o transportador mais

prximo na cadeia respiratria, a Coenzima Q (CoQ), que transfere os

- 34 -

electres entre estes dois complexos e o complexo III. Posteriormente, os

electres so transferidos para o citocromo c e finalmente para o complexo IV

onde ocorre mais entrada de protes. no complexo IV que o O2, fornecido na

respirao pelo sistema circulatrio, funciona como receptor de electres e se

liga aos protes existentes na matriz levando formao de H2O (Fig 9).

Assim, o transporte de electres atravs dos complexos respiratrios tem como

finalidade a transferncia de energia dos substratos energticos existentes na

matriz mitocondrial para uma forma de energia (gradiente electroqumico de H+)

que poder ser utilizada para fosforilar o ADP. As mitocndrias produzem ATP

atravs da associao entre o gradiente de protes, gerado pela respirao, e

a fosforilao oxidativa do ADP pelo complexo V (FoF1ATPase ou ATPsintase).

O complexo V constitudo por duas subunidades: a subunidade FO,

correspondente a um segmento hidrofbico que atravessa a membrana

mitocondrial interna e que funciona como canal a protes do complexo, e a

subunidade F1 que corresponde cabea esfrica do complexo virada para o

lado da matriz e possui uma funo cataltica na sntese de ATP (Fig. 9).

Situada entre estas duas subunidades existe uma protena que confere

sensibilidade oligomicina (OSCP oligomycin sensibility conferring proten),

fazendo com que a ATP sintetase seja inibida por este composto Pelo facto de

a membrana mitocondrial interna ser impermevel a protes, ocorre a sua

acumulao no espao intermembranar gerando a formao do gradiente

electroqumico de H+. Quando o ADP e o Pi, componentes necessrios

sntese de ATP, esto disponveis na matriz mitocondrial, eles ligam-se

fraco cataltica do complexo V, permitindo a abertura da fraco FO e a

consequente entrada de protes para o interior da matriz. A energia libertada

no influxo de protes atravs da fraco FO usada na fosforilao do ADP

para sintetizar ATP pela fraco F1.

- 35 -

Figura 9 Representao esquemtica do sistema de transporte de electres

(complexos I, II, III, IV) e do sistema fosforilativo (complexo V), com os respectivos

substractos e inibidores. (Monteiro P et al 2003).

A associao entre a oxidao de substratos pela cadeia respiratria e a

fosforilao designa-se por teoria quimiosmtica e foi proposta por Peter

Mitchell em 1961. Na cadeia respiratria, o fluxo de electres gera energia

redox suficientemente elevada para ser utilizada para ejectar protes do

compartimento mitocondrial interno, para o espao intermembranar. O

gradiente electroqumico de protes assim gerado, tambm designado por

fora protomotriz (p), constitui a fora motriz capaz de fazer o retorno dos

protes atravs do complexo ATPsintase. Este gradiente composto de um

componente elctrico, o potencial transmembranar () e de um gradiente

(pH). Como resultado, as mitocndrias so

de cerca de

180 mV (negativo no interior) e cujo meio interno mantm um valor de pH de

cerca de 8. Em consequncia disto, as mitocndrias conseguem no s

acumular compostos de carcter catinico, que sejam capazes de atravessar

as membranas, como tambm internalizar cidos fracos na sua forma aninica.

(Szewczyk e Wojtczak, 2002).

- 36 -

3.3 - Envolvimento da mitocndria nos mecanismos de morte celular

Existem diferentes estudos que demonstram que a mitocndria controla a

vida e a morte celular. A permeabilizao da membrana mitocondrial precede o

processo de morte celular por apoptose ou necrose, que dependente do tipo

de clula ou do estmulo indutor do tipo de morte da clula, e esta

permeabilizao constitui um dos principais factores indicador de morte celular.

De facto, existe um nmero elevado de factores pr-apoptticos que actuam a

nvel da membrana mitocondrial induzindo a permeabilizao da membrana e

que, por sua vez, activam os compostos anti-apoptticos da famlia Bcl-2 a

interagir com protenas da membrana mitocondrial evitando a sua

permeabilizao. Outro facto que refora o envolvimento da mitocndria na

morte celular a existncia de intervenes farmacolgicas especficas, isto ,

atravs de compostos que actuam a nvel das protenas mitocondriais que

evitam ou retardam a morte celular. (Loeffler e Kroemer, 2000)

A necrose ou morte acidental pode ser desencadeada por um profundo

dano celular ou por stresse. Ocorre ento, um rpido colapso da homeostase

interna sendo acompanhada de lise da membrana citoplasmtica e das

membranas internas com libertao de restos celulares para o espao

extracelular, promovendo um processo inflamatrio. caracterizada

morfologicamente pela formao de protuberncias na membrana plasmtica

seguida pela eventual ruptura de algumas delas e a consequente libertao de

componentes citoslicos (Monteiro P et al 2003).

A apoptose um tipo de morte celular programada e trata-se de um

processo fisiolgico essencial, necessrio ao desenvolvimento normal e

manuteno da homeostase dos tecidos (Fumarola C et al 2004 ). No entanto,

a apoptose est tambm envolvida em diversos processos patolgicos dos

quais se destacam as doenas neurodegenerativas, doenas imunolgicas e

processos cancergenos. Assim, aps um sinal apopttico as clulas sofrem

uma srie de alteraes que culminam na sua morte, sem que ocorra a

libertao dos seus contedos celulares (Monteiro P et al 2003). Este tipo de

morte celular funcionar como uma espcie de triagem da populao celular

eliminando as clulas danificadas, mutadas, envelhecidas ou potencialmente

perigosas, tendo tambm um papel importante na regulao de programas de

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fumarola%20C%22%5BAuthor%5D

- 37 -

crescimento e diferenciao celular e tecidular. A apoptose caracterizada por

uma diminuio do volume da clula acompanhada da formao de

protuberncias na membrana plasmtica, estas acabam por se desprender da

membrana originando fragmentos membranares que so fagocitados pelas

clulas vizinhas.

Outra das grandes diferenas entre a necrose e a apoptose reside a nvel

da bioenergtica. Verificando-se que em clulas necrticas os nveis de ATP

baixam drasticamente e esta perda das reservas energticas ser a principal

causa deste tipo de morte celular (Malhi H et al 2006). Contrariamente, as

clulas em apoptose mantm, parcialmente, as suas reservas de ATP,

necessrias para o controlo dos mecanismos de apoptose, sendo um processo

totalmente dependente de energia. Deste modo, a mitocndria um elemento

fundamental nos processos de morte celular por apoptose e/ou necrose e

poder determinar o tipo de morte celular.

3.3.1 - Importncia da mitocndria nos processos apoptticos

Estudos realizados com vrios sistemas mitocondriais demonstram um

papel importante da mitocndria nos mecanismos de induo da apoptose

(Lemasters et al., 1999). Actualmente, aceite que em muitas clulas

apoptticas a libertao de protenas do espao intermembranar constitui um

dos primeiros eventos da apoptose. A mitocndria perante um estmulo

apopttico (danos no DNA, isqumia, radiaes ultravioletas e mecanismos

vrios de stress oxidativo) desviada do seu papel original, que o da

manuteno da vida celular, para um papel oposto, o de facilitar a morte celular

(Fig 9). Existem vrios factores responsveis por esta alterao,

nomeadamente, o clcio, a ceramida, o xido ntrico, as caspases (protenas

cistenicas que actuam em resduos de aspartato), as ROS e membros da

famlia Bcl-2). O efeito final de muitos destes factores a libertao de duas

protenas do espao intermembranar, o citocromo c e o factor indutor de

apoptose (AIF). Estas duas protenas participam em eventos ps-mitocondriais

necessrios para completar o programa de morte celular. A forma como estes

factores foram a mitocndria a participar no programa de morte celular ainda

- 38 -

no inteiramente claro, contudo a hiptese mais provvel envolve a PTM.

Numerosos dados experimentais sugerem que vrios dos factores que induzem

a PTM so membros da famlia das protenas Bcl-2. A protena Bcl-2 um

oncogene que tem um efeito inibitrio da PTM, enquanto outro membro da

famlia, a Bax, pode formar complexos com a Bcl-2 anulando desta forma o

efeito inibitrio exercido por Bcl-2 na PTM e, quando atinge determinadas

concentraes, estimula a MPT (Danial et al 2004). A PTM seguida da perda

do (pelo menos temporariamente), intumescimento da mitocndria e,

finalmente, ruptura da membrana mitocondrial externa com libertao do

citocromo c e do AIF.

O citocromo c a protena cuja libertao parece ser mais crtica para a

iniciao dos processos de apoptose (Desagher S et al 2000). No entanto, o

mecanismo pelo qual ocorre a sua libertao da mitocndria no se encontra

ainda perfeitamente esclarecido, podendo ocorrer de um modo controlado

atravs de poros na membrana externa ou por ruptura fsica desta membrana.

O citocromo c na presena de ATP ou dATP, forma um complexo com o apaf-1

e a procaspase 9. A formao deste complexo designado por apoptossoma

cliva a procaspase 9 com libertao da caspase 9 activa que cliva e activa a

procaspase 3. Por sua vez, a caspase 3 activa induz a clivagem proteoltica de

uma srie de protenas alvo no citosol, ncleo e membrana plasmtica

responsveis pela morfologia caracerstica da apoptose (Parone et al 2002).

Vrios estudos tm demonstrado que a mitocndria est tambm envolvida na

induo da apoptose por mecanismos independentes das caspases. Durante

este processo, ocorre libertao de protenas designadas por factor indutor da

apoptose (AIF) e endonuclease G do espao intermembranar mitocondrial para

o citossol, desencadeando este tipo de morte celular sem activar a cascata

apopttica. Durante a apoptose, o AIF desloca-se da membrana mitocondrial

externa para o citossol e, posteriormente, para o ncleo onde induz

condensao da cromatina e fragmentao do DNA (Daugas et al., 2000).

- 39 -

Figura.10 Relao entre a mitocndria e a morte celular, evidenciando a importncia

da quantidade de ATP nos processos apoptticos e necrticos. Na morte celular por

necrose, ocorre depleo de ATP e h ruptura da membrana plasmtica. A outra via

de morte celular por apoptose, sendo os nveis de ATP da clula mantidos

parcialmente. A apoptose caracterizada por uma diminuio do volume da clula

acompanhada da formao de protuberncias da membrana plasmtica (Monteiro P et

al 2003)

Adicionalmente, o AIF induz a exposio da fosfatidilserina na monocamada

externa (geralmente localizada na monocamada interna), facto que possibilita o

reconhecimento e posterior remoo das clulas apoptticas por clulas

vizinhas. De modo idntico, a endonuclease G, cuja funo est implicada na

replicao do DNA mitocondrial, induz a fragmentao do DNA nuclear aps

ser libertado do espao intermembranar durante a apoptose.

- 40 -

No decurso morte celular por necrose, as clulas, as mitocndrias e

outros organitos aumentam de volume, como consequncia da perda da

integridade fsica das membranas plasmtica e mitocondrial, no sendo, no

entanto, observadas quaisquer modificaes nucleares no decorrer deste

processo. (Desagher e Martinou, 2000). A mitocndria responsvel pela

maior parte (cerca de 80-90%) da sntese de ATP atravs da fosforilao

oxidativa, que usa a energia resultante da respirao mitocondrial. Assim,

factores que alterem a associao do sistema fosforilativo com o sistema de

transporte de electres constituem mecanismos responsveis pela diminuio

da eficincia fosforilativa das mitocndrias e, consequentemente, por um

abaixamento dos nveis de ATP necessrios viabilidade celular. As alteraes

estruturais induzem um aumento da permeabilidade mitocondrial a solutos de

baixa massa molecular. Este processo conhecido por PTM acompanhado por

um intumescimento da mitocondrial e a mitocndria perde a sua capacidade

para manter estveis o e o gradiente de protes (isto ocorre uma

dissociao total ou parcial da fosforilao oxidativa). Ao ocorrer uma

permeabilizao membranar passiva constante, ocorre a hidrlise contnua do

ATP pela ATPsintase, promovendo o esgotamento das reservas energticas

celulares e conduzindo morte celular por necrose (Fig 10). Adicionalmente,

h perturbao contnua dos equilbrios inicos, especialmente do Ca2+, que

exacerbar os danos devido activao de enzimas degradativas como as

fosfolipases, proteases e nucleases. A activao da PTM facilitada na

presena de oxidantes e espcies reactivas de oxignio (ROS) e azoto (RNS)

(Zoratti et al 2005). Por sua vez, a acumulao de ROS e RNS facilita a

induo da PTM (Pedersen, 1999).

3.4 - Aco da mitocndria na homeostase do Ca2+ celular

A mitocndria desempenha uma aco vital na regulao do Ca2+

citoslico, possuindo vrias protenas envolvidas na acumulao e libertao

de Ca2+ pelo que, a mitocndria actua como um reservatrio de Ca2+.

Adicionalmente, a mitocndria fornece a maior parte do ATP usado pelas Ca2+-

ATPases do retculo endoplasmtico e da membrana plasmtica. (Saris e

Carafoli 2005). Por outro lado, a adio de Ca2+ a uma suspenso de

- 41 -

mitocndrias energizadas resulta na estimulao da cadeia respiratria, efluxo

de protes da matriz e influxo de Ca2+ para dentro da mitocndria. As

mitocndrias so capazes de acumular clcio para a matriz atravs do

gradiente electroqumico sem que ocorra hidrlise do ATP ou ocorra

cotransporte com qualquer outro io ou seja o influxo de Ca2+ um processo

puramente electrognico movido pela componente elctrica, o da fora

protomotriz (H+) A protena responsvel pela acumulao de clcio o

uniporter de clcio, no entanto, em mitocndrias isoladas a sua constante de

afinidade baixa, o que sugere que este no ser o mecanismo de influxo de

Ca2+ quando as mitocndrias so expostas a rpidos e intensos pulsos de

clcio intracelular. Uma via alternativa de influxo de Ca2+ o designado por

RAM (do ingls rapid mode uptake), atravs do qual ocorrer a rpida captao

de Ca2+. Apesar de a captao de Ca2+ pelas mitocndrias ser apontada

essencialmente como um dispositivo de segurana em situaes de

sobrecarga intracelular transitria de Ca2+ os fluxos mitocondriais de Ca2+

fazem parte da sinalizao celular do Ca2+ (Orrenius et al., 2003). Uma vez

dentro da mitocndria, o Ca2+ tm vrios efeitos nomeadamente, a estimulao

de desidrogenases na matriz mitocondrial sensveis ao Ca2+, que por sua vez

so locais de produo de NADH para a cadeia respiratria e como tal para a

estimulao do metabolismo energtico mitocondrial (Orrenius et al., 2003).

Todavia, as mitocndrias no conseguem captar quantidades ilimitadas

de Ca2+ tendo por isso de o libertar a uma velocidade comparvel do influxo.

O efluxo de Ca2+ da mitocndria para o citosol pode ocorrer atravs de

diferentes mecanismos. Assim, pode ocorrer atravs de um mecanismo de

antiporte com Na+ ou H+, isto , de um transporte dependente de Na+ ou de

outro independente de Na+, que troca Ca2+ por Na+ ou por H+, respectivamente

por reverso do uniporta de influxo de Ca2+, por alteraes na fase lipdica da

membrana, atravs de vias de libertao mediadas por canais ou pela

combinao de dois ou mais destes mecanismos. Adicionalmente, a libertao

de Ca2+ da mitocndria pode tambm ocorrer por oxidao de nucletidos de

nicotinamida adenina da matriz a ADP-ribose nicotinamida ou por oxidao de

grupos -SH de protenas membranares que se encontram associados com a

regulao da dinmica de Ca2+ da mitocndria. Outro mecanismo independente

de sdio e fundamental no efluxo de Ca2+, a formao de um poro de

- 42 -

permeabilidade transitria o (PMPT), em cujo estado de baixa condutncia

responsvel pela descarga de Ca2+ para valores de concentrao abaixo dos

limites (Bernardi P et al 1998) no entanto em estados mais avanados d

origem a um megacanal designada de MPT que constitui igualmente um

mecanismo importante para a libertao de clcio da mitocndria como se

descrever mais adiante.

Em concluso, apesar de a mitocndria poder no ter um papel

determinante na homeostase de clcio celular em condies de repouso, ela

determinante na forma e na durao de um pico concentracional de clcio aps

estimulao celular. Adicionalmente o posicionamento da mitocndria junto do

retculo endoplasmtico pode ser condicionante da sua capacidade

tamponizante. Alm do mais a acumulao elevada de Ca2+ deletria para a

funo mitocondrial e celular tendo sido proposto que o Ca2+ citoslico

desempenha um papel importante na estimulao de sinais apoptticos,

atravs da regulao de enzimas especficas que, uma vez activadas,

conduzem morte celular, como por exemplo as endonucleases.

Paralelamente, a excitao-contraco no msculo esqueltico e cardaco

dependem dos nveis de Ca2+ citoslico.

O potencial de membrana () gerado atravs da ejeco de protes pelos

complexos enzimticos do sistema de transporte de electres. O constitui a

fora motriz para a fosforilao do ADP pela F1Fo ATPase. Adicionalmente a

captao de Ca2+ atravs do uniporta de Ca2+ dependente do , e a

dissipao deste potencial anula a captao de Ca2+ mitocondrial. A

composio molecular exacta do uniporta no conhecida e pensa-se que

pode existir uma configurao alternativa para o poro e que ser o responsvel

pela rpida captao de Ca2+ (RAM) atravs da qual a mitocndria pode

rapidamente acumular quantidades limitadas de Ca2+ O efluxo de Ca2+ ocorre

atravs do antiporta Ca2+/Na+ que troca 2 ies de Na+ por cada Ca2+. Em algum

tipo de clulas podem tambm existir um transportador de Ca2+ e de H+. A PTM

um mega canal e constitudo por vrias protenas mitocondriais que podem

ser induzidas pela acumulao de Ca2+, pelo stress oxidativo. Uma vez

induzido o poro de PTM permite a passagem de todas as molculas superiores

a 1500Da. Contudo, ocorrem aberturas rpidas e reversveis da PTM e estas

podem ter um papel primordial no controlo do Ca2+ mitocondrial. O influxo de

- 43 -

Ca2+ associado sua libertao mediada pelos sistemas de troca constitui um

ciclo de Ca2+ dissipador de energia mitocondrial. (Jacobson et al 2004).

3.5 - Permeabilidade transitria mitocondrial

A PTM consiste na abertura de uma via de permeabilidade inicialmente

reversvel e que permite a difuso de solutos at 1500Da da matriz mitocondrial

para o espao extramitocondrial e vice-versa. Trata-se de um processo

complexo do qual j se conhecem vrios indutores moduladores e inibidores,

alguns dos quais sero mencionados de seguida. A PTM causada pela

formao e abertura de poros proteicos na membrana interna mitocondrial os

designados poros transitrios de permeabilidade mitocondrial. Apesar de ainda

ser um assunto muito discutido na literatura, existe algum consenso sobre o

que poder iniciar a condio de permeabilidade transitria mitocondrial.

sabido que a entrada macia de clcio para o interior da mitocndria, associada

a um incremento da gerao de espcies reactivas de oxignio no interior

daquele organelo pode levar formao dos PTM, rompendo a barreira de

impermeabilidade caracterstica e necessria da membrana interna

mitocondrial (Zoratti M et al., 2005). Algum consenso existe tambm sobre as

possveis consequncias para a mitocndria uma vez que a abertura de poros

de PTM provoca a despolarizao mitocondrial, dissociao da fosforilao

oxidativa, libertao de solutos intramitocondriais perdendo este organelo a

capacidade de produo de energia e a capacidade de tomada de clcio. A

PTM est tambm associada induo de um aumento de volume

mitocondrial, causando um rompimento da membrana externa e podendo

mesmo levar libertao de factores indutores da apoptose, como o citocromo

c, ou, em ltima anlise, a necrose da clula. Os poros de PTM so complexos

multiproteicos que se formam nas zonas de unio entre a membrana externa e

interna da mitocndria, apesar da identidade molecular deste complexo

multiproteico no se encontrar ainda completamente definida, alguns dos seus

componentes centrais foram j identificados (Fig 11) e incluem protenas

citoplasmticas como a hexocinase (HK) e a creatina cinase (CK) que se

encontra localizada no espao intermembranar, protenas da membrana

externa o canal aninico dependente de voltagem (VDAC) e o receptor das

- 44 -

benzodiazepinas (BPR), protenas da membrana interna o transportador dos

nucletidos da adenina (ANT) e protenas da matriz mitocondrial a ciclofilina D.

Figura 11 - Representao esquemtica dos complexos respiratrios; FoF1Sintetase;

e dos componentes do poro de permeablidade transitria na membrana mitocondrial

interna (MMI) e membrana mitocondrial externa (MME).

Em condies fisiolgicas o poro permanece fechado at que o Ca2+

aumente substancialmente. A PTM especificamente inibida por ciclosporina A

(CyA) que se liga CphD impedindo a sua ligao s restantes protenas

constituintes do poro e, como tal, a sua formao. A CphD uma peptidilprolilo

cis-trans isomerase da matriz mitocondrial que em situaes de sobrecarga de

Ca2+ e de stresse oxidativo, se liga s protenas constituintes do poro induzindo

a sua activao e abertura conferindo-lhe sensibilidade inibio pela CyA. A

induo da PTM modulada por diferentes factores, sendo favorecida em

condies de elevada acumulao de Ca2+ na mitocndria, por aumento do

quociente NAD+/NADH, por prooxidantes, por pH elevado, por peroxidao

lipdica e pelo o stresse oxidativo devido s ROS e/ou depleo mitocondrial

de GSH ( Colell et al 2004). A PTM induzida por Ca2+ pode ser estimulada por

uma grande variedade de compostos com diferentes caractersticas qumicas,

incluindo o Pi, agentes oxidantes, reagentes ditilicos, protonforos e ligandos

do ANT, quando acompanhada por concentraes matriciais elevadas de Ca2+

e stresse oxidativo. Nestas condies, ocorre oxidao de grupos -SH de

protenas membranares mitocondriais, NAD(P)H, GSH matricial e depleo de

nucletidos de adenina (Halestrap et al., 2002). Ichas e Mazat em 1998,

propuseram que existe uma alternncia entre um estado de baixa condutncia

MME

MMI

PBR

ANT

VDAC

HK

CK

CycD

Complexos Respiratrios

FoF1 ATP

Sintase

MATRIZ

CITOSOL

Espao intermembranar

PTM

- 45 -

do poro de PTM que resulta de aberturas transitrias do poro e um estado de

alta condutncia que resulta de aberturas de longa durao e que conduzem

ao estado completamente aberto do poro. A alternncia entre os dois estados

controlada pela ligao do Ca2+ ao poro conduzindo ao intumescimento e

consequente disfuno mitocondrial, o que ocorre perante situaes de

sobrecarga de Ca2+. Adicionalmente, muitas so as evidncias que sugerem a

existncia de dois modos de abertura do poro de MPT: um modo regulado e

outro desregulado (Lemasters, 2002). As aberturas transitrias do poro de MPT

resultam na dissipao temporria do gradiente de protes e na despolarizao

mitocondrial (Bernardi P e tal 1998) e so dependentes do pH e permitem a

difuso de pequenas molculas como o Ca2+ e H+. O estado de alta

condutncia, que permite a difuso no selectiva de grandes molculas, tem

aberturas estveis, conduzindo dissipao do e ruptura da estrutura

mitocondrial. A importncia fisiolgica da PTM continua por esclarecer, todavia,

em condies patolgicas, um ou vrios dos factores reguladores da PTM

podem contribuir para alterar a susceptibilidade sua induo. Assim, a PTM

constitui um elemento chave no controlo da viabilidade da clula

independentemente do fentipo da morte celular verificando-se que agentes

que previnem ou induzem a PTM regulam a vida ou morte da clula (Zoratti M

et al., 2005).

- 46 -

III - OBJECTIVOS

- 47 -

III - OBJECTIVOS

Os produtos derivados de plantas tm ganho algum relevo e,

recentemente, foi evidenciada a aco anti-Leishmania de leos essenciais e

de alguns dos seus constituintes.

Dado o papel central da mitocndria nas funes celulares e a sua

relevncia num vasto nmero de doenas, estes organelos tm sido

considerados como um dos principais alvos teraputicos. A mitocndria tem

uma importncia fundamental nos processos de sobrevivncia e morte celular,

dado que essencial para a produo de ATP, atravs do processo de

fosforilao oxidativa, sendo tambm o principal organelo responsvel pela

formao intracelular de espcies reactivas de oxignio. Alm disso, a

mitocndria tambm muito importante no controlo das vias de sinalizao que

conduzem morte celular por apoptose e necrose. Assim, as alteraes na

estrutura e funes mitocondriais podem funcionar como alvos primrios na

avaliao da toxicidade e morte celular induzidas pelos compostos em

avaliao.

Assim, o objectivo deste trabalho foi estudar a actividade anti-Leishmania

do p-cimeno, um constituinte de leos essenciais, e do seu derivado sinttico 2-

nitro-p-cimeno, para esclarecer possveis mecanismos de aco e toxicidade

usando a mitocndria como modelo celular.

Assim com este objectivo geral foram realizados estudos com os

seguintes objectivos especficos:

Avaliar os efeitos do p-cimeno, constituinte dos leos essenciais, e do

seu derivado sinttico, 2-nitro-p-cimeno na viabilidade celular de promastigotas

de L. infantum;

Avaliar os efeitos do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno na morfologia e

mobilidade dos promastigotas de L. infantum;

Avaliar os efeitos do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno na bioenergtica e

permeabilidade transitria mitocondrial.

Avaliar a relao funo/estrutura qumica do p-cimeno e do 2-nitro-p-

cimeno.

- 48 -

IV - MATERIAIS E MTODOS

- 49 -

IV - MATERIAIS E MTODOS

1 - Susceptibilidade de Leishmania infantum ao 2-nitro-p-cimeno e p-

cimeno

1.1 - Origem das estirpes e manuteno das culturas

As culturas de promastigotas de Leishmania infantum Nicolle (zimodemo

MON-1) foram mantidas em ambiente estril, a 26C em meio de cultura

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 tamponado com cido 4-(2-

hidroxietil) piperazina-1-etanosulfnico (HEPES) suplementado com 10% de

SFB inactivado a 56C e penicilina G (250 g/ml) e sulfato de estreptomicina

(250 g/ml).

1.2 - Determinao do crescimento

Com o objectivo de definir os tempos de incubao para a realizao dos

estudos de actividade anti-Leishmania, foi feito o estudo do crescimento

populacional das promastigotas de L. infantum.

Em microrganismos unicelulares o crescimento populacional envolve um

aumento do nmero de clulas ou biomassa como consequncia do

crescimento e da diviso celular. Os estudos de crescimento so

representativos das condies de todas as clulas de uma populao e no de

variaes individuais. O crescimento populacional , portanto, avaliado

seguindo a variao do nmero de clulas ao longo do tempo como

consequncia do crescimento ou da diviso celular. No presente trabalho, o

crescimento de L. infantum foi avaliado por contagem de clulas totais em

cmara de Neubaeur (Fig. 12), ao longo do tempo de incubao.

As promastigotes de L. infantum (106 clulas/ml) foram incubadas a 26C,

em meio de cultura RPMI 1640 tamponado com HEPES suplementado com

10% de SFB inactivado a 56C e penicilina G (250 g/ml) e sulfato de

estreptomicina (250 g/ml). Em intervalos de 24 horas retiram-se da estufa

duplicados e alquotas de cada tubo foram fixadas com uma soluo de

formaldedo 10% em PBS. A contagem do nmero de clulas totais foi

- 50 -

realizada em cmara de Neubauer ao microscpio ptico. A partir da curva de

crescimento foi calculada a taxa de crescimento e o tempo de gerao ou

duplicao.

Figura 12 - Cmara de Neubauer para contagem de clulas.

1.3 - Estudos de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada pelo teste do 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazlio (MTT) (Denizot et al, 1986). O catio do MTT um sal

hidrossolvel de cor amarela que as desidrogenases mitocondriais reduzem a

uma formazana insolvel de cor azul que absorve a 530 nm. O ensaio baseia-

se no facto de que s as clulas viveis reduzem o MTT, podendo quantificar a

extenso dessa reduo por espectofotometria a 530 nm (Fig.13)..

Fig.13 - Reduo do brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio

(MTT) pelas desidrogenases mitocondriais.

- 51 -

O 2-nitro-p-cimeno, p-cimeno foram diludos em dimetilsulfxido (DMSO)

a 100 mg/ml e, posteriormente, em meio de cultura RPMI 1640 tamponado com

HEPES suplementado com 10% de SFB inactivado a 56C de modo a obter

uma gama de concentraes de 25 a 400 g/ml. A concentrao mxima de

DMSO nos ensaios no excedeu os 0,4%, concentrao que no interfere de

forma significativa no crescimento celular.

As promastigotes de L. infantum (106/ml) em fase de crescimento

logartmica foram incubadas em tubos de 1,5ml a 26C durante 24h, em meio

de cultura RPMI 1640 tamponado com HEPES suplementado com 10% de SFB

inactivado a 56C, na presena de vrias concentraes p-cimeno e 2-nitro-p-

cimeno. Em paralelo e nas mesmas condies, foram realizados ensaios de

controlo na presena do solvente (DMSO), mas sem a adio dos compostos.

Aps as 24 horas, os tubos foram centrifugados a uma velocidade de

2500 rpm/5 minutos, de modo a permitir a sedimentao das promastigotes. De

seguida, o sobrenadante foi aspirado, as clulas foram lavadas com tampo

PBS (pH 7,2) e incubadas a 37C durante duas horas com 450 l de PBS e 50

l de uma soluo de MTT (5 mg/ml). Depois da incubao, as clulas foram

novamente sedimentadas, o meio foi eliminado por aspirao e os cristais

redissolvidos em 500 l de DMSO. De cada amostra foram retirados 300 l

para uma placa de leitura tipo ELISA e a absorvncia das amostras foi lida a

530 nm num leitor de placas (Synergy HT, Bio-TEK). Os resultados obtidos

foram expressos em percentagem de absorvncia relativamente ao controlo.

As experincias foram sempre realizadas em triplicado, tendo-se

determinado a mdia e erro padro dos resultados obtidos.

As concentraes que induzem a perda de viabilidade a 50% (IC50) foram

obtidas por interpolao de regresses dose-resposta extrapoladas pelo

GraphPad Prism 5.

- 52 -

1.4 - Estudos morfolgicos

Os efeitos do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno na morfologia das

promastigotes de L. infantum foram estudados em preparaes a fresco por

microscopia ptica de contraste de fases (Eclipse E400, Nikon) acoplado com

cmara digital (165 DN100, Nikon) e por microscopia ptica de fase normal,

aps colorao de Giemsa.

Os estudos a fresco permitiram avaliar a forma, o tamanho e a mobilidade

celular utilizando a tcnica da gota pendente, na qual, as clulas no fixadas

ficam suspensas numa lmina escavada (lmina de Koch) (Fig 14).

Figura.14 Esquema de uma preparao em gota pendente usando a lmina

de Koch.

A observao dos esfregaos corados permitiram estudar as alteraes

na morfologia e nas estruturas das promastigotas de L. infantum.

Para os estudos morfolgicos, as promastigotas em fase logartmica

foram incubadas durante 24h, em meio de cultura RPMI 1640 tamponado com

HEPES suplementado com 10% de SFB inactivado, adicionadas de solues

do p-cimeno e do 2-nitro-p-cimeno nas concentraes correspondentes ao IC50.

Tal como nos estudos de viabilidade, os controlos foram realizados ao mesmo

tempo e nas mesmas condies, substituindo as solues dos compostos por

DMSO, na concentrao correspondente presente nas solues dos

compostos. Aps o perodo de incubao, as clulas foram sedimentadas, o

meio rejeitado e substitudo por meio de cultura fresco. Retirou-se uma alquota

- 53 -

para observao microscpica directa em lmina de Koch e outra alquota foi

usada para execuo de um esfregao e posterior colorao por Giemsa. Aps

a execuo do esfregao, as clulas foram fixadas em metanol puro e coradas

com uma soluo aquosa de Giemsa (1/10, V/V) durante 10 minutos, em

seguida as lminas foram lavadas e deixadas a secar ao ar.

2 - Avaliao dos efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

bioenergtica mitocondrial

2.1 - Isolamento de mitocndrias de fgado de rato

As fraces mitocondriais foram isoladas a partir de fgado de ratos

Wistar, de acordo com o mtodo descrito por Gazotti e colaboradores (1979)

com algumas modificaes. Os animais, mantidos em jejum, foram sujeitos a

deslocamento cervical e posteriormente decapitados de forma a sangrarem

rapidamente. O abdmen dos animais foi aberto com recurso a uma tesoura e

o fgado foi rapidamente removido e colocado em meio de homegeneizao

contendo 250 mM de sacarose, 10 mM de Hepes, 1 mM de EGTA, pH 7,4 e

albumina srica bovina (BSA) deslipidificada (0,1%) (Fernandes et al., 2008).

Com o auxlio de uma tesoura, o fgado foi rapidamente triturado e o

sobrenadante rejeitado de forma a remover o sangue. Em seguida o tecido foi

ressuspenso em cerca de 60 ml de meio de homogeneizao e transferido para

um homogeneizador de vidro tipo Potter-Elvejhen. Com o recurso a um pisto

de teflon ligado a um berbequim, a suspenso foi homogeneizada por 6 cursos

do pisto a 250 rpm. A suspenso foi transferida para dois tubos de centrfuga

equilibrados que foram centrifugados a 4C durante 10 minutos a uma

velocidade de 2500 rpm. O sobrenadante foi ento transferido para novos

tubos e centrifugado a 10000 rpm durante 10 minutos a 4C, obtendo-se assim,

um sedimento composto pela fraco mitocondrial. O sobrenadante foi

eliminado por aspirao e o sedimento ressuspenso em 1 ml de meio de

lavagem constitudo por 250 mM sacarose, e 10 mM de Hepes com pH de 7,2

(Fernandes et al., 2008). A suspenso mitocondrial foi transferida para novos

tubos de centrfuga e diluda em 45 ml de meio de lavagem seguida de duas

- 54 -

centrifugaes sequenciais de 10000 rpm durante 10 minutos a 4C. A fraco

mitocondrial purificada foi ressuspensa em 2 ml de meio de lavagem e mantida

num eppendorff a 4C ao longo dos ensaios experimentais.

2.2 - Determinao da concentrao de protena

A concentrao de protena da fraco mitocondrial foi determinada pelo

mtodo colorimtrico do biureto (Gornall et al., 1949). A reaco do biureto

permite a determinao quantitativa de protenas por formao de um quelato

de cobre com ligaes peptdicas da protena a pH alcalino apresentando uma

colorao violeta e absorvncia a 550 nm. A reduo do Cu(II) a Cu(I)

acompanhada por uma mudana de cor, consoante o contedo proteico da

amostra. A concentrao de protena foi ento quantificada atravs de uma

curva de calibrao construda a partir de padres de BSA. Assim, cerca de 50

l da suspenso mitocondrial foram colocados num tubo de ensaio contendo

0,95 ml de uma soluo de NaCl e 25 l de SDS a 20%. Em simultneo foram

tambm preparados os padres de BSA com um volume final de 2 ml acertado

com NaCl e SDS a 20%. Aps a preparao de todos os tubos foram

adicionados a cada um deles 1,5 ml de reagente de biureto, estes foram

incubados a 37C durante 20 minutos e a absorvncia lida a 550 nm.

2.3 - Determinao do consumo de oxignio

O consumo de oxignio mitocondrial associado fosforilao de ADP foi

avaliado temperatura de 30C, recorrendo a um elctrodo de oxignio tipo

Clark (YSI Model 5331, Yellow Spring Instruments) ligado a um registador e o

elctrodo foi calibrado de acordo com Rickwood e colaboradores (1987). Os

ensaios foram realizados numa cmara de reaco e a suspenso

mitocondrial, composta por 1 mg de protena diluda em 1 ml de meio de

respirao contendo 130 mM de sacarose, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2,

0,1 mM de EGTA, 5 mM de KH2PO4 e 10 mM de Hepes com pH 7,4, foi

mantida sob agitao ao longo dos ensaios.

- 55 -

Os ensaios foram iniciados com a adio de 5 mM glutamato/ 2,5 malato,

substrato respiratrio que induz um pequeno aumento no consumo do oxignio

pelas mitocndrias (estado 2 da respirao), aps cerca de 1 minuto foram

adicionadas 150 nmoles de ADP suspenso, o que originou, nas situaes

controlo, um aumento acentuado no consumo de oxignio (estado 3 da

respirao). Aps o consumo de todo o ADP adicionado, o consumo de

oxignio pelas mitocndrias retornou para valores prximos do inicial (estado 4

da respirao). Em seguida foram adicionados mais 150 nmol de ADP

imediatamente seguida da adio de oligomicina 1 M (estado 4 oligomicina)

que bloqueia a fraco F0 da ATP sintase e nos permitiu avaliar a fuga de

electres atravs desta. Para finalizar os ensaios, adicionou-se FCCP (ionforo

de protes) 1 M suspenso (estado 4 FCCP). Na presena deste

dissociador da fosforilao oxidativa, a permeabilidade da membrana

mitocondrial aos protes mxima e, consequentemente, os consumos de

oxignio so fortemente estimulados, pelo que, variaes na velocidade de

consumo de oxignio registadas aps a adio do FCCP so indicadoras de

que poder existir perturbaes no sistema de transporte de electres.

Para avaliao dos efeitos dos compostos no consumo de oxignio, as

suspenses mitocondriais foram previamente incubadas com as diferentes

concentraes dos vrios compostos durante 3 minutos antes do incio da

energizao com o substrato respiratrio.

A velocidade do consumo de oxignio foi calculada para cada estado da

respirao, tendo por base a calibrao do elctrodo que foi feita de modo a

que a concentrao de oxignio de 240 nmoles/ml de meio de respirao, a

30C, correspondesse a 300 mm de papel de registador. Os resultados obtidos

a partir destes ensaios permitiram-nos determinar, o ndice de controlo

respiratrio (ICR) que avalia a integridade das mitocndrias e calculado pelo

quociente entre a velocidade de consumo de oxignio na presena de ADP

(estado 3) e a velocidade de consumo de oxignio aps o consumo do ADP

adicionado (estado 4). A eficincia fosforilativa calculada pelo quociente entre

o ADP adicionado e a quantidade e oxignio consumido para o fosforilar.

- 56 -

2.4 - Determinao do potencial de membrana das mitocndrias

O potencial de membrana mitocondrial () foi determinado

indirectamente com um elctrodo de tetrafenilfosfnio (TPP+) selectivo ao

catio lipoflico TPP+ e como elctrodo de referncia foi usado o elctrodo de

calomelanos (Ag/AgCl2) (modelo MI 402; microelctrodos, Inc., Bedford, NH).

Os elctrodos foram ligados a um aparelho de pH (Crison micro pH 2001) e o

sinal correspondente diferena de potencial gerada entre os elctrodos foi

debitado num registador Kipp & Zonen, aps ter passado por um circuito de

compensao de voltagem basal.

O potencial de membrana calculado assumindo que a distribuio do

TPP+ entre a mitocndria e o meio respeita a equao de Nernst, como o

descrito por Kamo e colaboradores (1979), de acordo com a seguinte equao:

(mV) = 59 log (v/V) 59 log (10 E/59 1),

em que v, V e E representam, respectivamente, o volume mitocondrial, o

volume do meio de incubao e a deflexo do potencial de elctrodo desde a

linha basal. Como volume da matriz mitocondrial foi tomado o valor de 1,1

l/mg de protena (Massini et al., 1984).

A determinao do potencial foi efectuada numa cmara de reaco

aberta, termostatizada a 30C, em 1 ml de meio de reaco contendo 130 mM

sacarose, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 5 mM KH2PO4, 5 mM

HEPES a pH 7,4 (Fernandes et al., 2008) suplementado com 3 M TPP+ e 5

mM glutamato/2,5 mM malato. As reaces foram iniciadas por adio das

mitocndrias isoladas de fgado (1 mg protena) permitindo o desenvolvimento

do potencial mximo de polarizao (Fig.15 Polarizao) sendo a

despolarizao induzida por adio de 150 nmoles de ADP. Aps a fosforilao

de todo o ADP adicionado ocorre a repolarizao da membrana mitocondrial

interna e o restabelecimento do potencial membranar (Fig.15-Repolarizao).

- 57 -

Figura 15 - Representao esquemtica de um registo tpico obtido a partir de

experincias com elctrodo de TPP+

3 - Avaliao dos efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

permeabilidade transitria mitocondrial

A sonda Clcio Green 5-N uma sonda flourescente especfica para o

clcio, de tal forma que a intensidade de fluorescncia ser proporcional

quantidade de clcio presente ou libertado para o meio por induo da PTM.

As reaces decorreram em cuvetes de espectrofluorimetria, a 30C e sob

agitao contnua. A suspenso mitocondrial (0,25 mg/ml) foi adicionada a 2 ml

de meio de reaco composto por 200 mM de sacarose, 1 mM de KH2PO4, 10

M de EGTA, 10 mM de Tris-Mops, a pH 7,4 o qual foi suplementado com

rotenona (2 M) oligomicina (0,5 mg/ml) e Calcium-Green (100 M)

A observao e registo dos movimentos de clcio foi feita tendo por base

a emiso de flourescncia da sonda quando ligada ao clcio. A monitorizao

foi realizada pela emisso de fluorescncia usando um de excitao de 506

nm (fenda 4 m) e um de emisso de 531 nm (fenda 10 nm) utilizando um

espectrofluormetro Perkin Elmer LS-50 B. Esta avaliao da fluorescncia foi

feita durante um minuto na ausncia de clcio e substratos respiratrios

Polarizao Repolarizao

Despolarizao

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(obteno de uma linha basal), aps o qual foi adicionado o clcio. Decorrido

mais um minuto, as mitocndrias foram energizadas com succinato (5 mM)

seguido de cerca de 10 minutos de monitorizao contnua. Os compostos em

estudo e a CyA foram adicionados suspenso de membranas e incubados

durante 3 minutos antes da adio do clcio.

4 - Avaliao de efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na integridade

das mitocndrias

Para esclarecer os efeitos do 2-nitro-p-cimeno e do p-cimeno na

integridade da membrana mitocondrial, foram avaliadas as variaes dos

volumes osmticos por monitorizao espectrofotomtrica da absorvncia

aparente da suspenso a 540 nm, num espectrofotmetro Perkin-Elmer,

lambda 6 UV/VIS (Custdio et al., 1998). As experincias decorreram em 2 ml

de meio de respirao contendo sacarose 130 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM,

EGTA 0,1 mM, KH2PO4 5 mM e HEPES 5 mM, pH 7,4, suplementado com

rotenona 2 M. A suspenso mitocondrial (1 mg) foi adicionada ao meio de

respirao na presena de substratos respiratrios, temperatura de 30 C e

sob agitao magntica constante, tendo sido feita a leitura contnua da

absorvncia a 540 nm durante 30 minutos. Para esclarecer os efeitos dos

compostos, a suspenso de mitocndrias foi incubada durante 3 minutos na

ausncia (controlo) e na presena de diferentes concentraes de 2-nitro-p-

cimeno e do p-cimeno, antes de iniciar a leitura da absorvncia a 540 nm.

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