NUCLÉOLOProfa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo OliveiraPós Graduanda Priscila Pasqüetto Mendonça

- Estrutura + facilmente visível (sem qualquer coloração): ↑ índice de refração

- Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin (1839)

NUCLÉOLO

- Organela celular, cuja função é a de produzir ribossomos- Geralmente ovalada- Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)

Tamanho, forma e númerodepende do estado funcional da

célula- Tamanho - Grandes: glândulas e neurônios

- Pequenos: céls da glia e endotélio

- Número - Normalmente 1 (linfócitos humanos)

- +1: hepatócitos, céls vegetais (tulipas: 6-13)

- Ovócitos de anfíbios: 3000

Composição Química- RNA: 3-17% (pp RNAr) (RNP)

- DNAr: até 17% (seqüências altamente repetidas)

- Proteínas: até 85% - histonas- acídicas: Numatrina,

Nucleolina, Ribogranulina

- enzimas: RNA polimerase I,DNA topoisomerase I e II

Métodos de EstudoMicroscopia de Luz

- Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR, Azul de Toluidina e Variante da Concentração Eletrolítica Crítica)

D1, D2 - T. infestans ♂

←

D3 - T. infestans ♂

↓<

*

Cromatina esverdeada

Nucléolo - azul

Métodos de EstudoMicroscopia de Luz

-Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)- Microscopia de contraste de fase

Métodos de EstudoImpregnação por íons prata no cito

diagnóstico do câncer

Nucléolo x Citodiagnóstico

Parâmetros:

• Tamanho• Número• Forma• Razão área N nu

Microscopia Eletrônica - Método de Bernhard → RNA + proteínas: elétrondensos

→ DNA: eletronlúcidos

Métodos de Estudo

Além de...- Análises bioquímicas e microespectrofotometria

- Autorradiografia

- Agentes inibidores do RNAr

- Análises moleculares

Métodos de Estudo

Experimento realizado na região espaçadora ITS-1

Figura 1. (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm 800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco).

L Rd R n Rr Tb Ti Tv L

L Ph Pm Tb Ti Tv Rd Rn Rr L

A

B

2.036163 61018

506

Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002

- Estudaram as regiões espaçadoras

ITS-1 da Região Organizadora

Nucleolar (RON)- Migração das

moléculas de RNAr

No microscópio de luz: simples- ovalada, no máximo

alguns vacúolos No microscópio eletrônico: três

grandes regiões

Morfologia do Nucléolo

Centro Fibrilar (CF)

Componente Fibrilar Denso

(CFD)Componente Granular (CG)

1) Centro Fibrilar (CF)- Conjunto de finas fibrilas (4-8nm)- ↑ atividade transcricional, ↑ n° e

tamanho dos CFs- Composição Química: DNAr, DNA topoisomerase I, RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina, Fibrilarina

Morfologia do Nucléolo (MET)

Centro Fibrilar (CF)

Morfologia do Nucléolo (MET)2) Componente Fibrilar Denso

(CFD)- Fibrilas densamente empacotadas →

redes- Ao redor dos CFs- Composição Química: DNAr , RNA

polimerase I, Fibrilarina, Nucleolina, Numatrina

Componente Fibrilar Denso

(CFD)

Morfologia do Nucléolo (MET)3) Componente Granular (CG)- Estruturas granulares de 10 a 15nm

de diâmetro- Periferia, ao redor do CFD- Local de armazenamento das pré

unidades ribossômicas- Composição Química: RNP, Fibrilarina,

Nucleolina, RibogranulinaComponente Granular (CG)

Morfologia do Nucléolo

Morfologia do Nucléolo (MET)

Vários Centros Fibrilares

Alta transcrição

Morfologia do Nucléolo (MET)

4) Esqueleto Nucleolar- Região amorfa relacionada com o

esqueleto nuclear- Composição Química: Proteínas

acídicas

5) Vacúolos Nucleolares- Áreas “vazias”????- Dúvidas... Artefatos??? ... Áreas

menos densas???

Morfologia do Nucléolo (MET)6) Cromatina associada ao

Nucléolo- Ao redor – envia ramificações

intranucleolares- Cromatina perinucleolar – não faz

parte do nucléolo- Segmentos cromossômicos específicos

- RONs

a) Nucléolos Reticulados (nucleolonemas)

- Região granular periférica + Região fibrilar central

b) Compactos- Essencialmente

granulosos (massa celular compacta e anastomosada)

c) Em anelCamadas concêntricas:

- central filamentosa

- cortical granulosa

Tipos de Nucléolo

EX: Triatoma infestans

EX: Anfíbios

EX: Allium cepa

Fisiologia do Nucléolo- Biogênese dos RIBOSSOMOS- Função bem estabelecida com

observações de Brown em 1964 (Xenopus laevis)

- Defeito cromossômico: formação dos nucléolos (perda de DNAr)

- Número de nucléolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)

Aa X Aa¼ AA: ½ Aa: ¼ aa

Experimento de Miller e Beatty (1967)- Ovócitos de Triturus viridescens

- Choque osmótico – separação das regiões nucleolares

- CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, por RNA 45S transcrito

- CG: moléculas de RNA precursor da grande subunidade 32S

Experimento de Miller e Beatty (1967)

Experimento de Miller e Beatty (1967)- DNAr em tandem

- Muitas moléculas de RNAr transcritas

- Regiões de DNA espaçador

- “Árvore de Natal”

Experimento de Miller e Beatty (1967)- Cada RNA polimerase se associa ao

promotor , e se move ao longo do DNAr

RON: motivo genético altamente redundanteDNA Espaçador; ITS: Segmentos intercalares transcritos; ETS: Seqüência externa transcrita

Metabolismo Nucleolar

Metabolismo Nucleolar

Subunidade maior (60S): RNAr 28S + RNAr 5,8S + RNAr 5S + proteínas

nucleolaresSubunidade menor (40S): RNAr 18S + proteínas

nucleolaresProteínas nuleolares: Importadas do citoplasma

Metabolismo Nucleolar

S = Unidade de Sweedberg – é a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a qual se

sedimentam as partículas no campo de centrifugação. Ocorre influência do tamanho,

densidade e forma da partícula e também do meio no qual as partículas estão suspensas.

Metabolismo NucleolarProcessamento do

RNA:RNA 45 S

RNA 5,8 S

RNA 32 S RNA 20 S

RNA 28 S RNA 18 S+

+RNA 5 S

Subunidade menorSubunid

ade maior

Metabolismo NucleolarAs proteínas nucleolares (ou ribossomais) são

importadas para o nucléolo a partir do citoplasma e começam a unir-se ao pré-RNAr (RNA 45 S) antes de sua clivagem. Enquanto o pré-RNAr é processado,

proteínas nucleolares adicionais e o RNAr 5 S (transcrito de uma outra região que não pertence à

RON) unem-se para formar partículas pré-ribossomais. Os passos finais da maturação seguem a exportação de

partículas pré-ribossomais para o citoplasma, produzindo as subunidades ribossomais 40 S e 60 S

Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs)- Moldes de DNA relacionados com a

síntese de estruturas nucleolares – zonas de constricções secundárias que apresentam regiões satélites

- RONs: local do cromossomo responsável pela codificação do RNA 45S

Cromossomos Humanos

- zonas de constricções secundárias (ativamente transcritos)- regiões satélites

Representação esquemática da metade

do cariótipo

- Como o nucléolo se organiza??!!

- Presente durante intérfase e início da prófase

- “Desaparece”: final da prófase (mitose) e no diplóteno (meiose)

- “Reaparece” na telófase

Biogênese do Nucléolo

No Homem: após a mitose, dez pequenos nucléolos são formados, que rapidamente se fundem, formando um único e grande nucléolo

Biogênese do Nucléolo

Dez pontinhos, representando os dez

cromossomos portadores das RONs

A aparência do nucléolo muda dramaticamente durante as diferentes fases do ciclo celular

1)Reconstrução do nucléolo a partir dos corpúsculos pré-nucleolares que estão agrupados junto as RONs

2) Reconstrução a partir de uma Matriz pré-existente

3) Formação de estrutura totalmente nova a partir da RON

Biogênese do NucléoloTrês hipóteses: