Disciplina: Elementos de Microscopia e MicroanáliseDocente: Profa Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo OliveiraAluna: Maria Isabel Afonso da Silva

Pós-Graduação em Genética

Técnicas Citoquímicas aplicadas às alterações biológicas em resposta a

agressões ambientais

A ordem Chelonia:• muitas particularidades• características peculiares Poucas referências bibliográficas

M.a. de evolução e adaptações

Crescente expansão das fronteiras agrícolas e industriais

intensa exploração e urbanização

contaminam os habitats dos animais silvestres

• Comprometer a sobrevivência e fisiologia dos organismos;• Induzir alterações genéticas

Mutações e/ou Carcinogênese.

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

Phrynops geoffroanus ou “Cágado-de-Barbelas”

Ampla distribuição na América do Sul

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

PreservaçãoManejo adequado

Perfil hematológico Perfil fisiológico

Biologia da espécie

Características fisiológicas Influências ambientais

Hematologia de répteis

INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO

O perfil hematológico de répteis pode sofrer grande variação fisiológica;A interpretação dos achados da série branca é distinta e complexa É necessário elaborar um perfil para a espécie em estudo em determinada região e situação através de pesquisas periódicas.

Estudos em relação a diversas condições ambientais => hábitos de vida e adaptações ao ambiente,

• futura comparação com outras espécies para maior compreensão dos aspectos evolutivos e conhecimento sobre esta.

Amostras SanguíneasPunção Cardíaca

1- Hemograma

• Hematócrito• Dosagem da hemoglobina circulante• Contagem de células• Contagem de eritrócitos• Cálculo de leucócitos• Cálculo dos índices hematimétricos

•VGM•CHGM•HGM 

• Contagem diferencial dos leucócitos

Basofilia: Corantes básicos (+)/ catiônico Substrato aniônico (-)

Como a hematoxilina- grupamentos fosfatos dos ácidos nucléicos (Núcleo)

Como a eosinaAmino de resíduos protéicos (NH3)- (núcleo e Citoplasma)

Acidofilia:Corantes ácidos (-)/ aniônico Substrato catiônico (+)

• Coloração de rotina para análise geral da morfologia das células sanguíneas• Facilita a identificação e diferenciação dos leucócitos

Panótipo (Hematocor-BiológicaR)

Reação de Acidofilia/Basofilia-Mediadas por Ligações Eletrostáticas

Células Vermelhas de Quelônios

Atuam na inflamação, promovem fagocitose; como célula hemostática

Células brancas de Quelônios

Requisitados no combate a doenças infecciosas de origem bacterianas infecção viral,

Respondem à infecções bacterianas

Células Brancas de Quelônios

•Encontrados em infecções parasitárias.

•Estão presentes no combate a infecções bacterianas.

•reações imunes.

• proteínas de forma tridimensional acelerar as reações químicas são catalisadores biológicos.

• O resultado da reação é uma mudança específica do substrato, criando uma nova molécula química ou um produto.

Citoquímica de Enzimas

•As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação química que realizam.

Copyright ©2002 BMJ Publishing Group Ltd.

habilidade de catalisar, em condições ácidas, a hidrólise de monoesteres ortofosfato

Podem ser diferenciadas de acordo com propriedades estruturais, catalíticas, imunológicas, distribuição no tecido e localização subcelular

• Encontradas em eritrócitos, leucócitos, fígado, baço, rins, ossos e outros tecidos em humanos• Em répteis não se tem muito estudo sobre sua localização.

Fosfatases ácidas

A LAP => monoester ortofosfórico do compartimento endossomo/lisossomo fundamental para o catabolismo de um ou vários substratos no lisossomo.•Muitas doenças lisossomais => manifestações morfológicas, bioquímicas e clínicas causadas pelo armazenamento do conteúdo lisossômico.

Responsáveis pela hidrólise dos fosfatos de ésteres orgânicos, que durante a incubação cria a base para as reações citoquímicas. • Especificidade por substrato menos limitada • Ótima atividade em valores baixos de pH. Localização:•Lisossomos, •complexo de Golgi, • corpos multivesiculares• superfície do RER

Fosfatases ácidas

hidrolizam uma variedade de ésteres orgânicos com a liberação de íons fosfatos.

Seu papel é muito importante na autólise de tecidos

Método de fosfato de chumbo - Gömöri (1950)

Fosfatases ácidas

Como controle, é utilizado meio de incubação sem o substrato

Observações:• O meio de incubação é preparado no dia anterior e permanece over-night a 37º C; • os reagentes são guardados em solução estoque a 4ºC. • O pH da solução de incubação final é importante e não pode exceder 5,2. • A solução de sulfeto de amônia a 1% é preparada no momento de uso.

-glicerofosfato de sódio + Nitrato de Chumbo (com tampão acetato).

37ºC por 30’

lavar em Tampão Acetato (pH 5,0) e mergulhar em sulfeto de amônia 1%, 1’

sulfeto de chumbo• depósito granular denso e escuro, com coloração marrom.

enzimas liberam o fosfato do substratoprecipitado insolúvel

de fosfato de chumbo

relacionada com a destruição da matriz óssea pela ação de enzimas, com a reabsorção de tecido ósseo.

doador

catalisar a transferência H

peróxido de hidrogênio

•Variações nos padrões dos sistemas isoenzimáticos da peroxidase => organismos submetidas a estresses abióticos. • O incremento da atividade dessas enzimas antioxidantes é fundamental para evitar danos em nível celular.

•Organismos com altos níveis de antioxidantes => mais tolerantes a danos oxidativos

peroxidases

peróxido de hidrogênio

decomposto pela oxidação de cosubstratos (compostos fenólicos e/ou antioxidantes)

POD: fazem parte do grupo das enzimas oxidases.

Peroxidases

Peroxidases

É incapaz de funcionar anaerobicamente e precisam de peróxido como catalizador. Método=> Sato (1928), segundo Lison (1960).

benzidina (incolor e insolúvel)

Peroxidases:catalítico para H2O2

oxida

benzopurpurina (cor marrom avermelhado)

azul de benzidina (instável e insolúvel)

Peroxidases

4)Lavar novamente e cobrir com solução aquosa de fucsina básica a 1% durante 20 segundos.O material, após novamente ser lavado em água destilada, é seco ao ar e montado em gelatina-glicerina

1) Solução: sulfato de cobre e ácido acético durante 1’.

3)Cobrir com uma solução saturada de benzidina + H2O2 (10 V) –homogeneizar- 2 a 8 minutos.

2)Lavar com água destilada.

Como controle da reação=> dois meios, um na ausência de benzidina e outro sem peróxido de hidrogênio.

Método citoquímico de peroxidase em amostras de sangue humano. À esquerda- atividade de peroxidase positiva em neutrófilo. A amostra à direita corresponde ao controle da reação.

Alterações citogenéticas específicas x teratogênese

Genotóxicos:• defeitos hereditários -mutações em células germinativas •efeitos teratogênicos•mutações pontuais, deleções, translocações e aneuploidia; •quebra da dupla fita de DNA, •aberrações cromossômicas, •formação de micronúcleo, •intercâmbio de cromátides irmãs.

Os métodos + comumente usados para avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos => contagem de MN e fragmentação de DNA - detectados em diferentes tipos de células pelo ensaio cometa

Mutagênicos:• agem sobre o desenvolvimento=> redução no índice mitótico => comprometimento no desenv. e cresc. do organismo. • impacto significativo sobre o “pool” gênico de uma população

•dispersos no citoplasma – separados do núcleo principal.

Aparência:•pequeno núcleo •MO: material nuclear, intensidade luminosa ~ núcleo, •formato oval/circular •A< 1/3 do núcleo

Os micronúcleos:•fragmentos cromossômicos acêntricos

cromossomos com atraso durante a anáfase

•originam-se de

•formados durante a telófase •representam a perda de cromatina

cromossômico estrutural

dano no aparelho mitótico

Os micronúcleos:

Teste do micronúcleo:

• desenvolvido por Schmid (1975) avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos. detecta mutações brutas: aberrações cromossômicas

Utilizações:monitoramento biológico e ambiental rastreio de compostos para determinar a sua genotoxicidade após exposição direta ou indireta avaliações toxicológicas dos produtos químicos industriaisavaliações dos perigos de exposição geral.

Esfregaços:1. Fixar 10’ em metanol absoluto2. Após 24 horas=> em HCl à 60O C por 11’3. Reativo de Schiff por 2 horas, em local escuro.4. “Fast Green” por 20 segundos.

Teste do micronúcleo:

Vantagens:• acessível, não-invasivo •análise rápida de um elevado número de células •a velocidade e facilidade de análise, •não-exigência de células em metáfase, •pequenas concentrações de células •eficácia em danos clastogênicos e aneugênicos.

Teste do micronúcleo:

Outra técnica útil para biomonitoramento de contaminação ambiental.

Processo rápido, simples e sensível => vários tipos de células Possibilidade de medir a integridade do DNA em nível celular. Pode detectar baixos níveis de danos de DNA Exige um pequeno número de células por amostra, Flexível Curto período de tempo necessário para concluir um estudo

Ensaio Cometa

Ensaio Cometa

• A visualização de mobilidade dos fragmentos de DNA => modo conveniente e sensível de detectar quebra de DNA nas células. • O nível de base de danos no DNA varia => espécie x tipo de células; isto influenciará a sensibilidade do ensaio

Células com danos no DNAproduzem aumento da migração de fragmentos de DNA do núcleo

"cauda de cometa".

Agentes endógenos/ produtos do metabolismo celular aeróbio e inflamação + exógenos/ uma variedade de agentes químicos e físicos

modificar o DNA celular e outros componentes celulares.

Ostling e Johanson em 1984 Singh et al. (1988) e Klaude et al. (1996)

sangue coletado é diluído em solução fisiológica

Depositar 10 L da suspensão celular preparada com 120 L de agarose de baixo ponto de fusão a 37º C sobre lâminas pré-gelatinizadas.

20’ em geladeira cobertas com lamínulas.

solução de lise - 1htampão NaOH com EDTA (pH ~13), por 20 minutos em corrente de eletroforese, no escuro

neutralizadas com Tris, por 15 minutos e fixadas em etanol absoluto por 10 minutos.

A análise => microscópio de fluorescência, em objetiva de 40x.

CONCLUSÃOCONCLUSÃO

Os dados úteis para futuros estudos que envolvam a biomonitorização das regiões naturais

Há grande impacto dos poluentes do ambiente sobre o organismo em estudo.

Técnicas de micronúcleo, cometa

Ferramentas de biomonitoração das regiões naturais

Avaliação de agentes genotóxicos e mutagênicos

Phrynops geoffroanus como um organismo sentinela de efeitos genotóxicos.

OBRIGADA!!!