Fisiologia microbiana

Nutrição e crescimento

Nutrição microbianaComponentes necessários às célulasMeios de culturaCondições ambientais

Crescimento populacionalVelocidade de crescimentoTempo de geraçãoMedidas do crescimento

Nutrição de microrganismos

• Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados.• Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas, enquanto outros são

tão exigentes quanto o homem.

• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é

necessário o cultivo em laboratório: - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais. - Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.

Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase) precisa de

hospedeiro para ser cultivado.

Introdução

Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.

Os elementos químicos principais para o crescimento das células são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).

O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano.

Necessidade de meios de cultura adequados

Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que contém carbono

Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade.

- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.

Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas.

- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

Matéria secaÁgua

C

N

H

P, S, K, Na ...

célula

Componentes necessários às célulasMacronutrientes

Fonte de carbono:- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos

lipídeos proteínas

- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos):

É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgânicos.

Fonte de Nitrogênio:- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.

(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)

moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)

A capacidade de algumas bactérias em utilizar o

nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental

importância para a vida de todos os seres.

• Hidrogênio:- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e

gases)

• Função:

Manutenção do pHFormação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração

Componentes necessários às células

• Oxigênio:

- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)

- É obtido a partir das proteínas e gorduras.

Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.

P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP

S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas

K – Atividade de enzimas

Mg – Estabilidade dos ribossomos

Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos

Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.

Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.

Componentes necessários às células

Outros macronutrientes:

• Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição

de um meio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)

- Nem sempre sua adição é necessária

- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra

pura podem apresentar deficiências desses elementos.

Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte

o N2 para NH3 durante a FBN.

Componentes necessários às célulasMicronutrientes

• Água:- Componente absolutamente indispensável

(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)

No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.

Outros aditivos: Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma,

provocar inibição, estabilizar o pH:

• Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicosEDTA, ácido cítrico, polifosfatos.

• InibidoresEx: produção de ácido cítrico por Aspergillus nigerUtiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

Água e outros aditivos

• Tampões

- Carbonato de cálcio- Fosfatos- Proteínas (peptona)

Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulasepectina induz a pectinaseamido induz a amilase

Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma– Remoção de células, perda do produto, contaminação– Redução do volume do meio

álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas

Outros aditivos

Meios de cultura

ClassesQuimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)

Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmem de bovino)

Não existe um meio de cultura universal, masExistem vários tipos meios para diversas finalidades

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Meios de cultura

Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionais

Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.

Meio de cultura

solidificado com 1,5 % de ágar.

Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.Robert Koch introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras).

Meios de cultura

• Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades.

Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espéciesOutros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.

Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey

Microplacas com diferentes meios de cultura para

identificação de enterobactérias.

Meios de cultura para bactérias

• Normalmente imitam o habitat normal

Ex.Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura.As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas.

Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas

Meios de cultura para fungos

• Todos os fungos são heterotróficos

Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.

Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias.

Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.

Meios de cultura para protozoários

• Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências nutricionais complexas

Muitos não são cultivados in vitro.

Os que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, soro fetal, infusão de fígado e células bacterianas.

Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e sais inorgânicos.

Tetrahymena pyriformis não é patogênico mas é utilizdo para diversas pesquisas médicas e biológicas.

Meios de cultura para algas

• As algas utilizam luz como energia, dióxido de carbono, água e íons inorgânicos solúveis. São fotoautotróficos.

Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas.

Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na água do mar poderão ser necessários.

Maré vermelha.Algas que produzem toxinas. Algas unicelulares

Meios especiais

Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio)

Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros.

Ex. meio ágar verde brilhante.

Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista.

Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas.

Meios seletivos/diferenciais:

Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta.

Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem

inibir as demais.

Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.

MEIOS DE CULTURA

Composição elementar média (% do peso seco)

Elemento Bactéria Fungo

Carbono 52 51

hidrogênio 7 7

Nitrogênio 13 8,5

Fósforo 2,5 0,4-4,5

Enxofre 0,6 0,1-0,5

Potássio 2,5 0,2-2,5

Sódio 0,75 0,02-0,5

Cálcio 0,55 0,1-1,4

Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -

Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

Relação C:N:P:S 85:23:4:1

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de Nou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)

Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles.

Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)

Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)

Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose

Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1

e assim por diante.

Passo 2: otimização

Meios de CulturaComo determinar uma composição inicial para um meio de cultivo?

Temperatura Oxigênio pH Pressão osmótica, atmosférica, hidrostática Radiação eletromagnética

Condições ambientais (fatores abióticos)

Temperatura Grupos

1. Psicrófilos – temperatura ótima abaixo de

15 oC, suscetíveis de crescer a 0 oC.

2. Mesófilos – temperatura ótima 20o - 40 oC,

maioria dos patógenos humanos.

3. Termófilos – temperatura ótima acima de

45 oC.

Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante

Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso com indicador redox:Rosa quando oxidado

Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O2

são formados vários intermediários tóxicos.

Ex: H2O2, OH°, O2-

Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas

Sistema para cultivo de anaeróbios

Sistema para cultivo de aeróbiosEquipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura

pH• Ao contrário da temperatura, o pH ótimo para o crescimento encontra-

se no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá,

• Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto

em todas as condições de pH.

• Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os

metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos.

Necessário a adição de um tampão ao meio.

Pressão osmótica

• Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se.

Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.

• Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células • Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão

Varia de minutos até diasDepende muito das condições ambientais

CRESCIMENTO MICROBIANO

O padrão de crescimento é o exponencial

Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos:

21 > 22 > 23> 24

Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisões (gerações) N0 é o número inicial

O número de gerações será:

A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo:

A recíproca de R é o tempo de geração:

n0N = N .2

0n = 3,3(logN- logN )

0

nR =t - t

01 t - tG = =R n

O ciclo de crescimento

• A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana

• O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.

1) Fase Lag

Período de adaptação da cultura

• Mudança de meio, preparação do complexo enzimático

• Reparação das células com danos.

2) Fase exponencial

Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.

• A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as

velocidades de crescimento são bastante variáveis:

- Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos

- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

3) Fase estacionária: Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial

não pode ocorrer indefinidamente.

• Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.

Divisão = morte → crescimento líquido nulo

Ainda pode ocorrer catabolismo e produção de metabólitos secundários

4) Fase de morte (declínio):

• A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte.

A morte celular é acompanhada da lise celular

MEDIDAS DO CRESCIMENTO

• Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:

1) Peso seco total das próprias células

filtração, secagem e pesagem

2) Peso de algum componente celular

extração, secagem e pesagem

3) Variação no número de células a) contagem de células totais (direta) b) contagem de células viáveis (indireta)

Contagem microscópica direta

• Vantagens: método rápido e fácil

• Desvantagens:Não distingue as células vivas das mortasPode-se omitir células pequenasCélulas móveis precisam ser imobilizadas

Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)Ex.: Câmara de Neubauer

Contagem de células viáveis (indireta)

Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis.

É c o nta da a pla c a c o m 3 0 a 3 0 0 c o lô nia s

• Diluição das suspensões celularesAmostras concentradas precisam ser diluídas

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros métodos

TurbidimetriaAs células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio

Pode ser medida com um espectrofotômetro

• O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão Turbidez X quantidade de células

Contagem eletrônica