O Papel da Genética do O Papel da Genética do Parasita na Doença de Parasita na Doença de

ChagasChagas

Juliana Ramos Pimenta

Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG

Prevalência:

16 a 18 milhões de infectados (WHO, 1991)

Formas de transmissão:

Transmissão vetorial

Transmissão transfusional

Transmissão congênita

Formas excepcionais de transmissão

Distribuição

Doença de Chagas

Fase Aguda

alta parasitemia

alto parasitismo tissular

edema periorbital (1-2%)

sintomas leves

miocardites/encefalites agudas

Doença de Chagas

Fase Crônica

baixa parasitemia

baixo parasitismo tissular

nenhum sinal aparente

diferentes formas

CardíacaDigestiva

Indeterminada

?

Cardio-digestiva

Doença de Chagas

Trypanosoma cruzi

Formas do parasita

TripomastigotaAmastigota Epimastigota

1.5 a 5 10 a 20 10 a 20

Trypanosoma cruzi

Isolado de um paciente

Cepas X Clones

CEPA

CEPA(MC43)

MC43- Clone1

MC43- Clone2

MC43- Clone3MC43

Trypanossoma cruzi

Trypanossoma cruzi

AspectosGenéticos

AspectosBioquimicos

AspectosBiológicos

Variabilidade do parasita

Trypanossoma cruzi

T. cruzi

T. cruzi I

T. cruzi II

Nova nomenclatura (1999)

Pacientes assintomáticos

Adaptado a marsupiaisCiclo Silvestre

Baixa parasitemia

Alta parasitemia

Pacientes crônicos

Ciclo doméstico

Adaptado a primatas

Trypanossoma cruzi

Ciclo silvestre Ciclo doméstico

Infecções policlonais de T. cruzi

Trypanossoma cruzi

Diferentes parasitas

Diferentes parasitas

Diferentes formas clínicas

Diferentes formas clínicas

Estudos Moleculares

Correlacionar com formas clínicas da doença de Chagas

Caracterizar geneticamente os

parasitas

Microssatélites de DNA

Microssatélites de DNA

Locos de microssatélites em T. cruzi

Loco Repetição

MCLE01 (CA) 9

MCLE08 (CA)2

AA(CA)12

SCLE10 (GT)2

(TG)10

SCLE11 (AC)9

MCLF10 (CA) 2 A (CA)14

MCLG10 (CA) 8

MCLE03 (CT)4 (GT) 2CTAT(GT)15

MCLE05 (TC)9 (GT)4

AAT (AAT) 8TAC (TAC)15TAT (TAT) 20

AAAT (AAAT) 6

AA AB AC BB BC CC

Amplificação de microssatélites (PCR)

alelo A

alelo B

alelo C

ALF

LASER

Análise dos fragmentos

A B

C D

A - Monoclonal (homozigoto)

B - Monoclonal (heterozigoto)

C - Policlonal

D - Policlonal

Perfis dos fragmentos amplificados

MicrossatélitesAnálises filogenéticas

Tecidos de pacientes

chagásicos

Células únicas de T.

cruzi

Análises Filogenéticas

A

B

C

D

A B C DA 0 1 1 0

B 1 0 1 1

C 1 1 0 1

D 0 1 1 0

0 semelhança1 diferença

MATRIZ

Tamanho dos alelos

A D B C

Árvore filogenética

PCR

95/94

200pm

103894

11/94

58/94

27/94

Ig 539

Ig 62

803GLT 593

GLT 564 1931

84Ti

1523

1502 D7

Rb IX

Rb VIGLT 600

Rb I

T. cruzi I

T. cruzi II

Trypanossoma cruzi

Árvore filogenética

Microssatélites

Análises filogenéticas Tecidos de

pacientes chagásicos

Células únicas de T.

cruzi

Epimas tigotas de T. cruzi

PCR de células únicas

Separação das células únicas através do FACS

Fluorescence Activated Cell Sorter

Separação das células únicas através do FACS

Microplacas de 96 wellsEpimas tigotas de T. cruzi

PCR de células únicas

PCR microssatélitesEletroforeseSequenciador

automático de DNA

Fluorescence Activated Cell Sorter

1 - Well contendo 1 célula

2 - Well contendo 1 célula

3 - DNA de JG

4 - DNA de Colombiana

PCR de células únicas

1 cé

lula

DN

A J

G

DN

A C

olom

bia

na

1 cé

lula

1 cé

lula

PM

Con

trol

e -

Eletroforese Sequenciador automático

Microssatélites

Análises filogenéticas Tecidos de

pacientes chagásicos

Células únicas de T.

cruzi

Modelo Histotrópico Clonal

Infecção policlonal

Manutenção de parasitas

in vitro

Parasitas disponíveis para análise

Nem todos os clones são capazes

de estabelecer infecção

Isolamento

REDUÇÃO POPULACIONAL

Trypanossoma cruzi

ATAATAATAATAATAATA 5’3’TATTATTATTATTATTAT5’ 3’

DNA molde inicial

TAT externo F

ATAATAATAATAATAATA 5’3’

TATTATTATTATTATTAT5’ 3’

TAT externo R

ATAATAATAATAATAATA 5’3’

TATTATTATTATTATTAT5’ 3’TAT int. F

TAT int. R

ATAATAATAATAATAATA 5’3’

TATTATTATTATTATTAT5’ 3’

1a amplificação

2a amplificação

Produto final

Full-nested PCR

1a amplificação 2a amplificação Full nested

10 fg DNA

Loco TAT

1 célula humana - 3g DNA

1 célula de T. cruzi - 200fg DNA

Resultado Full-nested PCR

6m

6m

6m

Col+JG(50+50 tripomastigotas)

Col1.7G2(50 tripomastigotas)

JG(50 tripomastigotas)

Reto Coração

Reto Coração

Reto Coração

Infecções experimentais

Amplificação de microssatélites em tecidos de camundongos infectados

Amplificação de microssatélites em tecidos de pacientes

Resultados

DNA hum.

Tecidos de pacientes (1:10)

Laboratório de Genética - Bioquímica, UFMG

“Grupo dos Cruzi”

Jorge

Simone

Renato

Prof. Andréa Macedo

Juliana