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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS AUTÓLOGO E SUA
AÇÃO SOBRE FERIDAS CUTÂNEAS COM AUTOENXERTOS EM
EQUINOS
Ana Carolina Barros da Rosa Pedroso
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura
GOIÂNIA
2017
ii
iii
ANA CAROLINA BARROS DA ROSA PEDROSO
OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS AUTÓLOGO E SUA
AÇÃO SOBRE FERIDAS CUTÂNEAS COM AUTOENXERTOS EM
EQUINOS
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Área de Concentração:
Cirurgia, Patologia animal e Clínica médica - CiPAC
Linha de Pesquisa:
Patobiologia e morfofisiologia animal, experimental e
comparada
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura -
EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof.ª Dr.ª Luciana Ramos Gaston Brandstetter - EVZ/UFG
Prof.ª Dr.ª Júlia de Miranda Moraes - Campus Jataí/UFG
GOIÂNIA
2017
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela certeza mais do que absoluta de Sua presença ao meu lado
em minha caminhada diária, por ser meu alento, meu consolo e minha paz.
Agradeço aos meus pais, João Maurício Pedroso e Ana Rita Barros da Rosa, por
confiarem em mim e por me proporcionarem a possibilidade de continuar estudando. Eu amo
vocês demais!
Agradeço às minhas orientadoras, Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de
Moura e Prof.ª Dr.ª Luciana Ramos Gaston Brandstetter, pela paciência, pela confiança e pelo
exemplo que são para mim. Prof.ª Veridiana, muito obrigada por ter me acolhido tão bem, pela
disposição em ajudar e, principalmente, por ter enriquecido este trabalho com seu
conhecimento. Prof.ª Luciana, muito obrigada pela orientação de tantos anos, por confiar em
mim e por não ter me deixado desistir nos momentos (muito) difíceis!
Agradeço imensamente à minha maravilhosa equipe, Ana Kellen Lima de Queiroz,
Artur Antero Silva Amorim, Joel Phillipe Costa e Souza, Letícia Hirata Mendes, Marcos Luiz
Dias Júnior, Maria Clara de Sousa Bastos, Pedro Henrique Pinheiro Queiroz e Plínio Azevedo
Coelho, por toda a ajuda, por todo o incentivo e por todos os momentos felizes que me
proporcionaram. “Meus meninos”, sem vocês este trabalho não teria sido possível. Não tenho
como agradecer tanta dedicação. Muito muito obrigada!
Agradeço aos residentes e ex-residentes do Setor de Grandes Animais, Helena
Tavares Dutra, Jéssica Alves da Silva, Mayara Leão Baylão e Victor Thiago Pires Pinheiro,
pela ajuda durante o experimento, pela companhia em tantos fins de semana de plantão e por
serem, também, amigos tão queridos. Vocês são demais!
Agradeço aos meus amigos do coração, Evelyn de Oliveira, Luíza Lucena de
Albuquerque, Paula Lima Magalhães, Paulo José Bastos Queiroz, Rodolfo Peixoto de Carvalho,
a todos os “meus meninos” e, também, aos meus novos companheiros e amigos, Gabriela do
Socorro Neves Soares, Jéssyca Ataíde Ferreira, Maria Luiza Gomes Ferreira da Costa e Pedro
Augusto Cordeiro Borges, por estarem ao meu lado nos bons e nos maus momentos, por me
proporcionarem as melhores gargalhadas do mundo, pelos espetinhos no Chiquinho e por tantos
outros momentos inesquecíveis. Eu sou muito abençoada por Deus, por ter cada um de vocês
na minha vida. Amo vocês!
viii
Agradeço à Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás,
na pessoa do Prof. Dr. Marcos Barcellos Café, e à Ourofino Saúde Animal pelo apoio concedido
para execução deste projeto.
Por último, mas não menos importante, agradeço aos amigos equinos, Asa Branca,
Branca, Conhaque, Flicka, Gato, Madalena, Morena, Roxão, Toscana, Tronchinha e Wesley,
pela cooperação, ainda que em algumas ocasiões não espontânea, e por terem me ensinado
tanto. Jamais irei esquecê-los.
A cada um de vocês, meus sinceros agradecimentos!
ix
“... a felicidade não é o destino, ela está no caminho.”
Sri Prem Baba
x
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ....................................................................... 1
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................. 3
2.1. Cicatrização ......................................................................................................................... 3
2.1.1. Fase inflamatória .............................................................................................................. 3
2.1.2. Fase proliferativa .............................................................................................................. 5
2.1.3. Fase de maturação ou remodelamento.............................................................................. 6
2.2. Enxertos de pele................................................................................................................... 7
2.2.1. Eventos fisiológicos associados à integração do enxerto ................................................. 9
a) Revascularização .................................................................................................................... 9
b) Contração do enxerto e da ferida.......................................................................................... 10
2.2.2. Causas de falha na integração do enxerto ....................................................................... 10
2.2.3. Preparação do sítio receptor do enxerto ......................................................................... 11
2.2.4. Cuidados pós-operatórios ............................................................................................... 13
2.3. Plaquetas ............................................................................................................................ 13
2.3.1. Anatomia e função das plaquetas ................................................................................... 14
a) Hemostasia ........................................................................................................................... 15
b) Cicatrização de feridas ......................................................................................................... 15
c) Imunidade ............................................................................................................................. 16
2.4. Plasma rico em plaquetas - PRP ........................................................................................ 17
2.4.1. Definição ........................................................................................................................ 17
2.4.2. Método de obtenção e preparo........................................................................................ 17
2.4.3. Componentes .................................................................................................................. 18
2.4.4. Aplicações ...................................................................................................................... 19
xi
CAPÍTULO 2 - MÉTODO DE DUPLA CENTRIFUGAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO
PLASMA RICO EM PLAQUETAS ........................................................................................ 25
CAPÍTULO 3 - AÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS AUTÓLOGO EM
AUTOENXERTOS DE PELE EM EQUINOS ........................................................................ 34
CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................ 49
ANEXOS .................................................................................................................................. 50
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 – Perfil temporal das fases da cicatrização. As linhas sólidas representam o perfil
da cicatrização de animais de laboratório, enquanto que as áreas com
preenchimento representam o perfil de cicatrização de feridas em membros de
equinos. ................................................................................................................ 3
FIGURA 2 – Ferida criada experimentalmente na região glútea de equino. A) Ferida no dia da
sua confecção. B) Ferida aos sete dias de sua criação, exibindo preenchimento
por tecido de granulação. ..................................................................................... 5
FIGURA 3 – Ferida extensa e com grande perda tecidual em região de metatarso equino. A)
Ferida uma semana após a injúria, com exposição óssea e tecido necrosado. B)
Ferida durante o tratamento, em processo de granulação e livre de infecção.
Quando a granulação torna regular, a ferida estará apta a receber enxerto. ........ 9
FIGURA 4 – Ferida experimentalmente induzida em região glútea de equino apresentando
tecido de granulação ideal para a inserção de enxerto. ..................................... 13
FIGURA 5 - Esquema de uma plaqueta em suas formas inativa (esquerda) e ativa (direita).
Quando ativadas, as plaquetas mudam de forma e desenvolvem pseudópodes, que
promovem a agregação plaquetária e a liberação dos seus grânulos. ................ 14
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 3
FIGURA 1 - Representação gráfica da avaliação macroscópica referente à porcentagem de
integração dos autoenxertos de pele em feridas cutâneas tratadas ou não com
PRP. ................................................................................................................... 40
FIGURA 2 - Representação gráfica dos valores médios e desvios-padrão da avaliação
morfométrica das feridas, representados em área (cm²), nos sete momentos de
avaliação. ......................................................................................................... 41
FIGURA 3 - Fotomicrografias da ferida da pele de equino ao 14º dia após a realização de
procedimento de enxertia. A) Neovascularização acentuada (escore 3), em ferida
cutânea de animal do grupo (T). B) Neovascularização discreta (escore 1),
observada em ferida de pele de equino do grupo (C). HE, objetiva 10x. ......... 42
xiv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABELA 1 - Contagem plaquetária (plaquetas/μL) do sangue total (ST) e do plasma rico em
plaquetas (PRP) e o aumento percentual da segunda contagem de plaquetas em
relação à primeira. ............................................................................................. 29
TABELA 2 - Médias, desvios-padrão e análise estatística das contagens plaquetárias do sangue
total (ST) e do plasma rico em plaquetas (PRP). ............................................... 29
xv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 3
TABELA 1 - Resultados individuais, médias e desvios-padrão da avaliação macroscópica, em
porcentagem, da integração dos autoenxertos de pele de equinos tratados ou não
com PRP, nos dias 14 e 28 após a realização do procedimento de enxertia. ..... 39
TABELA 2 - Médias e desvios-padrão da avaliação morfométrica das feridas, representados
em área (cm²), nos sete momentos de avaliação. .............................................. 40
TABELA 3 - Médias e desvios-padrão das variáveis neovascularização, infiltrado inflamatório,
fibroblastos jovens, colagenização e integração do autoenxerto nos cortes
histológicos de feridas de pele de equinos tratados ou não com PRP, nos dias 14,
28 e 35 após a realização de procedimento de enxertia. ................................... 42
TABELA 4 - Valores médios e desvios-padrão da espessura da epiderme (acantose) da região
glútea de equinos, tratados ou não com PRP, aos dias 14, 28 e 35 após a realização
de procedimento de enxertia. ............................................................................. 43
xvi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
PRP Plasma rico em plaquetas
MMP Metaloproteinase de matriz
TIMP Inibidores teciduais de metaloproteinases
ADP Adenosina-difosfato
ATP Adenosina-trifosfato
PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas
TGF-β Fator de crescimento de transformação β
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
EGF Fator de crescimento epidermal
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
IGF Fator de crescimento semelhante à insulina
TRAP Receptor ativador de peptídeo-6 de trombina
AINEs Anti-inflamatórios não-esteroidais
xvii
RESUMO
A relevância econômica da criação de equinos no Brasil denota a importância do
desenvolvimento de novos tratamentos, economicamente viáveis, para promover a cicatrização
tecidual. Os enxertos de pele e o Plasma Rico em Plaquetas (PRP) são alternativas disponíveis
para a melhoria do processo de cicatrização nesses animais. Este estudo teve por objetivo
estabelecer um método simples para produção de PRP autólogo, assim como avaliar sua ação
sobre feridas cutâneas contendo autoenxertos de pele em equinos. Foram utilizados oito equinos
hígidos, com idade variando entre três e 18 anos e peso vivo médio de 350 kg. Na obtenção do
PRP, foi utilizado protocolo em dupla centrifugação. Foram realizadas duas feridas de 6 x 6
cm, em cada um dos lados da região glútea. Após o preenchimento da ferida por tecido de
granulação, foram realizados autoenxertos do tipo punch, com fragmentos colhidos do pescoço.
As feridas do lado esquerdo receberam tratamento com PRP (GT) e as feridas do lado direito
não receberam tratamento (GC). O protocolo utilizado na obtenção do PRP resultou em
concentração plaquetária, em média, três vezes acima daquela do sangue total. Na avaliação da
ação do PRP na cicatrização dos autoenxertos, foram consideradas variáveis macroscópicas e
microscópicas. Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05) quanto às variáveis
infiltrado inflamatório, fibroblastos jovens, colagenização, espessura da epiderme, integração
macroscópica e microscópica dos autoenxertos e retração das bordas da ferida. Contudo, a
neovascularização foi significativamente maior (p=0,0191) no grupo tratado com o PRP, no 14º
dia após a inserção dos autoenxertos. Conclui-se que o método de dupla centrifugação resulta
em PRP com concentração plaquetária adequada ao uso terapêutico. Quanto à ação do PRP,
este favorece o processo de reparo da pele com autoenxertos em equinos, já que aumenta a
neovascularização na fase inicial da cicatrização da ferida. Ainda, o PRP parece influenciar
positivamente a integração dos autoenxertos de pele e a retração das bordas da ferida, o que é
de fundamental importância para a redução do tempo de internação dos animais e,
consequentemente, dos custos terapêuticos.
Palavras-chave: cavalos, cicatrização, concentração plaquetária, enxertos de pele, punch.
xviii
ABSTRACT
The economic relevance of equine breeding in Brazil indicates the importance of the
development of new economically viable treatments to promote tissue healing. Skin grafts and
Platelet Rich Plasma (PRP) are available alternatives for improving the wound healing process
in these animals. This study aimed to establish a simple method for autologous PRP production,
as well as to evaluate its action on cutaneous wounds containing skin autografts in horses. Eight
healthy horses were used, ranging in age from 3 to 18 years and mean live weight of 350 kg.
For PRP obtention, a double centrifugation protocol was used. Two 6 x 6 cm wounds were
performed on each side of the gluteal region. After the wound was filled by granulation tissue,
punch autografts were obtained, with fragments harvested from the neck. Left-sided wounds
were treated with PRP (GT) and right-sided wounds were not treated (GC). The protocol used
to obtain PRP resulted in platelet concentration, on average, three times higher than that of
whole blood. In the evaluation of PRP action in the healing of autografts, macroscopic and
microscopic variables were considered. There was no significant difference between the groups
(p> 0.05) for the variables inflammatory infiltrate, young fibroblasts, collagenization,
epidermal thickness, macroscopic and microscopic integration of the autografts and retraction
of the wound edges. However, neovascularization was significantly greater (p = 0.0191) in the
PRP group, on the 14th day after insertion of the autografts. It is concluded that the double
centrifugation method results in PRP with adequate platelet concentration for therapeutic use.
As for the action of PRP, this favors the process of skin repair with autografts in horses, since
it increases the neovascularization in the initial phase of wound healing. Moreover, PRP seems
to positively influence the integration of skin autografts and retraction of the wound edges,
which is of fundamental importance for the reduction of hospitalization time and consequently
of the therapeutic costs.
Key words: equine, platelet concentration, punch, skin grafts, wound healing.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1. INTRODUÇÃO
O cavalo ocupa posição de destaque na economia dos países desenvolvidos; no
entanto, sua contribuição para a geração de renda e postos de trabalho no Brasil ainda é pouco
conhecida. Apesar da incorporação de máquinas de última geração e de ferramentas
tecnológicas, esses animais continuam sendo de extrema importância para o desenvolvimento
de atividades pecuárias e agrícolas na maioria das propriedades rurais. Somando-se cavalos de
lida, raça, lazer e competição, a tropa nacional é superior a cinco milhões de cabeças1.
A frequência dos ferimentos cutâneos em equinos é de grande relevância quando
comparada a outras espécies. A cicatrização dessas feridas é um processo complexo, no qual
ocorre interação entre eventos celulares e moleculares, que resultam na cicatriz2. A cicatrização
nos cavalos é comumente lenta e difícil, o que leva às feridas crônicas e, consequentemente,
aos custos elevados com tratamentos3. Essas feridas possuem menor disponibilidade de fatores
de crescimento4, que agem como sinalizadores na regulação dos eventos envolvidos na
cicatrização5 e que têm as plaquetas como principal fonte6.
O crescente número de animais e a importância econômica relevante da criação de
equinos no Brasil, além das perdas representadas pelos ferimentos cutâneos nesta espécie,
denotam a importância do desenvolvimento de novos tratamentos economicamente viáveis para
promover a cicatrização tecidual. Os enxertos de pele são boa opção quando uma ferida não
pode ser fechada cirurgicamente ou excede a capacidade de cicatrização pela contração e
reepitelização. A enxertia de uma ferida em fase de granulação é considerada um tratamento de
custo-benefício favorável e de fácil execução7.
Outra alternativa disponível para a melhoria da cicatrização de feridas em cavalos
é o plasma rico em plaquetas (PRP), um produto derivado da centrifugação do sangue total, rico
em citocinas e fatores de crescimento. O PRP tem sido utilizado como opção terapêutica em
diversas enfermidades em humanos e animais, porém ainda não há confirmações inequívocas
quanto a sua eficácia. Em relação às feridas cutâneas de equinos, sabe-se que os resultados
dependem da localização da lesão, da forma de obtenção e composição do PRP, da forma de
apresentação (gel ou líquido), da via e frequência de aplicação e do volume e momento em que
é administrado durante o processo de cicatrização8.
Nesse contexto, esta pesquisa teve por objetivo estabelecer um método simples e
eficiente de produzir um PRP autólogo de qualidade terapêutica, assim como avaliar sua ação
sobre feridas cutâneas contendo autoenxertos de pele em equinos, a fim de colaborar com
2
informações adicionais que auxiliem no esclarecimento de questões acerca do efeito desse
produto, em associação aos enxertos, no processo de cicatrização cutânea nos equinos.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cicatrização
O reparo é caracterizado por dois processos, a regeneração e a cicatrização. A
regeneração consiste na substituição do tecido lesionado por células normais do mesmo tipo e
só é possível em tecidos com tipos celulares capazes de realizar mitose, como epitélio, tecido
ósseo e tecido hepático. A cicatrização é uma reação designada a restabelecer a continuidade
do tecido lesionado com tecido conjuntivo, com qualidade biológica inferior, e tem como
objetivo restaurar e recuperar a integridade, força e função da pele9. É um processo complexo,
que envolve uma série de interações, em um fluxo constante, entre tipos celulares diferentes, a
matriz extracelular e os mediadores que influenciam as atividades biológicas sequenciais10.
Didaticamente, o processo de cicatrização pode ser dividido em três fases, mas os eventos e
elementos de cada uma destas se sobrepõem (Figura 1), a saber: fase inflamatória, fibroblástica
ou proliferativa e de maturação e remodelamento11.
FIGURA 1 – Perfil temporal das fases da cicatrização. As linhas sólidas representam o perfil da
cicatrização de animais de laboratório, enquanto que as áreas com preenchimento
representam o perfil de cicatrização de feridas em membros de equinos.
Fonte: Adaptado de Theoret9.
2.1.1. Fase inflamatória
O início da fase inflamatória é caracterizado pela hemostasia e formação do coágulo
e da matriz extracelular provisória. Esses eventos iniciam-se imediatamente após a injúria e se
encerram em algumas horas9. O trauma aos vasos sanguíneos leva à hemorragia, fazendo com
que a membrana endotelial lesada libere fosfolipídios, que se transformam em ácido
4
araquidônico e seus metabólitos. Essas moléculas mediam o tônus e a permeabilidade vascular
e iniciam a vasoconstrição, que permanece por cinco a dez minutos após a injúria. A
vasoconstrição limita a hemorragia, mas também diminui a oxigenação nos tecidos adjacentes,
o que leva à hipóxia transitória, ao aumento da glicólise e às mudanças de pH. Essas alterações
desencadeiam ativação, adesão e agregação plaquetárias e, consequentemente, a formação do
coágulo, que atua como matriz provisória para preencher o espaço criado pela ferida, servindo
ainda como superfície para a migração celular12. As plaquetas ativadas estão entre as primeiras
células a promover a inflamação e a sua degranulação libera quimiocinas, que mediam o influxo
celular para o local da lesão13.
Após a hemostasia e a coagulação, inicia-se a inflamação propriamente dita ou fase
de debridamento, que é crucial ao reparo, pois prepara a ferida para os eventos subsequentes,
por meio da liberação de mediadores que amplificam e sustentam as fases seguintes. A
inflamação pode ser dividida em fase precoce, que corresponde ao momento de recrutamento
de neutrófilos, e fase tardia, em que há a migração e a transformação de monócitos9. Os
leucócitos são recrutados por inúmeros mediadores vasoativos, quimiocinas, plaquetas,
mastócitos10 e células estromais lesionadas ou ativadas14.
Os neutrófilos, que também são fonte de citocinas pró-inflamatórias, são a primeira
linha da defesa orgânica em feridas contaminadas, sendo responsáveis pela lise de debris
celulares e bactérias, por meio da fagocitose e mecanismos enzimáticos. A vasodilatação, que
ocorre em seguida à vasoconstrição inicial, e o consequente aumento da permeabilidade
vascular, acontecem em resposta à liberação de agentes vasodilatadores, facilitando a diapedese
celular minutos após a injúria. Dessa forma, a concentração de neutrófilos aumenta
progressivamente e alcança seu pico em um a dois dias9. A migração e a fagocitose cessam
quando o sítio da injúria se torna livre de contaminação e os neutrófilos remanescentes morrem
dentro de poucos dias, quando são fagocitados por macrófagos teciduais e fibroblastos
modificados, o que caracteriza o fim da fase precoce da inflamação14.
Os macrófagos apresentam função central em todas as fases da cicatrização, pois
são responsáveis pela apresentação de antígenos, fagocitose, produção de citocinas e fatores de
crescimento, além de atuar estimulando a proliferação celular e a liberação de enzimas
degradativas, importantes na fase de remodelamento. A sua concentração aumenta rapidamente
em tecidos inflamados, pois além das células residentes, os monócitos migram da vasculatura
para o local da lesão e se diferenciam em macrófagos15,16.
Para que a inflamação cesse, os eventos que a iniciaram devem ser finalizados ou
revertidos e as células inflamatórias devem ser dispersas da ferida, por apoptose, que ocorre
5
durante todo o processo17. Quando a inflamação não se resolve, se torna crônica e se caracteriza
pelo acúmulo de tecido conjuntivo. Esse tecido é formado por componentes da matriz
extracelular, como colágenos, fibronectina e ácido hialurônico. A fibrose, a depender da
quantidade e localização, leva a prejuízos na função do órgão, falência ou mesmo a morte9.
2.1.2. Fase proliferativa
A fase proliferativa ou de proliferação celular tem como objetivo principal
preencher a superfície da ferida com tecido de granulação, um estroma rico em fibronectina e
hialuronato, que cria uma barreira física à infecção, que também atua como superfície para a
migração celular (Figura 2). Três eventos caracterizam essa fase, fibroplasia, angiogênese e
reepitelização. O tecido de granulação é formado essencialmente por macrófagos, responsáveis
pelo debridamento da ferida e produção de mediadores que estimulam a fibroplasia e a
angiogênese; fibroblastos, que proliferam e sintetizam novos componentes da matriz
extracelular; e vasos sanguíneos neoformados, que carreiam oxigênio e nutrientes, e conferem
à granulação sua característica vermelha e granular9.
FIGURA 2 – Ferida criada experimentalmente na região glútea de equino. A) Ferida no dia da sua
confecção. B) Ferida aos sete dias de sua criação, exibindo preenchimento por tecido
de granulação.
Fonte: Arquivo pessoal.
A fibroplasia tem início de três a cinco dias após a injúria e possui alta atividade
celular, apesar de não contribuir em força de tensão. Os fibroblastos, as células endoteliais e
epiteliais são responsáveis pela síntese e maturação da matriz extracelular. Os fibroblastos, sob
influência de citocinas e fatores de crescimento, são recrutados para a ferida, proliferam e, em
6
seguida, alteram sua função para realizar síntese proteica e substituir a matriz extracelular
provisória por colágeno. O pico de acúmulo de tecido conjuntivo ocorre de sete a quatorze dias
após a injúria, o que corresponde ao período de maior ganho em força de tensão9.
A angiogênese é caracterizada por novos capilares sanguíneos com origem naqueles
pré-existentes e, consequentemente, pelo restabelecimento da oxigenação e nutrição ao tecido
de granulação recém-formado, em resposta ao dano tecidual e à hipóxia. O estímulo
angiogênico inicia-se no segundo dia após a injúria e é induzido por fatores de crescimento,
quimiocinas e enzimas angiogênicas, além de moléculas de adesão como integrinas, a maior
parte liberada na fase inflamatória9. Após a reconstituição completa do estroma e o
preenchimento do sítio da ferida, não há mais necessidade de um fluxo sanguíneo intenso. Nesse
momento, os estímulos pró-angiogênicos diminuem e os estímulos antiangiogênicos
aumentam18,19, o que faz com que a maior parte da rede capilar recém-formada regrida, pela
ação de metaloproteinases de matriz (MMP) e apoptose seletiva de células endoteliais20.
A epitelização ou reepitelização é o processo de restabelecimento de uma superfície
epitelial exposta. A proliferação dos queratinócitos basais das margens da ferida tem início de
um a dois dias após a injúria, assim como a migração das células epiteliais, sendo necessário
um leito de granulação por onde estas possam se deslocar9. Quimiocinas, citocinas, integrinas,
queratinas, moléculas da matriz extracelular e MMP são responsáveis pela modulação da
proliferação e migração dos queratinócitos durante a epitelização21.
2.1.3. Fase de maturação ou remodelamento
A fase de maturação ou remodelamento se inicia por volta da terceira semana após
a injúria e pode durar mais de um ano, a depender da genética do paciente, idade, local e tipo
da lesão e duração da inflamação9. A matriz extracelular madura é uma superfície não celular
composta de proteínas, glicosaminoglicanos, polissacarídeos e água, que facilita a comunicação
bidirecional entre as células e seu ambiente bioquímico e biofísico22. Durante o remodelamento,
a atividade sintética de fibroblastos diminui, havendo pouco ganho em força de tensão9. Os
fibroblastos sofrem apoptose ou são diferenciados em miofibroblastos para participar da
contração da ferida23, que tem início na segunda semana e melhora a aparência da cicatriz.
A contração é uma combinação de forças geradas por fibroblastos migratórios e
miofibroblastos, que são os elementos celulares mais abundantes do tecido de granulação
saudável, sendo que a sua concentração é proporcional à necessidade de contração da ferida.
Essa fase pode ser subdividida em fase de contração tardia, em que as bordas da ferida retraem
e sua área aumenta temporariamente, o que ocorre antes da migração de fibroblastos; fase de
7
contração rápida e fase de contração lenta, quando a ferida se aproxima do fechamento
completo. A contração cessa em resposta a um dos seguintes eventos: ou as bordas da ferida se
encontram, causando inibição por contato; ou a tensão da pele adjacente se torna igual ou maior
à força contrátil dos miofibroblastos ou a concentração dessas células é insuficiente, o que faz
com que a ferida se torne crônica e o tecido de granulação assuma uma pálida9.
O processo de contração é mais rápido em locais onde a pele é mais “solta”9 e,
quando se encerra, os miofibroblastos são eliminados por apoptose23 ou se diferenciam em
fibroblastos quiescentes24. Em lesões crônicas ou fibrosas, há persistência de miofibroblastos,
que podem estar envolvidos no acúmulo de mais matriz extracelular e na contratura patológica,
processo que ocorre em locais próximos a orifícios corporais e articulações, mas raro em
equinos9.
A fase final do processo de cicatrização é a maturação, em que há conversão da
matriz extracelular do tecido de granulação em tecido cicatricial e que consiste da síntese, lise
e remodelamento do tecido conjuntivo. Nas três primeiras semanas após a injúria há equilíbrio
entre síntese e lise do colágeno. As primeiras fibras colágenas são depositadas de forma
aleatória e, durante o remodelamento, são reorganizadas de forma a proporcionar maior força
de tensão à ferida. O remodelamento depende de proteinases liberadas de células inflamatórias
e mesenquimais, como as metaloproteinases, que pouco atuam na pele normal, mas são
amplamente recrutadas à necessidade de proteólise. Essas enzimas são essenciais ao
remodelamento, mas também podem ser responsáveis pela cronicidade das feridas9.
A homeostase entre síntese e lise do colágeno depende da ação simultânea de MMP
e seus inibidores não específicos e específicos, os inibidores teciduais das metaloproteinases
(TIMP). O desequilíbrio entre as MMP e os TIMP leva ao atraso no reparo e à resolução
anormal da cicatrização. O resultado do processo de reparo é uma cicatriz madura, avascular e
acelular, com substituição do colágeno tipo III pelo I e proteoglicanos. Em equinos, as feridas
completamente cicatrizadas por segunda intenção têm apenas 60% da força de tensão da pele
intacta9.
2.2. Enxertos de pele
Os enxertos de pele podem ser classificados conforme sua espessura, sendo
considerados de espessura total os constituídos de epiderme e derme em sua totalidade; e parcial
aqueles constituídos de epiderme e somente uma porção da derme. A espessura da derme pode
variar entre indivíduos da mesma espécie e entre regiões do corpo do indivíduo. Em cavalos, a
espessura da pele pode variar de 1-5 mm, a depender da região corpórea25.
8
Outra classificação considera a fonte vascular dos enxertos, podendo ser
pediculados ou livres. Os pediculados são enxertos de espessura total, que se mantêm ligados
ao sítio doador através da vasculatura. Esse tipo de enxerto é pouco utilizado em equinos devido
à dificuldade de mobilizar a quantidade adequada de pele nesses animais26,27. Os enxertos livres
são aqueles em que um fragmento de pele é destacado da sua fonte de suprimento sanguíneo
original e transferido a uma ferida em outro local, onde, para sobreviver, deve criar novas
conexões vasculares. Esse tipo de enxerto é ainda classificado, de acordo com sua origem, em
autoenxertos ou isoenxertos, que são obtidos de uma área e inseridos em outra do mesmo
indivíduo e são o tipo mais comum de enxerto livre; aloenxertos ou homoenxertos, que são
realizados entre indivíduos diferentes da mesma espécie; e, por fim, xenoenxertos ou
heteroenxertos, que são realizados entre indivíduos de espécies diferentes25. Os aloenxertos e
os xenoenxertos estabelecem novas conexões vasculares com o sítio receptor, mas geralmente
sofrem rejeição devido à resposta imune do receptor28.
Deve-se considerar a realização de enxertos cutâneos em defeitos de pele de
espessura total, onde não há possibilidade de cicatrização por primeira intenção e que,
provavelmente, levarão um tempo prolongado para finalizar o seu fechamento completo. Na
clínica de equinos, as feridas de pele são uma ocorrência muito comum, principalmente aquelas
em membros distais, em que a cicatrização é difícil. Nesses casos, os enxertos de pele são uma
boa alternativa para acelerar a finalização do processo de reparo (Figura 3). A escolha do tipo
de enxerto a ser realizado depende da localização e do tamanho da ferida, da aparência
cosmética desejada, dos equipamentos disponíveis, da habilidade do cirurgião e dos recursos
financeiros do proprietário25.
Para o aceite e a integração dos enxertos, a ferida deve ser bem vascularizada e livre
de infecção e de tecido necrótico. Feridas recentes ou criadas cirurgicamente geralmente são
limpas e muito vascularizadas, assim como feridas com tecido de granulação saudável, o que
as faz ideais a receber enxertos29,30. A maioria dos tecidos é capaz de receber e aceitar enxertos,
à exceção do tecido ósseo desprovido de periósteo, tecido tendíneo sem paratendão ou tecido
cartilaginoso sem pericôndrio. Ainda, alguns tecidos apresentam maior resistência ao aceite de
enxertos, como tecido adiposo, cápsula articular e ligamentos25.
9
FIGURA 3 – Ferida extensa e com grande perda tecidual em região de metatarso equino. A)
Ferida uma semana após a injúria, com exposição óssea e tecido necrosado. B)
Ferida durante o tratamento, em processo de granulação e livre de infecção.
Quando a granulação torna regular, a ferida estará apta a receber enxerto.
Fonte: Arquivo pessoal.
2.2.1. Eventos fisiológicos associados à integração do enxerto
a) Revascularização
A primeira ligação entre o enxerto e a ferida ocorre pela adesão da fibrina, presente
na granulação, ao colágeno exposto do enxerto31. Inicialmente o enxerto é nutrido pela
embebição plasmática, processo pelo qual o transudato é inserido passivamente, por ação dos
capilares, pelo lúmen exposto dos vasos do enxerto32,33, e que dura aproximadamente 48 horas.
Enquanto isso, o enxerto não possui suprimento sanguíneo próprio, o que leva a uma baixa
tensão de oxigênio local e, consequentemente, atividade mitótica reduzida das células do
enxerto. O estado de hipóxia faz com que o metabolismo se torne anaeróbio, levando ao
acúmulo de metabólitos. Nesse momento, o enxerto se torna edematoso25.
Depois das primeiras 48 horas há inosculação, processo pelo qual novos capilares
da ferida atravessam a matriz extracelular e de fibrina para realizar anastomose com os capilares
do enxerto33,34. A neovascularização ocorre em seguida, quando os capilares da ferida invadem
vasos pré-existentes no enxerto e formam novos canais vasculares para a sua derme. O enxerto
10
se revasculariza completamente por volta do quinto dia e depois disso pode ser considerado
integrado à ferida, mas é só depois do décimo dia que a adesão se torna firme25. A circulação
linfática é restabelecida por volta do sétimo dia, o que leva à resolução do edema34. É possível
que ocorra falha na revascularização da porção superior do enxerto, que se torna necrótica e
desintegra, deixando a derme vascularizada ou a granulação à mostra25.
b) Contração do enxerto e da ferida
As fibras de elastina das camadas mais profundas do fragmento de pele a ser
enxertado recuam e fazem com que o enxerto contraia imediatamente após sua colheita, evento
chamado contração primária35. A contração secundária é a que ocorre após a integração do
enxerto e depende de fatores que incluem a espessura da derme do enxerto, a fase da
cicatrização em que o leito recipiente se encontra no momento da enxertia, a porcentagem da
área enxertada e fatores mecânicos. A contração tende a ser mais rápida em enxertos de
espessura total e lenta em feridas recentes em comparação àquelas preenchidas com tecido de
granulação25.
Citocinas ainda não identificadas na derme do enxerto podem explicar o estímulo
que a enxertia fornece à contração da ferida, mesmo quando não há integração35. Essa
aceleração da contração também se explica pelo fato de que a camada superficial do tecido de
granulação contém leucócitos, que não são encontrados abaixo do novo epitélio que avança das
bordas da ferida, ou seja, quando há maior área de epitelização fornecida pelo enxerto, há menos
células inflamatórias e, consequentemente, redução da inflamação25.
A resposta das feridas dos equinos a fatores derivados dos enxertos é determinada
principalmente pela idade da granulação e concentração e estágio de diferenciação dos
miofibroblastos. A contração é mais lenta quando o enxerto é realizado logo após a injúria, pois
os miofibroblastos ainda não infiltraram na ferida, e quando o tecido de granulação se
transformou em fibrose, momento em que não há mais miofibroblastos36,37.
2.2.2. Causas de falha na integração do enxerto
Apesar de o tecido de granulação contar com quantidade abundante de vasos
sanguíneos e células fagocíticas, que atuam como barreira contra a invasão bacteriana31,38,39, a
principal causa de falha na integração do enxerto é a infecção38. Todas as feridas possuem uma
população saprófita de bactérias, porém quando a concentração bacteriana ultrapassa a
contagem de 105 organismos por grama de tecido, a ferida é considerada infectada e não deve
receber enxerto. Porém, essa análise quantitativa é impraticável à maioria dos clínicos25.
11
Ressalte-se que alguns tipos de bactérias, como Streptococcus e Pseudomonas spp, produzem
enzimas proteolíticas que degradam o elo fibrinoso entre o leito de granulação e o enxerto.
Dessa forma, uma contagem inferior a 105 organismos por grama de tecido é suficiente para
que a ferida seja considerada infectada por essas bactérias31.
A inflamação crônica também é causa de falha na integração do enxerto, pois leva
à produção de quantidade moderada de exsudato purulento, que contém enzimas de degradação
prejudiciais à qualidade do tecido de granulação e que, consequentemente, reduzem a taxa de
aceitação do enxerto40. O acúmulo de fluido abaixo do enxerto, como sangue, soro ou exsudato,
também atrapalha a ligação fibrinosa entre o enxerto e o leito de granulação, o que obstrui a
revascularização e causa falha na integração34.
O enxerto deve permanecer imóvel após a sua inserção na ferida, pois o movimento
causa rompimento de sua ligação fibrinosa com o tecido de granulação, impedindo que ocorram
a embebição plasmática e a revascularização. Locais de alta mobilidade como articulações,
podem receber gesso, que deve permanecer de uma semana a dez dias. As trocas de curativo
devem ser realizadas com cautela, pois também podem causar a remoção física do enxerto25.
2.2.3. Preparação do sítio receptor do enxerto
A aceitação do enxerto varia de acordo com o estágio do processo de cicatrização
em que a ferida se encontra. Feridas recentes ou chamadas frescas aceitam melhor o enxerto,
seguidas do tecido de granulação recém-formado, e do tecido de granulação maduro ou fibroso,
pois a vascularização diminui à medida que a ferida se torna madura25. Assim, nesses casos, o
tecido fibroso deve ser excisado antes da realização do enxerto41.
Feridas crônicas ou com pontos de drenagem também devem ser investigadas antes
de receber o enxerto, pois pode haver corpos estranhos ou comprometimento ósseo, tendíneo,
ligamentar ou de estruturas sinoviais. Nesses casos, é indicada a realização de exames de
imagem, como radiografia e ultrassonografia, para confirmar condições como sequestro ósseo
ou osteíte séptica, que prejudicam o fechamento da ferida25.
Quando a ferida é considerada infectada, deve-se instituir tratamento com
antimicrobianos antes da realização do enxerto. A aplicação tópica é mais eficiente que o uso
sistêmico de antibióticos, pois a fibrina localizada na base do tecido de granulação impede a
penetração adequada do fármaco, que não alcança a concentração terapêutica adequada na
ferida42. É comum a contaminação da ferida por bactérias do tipo Streptococcus ou
Pseudomonas spp. Os Streptococcus são susceptíveis à penicilina ou outros β-lactâmicos,
porém outras bactérias presentes na ferida podem secretar β-lactamase. Assim, é importante
12
associar ao clavulanato de potássio ou ácido clavulânico, inibidores dessa enzima43. Já as
Pseudomonas, que produzem exsudato de coloração azul-esverdeada, geralmente são sensíveis
à sulfadiazina de prata, aminoglicosídeos e polimixina B25.
Além do uso de antimicrobianos, o debridamento é um método eficaz para reduzir
o risco de infecção ou inflamação crônica25. O tecido de granulação exuberante pode ser
excisado um pouco abaixo ou no mesmo nível da pele adjacente, pelo menos 24 horas antes da
realização do enxerto44, o que implica na remoção física da maior parte da carga bacteriana,
células inflamatórias e debris, melhorando, consequentemente, o microambiente da ferida25. A
inflamação crônica também pode ser reduzida com uma única aplicação de corticosteroide,
cerca de dois dias antes do enxerto, auxiliando na sua integração45.
O tecido de granulação ideal para receber o enxerto é firme, plano, sem muitas
irregularidades, de coloração vermelha, bem vascularizado e pode produzir secreção
serossanguinolenta ou até mesmo purulenta, desde que em pequena quantidade (Figura 4). A
aderência do curativo à ferida, devido à fibrina, e o novo epitélio que avança de suas bordas são
indicativos de que a ferida está livre de infecção e pronta a receber o enxerto25. No momento
do procedimento, a pele ao redor da ferida pode receber antissepsia cirúrgica, porém a ferida
deve ser limpa apenas com solução salina, pois os detergentes cirúrgicos são citotóxicos e
aumentam a susceptibilidade à infecção, além de evocar maior inflamação. A superfície da
ferida deve ser limpa com gaze para a remoção de debris fibrinosos46.
A escolha do sítio doador depende do tipo de enxerto a ser realizado e se a colheita
será com o animal em posição quadrupedal ou sob anestesia geral. O local deve receber
tricotomia, preparo cirúrgico e também deve ser enxaguado com solução salina, já que os
detergentes e desinfetantes cirúrgicos são, como dito, prejudiciais à aceitação do enxerto no
sítio recipiente. Para a obtenção de melhor resultado cosmético, deve-se levar em conta a
orientação do crescimento piloso ao momento da colheita e do implante25.
13
FIGURA 4 – Ferida experimentalmente induzida em região glútea
de equino apresentando tecido de granulação ideal
para a inserção de enxerto.
Fonte: Arquivo pessoal.
2.2.4. Cuidados pós-operatórios
Após o procedimento cirúrgico, realiza-se curativo oclusivo com material não-
aderente. A qualidade do curativo é de grande importância, pois este fornece proteção contra
infecção, auxilia a limitar a mobilidade local, absorve secreções produzidas pela ferida, além
de exercer pressão no enxerto, o que previne o acúmulo de fluido sob o mesmo. A primeira
camada do curativo deve ser realizada com membrana estéril contendo antimicrobianos e pode
ser suturada se a região possuir grande mobilidade25. Se a ferida localiza-se em membros, a
segunda camada deve ser volumosa, para limitar a mobilidade local ou, ainda, há possibilidade
de imobilização com bandagem Robert Jones, talas ou gesso47.
É preconizado que o curativo seja mantido no lugar de sete a nove dias, para evitar
que as frágeis conexões fibrinosas e vasculares entre o enxerto e a ferida sejam interrompidas
mecanicamente. A aderência do curativo à ferida é considerada um bom sinal, pois pode indicar
que o enxerto também está bem aderido. A troca de curativo deve ser realizada precocemente
quando da suspeita de infecção25.
2.3. Plaquetas
As plaquetas foram descobertas em 1865 e somente após duas décadas foi
estabelecida sua função na mediação da hemostase, quando sugeriu-se que essas pareciam
14
associar-se aos leucócitos. Atualmente, sabe-se que as plaquetas apresentam ação importante
na hemostasia e também na imunidade, e as suas funções são profundamente estudadas13.
2.3.1. Anatomia e função das plaquetas
As plaquetas são pequenos fragmentos citoplasmáticos discoides, de
aproximadamente 1-3 μm de diâmetro, originados dos megacariócitos na medula óssea.
Possuem um citoesqueleto contrátil na periferia, que contém actina e miosina, e estruturas
intracelulares, como lisossomos e dois tipos de grânulos. Os grânulos densos contêm adenosina-
difosfato (ADP), adenosina-trifosfato (ATP), serotonina e cálcio, enquanto os α-grânulos
contêm fatores de coagulação e crescimento e outras proteínas48. Estudos identificaram
aproximadamente 4.000 proteínas derivadas das plaquetas, com pequena variação entre
indivíduos49. Quando em latência, as plaquetas não são trombogênicas e necessitam de estímulo
para sua ativação. Depois de ativadas, alteram sua forma e desenvolvem pseudópodes, que
promovem a agregação plaquetária e a liberação do conteúdo dos seus grânulos (Figura 5)5.
Outros estudos mostraram que a degranulação depende do tipo de estímulo recebido, ou seja,
as plaquetas liberam grânulos inflamatórios ou hemostáticos a depender do estímulo, embora
os mecanismos moleculares exatos que justificam essa capacidade ainda não tenham sido
completamente esclarecidos50,51.
FIGURA 5 - Esquema de plaqueta em suas formas inativa (esquerda) e ativa (direita). Quando
ativadas, as plaquetas mudam de forma e desenvolvem pseudópodes, que promovem
a agregação plaquetária e a liberação dos seus grânulos.
Fonte: Adaptado de Everts et al5.
15
Além da ação primordial na hemostasia, as plaquetas podem ser consideradas
sentinelas do processo imune, pois auxiliam o início e a organização da inflamação. Sua
interação precoce com o endotélio fornece moléculas de adesão e estímulos quimiotáticos para
o recrutamento de leucócitos. A ativação leucocitária é aumentada pela formação dos agregados
leucócito-plaquetários e liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios, que modulam a
diferenciação das células imunes. As plaquetas são ainda capazes de internalizar e agregar
patógenos, embora sua capacidade de destruí-los seja limitada13. As funções das plaquetas são
abordadas separadamente abaixo, embora se sobreponham.
a) Hemostasia
As plaquetas exercem ação central na hemostasia, que é caracterizada por interação
balanceada entre estas, a vasculatura e as proteínas plasmáticas de coagulação5. Em condições
normais, as células endoteliais inibem a adesão plaquetária a partir de uma série de mediadores.
Após uma injúria, os mecanismos protetivos são inibidos e essas células ativadas, passando a
expressar P-selectina em sua superfície, onde as plaquetas se aderem e são ativadas52. As
plaquetas ativadas translocam moléculas de adesão para sua superfície, que são ligantes para
leucócitos e outras plaquetas, e ocorre, assim, agregação plaquetária com posterior liberação do
conteúdo dos seus grânulos13. A serotonina leva à vasoconstrição, o ADP estimula a liberação
dos grânulos de outras plaquetas e outros agentes liberados levam à ativação da fosfolipase A2
da membrana plaquetária. Segue-se a liberação do ácido araquidônico, que é convertido em
tromboxano A2 e também causa agregação plaquetária e liberação de fatores de crescimento.
Assim é formado um plug plaquetário, que contém a hemorragia e protege o local da injúria
contra a entrada de microrganismos. Esse processo é denominado hemostasia primária53.
A hemostasia secundária é caracterizada pela ativação dos fatores de coagulação e
pela formação da rede de fibrina que estabiliza o plug plaquetário54. O evento seguinte é a
fibrinólise, em que o sistema fibrinolítico é ativado através de citocinas liberadas por leucócitos
que foram recrutados pelos fatores de crescimento e citocinas previamente liberados pelas
plaquetas5. Dessa forma, plaquetas e proteínas liberadas por seus grânulos participam de todas
as etapas da hemostasia.
b) Cicatrização de feridas
A cicatrização é um processo complexo, que envolve uma série de interações entre
células e matriz extracelular. As plaquetas também são importantes nesse processo e participam
de todas as fases, através da liberação dos fatores de crescimento, que são mediadores de vários
16
eventos envolvidos na cicatrização. A secreção ativa desses fatores de crescimento é estimulada
pela coagulação e tem início aproximadamente dez minutos após a formação do coágulo. Após
essa liberação inicial, as plaquetas continuam sintetizando e liberando-os por até sete dias55.
O fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento
transformador-β (TGF-β) são os mais importantes no início da resposta inflamatória, pois além
de estimular a degranulação de outras plaquetas, são quimiotáticos e mitogênicos para células
inflamatórias56,57. O PDGF, em especial, leva ao aumento da resposta inflamatória através do
estímulo ao influxo de neutrófilos e macrófagos57, além de aumentar a deposição de matriz
extracelular58. O fator de crescimento de fibroblastos (FGF) possui ação quimiotática e
mitogênica para fibroblastos, que iniciam a produção do colágeno, assim como TGF-β, que
também estimula a colagenização. O fator de crescimento epidermal (EGF) leva a à aceleração
da epitelização59, enquanto que o FGF e o PDGF estimulam a contração da ferida e seu
remodelamento durante a última fase do processo de cicatrização57,60.
c) Imunidade
Os chamados ligantes hemostáticos como trombina, tromboxano A2 e ADP
exercem função na regulação da inflamação e, consequentemente, na resposta imunológica61.
A inibição terapêutica da trombina mostrou resultados promissores em doenças hepáticas62,
sepse63 e lesão renal de isquemia e reperfusão64. O bloqueio dos receptores de ADP pode
atenuar a inflamação na sepse65. Além disso, as plaquetas expressam vários receptores toll-like,
reconhecedores de patógenos, e têm a habilidade de se ligar a bactérias e formar agregados,
através de mecanismo patógeno-dependente66.
As plaquetas possuem capacidade de englobar bactérias e vírus menores por
mecanismo similar à fagocitose67. Esses micro-organismos usam dessa capacidade para driblar
a resposta imune do hospedeiro68 e, dessa forma, as plaquetas podem ajudar na sua
disseminação69. Aparentemente as plaquetas são incapazes de lisar os patógenos internalizados
por não possuírem organelas bactericidas, mas podem auxiliar na sua eliminação70 pela
liberação de peptídeos antimicrobianos, incluindo quimiocinas clássicas68.
A interação com células da resposta imunológica se dá através da formação de
agregados leucócito-plaquetários, cuja presença tem sido identificada como parâmetro clínico
para avaliação da severidade da sepse71. A interação entre plaquetas e neutrófilos apresenta
meia-vida curta, mas faz sinalização a outros leucócitos, ativa as integrinas de outros
neutrófilos, promove degranulação de outras plaquetas e aumenta a fagocitose72. Os agregados
formados rapidamente, abundantemente e de forma estável são aqueles entre monócitos e
17
plaquetas. Os monócitos ativados pelas plaquetas se transformam em um fenótipo pró-
inflamatório, são recrutados e emigram mais eficientemente para os sítios de inflamação73. A
interação entre plaquetas e macrófagos pró-inflamatórios também demonstrou aumentar a
ativação dos macrófagos74. As plaquetas também parecem interagir com células dendríticas,
modulando sua diferenciação, maturação e ativação75. Os agregados com linfócitos são menos
investigados. A ativação dessas células mediada pelas plaquetas promove recrutamento e
ativação de células T, B e natural killers76.
2.4. Plasma rico em plaquetas - PRP
2.4.1. Definição
O PRP é uma preparação de plasma autólogo enriquecido com concentração
plaquetária acima daquela contida no sangue total77. O seu potencial terapêutico é atribuído à
capacidade das plaquetas de liberar e suprir quantidades suprafisiológicas de fatores de
crescimento essenciais e citocinas, que promovem estímulo regenerativo, melhorando o
processo de cicatrização78.
Os primeiros relatos de seu uso clínico são das décadas de 1980/1990, em cirurgia
cardíaca, dental e maxilofacial79,80. Atualmente, o PRP ganhou popularidade na medicina
regenerativa, esportiva e musculoesquelética, com seus potenciais benefícios no tratamento de
ampla gama de desordens degenerativas, devido à sua influência no reparo81. Porém, ainda há
muitas questões a investigar a respeito do uso e da eficácia desse produto, como métodos de
obtenção e dose adequada para cada tipo de tratamento, melhor randomização dos estudos
clínicos, utilização de maior número de amostras nos estudos, acompanhamento posterior por,
no mínimo, dois anos e comparação entre preparados com ou sem leucócitos78.
2.4.2. Método de obtenção e preparo
Ainda não há consenso sobre o melhor método de obtenção do PRP e concentrações
adequadas dos componentes sanguíneos que o constituem78, sendo que cada formulação tem
suas propriedades biológicas e efeitos, o que torna ainda mais difícil a formulação de conclusões
embasadas sobre a eficácia do produto82. Inicialmente eram utilizadas máquinas
semiautomáticas separadoras de células, por meio das quais se obtinha de 20-50 ml de PRP a
partir de 250-500 ml de sangue total. Atualmente, o método de obtenção mais utilizado é
baseado em duas centrifugações, em que se obtém um menor volume de PRP a partir de
menores volumes de sangue total5, que é separado em três camadas: plasma, camada
18
leucocitária e hemácias83 A escolha do melhor método depende da utilidade, do tipo de
procedimento cirúrgico e do volume final de plasma necessário5.
As plaquetas necessitam de ativação para sair do seu estado de latência, porém
também não há consenso sobre a ativação ou não do PRP. Após a ativação, aproximadamente
70% dos fatores de crescimento são liberados nos primeiros dez minutos84. O PRP ativado com
mistura de trombina e cálcio, em doses baixas, leva à liberação desses fatores durante sete dias,
em comparação com o PRP não ativado85. Por outro lado, quando há ativação, a diferenciação
dos fibroblastos é menos eficiente e, consequentemente, a cicatrização também se torna menos
eficiente. Assim, a ativação pode acelerar a liberação dos fatores de crescimento, mas pode não
ser ideal à otimização dos efeitos terapêuticos do PRP, principalmente na cicatrização de
feridas86.
A trombina é o mais potente ativador de plaquetas e induz a liberação imediata de
PDGF87. A trombina proveniente do plasma bovino é disponível comercialmente, mas seu uso
já foi associado ao desenvolvimento de anticorpos contra alguns fatores de coagulação, o que
pode caracterizar risco ao desenvolvimento de coagulopatias88. O TRAP é um peptídeo sintético
que mimetiza a ação da trombina e leva à liberação mais sustentada e a aumento da
concentração de alguns fatores de crescimento89. Destaca-se que o tempo de estocagem diminui
a atividade biológica do PRP90.
2.4.3. Componentes
Apesar de ser um concentrado de plaquetas, o PRP também possui outras células
sanguíneas em menor quantidade, como leucócitos e hemácias. As plaquetas, como descrito,
exercem ação central na mediação dos efeitos anabólicos do PRP pela liberação do conteúdo
dos seus grânulos, e são responsáveis pelo estímulo ao recrutamento, diferenciação,
comunicação e migração celular, além da formação da matriz de fibrina e outras funções
essenciais86. A concentração ideal de plaquetas a ser obtida no PRP ainda é controversa e
necessita de mais estudos. Dados da literatura sugerem que concentrações de duas a quatro
vezes maiores do que a do sangue total devem ser atingidas, e que quantidades muito maiores
podem não trazer benefício ou até mesmo inibir o reparo91. Os dispositivos de separação mais
recentes obtêm concentração de plaquetas seis a dez vezes maior do que a do sangue total, o
que tende a ser um parâmetro qualitativo para os fabricantes5.
Os leucócitos são mediadores essenciais nas respostas inflamatória e imunológica,
e no processo de cicatrização92. Os neutrófilos são recrutados logo no início da fase inflamatória
do reparo, enquanto que monócitos e macrófagos são responsáveis pela fagocitose de bactérias
19
e debridamento do tecido necrótico. Os macrófagos, assim como as plaquetas, também secretam
fatores de crescimento83. Apesar de sua ação benéfica, estudos in vitro mostraram que a alta
concentração dessas células no PRP pode aumentar a resposta inflamatória local de forma
prejudicial93. Há, ainda, um estudo que descreve que a diminuição da concentração de
leucócitos e, em consequência, a diminuição da resposta inflamatória, pode ser benéfica para a
otimização do PRP em comparação ao aumento da concentração de plaquetas91.
As hemácias, por meio da hemoglobina, têm a função primária de carreamento e
distribuição de oxigênio e outros gases metabólicos, nutrientes e moléculas regulatórias, como
óxido nítrico, que estimula a vasodilatação. Durante o estresse oxidativo, o ferro contido nas
heme-moléculas pode liberar radicais livres de oxigênio, que são citotóxicos e podem induzir
apoptose92. Dessa forma, essas células devem ser reduzidas em número ou eliminadas do PRP,
principalmente quando do uso intra-articular78.
2.4.4. Aplicações
O PRP é um produto seguro por ser derivado do sangue autólogo, o que minimiza
o risco de transmissão de doenças infectocontagiosas. Porém, deve-se realizar avaliação
hematológica antes do seu uso, de forma a excluir disfunções plaquetárias. O uso do PRP é
contraindicado quando a contagem de plaquetas é inferior a 105/μl, a hemoglobina inferior a
10g/dl ou quando houver tumores, doenças metastáticas ou outras infecções ativas5.
A aplicação do PRP não é recomendada em indivíduos que estejam recebendo
medicação antiplaquetária, pois pode haver inibição da degranulação e liberação dos fatores de
crescimento. Agentes antiplaquetários estão presentes em fármacos de várias classes, como
inibidores reversíveis e irreversíveis de cicloxigenases, inibidores de receptores de ADP e
inibidores de fosfodiesterase94. O PRP autólogo produzido com o sangue de indivíduos que
fazem uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) apresenta redução na agregação
plaquetária e, consequentemente, em seu potencial terapêutico95.
20
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25
CAPÍTULO 2 - MÉTODO DE DUPLA CENTRIFUGAÇÃO PARA
OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS
DOUBLE CENTRIFUGATION METHOD FOR PLATELET RICH PLASMA
OBTENTION
RESUMO: Não há um consenso na literatura quanto ao melhor método de obtenção do plasma
rico em plaquetas (PRP) ou à concentração plaquetária ideal com o objetivo de resultados
positivos ao estímulo à reparação tecidual. Além disso, alguns métodos descritos são de difícil
reprodução. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de obtenção de
PRP que seja simples, barato e reprodutível. O método foi padronizado em equinos e o
protocolo utilizado baseou-se em dupla centrifugação, sendo a primeira a 900 rpm por um
minuto e a segunda a 1800 rpm por cinco minutos. Conclui-se que o método de dupla
centrifugação, uma em baixa e outra em alta rotação, resulta em PRP com concentração
plaquetária, em média, 3,23 vezes acima da concentração basal do sangue total, o que é
considerado adequado ao uso terapêutico. Ainda, o protocolo aplicado constitui-se em método
simples, facilmente reprodutível e de baixo custo à obtenção do PRP autólogo em equinos.
Palavras-chave: concentração plaquetária, dupla centrifugação, cicatrização.
ABSTRACT: There is no consensus in the literature about the best method of obtaining platelet
rich plasma (PRP) or ideal platelet concentration with the objective of positive results in
stimulating tissue repair. In addition, some methods described are difficult to reproduce.
Therefore, the objective of this study was to develop a method of obtaining PRP that is simple,
cheap and reproducible. The method was standardized in horses and the protocol used was
based on double centrifugation, the first one at 900 rpm for one minute and the second at 1800
rpm for five minutes. It is concluded that the double centrifugation method, one in low and one
in high rotation, results in PRP with platelet concentration, on average, 3,23 times above the
basal total blood concentration, which is considered adequate for therapeutic use. Moreover,
the protocol applied is a simple, easily reproducible and low-cost method to obtain autologous
PRP in horses.
Keywords: double centrifugation, platelet counting, wound healing.
26
INTRODUÇÃO
As plaquetas são células sanguíneas pequenas e discoides (1-3 μm de diâmetro),
originadas dos megacariócitos na medula óssea e possuem dois tipos de grânulos intracelulares.
Os grânulos densos armazenam adenosina-difosfato (ADP), adenosina-trifosfato (ATP),
serotonina e cálcio, enquanto os α-grânulos armazenam fatores de coagulação, fatores de
crescimento e outras proteínas1. Quando em latência, as plaquetas não são trombogênicas,
necessitando de estímulo para ativação, que ocorre através do seu contato com o colágeno, por
exemplo. Depois de ativadas, alteram-se morfologicamente e desenvolvem pseudópodes, que
promovem agregação plaquetária e liberação do conteúdo dos seus grânulos2. Sabe-se que essas
células exercem papel primordial na hemostasia, além de consideradas células imunes
sentinelas, que auxiliam no início e organização dos eventos inflamatórios3.
O plasma rico em plaquetas (PRP) é definido como uma preparação de plasma
autólogo, enriquecido com uma concentração plaquetária acima daquela presente no sangue
total4. Diversos métodos de obtenção são descritos na literatura, sendo a maioria baseada em
uma ou duas centrifugações do sangue autólogo, colhido com uso de anticoagulante5. Seu
potencial terapêutico consiste na capacidade das plaquetas de liberar e suprir quantidades
suprafisiológicas de fatores de crescimento e citocinas, que promovem estímulo regenerativo e
auxiliam no processo de cicatrização6.
Os fatores de crescimento são peptídeos sinalizadores liberados pelos α-grânulos
plaquetários e possuem papel central nos processos de regeneração e cicatrização tissular.
Interagem com receptores da superfície celular, aumentando a transcrição gênica e a síntese
proteica. As proteínas sintetizadas desencadeiam a proliferação e diferenciação celular, além
de estimular a produção de matriz extracelular e a angiogênese, favorecendo o processo de
reparo tecidual. Os fatores de crescimento de maior relevância incluem o Fator de Crescimento
Derivado das Plaquetas (PDGF), Fator de Crescimento Transformador-β (TGF-β), Fator de
Crescimento Vascular Endotelial (VEGF), Fator de Crescimento de Fibroblastos (FGF), Fator
de Crescimento Semelhante à Insulina (IGF) e Fator de Crescimento Epidermal (EGF)7.
Os primeiros relatos do uso clínico do PRP datam da década de 1980, em cirurgias
cardiotorácicas e maxilofaciais8. Atualmente, seu uso se expandiu para áreas de cirurgia plástica
e ortopedia, além da medicina esportiva9. Em modelos animais, o uso do PRP já foi relatado
em estudos envolvendo a neovascularização da córnea em coelhos e regeneração do tecido
conjuntivo e reepitelização de feridas cirúrgicas10. Em equinos, o PRP vem sendo pesquisado
27
desde o início dos anos 2000 em tratamento de feridas, tendinites, desmites, osteoartrites e
consolidação de fraturas11.
Os métodos descritos para a obtenção do PRP consistem em centrifugações, com o
objetivo de concentrar as plaquetas e reduzir hemácias e leucócitos12. São descritos dois tipos
de protocolo. O primeiro consiste em uma centrifugação lenta e curta, com isolamento do
plasma e plaquetas e redução da concentração de hemácias e leucócitos. Nesse caso, obtém-se
um número de plaquetas de uma a três vezes acima do nível sérico basal do indivíduo; o segundo
consiste em duas centrifugações, sendo a segunda mais rápida e longa que a primeira. Nesse
caso, obtém-se um número maior de plaquetas, de três a oito vezes acima do nível sérico basal
do indivíduo, porém hemácias e leucócitos permanecem no preparo.
Há vasta literatura acerca do PRP, porém os estudos são distintos entre si no que
diz respeito, principalmente, à metodologia aplicada a sua obtenção. Dessa forma, há
dificuldade na padronização de novos estudos e comparação dos resultados a partir dos
trabalhos disponíveis13. Dessa forma, objetivou-se padronizar uma técnica simples, barata e
facilmente reprodutível para a obtenção do PRP em concentração terapêutica adequada, a fim
de tornar seu uso uma alternativa viável na prática da clínica de equinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos envolvendo os animais deste estudo foram aprovados pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Goiás, CEUA/UFG (processo
074/2016). Foram utilizados oito equinos hígidos, sendo cinco machos e três fêmeas, sem raça
definida, com idade variando entre três e 18 anos e peso vivo médio de 350 kg.
O sangue dos animais foi colhido assepticamente, através de punção jugular, com
sistema de tubo a vácuo e agulha 21G, contendo citrato de sódio a 3,2%. Foram preenchidos
cinco tubos, com capacidade para 4,5 ml cada um, totalizando 22,5 ml de sangue de cada
animal. Os tubos foram devidamente homogeneizados e encaminhados ao laboratório.
Inicialmente, foi realizada contagem automática de plaquetas (Analisador Hematológico Nihon
Kohden Celltac Alpha) de um dos tubos contendo sangue total, com a finalidade de estabelecer
a contagem plaquetária basal de cada animal. Após 10 minutos, período destinado à
sedimentação natural das hemácias nos tubos, estes foram submetidos a centrifugação por um
minuto, em baixa rotação (900 rpm), resultando na formação de duas colunas: uma inferior,
formada pelas hemácias; e outra superior, formada pelo plasma e plaquetas em suspensão. Entre
essas duas colunas, formou-se uma estreita faixa esbranquiçada, denominada zona de névoa
28
(buffy-coat), formada por plaquetas maiores e leucócitos. O plasma foi cuidadosamente
pipetado em sua totalidade e transferido para um novo tubo, sem anticoagulante e com
capacidade para 10 ml. Este tubo foi então submetido à nova centrifugação, por cinco minutos,
a 1800 rpm. Em seguida, dois terços superiores do plasma, definidos como plasma pobre em
plaquetas (PPP), foram pipetados e descartados. O PRP, formado pelo terço inferior, foi
protegido da luz e homogeneizado por 30 minutos, para ser submetido à nova contagem
plaquetária, também automatizada.
A análise estatística foi realizada inicialmente de forma quantitativa, calculando-se
a média e desvio padrão das concentrações plaquetárias obtidas. Posteriormente, as variáveis
avaliadas foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e ao Teste de Tukey. Diferença
estatística foi considerada quando do valor de probabilidade menor que 0,05 (p<0,05) na tabela
ANOVA. Para a análise dos dados utilizou-se o programa estatístico R (Versão 3.3.1 – 2016 –
The R Foundation for Statistical Computing).
RESULTADOS
As contagens plaquetárias do sangue total e do PRP estão descritas na Tabela 1 Para
as amostras de dois animais (A4 e A6) foi possível concentrar quatro vezes mais plaquetas do
que no sangue total. O PRP produzido a partir das amostras de dois animais (A2 e A8) não
atingiu concentração plaquetária três vezes maior que a do sangue total.
A análise estatística revelou diferença entre as contagens plaquetárias do ST e PRP,
sendo a concentração plaquetária do PRP significativamente maior em relação àquela do ST.
Médias e desvios-padrão são descritos na Tabela 2.
As contagens leucocitárias do PRP produzido não obedeceram a um padrão. Houve
contagens abaixo (4,1 x 10³/μl) e outras muito acima do valor basal (27,7 x 10³/μl).
29
TABELA 1 - Contagem plaquetária (plaquetas/μL) do sangue total (ST) e do plasma
rico em plaquetas (PRP) e o incremento plaquetário da segunda
contagem em relação à primeira.
ANIMAL ST PRP Incremento plaquetário
A1 103.000 326.000 Aumento de 3,17 vezes
A2 120.000 325.000 Aumento de 2,71 vezes
A3 125.000 411.000 Aumento de 3,29 vezes
A4 132.000 564.000 Aumento de 4,27 vezes
A5 161.000 514.000 Aumento de 3,19 vezes
A6 100.000 412.000 Aumento de 4,12 vezes
A7 114.000 349.000 Aumento de 3,06 vezes
A8 132.000 270.000 Aumento de 2,05 vezes
TABELA 2 - Médias, desvios-padrão e análise estatística das
contagens plaquetárias do sangue total (ST) e do
plasma rico em plaquetas (PRP).
Amostra Contagem plaquetária (plaquetas/μL)
ST 123.375 ± 19.375b
PRP 396.375 ± 100.465a
*Letras diferentes na mesma coluna representam diferença
significativa (p<0,05) ao teste de Tukey.
DISCUSSÃO
Devido à dificuldade de reprodutibilidade de técnicas anteriormente descritas,
optou-se por desenvolver um método de obtenção de PRP simples e barato. Existem dois
métodos básicos, que mantêm ou não hemácias e leucócitos no produto final13. No primeiro, o
objetivo é capturar todas as plaquetas, o que resulta em maior concentração leucocitária. No
segundo, se busca isolar essas células e, por esse motivo, a concentração plaquetária é menor.
No presente estudo, a metodologia aplicada visou o maior número de plaquetas, sendo obtido
um PRP com concentrações leucocitárias acima dos valores basais.
Os leucócitos têm grande influência na função do PRP, pois eles se ligam às
plaquetas ativadas e, através dessa interação, outros leucócitos são recrutados aos sítios de
inflamação14. Níveis leucocitários próximos aos basais no PRP têm efeito imunomodulatório
positivo, enquanto níveis elevados podem causar efeitos negativos15,16. Por outro lado, estudos
relatam que o PRP utilizado em feridas abertas e para a prevenção de infecções pode ter
concentrações elevadas de leucócitos17,18. Dessa forma, presume-se que o PRP obtido pelo
30
protocolo descrito no presente estudo, embora tenha apresentado altas concentrações
leucocitárias, não causaria efeitos negativos para utilização em cicatrização de feridas.
Ainda não há consenso entre os pesquisadores acerca da concentração ideal de
plaquetas que deve ser alcançada no PRP. Apesar de controversa, a concentração plaquetária é
considerada o parâmetro mais significativo na identificação da eficácia do PRP e na escolha do
melhor protocolo13. O protocolo estabelecido foi suficiente para concentrar as plaquetas, em
média, três vezes acima da contagem do sangue total. Estudos demonstram que contagens
plaquetárias entre uma e quatro vezes acima da basal possuem eficácia em regeneração
tecidual19,20. Em contrapartida, outro estudo, testando a ação do PRP na regeneração óssea em
coelhos, demonstrou que contagens plaquetárias de meia a uma vez e meia, acima da contagem
basal, não acarretaram em benefícios ao processo de reparo, e que contagens de seis a onze
vezes acima da basal causaram efeitos inibitórios na regeneração óssea21. Dessa forma, a
concentração plaquetária obtida no presente estudo pode ser considerada adequada, uma vez
que, de acordo com a literatura disponível, contagens muito baixas não incitam resposta celular
suficiente e contagens muito altas podem causar efeitos deletérios.
Um estudo classificou o PRP de acordo com a relação entre a concentração
plaquetária no sangue total e a do PRP obtido e a considerou baixa quando da concentração
plaquetária do PRP menor que a do sangue total; moderada quando de uma a quatro vezes
maior; alta quando de quatro a seis vezes maior; e super alta quando acima de seis vezes o valor
basal. O PRP obtido com o sangue dos animais A4 e A6 se enquadra na categoria alta, pois a
concentração plaquetária final foi pelo menos quatro vezes maior em relação àquela do sangue
total desses animais. Destaque-se que alguns estudos obtiveram resultados positivos com o uso
de concentrações similares20-22. Os demais animais se enquadram na categoria moderada, já que
as concentrações finais ficaram entre duas a quatro vezes maiores do que as do sangue total.
Acerca disso, estudos mostram a eficácia do PRP com concentrações plaquetárias de duas a três
vezes maiores que a basal19,23-25. Outro estudo relatou que uma concentração de apenas 2,5
vezes maior alcançou ótimos resultados na função de osteoblastos e fibroblastos26. Dessa forma,
acredita-se que as concentrações plaquetárias obtidas neste estudo possam resultar em efeitos
terapêuticos positivos, desde que seguidos protocolos adequados a cada caso.
De acordo com um estudo27, a concentração plaquetária final está positivamente
correlacionada à concentração inicial do sangue total, o que não foi observado nesta pesquisa.
O animal com menor contagem plaquetária no sangue total (A6) foi o que obteve o segundo
maior aumento após a segunda centrifugação (aumento de 4,12 vezes). Vale ressaltar a
dificuldade de padronização dos resultados, uma vez que o mesmo protocolo foi utilizado para
31
as amostras de todos os animais e, ao comparar as contagens plaquetárias do PRP, observa-se
variação significativamente maior do que aquela constatada quando comparadas as contagens
de plaquetas do sangue total desses animais.
CONCLUSÃO
Conclui-se que o método de dupla centrifugação, com a primeira a 900 rpm, por um
minuto, e a segunda a 1800 rpm, por cinco minutos, resulta em PRP com concentração
plaquetária, em média, 3,23 vezes acima da concentração basal do sangue total, o que é
considerado adequado ao uso terapêutico. Ainda, o protocolo aplicado constitui-se em método
simples, facilmente reprodutível e de baixo custo à obtenção do PRP autólogo em equinos.
32
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34
CAPÍTULO 3 - AÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS
AUTÓLOGO EM AUTOENXERTOS DE PELE EM EQUINOS
AUTOLOGOUS PLATELET-RICH PLASMA ACTION ON SKIN AUTOGRAFTS IN
HORSES
RESUMO: Este estudo avaliou a ação do PRP autólogo em feridas cutâneas, contendo
autoenxertos de pele em equinos. Foram utilizados sete equinos hígidos, nos quais foram
produzidas duas feridas cutâneas de 6 x 6 cm, em cada um dos lados da região glútea. Oito dias
após a indução das feridas, foram realizados enxertos com fragmentos de pele colhidos do
pescoço, assim como a aplicação do PRP, preparado através de protocolo de dupla
centrifugação. As feridas com autoenxertos do lado esquerdo receberam PRP, compondo o
grupo tratado (grupo T), e as com autoenxertos do lado direito não receberam tratamento,
compondo o grupo controle (grupo C). Foram realizadas avaliações macroscópica e
microscópica, considerando as variáveis integração dos autoenxertos e retração das bordas da
ferida, além de neovascularização, infiltrado inflamatório, fibroblastos jovens, colagenização,
reepitelização, integração dos autoenxertos e espessura da epiderme. Não houve diferença entre
os grupos (p>0,05) em relação à maioria das variáveis macroscópicas e microscópicas.
Contudo, a neovascularização foi significativamente maior (p=0,0191) no GT, no 14º dia após
a realização da enxertia. Conclui-se que o PRP favorece o processo de reparo da pele com
autoenxertos em equinos, já que aumenta a neovascularização na fase inicial da cicatrização da
ferida. Ainda, o PRP parece influenciar positivamente a integração dos autoenxertos de pele e
a retração das bordas da ferida.
Palavras-chave: Enxerto de pele, cicatrização, tecido de granulação, retração das bordas da
ferida.
ABSTRACT: This study evaluated the action of autologous PRP on cutaneous wounds,
containing skin autografts, in the gluteal region of horses. Seven healthy horses, aged between
3-18 years and mean live weight of 350 kg, were used. Two 6 x 6 cm cutaneous wounds were
produced on each side of the gluteal region. Eight days after wound induction, grafts were
performed with skin fragments harvested from the neck, as well as the application of PRP,
prepared by double-centrifugation protocol. Wounds with autografts on the left side received
PRP, composing the treated group (group T), and those with autografts on the right side did not
receive treatment, composing the control group (group C). Macroscopic and microscopic
evaluations were performed, considering the integration of autografts and retraction of wound
edges, as well as neovascularization, inflammatory infiltrate, young fibroblasts,
collagenization, reepithelization, autografts integration and epidermal thickness. There was no
difference between the groups (p> 0.05) in relation to most macroscopic and microscopic
variables. However, neovascularization was significantly greater (p = 0.0191) in WG, on the
14th day after grafting. It is concluded that PRP favors the process of skin repair with autografts
in horses, since it increases the neovascularization in the initial phase of wound healing.
Furthermore, the PRP seems to positively influence the integration of the skin autografts and
the retraction of the wound edges.
Keywords: Granulation tissue, retraction of the wound edges, skin grafts, wound healing.
35
INTRODUÇÃO
A frequência dos ferimentos cutâneos em equinos é muito alta e leva a tratamentos
onerosos. Essa espécie apresenta cicatrização lenta e difícil, principalmente em feridas
localizadas em membros distais. Isso pode ser atribuído a fatores como o baixo suprimento
sanguíneo local1, resposta inflamatória insuficiente2, estímulo persistente a proteínas pró-
fibróticas3, desequilíbrio entre a síntese e a lise do colágeno4 e apoptose deficiente dos
componentes celulares do tecido de granulação5. Essas características acarretam no
desenvolvimento de feridas crônicas6 e, consequentemente, levam a prejuízos à saúde do
animal. Devido ao interesse clínico, científico e econômico, essa área tem sido alvo de muitos
estudos e pesquisas.
O processo de cicatrização ou reparo é um processo orgânico que visa restaurar a
integridade anatômica ou funcional do tecido lesionado. Caracteriza-se por uma complexa
cascata de eventos bioquímicos e celulares sequenciados e controlados, em resposta à lesão
tecidual, tendo como resultado uma cicatriz. Quando há descontrole na sequência ou no
equilíbrio desses eventos, a consequência é a formação de uma cicatriz exuberante, resultado
da síntese excessiva de colágeno e conhecida como queloide7.
A utilização de enxertos de pele deve ser considerada em feridas extensas, com
grande perda tecidual e pele insuficiente para o fechamento adequado, e em locais de
cicatrização difícil, como os membros distais dos equinos8. Seu uso pode melhorar o resultado
da cicatrização, tanto em relação ao tempo, quanto aos resultados cosméticos e funcionais9, pois
diminuem a superfície da granulação e estimulam a contração da ferida, acelerando, assim, a
cicatrização10.
O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) é uma fração de plasma do sangue autólogo,
com concentração de plaquetas maior que no sangue total11. É um produto autógeno, atóxico,
com baixo risco de transmissão de doenças infectocontagiosas12 e com grande potencial na
integração de vários tipos de enxertos13. O PRP representa uma mistura natural e fisiológica de
fatores de crescimento e outras proteínas que possuem efeitos biológicos sinérgicos e atuam
como mediadores no processo de cicatrização14. Os fatores de crescimento mais estudados são
o PDGF, TGF-β, VEGF e EGF. Eles estão associados ao estímulo à resposta inflamatória,
angiogênese, proliferação de fibroblastos e, consequentemente, aumento da síntese de
colágeno15. Sendo assim, o potencial terapêutico do PRP é atribuído à sua concentração
suprafisiológica desses fatores de crescimento, que fornecem estímulo regenerativo e melhoram
a qualidade do processo de cicatrização16. Diante disso, este estudo teve por objetivo verificar
36
a ação do PRP autólogo em feridas cutâneas contendo autoenxertos na região glútea de equinos,
por meio de avaliações macroscópicas e microscópicas.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal de Goiás (CEUA/UFG) (processo 074/2016). Foram utilizados sete
equinos, cinco machos e três fêmeas, sem raça definida, com idade variando entre três e 18 anos
e peso vivo médio de 350 kg. Previamente ao início do período experimental, os animais
receberam vacina antitetânica (Hertape/Marcolab, Juatuba, MG, Brasil), foram desverminados
com pasta oral à base de ivermectina 1% (Handicap Equinos®, Hertape/Marcolab, Juatuba, MG,
Brasil) e submetidos a exames clínico e hematológico, para assegurar as condições de higidez
dos equinos.
Durante o período experimental, os equinos foram mantidos em galpão coberto e
alojados em baias individuais, com piso de concreto e cama de palha de arroz. A dieta foi
composta por feno de tifton, na proporção de 1% do peso vivo/dia, dividido em três refeições
diárias, e ração comercial com 15% de proteína, também na proporção de 1% do peso vivo/dia,
dividida em duas refeições diárias. Água foi fornecida ad libitum.
Indução das feridas
Os equinos foram sedados com cloridrato de detomidina a 1% (Eqdomin®,
Ourofino, Cravinhos, SP, Brasil), na dose de 20-40 μg/kg. Em seguida, foram realizadas
tricotomia e antissepsia da região glútea bilateral. Procedeu-se a anestesia local em “U”
invertido, com cloridrato de lidocaína a 2%, sem vasoconstritor. Com o auxílio de uma lâmina
de bisturi número 22, foram realizadas duas feridas de 6 x 6 cm, uma em cada lado da região
glútea, abrangendo a espessura total da pele e tecido subcutâneo. Com o objetivo de promover
analgesia, os animais receberam duas doses de 25 mg/kg de dipirona sódica (D500®, Fort Dodge
Saúde Animal, Jaguariúna, SP, Brasil), via endovenosa, uma ao término do procedimento
cirúrgico e outra após doze horas. Foram realizados curativos diários utilizando atadura de
Rayon não aderente, gaze e esparadrapo. No oitavo dia após a indução das feridas, momento
em que o tecido de granulação preencheu o defeito criado até o nível da pele adjacente,
realizaram-se a preparação do PRP, a colheita dos fragmentos de pele para o autoenxerto, o
procedimento de enxertia e a aplicação do PRP.
37
Obtenção do PRP
Algumas horas antes da aplicação dos autoenxertos, o PRP foi preparado. Para isso,
20 ml de sangue de cada animal foram colhidos, através de punção jugular, com o auxílio de
agulha 21G e tubos a vácuo com citrato de sódio a 3,2%. Para a obtenção do PRP foi utilizado
protocolo adaptado de Carmona17, com dupla centrifugação, sendo a primeira por 1 min, a 900
rpm, e a segunda por 5 min, a 1800 rpm. O PRP foi utilizado imediatamente após o seu preparo.
Colheita dos fragmentos de pele para o enxerto, preparação do sítio receptor e
procedimento de enxertia
Os equinos foram sedados, conforme protocolo utilizado para a indução das feridas.
A região do pescoço sob a crina, sítio doador selecionado, foi submetida a tricotomia,
antissepsia e anestesia local, também conforme protocolo utilizado anteriormente. Com o
auxílio de um punch de biopsia de 6 mm de diâmetro, 12 fragmentos da pele do pescoço foram
colhidos, com 1 cm de distância entre estes, sendo a fáscia e gordura subcutâneas removidas,
com o auxílio de uma tesoura Mayo curva. Em seguida, para evitar a desidratação, os
fragmentos foram posicionados sobre gaze estéril embebida em solução fisiológica. Os defeitos
criados na pele do pescoço foram suturados com fio de nylon 2-0, em ponto simples, e
receberam pomada à base de sulfadiazina de prata a 1%. As feridas receptoras na região glútea
foram lavadas com solução fisiológica estéril para remoção de quaisquer sujidades. Um punch
de biopsia de 4 mm de diâmetro foi utilizado para criar seis defeitos no tecido de granulação de
cada uma das duas feridas, à esquerda e à direita, produzindo leitos receptores para os
autoenxertos. Swabs estéreis foram inseridos em cada leito para conter a hemorragia e prevenir
a formação de coágulos. Seis fragmentos de pele extraídos do pescoço foram submersos no
PRP previamente preparado e implantados nos defeitos criados na ferida da região glútea
esquerda de cada animal, sendo este considerado o grupo tratado (GT). O restante do PRP foi
aplicado topicamente sobre as feridas, ao final da inserção dos fragmentos. A ferida do lado
direito de cada animal recebeu os outros seis enxertos, contudo, sem a aplicação do PRP,
compondo este o grupo controle (GC). Em seguida, em ambas as feridas, foi realizado curativo
com atadura de Rayon não aderente, gaze e esparadrapo. Foram realizados curativos diários e
as feridas mantidas fechadas até a completa cicatrização.
Avaliação macroscópica
Macroscopicamente, a integração dos autoenxertos foi avaliada aos dias 14 e 28
após a realização do procedimento de enxertia, considerando-se a quantidade de fragmentos de
38
pele que permaneceram no local do implante. Dessa forma, foram considerados os valores de
100%, 83%, 66%, 50%, 33% e 16% para a integração de seis, cinco, quatro, três, dois e um
autoenxertos, respectivamente. A retração das bordas da ferida foi avaliada por morfometria, a
partir de fotografias digitais, obtidas semanalmente, até o 35º dia após a realização do
procedimento de enxertia, perfazendo sete momentos de avaliação. Foi utilizado paquímetro
como referência para a avaliação computadorizada, que foi realizada com o programa Image
J®, através do qual se obteve a área de granulação da ferida nos sete momentos de avaliação.
Avaliação microscópica
Foram realizadas biopsias das feridas, com o auxílio de bisturi com lâmina nº 15,
aos dias 14, 28 e 35 após a inserção dos autoenxertos, de ambas as feridas, contemplando uma
porção do fragmento enxertado e uma porção do tecido de granulação. Os fragmentos foram
fixados em formalina tamponada a 10% por 48 horas, processados, incluídos em parafina e
corados com hematoxilina e eosina (HE). A avaliação foi realizada em microscópio óptico,
considerando as variáveis intensidade de neovascularização, infiltrado inflamatório,
fibroblastos jovens e colagenização, para as quais, quando presentes, foram atribuídos os
escores discreto (1), moderado (2) e acentuado (3). Também foi avaliada a integração do
autoenxerto, considerada presente quando da continuidade tecidual observada entre o tecido de
granulação do leito receptor e a derme do fragmento implantado. Ainda, quanto à reepitelização,
esta foi considerada completa quando constatada continuidade entre o epitélio do fragmento
implantado e aquele das bordas da ferida ou incompleta quando da descontinuidade. Para a
variável acantose, realizou-se a média da espessura de três pontos da epiderme em cada
fragmento.
Análise estatística
A análise estatística dos parâmetros avaliados foi realizada inicialmente de forma
quantitativa, calculando-se a média e desvio padrão para as variáveis paramétricas e a mediana
para as variáveis não paramétricas. Posteriormente, as variáveis paramétricas foram submetidas
à análise de variância (ANOVA) e ao Teste de Tukey. Destas, as que não apresentaram
normalidade pelo Teste de Shapiro-Wilk, foram então submetidas ao teste não-paramétrico
Kruskal-Wallis. Diferenças estatísticas foram consideradas quando do valor de probabilidade
menor que 0,05 (p<0,05) na tabela ANOVA. Variáveis não paramétricas foram analisadas pelo
teste de Wilcoxon (Teste T) para dados pareados. Para a análise dos dados utilizou-se o
programa estatístico R (Versão 3.3.1 – 2016 – The R Foundation for Statistical Computing).
39
RESULTADOS
O protocolo utilizado para o preparo do PRP resultou, em média, em contagem de
plaquetas 3,2 vezes maior que a do sangue total de cada animal.
Observou-se maior porcentagem de integração dos autoenxertos na avaliação
macroscópica no GT, nos dois momentos de avaliação, embora não tenha sido observada
diferença estatística (p<0,05). Os resultados de cada animal, os valores médios e desvios-padrão
da avaliação macroscópica da integração dos fragmentos de pele enxertados, estão ilustrados
na Tabela 1 e Figura 1.
TABELA 1 - Resultados individuais, médias e desvios-padrão da avaliação macroscópica,
em porcentagem, da integração dos autoenxertos de pele de equinos tratados
ou não com PRP, nos dias 14 e 28 após a realização do procedimento de
enxertia.
D14 D28
ANIMAIS Grupo (T) Grupo (C) Grupo (T) Grupo (C)
1 100% 100% 100% 100%
2 100% 100% 100% 100%
3 100% 83% 100% 83%
4 100% 66% 100% 66%
5 100% 100% 100% 100%
6 100% 83% 100% 83%
7 100% 100% 100% 100%
Médias e desvios-padrão 100 ± 0a 90 ± 13a 100 ± 0a 90 ± 13a
Escores de integração dos autoenxertos: seis (100%), cinco (83%), quatro (66%). Valores
seguidos de letras diferentes, na mesma linha e mesma variável diferem entre si pelo Teste
de Wilcoxon para dados pareados (p<0,05).
40
FIGURA 1 - Representação gráfica da avaliação macroscópica referente à
porcentagem de integração dos autoenxertos de pele em feridas
cutâneas tratadas ou não com PRP.
As médias e os desvios-padrão referentes à avaliação morfométrica das feridas estão
descritos na Tabela 2. Não houve diferença significativa entre os grupos (T) e (C) (p>0,05).
Apesar disso, em seis momentos notou-se que as feridas do grupo (T) apresentaram menor área
quando comparadas àquelas do grupo (C) (Figura 2). Além disso, em seis animais o lado tratado
apresentou fechamento completo da ferida, em média, cinco dias antes da última avaliação (35º
dia); enquanto no lado não tratado, quatro animais não apresentaram fechamento completo da
ferida aos 35 dias.
TABELA 2. Médias e desvios-padrão da avaliação morfométrica das
feridas, representados em área (cm²), nos sete momentos de
avaliação.
Grupo (T) Grupo (C)
T1 34,69 ± 1,09a 36,36 ± 3,06a
T2 30,83 ± 2,50a 30,91 ± 2,09a
T3 16,2 ± 4,05a 15,5 ± 5,31a
T4 7,13 ± 2,69a 7,94 ± 4,33a
T5 2,37 ± 1,41a 4,57 ± 3,74a
T6 0,48 ± 0,53a 1,85 ± 2,41a
T7 0,16 ± 0,31a 0,79 ± 1,35a
Valores seguidos de letras diferentes, na mesma linha e mesma variável
diferem entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05).
0
20
40
60
80
100
120
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
C/ PRP
S/ PRP
41
FIGURA 2 - Representação gráfica dos valores médios e desvios-padrão da
avaliação morfométrica das feridas, representados em área
(cm²), nos sete momentos de avaliação.
As medianas das variáveis microscópicas são apresentadas na Tabela 3. Não houve
diferença significativa (p>0,05) entre os grupos (T) e (C) em relação à quantidade de infiltrado
inflamatório, fibroblastos jovens, colagenização e integração dos autoenxertos. A
neovascularização no 14º dia após a realização da enxertia foi significativamente maior no
grupo (T) (p=0,0191), o que não foi observado nos demais momentos (Figura 3). Também não
foi observada diferença em relação à reepitelização quando comparados os grupos (C) e (T)
(p>0,05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
COM PRP
SEM PRP
42
TABELA 3 - Medianas das variáveis neovascularização, infiltrado inflamatório,
fibroblastos jovens, colagenização e integração do autoenxerto nos cortes
histológicos de feridas de pele de equinos tratados ou não com PRP, nos
dias 14, 28 e 35 após a realização de procedimento de enxertia.
PARÂMETRO MOMENTO Grupo (T) Grupo (C) Valor de p
Neovascularização
D14 3a 2b 0,0431
D28 2ª 2a 0,0593
D35 1a 1ª 0,1088
Infiltrado
inflamatório
D14 1ª 2a 0,1775
D28 1a 1ª 0,1088
D35 1ª 1a 0,7150
Fibroblastos jovens
D14 3a 3ª 0,1797
D28 2ª 3a 0,4227
D35 2a 1ª 0,7150
Colagenização
D14 1ª 1a 0,1797
D28 2a 2ª 0,4227
D35 1ª 1ª 0,0679
Integração do
autoenxerto
D14 1a 1ª 0,5930
D28 2ª 2a 0,6547
D35 1a 2a 0,1056
Escores: ausente (0), discreto (1), moderado (2), acentuado (3). Valores seguidos de letras
diferentes, na mesma linha e mesma variável diferem entre si pelo Teste de Wilcoxon
(p<0,05).
FIGURA 3 - Fotomicrografias da ferida da pele de equino ao 14º dia após a realização de procedimento
de enxertia. A) Neovascularização acentuada (escore 3), em ferida cutânea de animal do
grupo (T). B) Neovascularização discreta (escore 1), observada em ferida de pele de
equino do grupo (C). HE, objetiva 10x.
43
As médias e os desvios-padrão da variável acantose estão descritos na tabela 4. O
Teste de Shapiro-Wilk não demonstrou normalidade dos dados, portanto, essa variável foi
submetida ao Teste de Kruskal-Wallis. Não houve diferença à comparação entre os grupos
(p>0,05).
TABELA 4 - Valores médios e desvios-padrão da espessura da epiderme (acantose)
da região glútea de equinos, tratados ou não com PRP, aos dias 14, 28
e 35 após a realização de procedimento de enxertia.
GRUPO (T) GRUPO (C) Valor de p
D14 142,04 ± 111,94a 264,56 ± 167,50a 0,0007
D28 169,51 ± 90,99a 264,98 ± 163,24a 0,0017
D35 282,54 ± 158,55a 216,36 ± 159,81a 0,0021
Valores seguidos de letras diferentes, na mesma linha e mesma variável diferem entre
si pelo Teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).
DISCUSSÃO
O protocolo utilizado para o preparo do PRP concentrou as plaquetas, em média,
3,2 vezes acima da concentração do sangue total. Apesar das controvérsias acerca da
concentração plaquetária ideal, sabe-se que há um intervalo de eficácia, sendo que
concentrações baixas ou muito altas podem ser ineficazes ou resultar em efeitos adversos18.
Estudos demonstram que contagens de uma a quatro vezes acima da basal resultam em efeitos
positivos sobre a regeneração tecidual19,20. Dessa forma, a concentração de plaquetas obtida
neste estudo é coerente com os resultados positivos referentes à cicatrização da pele tratada com
PRP.
À avaliação macroscópica, não houve diferença entre os grupos, em relação à
integração dos autoenxertos. Resultados semelhantes já foram descritos21, nos quais houve
associação entre a ausência de resultados favoráveis e a aplicação única do PRP. Por outro lado,
nos parece claro quanto ao efeito positivo do PRP na fixação dos fragmentos de pele enxertados,
tendo em vista que todos os animais do grupo tratado apresentaram 100% de integração dos
fragmentos implantados, o que não ocorreu no grupo controle, em que apenas quatro animais
exibiram integração de todos os fragmentos enxertados. Dessa forma, ainda que, no presente
estudo, também tenha se realizado aplicação única de PRP, sugere-se que o número reduzido
de animais avaliados justifique a ausência de diferença entre os grupos tratado e controle. Em
contrapartida, outro estudo22 relatou melhor integração dos enxertos quando o PRP foi utilizado
em feridas crônicas enxertadas com fragmentos de pele em humanos. Da mesma forma, o uso
44
do gel de PRP foi avaliado, associado a enxertos de pele, no tratamento de úlceras crônicas em
pacientes diabéticos e resultados significativamente melhores em relação à integração no grupo
tratado foram encontrados23. Ainda, outro trabalho24, relatou menor perda de enxertos ao avaliar
o efeito do gel de PRP na cicatrização de enxertos cutâneos de equinos. O resultado dessas
pesquisas, somado ao fato de todos os animais tratados deste estudo terem apresentado 100%
de integração dos autoenxertos, reforçam a ideia quanto ao efeito benéfico das plaquetas no
processo de cicatrização de feridas cutâneas tratadas com autoenxertos e PRP.
O resultado macroscópico referente à integração dos fragmentos de pele no GT não
foi observado à avaliação microscópica desta mesma varável, o que pode ser explicado pela
agressão mecânica causada no momento da colheita da amostra. A ligação entre o leito receptor
e o fragmento implantado se dá, inicialmente, pela adesão da fibrina presente na ferida e,
posteriormente, pela neovascularização, proliferação fibroblástica e colagenização. Embora o
enxerto possa ser considerado firmemente aderido após o décimo dia8, a agressão mecânica
causada pela lâmina de bisturi e pinça no momento da realização da biopsia, pode ter colaborado
para o rompimento dessa adesão.
A avaliação morfométrica, em que se considerou macroscopicamente a área da
ferida coberta por epitélio, não demonstrou diferença significativa entre os grupos, apesar de a
maioria das feridas do grupo tratado com PRP apresentar maior epitelização. Aliado a isso, o
tempo de fechamento completo das feridas foi menor em seis animais do grupo tratado. Nesse
contexto, um estudo22 também relatou melhor evolução dos enxertos quando do uso do PRP em
feridas crônicas em humanos. Ainda, outro estudo23 corrobora esses achados, tendo em vista
que os autores relataram menor tempo na completa cicatrização de úlceras cutâneas tratadas
com enxertos de pele e PRP em pacientes diabéticos.
Considera-se que os resultados do grupo tratado com PRP foram positivos à
avaliação macroscópica, mesmo sem diferença estatística entre os grupos. Acerca disso,
pondera-se que resultados mais consistentes poderiam ser obtidos com um maior número
amostral. Além disso, os trabalhos que apresentaram dados macroscópicos significativos em
favor do PRP foram realizados com feridas crônicas, que apresentam baixas quantidades de
fatores de crescimento, devido à diminuição da sua produção ou liberação, sequestro, aumento
da degradação ou a combinação desses fatores25,26. No presente estudo, as feridas eram agudas,
o que pode ter acarretado na ausência de resultados impactantes, tendo em vista que, neste caso,
a modulação da resposta inflamatória foi suficiente para favorecer a adesão dos autoenxertos e
a rápida retração da ferida.
45
Neste estudo, as variáveis microscópicas referentes a fibroblastos jovens,
reepitelização, infiltrado inflamatório colagenização e integração dos autoenxertos não
apresentaram diferenças entre os grupos tratado e controle. Alguns autores27 obtiveram
resultados semelhantes quando avaliaram os efeitos do PRP na cicatrização de feridas em
membros distais de cavalos, já que não encontraram diferenças quanto à resposta inflamatória
e reepitelização. Em outro estudo28 realizado com equinos, os efeitos do gel de PRP na
cicatrização de feridas incisionais no pescoço desses animais foram testados e foi observado
processo inflamatório de maior intensidade no grupo controle. Já em trabalho21 que avaliou o
uso do PRP no processo de reparação de feridas dérmicas padronizadas em ratos, não foi
observada diferença quanto à população de fibroblastos jovens e reepitelização. De forma
semelhante, outro estudo29 avaliou o PRP associado à esponja cirúrgica em enxertos cutâneos
em coelhos e também não observou diferença quanto ao infiltrado polimorfonuclear,
proliferação fibroblástica e reepitelização.
Por outro lado, trabalhos semelhantes demonstraram resultados diferentes com o
uso do PRP. Em trabalho publicado recentemente24, foram avaliados os efeitos do gel de PRP
na cicatrização de enxertos cutâneos em equinos e foi observada maior resposta inflamatória no
sétimo dia após a realização da enxertia, além de maior colagenização e organização das fibras
colágenas. No presente estudo, a primeira avaliação foi realizada no 14º dia, momento em que
a inflamação normalmente já se encontra resolvida, ou próxima à resolução, o que poderia
justificar a ausência de efeitos positivos sobre a resposta inflamatória. Em testes realizados com
o uso de aplicações seriadas de PRP em feridas induzidas na região de metacarpo/metatarso em
um equino, o resultado foi reepitelização avançada e incremento na divisão celular30. Outros
autores31 testaram a utilização do PRP autólogo em enxertos cutâneos em coelhos e, apesar de
não observarem diferença significativa na resposta inflamatória, houve um aumento no número
de fibroblastos jovens. Resultado semelhante foi observado em estudo comparativo entre a cola
de fibrina e o PRP em enxertos cutâneos em cães, em que, nas análises histológicas realizadas
só se observou diferença na concentração de fibroblastos, que foi maior no grupo tratado com
PRP32.
No presente estudo, a neovascularização foi significativamente maior no 14º dia
após a aplicação dos autoenxertos com PRP. Resultados semelhantes foram encontrados em
estudos33,34 que observaram maior neovascularização no mesmo período. Outros trabalhos
também observaram maior vascularização com o uso do PRP na cicatrização de equinos, assim
como na cicatrização de enxertos cutâneos em coelhos29,30. No presente estudo, assim como na
maioria dos trabalhos descritos na literatura disponível, não houve uniformidade nos resultados
46
das análises histológicas, o que continua gerando controvérsias a respeito da eficácia do PRP.
Apesar deste estudo não demonstrar resultados positivos em relação à resposta inflamatória,
reepitelização e presença de fibroblastos jovens, houve aumento significativo da
neovascularização, o que é um parâmetro importante, uma vez que a angiogênese possui papel
fundamental no processo de cicatrização e na integração dos enxertos ao leito da ferida.
A espessura da epiderme foi avaliada após a realização dos autoenxertos de pele e
não se observou diferença entre os grupos tratado e não tratado. Resultados diferentes foram
encontrados em estudo34 que avaliou a epitelização em sítio doador de enxerto de pele de
espessura parcial em humanos. Os autores relataram que, no grupo tratado com PRP, a
espessura da epiderme foi significativamente maior do que no grupo controle, que apresentou
queratinização insuficiente. Durante a cicatrização, os queratinócitos sofrem migração,
proliferação e diferenciação35, eventos que poderiam ser influenciados positivamente pelo uso
do PRP. No estudo realizado pelos autores citados, o enxerto foi de espessura parcial, enquanto
que no presente estudo foram realizados autoenxertos de espessura total. Além disso, foram
feitas aplicações seriadas de PRP, diferentemente deste estudo, em que foi realizada uma única
aplicação, o que poderia justificar os diferentes resultados encontrados.
CONCLUSÃO
O PRP favorece o processo de reparo da pele com autoenxertos em equinos, já que
aumenta a neovascularização na fases inicial da cicatrização da ferida. Ainda, o PRP parece
influenciar positivamente a integração dos autoenxertos de pele e a retração das bordas da
ferida, o que é de fundamental importância para a redução do tempo de internação dos animais
e, consequentemente, dos custos terapêuticos.
47
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49
CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
O PRP vem sendo pesquisado há mais de 20 anos, havendo amplo material
disponível na literatura a respeito do seu uso em variadas áreas da medicina e da medicina
veterinária. Apesar disso, os resultados desses estudos ainda são conflitantes no que concerne
ao método de obtenção, composição celular e eficácia em suas diferentes aplicações. Dessa
forma, ainda há de se explorar cientificamente esse produto biológico, que demonstra grande
potencial terapêutico como adjuvante em uma série de condições patológicas.
Ao tentar reproduzir os protocolos de obtenção de PRP descritos na literatura,
muitas vezes esbarra-se em dificuldades para alcançar as concentrações plaquetárias adequadas.
Dessa forma, buscou-se desenvolver um protocolo simples, barato e, principalmente,
facilmente reprodutível. O resultado foi um PRP com concentrações plaquetárias adequadas,
porém pôde-se confirmar a dificuldade de padronização da técnica, uma vez que mesmo
executando exatamente o mesmo protocolo para vários animais, a variação na concentração de
plaquetas foi bastante ampla.
Quando avaliados os efeitos do PRP na cicatrização de feridas cutâneas e na
integração de autoenxertos, resultados favoráveis foram observados, apesar de parte das
variáveis analisadas não apresentar diferença significativa, o que pode ser atribuído ao pequeno
número amostral. Variáveis como neovascularização, integração macroscópica dos
autoenxertos e retração das bordas das feridas foram melhores com o uso do PRP, o que
representa resultado positivo importante, uma vez que influenciam diretamente no tempo de
cicatrização e, consequentemente, diminuem o tempo de tratamento dos animais.
Diante disso, constata-se a necessidade da continuidade das pesquisas e,
principalmente, de maior padronização destas, uma vez que se torna difícil a comparação entre
resultados provenientes de metodologias amplamente distintas. Ainda assim, o PRP pode ser
considerado um produto de grande potencial terapêutico em relação ao estímulo à cicatrização,
o que certamente influencia positivamente a integração de enxertos cutâneos.
50
ANEXOS
ANEXO A: Aprovação do CEUA
51
52
53
![AVALIAÇÃO DO TESTE DE SORO AUTÓLOGO E DO TESTE · PDF filemuito superior ao TSA usando plasma ao invés de soro através do Teste de Plasma Autólogo (TPA) [7]. Dessa forma, existe](https://img.document.onl/doc/110x75/5a9bb72a7f8b9adb5c8e0501/avaliao-do-teste-de-soro-autlogo-e-do-teste-superior-ao-tsa-usando-plasma-ao.jpg)
