Oleos Essenciais p Proteus

8/10/2019 Oleos Essenciais p Proteus

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UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO EPESQUISA

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

ABORDAGEM BIOTECNOLGICA EM Proteus mirabilis

Lessandra Mi !e"i#

Ca$ias d% S&"

'(()

i


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Lessandra Mi !e"i#

ABORDAGEM BIOTECNOLGICA EM Proteus mirabilis

Tese a*resen+ada a% Pr%,ra#a

Pr%,ra#a de P s-Grad&a./% e#

Bi%+e n%"%,ia da Uni0ersidade de

Ca$ias d% S&"1 0isand% a %2+en./%

de ,ra& de D%&+%r e# Bi%+e n%"%,ia.

Orien+ad%r3 Pr%45 Dr5 Ser,i% E !e0erri,ara6

C%-%rien+ad%res3 Pr%45 Dr5 S7r,i% O"a0% Pin+% da C%s+a

Pr%485 Dra5 Ana Pa&"a L%n,ara6 De"a#are

Ca$ias d% S&"

'(()

ii


3/126

Dedico

Aos meus pais, Eva e Vitrio, pelo

amor incondicional e incentivo

permanente para meu crescimento

profissional e pessoal.

Ao meu marido, Nei, pelo carinho e

compreenso por tantos momentos

suprimidos de nossas vidas em

respeito aos meus projetos

profissionais. Muitos desafios

superamos durante os anos de minha

formao na ps- raduao e a ora

ns compartilhamos essa vitria.

iii


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A!"ADE#$MEN%&'

Ao meu orientador, (rof. Dr. 'er io Echeverri ara), por todo o apoio e ami*ade

nesses anos de conv+vio. 'inceramente, a radeo-lhe por toda a confiana

depositada em meu tra alho e por a rir as portas para um novo e estimulante

caminho a pes uisa em micro iolo ia molecular. No tenho formas de

e/pressar o uanto o conv+vio com seus ensinamentos e atitudes modificou

minha vida. 'ou-lhe muito rata por todo aprendi*ado proporcionado.

0 (rof1 Dr a. Ana (aula 2on ara) Delamare, ami a uerida e irm de corao. 3oste

muito mais ue minha co-orientadora uma rande companheira e

incentivadora, mesmo nos momentos mais dif+ceis. A radeo por todos os

conselhos, pelo carinho e paci4ncia, al5m do constante apoio na e/ecuo

desse tra alho.

Ao (rof. Dr. 'er io &lavo (into da #osta, ilustre mestre, pelo apoio e constanteincentivo, e por sa er transferir com rande entusiasmo seu interesse pela

pes uisa micro iol ica.

Aos professores do $nstituto de 6iotecnolo ia, em especial ao (rof. Dr. Aldo 7ose

(inheiro Dillon, coordenador do (ro rama de (s-!raduao em

6iotecnolo ia, pelo apoio e incentivo.

Aos professores Da o erto Vanoni !odo) e Die o 6onatto, pelo apoio, incentivo e

orientao nos v8rios encontros para ade uao do tra alho.

Aos cole as do 2a oratrio de Micro iolo ia Aplicada e 6iotecnolo ia Ve etal $69

:#', em especial ; Manuela, 2uciana, #ristiane e 7ucimar, pelo

companheirismo e dedicao, al5m do incans8vel au/+lio na e/ecuo deste

tra alho.

iv


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Ao 7uliano 3racasso, m5dico residente do (ro rama de "esid4ncia em $nfectolo ia

do


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INDICE

P9,ina

LISTA DE :IGURAS i/

LISTA DE QUADROS /ii

;5 INTRODUO >?

'5 REVISO BIBLIOGR@

.?. !4nero (roteus

.?.? $mportBncia de Proteus spp. como a ente pato 4nico

.?. M5todos moleculares na caracteri*ao de P. mirabilis

.?.@ 3atores de pato enicidade de Proteus spp.

.?.@.? :rease

?. .?.@. @

>C

>

>

>F

?

?C. . GHuorum sensin I e fatores de pato enicidade em P. mirabilis ?F.@. Atividade antimicro iana de compostos ve etais

.@.?. Jleos Essenciais

.@. . %erpenos

@?

@

=5 RESULTADOS E DISCUSSO @K

CAP>TULO;5 COMPARISON O: DI::ERENT PCR BASED

MOLECULAR MAR?ERS :OR T@E C@ARACTERI ATION O:

Proteus mirabilis CLINICAL ISOLATES5

@

A stract @L

$ntroduction @

Material and Methods @F

vi


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"esults C

Discussion CK"eferences CL

CAP>TULO '5 T@E E::ECT O: MONOTERPENES ON S ARMING

DI::ERENTIATION AND @AEMOL SIN ACTIVIT IN Proteus

mirabilis 5

KK

A stract K

$ntroduction KL"esults and Discussion KE/perimental"eferences C

CAP>TULO =5 T@E EXTRACELLULAR METALLOPROTEASE

COMPLEX O: PROTEUS MIRABILIS.

LC

A stract LK

$ntroduction LMaterial and Methods LL"esults and Discussion L"eferences @C. #&N#2:' E' F?K. 6$62$&!"A3$A #&M(2EMEN%A" F@

vii


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LISTA DE :IGURASP9,inas

3i ura ?- 3i ure ?O E/amples of the profiles o tained usin the five (#"

methods. A. "A(D &(A??, 6. E"$#-(#", #. $''" , D. 6&P-(#", E. "E(-

(#". 'amples from leftO $6 (ro?>? and ?> , $6 @, $6 Eco ?>C, $6 (ro

?>K to $6 (ro ?>L, $6 Mor ?> , and $6 (ro ?>F and ??>.

K@

3i ura - 3i ure O Dendro rams o tained for P. mirabilis and out roup

species usin different (#" fin erprintin methods. A. 6&P, 6. "E(-(#", #.

"A(D, D. $''" and E. E"$#-(#".

KC

3i ura @- 3i ure ?O 'Qarmin of Proteus mirabilis 2 on 26 sQarmin a ar

plates Qithout terpenes aO, and Qith >.K m 92 of R-terpineol O and >.@ m 9ml

citronellol cO. $ncu ation period of Ch at @LS#.

F

3i ura C- 3i ure O Effect of selected monoterpenes on the sQarmin ehavior

of Proteus mirabilis 2 Qild strainO control no terpenesO, pule one

>.K m 92O, citral >.K m 92O, eraniol >.@ m 92O, citronellol >.@ m 9

2O, R-terpineol >.Km 92O. %he data represent the avera es of colon)

diameter of three independent e/periments Qith standard deviations.

L>

viii


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3i ura F- 3i ure O "elationship etQeen some acterial metalloproteases

inferred usin the Nei h or-7oinin method. %he percenta e of replicate trees in

Qhich the associated ta/a clustered to ether in the ootstrap test ?>> replicatesO

is shoQn ne/t to the ranches.

3i ura ?>- 3i ure @O %ri-dimensional model of the P. mirabilis mira ilisin AO

and the model metalloprotease serral)sinO ofSerratia marcescens.

3i ura ??- 3i ure CO #onserved *inc indin motif and active site of the

mira il)sin of P. mirabilis.

F>

F>

/


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LISTA DE TABELASP9,ina

%a ela ?- %a le ?O 2ist of isolates used, their ori in, sample source, and

anti iotic resistance.

K?

%a ela - %a le O (rimers se uences. K

%a ela @- %a le @O (earson product-moment correlation coefficient etQeen

similarit) values o tained Qith enetic fin erprintin methods.

K

%a ela C- %a le ?O Minimum inhi itor) concentration M$#O and the effect of

?9?> M$# concentration of monoterpenes on the sQimmin 9sQarmin ehavior

of P. mirabilis 2 .

%a ela K- %a le ?O Accession num ers of the se uences used in this QorW.

%a ela - %a le O Ali nment and secondar) structure of the mira il)sin UapAO

de P. mirabilis and the serral)sin ofSerratia marcescens. #alcium- indin

repeats of c-terminal domain of serral)sin su amil) )elloQO Qith their

characteristic ! /!/D pattern, and the h)dropho ic consensus motif


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;5 INTRODUO

& 4nero Proteus 5 caracteri*ado pela r8pida mo ilidade, fen=meno denominado

GsQarmin I. Huanto ; homolo ia de seu DNA, apresenta apenas uma discreta relao

com o da Escherichia coli . 3re Xentemente relacionado com infecYes urin8rias,

facilitadas pela sua capacidade em de radar ur5ia, tem sido encontrado coloni*ando

cateteres e sondas vesicais, principalmente a esp5cie Proteus mirabilis .

Devido a sua crescente importBncia na pr8tica cl+nica, tanto como a ente

infeccioso de dif+cil erradicao, uanto como micror anismo com possi ilidade de

produ*ir Z-lactamases de espectro e/pandido, seu controle no am iente hospitalar

tornou-se essencial. A necessidade da correta identificao dessa act5ria estimulou

com ue m5todos de identificao molecular sejam constantemente estudados e

aprimorados para essa finalidade. M5todos aseados em (#" t4m se mostrado [teis,

mas precisam ser validados para a rotina la oratorial.

Diversos fatores de pato enicidade, ou seja, caracter+sticas iol icas de

Proteus ue favorecem a sua participao em processos infecciosos t4m sido

identificados, tais como a capacidade de mo ilidade e fi/ao celular, produo de

protease, urease e hemolisina. Diversos autores inferem ue a correta co-re ulao

desses fatores de virul4ncia durante a diferenciao de GsQarmin I est8 relacionada

com a capacidade de coloni*ar e invadir o tecido do hospedeiro.

?


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V8rios estudos su erem ue e/tratos ve etais podem ser importantes produtos

no controle de P. mirabilis ao interferir em sinais de G uorum sensin I, e

conse uentemente, na diferenciao celular e e/presso de fatores de virul4ncia. Neste

sentido, os terpenos, compostos presentes em leos essenciais, podem representar uma

alternativa vi8vel no controle de infecYes por esses micror anismos.

As proteases micro ianas v4m se destacando como importantes fatores de

virul4ncia devido a ao direta so re prote+nas do hospedeiro, particularmente

imuno lo ulinas. & estudo em P. mirabilis tem sido focali*ado na protease UapA

mira ilisinaO, en*ima capa* de de radar $ A, $ !, entre outras prote+nas. %ra alhos

relatam ue no somente UapA 5 re ulada durante o GsQarmin I, mas tam 5m

hemolisinas, fatores li ados ; diferenciao celular e hiperproduo do fla elo.

Assim sendo, na presente tese foram avaliados distintos sistemas via (#"

"A(D, E"$#-(#", "E(-(#", 6&P-(#" e $''"O para caracteri*ao molecular de

isolados cl+nicos de P. mirabilis, o efeito de monoterpenos so re a diferenciao celular

e a produo de fatores de pato enicidade dessas act5rias, e reali*ado um estudo

ioinform8tico so re o comple/o de metaloproteases com ase no recentemente

pu licado enoma de P. mirabilis.


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'5 REVISO BIBLIOGR


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acilos e/i em atividade proteol+tica em condiYes de aero iose e so anaer ios

facultativos. A deaminao o/idativa dos amino8cidos e a ha ilidade em hidrolisar

ur5ia em am=nia e di/ido de car ono so as propriedades io u+micas de maior

representatividade desses acilos.

Apesar dessa caracter+stica saprof+tica do Proteus em meio am iente e no

intestino humano e de animais dom5sticos, em condiYes favor8veis a sua proliferao

pode ser um a ente pato 4nico importante, principalmente em pacientes eri8tricos,

psi ui8tricos, parapl5 icos e imunodeprimidos &^>>O. Autores relatam

ser um fre Xente a ente de infecYes nosocomiais, principalmente em pacientes de

unidades de terapia intensiva :%$sO, onde tem sido respons8vel pela autoinfeco

atrav5s da seleo antimicro iana, j8 ue fa* parte da flora intestinal _u et al., >> O]

al5m dos casos de acteremia e transmisso entre pacientes pela falta de cuidados com

lava ens de mos de profissionais da sa[de (earson et al., >> O. Esses processos

infecciosos esto principalmente associados a tr4s esp5cies de Proteus P. vulgaris, P.

mirabilis e P. penneri .

'5;5; I#*%r+ n ia de Proteus spp. %#% a,en+e *a+%, ni %

Atualmente, Proteus spp. tem sido descrito como importante a ente infeccioso

tanto de infecYes comunit8rias, uanto hospitalares %ortora et al., >>>O. Entre os

processos infecciosos causados por esses acilos, destaca-se a infeco urin8ria, ue

se undo #hoQ et al. ?FLFO, pode ser dividida em duas cate orias infecYes sist4micas

ou hemato 4nicasO e infecYes ascendentes na ual ocorre a coloni*ao de todo o

trato urin8rio, desde a uretra at5 o rimO. & se undo tipo de infeco 5 a mais fre Xente,

principalmente pela esp5cie P. mirabilis , ue coloni*a cateteres urin8rios ou pacientes

com anormalidades anat=micas, ou mesmo aps procedimentos cir[r icos urol icos

C


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2i et al, >> ] (earson et al, >> O. _arren et al. ?FF O descreve ue P. mirabilis 5

considerado a terceira causa de infeco urin8ria complicada, aps Escherichia coli e

Klebsiella pneumoniae , correspondendo a ? ` dos processos infecciosos] j8 em

acteri[ria por cateter de lon a perman4ncia, 5 a se undo a ente mais fre Xente aps

Escherichia coli , ocorrendo em ?K` dos casos. Esses dados so confirmados por

tra alhos pu licados recentemente 6urral et al, >>C] > O.

As infecYes causadas por acilos do 4nero Proteus so caracteri*adas como de

lon a perman4ncia e dif+cil tratamento, podendo muitas ve*es levar ao ito (enner,

?FF O. As complicaYes fre Xentes so urolit+ase, o struo de cateteres urin8rios,

lit+ase vesical, al5m de complicaYes renais como pielonefrite (earson et al., >> O. O. Dei hton et al. ?FF O citam a participao desse

micror anismo na artrite reumatide, pois foram encontrados anticorpos anti- Proteus

em pacientes com e/acer ao da doena. 'enior et al. ?FFKO conclu+ram em seu

estudo ue pacientes com artrite reumatide comprovada la oratorialmente com fator

reumatide positivoO apresentam elevados n+veis de anticorpos s5ricos $ M anti- P.

mirabilis , mas no de $ !. %am 5m, nesse mesmo tra alho, foram encontrados altos

n+veis s5ricos de $ A anti- P. mirabilis. Al5m disso, tanto 'enior et al. ?FFKO uanto

"ashid E rin er >>LO conclu+ram ue anticorpos anti- Proteus foram encontrados

K


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em maior uantidade em pacientes com artrite reumatide a uda do ue anticorpos para

outros 4neros acterianos.

#omo j8 o servado, as esp5cies com maior preval4ncia em processos

infecciosos so P. vulgaris e P. mirabilis , por5m P. penneri tam 5m tem sido descrito

como a ente de infecYes urin8rias e s+ndromes astrointestinais. Apresenta os mesmos

fatores de virul4ncia ue as demais esp5cies do 4nero, mas as propriedades

io u+micas da en*ima urease so [nicas, distin uindo-se da urease de Providencia

spp., Morganella spp. e outros Proteus spp. Drechsel et al., ?FF@] \osalsWi et al.,

?FFLO. &utra caracter+stica dessa esp5cie de Proteus 5 a sua resist4ncia ao cloranfenicol

> ] _u et al., >> O. #om o aumento da identificao

dessa act5ria como a ente pato 4nico de surtos hospitalares, com um perfil de

sensi ilidade antimicro iana restrito devido a produo de Z-lactamases de espetro

e/pandido, diversos tra alhos salientam a necessidade de m5todos r8pidos e pr8ticos de

identificao para o controle desse micror anismo no am iente hospitalar &^>>] (earson et al., >> ] _u et al., >> O.


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A enotipa em acteriana contri ui com novas oportunidades para identificao

de clones e sua disseminao, em como 5 de rande au/+lio em estudos

epidemiol icos a fim de desenvolver estrat5 ias de controle de micror anismos,

avaliao de interrelao entre cepas e presena de enes de multirresist4ncia \im et

al., >>C] _u et al., >> ] _u et al., >> O. A escolha correta do m5todo a ser utili*ado

5 fundamental.

A "eao em #adeia da (olimerase (#" T pol)merase chain reactionO 5 uma

t5cnica ue consiste na amplificao de um rande n[mero de cpias de DNA por meio

da utili*ao de iniciadores e de uma polimerase termoest8vel %a DNA polimeraseO,

ue sinteti*a cpias do fra mento de DNA a partir de uma [nica mol5cula de DNA

molde em um termociclador #oen)e et al., >> O. Essa t5cnica revolucionou o

dia nstico de a entes infecciosos, a tipa em e caracteri*ao, o mapeamento en=mico

e a vi ilBncia epidemiol ica hospitalar 2u et al, >>>] 'a u a et al, >>@O.

Desde os primeiros relatos de seu uso na d5cada de > e F>, sua aplica ilidade

na 8rea da sa[de tem sido de rande valia Versalovic et al., ?FFCO. A reao da (#"

em testes dia nsticos est8 aseada na utili*ao de iniciadores espec+ficos constru+dos

a partir de uma se X4ncia repetitiva do enoma se X4ncia-alvoO. &s produtos de

amplificao podem ser facilmente visuali*ados atrav5s de t5cnicas de eletroforese em

5is de a arose ou poliacrilamida corados pelo rometo de et+deo ou pela prata, al5m de

sua deteco com o uso de sondas en5ticas. &s produtos de amplificao podem ainda

ser su metidos ; restrio com diferentes endonucleases, clona em ou ao

se Xenciamento en=mico ban "othman, >>CO.

Entre os m5todos moleculares aseados em (#" utili*ados para estudos de

discriminao de act5rias esto "A(D random amplified pol)morphic DNAO, um

m5todo astante eficiente para an8lise de act5rias Nicolas-#hanoine Espinasse-

L


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Maes, ?FFLO] en uanto E"$# entero acterial repetitive inter enic consensus se uenceO,

"E( repetitive e/tra enic palindromic se uenceO e 6&P repetitive inter enic

se uence elements ofStreptococcus O foram desenvolvidos especificamente para an8lise

de procariotos '*c*uWa \a*noQsWi, >>CO.

No caso do 4nero Proteus , a "i otipa em e o (3!E pulsed-field el

electrophoresisO provaram ser efica*es na identificao das v8rias esp5cies (i nato et

al., ?FFFO, principalmente no caso de P. mirabilis (faller et al., >>>] 'a u a et al.,

>>@O. (or5m, devido ao custo relacionado a essas t5cnicas, em como limitaYes de

aplicao como rotina, m5todos moleculares precisam ser validados para P. mirabilis .

"A(D tem sido usado com sucesso na identificao de P. mirabilis 6in en et al., ?FF@]

Nicolas-#hanoine Espinasse-Maes, ?FFLO e P. penneri


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& operon da urease de P. mirabilis tem .CK WDa e apresenta sete Gopen readin

framesI da ureA ao ureG . As prote+nas determinadas peloureA , ureB e ureC so as

su unidades estruturais R :reAO, Z :re6O e :re#O, com as respectivas massas

moleculares de ??.>, ? . e ?.> WDa. &s polipept+deos adicionais :reD, :reE e :re3

com @?.>, ?L.F e @.> WDa respectivamenteO so codificados por enes acessrios e

esto envolvidos na insero do +on n+ uel na apoen*ima 7ones Mo le), ?F O. (ara

a reali*ao da atividade en*im8tica completa do P. mirabilis , o polipept+deo :re!,

com .C WDa, tam 5m 5 necess8rio. A aus4ncia deureD , ure e ureG resulta na

produo de uma en*ima inativa sem o +on n+ uel, en uanto a aus4ncia deureE apenas

diminui a atividade da en*ima. Especula-se ue o :reD tenha um papel de prote+na

chaperona urease espec+fica, [til na ativao da prote+na urease Mo le) 6elas,

?FFKO.

A transcrio dos enes estruturaisureA , ureB e ureC 5 reprimida pela prote+na

codificada peloure! . NicWolson et al. ?FF?O relatam ue a desrepresso da transcrio,

provavelmente devido a li ao da ur5ia aoure! , li era a e/presso dos enes

estruturais respons8veis pela s+ntese da urease. Estudos descrevem a desco erta de ue

o ure! 5 transcrito do seu prprio promotor na direo oposta a transcrio do restante

do operon. Acredita-se ue o :re" tenha @@.C WDa, caracter+stica de uma prote+na

re ulatria de li ao ao DNA, com ? res+duos de !lu e ? de 2)s, ue provavelmente

atuam na li ao ao DNA. A :re" ativa a transcrio de enes estruturais da urease,

ureD e ureA do promotor GupstreamI doureD Mo le) #hippendale, ?FF>] $sland

Mo le), ?FFKO.

Diversos autores, como Musher et al. ?FLKO, t4m estudado e comprovado a

importBncia da urease em processos infecciosos. 7ohnson et al. ?FF@O utili*aram um

mutante constitutivo urease-ne ativo de P. mirabilis com uma mutao de insero com

?>


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ureC para provar a importBncia da urease em infecYes urin8rias ascendentes em

e/perimentos com ratos. Esse mutante apresentava K>` da dose infectante maior ue a

amostra inicial sem a insero. & mutante foi eliminado da e/i a, en uanto amostras

urease-positivas permaneciam aderidas ao epit5lio vesical e renal, e causavam um maior

n[mero de lesYes.

P. mirabilis e P. penneri so as esp5cies de maior importBncia implicadas na

lit+ase renal e vesical "ad*ilejeQsWa-2e recht et al., ?FF@O, sendo a urease de rande

importBncia na formao de cristais nesse locais #lapham et al., ?FF>O. sa ido ue a

hidrlise da ur5ia ocasiona o aumento do p< urin8rio, propiciando a precipitao de

componentes como c8lcio e ma n5sio, resultando na formao de estruvita e car onato

de apatita Mo le) O demostraram em seus e/perimentos Gin vitroI o crescimento de

cristais de estruvita juntamente com o iofilme de P. mirabilis. 78 o estudo de Mc2ean

et al. ?F O descreve toda a formao do cristal primeiramente o P. mirabilis ascende

so re o trato urin8rio, coloni*a o uroepit5lio e ento forma col=nias envoltas pelo

licoc8lice, ue facilita a adeso das col=nias no local] posteriormente a produo de

ur5ia aumenta o p< local, possi ilitando a precipitao de cristais de estruvita e

car onato de apatita, os uais se depositam no licoc8lice, prote endo as col=nias da

a resso de antimicro ianos e c5lulas de defesa do hospedeiro. Nesse meio prote ido,

??


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as act5rias continuam reprodu*indo-se e produ*indo urease, havendo crescimento

nesse microam iente dos cristais de estruvita e apatita, dando apar4ncia final de uma

rande col=nia acteriana Gfossili*adaI #lapham et al., ?FF>O.

'5;5=5' @e#%"isinas


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se X4ncia de nucleot+deos dos uatro enes cont+nuos da hemolisina hl"C, hl"A, hl"B,

hl"D O so conservados nos plasm+dios e cromossomos como nas cepas de E. coli . Esses

enes, apesar de apresentarem ! # contendo cerca de @F` no lu ar de K>`,

percenta em t+pica do enoma da E. coli , h8 suspeita de ue os eneshl" no se

ori inaram dessa esp5cie \oronaWis et al., ?F LO.

No 4nero Proteus , a hemolisina


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supere/presso de 3lhD# , 2rp ou :mo6. A e/presso do ene %apA, o ual como o

ene hpmBA tam 5m 5 re ulado em associao com a capacidade de reali*ar

GsQarmin I, no necessita de 2rp, mas do $lhDC ue 5 re ulado pelo :mo6. &s

resultados do tra alho de 3raser et al. >> O indicam possi ilidade de li aYes para

controle de e/presso de enes de virul4ncia e a diferenciao de c5lulas ue reali*am

GsQarmin I.

'5;5=5= Me+a"%*r%+eases

Allison et al. ?FF aO demonstraram, em seu estudo, ue a diferenciao de

col=nias na forma ve etativa de P. mirabilis para a forma fla elada e filamentosa, ue

possui capacidade de reali*ar mi rao, 5 acompanhada de um si nificativo aumento da

atividade de fatores de virul4ncia como a presena de proteases. 78 ue a capacidade de

invadir o uroepit5lio 5 uma caracter+stica das c5lulas fla eladas, a atividade proteol+tica

tem sido considerada como um fator importante na diferenciao do potencial de

virul4ncia em P. mirabilis _arren et al.] ?F O. Esto descritas como proteases a

mira ilisina codificada pelo ene %apAO, a prote+na UapE codificada pelo ene %apE O,

a su unidade alfa da :rease ue 5 uma homlo a no-peptidase da fam+lia M@

codificada pelo eneureC O, a prote+na ativadora da hemolisina ue 5 uma homlo a

no-peptidase da fam+lia M?F codificada pelo enehpmBO, a 6eta-2actamase classe #

ue 5 homlo a no-peptidase da fam+lia '? codificada pelo enebla CM& -CO e a

protease 'M% ue 5 uma peptidase da fam+lia :@ cujo ene codificador no foi

descrito at5 o momentoO _assif et al., ?FFKO. "ecentemente, outras 6eta-2actamases

t4m sido associadas a P. mirabilis , principalmente as de espectro e/pandido E'62O,

como a #%P-M codificada pelos enesbla C'( -MO, relatadas em diversos tra alhos

"ao et al., ?FF ] \arapavlidou et al., >>K] _u et al., >> ] _u et al., >> O.

?C


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A $ A, na forma de prote+na secretria s)gAO, 5 um d+mero de $ A unido por

uma cadeia G7I ue cont5m o componente secretrio encarre ado de transportar a

mol5cula-anticorpo. A $ A 5 predominante em secreo mucide e sua funo 5

prote er a mem rana mucosa e tecido adjacente de act5rias e seus produtos. A s)gA 5

particularmente resistente ; de radao por en*imas proteol+ticas, e/istindo apenas

al uns micror anismos capa*es de sinteti*ar en*imas proteol+ticas e/tracelulares ue a

de radam. 2oomes et al. ?FF>O e 'enior et al. ?FF?O, demostraram ue P. mirabilis, P.

vulgaris e P. penneri tam 5m so capa*es de sinteti*ar proteases contra $ A.

:ma en*ima e/tracelular com capacidade de clivar tanto anticorpos $ A uanto

$ !, em como outras prote+nas no-imuno lo ulinas como elatina, case+na e

al umina ovina s5rica, tam 5m foi isolada de P. mirabilis de pacientes com infecYes

urin8rias de repetio 2oomes et al., ?FF>O. A atividade en*im8tica parecia ser devida a

um polipept+deo de K> WDa, ue provavelmente cliva a cadeia R da $ A, principalmente

entre os dom+nios #< e #


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& papel das proteases anti-$ A e anti-$ ! como fatores de virul4ncia em

infecYes urin8rias parece ser relevante, por5m no so conhecidos todos os anticorpos

presentes no trato urin8rio e pode ocorrer tam 5m um processo de opsoni*ao de

act5rias mediado por anticorpos, e posterior adeso do fra mento 3c dos anticorpos ;s

c5lulas fa ocit8rias. Esse mecanismo de defesa desempenha, provavelmente, um

importante papel, j8 ue anticorpos $ A e $ ! podem ser ops=nicos e o receptor 3c da

$ A tem sido identificado em c5lulas polimorfonucleares humanas. (ortanto, a s+ntese e

a ao da protease acima descrita ue atua no trato urin8rio deve diminuir, ou mesmo

eliminar, a fa ocitose devido ; hidrlise de anticorpos ops=nicos em fra mentos

inefetivos 2oomes et al., ?FF O.

Aps diversos estudos ue mencionavam a e/ist4ncia dessa metaloprotease

e/tracelular de P. mirabilis , _assif et al. ?FFKO caracteri*aram-na io uimicamente e

eneticamente Uap A ou mira ilisina. &s autores descreveram ue a en*ima seria capa*

de de radar tanto a forma secretora uanto s5rica de $ A? e $ A , nos humanos e em

ratos, em como a $ !, tendo sua atividade estimulada pelos c8tions de c8lcio e

ma n5sio dispon+veis no local. A metaloprotease UapA 5 muito semelhante ;s

proteases anti-$ A e anti-$ ! de Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens e

Er*inia chr"santhemi. %odas essas prote+nas pertencem a fam+lia das serralisinas de

metaloproteases de *inco, ue so mem ros da superfam+lia A6# de transportadores

procariticos e eucariticos. A fam+lia das serralisinas 5 um ramo de um rande rupo

de prote+nas marcadoras de pato enicidade de act5rias Actinobacillus spp, Bordetella

pertussis, E. coli enterohemorr+gica, eisseria meningitidis e Pseudomonas

$luorescens _assif et al., ?FFKO

?


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A UapA purificada 5 est8vel por lon os per+odos ; CS# em p< .> e no 5

afetada pelo calor ; >S# por K min. A atividade en*im8tica 5 detectada entre p< .> ;

?>.>, com tima atividade em p< .>. A adio de c8tions ma n5sio e c8lcio aumentam

sua atividade, en uanto ED%A a ini e. 'enior et al. ?F O e 2oomes et al. ?FF O

descrevem ue a aus4ncia do aumento da atividade en*im8tica em K` com adio dos

c8tions ivalentes su ere ue a prote+na purificada j8 possui li ados a ela +ons met8licos

ivalentes. 2oomes et al. ?FF O tam 5m relatam ue, em adio ao ED%A, ?,?>-

fenantrolina e R,R -dipiridil ini em a atividade dessa en*ima, en uanto a incu ao na

presena tanto de D3( ou iodoacetamida no produ*em efeito, em como a

fosforamidona, um ini idor de al umas metaloproteases.

& ene %apA ue codifica a mira ilisina tem sido clonado e supere/pressado. A

metaloprotease recom inante tem atividade so re a $ A? e $ ! humanas, em como a

$ A s5rica, $ A secretria, case+na e a*ocase+na 2oomes et al., ?FF@O. (or outro lado,

no tem atividade contra al umina s5rica, citocromoC , fla elina de P. mirabilis ,

ovoal umina ou fosforilaseb _assif et al., ?FFKO. Ainda h8 descrio da capacidade

dessa en*ima clivar outras prote+nas encontradas no trato urin8rio, incluindo prote+nas

de complemento #? e #@O e componentes estruturais do uroepit5lio actina, tu ulina,

col8 eno e lamininaO.

A se X4ncia de amino8cidos tem sido dedu*ida a partir do ene %apA. :m Gopen

readin frameI &"3O de ?CL@ pares de ases confere evid4ncias de ser o ene

estrutural da metaloprotease secretada. A se X4ncia de amino8cidos su ere uma

prote+na composta de CF? res+duos com massa molecular total de KC.>>> Da. 6aseado

em an8lise de eletroforese em el, a mira ilisina recom inante 5 composta por uma

[nica prote+na de KK WDa 6elas, >> O. Essa en*ima 5 rica em licina ??. mol`O.

?L


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A mira ilisina 5 homlo a as serralisinas da fam+lia M?>, e as proteases do

su rupo de serralisinas so secretadas pelo cassete li ado ao A%( A6#O da

superfam+lia de transportadores procariticos e eucariticos O. (rote+nas secretadas por esse sistema

no possuem se X4ncia sinal N-terminal, mas cont5m a #-terminal ue 5 essencial para

sua secreo. Esta se X4ncia termina com a se X4ncia de uatro amino8cidos DPPP,

ue nesse caso 5 D3$V !hi o _andersman, ?FFCO. &utra caracter+stica desse rupo

de prote+nas secretadas 5 conter C-?@ repetiYes da se X4ncia !!PP!PD pr/imo ao

sinal de secreo #-terminal. $sso funciona como uma conformao GZ- rollI ue serve

como um s+tio de li ao para c8tions c8lcio 6aumann,?FFCO. A mira ilisina tem tr4s

s+tios desses locali*ados em !l)@C@ at5 Asp@C , !l)@ ? at5 Asp@ e !l)@LF at5

Asp@ C. :m uarto s+tio pode e/istir de !l)@ at5 Asn@F@, em ora haja pouca

evid4ncia de ue o [ltimo res+duo com aspara ina su stitua o aspartato.

'e undo o tra alho de _assif et al. ?FFKO, h8 dois &"3s adicionais GupstreamI

ao %apA contendo se X4ncias homlo as aos demais mem ros da poro do

transportador dessa fam+lia, ou seja, deS. marcescens (rtD e (rtE. :m ene

codificando a terceira prote+na do sistema transportador A6#, homlo a ao (rt3, no

foi encontrada, mas sua presena 5 hipoteticamente mencionada no presente tra alho, j8

ue h8 descrio de e/istir espao suficiente na 8rea delineada pela insero %nK ue

produ*em um fentipo (rt- para codificar uatro prote+nas UapA mais as tr4s prote+nas

do transportador A6#O.

%ra alhos como o de _assif et al. ?FFKO e _alWer et al. ?FFFO descrevem a

completa se X4ncia do operon de metaloprotease de P. mirabilis , contendo os enes

?


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%apE, %apA, %apB, %apCe %apD] e o tra alho de (earson et al. >> O descreve, al5m do

ue o Uap E, mais tr4s enes representados se uencialmente. & estudo de _alWer et al.

?FFFO descreve ue Uap6, Uap# e UapD so homlo os aos transportadores proteicos

e/tracelulares da fam+lia A6#, tendo como prov8vel funo e/portar o UapA. 78 a

metaloprotease UapE apresenta homolo ia ao UapA, mas diferente dessa protease, no

possui a se X4ncia sinal #-terminal caracter+stica das prote+nas transportadas pelo

sistema A6#. Assim, os autores conclu+ram ue UapE 5 provavelmente uma en*ima

e/tracelular, sendo sua funo ainda desconhecida.

Huanto ; re ulao da mira ilisina, h8 descrio de um mecanismo associado a

G uorum sensin I, ou seja, uma comunicao entre c5lulas acterianas pela produo de

compostos sinali*adores ue, uando presentes em condiYes apropriadas e uantidades

ade uadas, eram respostas espec+ficas. 'e undo descrito por 6elas et al. ?FF O, a

sinali*ao para a protelise de $ A do or anismo hospedeiro est8 relacionada a

re ulao da capacidade de diferenciao celular para reali*ar GsQarmin I, a ual 5

re ulada pelo "s A.

'5' Q&%r sensin,H e 4a+%res de *a+%,eni idade e# P. mirabilis

As act5rias comunicam-se atrav5s de mol5culas u+micas sinali*adoras, ficando

a resposta na depend4ncia do ac[mulo dessas mol5culas, denominadas autoindutores

6assler et al., ?FFLO. A deteco desses autoindutores proporciona ; act5ria distin uir

entre a ai/a e alta densidade populacional, e controlar a e/presso de enes em

resposta a mudana do n[mero de c5lulas presentes no local 6assler et al., ?FF@O. Esse

processo denominado G uorum sensin I proporciona a uma populao acteriana

controlar a e/presso 4nica de toda uma comunidade, assim re ulando diversos

comportamentos como sim iose, pato enicidade, produo de antimicro ianos e

?F


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formao de iofilme. Estudos recentes demonstram a e/ist4ncia de uma lin ua em

espec+fica, em como outra universal de sinali*ao de G uorum sensin I,

proporcionando a comunicao intra e interesp5cies acterianas 6assler, ?FFF] 2ille)

6assler, >>>O.

A re ulao desse sistema foi primeiramente descrita por En e recht et al.

?F @O e En e recht 'ilverman ?F C, ?F LO ao demonstrar a necessidade de dois

componentes re ulatrios a prote+na 2u/$ respons8vel pela produo do autoindutor


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sinal similar a histidina uinase da superfam+lia de re uladores de resposta acterianos

com duplo componente.

"s A parece ter funo similar ao 2u/H e 6v ', outras histidina uinases

ue notificam condiYes am ientais. 'e undo 6elas et al. ?FF O, o "s A funciona

como um sensor de mem rana ue controla a mi rao celular ao monitorar um aspecto

essencial no am iente ao redor da c5lula. A se X4ncia de amino8cidos similar entre o

"s A e 2u/H su ere ue o "s A pode ser importante no G uorum sensin I. Al5m

disso, "s A tem homolo ia com v8rios dom+nios funcionais associados com o sensor

histidina uinase, ue cont5m o res+duo de aspartato necess8rio para transferir o fsforo

para um desconhecido re ulador proteico de resposta 'chauder et al., >>?] 'chneider

et al., >> O.

& tra alho de 6elas et al. ?FF O tam 5m su ere ue, como o fen=meno de

GsQarmin I 5 dependente da densidade populacional e ocorre comunicao intercelular

para re ular esse fen=meno, o mesmo deve sofrer influ4ncia de autoindutores ue no

sejam do tipo


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sinal iniciando a mi rao celular, ou modo mvel _assif et al., ?FFK] An5as et al.]

>>?O. Esse movimento direcionaria as c5lulas para lon e da 8rea de resposta

imunol ica, tendo o "s A funcionado como um sinali*ador ao re ular os modos de

e/ist4ncia da act5ria, tanto no modo adesivo uanto no mvel 6elas et al., ?FF ]

Miller 6assler, >>?O.

'5= A+i0idade an+i#i r%2iana de %#*%s+%s 0e,e+ais

Em ora as ind[strias u+micas e farmac4uticas tenham produ*ido rande

variedade de diferentes anti iticos nas [ltimas d5cadas, cada ve* mais tem sido

o servado um aumento da resist4ncia das act5rias a essas dro as usadas para fins

terap4uticos #ohen, ?FF O. Em eral, act5rias t4m a ha ilidade en5tica de ad uirir e

transmitir resist4ncia ;s dro as utili*adas como a entes terap4uticos, o ue est8

ad uirindo proporYes preocupantes j8 ue o pro lema dos micr ios resistentes est8

crescendo, e a perspectiva para o uso de anti iticos 5 indefinida. (or isso, medidas

devem ser tomadas para resolver este pro lema como, por e/emplo, controlar o uso de

antimicro ianos, ampliar pes uisas para melhor entender o mecanismo en5tico de

resist4ncia e continuar estudos para desenvolver novas dro as, sint5ticas ou naturais

Amoroso, >> ] Nascimento et. al. >>>O. 'endo assim, pes uisas voltadas para o

estudo e avaliao de produtos naturais como terap4uticos, e principalmente com

atividade anti itica, devem ser estimulados no intuito de criar novas dro as ou adaptar

as j8 e/istentes para ue voltem a ter atividade. Al5m disso, a &r ani*ao Mundial de

'a[de _` da populao dos pa+ses em desenvolvimento

dependem das plantas medicinais como [nica forma de acesso aos cuidados 8sicos de

sa[de.


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Devido a sua atividade meta lica secund8ria, os ve etais superiores so

capa*es de produ*ir su stBncias anti iticas, utili*adas como mecanismo de defesa

contra predao por micror anismos, insetos e her +voros !ottlie 6orin, >> ]

!ottlie , ?F ?O. Al uns pes uisadores preferem dar a essas su stBncias ini idoras, de

ori em ve etal, a denominao de fintocidas ou de su stBncias semelhantes a

anti iticos gAnti iotic 2iWe-'u stancesg. &s principais rupos de compostos com

propriedades antimicro ianas, e/tra+dos de plantas incluem terpenides e leos

essenciais %orssel, ?F FO] alcalides, lectinas e polipept+dios %erras et al., ?FF@]

Uhan 2eQis, ?FFLO e su stBncias fenlicas e polifenis, ue so fenis simples,

8cidos fenlicos, uinonas 'tern et al., ?FF O, flavonas, flavonis e flavonides, tanino

e cumarinas !onalves et al., >>KO. &s compostos isolados de plantas so su stBncias

cuja estrutura u+mica, com raras e/ceYes, apresenta randes diferenas estruturais em

relao aos anti iticos derivados de micror anismos. Esses a entes antimicro ianos

isolados de plantas superiores podem a ir como re uladores do meta olismo

intermedi8rio, ativando ou lo ueando reaYes en*im8ticas, afetando diretamente uma

s+ntese proteica em n+vel nuclear ou ri ossomal, ou mesmo alterando estruturas de

mem ranas 'in h 'hulWa, ?F CO. Entretanto, a maioria das plantas, normalmente

empre adas como fitoter8picos populares, no tiveram suas potencialidades terap4uticas

efetivamente comprovadas. :ma parcela si nificante destes estudos foi reali*ada frente

a micror anismos de refer4ncia sem a utili*ao de ensaios paralelos utili*ando

anti iticos comerciais ue pudessem fornecer parBmetros mais precisos uanto ao real

potencial actericida destes e/tratos !onalves et al., >>KO.

&s e/tratos so produtos o tidos pelo tratamento de su stBncias ve etais, por um

solvente apropriado, o ual 5 evaporado at5 a consist4ncia desejada. :m dos principais

tra alhos ue avaliaram e/tratos ve etais foi o reali*ado em >>> por Avancini e

@


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cola oradores, ue avaliaram o potencial antimicro iano do e/trato da car ueja

Baccharis trimera -ess O D.#.,Compositae e testaram suas atividades acteriost8ticas e

actericidas so re act5rias ram-positivas Staph"lococcus aureus e Streptococcus

uberis O e ram ne ativas Salmonella gallinarum e Escherichia coli O e conclu+ram ue

as act5rias ram-positivas demonstram maior sensi ilidade ao e/trato em relao ;s

ram-ne ativas.

& conhecimento so re o potencial terap4utico dos ve etais tem despertado o

interesse cient+fico, uscando, nesse conhecimento, novos caminhos para o controle e

tratamento de diversas doenas Donia et al., >>@O e, aseado nisso, #echinel 3ilho

>> O analisou plantas selecionadas a partir da indicao popular e da sua a undBncia,

cujos e/tratos apresentaram atividade antimicro iana, como os e/tratos de Bauhinia

splendens , onde os mais polares apresentaram efic8cia contra act5rias pato 4nicas

como Staph"lococcus aureus e Salmonella tiph"murium . 78 os e/tratos de Aleurites

moluccana -. illd Euphorbiaceae O, tam 5m avaliados, coletados e analisados no

6rasil no apresentaram atividade antimicro iana] por5m essa mesma planta, coletada e

analisada no


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selecionadas pela sua atividade antimicro iana. & estudo foi feito, a partir dos e/tratos

hidroalcolicos das folhas das se uintes plantas Arcitum lappa ardana, orelha-de-

i anteO, 'anacetum vulgare -. tanaceto, erva dos vermesO, Psidium gua/ava

oia eiraO, Mi0ania glomerata Sprend uacoO,Spilanthes acmella Mart a rio-do-

6rasilO, -ippia alba erva-cidreiraO, Achillea mille$olium -. mil-folhasO, Piper regnellii

Mi1 . paraipo a, capevaO, Eugenia uni$lora - . pitan aO, Sambucus canadensis -. e

Plantago ma/or -. tana em, erva-de-orelhaO. &s e/tratos de Er"thina speciosa

Andre*s mulun uO e de Punica granatum - romO foram o tidos a partir do caule e da

fruta, respectivamente. &s e/tratos foram testados so re os se uintes microor anismos

Staph"lococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e

os fun os C2ndida albicans, Candida 0rusei, Candida parapsilosis e Candida

tropicalis , cujo crit5rio utili*ado para indicar o n+vel de atividade dos e/tratos foi

aseado na M$# #oncentrao $ni itria M+nimaO, onde os e/tratos ue possu+am M$#

?>>m 9ml apresentavam oa atividade antimicro iana] M$# entre ?>> e K>>m 9ml,

atividade moderada] M$# entre K>> e ?>>>m 9ml apresentavam fraca atividade

antimicro iana e e/tratos com M$# acima de ?>>>m 9ml foram considerados inativos.

A partir da an8lise dos ?@ e/tratos, pelo menos fam+lias de plantas diferentes

apresentaram al uma atividade antimicro iana, principalmente so re act5rias ram-

positivas, o ue representa LL` dos e/tratos analisados. &s autores concluem ue,

apesar de a pes uisa so re os resultados do uso etno otBnico das ?@ esp5cies de plantas

estudadas ter sido reali*adain vitro , a pes uisa in vivo pode ajudar na determinao do

potencial de ao dessas plantas para o tratamento de doenas infecciosas.

&utro estudo a ordou o efeito micro icida de e/tratos de plantas conhecidas e

lar amente utili*adas na medicina popular, a oia eira Psidium gua/ava 2$NN. e do

mamoeiro #arica papa)a 2$NN so re act5rias ent5ricas causadoras de diarr5ias infantis

K


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Escherichia coli e Staph"lococcus aureus . Dos e/tratos utili*ados, os ue o tiveram

melhores resultados foram os e/tratos a uosos e cet=nicos, am os a K>`, das folhas

jovens rotoO da oia eira. Em relao aos e/tratos de folhas de mamoCarica papa"a

2$NN, estes no apresentaram ual uer atividade frente aos microor anismos testados

Escherichia coli e Staph"lococcus aureus . De acordo com a concluso dos autores, o

uso do e/trato do roto da oia eira no tratamento de diarr5ias causadas por

Escherichia coli e Staph"lococcus aureus 5 uma opo vi8vel devido ; sua r8pida ao,

f8cil cultivo em pa+ses tropicais e seu ai/o custo Vieira et al., >>?O.

A Curcuma longa -. 3ingiberaceae , planta distri u+da em re iYes tropicais e

su tropicais do mundo, al5m de lar amente utili*ada na medicina popular no tratamento

de diversas doenas, 5 tam 5m muito citada na literatura pela variedade de atividades

ue apresenta. &s principais compostos respons8veis pelas atividades da planta so a

curcumina e seus derivados. %estes Gin vitroI mostraram atividades antiparasit8rias,

antiespasmdica, antiinflamatria e tam 5m o potencial anticancer+ eno da curcumina,

mais a undante componente da planta. &s derivados da curcumina ue apresentaram

atividade foram o curcuminato de sdio atividade antinflamatriaO] ariltumerona,

atividade antiof+dicaO, onde sua ao neutrali*ou a ao hemorr8 ica e o efeito fatal do

veneno] metil-curcumina atividade anti-leishimaniticaO] o dimeto/i-curcumina e o

isdemeto/i-curcumina atividade antio/idanteO > O. A curcumina

tam 5m apresentou atividades como anti acteriana, onde o leo da #urcuma ini iu o

crescimento deStaph"lococcus aureus , Staph"lococcus aureus e Bacillus t"phosus ] e

ainda atividade anti- ?O. Diante das atividades relatadas e do

potencial apresentado pela curcumina e derivados, 5 interessante uma cont+nua


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investi ao de compostos ue possam ser usados na produo de novas dro as e no

tratamento de diversas doenas > O .

Al uns estudos tam 5m t4m demonstrado ue al5m de atividades

antimicro ianas so re um dado microor anismo, compostos de plantas apresentam

tam 5m atividade contra linha ens de microor anismos resistentes a anti iticos.

(arece haver um efeito sin5r ico entre compostos de plantas associados a outros

compostos ve etais, ou ainda a anti iticos inativos, potenciali*ando-os na atividade. &

potencial de e/tratos de plantas e fitof8rmacos em modelos de linha ens de

microor anismos multirresistentes a dro as foi avaliado em v8rios estudos como citados

em > O, em como o efeito sin5r ico da associao dos e/tratos com

atividade antimicro iana com anti iticos. No estudo de Nascimento et al. >>>O foram

avaliadas as se uintes plantas Achilea mille$olium milfolhasO,Car"oph"llus

aromaticus cravo da +ndiaO, Melissa o$$icinalis erva cidreiraO,4cimun basilicum

alfavacaO, Psidium gua/ava oia eiraO, Punica guanatum romO, !osmarinus

o$$icinalis alecrimO,Salvia o$$icinalis salviaO,S"%"g"um /oabolanum jam oloO e

'h"mus vulgaris tomilhoO. 3oram utili*ados os fitof8rmacos 8cido en*ico, 8cido

cinBmico, eu enol e farnesol so re os microor anismosCandida albicans leveduraO,

Staph"lococcus aureus , Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus

subtilis, Proteus spp essas cinco, sens+veis a anti iticosO e oito act5rias resistentes a

anti iticos Klebsiella pneumoniae duas amostras diferentesO,Shigella spp., Proteus

spp, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli e

Staph"lococcus aureus . & tiveram como resultado da atividade dos e/tratos de

alfavaca, cravo-da-+ndia, oia a, jam olo, erva-cidreira, rom, alecrim e tomilho ue

apresentaram uma atividade m+nima contra os microor anismos testados. &s e/tratos de

cravo e jam olo apresentaram maior atividade, ini indo F microor anismos C, `O e

L


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microor anismos KL,?`O, respectivamente, apresentando tam 5m alta atividade

contra act5rias resistentes a anti iticos @,@`O. &s e/tratos de s8lvia e mil folhas no

apresentaram nenhum tipo de atividade. A an8lise, uanto ao efeito sin5r ico dos

e/tratos, mostrou ue a associao dos e/tratos de cravo-da-+ndia, jam olo, rom e

tomilho com anti iticos apresentaram atividade contra P. aeruginosa . & e/trato de

alho, uando com inado com ampicilina, produ*iu efeito contra Klebsiella pneumoniae .

& crescimento de Proteus spp . foi ini ido uando se associou e/trato de cravo-da-+ndia

com a tetraciclina. #omo resultados da avaliao, os autores puderam concluir ue os

e/tratos estudados apresentaram atividade antimicro iana, inclusive so re

microor anismos resistentes a anti iticos, a indo isoladamente ou associados a

anti iticos, devido ao efeito sin5r ico Nascimento et al. >>>O.

:ma das formas mais comuns do uso de e/tratos ve etais para fins medicinais 5

o e/trato ruto. #hen et al. ?F FO apresentaram uma seleo de e/tratos rutos de

plantas taiQanesas com atividade antimicro iana contraStreptococcus mutans , act5ria

conhecida por ser cario 4nica. Verificaram LF e/tratos a uosos de diversas plantas,

onde desses e/tratos, apresentaram atividade anti acteriana. Dentre as seis, as

esp5cies Morus australis, -ud*igia octovalis e 'hu/a orientalis foram as mais efetivas

na ini io dos sorotipos # e D doStreptococcus mutans . Em Martine* et al. ?FF O,

analisou-se a atividade antimicro iana de e/tratos deShinus terebenti$olius !addi,

Anacardiaceae , em diferentes concentraYes contra as act5rias ram-positiva Bacillus

subtilis , !ram-ne ativas P. Aeruginosa e Escherichia coli e a levedura Candida

albicans . &s resultados o tidos indicaram ue os e/tratos nas concentraYes de K>` e

?>>` apresentaram atividade antimicro iana frente a todos os microor anismos

testados, e/ceto contra a leveduraCandida albicans .


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"ecentemente, !onalves e cola oradores >>KO testaram a atividade

anti acteriana de ?L plantas da flora rasileira A. occidentale, P. emarginatus, C.

langsdor$$ii, A. colubrina, M. perui$erum, S. adstringens, B. orellana, E. uni$lora, P.

gua/ava, M. tenui$lora, ). paraguariensis, 4. odori$era, 5. courbaril, S. terebinthi$olia,

G. americana, '. avellanedae e C. s"lvestris O contra os se uintes micror anismos

Escherichia coli , Enterobacter aerogenes , Streptococcus p"ogenes , Klebsiella

pneumoniae , Providencia spp., Proteus mirabilis , Pseudomonas aeruginosa , Shigella

sonnei , Staph"lococcus aureus e Staph"lococcus spp. #omo resultados, o servaram no

haver atividade antimicro iana de e/tratos hidroalcolicos das esp5cies Anadenanthera

colubrina, Genipa americana, 'abebuia avellanedae e Casearia s"lvestris, ao contr8rio

do anteriormente relatado em literatura Mors et al, >>>] &liveira et al, ?FF>] 6asile,

?FF>O.

& e/trato de Pterodon emarginatus apresentou atividade somente contra Proteus

mirabilis , e os de4cotea odori$era e Schinus terebinthi$olia apresentaram atividade

somente contraStaph"lococcus aureus . &s e/tratos destas plantas so conhecidos por

apresentarem atividade antimicro iana tam 5m contra Pseudomonas 6andeira

_anicW, ?FLCO, o ue no foi confirmado nos resultados de !onalves e cola oradores.

Dois e/tratos apresentaram atividade antimicro ina contra dois micror anismos, o de

5"menaea courbaril teve ao contra Proteus mirabilis e Staph"lococcus aureus e o de

Copai$era langsdor$$ii apresentou ao contra Proteus mirabilis e Shigella sonnei .

5"menaea courbaril 5 conhecida por conter terpenos e compostos fenlicos com

comprovada propriedade antimicro iana Marsaioli, ?FLKO.

& se undo e/trato, o deCopai$era langsdor$$ii , 5 referido na literatura como

tendo ao tam 5m contra Escherichia coli e Staph"lococcus aureus El Nun*io, ?F KO,

o ue no se confirmou nos resultados desse estudo, onde estes dois [ltimos

F


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micror anismos mostraram-se resistentes. Al uns e/tratos apresentaram maior

amplitude de atividade actericida, como 5 o caso de M"ro#"lon perui$erum ue

apresentou atividade contraStreptococcus p"ogenes, Shigella sonnei e Staph"lococcus

aureus ] e o e/trato de )le# paraguariensis ue ini iu os micror anismos Shigella

sonnei, Staph"lococcus aureus e Staph"lococcus spp. coa ulase] sendo esses resultados

in5ditos desse tra alho. & e/trato de Bi#a orellana apresentou ao contra

Streptococcus p"ogenes, Proteus mirabilis e Staph"lococcus aureus , em ora recentes

dados da literatura no tenham constatado atividade deste e/trato contra estas act5rias

Almeida Alves et al., >>>O. 78 a atividade do e/trato de Psidium gua/ava , citado como

sens+vel paraStaph"lococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa e Candida albicans > ] !nan Demello, ?FFFO,

apresentou sensi ilidade frente aStreptococcus p"ogenes, Proteus mirabilis e

Staph"lococcus aureus , no sendo constatado ao contra a Escherichia coli e

Pseudomonas aeruginosa . A ao do e/trato de Anacardium occidentale confirmou

plenamente os dados o tidos na literatura 2oren*i, ?FF O, ini indo o crescimento de

Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staph"lococcus aureus e Staph"lococcus coa ulase

ne ativo.

Alta atividade antimicro iana foi o tida com o e/trato de Mimosa tenui$lora .

#itado na literatura por apresentar atividade contraStreptococcus spp. eStaph"lococcus

spp. >>O, teve os resultados confirmados contra Escherichia coli,

@>


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\ushiro et al., ?F O, Pisum sativum Morita et al., >>>O,4lea europaea , 'ara##acum

o$$icinale 'hi u)a et. al., ?FFFO, al5m de Arabidopsis thaliana ?O cujo papel 5 a defesa contra pat enos e pestes.

>?] Morrisse) &s urn, ?FFF] (rince et al., ?F LO. Em

tra alhos so re a atividade de 8cidos anac8rdicos, ue so compostos fenlicos

formados por uma cadeia lateral al uil no isoprenide, presentes no leo da casca da

castanha de caju, 2ima et al., >>>O, analisaram a atividade antimicro iana so re

microor anismos da cavidade oralStreptococcus mutans, Staph"lococcus aureus,

Candida albicans e Candida utilis . A amostra dos 8cidos demonstrou ter potente

atividade anti acteriana so re act5rias ram-positivas, principalmente so re o

Streptococcus mutans , maior do ue em act5rias ram-ne ativas.

Estudos farmacol icos feitos com leos essenciais de ?K esp5cies de plantas

arom8ticas o tidas no Nordeste do 6rasil t4m apresentado atividades coerentes com o

uso destas plantas na medicina popular. Estudos com o efeito desses leos na contrao

muscular e com seus efeitos anticonvulsivo, anal 5sico, antiinflamatrio e

anti acteriano > O. 3oi relatada a atividade antimicro iana de leos

essenciais e purificados os compostos ativos de4cimum gratissimum , tradicionalmente

usados na medicina popular rasileira para tratar diferentes doenas como infecYes no

trato respiratrio, diarr5ias, doenas de pele, pneumonias e tam 5m fe re, tosse e

conjuntivite. & composto ue apresentou atividade anti acteriana para act5rias ram-

positivas e ram-ne ativas no leo essencial foi identificado como eu enol NaWamura

et al., ?FFFO.

'5=5' Ter*en%s

&s terpenos so ori inados da via do acetato-mevalonato a partir de uma

unidade isopreno. A classificao dos terpenos 5 feita de acordo com a uantidade de

@


44/126

unidades isopreno em hemiterpenides, #K] monoterpenides, #?>] ses uiterpenides,

#?K] diterpenides, # >] triterpendes, #@>] e carotendes, #C>. Eles apresentam

funYes variadas nos ve etais. &s monoterpenos so constituintes dos leos vol8teis,

atuando na atrao de polini*adores. &s ses uiterpenos, em eral, apresentam funYes

protetoras contra fun os e act5rias > O, en uanto muitos diterpenides

do ori em aos horm=nios de crescimento ve etal. &s triterpenides e seus derivados,

os esterides, apresentam uma ama de funYes. Morita et al., >>>O. Muitos t4m

funYes de proteo contra her +voros, al uns so antimitticos, e outros atuam na

erminao das sementes e na ini io do crescimento da rai* > ]

bounes et al., >>>] Morita et al., >>>] El-'aWhaQ) et al., ?FF O.

Estudos relacionados ; atividade antimicro iana de plantas tiveram in+cio no ano

de ?FC>. 'a e-se ue as plantas possuem v8rias vias meta licas secund8rias ue do

ori em a diversos compostos dentre eles os terpenos. Huanto ; atividade actericida dos

terpenos, autores t4m su erido efeitos so re a parede celular acteriana ou mem rana

citoplasm8tica, a indo so re compostos lipof+licos e causando a perda de en*imas e

nutrientes da mem rana celular _an et al., >> O.

Mansouri e cola oradores >>KO relatam em seu tra alho a ini io de

sQarmin em isolados de Proteus spp. , em como a atividade actericida de K leos

essenciais ou e/tratos de plantas. &utros tra alhos, como o de _an et al. >> O,

salientam a atividade actericida de e/tratos ve etais em isolados de P. mirabilis , com

possi ilidade de ini ir GsQarmin I.


45/126

terpenos, podero ser importantes alternativas para manejo desse pat enos em tempo

de emer 4ncia de act5rias multirresistentes ao antimicro ianos convencionais

%eplitsWi et al., >>>] Uhan , >>@O.

@C


46/126

=5 RESULTADOS E DISCUSSO

&s resultados e discusso so apresentados na forma de arti os, correspondentes

aos se uintes cap+tulos

#ap+tulo ?- #omparison of different (#" ased molecular marWers for the

characteri*ation of Proteus mirabilis clinical isolates.

#ap+tulo - %he effect of monoterpenes on sQarmin differentiation and

haemol)sin activit) in Proteus mirabilis.

#ap+tulo @- %he e/tracellular metalloprotease comple/ of Proteus mirabilis.

@K


47/126

CAP>TULO ;

COMPARISON O: DI::ERENT PCR BASED MOLECULAR MAR?ERS :OR

T@E C@ARACTERI ATION O: Proteus mirabilis CLINICAL ISOLATES5

Lessandra Mi !e"i# ?1 Ga2rie"a M&""er?1 & i#ar a aria ?1 Ana Pa&"a L%n,ara6

De"a#are?1 S7r,i% O"a0% Pin+% da C%s+a? and Ser,i% E !e0erri,ara6 ?

; )nstitute o$ Biotechnolog", 6niversit" o$ Ca#ias do Sul, Ca#ias do Sul, !S, Bra%il.

S!%r+ +i+"e3 M%"e &"ar MarJers 4%r Proteus mirabilis

ote7 3inancial support from the 3oundation of the :niversit) of #a/ias do 'ul and

#N( .

8'rabalho aceito para publica9:o no Bra%ilian ;ournal o$ )n$ectious Diseases .

6acterial isolates Qere maintained on %r)pticase 'o) ean A ar %'AO, and

permanent stocWs Qere conserved on %'6! %r)ptone 'o) 6roth Qith ?K` l)cerolO at

T >S#. 3or DNA anal)sis, sin le colonies Qere transferred to ?ml of 26 2uria 6rothO

and incu ated at @LS# for ? h.

PCR 4in,er*rin+in,5 DNA samples Qere prepared as descri ed ) 2u C Qith some

modifications. 6riefl), sin le colonies of each isolate Qere inoculated on 26 medium

and reQ overni ht at @Lk#. #ells Qere collected ) centrifu ation at ?@>>> / for K

min, and ressuspended in ?>>l of e/traction uffer ?` %riton-P-?>>, ?>>mM %ris-

k#.

3or "A(D, E"$#, 6&P and "E( anal)sis, l of DNA samples Qere

transferred to @l of amplification mi/ containin >mM %ris-mM

\#l, LmM M #l , >. K` %riton-P-?>>, mM dN%(s, ?M of each primer E"$# and

"E(O or ?.KM of the primer for "A(D and 6&P, and ?. K: of %a (ol)merase

$nvitro enO. DNA amplification Qas conducted on a M7 "esearch thermoc)cler

pro rammed for an initial denaturation step at F S# C minO folloQed ) C> c)cles of

denaturation for ? min at FCS#, annealin for ? min at the appropriate temperature

"A(D and "E(- C>S#, E"$#- C S#, and 6&P- K>S#O, e/tension for K min at L S#, and

a final e/tension for K min at L S#. 'amples Qere maintained at CS# until eletrophoretic

separation of amplification products.

C>


52/126

%he primers used Qere E"$#-?" K -A%!%AA!#%##%!!!!A%%#A#-@ O

and E"$#- K -AA!%AA!%!A#%!!!!%!A!#!-@ O, and "E(-(#"-?" K -

$$$$#!$#!$#A%#$!!#-@ O, and "E(-(#"- $ K -$#!$#%%A%#$!!##%A#-@ O

descri ed ) Versalovic et al. ? , 6&P-A?" K -

#%A#!!#AA!!#!A#!#%!A#!-@ O previousl) used in several acterial species

??,? , , and "A(D and $''" cited in %a le .

%he amplification reaction for $''" marWers included l of DNA samples and

@l of a (#" mi/ includin >mM %ris-mM \#l, @mM M #l, `

formamide, >.LKmM of each dN%(, ?M of each primer and ?.K: of %a (ol)merase

$nvitro enO. 3or the DNA amplification, the reaction mi/ture Qas denatured for K min

at F S#, folloQed C> c)cles at FCS# ? minO, C S# to K>k# CKsO and L S# minO Qith

final e/tension for K min at L S#.

%he amplification products Qere electrophoresed in ?.K` a arose els in %ris-

orate uffer >.> FM %ris, >.> FM oric acid, >.>> M ED%AO. 2am da Eco"$9 9mlO, visuali*ed on a :V li ht transilluminator, and documented Qith :V$%E#

s)stem. $ma e anal)ses Qere carried out usin 2a ima e softQare.

%he amplifications Qith the five methods Qere repeated three times independent

cultures and DNA e/tractionsO to evaluate the reproduci ilit) Qith tQo replications of

each isolate per round. &nl) Qell defined and reproduci le amplification products

presence and intensit)O Qere scored and used on statistical anal)ses.

S+a+is+i a" ana"6ses5'imilarit) 7accard s coefficients, (earson s correlation etQeen

distance matrices, and cluster anal)sis unQei hted pair- roup method Qith avera e

linWa e - :(!MAO Qere performed usin the ''#( ?>.? softQare pacWa e. 6ootstrap

C?


53/126

anal)sis Qas done Qith the _in oot pro ram. Discriminator) inde/ D$O Qas

determined ) the num er of relative fre uencies of the different profiles o tained ) a

iven primer or method, and Qas calculated ) usin 'impson s inde/ of diversit) @

as folloQ

D$ ?- n / n /=?O9 => O

_here is the total num er of isolates andn / is the num er of isolates elon in to the

/th t)pe.

Res&"+s

RAPD +6*in,. $nitiall) a set of ten decameric "A(D primers %a le O Qere selected

from the > primers of Wits A, P and U of &peron %echn. ased on the num er, ualit)

and pol)morphism of amplification products usin three P. mirabilis isolates ar itraril)

chosen $6(ro ?>?, $6(ro?> and $6(ro? >O. Applied to all the isolates, the selected

primers enerated a total of ? amplification products var)in etQeen @>> and CCK

p. #onsiderin just the F Proteus isolates, ands Qere identified of Qhich K?

KF.@`O e/hi ited some de ree of pol)morphism. Each decameric primer amplified

from @ to ?C se ments, of Qhich K to >` Qere pol)morphic.

%hirt)-five Proteus specific amplification products Qere identified Qhich can e

used to desi n Proteus specific '#A" primers %a le O. An e/ample of "A(D profiles

shoQin three Proteus specific ands of ??@ p, @? p and C@? p, and several

pol)morphic ands is shoQn in 3i ure ?. #onsiderin all the amplification products,

"A(D marWers alloQed the discrimination of almost all the isolates, e/ceptin three

isolates o tained from patient ?> $6(ro ???, ?? and ?? O, tQo isolates $6(ro ? ? and

$6(ro ? O from hemocultures of patient ? , and isolates $6(ro ?> and ?@? o tained

C


54/126

from foot secretion and sWin iops) of patient F 3i ure O. %hese isolates shoQed the

same anti iotic resistance patterns %a le ?O and Dienes t)pes data not shoQnO.

As e/pected, representatives of E. coli , M. morgani , and 5. alvei Qere clearl)

differentiated from each other and from the P. mirabilis isolates 3i ure O.

ISSR 4in,er*rin+in,5'even $''" inter enic sin le se uence repeatsO primers Qere

evaluated a ainst three isolates of P. mirabilis $6(ro ?>?, $6(ro?> and $6(ro? >O.

%he primers used Qere A#O%, A!OA, !AO%, A!Ob%, !A%AOC, !A#AOC, and

!%!#O C. No amplification Qas o tained Qith primer A!Ob%, Qhere primers

!A%AOC and !%!#OC produced smear. %he other four primers enerated Qell-defined

amplification products 3i ure ?O. Applied to all the isolates, the selected primers

enerated a total of CF scora le ands, var)in etQeen ? K and L?K p, @ LL, K`O

of these ands Qere pol)morphic Qithin P. mirabilis . %he main pro lem o served Qith

$''" marWers Qas the loQ reproduci ilit).

#onsidered to ether, the four $''" primers alloQed discrimination of all the

isolates. of the ? 6&P

marWers e/hi ited some de ree of pol)morphism, ein useful as discriminant marWers.

%hree ands E"$#-K?Kp , 6&P-??FFp and 6&P-C> p O Qere characteristics of P.

mirabilis. As occurred Qith "A(D anal)sis, the control species E. coli , M. morganii ,

and 5. alvei O Qere clearl) different form each other, and from the Proteus isolates

C@


55/126

3i ure O. Despite the loQ num er of amplification products o tained, E"$#-(#" and

6&P marWers alloQed separatin the F Proteus isolates into several roups 3i ure O.

Moreover, these marWers confirmed the identit) of isolates $6(ro ? ? and ? patient

? O, $6(ro ?> and $6(ro ?@? patient FO, and $6(ro ???, ?? and ?? isolated from

tra ueal and ear secretions of patient ?>.

"E(-(#" usin primers ?" and $ )ielded ?C amplification products that

alloQed the separation of the four acterial species included in the anal)sis. A ver) loQ

num er of ands Qere o tained in P. mirabilis C andsO Qith just tQo pol)morphic

products L Fp and C?p O, and a Proteus specific product of ? >p .

C%#*aris%n %4 #e+!%ds5As can e o served in %a le , discriminator) inde/

'impson s inde/O, Qhich represents the pro a ilit) that tQo isolates randoml) chosen

Qill e distin uished ) a iven method, varied etQeen >. ? for "E(-(#" to ?.>>>

for $''", Qith hi h values for "A(D, 6&P and E"$#. Amon "A(D primers, &(U >,

&(P?@, &(A??, &(U> and &(A?F ave the hi hest D$ values %a le O. $mportant

variation on the discriminator) inde/es Qas also o served amon $''" primers, Qhere

$''" ?, and >. F to ?.>>>O Qere more discriminant than $''"@ >.CK O.

#omparison of the similarit) values o tained Qith the five DNA fin erprintin

methods emplo)ed ave hi h and si nificant correlations etQeen "A(D and 6&P,

"A(D and E"$#, and 6&P and E"$# %a le @O. "E( similarit) values correlated Qith

those o tained usin 6&P, "A(D, and E"$#, ut these correlations should e taWen

Qith caution due to the loQ num er of amplification products o tained Qith "E(. No

correlation or loQ si nificant correlations Qere o served etQeen $''" similarit)

values and those o tained Qith the other methods.

CC


56/126


57/126

ro orate those reported ) #iesliWoQsWi et al. ?F , Qho shoQed !A#AOC and #AA%OC

as informative primers, and indicates that other primers, such as A#O% and A!OA,

can e useful in P. mirabilis studies. , Aeromonas

?@ , Bur0holderia ?? , ?ibrio C , amon others. P. mirabilis isolates o tained from

the same patient patients F, ?> and ? O in different data and9or sample source and e/-

hi itin the same anti iotic resistance and Dienes ehavior, e/hi ited identical or ver)

similar "A(D, E"$#-(#" and 6&P-(#" patterns, indicatin that these molecular

marWers can e used to verif) self contamination or strain persistence in a iven patient.

$n summar), the present data shoQed that "A(D, E"$#-(#" and 6&P-(#"

marWers had hi h discrimination a ilit) alloQin the enetic t)pin of clinical P.

mirabilis isolates, Qhich Qill prove useful for epidemiolo ical studies of this acteria.

A Jn%K"ed,#en+s

%he authors thanW the financial support from the 3oundation of the :niversit) of #a/ias

do 'ul, and the studentships provided ) #N( .

C


58/126

Re4eren es

?. Mo le) C CLK- C.

@. & .

. _alWer \. E., Mo haddame-7afari '., 2ocWatell #.V., 7ohnson D., 6elas, ".

UapA, the $ A-de radin metalloprotease of Proteus mirabilis , is a virulence

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@ .

CL


59/126

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CF


61/126

@. .

K>


62/126

%a le ?. 2ist of isolates used, their ori in, sample source, and anti iotic resistance.

$dentificationnum er

(atient A e 'e/ 'ampleori in

Date 'ample source Anti iotic resistance

$6(ro?>? >? K@ M #.:. S ? 9>K9>C (ulmonarsecretion n.d.

$6(ro?> > CK M $#: Adults ?L9>K9>C %ora/ic drain AM(, #$(, ':%$6(ro?>K >K L? 3 #.:. KS @9>K9>C :rine N$%$6(ro?> > KL 3 $#: Adults C9>K9>C 'putum AM($6(ro?>L >L M #.:. KS >F9> 9>C 'putum #$($6(ro?>F >F M #.:. S @?9>K9>C 3oot secretion n. d.$6(ro??> >F M #.:. S > 9> 9>C 'Win iops) AM(, #E3$6(ro??? ?> ? M $#: (ediatric > 9> 9>C %ra uealsecretion AM(, !EN, ':%

$6(ro?? ?> ? M $#: (ediatric > 9> 9>C %ra uealsecretion AM(, !EN, ':%$6(ro??@ ?? C M E.:. > 9> 9>C 'putum n. d.$6(ro??C ? C? 3 #hirur icalcenter ? 9>K9>C

A dominalhematoma

AM$, AM(, AM'] #E3] #PN.]#"&] #$(] ':%

$6(ro??K ?@ C M #ommunit) >@9> 9>C :rine AM(, #E3] #PN] !EN, N$%, N&", ':%$6(ro?? ?> ? M $#: (ediatric >F9> 9>C Ear secretion AM(, !EN, ':%$6(ro?? ?K F 3 '.M.%. @>9>L9>C :rine N$%$6(ro??F ? CC M #.:. S @>9> 9>C :rine AM(, N$%, N&", ':%$6(ro? > ?L CL 3 &. #. ?C9>L9>C :rine AM(, N$%, ':%$6(ro? ? ? L? M E.:. @9> 9>C 6lood culture AM(, ':%$6(ro? ? L? M E.:. ?L9> 9>C 6lood culture AM(, ':%$6(ro? @ ?F > 3 #ommunit) @>9> 9>C :rine N$%$6(ro? C > LF M E.:. ?C9>L9>C 6lood culture AM(, #$(, ':%$6(ro? K ? K 3 #ommunit) F9> 9>C :rine AM(, N$%, N&", ':%$6(ro? CK 3 #.:. KS >C9>L9>C :rine AM($6(ro? L @ > M #.:. KS @9>L9>C :rine N$%$6(ro? C > 3 #ommunit) 9>L9>C :rine N$%, ':%$6(ro? F > LF M #.:. KS @9>L9>C :rine AM(, #E3] N$%, N&", ':%$6(ro?@> K ? M $#: (ediatric >?9>L9>C :rine AM(, N$%$6(ro?@? > CK M $#: adults >C9>L9>C #hirur ic $nf. AM(, #$(, ':%$6(ro?@ L@ 3 #.:. S 9> 9>C _ound $nf. AM(, #$(, ':%.$6(ro?@@ L CF M #ommunit) @>9> 9>C :rine AM(, #E3] #PN] N$%, N&",':%$6@ >@ K? 3 #.:. KS ?F9>K9>C 6ile AM(, #E3] #PN$6Esc?>C >C ? 3 E.:. >9>K9>C :rine n. d.$6Mor?> > L@ M #.:. KS ??9> 9>K 3oot a scess AM(, ':%$6Mor??L ?C ? 3 #ommunit) ?K9>L9>C :rine AM(, #E3] #PN, N$%$6(ro T Proteus mirabilis ] $6Eco- Escherichia coli ] $6Mor- Morganella morganii ]

$6


63/126

%a le . (rimers se uences.

Pri#er Pri#er se &en es T%+a"ner%4 2ands

T%+a"ner %42ands in Proteus

Ner %4*%"6#%r*!i

2ands in Proteus

Si#*s%n sinde$ %4di0ersi+6

DI"A(D- &(A?> K !%!A%#!#A! @ @ K @ >.LK &(A?? K #AA%#!##!% @ @? ? F >. FF &(D > K A###!!%#A# @ F @ >.@@@ &(P?@ K A#!!!A!#AA @ @ ?@ F >.F ? &(P?K K #A!A#AA!## @ ?K >.K @ &(U>C K A!!#%!%!#% @ ?? L ? >.@@K &(U> K !!!%!!!%AA @ ?K ?> >. C &(U?> K ##!A#AAA## @ ? L K >. L &(U?F K !%!#!A!#AA @ ?C L >. CL &(U > K A#%%%!!#!! @ ?F L K >.FCK

;)) ) ; (5 )$''" ? A#O % ?K ?K ?K >.FK@$''" A!O A ? ? K >. F$''" @ !AO % >.CK$''" !A#AO C ? ? ? ?.>>>

=) ;5(((E"$#-(#" E"$# ?" and E"$# '' ;( (5 (6&P- (#" 6&P- A?" '( ;' ;( (5 )("E(-(#" "E(-(#" ?" and $ ; ' (5 ';

%a le @ T (earson product-moment correlation coefficient etQeen similarit) values o -

tained Qith enetic fin erprintin methods.BOX REP RAPD ISSR ERIC

BOX - >.L? >. C >.>KCns >.K KREP - >. ?L >.?C@ >. L>RAPD - >.> ns >. F@ISSR - >.? ?ERIC -'i nificant at ( >.>K, 'i nificant at ( >.>?, ns Not si nificant.

K


64/126

3i ure ?. E/amples of the profiles o tained usin the five (#" methods. A. "A(D

&(A??, 6. E"$#-(#", #. $''" , D. 6&P-(#", E. "E(-(#". 'amples from leftO $6

(ro?>? and ?> , $6 @, $6 Eco ?>C, $6 (ro ?>K to $6 (ro ?>L, $6 Mor ?> , and $6

(ro ?>F and ??>.

K@


65/126

3i ure . Dendro rams o tained for P. mirabilis and out roup species usin different

(#" fin erprintin methods. A. 6&P, 6. "E(-(#", #. "A(D, D. $''" and E. E"$#-

(#".

KC

IBPro 132

IBPro 133

IBPro 131

IBPro 130

IBPro 129

IBPro 128

IBPro 127

IBPro 126

IBPro 125

IBPro 124 IBPro 123

IBPro 122

IBPro 121

IBPro 120

IBPro 110

IBPro 106

IBPro 105

IBPro 102

IBPro 101

IBPro 119

IBPro 107

IBPro 109

IBPro 111

IBPro 113

IBPro 114

IBPro 115

IBPro 116

IBPro 118

IBPro 112

IBHal 103

IBMor 108

IBMor 117

IBEco 104

>.>>.?>.A>.@>.C

IBPro 128

IBPro 130

IBPro 132

IBPro 124

IBPro 131

IBPro 102

IBPro 118

IBPro 127

IBPro 106

IBPro 113 IBPro 122

IBPro 121

IBPro 105

IBPro 120

IBPro 119

IBPro 112

IBPro 116

IBPro 110

IBPro 111

IBPro 107

IBPro 133

IBPro 109

IBPro 101

IBPro 123

IBPro 125

IBPro 126

IBPro 129

IBPro 114

IBPro 115

IBHal 103

IBMor 108

IBMor 117

IBEco 104

>.>>.?>.A>.@>.C

IBPro 102

IBPro 131

IBPro 124

IBPro 119

IBPro 110

IBPro 132

IBPro 133

IBPro 129

IBPro 126

IBPro 101 IBPro 128

IBPro 113

IBPro 127

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CAP>TULO '

T@E E::ECT O: MONOTERPENES ON S ARMING DI::ERENTIATION

AND @AEMOL SIN ACTIVIT IN Proteus mirabilis 5

'er io Echeverri ara) ? , 2essandra Michelim?, , Ana (aula 2on ara) Delamare?,

#ristiane (aim Andrade?, '5r io &lavo (into da #osta? and 7ucimar Uacaria?.?$nstitute of 6iotechnolo ), :niversit) of #a/ias do 'ul, #a/ias do 'ul, 6ra*il.

!eneral


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A2s+ra +3 :rinar) tract infection ) Proteus mirabilis depends on several virulence

properties that are coordinatel) re ulated Qith sQarmin differentiation. m 92. Moreover, citral, citronellol, and eraniol effectivel) inhi it P. mirabilis

sQarmin in a dose dependent manner, reducin sQimmin 9sQarmin cell

differentiation and haemol)sin activit), and enhancin iofilm formation at ?9?> M$#

concentration. %he inhi ition of P. mirabilis sQarmin and virulence factor e/pression

) selected o/) enated terpenoids su est that essential oils Qith hi h concentration of

these compounds have the potential to e developed as products for preventin P.

mirabilis infections.

?e6K%rds3terpenoids, cell differentiation, Proteus mirabilis , M$#.

K


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In+r%d& +i%n

Proteus mirabilis is one of the most important patho ens associated Qith

complicated urinar) tract infections and acteremia, affectin patients Qith anatomical

a normalities, immunodeficienc), and lon -term urinar) catheteri*ation ?, . :rinar)

tract infection Qith P. mirabilis start Qith ladder coloni*ation, causin acteriuria and

c)stitis, and can ascend to the Widne)s, leadin to acute p)elonephritis, chronic

inflammation, Widne) stones and renal failure.

A prominent feature of P. mirabilis is the a ilit) to sQarm on a ar plates and

form hi hl) ordered and terraced colonies Qith characteristic concentric rin s.

'Qarmin is process in Qhich short ve etative sQimmin cells differentiate to lon

hi hl) fla ellated forms referred to as sQarmer cells ?, @ . 'Qarmer cell differentiation

depends on surface contact, inhi ition of fla ellar rotation, cell densit) and cell-cell

si nalin C, K .

'everal potential virulence factors includin haemol)sin, sQarmin , adhesins,

proteases, and ureases, ma) e responsi le for the patho enicit) of P. mirabilis - .

%he e/pression of virulence factors, includin haemol)sin, urease and protease, and the

a ilit) to invade human urothelial cells, is coordinatel) upre ulated durin sQarmin K,

-?> . Numerous compounds have een reported to prevent P. mirabilis sQarmin Gin

vitroI. Amon these are charcoal and ar itone ?? , urea ? , ethanol and sodium

a*ide ?@ , p-nitrophen)l l)cerol ? , ?C, ?K , fatt) acids ? , and resveratrol ?L .

%erpenes are secondar) meta olites, represented ) hemiterpenes,

monoterpenes, ses uiterpenes and their terpenoid derivatives. %hese isoprenoid

compounds are the main constituents of essential oils, ein responsi le for their aroma

or flavor. Essential oils are o tained from spices, aromatic her s, fruits, and floQers.

KL


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!enerall), the oil composition is a alance of various compounds, althou h in man)

species one constituent ma) prevail over all others ? .

%erpenes and terpenoids are active a ainst acteria, fun i, viruses, and proto*oa

? . %he anti acterial action of terpenes is not full) understood ut is speculated to

involve mem rane modifications resultin in alterations of mem rane permea ilit) and

in leaWa e of intracellular materials ?F . #lassified as !enerall) "eco ni*ed As 'afe

!"A'O, essential oils are used in food, cosmetics and pharmaceuticals, and have

ained special interest ecause of the resistance to anti iotics that microor anisms have

ac uired >, ? .

$n this stud) Qe evaluated the antimicro ial activit) of several monoterpenes,

and the effect of su -inhi itor) concentrations of these compounds on sQarmin ,

iofilm formation, and haemol)sin activit) of Proteus mirabilis .

Res&"+s and Dis &ssi%n

%he anti- acterial activit) of seventeen monoterpenes a ainst P. mirabilis 2 ,

as revealed ) their M$# values, is summari*ed in %a le ?. %he results shoQed that

monoterpenes e/hi ited anti- acterial activit) Qith var)in ma nitudes. #itral,

citronellol, eraniol, R-terpineol, terpinene-C-ol, linalool, and pule one Qere the most

effective monoterpenes a ainst P. mirabilis 2 , Qith M$# values etQeen @ and K m 9

2. %his results Qere confirmed Qith other K isolates of P. mirabilis and isolates of P.

vulgaris data not shoQO, indicatin that these M$# values are representative of the

antimicro ial

Documents

Oleos Essenciais p Proteus