PAI-1 ELISA - ibl-international.com · Os concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de iniciar o procedimento de teste. Se houver formação

Instruções de Utilização

PAI-1 ELISAImunoensaio enzimático para a determinação quantitativa

do Inibidor do activador do plasminogénio-1 (PAI-1) no soro e plasma humanos, nos sobrenadantes de culturas celulares

e outros fluidos biológicos.

BE59351

96

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected] D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

TABELA DE CONTEÚDOS

1. Aplicações 2

2. Sumário 2

3. Princípio do Teste 2

4. Materiais Fornecidos 3

5. Instruções de conservação – Kit ELISA 4

6. Recolha e armazenamento de amostras 4

7. Materiais Necessários Mas Não Fornecidos 4

8. Avisos e Precauções 5

9. Preparação de Reagentes 6

10. Procedimento do Ensaio 9

11. Cálculo de Resultados 11

12. Limitações do Procedimento 13

13. Características de Desempenho 13

14. Informações sobre encomendas 15

15. Sumário da Preparação de Reagentes 15

16. Sumário do Procedimento do Ensaio 16

17. Bibliografia 17

21.11.14 (24)

1. Aplicações O ELISA para PAI-1 humano é um ensaio imunossorvente ligado a enzima para a deteção quantitativa de PAI-1 humano. O ELISA para PAI-1 humano destina-se ao uso em diagnóstico in vitro. Não se destina a ser usado em procedimentos terapêuticos.

2. Súmario O inibidor do ativador do plasminogénio-1 (PAI-1) é o principal inibidor dos ativadores de plasminogénio no plasma, desativando rapidamente tanto o ativador do plasminogénio tecidular (t-PA) como o ativador do plasminogénio tipo uroquinase (u-PA). O PAI-1 é uma glicoproteína de cadeia simples com um peso molecular de 47 kilodaltons. Durante a fibrinólise, o ativador do plasminogénio tecidular (tPA) converte a proteína inativa plasminogénio em plasmina, a qual desempenha um papel fundamental na fibrinólise, ao decompor a fibrina e proporcionar atividade localizada da protease em diversas funções fisiológicas. O PAI- 1 é sintetizado no fígado e pelas células endoteliais, e a sua síntese é regulada por diversos mediadores fisiológicos, incluindo endotoxina, interleucina-1, fator de crescimento de fibroblastos-2, e lípidos. O inibidor do ativador do plasminogénio-1 é um inibidor importante do sistema fibrinolítico e, portanto, níveis elevados podem suprimir a fibrinólise e resultar num risco acrescido de trombose. Verificou-se que níveis aumentados de PAI-1 estão associados a diversos fatores de risco ateroscleróticos, e verificou-se também que o PAI-1 atua como um fator protrombínico tanto em perturbações tromboembólicas arteriais como venosas. Os níveis aumentados de PAI-1 estão associados a uma incidência acrescida de síndrome coronária aguda. Os níveis de PAI-1 também estão aumentados em doentes com doença das artérias coronárias (CAD) aguda e crónica e em doentes que sofrem de restenose após angioplastia coronária..

3. Princípio do Teste

Um anticorpo de revestimento anti-PAI-1 humana é adsorvido nos micropoços.

Figura 1

Figura 2

A PAI-1 humana presente na amostra ou no padrão liga-se aos anticorpos adsorvidos nos micropoços. Um anticorpo anti-PAI-1 humana conjugado com biotina é adicionado, ligando-se à PAI-1 humana capturada pelo primeiro anticorpo.

Após a incubação, o anticorpo anti- PAI-1 humana conjugado com biotina não ligado é removido durante a lavagem. É adicionada Estreptavidina-HRP que se liga ao anticorpo anti- PAI-1 humana conjugado com biotina.

Figura 3

Estreptavidina-HRP-

Segunda Incubação

Padrão o Amostra

Conjugado de Biotina

Primeira Incubação

Anticorpo do Revestimento

Micropoços Revestidos

2

Após a incubação, a Estreptavidina-HRP não ligada é removida durante a lavagem e adiciona-se aos poços um substrato reativo com HRP.

Figura 4

Substrato

Terceira Incubação

Forma-se um produto colorido em proporção à quantidade de PAI-1 humana presente na amostra ou no padrão. A reação é terminada pela adição de ácido e a absorvância é medida a 450 nm. Uma curva padrão é preparada a partir de 7 diluições padrão de PAI-1 humana e determina-se então a concentração da amostra de PAI-1 humana.

Figura 5

Substrato reagiu

4. Materiais Fornecidos

1 bolsa de alumínio com uma placa de micropoços revestidos com anticorpo monoclonal de PAI-1 humana

1 frasco (70 μL) Conjugado de Biotina anticorpo monoclonal anti-PAI-1 humana

1 frasco (150 μL) Streptavidina-HRP

2 frascos Padrão PAI-1 humano, liofilizados, 10000 pg/mL após reconstituição

1 frasco (5 mL) Tampão de Reacção Concentrado 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA)

1 frasco (50 mL) con Tampão de Lavagem Concentrado 20x (PBS con 1 % Tween 20)

1 frasco (15 mL) Solução de Substrato (tetrametilbenzidina)

1 frasco (15 mL) Solução de Paragem (1M Ácido Fosfórico)

4 Película Aderente

3

5. Instruções de conservação – Kit ELISA Conserve os reagentes do kit entre 2 °C e 8 °C exceto os controlos. Conserve os controlos liofilizados a -20 °C. Imediatamente após a utilização, os reagentes remanescentes devem ser colocados de novo no frio (2-8 °C), e os controlos a -20 °C, respetivamente. A data de validade do kit e dos reagentes está indicada nos rótulos. A data de validade dos componentes do kit só pode ser garantida se os componentes forem devidamente armazenados e, no caso de utilização repetida de um componente, se este reagente não for contaminado pela primeira manipulação.

6. Recolha e armazenamento de amostras Sobrenadante de cultura celular, soro e plasma (EDTA, citrato, heparina) foram testados com este ensaio. Outras amostras biologicas podem ser adequadas para utilização no ensaio. Remova o soro do coágulo logo que possível após a coagulação.

Tome atenção a um possível “Efeito Gancho” devido a concentrações elevadas da amostra (consulte o capítulo 11).

As amostras que contenham um precipitado visível devem ser clarificadas antes de utilizadas no ensaio. Não utilize espécimes grosseiramente hemolisados ou lipémicos.

As amostras devem ser aliquotadas e conservadas congeladas a -20 °C para evitar perda de PAI-1 humana bioativa. Se as amostras forem testadas num prazo de 24 horas, podem ser conservadas a uma temperatura entre 2 e 8 °C (para estabilidade da amostra, consulte a secção 13.5).Evite ciclos repetidos de congelação-descongelação. Antes do ensaio, a amostra congelada deve atingir a temperatura ambiente lentamente e ser misturada suavemente.

7. Materiais Necessários Mas Não Fornecidos- Pipetas graduadas de 5 mL e 10 mL

- Micropipetas de canal único ajustáveis de 5 µL a 1000 µL com ponteiras descartáveis

- Micropipetas multicanais ajustáveis de 50 µL a 300 µL com ponteiras descartáveis

- Reservatório de micropipeta multicanais

- Provetas, balões de vidro, cilindros necessários para a preparação dos reagentes

- Dispositivo para descarga de solução de lavagem (garrafa de esguicho multicanal ou sistema de lavagem automática)

- Leitor de tiras de micropoços com capacidade para ler a 450 nm (620 nm como comprimento de onda de referência opcional)

- Agua bidestilada o deionizada

- Calculadora estatística com programa para realizar análise de regressão

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8. Avisos e Precauções- Todos os produtos químicos devem ser considerados como potencialmente perigosos. Recomendamos,

portanto, que este produto seja manuseado apenas por pessoas com formação em técnicas laboratoriais e que seja manuseado de acordo com os princípios das boas práticas laboratoriais.

- Use vestuário protetor adequado, como bata de laboratório, óculos de proteção e luvas. Deve usar-se de cuidado para evitar o contacto com a pele ou os olhos. Em caso de contacto com a pele ou os olhos, lave imediatamente com água. Consulte a(s) ficha(s) de dados de segurança do material e/ou as declarações de segurança para obter instruções específicas.

- Os reagentes destinam-se ao uso em diagnóstico in vitro e não se destinam a ser usados em procedimentos terapêuticos.

- Não misture nem substitua os reagentes com os de outros lotes ou outras origens.

- Não utilize os reagentes do kit depois de vencida a data de validade indicada no rótulo.

- Não exponha os reagentes do kit à luz forte durante o período de armazenamento ou incubação.

- Não pipete com a boca.

- Não coma nem fume em áreas onde os reagentes ou as amostras do kit são manuseados.

- Evite o contacto da pele ou das membranas mucosas com os reagentes ou os espécimes do kit.

- Devem usar-se luvas de latex descartáveis ou de borracha ao manusear os reagentes ou os espécimes do kit.

- Evite o contacto do substrato com agentes oxidantes e com metal.

- Evite salpicos ou a criação de aerossóis.

- De modo a evitar a contaminação microbiana ou a contaminação cruzada de reagentes ou espécimes que possam invalidar o teste, use ponteiras nas pipetas e/ou pipetas descartáveis.

- Utilize tabuleiros de reagentes limpos exclusivos para distribuir o conjugado e o reagente do substrato.

- A exposição ao ácido inativa o conjugado.

- Deve usar-se água destilada em vidro ou água desionizada na preparação dos reagentes.

- O substrato deve estar à temperatura ambiente antes de ser usado.

- Descontamine e elimine os espécimes e todos os materiais potencialmente contaminados, uma vez que podem conter agentes infeciosos. O método preferencial de descontaminação é por autoclavagem durante no mínimo 1 hora a 121.5 °C.

- Os resíduos líquidos que não contenham ácido e os resíduos neutralizados podem ser misturados com hipoclorito de sódio em volumes tais desde que a mistura final contenha 1.0 % de hipoclorito de sódio. Espere 30 minutos para uma descontaminação eficaz. Os resíduos líquidos que contenham ácido devem ser neutralizados antes da adição de hipoclorito de sódio.

5

9. Preparação de ReagentesOs concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de iniciar o procedimento de teste. Se houver formação de cristais nos concentrados de tampão, aqueça-os ligeiramente até que fiquem totalmente dissolvidos.

9.1. Tampão de Lavagem (1x) Deite o conteúdo total (50 mL) do Concentrado de Tampão de Lavagem (20x) num cilindro graduado limpo de 1000 mL. Encha até ao volume total de 1000 mL com água destilada em vidro ou água desionizada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma. Transfira para um frasco para lavagem limpo e conserve a uma temperatura entre 2 °C e 25 °C. Tenha em atenção que o Tampão de Lavagem (1x) se mantém estável durante 30 dias. O Tampão de Lavagem (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela:

Número de tiras Tampão de Lavagem Concentrado (20x) (mL) Agua bidest. (mL)1 - 6 25 4751 - 12 50 950

9.2. Tampão de Reacção (1x)Deite o conteúdo total (5 mL) do Concentrado de Tampão de Reacção (20x) num cilindro graduado limpo de 100 mL. Encha até ao volume total de 100 mL com água destilada. Misture suavemente para evitar a formação de espuma.

Conserve entre 2 °C e 8 °C. Tenha em atenção que o Tampão de Reacção (1x) se mantém estável durante 30 dias.

O Tampão de Reacção (1x) pode também ser preparado de acordo com a seguinte tabela:

Número de tiras Tampão de Reacção Concentrado (20x) (mL) Agua bidest. (mL)1 - 6 2.5 47.51 - 12 5.0 95.0

9.3. Conjugado de BiotinaTenha em atenção que o Conjugado de Biotina deve ser usado no máximo de 30 minutos após a diluição.

Faça uma diluição de 1:100 da solução concentrada de Conjugado de Biotina com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:

Número de tiras Conjugado de Biotina (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)1 - 6 0.03 2.971 - 12 0.06 5.94

9.4. Streptavidina-HRPTenha em atenção que a Estreptavidina-HRP deve ser usada no máximo de 30 minutos após a diluição. Faça uma diluição de 1:200 da solução concentrada de Estreptavidina-HRP com Tampão de Reacção (1x) num tubo de plástico limpo conforme necessário de acordo com a seguinte tabela:

Número de tiras Streptavidina-HRP (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)1 - 6 0.03 5.971 - 12 0.06 11.94

6

9.5. Padrão PAI-1 HumanoReconstitua o padrão de PAI-1 humano ao adicionar água destilada. O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de vidro do padrão. Agite ou misture suavemente para garantir a solubilização completa e homogénea (concentração do padrão reconstituído = 10000 pg/mL). Deixe que o padrão se reconstitua durante 10-30 minutos. Misture bem antes de fazer as diluições. Após a utilização, o padrão restante não pode ser guardado e deverá ser eliminado.

As diluições do padrão podem ser preparadas diretamente na placa do micropoço (consulte a secção 10. d) ou, em alternativa, em tubos (consulte a secção 9.5.1).

9.5.1. Diluição Padrão Externa Rotule 7 tubos, um para cada ponto do padrão.

S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Depois prepare diluições em série de 1:2 para a curva padrão da seguinte forma: Pipete 225 µL de Diluente de Amostras para cada tubo.

Pipete 225 µL de padrão reconstituído (concentração = 10000 pg/mL) para o primeiro tubo, rotulado S1, e misture (concentração do padrão 1 = 5000 pg/mL). Pipete 225 µL desta diluição para o segundo tubo, rotulado S2, e misture bem antes da próxima transferência. Repita as diluições em série mais 5 vezes criando assim os pontos da curva padrão (veja a Figura 6).

O Tampão de Reacção (1x) serve como teste em branco.

Figure 6

S1 S2 S3 S4 - S7

Transferir 225 µL

PAI-1 Humano Padrão Diluido

Tampão de Reacção 225 µL Eliminar 225 µL

7

10. Procedimento do Ensaio

a. Predilua as suas amostras antes de começar com o procedimento de ensaio. amostras 1:50 com Buffer de Ensaio (1x) segundo o seguinte esquema: Diluição: 10 μL amostra + 490 μL Tampão de Reacção (1x)

b. Determine o número de tiras de micropoços necessário para testar o número desejado de amostras mais o número apropriado de poços necessários para executar os brancos e os padrões. Cada amostra, padrão, branco e amostra opcional de controlo deve ser testado em duplicado. Remova as tiras extra do micropoço do suporte e guarde num saco de alumínio com o dessecante fornecido a uma temperatura de 2-8 °C fechado hermeticamente.

c. Lave as tiras do micropoço duas vezes com aproximadamente 400 μL de Tampão de Lavagem por poço realizando uma aspiração completa do conteúdo do micropoço entre as lavagens. Permita que o tampão de lavagem repouse nos poços durante cerca de 10-15 segundos antes de aspirar. Tome cuidado para não arranhar a superfície dos micropoços. Após o último passo de lavagem, esvazie os poços e bata com as tiras dos micropoços em papel absorvente ou toalhas de papel para remover o tampão de lavagem em excesso. Utilize as tiras dos micropoços imediatamente após a lavagem. Em alternativa, as tiras dos micropoços podem ser colocadas invertidas sobre um papel absorvente húmido durante 15 minutos no máximo. Não deixe que os poços sequem.

d. Diluição de padrão na placa do micropoço (Em alternativa, a diluição de padrão pode ser preparada em tubos – consulte a secção 9.5.1): Adicione 100 μL de Diluente de Amostras em duplicado em todos os poços de padrão. Pipete 100 μL do padrão preparado (consulte Preparação de Padrão na secção 9.5, concentração = 10000 pg/mL) em duplicado no poço A1 e A2 (consulte a Tabela 1). Misture o conteúdo dos poços A1 e A2 por aspiração e ejeção repetida (concentração do padrão 1, S1 = 5000 pg/mL), e transfira 100 μL para os poços B1 e B2, respetivamente (consulte a Figura 7). Tenha cuidado para não arranhar a superfície interior dos micropoços. Continue este procedimento 5 vezes, criando duas filas de diluições padrão de PAI-1 humana variando entre 5000.0 e 78 pg/mL. Elimine 100 μL do conteúdo dos últimos micropoços (G1, G2) utilizados.

Figura 7

S1 S2 S3 S4 - S7

Transferir 100 µL

Padrão 1:1000 reconstituída PAI-1 Humano

Tampão de Reacção 100 µL Eliminar 100 µL

8

No caso de uma diluição de padrão externo (consulte a secção 9.5.1), pipete 100 μL destas diluições de padrão (S1 - S7) nos poços de padrão de acordo com a Tabela 1.

Tabela 1 A tabela representa um exemplo da disposição de testes em branco, padrões e amostras nas tiras dos micropoços:

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1 2 3 4

A Padrão 1 (5000 pg/mL)

Padrão 1 (5000 pg/mL) Amostra 1 Amostra 1

B Padrão 2 (2500 pg/mL)


C Padrão 3 (1250 pg/mL)


D Padrão 4 (625 pg/mL)


E Padrão 5 (313 pg/mL)


F Padrão 6 (156 pg/mL)


G Padrão 7 (78 pg/mL)


H Blanco Blanco Amostra 8 Amostra 8

e. Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x) em duplicado aos poços em branco.

f. Adicione 50 μL de Tampão de Reacção (1x) aos poços da amostra.

g. Adicione 50 μL de cada amostra em duplicado aos poços da amostra.

h. Prepare o Conjugado de Biotina (consulte Conjugado de Biotina na secção 9.3).

i. Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços.

j. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 2 horas, num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.

k. Prepare a Estreptavidina-HRP (consulte a preparação de Estreptavidina-HRP na secção 9.4).

l. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 3 vezes de acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo.

m. Adicione 100 µL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços, incluindo os poços em branco.

n. Cubra com uma película adesiva e incube à temperatura ambiente (18-25 °C) durante 1 hora num agitador de microplacas, se houver, definido para 400 rpm.

o. Remova a película adesiva e esvazie os poços. Lave as tiras dos micropoços 3 vezes de acordo com o ponto b. do protocolo de teste. Avance de imediato para o próximo passo.

p. Pipete 100 μL de Substrato TMB para todos os poços.

q Incube as tiras do micropoço à temperatura ambiente (18-25 °C) durante cerca de 10 min. Evite a exposição direta à luz intensa.

O desenvolvimento de cor na placa deve ser monitorizado e a reação do substrato interrompida (veja o próximo ponto deste protocolo) antes que os poços positivos não possam ser devidamente registáveis. A determinação do período de tempo ideal para o desenvolvimento da cor tem de ser feita individualmente para cada ensaio.

Recomenda-se adicionar a solução de paragem quando o padrão mais elevado tiver desenvolvido uma cor azul-escura. Em alternativa, o desenvolvimento da cor pode ser monitorizado a 620 nm pelo leitor de placas ELISA. A reação do substrato deve ser parada logo que o Padrão 1 atingiu uma DO de 0.9-0.95.

r Pare a reação da enzima ao pipetar rapidamente 100 μL de Solução de Paragem para cada poço. É importante que a solução de paragem seja espalhada rápida e uniformemente pelos micropoços para inativar completamente a enzima. Os resultados devem ser lidos imediatamente após a solução de paragem ser adicionada ou no período de uma hora se as tiras dos micropoços forem guardadas a uma temperatura de 2-8 °C no escuro.

s Leia a absorvância de cada micropoço num espectrofotómetro usando 450 nm como o comprimento de onda principal (opcionalmente 620 nm como o comprimento de onda de referência; 610 nm a 650 nm é aceitável). Limpe o leitor de placas de acordo com as instruções do fabricante ao usar os poços para testes em branco. Determine a absorvância das amostras e dos padrões.

Nota: No caso de incubação sem agitação, os valores da D.O. obtidos podem ser inferiores aos indicados abaixo. Não obstante os resultados continuam a ser válidos.

11. Cálculo de Resultados

- Calcule os valores médios de absorvância para cada conjunto de padrões e amostras em duplicado. Os duplicados devem estar a 20 por cento do valor médio.

- Crie uma curva padrão ao representar graficamente a absorvância média para cada concentração de padrão na ordenada face à concentração da PAI-1 humana na abcissa. Desenhe a curva que melhor se ajusta através dos pontos no gráfico (recomenda-se um ajuste de curva de 5 parâmetros).

- Para determinar a concentração de PAI-1 humana em circulação para cada amostra, encontre primeiro o valor médio de absorvância na ordenada e prolongue uma linha horizontal para a curva padrão. No ponto de interseção, prolongue uma linha vertical para a abcissa e leia a concentração correspondente de PAI-1 humana.

- Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1:100 (50 μL 1:50 amostra pré-diluído + 50 μL Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x 100).

- O cálculo das amostras com uma concentração que exceda o padrão 1 poderá resultar em níveis de PAI-1 humana baixos e incorretos (Efeito gancho). Tais amostras exigem uma pré-diluição externa adicional de acordo com os valores esperados da PAI-1 humana com o Tampão de Reacção (1x) de modo a quantificar com precisão o nível real de PAI-1 humana.

- Tem-se sugerido que cada instituição de teste determine uma amostra de controlo da concentração conhecida de PAI-1 humana e execute este controlo adicional com cada ensaio. Se os valores obtidos não se encontrarem dentro do intervalo esperado do controlo, os resultados do ensaio podem ser inválidos.

- A Figura 8 mostra uma curva padrão representativa. Esta curva não pode ser usada para obter resultados de teste. Cada laboratório deve preparar uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio.

10

Figura 8 Curva padrão representativa do ELISA para PAI-1 humana. A PAI-1 humana foi diluída duas vezes em série em Tampão de Reacção (1x). Não use esta curva padrão para obter resultados de teste. Deve ser executada uma curva padrão para cada grupo de tiras de micropoços usadas no ensaio.

Tabela 2 Dados típicos usando o PAI-1 ELISA Comprimento de onda: 450 nm Comprimento de onda de referência: 620 nm

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PadrãoConcentração do

PAI-1 humano (pg/mL)

D.O. (450 nm)

D.O. (450 nm) Media

C.V. (%)

1 5000 1.934 1.886

1.910 1.3

2 2500 1.114 1.152

1.133 1.7

3 1250 0.632 0.652

0.642 1.6

4 625 0.337 0.357

0.347 3.0

5 313 0.218 0.203

0.211 3.7

6 156 0.134 0.121

0.127 5.0

7 78 0.088 0.077

0.083 6.4

Blanco 0 0.037 0.038

0.038 1.2

Os valores da D.O. da curva padrão podem variar de acordo com as condições de execução do ensaio (p. ex., funcionário, técnica de pipetagem, técnica de lavagem ou efeitos da temperatura). Além disso, a vida útil do kit pode afetar a atividade enzimática e, assim, a intensidade da cor. Os valores medidos continuam a ser válidos.

12. Limitações do Procedimento

- Uma vez que as condições exatas podem variar de um ensaio para outro, deve ser criada uma curva padrão para cada série de testes.

- A contaminação bacteriana ou fúngica das amostras a testar ou dos reagentes ou a contaminação cruzada entre os reagentes pode dar origem a resultados erróneos.

- É preferível usar ponteiras de pipetas descartáveis, frascos ou material de vidro; o material de vidro reutilizável deverá ser lavado e todos os detergentes deverão ser eliminados antes de o material ser usado novamente.

- A lavagem inadequada ou insuficiente em qualquer fase do procedimento dará origem a resultados falso positivos ou falso negativos. Esvazie os poços completamente antes de distribuir solução de lavagem fresca, encha com tampão de lavagem conforme indicado para cada ciclo de lavagem e não deixe que os poços fiquem destapados ou sequem durante períodos prolongados.

- O uso de imunorradioterapia tem aumentado significativamente o número de doentes com anticorpos humanos IgG anti-rato (HAMA). HAMA pode interferir nos ensaios que utilizam anticorpos monoclonais murinos, dando origem tanto a resultados falso positivos como falso negativos.

- Amostras de soro contendo anticorpos de imunoglobulinas murinas ainda podem ser analisadas em tais ensaios quando as imunoglobulinas murinas (soro, fluido ascítico ou anticorpos monoclonais de especificidade irrelevante) são adicionadas à amostra.

13. Características de Desempenho

13.1. SensibilidadeO limite de deteção da PAI-1 humana definida como a concentração do analito que resulta numa absorvância significativamente maior do que a do meio de diluição (média mais 2 desvios padrão) foi determinado como 29.0 pg/mL (média de 6 ensaios independentes).

13.2. Reprodutibilidade

13.2.1. Intra-EnsaioA reprodutibilidade dentro do ensaio foi avaliada em 3 experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações diferentes de PAI-1 humana. Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da PAI-1 humana e o coeficiente de variação para cada amostra (veja a Tabela 3). O coeficiente de variação global calculado intra-ensaio foi de 4.7 %

12

Tabela 3 A concentração média da PAI-1 humana e o coeficiente de variação de cada amostra:

13

Amostra Experimento Concentração Média de PAI-1 humano (ng/mL)

Coeficiente de Variação (%)

1 1 2 3

53.7 60.1 57.2

5.9 1.9 1.7

2 1 2 3

7.7 8.3 8.7

11.6 3.2 6.0

3 1 2 3

133.8 139.4 128.5

5.1 1.9 5.7

4 1 2 3

62.0 59.4 55.6

4.2 2.6 3.7

5 1 2 3

44.0 43.3 40.6

6.4 4.5 7.2

6 1 2 3

28.4 33.6 30.3

5.5 2.9 4.2

7 1 2 3

31.5 33.5 30.5

6.0 1.6 4.0

8 1 2 3

51.4 52.5 51.4

9.4 1.4 4.9

13.2.2. Inter-EnsaioA reprodutibilidade de ensaio para ensaio no mesmo laboratório foi avaliada em 3 experiências independentes. Cada ensaio foi realizado com 6 réplicas de 8 amostras de soro contendo concentrações diferentes de PAI-1 humana. Foram executadas 2 curvas padrão em cada placa. Os dados abaixo mostram a concentração média da PAI-1 humana e o coeficiente de variação calculados em 18 determinações de cada amostra (veja a Tabela 4). O coeficiente de variação global calculado entre ensaios foi de 5.0 %.

Tabela 4 A concentração média da PAI-1 humana e o coeficiente de variação de cada amostra.

Amostra Concentração Média de PAI-1 humano (ng/mL)

Coeficiente de Variação (%)

1 57.0 5.62 8.2 5.83 133.9 4.14 59.0 5.55 42.6 4.26 30.8 8.57 31.8 4.88 51.7 1.2

13.3. Recuperação do reforçoA recuperação do reforço foi avaliada ao reforçar 4 níveis de PAI-1 humana no soro e plasma. As recuperações foram determinadas em 3 experiências independentes com 4 réplicas cada. A quantidade de PAI-1 humano endógeno em amostras não enriquecidas subtraiu-se dos valores enriquecidas. A recuperação variou entre 64.5 % e 84.8 % com uma recuperação global média de 72.2 % para soro e entre 44.8% e 68.4% com uma recuperação global média de 58.7% para as amostras de plasma.

13.4. Paralelismo de diluição Amostras de soro com diferentes níveis de PAI-1 humana foram analisadas em 2 diluições em série com 4 réplicas cada. A recuperação variou entre 91.9 % e 111.8 % com uma recuperação global média de 98.7 % (veja Tabela 5).

Tabela 5

Concentração Esperada da Amostra Diluição

Concentração Observada PAI-1 humana (ng/mL)

Recuperação da Concentração da PAI-1 humana (ng/mL) Esperada da PAI-1 (%)

1 1 2 4 8

--82.4 41.2 20.6

164.9 78.6 39.3 19.5

--95.3 95.3 94.4

2 1 2 4 8

--63.7 31.9 15.9

12.75 63.0 30.0 16.5

-- 98.8 94.2 103.5

3 1 2 4 8

.. 30.2 15.1 7.6

60.4 28.5 14.6 8.2

-- 94.5 96.8 108.8

4 1 2 4 8

-- 23.5 11.7 5.9

46.9 21.5 11.6 6.6

-- 91.9 98.8 111.8

13.5. Estabilidade da amostra

13.5.1. Estabilidade durante a congelação-descongelação Alíquotas de soro e amostras de plasma (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C e descongeladas 5 vezes, e foram determinados os níveis de PAI-1 humano. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da PAI-1 humana através da congelação e descongelação.

13.5.2. Estabilidade de conservação Alíquotas de soro e amostras de plasma (com reforço ou sem reforço) foram armazenadas a -20 °C, 2-8 °C, à temperatura ambiente, e o nível do PAI-1 humana foi determinado após 24 h. Não houve perda significativa da imunorreatividade detetada da PAI-1 humana durante a conservação nas condições acima descritas.

13.6. Especificidade O ensaio deteta simultaneamente o PAI-1 humano nas formas natural e recombinante. A interferência dos fatores em circulação do sistema imunitário foi avaliada ao reforçar estas proteínas em concentrações fisiologicamente relevantes num soro positivo de PAI-1 humana. Não se detetou reatividade cruzada.

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13.7. Valores esperadosUm painel de dadores aparentemente saudáveis e aleatoriamente selecionados (do sexo masculino e feminino) foi testado quando à PAI-1 humana. Os níveis descobertos de PAI-1 humanos para os soros variaram entre 1.2 e 286.0 ng/mL com um nível médio de 41.9 ng/mL para o plasma (EDTA) entre 0.0 e 110.0 ng/mL com um nível médio de 14.1 ng/mL, para o plasma (heparinizado) entre 0.9 e 99.0 ng/mL com um nível médio de 22.9 ng/mL e para o plasma (citrato) entre 2.4 e 43.8 ng/ml com um nível médio de 17.9 ng/mL.

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14. informações sobre encomendas

Ver a última página.

15. Sumário da Preparação de Reagentes

15.1. Tampão de Lavagem (1x)Adicione Concentrado de Tampão de Lavagem 20x (50 mL) a 950 mL de água destilada.

Número de tiras Tampão de Lavagem Concentrado (mL) Agua Bidest. (mL)1-6 25 475

1-12 50 950

15.2. Tampão de Reacção (1x)Adicione Concentrado de Tampão de Reacção 20x (5 mL) a 95 mL de água destilada.

Número de tiras Tampão de Reacção Concentrado (mL) Agua Bidest. (mL)1-6 2.5 47.5

1-12 5.0 95.0

15.3. Conjugado de BiotinaFaça uma diluição de 1:100 de Conjugado de Biotina em Tampão de Reacção (1x):

Número de tiras Conjugado de Biotina (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)1-6 0.03 2.97

1-12 0.06 5.94

15.4. Streptavidina-HRP

Faça uma diluição de 1:200 de Estreptavidina-HRP em Tampão de Reacção (1x):

Número de tiras Streptavidina-HRP (mL) Tampão de Reacção (1x) (mL)1-6 0.03 5.97

1-12 0.06 11.94

15.5. Padrão PAI-1 HumanoReconstitua o padrão de PAI-1 humana liofilizado com água destilada. (O volume de reconstituição está indicado no rótulo do frasco de padrão.)

16. Sumário do Procedimento do Ensaio

1. Pré-diluir amostra 1:50 com Tampão de Reacção (1x).

2. Determine o número de tiras de micropoços necessário.

3. Lave as tiras dos micropoços duas vezes com Tampão de Lavagem.

4. Diluição de padrão na placa do micropoço: Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, a todos os poços de padrão. Pipete 100 μL do padrão preparado para os primeiros poços e crie diluições de padrão para transferir 100 μL de poço para poço. Elimine 100 μL dos últimos poços. Em alternativa, diluição de padrão externa em tubos (consulte a secção 9.5.1): Pipete 100 μL destas diluições de padrão nas tiras dos micropoços.

5. Adicione 100 μL de Tampão de Reacção (1x), em duplicado, aos poços em branco.

6. Adicione 50 μL de Tampão de Reacção (1x) aos poços com as amostras.

7. Adicione 50 μL da amostra pré-diluído em duplicado aos poços de amostra designados.

8. Prepare o Conjugado de Biotina.

9. Adicione 50 μL de Conjugado de Biotina a todos os poços.

10. Cubra as tiras dos micropoços e incube 2 horas à temperatura ambiente (18 °C a 25 °C).

11. Prepare Estreptavidina-HRP.

12. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 3 vezes com Tampão de Lavagem.

13. Adicione 100 μL de Estreptavidina-HRP diluída a todos os poços.

14. Cubra as tiras dos micropoços e incube 1 hora à temperatura ambiente (18 °C a 25 °C).

15. Esvazie e lave as tiras dos micropoços 3 vezes com Tampão de Lavagem.

16. Adicione 100 μL de Solução de Substrato TMB a todos os poços

17. Incube as tiras dos micropoços durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente (18-25 °C).

18. Adicione 100 μL de Solução de Paragem a todos os poços.

19. Ponha em branco o leitor dos micropoços e meça a intensidade da cor a 450 nm.

Nota: Se as instruções neste protocolo tiverem sido seguidas, as amostras terão sido diluídas a 1:100 (50 μL 1:50 amostra pré-diluído + 50 μL Tampão de Reacção (1x)), a concentração lida da curva padrão deverá ser multiplicada pelo fator de diluição (x 100).

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17. BIBLIOGRAFIA

1) Adcock DM, Kressin DC, and Marlar RA, “Effect of 3.2% vs 3.8% Sodium Citrate Concentration on tine Coagulation Testing,” Am J Clin Pathol, 1997, 107(1):105-10.

2) Reneke J, Etzell J, Leslie S, et al, “Prolonged Prothrombin Time and Activated Partial Thromboplastin Time Due to Underfilled Specimen Tubes With 109 mmol/L (3.2%) Citrate Anticoagulant,” Am J Clin Pathol, 1998, 109(6):754-7.

3) “National Committee for Clinical Laboratory Standardization: Collection, Transport, and Processing ofBlood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation Assays; Approved Guideline,” Third Edition, Villanova: NCCLS Document H21-A3:11(23), 1999.

4) Gottfried EL and Adachi MM, “Prothrombin Time and Activated Partial Thromboplastin Time Can Be Performed on the First Tube,” Am J Clin Pathol, 1997, 107(6):681-3.

5) McGlasson DL, More L, Best HA, et al, “Drawing Specimens for Coagulation Testing: Is a Second TubeNecessary?” Clin Lab Sci, 1999, 12(3):137-9.

6) Huber K, Christ G, Wojta J, et al, “Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 in Cardiovascular Disease,” Status Report 2001, Thromb Res, 2001, 103(Suppl 1):S7-S19.

7) Huber K, “Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 (Part One): Basic Mechanisms, Regulation, and Role for Thromboembolic Disease,” J Thromb Thrombolysis, 2001, 11(3):183-93 (review).

8) Huber K, “Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 (Part Two): Role for Failure of Thrombolytic Therapy. PAI-1 Resistance as a Potential Benefit for New Fibrinolytic Agents,” J Thromb Thrombolysis, 2001, 11(3):195-202 (review)

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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα

Symbols Version 4.5 / 2015-12-07

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:

Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα

LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:

Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

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PAI-1 ELISA - ibl-international.com · Os concentrados de tampão devem atingir a temperatura ambiente e ser diluídos antes de iniciar o procedimento de teste. Se houver formação