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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
Patogenicidade de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em lagartas da broca - das - cucurbitáceas Diaphania hyalinata (Lepidoptera: Pyralidae).
REGINA GONÇALVES DOS SANTOS OLIVEIRA
ALEGRE ESPÍRITO SANTO – BRASIL
AGOSTO – 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
Potogenicidade de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em lagartas da broca - das - cucurbitáceas Diaphania hyalinata
(Lepidoptera: Pyralidae).
REGINA GONÇALVES DOS SANTOS OLIVEIRA
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Espírito Santo, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para a obtenção do titulo de Mestre em Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Dirceu Pratissoli Co-orientadores: Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk Prof. Dr. Anderson Mathias Holtz
ALEGRE ESPÍRITO SANTO – BRASIL
AGOSTO - 2007
Patogenicidade de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em lagartas da broca - das - cucurbitáceas Diaphania hyalinata
(Lepidoptera: Pyralidae).
REGINA GONÇALVES DOS SANTOS OLIVEIRA
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Espírito Santo, como parte das exigências do programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para a obtenção do titulo de Mestre em Produção Vegetal.
Aprovada Prof. Dr. João Batista Pavesi Simão Prof. Dr. Waldir Cintra de Jesus Junior Escola Agrotécnica Federal de Alegre Centro de Ciências Agrárias - UFES Prof. Dr. Ricardo. Antonio Polanczyk Prof. Dr. Anderson Mathias Holtz Centro de Ciências Agrárias - UFES Escola Agrotécnica Federal de Colatina (Co-orientador) (Co-orientador)
Prof. Dr. Dirceu Pratissoli Centro de Ciências Agrárias – UFES
(Orientador)
iv
DEDICO
Ao meu esposo Paulo César pelo companheirismo, a minha filha Melissa, a minha mãe pelas orações e a Dona Zilda, minha sogra que me ajudou durante os anos do curso.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Dirceu Pratissoli, Professor do Departamento de Produção Vegetal do CCA-UFES, pela orientação, estímulo, confiança e amizade.
Ao Dr. Ricardo A. Polanczyk, Professor do Departamento de Produção
Vegetal do CCA-UFES, pela co-orientação e pela valiosa colaboração durante o desenvolvimento do trabalho.
Ao Dr. Anderson M. Holtz, Professor da Escola Agrotécnica Federal de
Colatina, pela co-orientação, estímulo e amizade. Ao Dr. Waldir Cintra de Jesus Junior, Professor do Departamento de
Produção Vegetal do CCA-UFES, pelas orientações em fitopatologia e apoio. Ao MSc. Celson Rodrigues, Professor do Departamento de Produção
Vegetal do CCA-UFES, pela amizade e contribuição com sua experiência em fitopatologia.
Ao MSc. José S. Zanuncio Junior, Prof. Dr. Edvaldo F. dos Reis, Dr.
Geovanni O. Garcia e Vanderlan O. Paulucio pela colaboração com as análises estatísticas.
Ao Professor Dr. José Eduardo M. Pezzopane, Diretor do CCA-UFES pela
autorização para que eu pudesse cursar a Pós-Graduação neste Centro e assim enriquecer meus conhecimentos.
Ao Banco do Nordeste pela compra dos equipamentos para realização da
pesquisa com entomopatógenos. A bibliotecária do CCA-UFES Maria Cândida, pela colaboração e revisão das
referências bibliográficas, de forma tão atenciosa. Aos alunos do Núcleo de Desenvolvimento Tecnológico e Científico de
Manejo Fitossanitário, André Milanez , Flávio Neves e Wagner Faria que mantiveram a criação de Diaphania hyalinata.
vi
Aos colegas do curso de Pós-Graduação, Pedro Quarto Junior, Ângelo A. Campos, Rony B. Oliveira, José Marcilío da Silva, Vítor José Brum, Isaias dos Santos Bregonci, Alexandre Faria pela cooperação e momentos felizes que passamos juntos.
Aos professores do curso de Pós-Graduação, pelo apoio e dedicação
durante o curso. Ao amigo e MSc Hugo J. G. S. Junior, por ter repassado sua experiência
com entomopatógenos. A secretária do Departamento de Produção Vegetal Aidê M. da Silva e a
secretária da Pós-Graduação Madalena Capucho pela ajuda e amizade. A todos que direta ou indiretamente colaboraram para o êxito do presente
trabalho.
vii
SUMÁRIO
Página
AGRADECIMENTOS............................................................................................ v
LISTA DE TABELAS............................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS............................................................................................. x
RESUMO............................................................................................................. xi
ABSTRACT............................................................................................. ............ xii
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 01
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 03
2. 1 - Biologia e Hábito de Diaphania hyalinata Lineus (Lepidoptera:
Pyralidae)............................................................................................................. 03
2. 2 - Prejuízos causados por Diaphania hyalinata nas cucurbitáceas............... 04
2. 3 - Métodos de controle de Diaphania hyalinata............................................. 04
2. 3. 1 - Controle Químico................................................................................... 04
2. 3. 2 - Controle Biológico................................................................................... 05
2. 4 - Fungos entomopatogênicos........................................................................ 05
2. 4. 1 - Fungos entomopatogênicos: Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin e Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin………………...…….. 07
2. 4. 2 - Modo de ação dos fungos entomopatogênicos......................................... 10
2. 4. 3 - Presença, persistência e transmissão de entomopatógenos no
ambiente................................................................................................................ 10
2. 4. 4 - Atividade tóxica dos fungos entomopatogênicos..................................... 11
2. 4. 5 - Utilização de fungos entomopatogênicos na agricultura...... .................... 11
2. 4. 6 - Formulações comerciais de bioinseticidas............................................... 12
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 13
3. 1 - Obtenção e criação de Diaphania hyalinata............................................... 13
viii
3. 2 - Obtenção e multiplicação dos isolados de fungos .................................... 14
3. 3 - Viabilidade dos isolados de B. bassiana e M. anisopliae............................ 14
3. 4 - Obtenções das suspensões ....................................................................... 15
3. 4. 1 - Formulados ............................................................................................. 15
3. 4. 2 - Isolados B. bassiana e M. anisopliae ...................................................... 15
3. 5 - Teste de Patogenicidade ............................................................................. 15
3, 6 - Análise estatística ....................................................................................... 16
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 17
4. 1 - Seleção dos isolados pelo teste de patogenecidade................................... 17
4. 2 - Viabilidade do isolado CCAE-7 e do formuado Boveril Organic®.................... 17
4. 3 - Teste de Patogenicidade.............................................................................. 18
4. 3. 1 - Mortalidade corrigida nos ínstares estudados......................................... 18
4. 3. 2 - Mortalidade corrigida nas concentrações estudadas .............................. 19
4. 4 - Sintomatologia............................................................................................ 23
5 CONCLUSÕES................................................................................................ 25
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 26
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA Página 1 Uso de fungos entomopatogênicos produzidos no Brasil .... 12
2 Formulados comerciais de bioinseticidas à base de fungos
entomopatogênicos............................................................ 13
3 Mortalidade confirmada nos isolados Metarhizium anisopliae
(PL43), Beauveria bassiana (ESALQ 447) e formulado
Boveril Organic® e Metarril Organic®. Temperatura: 25 + 1ºC;
UR: 70 + 10% e fotofase: 12 horas...................................... 19
4 Mortalidade corrigida, (Abbott ) em porcentagem do isolado
CCAE-7 (B bassiana) em Diaphania hyalinata, nos diferentes
ínstares. Temperatura: 25 + 1ºC; UR: 70 + 10%;
e fotofase: 12 h................................................................... 22
5 Mortalidade corrigida (Abbott) em porcentagem do formulado
Boveril Organic® em Diaphania hyalinata nas diferentes
concentrações. Temperatura: 25 + 1º C; UR: 70 + 10 %
e fotofase: 12 h....................................................................... 23
6 Mortalidade corrigida, (Abbott ) em porcentagem do isolado
CCAE-7 (B bassiana) em Diaphania hyalinata, nas diferentes
concentrações. Temperatura: 25 + 1ºC; UR: 70 + 10%
e fotofase: 12 h..................................................................... 24
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA Página
1 Seca dos ramos de cucurbitáceas causada pelo ataque de
Diaphania hyalinata................................................................. 04
2 Mortalidade corrigida de lagartas de 2º, 3º, 4º e 5º ínstares de
D. hyalinata ocasionada pelo isolado CCAE-7 (B. bassiana) 20
3 Mortalidade corrigida de lagartas de 2º ínstar de D. hyalinata
ocasionada pelo formulado Boveril Organic®...................... 24
4 Lagartas de Diaphania hyalinata apresentando sintomas de
patogenicidade por B. bassiana. Em (a) lagartas mortas e
endurecidas; em (b) massa micelial do fungo cresce sobre os
cadáveres................................................................................ 26
xi
OLIVEIRA, Regina Gonçalves dos Santos, M.Sc. Universidade Federal do Espírito Santo, agosto de 2007. Patogenicidade de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em lagartas da broca-das-cucurbitáceas Diaphania hyalinata (Lepidoptera: Pyralidae). Orientador: Dirceu Pratissoli. Co-orientadores: Ricardo Antonio Polanczyk e Anderson Mathias Holtz. RESUMO - Avaliou-se o efeito de dois isolados de Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin (CCAE-7 e ESALQ 447), o isolado de Metarhizium anisopliae
(Mestchnikoff) Sorokin: (PL43) e dois formulados comerciais (Boveril Organic ® e
Metarril Organic®) no controle de Diaphania hyalinata (Linnaeus) no 2º, 3º, 4º e 5º
ínstares. Os experimentos foram mantidos em condições laboratoriais, em câmara
climatizada à temperatura de 25 + 1ºC, umidade relativa de 70 + 10%, e fotofase de
12 horas, conduzidos em delineamentos inteiramente casualizados, com 5
tratamentos e 4 repetições. Foram realizados bioensaios de patogenicidade nas
concentrações 1x103; 1x104; 1x105; 1x106; 1x107 e 1x108 conídios/ mL + Tween® 80
para o isolado CCAE-7, ESALQ 447 e PL43 e, nas concentrações 0,10; 0,15; 0,25;
0,40; 0,63; 1,00 g/ mL + Tween® 80 para Boveril Organic® e Metarril Organic®. A
mortalidade foi avaliada diariamente, calculando-se os índices de mortalidade
corrigida pela fórmula de Abbott para cada tratamento. O isolado CCAE-7
apresentou melhor eficiência no controle, com maior mortalidade corrigida (69,27 %)
na concentração 1x108 no 2° ínstar.
Palavras–chave: Fungos entomopatogênicos, cucurbitáceas, controle biológico.
xii
OLIVEIRA, Regina Gonçalves dos Santos, M.Sc., Federal University of Espírito Santo, augusto 2007. Patogenecity of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae fungus in melonworm Diaphania hyalinata (Lepidoptera: Pyralidade). Adviser. Dirceu Pratissoli. Co-adviser: Ricardo Antonio Polanczyk and Anderson Mathias Holtz.
ABSTRACT - The effect of isolates of Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin.:
CCAE-7 and ESALQ 447; Metarhizium anisopliae (Mestchnikoff) Sorokin: PL43 and
Boveril Organic® and Metarril Organic® was assessed for the control of Diaphania
hyalinata Linnaeus, in 2°, 3°, 4° and 5° larval instar.The experiments were carried out
in climatized chamber using temperature of 25 + 1°C, relative humidity of 70%, and
photofase of 12 hours, in the laboratory. The experiments were arranged in a
completely randomized desing with 5 treataments and 4 repetitions. Patogenicity
bioassays in the concentrations of 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 and 1x108
conidia/ mL + Tween® 80 for the isolate CCAE-7, ESALQ 447 and PL43 and,
concentrations of 0.10; 0.15; 0.25; 0.40; 0.63 and 1.00 g/ mL + Tween® 80 for Boveril
Organic® and Metarril Organic®. The mortality was assessed every day. The mortality
indexes was calculated using the Abbott equation for each treatment. The CCAE-7
was the most efficient isolate for the control of Diaphania hyalinata L., with the
highest correct mortality (69,27 %) in the concentration of 1x108 in the 2° larval
instar.
Key words: Entomopathogenic fungi, cucurbitaces, biological control.
1 INTRODUÇÃO
As plantas olerícolas pertencentes à família das cucurbitáceas constituem um
alimento de grande importância nas áreas tropicais, subtropicais e temperadas do
mundo. No Brasil o plantio de cucurbitáceas, abóbora (Cucurbita moscata),
abobrinha (Cucurbita pepo), moranga (Cucurbita maxima), melancia (Cittrulus
lanatus), melão (Cucumis melo) e pepino (Cucumis sativus.) geram cerca de R$ 300
milhões por ano (FERREIRA, 2007). A produção de cucurbitáceas no Espírito Santo
foi da ordem de 30.000.00 kg no ano de 2006 (CEASA, 2006). Estas cucurbitáceas
exigem grandes investimentos, por parte dos agricultores, devido à ocorrência de
pragas e doenças (MESQUITA et al., 2001).
A broca-das-cucurbitáceas Diaphania hyalinata (Linnaeus, 1758) é considerada
praga-chave, assume grande importância por danificar as plantas desde o plantio
até a colheita, ocasiona dano direto, relacionado às injúrias provocadas nos frutos,
além do dano indireto assumido na queda de produtividade em função da redução
da área fotossintética (FIGUEIRA, 2002; MELO, 2006). Quando não recebem tratos
culturais adequados, os prejuízos podem ser de até 100% da produção (GORING,
2000; ANTÔNIO et al., 2002; GALLO et al. 2002; BRITO, 2004; GUIMARÃES et al.,
2005).
O primeiro registro de uma espécie do gênero Diaphania como praga foi feito por
Walsh e Riley, em 1869 apud (BANDINI E LARA, 1998) que encontraram Diaphania
nitidalis (Cramer, 1782) destruindo frutos de pepino nas regiões de Alton, Ilinois,
Peeverly, Missouri, St. Joseph e Michigan.
No Brasil a primeira referência foi feita por Bondar em 1912 apud (BANDINI E
LARA, 1998), o qual chamou a atenção sobre os prejuízos causados em frutos de
melão e pepino.
2
O controle das brocas-das-cucurbitáceas é efetuado com o uso de inseticidas
químicos em pulverizações. O uso excessivo de inseticidas químicos sem
orientações técnicas pode deixar resíduos nos frutos e desenvolver resistência nos
insetos. Assim o estudo de métodos alternativos de controle passa a ser uma meta
bastate promissora para programas de manejo fitossanitário de pragas e doenças, o
qual sempre respeita os preceitos biológicos, econômicos e sociais. Dentre esses
métodos destaca-se o controle biológico com fungos entomopatogênicos (TERAO,
2003 ).
Os fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin e
Metarhizium anisopliae (Mestschnikoff) Sorokin são mundialmente conhecidos e
utilizados como agentes biocontroladores de inúmeras pragas agrícolas e de
armazenamento, como Sitophilus zeamais (Motschulsky, 1855), Acanthoscelides
obtectus (Say, 1831) (RODRIGUES e PRATISSOLI, 1989; RODRIGUES e
PRATISSOLI, 1990; HIDALGO, MOORE e LE PATOUREL, 1998). Essas espécies
apresentam potencial de controle para diversas ordens de insetos, inclusive para
lepidópteros pragas, como Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794), Plutella xylostella
(Linnaeus, 1758), Tuta absoluta (Meyrik, 1917) Spodoptera frugiperda (J. E., Smith &
Abbot, 1797) e Castnia licus (Drury, 1773) (ALVES et al., 1998; MARQUES et al.,
2001; GIUSTOLIN et al, 2001; FIGUEIREDO et al., 2002; SILVA et al., 2003a).
As diversas descobertas na área de controle microbiano vêm contribuindo para a
utilização cada vez maior de fungos entomopatogênicos no controle de pragas
agrícolas e urbanas, que podem ser utilizadas isoladamente ou associadas a outros
métodos de controle, servindo de suporte para o manejo integrado de pragas
(FERREIRA et al., 2005).
Dada a importância de D. hyalinata para o cultivo de cucurbitáceas e tendo em
vista o pouco estudo realizado com o controle biológico utilizando-se B. bassiana e
M. anisopliae sobre essas pragas, propõe-se, com o devido trabalho, avaliar o efeito
desses entomopatógenos sobre esta praga.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 - Biologia e Hábito de Diaphania hyalinata Linneaus, 1758
(Lepidoptera: Pyralidae).
A broca-das-cucurbitáceas é um lepidóptero pertencente à família Pyralidae,
tendo o gênero Diaphania as espécies D. hyalinata e Diaphania nitidalis (Cramer,
1782). Por ser a forma jovem a causadora dos danos, ela tem, vulgarmente, sido
denominada de “melonworm”, “guzanera del zapallo”, “la calabaza del melon”
“perfurdor de las guias e frutos de las cucurbitáceas”, broca-da-aboboreira, broca-
das-hastes da melancia, lagarta da abóbora e lagarta pombinha (GALLO et al.,
2002; ANTÔNIO et al., 2002, CAPINEIRA, 2006)
A distribuição geográfica dessa praga concentra-se em vários países do
continente americano, tendo sido registrada desde o sul dos Estados Unidos, no
Caribe e na América do Sul (GORING, 2000; CAPINEIRA, 2006).
As lagartas de D. hyalinata apresentam uma coloração que pode variar de um
verde claro a um verde intenso, tendo duas faixas longitudinais brancas ao longo do
dorso. Na forma adulta são mariposas com 30 mm de envergadura e 15 mm de
comprimento, apresentando suas asas com áreas centrais esbranquiçadas e
semitransparentes contornada com coloração escura. A fêmea efetua postura nas
folhas, ramos, flores ou nos frutos. O período larval é de aproximadamente 10 dias,
transformando-se em pupas, permanecendo por um período de 12 a 14 dias sobre
folhas secas ou no chão até atingirem o estágio adulto. O ciclo evolutivo completo é
de 25 a 30 dias (GALLO et al. 2002; GUIMARÃES et al., 2005).
4
2. 2 - Prejuízos causados por Diaphania hyalinata nas cucurbitáceas.
Em função do comportamento de ataque, D. hyalinata tem sido considerada
como polífaga nas cucurbitáceas, pois, com exceção das raízes, suas larvas atacam
folhas, brotos novos, ramos, flores e frutos. A preferência pela oviposição se dá nas
folhas, onde as larvas permanecem nos primeiros ínstares destruindo o limbo foliar.
O ataque nos brotos novos induz à seca dos mesmos, e nos ramos, induzem à seca
de toda a parte aérea da planta (Fig. 1). Nos frutos, o ataque pode ocorrer desde a
abertura de galerias na parte externa, até a penetração e destruição da polpa,
trazendo como conseqüência o apodrecimento dos frutos (Goring, 2000).
Figura 1 – Seca dos ramos de cucurbitáceas causada pelo ataque de D. hyalinata.
2. 3 - Métodos de controle de Diaphania hyalinata.
Os defensivos agrícolas vêm sendo empregados em escala crescente ano a
ano. Embora apresentem alta eficiência, trazem consigo dois graves aspectos a
serem considerados: custo e o impacto ambiental. Nesse contexto, o controle
biológico mostra-se como uma alternativa relevante e viável (ALVES et al., 1998).
2. 3. 1- Controle Químico
O controle da broca-das-cucurbitáceas é efetuado basicamente com o uso de
inseticidas piretróides, como B1-Fenthrin, Deltrametrin, Cypermethrin),
organofosforados, como Malathion, Protenofós, Tricloform e Fenitrothion ou
5
carbamatos, como Carbaril e Cloridrato de Cartape em pulverização (ANDREI,
2005). De acordo com Gallo et al. (2002), as lagartas de D. hyalinata são
controladas mais facilmente, porque têm preferência por folhas.
2. 3. 2- Controle Biológico
O controle biológico é um processo natural de regulação populacional através
de inimigos naturais. Seu uso mantém a qualidade do produto agrícola e reduz a
poluição do meio ambiente, contribuindo para a preservação dos recursos naturais e
aumentando a sustentabilidade dos agroecossistemas (ALVES et al., 1998).
O controle microbiano é um ramo do controle biológico que objetiva
principalmente, a redução ou manutenção da população de pragas em nível inferior
ao de dano econômico, dentro do contexto do manejo fitossanitário de pragas
(ALVES et al, 2002; ALMEIDA e BATISTA FILHO, 2002; GALLO et al., 2002;
POLANCZYK, 2004).
Dentre as várias alternativas ao emprego de inseticidas químicos, os fungos
entomopatogênicos podem vir a constituir um potencial para o controle de D.
hyalinata, minimizando a utilização de inseticidas convencionais.
2. 4 Fungos entomopatogênicos.
A primeira classificação de um entomopatógeno foi feita por Réaumur em 1726,
identificando um fungo do gênero Cordyceps atacando um lepidóptero. O relato
pioneiro comprovando a ação entomopatogênica de um fungo, foi feito em 1835, por
Agostino Bassi, que observou Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin causando a
doença denominada “muscardine branca” em bicho da seda Bombyx mori (Linneaus,
1758) (LEUCONA, 1996). O primeiro trabalho sobre o controle de pragas com fungo
entomopatogênico foi realizado pelo russo Metchnikoff em 1878-79, que utilizou
Metarhizium anisopliae (Mestchnikoff) Sorokin para controle de larvas do besouro
Anisoplia austriaca (Herbst, 1783) (ALVES et al., 1998).
Os fungos entomopatogênicos são responsáveis por cerca de 80% das
doenças causadas em insetos (CARDOSO et al., 2003). Existem cerca de 90
gêneros e mais de 700 espécies de fungos patogênicos a invertebrados já descritos
(ALVES et al., 1998; STÜMER et al., 2003). Apesar disso, a maioria dos trabalhos
referem-se a apenas duas espécies de fungos Mitospóricos: B. bassiana e M.
6
anisopliae. Preocupações com a eficácia dos inseticidas e segurança do meio
ambiente tem conduzido à busca de manejo alternativos de controle, levando-se em
conta os aspectos econômicos, toxicológicos, ambientais e sociais priorizados no
manejo fitossanitário de pragas. (CESNICK, 2006; FANCELLI et al., 2006;
LOUREIRO et al., 2005; FERREIRA et al, 2005; NASCENTE, COSTAS e DA
COSTA, 2005; ESTRADA et al., 2004; LIU, SKIMER e PARKER 2003, 2002).
Os fungos foram os primeiros patógenos a serem utilizados no controle
microbiano. Esses entomopatógenos têm sido utilizados com muito sucesso no
controle de importantes insetos e ácaros pragas em várias partes do mundo, tais
como Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867), no Brasil e no México (SOUZA e REIS,
2000; DE LA ROSA et al., 2000; LEZAMA-GUTIÉRREZ et al., 2000; DE LA ROSA,
LOPEZ E LIEDO 2002; NEVES e HIROSE, 2005; NEVES, SANTORO e SILVA,
2006); Pristiphora abietina (Christal, 1791), na Europa (FÜHRER et al., 2001) e
Ixodes scapularis (Say, 1821), nos Estados Unidos (HORNBORTEL et al., 2005).
As diversas descobertas na área de controle microbiano vêm contribuindo para
a utilização, cada vez maior, de fungos entomopatogênicos no controle de pragas
agrícolas e urbanas, que podem ser utilizados isoladamente ou associados a outros
métodos de controle, funcionando como suporte para o manejo fitossanitário de
pragas (FERREIRA et al., 2005).
No Brasil, os fungos entomopatogênicos vêm sendo estudados desde 1923,
quando Pestana identificou duas espécies de cigarrinhas infectadas por M.
anisopliae, que ele denominou de Penicillium anisopliae naquela ocasião. O primeiro
trabalho de controle biológico em nível de campo foi realizado por Moreira, aplicando
M. anisopliae contra cigarrinha Tomaspis liturata (Le Peletier & Servile, 1825), sem
muito sucesso (ALVES e FARIA, 2006).
Os fungos causadores de doenças em insetos e ácaros são organismos com
grande potencial para o controle de pragas devido às seguintes vantagens: a)
capacidade de supressão de populações de artrópodes, vasta gama de hospedeiros,
possibilidade de cultivo “in vitro” e formulação desses agentes (LEITE et al., 2003);
b) a produção pode ser feita em propriedades e cooperativas de agricultores,
agregando valores em cultivos orgânicos e na produção integrada (OLIVEIRA,
NEVES e KAWAZOE, 2003); c) fácil aplicação em larga escala (IVIE et al., 2002); d)
persistência no ambiente, baixo impacto ambiental, não induz à resistência, grande
variabilidade genética natural, são patógenos de largo espectro (IGLIS et al., 2001);
7
e) atacam insetos aquáticos e fitófagos que vivem na parte aérea das plantas e no
solo, podendo causar epizootias naturais e infectar diferentes estágios de
desenvolvimento dos hospedeiros, como ovos, larvas, pupas e adultos; f) são
tecnologias sustentáveis energeticamente e ambientalmente (ALVES et al., 2002).
O sucesso da utilização de fungos no controle de insetos depende de alguns
fatores, tais como: condições ambientais, cuidados na produção, armazenamento e
monitoramento a médio e longo prazo (ALVES et al., 1998).
Pesquisas mais recentes têm dado fortes subsídios à utilização de fungos
entomopatogênicos em larga escala no Brasil, entre elas o melhoramento clássico,
do desenvolvimento de marcadores moleculares e clonagens de genes, dentre
outras técnicas, diversas instituições nacionais têm obtido resultados positivos com
M. anisopliae e B. bassiana no controle biológico de insetos. Dentre as instituições
que se destacam nesse aspecto, citam-se a Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA) (CARNEIRO et al., 2004), a Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP) (DESTÉFANO, 2007), a Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP) (BRAGA, 1998), o Centro de Biotecnologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, a Universidade Estadual de Londrina
(AZEVEDO et al., 2000), a Universidade de Caxias do Sul (UCS) (VARGAS et al.,
2003) e a Universidade Federal de Pernambuco (FREIRE, 2001).
2. 4. 1- Fungos entomopatogênicos: Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin e
Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin.
O fungo B. bassiana, de ampla dstribuíção geográfica, é mais freqüente em
insetos e em amostras de solo, sendo encontrado no campo parasitando
coleópteros, lepidópteros, hemípteros, dípteros, himenópteros e orthopteros.
No Brasil, o potencial para a aplicação de B. bassiana no controle biológico é
muito grande e vem sendo responsável pela redução do uso de inseticidas em vários
cultivos de importância agrícola (ALVES et al., 1998).
Muitos estudos têm demostrado que certos isolados de B. bassiana são
eficazes no controle de lepidópteros. SILVA et al (2003b), estudou a suscetibilidade
de Plutella xylostella (Linnaeus, 1797) em B. bassiana em laboratório; os isolados
ESALQ 447 e ESALQ 634 obtiveram mortalidade acima de 58%.
A broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius,1794), também é
suscetível a B. bassiana. Testes ralizados em campo mostrando que o patógeno
8
causou mortalidade desde 44% (WENZEL, 2006). Giometti e Wenzel (2007)
conseguiram, com o isolado IBCB 251, mortalidades de 95% nos insetos tratados.
Silva (2001), selecionando isolados de B. bassiana constatou que esse fungo é
patogênico para Alabama argillacea (Hüebner, 1818), enquanto que César Filho,
Marques e Barros (2002) obtiveram mortalidades de até 90% quando se aplicou uma
concentração de 109 conídios / ml. Martins, Maruyama e Maruyama (2007)
constataram 77% de mortalidade, enquanto Silva et al. (2003a) encontraram
mortalidades de 90,78% para o isolado CG138 e CG645 de B. bassiana na mesma
praga.
Em banana, têm-se utilizado B. bassiana para o controle de Cosmopolites
sordidus (Germar, 1824) (FANCELLI et al., 2006; RANGEL, PENTEADO e TONET,
2007; MESQUITA, 2003). Batista, Tokara e Carvalho (2007), mencionaram que o
isolado CB66 de B. bassiana, pincelado em iscas tipo “telha”, onde coletaram 5
insetos/isca, reduziu em 61% a população de adultos.
Neves e Hirose (2005), selecionando isolados de B. basiiana para o controle da
broca-do-café H. hampei observaram que com os isolados CG425 ocorreram
mortalidades confirmadas de 82,81%. Da mesma forma, Okumura et al. (2003)
encontraram resultados semelhantes com 88, 61% de brocas mortas. Silva (2001)
constatou insetos adultos mortos de Anthonomus grandis (Bohem, 1843) por
infecção de B. bassiana.
Silva e Veiga (1998), observaram patogenicidade de 54% de B. bassiana sobre
Castnia icarus (Cramer, 1775) com 12 dias e Marques et al. (2001) estudando
Castnia. Licus (Drury, 1773), obtiveram 83,3% de mortalidade utilizando a
concentração, de 108 conídios/ mL. Também, Rodrigues e Pratissoli (1989)
constataram patogenicidade de B. bassiana em Spodoptera frugiperda (J. E.,Smith &
Abbot, 1797). Além de estudos com formigas (LOUREIRO e MONTEIRO, 2004),
cupins (ALMEIDA et al., 1998) e grãos armazenados Sitophilus zeamais
(Motschulsky, 1855), Acanthoscelides obtectus (Say, 1831) (RODRIGUES e
PRATISSOLI, 1990; HIDALGO, MOORE e LE PATOUREL, 1998).
Recentemente foi descrito B. bassiana como patógeno em ácaros fitófagos
sendo utilizado comercialmente para o controle de Tetranynchus urticae (Kock,
1836) (TAMAI et al. 1999, 2002), de Tetranynchus evansi (Barker & Pritchard, 1979)
nos EUA (WEKESA et al., 2006) e, no Brasil para o controle de ácaros do mamão e
em plantas ornamentais (ALVES e FARIA 2006). Alves et al. (2005) avaliou a
9
suscetibilidade do ácaro Phyllocoptruta oleivora (Ashmead, 1879), ácaro rajado dos
citrus, verificando que, 30% dos adultos morreram entre o terceiro e o quinto dia
após a inoculação do fungo ESALQ 447.
B. bassiana tem sido ainda estudada sobre parasitóide. Santos Junior (2006)
estudou a interação entre P. xylostella e Oomyzus sokolowskii (Kurdjumov, 1912), o
fungo não foi prejudicial ao parasitóide e não causou mortalidade no predador
Podisus nigrispinus (Dallas, 1851) (FRANÇA et al. 2006), porém Todorova et al,
(2002), constatou baixa mortalidade no predador Perillus bioculatus (Fabricius, 1775)
com o isolado B. bassiana IPP46 e Pessoa (2005), costatou compatibilidade do
fungo sobre ovos de Chrysoperla externa (Hagen, 1861) em laboratório.
Outro fungo entomopatogênico de grande importância é o fungo Metarhizium
anisopliae (Metschnikoff) Sorokin, que ocorre naturalmente em mais de 300 espécies
de insetos. É um fungo Mitospórico, da família Moniliaceae. Causa a doença
conhecida como “muscardine verde” (FREIMOSER et al., 2003). Sua primeira
descrição como agente de controle biológico data de 1879, quando Metschnikoff
relatou a doença causada por este fungo em larvas de curculionídeos atacando
beterraba (ALVES et al., 1998).
No Nordeste, M. anisopliae vem sendo utilizado com grande sucesso no
controle da cigarrinha Mahanarva posticata (Stal, 1855) na cultura da cana-de-
açúcar, onde conseguiu isolar o fungo PL43, altamente virulento à praga. No Estado
de São Paulo o fungo M. anispliae é utilizado para o controle de Mahanarva
fimbriolata (Stal, 1854) cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar (LOUREIRO et al.,
2005a, 2005b). Atualmente, o controle biológico com o fungo M. anisopliae atinge
uma área de aproximadamente 350.000ha de cana-de-açúcar, neste estado, com
aplicações tratorizadas e aéreas, variando as concentrações de 2 a 10 kg/ha, de
acordo com a flutuação da cigarrinha e a variedade da cana-de-açúcar (ALMEIDA,
2006).
Outra aplicação importante de M. anisopliae é no controle da cigarrinha-das-
pastagens (gêneros Deois e Zulia), principais pragas das pastagens brasileiras.
Neste caso, a importância desse agente de controle é ainda maior, já que o uso de
agrotóxicos em pastagens é inviável economicamente, além de deixar resíduos no
leite, e na carne e reduzir a biodiversidade (fauna silvestre e insetos parasitas e
predadores) (ALVES et al., 1998).
10
2. 4. 2 - Modo de ação dos fungos entomopatogênicos.
A infecção dos fungos entomopatogênicos pode ocorrer por via oral, pelo
tegumento ou pelo espiráculo, sendo que 12 horas após o contato com o inseto,
ocorre a germinação dos conídios. Decorridas 72 horas, o inseto pode ser totalmente
colonizado, advindo à morte em função da falta de nutrientes e do acúmulo de
substâncias tóxicas. As condições favoráveis para desenvolvimento da doença são:
umidade relativa em torno de 90% e temperatura entre 23 e 28ºC (ALVES et al.,
1998).
A maioria dos fungos penetra nos insetos, principalmente por contato e
ingestão (LEITE et al., 2003; LOUREIRO et al., 2005a). Seu modo de ação inicia-se
com a adesão ao tegumento e a germinação dos conídios sobre o inseto. Após inicia
a penetração, a partir da combinação de pressão e degradação enzimática,
atravessando a cutícula do mesmo e a multiplicação do fungo na hemocele e a
produção de toxinas. A seguir ocorre a morte do inseto e o fungo coloniza todo o
interior do hospedeiro. Posteriormente, o micélio sai para o exterior passando
através do tegumento, esporula sobre a superfície do inseto e, finalmente os
propágulos são disseminados no ambiente (NEVES, SANTORO e SILVA, 2006;
SEWIFY e HASHEM, 2001).
2. 4. 3 - Presença, persistência e transmissão de entomopatógenos no ambiente
A alta capacidade de disseminação dos propágulos é uma característica
favorável à ocorrência das epizootias nas populações de insetos. A capacidade de
sobrevivência dos propágulos no ambiente é variável nos diferentes grupos e até
mesmo entre as raças. Os fungos entomopatogênicos permanecem no ambiente
através de insetos mortos (FUXA, 1992; FANCELLI et al., 2006).
Os fungos entomopatogênicos ocorrem naturalmente no ambiente. A
temperatura de sobrevivência é entre 5 e 35ºC e a ideal é entre 20 e 30ºC,
necessitam de alta umidade para os esporos germinarem e penetrarem através da
cutícula. A sobrevivência do esporo pode ser reduzida em condições de campo após
exposição a radiações solares (TANG e HOU, 2001).
Poucos são os trabalhos que pesquisam o impacto dos entomopatógenos no
meio ambiente. Entretanto, Ivie et al. (2002), estudaram o impacto do fungo B.
bassiana em campo na biodiversidade nativa em Madagascar, sobre gafanhotos
11
migratórios, Locusta migratória capito (Saussure, 1884), aplicou o fungo B. bassiana
SP16 e inseticida químico em áreas de savana e pastagem. Os ensaios de campo
mostraram que B. bassiana SP16 não teve impacto significativo no número de
espécies ou espécimes comparado ao controle.
2. 4. 4 - Atividade tóxica dos entomopatógenos.
Diversas são as toxinas conhecidas produzidas por fungos
entomopatogênicos: B. bassiana produz beauvericina, que tem ação tóxica em
larvas de pernilongos e moscas adultas, beauverolides em baratas, ácido oxálico,
em ácaros e bassianolide em Bombyx mori (Linnaeus, 1758). M. anisopliae produz
destruxinas, que são tóxicas para larvas de B. mori e Galleria mellonella (Linnaeus,
1758) (KERSHAW, 1999).
2. 4. 5 - Utilização de fungos entomopatogênicos na agricultura
No ano agrícola de 2000, as quatros maiores empresas brasileiras do setor
processaram algo em torno de 155 toneladas de arroz para a produção de fungos
entomopatogênicos. Na tabela 1, tem-se uma estimativa da área tratada para o
controle de diferentes insetos-pragas (FARIA e MAGALHÃES, 2001).
Tabela 1 - Uso de fungos entomopatogênicos produzidos no Brasil.
Cultura Praga Fungo Área(1000 ha) Pastagens Cigarrinhas Metarhizium anisopliae 86,5 Cana-de-açúcar Cigarrinha Metarhizium anisopliae 12,9 Mamão Ácaro B Beauveria bassiana 4,9 Café Broca-docafé B Beauveria bassiana 1,1 Citrus Cochonilha Ortézia B Beauveria bassiana 0,6 Horticultura Diversas B Beauveria bassiana 0,3 Total 106,3 Fonte: FARIA e MAGALHÃES (2001).
2. 4. 6 - Formulações comerciais de bioinseticidas.
Nos últimos anos, houve um grande avanço nos estudos dos fungos
entomopatogênicos, visando à produção de bioinseticidas comerciais. A
preocupação mundial com a preservação ambiental tem estimulado o surgimento de
empresas produtoras de inseticidas microbianos interessadas em atender este
12
mercado promissor de bioinseticidas. A Tabela 2 mostra os formulados comerciais
produzidos em vários países até o ano 2001.
Devido à importância dos fungos entomopatogênicos no controle de pragas e a
necessidade de novos métodos de controle para D. hyalinata, o presente trabalho
teve como objetivo avaliar a eficiência dos fungos entomopatogênicos B.bassiana e
M. anisopliae em lagartas de D. hyalinata.
Tabela 2 – Formulações comerciais de bioinseticidas à base de fungos entomopatogênicos. Fungo Produto
Comercial Propágulo Formulação Inseto Praga
Beauveria bassiana
Bea-Sin Conídio WP
Mosca branca
Boverin Conídio aéreo submergido/ ou Blastosporos
WP Besouro colorado da batata, Lagarta Colding
Boveril-Spofa Conídio WP Besouro colorado da batata Conídia Conídio WDG Broca-do-café
Mycotrol BotaniGard
Conídio WP,ES Mosca branca, Lagarta-das-crucíferas, Trips, Gafanhoto
Naturalis Conídio ES Mosca branca, Afídios, Trips
Ostrinil Conídio G Broca Européia do milho Proecol Conídio WP Lagarta do Cartucho Bouveril Conídio WP Ácaro rajado Metarhizium anisopliae
Bio-Blast
Bio Green Conídio G Besouro cabeça vermelha Bio-Pat Conídio WC Baratas Bio 1020 Micélio G Besouro negro da uva Cobican Conídio WP Percevejo da cana-de-açúcar Metarril Conídio WP Cigarriha-da-cana-de-açúcar Metabiol Conídio WP Cigarrinha das pastagens Metarrizium
Switzerland Conídio G / WC Besouro branco da grama
Fonte: Inglis et al. ( 2001). WP= Pós molháveis; WDG= Grânulos disponíveis em água; ES= Suspo-emulsão; WC= Concentrado solúvel ; G= Grânulos.
.
13
.
3 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi realizada no Centro de Ciências Agrárias da UFES (CCAUFES)
em Alegre, Espírito Santo, nos setores de Fitopatologia e Entomologia do Núcleo de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e
Doenças (NUDEMAFI). Foram avaliados os formulados comerciais Boveril Organic®
(Beauveria bassiana, 5,0 x 108 conídios/g) e Metarril Organic® (Metarhizium
anisopliae, 5,0 x 108 conídios/g), dois isolados de Beauveria bassiana (CCAE–7 e
ESALQ 447); e um isolado de Metarhizium anisopliae (PL43), Os formulados
comerciais e os isolados foram inoculados no corpo das lagartas de Diaphania
hyalinata (Linnaeus, 1758), no 2º, 3º, 4º e 5º instares. Após esse procedimento, as
mesmas foram mantidas em condições laboratoriais, em câmara climatizada à
temperatura de 25 + 1ºC, umidade relativa de 70 + 10% e fotofase de 12 horas.
3.1 - Obtenção e Criação de Diaphania hyalinata.
As lagartas foram provenientes da criação estoque do Laboratório de
Entomologia do NUDEMAFI e obtidas de plantios de abóbora var. jacaré, localizados
na área experimental do CCA-UFES. A multiplicação em laboratório, procederam-se
de acordo com Silva, 2007. No laboratório, as lagartas foram colocadas em caixas
plásticas de acrílico transparente (11,5 x 11,5 x 3,5 cm), que permitiam a
visualização do seu interior no momento das vistorias e forradas com papel de filtro
para obsorver os exudatos provenientes do alimento e das fezes. Em seguida, foram
alimentadas com cubos de abóbora, e transferidas para uma sala com temperatura
de 25 + 1ºC, umidade relativa de 70 + 10% até atingirem estágio de pupas. Nessa
fase, as lagartas foram sexadas com auxílio de microscópio estereoscópico
avaliando-se as genitálias e, vinte pupas (10 machos e 10 fêmeas), formando dez
14
casais, foram colocados em gaiola confeccionada com um pedaço de cano de PVC
de 15 cm de diâmetro e 20 cm de comprimento, tendo na face inferior um pedaço de
isopor e na face superior coberto com um tecido “tipo filó” preso com elástico de
borracha natural. No seu interior, foi colocado um frasco com algodão embebido em
solução de mel a 10% para alimentação dos adultos, disposto no fundo da gaiola.
Acima do filó foram colocados discos de papel de filtro com o mesmo diâmetro da
gaiola e sobre estes pedaços de pepino, os quais serviram como estímulo para
oviposição de D. hyalinata. Os discos contendo ovos foram transferidos para caixas
plásticas de acrílico transparente (11,5 x 11,5 x 3,5 cm), lacradas para que não
ocorresse fuga das lagartas e após a emergência das mesmas, foram colocados
folhas de abóbora até atingirem os ínstares desejados para o estudo.
3. 2 - Obtenção e multiplicação dos isolados de fungos.
O isolado CCAE-7 de Beauveria bassiana, foi obtido da coleção de
entomopatógenos do NUDEMAFI. Os isolados ESALQ 447 de Beauveria bassiana e
PL43 de Metarhizium anisopliae foram obtidos da coleção do Laboratório de
Patologia de Insetos da Área de Fitossanidade da UFRPE – Recife. Todos foram
repicados em placa de Petri (9 cm de diâmetro) contendo BDA (batata-dextrose-
ágar), colocando-se uma pequena quantidade de conídos e incubados em câmara
climatizada a 25 + 1°C e fotofase de 12h e 70 + 10% de umidade relativa, onde
permaneceram por um período de dez dias.
3. 3 - Viabilidade dos isolados de B. bassiana e M. anisopliae.
Após a aferição das suspensões dos isolados, foram conferidas as viabilidades
dos isolados, utilizando-se duas placas de Petri contendo meio de cultura BDA
(batata dextrose-ágar), para cada concentração dos isolados. Nas placas, foram
colocados 0,1 mL de suspensão contendo 103, 104, 105, 106, 107, 108 conídios/ mL,
espalhando-se com alça de Drigalsky, feito isto antes de cada inoculação nas
lagartas de 2º, 3º, 4º e 5º ínstar de D. hyalinata. As placas foram incubadas em
câmara climatizada a 25 + 1 ºC e 12 horas de fotofase por 24 horas. As leituras
foram efetuadas em microscópio ótico mediante a determinação do porcentual de
conídios germinados e não germinados, contando-se 100 conídios por placa, 24
horas após o plaqueamento, totalizando 200 conídios em cada avaliação.
15
3. 4 - Obtenção das suspensões.
3. 4.1- Formulados.
As suspensões dos formulados Boveril Organic® e Metarril Organic® foram
preparadas em água destilada e esterilizada, nas concentrações de 1,00; 0,63; 0,40;
0,25; 0,15; 0,10 g/ mL. Agitou-se o produto e deixou-se por 5 minutos em repouso,
aproveitando-se o sobrenadante (eliminando-se o precipitado). Acrescentou-se às
suspensões espalhante adesivo Tween 80® a 0,05% (ADE + E).
3. 4. 2 - Isolados de B. bassiana e M. anisopliae.
As suspensões fúngicas foram obtidas mediante adição de 15 mL de água
destilada esterilizada e espalhante adesivo Tween 80® a 0,05% (ADE + E) às placas
contendo meio de cultura com fungo e aferidas mediante quantificação em câmara
de Neubauer com o auxílio de um microscópio ótico, sendo, posteriormente,
ajustada para 103, 104, 105, 106, 107 e 108 conídios/ mL.
3. 5 - Teste de Patogenicidade.
Foram testadas as concentrações de 1,00 g/ mL de Boveril Organic ® e Metarril
Organic® e 1x108 conídios/ mL dos isolados CCAE-7, ESALQ 447 e PL43 mais
espalhante Tween 80® a 0,05% em lagartas de D. hyalinata de 2º, 3º,4º e 5º ínstares
e um tratamento testemunha que recebeu água destilada mais espalhante Tween
80® a 0,05% (ADE + E). O experimento foi efetuado em delineamento inteiramente
casualizado, constando de 4 repetições com 20 gerbox (3,0 cm de altura e 6,5 cm de
diâmetro) contendo um disco de 5 cm de diâmetro de folha de abóbora. Sobre os
discos de folha de abóbora foram colocadas 2 lagartas de D. hyalinata perfazendo
um total de 160 lagartas por tratamento. As suspensões foram aspergidas com
auxílio de um pulverizador Guarany trombone S4-PAP4 sobre as lagartas, os quais
foram acondicionados em gerbox e mantidos em câmara climatizada a 25 + 1°C e
fotofase de 12 horas e 70 + 10% de umidade relativa até estágio de adulto.
A mortalidade foi avaliada diariamente e cada inseto morto foi lavado em álcool
70%, hipoclorito de sódio 1% e água destilada esterilizada, mantidos em câmara
úmida nas mesmas condições climáticas citadas anteriormente. Por meio desse
procedimento, obteve-se a confirmação do agente etiológico, observando-se o
16
crescimento micelial e conidiogênese na parte externa do inseto morto. Determinou-
se a porcentagem de mortalidade corrigida e mortalidade confirmada em relação à
testemunha pela fórmula de Abbott (1925).
Mortalidade corrigida = %de mortalidade no tratamento - % de mortalidade na testemunha x
100
100 - % de mortalidade na testemunha
3. 6 - Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias
estimadas das mortalidades comparadas através do teste de agrupamento de
médias Scott-knott (P=0.05) e Teste de Tukey (P=0,05), utilizando o programa
computacional SAEG (versão 4.0) e as concentrações avaliadas através de curvas
de regressão linear simples.
17
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4. 1 - Seleção dos isolados pelo teste de patogenicidade.
Os isolados ESALQ 447, PL43 e lagartas de 3º, 4º e 5º ínstares de D. hyalinata
inoculadas com o formulado Boveril Organic® foram descartados da análise, por não
terem causado mortalidade em D. hyalinata. Em relação, ao formulado Metarril
Organic®, foi observado uma pupa morta pelo fungo, devido a baixa mortalidade
também foi descartado da análise (Tabela 3).
TABELA 3 – Mortalidade confirmada nos isolados Metarhizium anisopliae (PL43),Beauveria bassiana (ESALQ 447) e formulado Boveril Organic® e Metarril Organic®. Temperatura: 25 + 1ºC; UR: 70 + 10% e fotofase: 12 h.
Formulado e Isolados Mortalidade Confirmada (%) METARRIL ORGANIC® 0,68 ESALQ 447 0 PL43 0 BOVERIL ORGANIC® no 3º, 4º e 5º ínstar de D. hyalinata
0
O isolado CCAE-7 para todos ínstares e o formulado Boveril Organic® em lagartas
de D. hyalinata de 2º ínstar, por causarem mortalidades acima de 60% nos testes
preliminares de patogenicidade. .
4. 2 - Viabilidade do isolado CCAE-7 e do formulado Boveril Organic®
O isolado de B. bassiana CCAE–7 e o formulado Boveril Organic®,
apresentaram germinação de conídios superiores a 70% para todos os ínstares
estudados, o que demonstrou a alta capacidade germinativa dos isolados, em média
18
a viabilidade apresentou 85% para o isolado CCAE-7 e 71% para o formulado
Boveril Organic®.
4. 3 - Teste de Patogenicidade.
4. 3 1 – Mortalidade corrigida nos ínstares estudados
As curvas de mortalidade corrigida pela regressão linear (Fig. 2), mostraram que o 2º
e 3º ínstares de D. hyalinata comportaram-se de forma semelhante apresentando-se
quase como retas superpostas, apresentando aumento de mortalidade ao se
aumentar a concentração do isolado CCAE-7, sendo que a maior mortalidade
69,27% (R2 = 0,9079) ocorreu no 2º instar na concentração 1x108 conídios/ mL (Tab.
4). No 4º e 5º ínstares apresentou-se o mesmo comportamento relatado
anteriormente, porém, sob taxas e valores de mortalidade menores que nos ínstares
para as maiores concentrações de isolado CCAE-7.
Os resultados aqui apresentado demonstraram, que as lagartas de estádios
iniciais são mais suscetíveis ao ataque do fungo devido ao menor grau de
esclerotização da cutícula e a bioquímica da superfície do inseto (DE LA ROSA,
LOPEZ e LIEDO, 2002), facilitando a penetração e o estabelecimento no
hospedeiro. Pimentel-Gomes et al., (1998) observaram maior suscetibilidade do
fungo B. bassiana com mortalidade de 54 % em lagartas de ínstares iniciais de C.
icarus e Figueiredo et al. (2002), observaram, também mortalidades de 53,3 a 83,3%
em lagartas de 3º ínstar de C. licus.
Provavelmente, a baixa mortalidade no 4º e 5º ínstares de D. hyalinata, mesmo
em altas concentrações é devido as largatas de tamanho maior, possuem maior
movimentação e os conídios podem se despreenderem da cutícula ou ao fato do
inseto no momento da ecdise, ter liberado a exúvia antes da penetração do tubo
germinativo do fungo (Wekesa et al. (2006), além de que o inseto ao longo do seu
desenvolvimento vai criando mecanismos de resistência ao patógeno. Giustolin et
al., (2001) também observaram menor suscetibilidade das largatas de 4º ínstar de T.
absoluta em relação ao fungo B. bassiana.
O isolado CCAE-7 causou mortalidade em todos os ínstares tratado com B.
bassiana, o que é importante, pois à nível de campo encontramos lagartas em todos
os instares. Uma vez que este isolado, por ser nativo, poderá se expressar melhor
em condições de campo, enquanto que isolados exóticos, como o do formulado
19
Boveril Organic®, provavelmente, por não terem conseguido eficiência em todos os
ínstares (Tab. 5), não serão eficientes nas mesmas condições de campo.
y = 9,0751 + 5,3215
R2 = 0,8717
Y= -9,5437 + 9,1608
R2 = 0,9079
y = -31,3209 +12,7499
R2 = 0,8177
y = -1,3960 + 5,4347
R2 = 0,7844
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
2º
3º
4º
5º
Concentração do isolado CCAE-7 (B. bassiana) conídios/ mL
Figura 2. Mortalidade corrigida de lagartas de 2º, 3º, 4º e 5º ínstares de D. hyalinata ocasionada pelo isolado CCAE-7 (B. bassiana).
4. 3. 2 - Mortalidade corrigida nas concentrações estudadas.
No presente trabalho as mortalidades corrigidas do isolado CCAE-7,
apresentaram porcentagens de 8,13 a 69,27% entre os ínstares (Tab. 4).
Considerando-se a porcentagem de lagartas de D. hyalinata com infecção, o 2º
ínstar
ínstae
ínstar
ínstar
Concentração
3 = 103 con./ mL
4 = 104 con./ mL
5 = 105 con./ mL
6 = 106 con./ mL
7 = 107 con./ mL
8 = 108 con./ mL
20
ínstar, na concentração 1x108 conídios/ mL do isolado CCAE-7 foi o que apresentou
maior mortalidade diferindo dos demais ínstares. O aumento na mortalidade ocorreu
inversamente proporcional, à medida que, os instares desenvolveram.
Para a concentração 1x107conídios/ mL, o 3º ínstar foi, o que apresentou maior
toxidade nas lagartas de D. hyalinata diferindo dos demais ínstares. Também, o 3º
ínstar na concentração 1x106 conídios/ mL foi, a que o fungo CCAE-7 causou maior
infecção (Tab. 4). O 2º e 4º ínstares nas concentrações 1x105 e 1x103 conídios/ mL
não diferiram entre si, mas diferiram do 5º e 3º ínstares. Entretanto, na concentração
1x104 conídios/ mL não houve diferenças significativas entre os ínstares.
Observou-se neste trabalho, que na maioria das concentrações, que o isolado
CCAE-7 foi mais eficiente no 2º e 3º ínstares e que as concentrações 1x108 e 1x107
conídios/ mL foram superiores as demais concentrações (Tab. 6).
As diminuições nas mortalidades das concentrações 1x105, 1x104 e 1x103
conídios/ mL parecem estar ligadas ao lento desenvolvimento da infecção em baixas
concentrações, isto também foi observado por Yoon et al (1999) utilizando as
mesmas concentrações de B. basiana em P.xylostella.
A concentração 1x106 conídios/ mL apresentou uma baixa eficiência no 2º
ínstar, pode ser, que a quantidade de conídios de B. bassiana presente na
suspensão foi insuficiente para atingir a supefície da lagarta de D. hyalinata. Meikle
et al. (2005), observaram que a área da superfície do corpo do inseto influencia na
quantidade de conídios depositada, que ao tratarem 5x106 conídios/ mL de
Paecilomyces fumosoroseus (Wise) Brown and Smith em termitas, eles receberam
5x102 - 5x103 conídios/ mL do fungo.
Wenzel (2006) encontraram valores de mortalidade corrigida para Diatraea
saccharalis de 89,0% na concentração correspondente a 5x108 conídios/ mL,
enquanto obeteve-se 69,27% para lagartas de D. hyalinata de 2º instar na
concentração cinco vezes menor (1x108 conídios/mL), enquanto que B. bassiana na
mesma concentração provocou 45,3% de mortalidade em lagartas de Castnia licus
(Villas Boas e Alves, 1993). Indicando que o isolado CCAE-7 contém alta
capacidade de penetração e infecção, o que é satisfatório quando se deseja um
isolado para formulação de um produto comercial.
21
Tabela 4 – Mortalidade corrigida (Abbott) em porcentagem do Isolado
CCAE-7(B bassiana) em Diaphania hyalinata, nos diferentes instares. Temperatura:
25 + 1ºC; UR: 70 + 10%; e fotofase: 12 h.
CONCENTRAÇÃO (CONÍDIOS/ ML)
INSTAR MORTALIDADE CORRIGIDA (%)
2º 69,27 A 3º 59,44 B 4º 53,78 B
108
5º 38,21 C
3º 61,71 A 2º 55,58 B 4º 44,18 C
107
5º 35,36 C
3º 57,78 A 4º 44,61 B 5º 40,43 B
106
2º 38,02 B
2º 30,17 A 4º 29,10 A 5 22,45 B
105
3º 17,99 B
4º 30,59 A 2º 29,78 A 5º 23,78 A
104
3º 19,74 A
4º 27,78 A 2º 22,20 A 5º 10,71 B
103
3º 8,13 B Médias seguidas pela mesma letra entre instares na coluna, não diferem entre si pelo teste de agrupamento Scott-Knott à 5% de probabilidade.
O formulado Boveril Organic® apresentou diferenças na mortalidade corrigida
em lagartas de 2º ínstar, variando de 12,62 a 51,17% (Tab. 5) de acordo com o
aumento da concentração (Fig. 3). A baixa eficiência do formulado Boveril Organic®,
pode ser explicado, porque em formulações com fungos, os conídios de B. bassiana
são inoculados em substrato artificial (arroz), perdendo sua viabilidade ao longo do
tempo, enquanto que o isolado CCAE-7 seus conídios foram isolados de lagartas de
D. hyalinata infectada com B. bassiana, portanto conservando sua patogenecidade.
22
Tabela 5 – Mortalidade corrigida (Abbott) em porcentagem do formulado comercial Boveril Organic® em Diaphania hyalinata, nas diferentes concentrações.Temp.: 25 + 1º C; UR: 70 + 10 % e fotofase: 12 h.
ÍNSTAR CONCENTRAÇÃO
(g/ mL) MORTALIDADE CORRIGIDA
(%) 1,00 51,17 A 0,63 40,41 B
2º 0,40 38,89 B 0,25 44,84 B 0,15 42,07 C 0,01 12,62 C Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de agrupamento Scott – Knott à 5% de probabilidadade.
A maior eficiência do isolado CCAE-7 em relação ao formulado Boveril Organic®
pode ser devido à capacidade do isolado CCAE-7 produzir maior quantidade de
toxina que o isolado do formulado Boveril Organic®. Oosporeina, pigmento de
coloração vermelha, é a toxina de maior quantidade produzida pelo fungo B.
bassiana, foi observada por Kleingen, Meadow e Aandal (2002) em larvas de
Mamestra brassicae (Linneaus, 1758) tratada com B. bassiana causando 70% de
mortalidade nessa praga. Estudos recentes indicam que diferentes isolados de B.
bassiana podem produzir diferentes níveis de proteases, quitinases, e lípases
enzimas associadas com a virulência de B. bassiana (ALVES et al. 2005).
Tabela 6 – Mortalidade corrigida (Abbott) em porcentagem do isolado CCAE-7 (B. bassiana) em Diaphania hyalinata, nas diferentes concentrações.Temperatura.: 25 + 1º C; UR: 70 + 10 % e fotofase: 12 h.
CONCENTRAÇÃO
(Conídios/ mL) MORTALIDADE CORRIGIDA
(%) 108 57,99 A
107 52,08 AB 106 43,77 B 105 26,74 C 104 25,97 C 103 18,21 C
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de médias Tukey à 5% de probabilidadade.
23
. Concentração do formulado Boveril (B. bassiana) g/ mL
Figura 3. Mortalidade corrigida de lagartas de 2º ínstar de D. hyalinata
ocasionada pelo formulado Boveril Organic®.
A patogenicidade em inseto é determinada pela habilidade de um patógeno provocar
uma doença, sendo influenciada pela característica genética do mesmo (Leucona,
1996), enquanto que virulência mede o grau de patogenicidade dentro de um grupo
ou espécie de patógeno, além de sua capacidade de bloquear a “resistência natural”
do inseto e, invadir e multiplicar-se nos tecidos do hospedeiro. A virulência pode ser
alterável através de melhoramento genético (Alves e Leucona,1998). Portanto, o
isolado CCAE-7 tem uma habilidade maior de provocar doença em D. hyalinata
(69,27 %) que o isolado de B. bassiana no formulado Boveril Organic® (57,17 %).
4. 4 - Sintomatologia.
Os sintomas de infecção nas lagartas de D. hyalinata, inicialmente observados
foram supressão da alimentação e, posteriormente, o retardamento dos seus
movimentos. Sintomas característicos atribuídos ao fungo B. bassiana foram
observados em lagartas de D. hyalinata mortas, que apresentaram inicialmente
coloração rósea e consistência endurecida. Após a colonização do corpo dos insetos
pela massa micelial (Figura 4), ocorreu a produção de conídios, de coloração
branca. Algumas lagartas apresentaram coloração escura, não apresentando
esporulação,o que pode ser caracterizado como efeito do fungo, conforme referido
y = -0,6674x + 27,217
R 2 = 0,6954
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10 20 30
24
por Alves (1998) e Figueiredo (2002). Segundo, Loureiro et al.,(2005a) a
interferência de bactérias na colonização do fungo pode ocorrer, através de orifícios
presente na cutícula, no momento da penetração ou pelo rompimento do tecido
epitelial pela germinação /penetração e também, pela liberação de toxinas que
desestruturam a parede intestinal, possibilitado a contaminação da hemolinfas.
(a) (b)
Figura 4. Lagartas de D. hyalinata (L.) apresentando sintomas de patogenecidade
por B. bassiana. Em (a) lagartas mortas e endurecidas; em (b) massa micelial do
fungo sobre os insetos mortos.
As observações foram feitas até o estágio de adultos, foram também
observadas pupas recobertas pelo fungo.
A morte das lagartas de D. hyalinata ocorrerram a partir do 3º dia para o isolado
CCAE-7 e apartir do 5º dia para o formulado Boveril Organic®.
25
5 CONCLUSÕES
O isolado CCAE-7 de Beauveria bassiana foi patogênico para todos os ínstares
de Diaphania hyalinata estudados em condições de laboratório.
O isolado CCAE-7 apresentou melhor eficiência no controle na concentração de
1X108 conídios/ ml, com mortalidade corrigida de 69,27 % no 2° ínstar.
O formulado Boveril Organic apresentou patogenicidade somente no 2º ínstar
de D. hyalinata
O formulado Metarril Organic®, PL43 (M. anisopliae), ESALQ 447 (B. bassiana)
não foram patogênicos para lagartas de D. hyalinata.
.
26
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