Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
CÍNTIA DAS CHAGAS BERNARDO
Conídios e blastosporos de Metarhizum spp. e Beauveria bassiana:
virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à
radiação UV-B
Goiânia
2016
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade
Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca
Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº 832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com
a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ X ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Nome completo do autor: Cíntia das Chagas Bernardo
Título do trabalho: Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria
bassiana: virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à radiação UV-B
3. Informações de acesso ao documento:
Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se
imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF da tese ou
dissertação.
____________________________________ Data: 24 / 08 2016 Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
i
CÍNTIA DAS CHAGAS BERNARDO
Conídios e blastosporos de Metarhizum spp. e Beauveria bassiana:
virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à
radiação UV-B
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde
Pública da Universidade Federal de Goiás como
pré-requisito para obtenção do Título de
Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Éverton Kort Kamp Fernandes
Goiânia
2016
ii
FICHA
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluna: Cíntia das Chagas Bernardo
Orientador: Éverton Kort Kamp Fernandes
Membros:
1. Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt
2. Gabriel Moura Mascarin
3. Walquíria Arruda
4. Drauzio Eduardo Naretto Rangel
Data: 19/07/2016
iii
Aos próximos leitores, que encontrem os
conhecimentos que buscam.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me permitir realizar meus sonhos;
Aos meus pais e irmão, Marta, Danilo e Bruno, que talvez não saibam o quão
importantes foram suas ligações inesperadas ou fotos... por me fazerem estar presente
mesmo nos momentos em que eu estava em Goiás. Amo vocês!
A Jésus Junca Pereira, pelo amor e por ser minha família em Goiás;
À família Junqueira, pelo acolhimento e por tornarem meus dias em Goiás mais
aconchegantes e animados;
Aos amigos que conquistei no “melhor lab do mundo”, em especial Cárita, Caroline,
Elen, Flávia, Lucas, Marcos e Ronaldo;
Ao chefe, Éverton Kort Kamp Fernandes, pelos ensinamentos, broncas e “presentes”,
os quais me fizeram crescer pessoal e profissionalmente;
À professora Walquíria Arruda, pela paciência, disponibilidade e conhecimentos
dispensados a mim;
Ao professor Wolf Christian Luz por ter sido meu orientador no início do meu caminho
no Laboratório de Patologia de Invertebrados;
À professora Isabella Vilhena Freire Martins, por ser a responsável pela minha escolha
em seguir a carreira acadêmica, além dos conselhos como mestre e mãe;
Aos demais professores e amigos que de alguma forma contribuiram para a minha
formação seja profissional ou pessoal, meu muito obrigada!
v
SUMÁRIO
TABELAS .................................................................................................................. vi
FIGURAS .................................................................................................................. vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .............................................................. x
RESUMO ................................................................................................................... xii
ABSTRACT .............................................................................................................. xiii
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 15
2.1 Carrapatos ixodídeos ....................................................................................... 15
2.2 Ciclo biológico dos carrapatos ixodídeos ....................................................... 16
2.3 Fungos entomopatogênicos: Metarhizium e Beauveria .................................. 17
2.4 Mecanismos de defesa dos carrapatos ixodídeos contra fungos
entomopatogênicos ................................................................................................ 19
2.5 Uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos ixodídeos ........ 20
2.6 Influência de fatores abióticos, radiação ultravioleta e calor, no
desenvolvimento de fungos entomopatogênicos ................................................... 23
3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 26
4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28
4.1 Objetivo geral .................................................................................................. 28
4.2 Objetivos específicos ...................................................................................... 28
5 RESULTADOS ...................................................................................................... 29
ARTIGO 1 ................................................................................................................. 30
ARTIGO 2 ................................................................................................................. 54
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 55
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 78
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 79
vi
TABELAS
ARTIGO 1
Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos investigados no presente estudo. ...... 34
Tabela 3. Parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus
tratadas por imersão em suspensão aquosa (107 propágulos/mL) de conídios ou
blastosporos de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363)
ou Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307). Médias seguidas de mesma letra não
diferem quanto ao efeito do tratamento sobre o parâmetro biológico (F>6,305;
H>17,7857; p<0,05). .................................................................................................. 43
ARTIGO 2
Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos utilizados nos testes de tolerância ao
calor (45ºC) e à radiação ultravioleta UV-B. ............................................................. 57
vii
FIGURAS
Figura 1. Fotomicrografia de conídios (A) e blastosporos (B) de Metarhizium
robertsii s.l. (IP 146), no aumento de 400X, em microscópio óptico. ....................... 18
Figura 2. Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos. ........................................ 19
ARTIGO 1
Figura 1. Mortalidade média de larvas Rhipicephalus microplus tratadas com Tween
80 na concentração de 0,01% (controle) ou com suspensão de conídios ou blastosporos
(107 propágulos/mL) de isolados de Metarhizium spp. (IP 46, IP 146, IP 363 e IP 1)
ou Beauveria bassiana (IP 361, CG 138, CG 397, CG 484 e IP 364). Dados obtidos a
partir de avaliação de dez réplicas em uma repetição. ................................................ 39
Figura 2. Mortalidade acumulada, no décimo dia pós-tratamento, de larvas não
alimentadas de Rhipicephalus microplus tratadas com suspensões de conídios ou
blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae
s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307), nas concentrações de 106, 107
e 108 propágulos/mL. Barras de diferentes propágulos do mesmo isolado seguidas por
asterisco (*) diferem entre si, dentro de uma mesma concentração. .......................... 41
Figura 3. Exteriorização e conidiogênese de Metarhizium robertsii (IP 146) (A: vista
ventral e B: vista dorsal) e Beauveria bassiana (IP 361) (C: vista dorsal e D: vista
ventral) sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão
com suspensão de blastosporos (107 propágulos/mL). Após término da postura as
fêmeas foram incubadas a 27 ± 1°C, UR ≥ 80% até a completa exteriorização do fungo.
.................................................................................................................................... 44
Figura 4. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus
tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Metarhizium
robertsii (IP 146) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas
viii
após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:
blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório. .............................. 45
Figura 5. Eletromicrografia evidenciando o poro anal de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus tratadas com suspensão de blastosporos de isolados de (A)
Metarhizium robertsii (IP 146), ou (B) Beauveria bassiana s.l. (IP 361), após os
tempos de incubação de 48 e 4 horas, respectivamente, a 27 ± 1°C com umidade
relativa superior a 80%. .............................................................................................. 46
Figura 6. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus
tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Beauveria
bassiana (IP 361) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas
após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:
blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório. .............................. 47
ARTIGO 2
Figura 1. Espectro da irradiação baseado na fórmula de Quaite (Quaite et al. 1992)
emitido por quatro lâmpadas fluorescentes (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation,
Cleveland, USA) em câmara de madeira confeccionada para exposição de
microrganismos à radiação ultravioleta. O valor da irradiância de Quaite (743,75
mWm-2) foi obtida com auxílio do espectrorradiômetro USB2000+RAD (Dunedin,
FL) coberto por diacetato de celulose para o completo bloqueio de comprimentos de
onda inferiores a 290 nm. .......................................................................................... 60
Figura 2. Termotolerância de propágulos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), M.
robertsii (IP 146), M. acridum (ARSEF 324) e Beauveira bassiana (IP 361 e CG 307)
aquecidos a 45 ± 0,2°C em banho-maria. Conídios foram expostos ao calor por 0
(controle), 60, 120, 240 e 360 minutos, enquanto blastosporos nos tempos de 0
(controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos. Desvio padrão calculado
sobre 3 repetições independentes. .............................................................................. 63
Figura 3. Termotolerância comparativa entre conídios e blastosporos de um mesmo
isolado em Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146),
ix
Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307).
Médias seguidas por asterisco (*) ou duplo asterisco (**) diferem entre si (P < 0,05)
quando expostas a 45 ± 0,2°C, por 60 ou 120 minutos, respectivamente. ................ 64
Figura 4. Termotolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium acridum
(ARSEF 324) expostos a 45 ± 0,2°C por 0 (controle), 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40,
48, 56 ou 64 horas. Médias seguidas por asterisco (*) indicam diferença do percentual
relativo médio de UFC entre os propágulos dentro de um mesmo tempo de exposição
(F12,26=7,323; P < 0,001). .......................................................................................... 65
Figura 5. Tolerância à radiação ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos de
Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium
acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307), expostos às doses
de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, à 743,75 mW m-2 de
irradiância de Quaite (QUAITE et al., 1992). ........................................................... 67
x
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
µL - Microlitro
ARSEF - Isolados fúngicos mantidos na Collection of Entomopathogenic Fungal
Cultures nos Estados Unidos
BDAL – Batata dextrose ágar, acrescido de extrato de levedura
CFI - Coleção de Fungos de Invertebrados
CG - Isolados fúngicos mantidos na Coleção de Fungos de Invertebrados na
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
g - Gramas
IN - Índice nutricional (IN = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) –
peso da quenógina (g) × 100
IP - Isolados fúngicos mantidos na coleção do Laboratório de Patologia de
Invertebrados no Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
IPO - Índice de produção de ovos (IPO = peso da massa de ovos (g) / peso inicial
da fêmea ingurgitada (g) × 100)
IPTSP - Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
L – Litro
LPI - Laboratório de Patologia de Invertebrados
mL - Mililitro
PC – Percentual de controle
PR – Percentual relativo
RE - Reprodução estimada (RE = peso da massa de ovos (g)/peso da teleógina (g)
x % de eclosão das larvas x 20.000
SNK - Student-Newman-Keuls
xi
UFC – Unidade formadora de colônia
UFG - Universidade Federal de Goiás
UR – Umidade relativa do ar
UV-A - Radiação ultravioleta A
UV-B - Radiação ultravioleta B
UV-C - Radiação ultravioleta C
xii
RESUMO
O presente estudo comparou conídios e blastosporos de Metarhizium anisopliae s.l.
(IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307)
quanto a virulência para Rhipicephalus microplus, e quanto a tolerância ao calor e a
radiação UV-B; foi avaliado ainda o desenvolvimento de conídios e blastosporos dos
isolados IP 146 e IP 361 na cutícula de carrapatos por meio da microscopia eletrônica
de varredura (MEV). Larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram tratadas
(larvas: 106, 107 ou 108 propágulos/mL; fêmeas: 107 propágulos/mL) por imersão, com
conídios e blastosporos dos isolados avaliados. Maior percentual de mortalidade foi
obtido nos grupos de larvas tratadas com conídios de IP 361, o qual obteve menor
CL50. No bioensaio com fêmeas, blastosporos de IP 146 e IP 361 proporcionaram
percentual de controle superior a 90%, enquanto que conídios dos mesmos isolados
promoveram mortalidade de 70,97% e 63,29%, respectivamente. Para análise do
desenvolvimento dos propágulos na cutícula de fêmeas ingurgitadas, essas foram
tratadas topicamente com 50 µL de suspensão fúngica (107 propágulos/mL), incubadas
em diferentes tempos de 0 a 96 horas; após cada tempo de incubação as fêmeas foram
processadas e analisadas por MEV. Blastosporos de ambos isolados iniciaram seu
desenvolvimento já após 4 horas de tratamento, demonstrando rápido
desenvolvimento e sugerindo penetração por aberturas naturais do carrapato; com 4
horas de incubação foi possível ver a penetração de blastosporos de IP 361 através da
cutícula, situação não evidenciada pelo isolado IP 146 em nenhum tempo avaliado.
Nos testes de tolerância ao calor, o isolado de Metarhizium acridum (ARSEF 324) foi
inserido como isolado padrão, por ser conhecida a sua tolerância. Suspensões fúngicas
(103 propágulos/mL) foram expostas ao calor (45°C) por diferentes tempos, em
seguida inoculadas em placas de Petri com meio BDAY acrescido de cloranfenicol
(0,055% v/v) e incubadas por 7 dias a 27°C, e UR ≥ 80%. Conídios de ARSEF 324
(79,1%) demonstraram ser mais tolerantes ao calor do que conídios de IP 363 (55,5%),
IP 146 (1,5%), CG 307 (0%) e IP 361 (0%) no tempo de 2 horas de exposição, assim
como blastosporos no tempo de 60 minutos, demonstrando percentual relativo médio
de 100%, 12,3%, 30,7%, 55% e 0%, respectivamente. Nos testes de exposição à UV-
B, suspensões fúngicas (103 propágulos/mL) foram inoculadas em placas de Petri
contendo BDAY e expostas a diferentes doses de radiação; após tratamento, as placas
foram incubadas por 7 dias a 27°C, e UR ≥ 80%. Não houve diferença do percentual
relativo médio de conídios e blastosporos expostos a mesma dose de radiação.
Adjuvantes adequados que visem proteger os propágulos fúngicos contra fatores
abióticos estressantes são requeridos para formulações de conídios e blastosporos; no
entanto, a seleção de isolados naturalmente mais tolerantes ao calor e a radiação UV-
B podem favorecer o desenvolvimento de bioprodutos. Nesse sentido, acredita-se que
blastosporos sejam promissores para o biocontrole de carrapatos, já que estes se
demonstraram virulentos para R. microplus, além de apresentarem rápido
desenvolvimento sobre a cutícula desse artrópode, o que pode indicar menor tempo de
exposição desses propágulos a fatores abióticos limitantes no ambiente.
Palavras-chave: propágulos fúngicos, fungo entomopatogênico, carrapato, Ixodidae,
termotolerância, radiação ultravioleta.
xiii
ABSTRACT
The current study compared the virulence of conidia and blastospores of Metarhizium
anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146) and Beauveria bassiana s.l. (IP
361 and GC 307) against Rhipicephalus microplus, and the tolerance to heat and UV-
B radiation; in addition, it evaluated the development of conidia and blastospores of
the isolates IP 146 and IP 361 on the tick cuticle by scanning electron microscopy
(SEM). Larvae and engorged females of R. microplus were treated (larvae: 106, 107 or
108 propagules/mL, females: 107 propagules/mL) by immersion in conidia or
blastospores suspensions of tested isolates. The higher percentage of larval mortality
was obtained in the group treated with conidia of IP 361, which had lower LC50. In
bioassays with engorged females, IP 146 and IP 361 blastospores, provided tick
percent control superior to 90%, while conidia of the same isolates, promoted 70.97%
and 63.29% of tick control, respectively. Ticks were treated topically with 50 μL of
fungal suspension (107 propagules/mL) and incubated at different times from 0 to 96
hours to analyze its development on the engorged females cuticle; after each
incubation time, the females were fixed and analyzed by SEM. Blastospores of both
isolates have started development 4 hours after treatment, demonstrating rapid
development and suggesting penetration by the tick natural openings; at 4 hours
incubation, indicative of penetration of IP 361 blastospores through the cuticle was
observed, but no signs of penetration was observed with IP 146 blastospores at any
time evaluated. Furthermore, fungal suspensions (103 propagules/mL) were exposed
to heat (45 °C) for several time periods, then inoculated in Petri plates with BDAY
medium plus chloramphenicol (0.055% v/v), and incubated for 7 days at 27 °C and
RH ≥ 80%. ARSEF 324 conidia (79.1%) were more tolerant to heat than conidia of IP
363 (55.5%), IP 146 (1.5%), GC 307 (0%), and IP 361 (0% ) at 2 hours exposure, as
well as blastospores after 60 minutes exposure, demonstrating mean percent CFU of
100%, 12.3%, 30.7%, 55% and 0%, respectively. Fungal suspensions (103
propagules/mL) were also inoculated on BDAY in Petri plates, and exposed to UV-B
radiation; after treatment, plates were incubated for 7 days at 27 °C and RH ≥ 80%.
No difference in mean relative percent CFU between conidia and blastospores was
observed. Suitable adjuvants which aim at protecting fungal propagules against
stressful abiotic factors are required for conidia and blastospores; however, the
selection of isolates with marked natural tolerance to heat and UV-B radiation may
increase performance of bioproducts. Accordingly, it is suggested that blastospores are
promising fungal propagules for biological control of ticks, since they were virulent
against R. microplus; in addition, the rapid development of blastospores on the tick
cuticle indicates they may be exposed shortly to harmful environmental abiotic factors.
Key words: fungal propagules, entomopathogenic fungi, tick, Ixodidae,
thermotolerance, UV radiation.
14
1 INTRODUÇÃO
Os micoinseticidas são uma alternativa sustentável aos produtos químicos no
controle de artrópodes pragas, sendo, os fungos entomopatogênicos os mais promissores
agentes (ROT et al., 2013), pois são os patógenos mais abundantes naturalmente
associados a artrópodes (LACEY et al., 2015). Bioprodutos à base de Beauveria bassiana
e Metarhizium anisopliae são os mais comuns, compreendendo mais de 60% dos produtos
no mercado (FARIA; WRAIGHT, 2007), sendo também, estes dois fungos os mais
investigados para o controle de carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).
Estudos demonstram que fungos entomopatogênicos são eficazes contra
diferentes estágios de desenvolvimento de carrapatos (GINDIN et al., 2002, 2009), além
de promoverem efeitos subletais como diminuição do índice de produção de ovos e do
período de postura (REIS et al., 2008; ANGELO et al., 2010). A maioria dos estudos se
concentram na avaliação de conídios como propágulo infectante, porém, recentemente,
blastosporos têm sido explorados como alternativa promissora para o controle de
carrapatos e outros atrópodes (MIRANPURI; KHACHATOURIANS, 1990; VEGA et
al., 1999; KIRKLAND; CHO; et al., 2004; KIRKLAND; WESTWOOD; et al., 2004;
WASSERMANN et al., 2016).
Blastosporos são formas vegetativas do fungo produzidas naturalmente na
hemocele do hospedeiro (FANG et al., 2010). Apesar de apresentar vantagens em relação
a conídios como rápida germinação e multiplicação, estudos iniciais apontam esses
propágulos como menos resistentes a fatores estressantes, como o calor e à radiação UV-
B (VEGA et al., 1999; KIM et al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al., 2014). É importante
ressaltar que propágulos cuja germinação é mais rápida ficam menos tempo expostos a
fatores prejudiciais ao seu desenvolvimento (VEGA et al., 1999), os quais podem ser
minimizados por formulações protetoras (CAMARGO et al., 2012a; KIM et al., 2013).
O presente estudo comparou conídios e blastosporos de isolados de Metarhizium
spp. e Beauveria bassiana quanto a virulência para larvas e fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus, e avaliou o desenvolvimento desses propágulos na cutícula
desse artrópode; além disso, demonstrou a tolerância à radiação UV-B e ao calor de
conídios e blastosporos.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Carrapatos ixodídeos
Os ixodídeos, vulgarmente conhecidos como "carrapatos duros", pertencem ao
filo Arthropoda, classe Arachnida, ordem Ixodida e família Ixodidae, e possuem grande
importância econômica e na saúde pública e animal (MASSARD; FONSECA, 2004).
Estes artrópodes apresentam escudo quitinoso, que nos machos se estende por todo dorso
e nas fêmeas, larvas e ninfas cobre apenas um terço do dorso, possibilitando a expansão
do corpo após repasto sanguíneo (BRITO et al., 2006). As peças bucais presentes no
gnatossoma são anteriores e visíveis pela superfície dorsal, enquanto a abertura genital
fica na linha média ventral e o ânus é posterior (URQUHART et al., 1996).
Carrapatos são ectoparasitos obrigatórios de vertebrados e necessitam de
alimentar-se de sangue para completar seu ciclo biológico (BRITO et al., 2006). Além
dos hábitos hematófagos, os carrapatos também são vetores de bactérias, protozoários,
rickettsias e vírus em praticamente todo o mundo (BITTENCOURT, 2000). Os carrapatos
são responsáveis pela transmissão de pelo menos seis diferentes famílias de vírus, sendo
tais agentes importantes causadores de doenças em humanos e nos animais
(SONENSHINE et al., 2002).
Os gêneros de carrapatos, pertencentes à família Ixodidae, mais comumente
encontrados no Brasil são Amblyomma, Ixodes, Rhipicephalus e Dermacentor
(MASSARD; FONSECA, 2004). Bittencourt (2000) reportou que os carrapatos são
importantes parasitos para humanos e animais domésticos ou selvagens. Em humanos, os
carrapatos podem acarretar condições tóxicas severas como paralisia e toxicoses, irritação
e alergia, podendo ainda serem vetores de doenças como a febre hemorrágica do Congo,
febre maculosa e doença de Lyme (ESTRADA-PEÑA; JONGEJAN, 1999).
Os carrapatos são parasitos não permanentes, que se alimentam em mamíferos,
aves e répteis, na maioria das regiões do globo terrestre (ANDERSON, 2002). Estes
artrópodes, de um modo geral, apresentam algum grau de especificidade por hospedeiro,
porém o homem e outros animais podem ser utilizados como hospedeiros alternativos
(MASSARD; FONSECA, 2004).
16
2.2 Ciclo biológico dos carrapatos ixodídeos
Os ixodídeos são parasitos temporários e passam por períodos relativamente
pequenos sobre seus hospedeiros (URQUHART et al., 1996). O ciclo biológico desses
carrapatos consiste de um estágio inativo (ovos) e três estágios móveis e hematófagos
(larva, ninfa e adulto) (BRITO et al., 2006). A vida parasitária evolui sem interferências
climáticas, portanto, é praticamente constante nas diversas regiões onde os carrapatos
estão presentes, porém a fase de vida livre sofre interferências especialmente da
temperatura e umidade relativa do ar (GONZALES, 1975).
O número de hospedeiros que os ixodídeos utilizam para realização completa do
seu ciclo biológico varia de um a três, sendo classificados de acordo com o número de
hospedeiros como: monoxeno, dioxeno ou trioxeno (URQUHART et al., 1996).
O gênero Rhipicephalus, subgênero Boophilus, e o gênero Dermacentor são
carrapatos monoxenos (BRITO et al., 2006). Dessa forma, sobre o hospedeiro, machos e
fêmeas acasalam, começando assim o processo de alimentação e ingurgitamento das
fêmeas com sangue, as quais tendem a se desprender do hospedeiro a partir do 18º dia,
sendo que a maioria tende a cair durante o 22º dia. (FURLONG et al., 2005). Durante o
processo de repasto sanguíneo (alimentação) o carrapato injeta no hospedeiro saliva que
contém substâncias anticoagulantes e anestésicas (BRITO et al., 2006).
Cada teleógina de Rhipicephalus microplus ovipõe cerca de 3.000 ovos
(FURLONG et al., 2005). Os ovos darão origem às neolarvas de carrapatos que estarão
em condições de parasitar o animal dentro de aproximadamente seis dias (período de
endurecimento da cutícula), quando então tornam-se larvas infestantes, as quais são
capazes de se fixar e se alimentar no hospedeiro (GONZALES, 1975), começando assim
a fase parasitária do ciclo biológico do carrapato.
Sobre o hospedeiro, as larvas procuram se fixar no animal pela introdução do seu
aparelho bucal (FURLONG et al., 2005). Após alimentar-se por aproximadamente três
dias, iniciam a próxima muda para a fase de ninfa (GONZALES, 1975). No ciclo de
carrapatos monoxenos, a alimentação larval e ninfal, assim como as mudas, ocorrem
sobre o hospedeiro (BRITO et al., 2006). As ninfas dão origem a indivíduos sexuados,
chamados de neandro (machos) e neógina (fêmeas) (GONZALES, 1975).
Nos climas tropicais úmidos, o ciclo de R. microplus ocorre durante todo o ano,
sem a interrupção causada pela hipobiose das larvas, determinada pelas baixas
17
temperaturas (BRITO et al., 2006). A latitude, no entanto, influencia o fotoperíodo,
promovendo a sazonalidade e permitindo que os carrapatos sincronizem o período de vida
livre do ciclo com as condições climáticas ideais (BRITO et al., 2006).
Os gêneros Ixodes e Amblyomma são carrapatos heteroxenos apresentando em seu
ciclo até três hospedeiros diferentes (MASSARD; FONSECA, 2004). Em carrapatos
heteroxenos, o ciclo geralmente dura longos períodos; no caso do Ixodes, por exemplo, o
ciclo evolutivo requer três anos para se completar (URQUHART et al., 1996).
Assim como nos carrapatos monoxenos, uma vez fecundada, as fêmeas
completam seu único e grande repasto sanguíneo, ao contrário dos machos que se
alimentam de forma intermitente e se acasalam repetidamente (URQUHART et al.,
1996). As fêmeas ingurgitadas caem na vegetação e iniciam a oviposição
aproximadamente após 10 dias em condições favoráveis para o desenvolvimento dos ovos
(BRITO et al., 2006).
O ciclo de carrapatos heteroxenos acontece com estágios semelhantes ao de
carrapatos monoxenos, porém as mudas que ocorrem das fases de larva para ninfa e desta
para adulto acontecem no ambiente (MARTINS et al., 2007). Nos carrapatos heteroxenos
há uma atividade sazonal, pois, quando em condições de baixa umidade e altas
temperaturas a atividade desses praticamente cessa.
2.3 Fungos entomopatogênicos: Metarhizium e Beauveria
Os gêneros Metarhizium e Beauveria são os fungos entomopatogênicos mais
estudados no controle de carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008), sendo
estes fungos anamórficos pertencentes à subdivisão Clavicipitacea, Hypocreales
(BISCHOFF et al., 2009; REHNER et al., 2011).
Metarhizium anisopliae sensu lato (s.l.) e Beauveria bassiana s.l. invadem seus
hospedeiros por penetração direta da cutícula (BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA
et al., 2005; HARTELT et al., 2008). A adesão de conídios sobre a cutícula ocorre
passivamente através de interações eletrostáticas (SOSA-GOMEZ et al., 1997) e, em
seguida, é iniciado o processo de germinação. Após a germinação dos conídios, os
apressórios são formados, os quais secretam enzimas hidrolíticas que favorecem a
penetração das hifas (HARTELT et al., 2008). Uma vez dentro do hospedeiro, o micélio
se ramifica dando origem a blastosporos leveduriformes (GOETTEL; INGLIS, 1997).
18
De um modo geral, blastosporos de fungos entomopatogênicos são maiores do ue
conídios aéreos (JACKSON et al., 1997), crescendo preferencialmente na hemocele de
hospedeiros infectados (ASKARY et al., 1999) (Figura 1).
Figura 1. Fotomicrografia de conídios (A) e blastosporos (B) de Metarhizium robertsii
s.l. (IP 146), no aumento de 400×, em microscópio óptico.
Fonte: Arquivo pessoal.
A morte do hospedeiro infectado por fungos entomopatogênicos ocorre em até 10
dias (ANGELO, 2011) pela combinação da ação de toxinas fúngicas, obstrução física da
circulação, diminuição da nutrição e pela invasão dos órgãos (GOETTEL; INGLIS,
1997). Após a morte do hospedeiro, o fungo cresce externamente ao cadáver e esporula
(HARTELT et al., 2008). Segundo Goettel e Inglis (1997), um fungo apenas emerge do
cadáver de seu hospedeiro e esporula se houver condições apropriadas de temperatura e
umidade para o seu desenvolvimento (Figura 2).
A B
19
Figura 2. Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos.
Fonte:MASCARIN; PAULI, 2010.
2.4 Mecanismos de defesa dos carrapatos ixodídeos contra fungos entomopatogênicos
A cutícula dos carrapatos, que nos ixodídeos é quitinosa, é uma barreira fisico-
química que deve ser vencida por fungos entomopatogênicos (MENT et al., 2013). A
cutícula de carrapatos ixodídeos é composta por uma camada proteica interna, uma
camada intermediária formada por lipídios e uma parte externa composta por cera,
produzida por glândulas dérmicas (SONENSHINE, 1991). Esses compostos apresentam
funções distintas, que influenciam tanto na defesa quanto na sobrevivência dos carrapatos
(CHERRY, 1969; HAMILTON et al., 1989; MENT et al., 2010).
Durante a infecção em carrapatos, fungos entomopatogênicos entram em contato
com componentes de cutícula desses artrópodes que são tóxicos aos conídios e aos tubos
germinativos (MENT et al., 2013). Depois de vencida as primeiras barreiras naturais do
hospedeiro, os fungos invadem a cavidade geral e, então, sofrem a ação do sistema de
defesa celular desencadeada pelos hemócitos presentes na hemolinfa (ALVES, 1998).
A hemolinfa é o fluído circulante no corpo dos carrapatos, sendo composto por
hemócitos (células circulantes) e plasma (líquido sem hemócitos) (GUDDERRA et al.,
2002). O plasma, componente da hemolinfa, é um meio aquoso e composto por proteínas,
aminoácidos, carboidratos, lipídios, hormônios e vários sais (ANGELO, 2011). A
20
atividade de lecitinas e hemoaglutininas, parecem estar relacionados a fatores
moleculares de reconhecimento self e non-self em reações de defesa contra bactérias e
fungos (BOWMAN; NUTTALL, 2008).
A hemolinfa contém vários tipos de hemócitos, sendo o mais abundante os
fagócitos (plasmócitos e granulócitos) (SONENSHINE et al., 2002). Os hemócitos são os
principais componentes da hemolinfa variando de 50 a 60% de seu conteúdo
(SONENSHINE, 1991), apresentando um papel importante no sistema imune do
carrapato (ZHIOUA et al., 1996). A quantidade, assim como o tipo de hemócito, é
essencial para imunidade dos artrópodes (RUSSO et al., 2001), que por meio de
mecanismos da fagocitose, encapsulação, nodulação, coagulação e cicatrização
combatem agentes externos que invadem o hospedeiro (ALVES, 1998).
As reações de defesa ocorrem provavelmente em dois estágios, sendo o primeiro
o reconhecimento de partículas estranhas pelos granulócitos e coagulócitos seguido pela
liberação de fatores de reconhecimento que numa segunda estapa conduzem os
plasmócitos em direção às partículas invasoras (ALVES, 1998). Agentes patogênicos
fracos são facilmente encapsulados e destruídos, porém, patógenos virulentos como
alguns isolados de M. anisopliae e B. bassiana, são capazes de resistir à fagocitose e
encapsulamento, e levar o hospedeiro à morte (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).
2.5 Uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos ixodídeos
Os carrapatos são vetores de difícil controle pois apresentam muitas espécies e
ciclos biológicos distintos (BLAGBURN; DRYDEN, 2009), além de serem abundanres
e bem adaptados ao ambiente em que estão inseridos. Kaufman (2010) comenta que os
carrapatos ganham grande atenção da ciência principalmente por serem vetores de vários
patógenos, e que os esforços têm-se concentrado nos métodos de controle desses
artrópodes.
Tradicionalmente, métodos de controle usando substâncias químicas, possuem
alto custo, promovem poluição ambiental e o desenvolvimento da resistência aos
acaricidas (RIBEIRO et al., 2010). A resistência às três maiores classes de carrapaticidas
que são amplamente utilizadas no controle de carrapatos: organofosforados (OPs),
piretroides (SPs) e amitraz (formamidinas), são bem documentados no México, Austrália
e Brasil (BARRÉ et al., 2008)
21
Preocupações com a segurança e o impacto ambiental, com relação à aplicação de
produtos químicos, redirecionam as pesquisas para métodos sustentáveis de controle do
carrapato, incluindo o controle biológico (CHANDLER et al., 2000). Métodos
alternativos de controle tornam-se cada vez mais importantes pelo crescente número de
relatos de resistência aos carrapaticidas químicos comumente utilizados (MERLINI;
YAMAMURA, 1998; JONSSON et al., 2000; FOIL et al., 2004; FERNÁNDEZ-SALAS
et al., 2012)
Segundo Flamini (2003), o controle de doenças causadas por ácaros parasitas de
plantas, humanos e animais está baseado no uso de drogas, porém quando essas não são
eficazes fazem com que essas pragas tornem-se um problema maior e mais sério. A partir
disso, associado a outros fatores como o aumento da procura por alimentos mais
saudáveis e com menos resíduos tóxicos, além de uma legislação mais severa quanto à
poluição ambiental, tem-se somado esforços para o desenvolvimento de biopesticidas a
base de fungos (FARIA; WRAIGHT, 2007).
O controle biológico vem sendo utilizado não somente como uma forma
alternativa de controle, mas também associado aos químicos, como uma forma de
controle integrado (BAHIENSE et al., 2006; SOUSA; BERNARDES; et al., 2011).
Parasitos, predadores de insetos e fungos entomopatogênicos têm sido apontados como
agentes promissores para o uso no controle biológico de vetores (JACKSON et al., 1997).
Vários fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados a carrapatos e
alguns têm demonstrado alta virulência contra esses artrópodes, sendo os gêneros
Metarhizium e Beauveria os mais investigados (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).
Muitos autores citam o uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos em
testes in vitro (BITTENCOURT et al., 1996; PIRALI-KHEIRABADI et al., 2007;
ANGELO et al., 2010; SUN et al., 2011) e in vivo (BITTENCOURT et al., 2003;
ALONSO-DÍAZ et al., 2007; ANGEL-SAHAGÚN et al., 2010).
Segundo Filho et al. (2009), o controle utilizando fungos apresenta diferentes
formas de aplicação, não sendo indicados apenas como substitutos dos produtos
químicos. Muitas características devem ser levadas em consideração durante o
desenvolvimento de micopesticidas, como a viabilidade e infectividade dos propágulos
durante o armazenamento, a capacidade de infectar a praga alvo nas condições ambientais
(JACKSON; JARONSKI, 2009), as características de infecção do propágulo fúngico e
aquelas inerentes ao hospedeiro alvo (FILHO et al., 2009).
22
No entanto, o processo de avaliação do potencial de um isolado fúngico deve
considerar também o custo-benefício, ou seja, um produto economicamente viável e de
fácil produção massal (JACKSON; JARONSKI, 2009). Kleepies e Zimmermann (1992)
citam que o método mais econômico de produção em massa de fungos
entomopatogênicos, sobre condições controladas, é a fermentação líquida.
Muitos micoacaricidas e micoinseticidas tem sido desenvolvidos desde a década
de 1960, sendo mais de 60% deles à base de B. bassiana e M. anisopliae e apenas 4% dos
bioprodutos disponíveis no mercado são à base de blastosporos (FARIA; WRAIGHT,
2007). Segundo Kim et al. (2013), a produção de conídios aéreos é onerosa e demanda
muito tempo, o que aumenta os riscos de contaminação. Em contrapartida, os autores
citam que, produzidos em meio líquido, blastosporos são de mais fácil produção, estando
esta completa em 3 a 4 dias dependendo do meio utilizado. Blastosporos podem ser
produzidos em tanques de fermentação (JACKSON et al., 2003) tornando seu cultivo
mais fácil.
Apesar de alguns estudos citarem vantagens de produção de larga escala
(JACKSON; JARONSKI, 2009) ou até maior virulência (HARTELT et al., 2008) de
blastosporos em relação a conídios, pouco se sabe sobre esses propágulos. Apesar das
vantagens sobre conídios, blastosporos também apresentam desvantagens como a maior
sensibilidade a fatores estressantes como a temperatura (KIM et al., 2013). Porém, é
sabido que alguns veículos, como o óleo, são utilizados com a finalidade de proteger os
propágulos fúngicos, conídios (LOPES et al., 2007; XAVIER-SANTOS et al., 2011;
CAMARGO et al., 2012b) ou blastosporos (KIM et al., 2013), contra o danos causados
por fatores abióticos.
Alguns autores citam que bioprodutos a base de blastosporos apresentariam menor
tempo de prateleira (JACKSON et al., 1997), porém muitos estudos vêm sendo
desenvolvidos para suprir as deficiências apresentadas por esse propágulos (LANE;
TRINCI, 1991; KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1994; CLIQUET; JACKSON, 1999,
2005; MASCARIN, et al., 2015) e ressaltar suas vantagens.
23
2.6 Influência de fatores abióticos, radiação ultravioleta e calor, no desenvolvimento
de fungos entomopatogênicos
O desempenho de fungos entomopatogênicos é afetado por uma variedade de
fatores bióticos e abióticos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). Rangel et al. (2008)
citam que a radiação ultravioleta (UV) e o calor são fatores que reduzem
significativamente a viabilidade de conídios a campo. Outros autores relatam ainda a
umidade relativa do ar e fatores relativos ao hospedeiro como temperatura e composição
química das secreções da pele (POLAR et al., 2005), como fatores que podem influenciar
o desenvolvimento de fungos entomopatogênicos quando utilizados a campo.
A radiação ultravioleta é a porção mais prejudicial e mutagênica do espectro solar
(BRAGA et al., 2015), sendo convencionalmente dividida em três comprimentos de onda:
UV-C (200 - 280 nm), UV-B (280 - 315 nm) e UV-A (315 - 400 nm) (PAUL; GWYNN-
JONES, 2003). Segundo estes autores, UV-C é absorvida pelo oxigênio e o ozônio da
atmosfera e, por isso, não chega a atravessá-la, enquanto UV-B e UV-A conseguem. A
porção UV-B induz alterações em DNA, proteínas e lipídios (HIDEG et al., 2013), assim
como a porção UV-A, normalmente menos danosa.
A porção UV-B da radiação é diretamente absorvida pelo DNA levando à
formação de dímeros de pirimidina e mutagênese, em contrapartida, a radiação UV-A
gera danos oxidativos e indiretamente danos ao DNA por fotosensibilização e formação
de espécies reativas de oxigênio (FRIEDBERG et al., 1995). Fungos entomopatogênicos
possuem mecanismos de proteção e reparo aos danos causados pela radiação UV. A
produção de melanina pelo fungo, pode proteger os propágulos da exposição à condições
ambientais adversas (BUTLER; DAY, 1998) por meio de absorção comprimentos de
onda do espectro solar, inclusive a radiação UV (SHANG et al., 2012). Em fungos, as
tirosinases apresentam um importante papel na formação de pigmentos, bem como em
mecanismos de defesa e virulência (HALAOULI et al., 2006). Fotoliases, são importantes
enzimas que, ativadas pela luz, atuam na reparação do DNA após formação dos dímeros
de pirimidinas, formados pela exposição à radiação UV-B (KAO et al., 2005).
A partir disso, esforços têm se concentrado em encontrar isolados mais tolerantes
à radiação UV, os quais consigam manter a viabilidade (capacidade de germinação) e a
virulência mesmo quando expostos a altas doses de radiação (BRAGA et al., 2001).
Muitos estudos vêm sendo conduzidos mimetizando as condições de exposição à luz
24
solar, com lâmpadas fluorescentes emissoras de radição UV-B (BRAGA et al., 2001;
RANGEL et al., 2005; FERNANDES et al., 2007; TAYLOR et al., 2013) a fim de
encontrar isolados promissores para o uso em programas de biocontrole. Segundo Braga
et al., (2015), além de inviabilizar os conídios, limitar o tamanho da população de fungos
e sua dispersão, doses subletais de radiação UV podem reduzir o vigor e a sua virulência.
Muitos fatores podem influenciar a quantidade de radiação UV recebida no meio
ambiente (280 - 400 nm) como a altitude, camada de ozônio, angulação do sol,
nebulosidade e até a poluição (PAUL; GWYNN-JONES, 2003). Portanto, embora a
exposição à radição UV com auxílio de lâmpadas possua certas vantagens sobre a
exposição à radiação solar, como a reprodutibilidade e o maior controle do ambiente de
exposição dos isolados, a análise dos resultados obtidos devem ser cuidadosamente
extrapoladas para condições ambientais (BRAGA et al., 2001).
Além disso, outros fatores abióticos também são importantes limitadores da
atividade de fungos entomopatogênicos, como altas temperaturas, por exemplo (XIE et
al., 2012). Aumentos repentinos de temperatura promovem importantes danos da
estrutura celular e interferem em funções essenciais de microrganismos (RICHTER et al.,
2010). O calor úmido pode causar a desnaturação de proteínas, enquanto que baixa
umidade associada a altas temperaturas promovem danos ao DNA de microrganismos
(SETLOW; SETLOW, 1996).
Vários mecanismos de proteção são utilizados pelos fungos para suportar os
estresses aos quais são submetidos. Em resposta ao estresse térmico, células ativam uma
importante via de sinalização transitória que expressa proteínas, como as chaperonas,
chamadas de heat shock proteins (HSP), que previnem a formação de agregados não
específicos de proteínas (RICHTER et al., 2010); desta forma as HSP são importantes
indutoras de termotolerância (PLESOFSKY-VIG; BRAMBL, 1985).
Sabe-se que fungos que crescem em condições ambientais extremas tendem a
possuir mecanismos que os protegem de fatores estressantes, entre eles estão o acúmulo
de trealose e manitol (RANGEL et al., 2008). Estudos vêm sendo desenvolvidos no
intuito de, a partir de locais com condições estressantes para o desenvolvimento de
fungos, encontrar isolados mais termotolerantes (RANGEL et al., 2005b; FERNANDES
et al., 2008).
O calor em conjunto com à radiação UV são os principais responsáveis pela falha
em programas de controle biológico (RANGEL et al., 2005b). Portanto, estudos que
25
apontem isolados mais tolerantes às condições adversas presentes no ambiente onde
destina-se a aplicação de bioprodutos, são importantes para a disseminação desse tipo de
controle. Neste sentido, o uso de fungos entomopatogênicos em programas de controle
biológico de vetores não depende apenas seleção de isolados virulentos, mas também da
seleção de isolados tolerantes a fatores naturais estressantes.
26
3 JUSTIFICATIVA
O potencial de fungos entomopatogênicos para controle de carrapatos é
frequentemente subestimado (FERNANDES et al., 2012). Novos estudos que apontem
isolados e preparos fúngicos mais eficazes para controle biológico de carrapatos,
incluindo maior tolerância à condições ambientais adversas, são necessários para
popularização de produtos biológicos à base de fungos.
Cerca de 171 produtos à base de fungos são destinados ao controle de artrópodes
pragas em todo o mundo, e 42,7% deles estão ou foram disponibilizados comercialmente
na América do Sul. Apenas três produtos são indicados para controle de carrapatos,
embora não sejam produtos exclusivos para este grupo de artrópodes (FARIA;
WRAIGHT, 2007). Micoacaricidas, como são conhecidos os produtos destinados ao
controle de carrapatos e outros membros da subclasse Acari, estão disponíveis
comercialmente como conídios em formulações oleosas ou em pó molhável (FARIA;
WRAIGHT, 2007).
Micoacaricidas têm mostrado resultados promissores em estudos laboratoriais e
de semi-campo. Apesar de alguns estudos listarem uma série de vantagens de
blastosporos de fungos entomopatogênicos em relação aos conídios (JACKSON et al.,
1997; VEGA et al., 1999; HARTELT et al., 2008), pouco se sabe sobre a eficácia de
blastosporos para o controle de carrapatos. Não foram encontrados produtos à base de
blastosporos recomendados para controle de carrapatos, e dos 171 produtos biológicos à
base de fungos listados por Faria e Wraight (2007), apenas 4,1% são formulações com
blastosporos. Além disso, o desempenho dos blastosporos é pouco conhecido em
laboratório ou em campo, principalmente contra carrapatos.
As vantagens dos blastosporos em relação aos conídios incluem a germinação que
pode ser até quatro vezes mais rápida do que a de conídios, alta infectividade (VEGA et
al., 1999; HARTELT et al., 2008), e a facilidade de produção de elevadas concentrações
de blastosporos (JACKSON; JARONSKI, 2009). Esses benefícios sobrepõem algumas
das desvantagens dos blastosporos que é a menor tolerância à fatores de estresse em
relação aos conídios e menor estabilidade (KIM et al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al.,
2014; MASCARIN et al., 2015); no entanto, uma adequada formulação dos blastosporos
pode proteger esses propágulos desses efeitos.
27
O controle de carrapatos é dificultado na atualidade especialmente pelo elevado
índice de resistência aos acaricidas químicos utilizados convencionalmente. Além disso,
o seu uso indiscriminado tem chamado a atenção por causar sérios danos ao meio
ambiente e por deixar resíduos em alimentos, afetando diretamente a saúde humana e
animal (FERNANDES et al., 2012). Neste sentido, torna-se necessário a busca por
métodos de controle alternativo ao uso exclusivo do método convencional, que sejam
mais eficientes, menos tóxicos ao homem e aos animais, e de menor impacto ambiental.
Sendo assim, o presente estudo investigou a eficácia de blastosporos para controle
de carrapatos, permitindo compreender alguns importantes mecanismos de ação de
blastosporos de fungos entomopatogênicos contra carrapatos, e avaliou sua eficácia como
agente de biocontrole. Além disso, foi investigada a tolerância de blastosporos a
importantes fatores abióticos de estresse, como elevada temperatura e radiação
ultravioleta. Esses resultados, por sua vez, foram comparados aos resultados obtidos por
conídios dos mesmos isolados investigados. Neste sentido, buscou-se contribuir com o
desenvolvimento de bioprodutos para controle de carrapatos, que são importantes vetores
de patógenos que comprometem a saúde humana e animal.
28
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Contribuir com o aprimoramento do controle microbiano do carrapato
Rhipicephalus microplus, comparando a eficácia entre blastosporos e conídios de fungos
entomopatogênicos.
4.2 Objetivos específicos
Avaliar comparativamente a virulência de conídios e blastosporos de isolados de
Metarhizium spp. e B. bassiana s.l. para larvas não alimentadas e fêmeas
ingurgitadas de R. microplus;
Avaliar comparativamente a tolerância de conídios e blastosporos dos isolados de
Metarhizium spp. e B. bassiana s.l. à condições estressantes de temperatura e
radiação ultravioleta UV-B;
Investigar e comparar a velocidade de germinação de conídios e blastosporos dos
isolados Metarhizium robertsii e B. bassiana s.l. sobre a cutícula de fêmeas
ingurgitadas de R. microplus.
29
5 RESULTADOS
Artigo 1 - Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. ou Beauveria bassiana em
Rhipicephalus microplus: Virulência e desenvolvimento durante o processo de
infecção
Bernardo, C.C. Barreto, L.P., Luz, C., Arruda, W., Fernandes, E.K.K.
Experimental and Applied Acarology
Artigo 2 - Tolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria
bassiana ao calor e à radiação UV-B
Bernardo, C.C., Pereira Júnior, R.A., Luz, C., Rangel, D. E. N., Fernandes, E.K.K
Journal of Applied Microbiology
30
ARTIGO 1
Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria
bassiana em Rhipicephalus microplus: virulência e
desenvolvimento durante o processo de infecção
Cíntia C. Bernardo1, Lucas P. Barreto1, Christian Luz1, Walquíria Arruda2, and
Éverton K. K. Fernandes1*
1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás (UFG),
Goiânia, Goiás 74690-900, Brasil. 2 Instituto de Ciências Biológicas, UFG, Goiânia, Goiás 74690-900, Brazil.
* Correpondências devem ser enviadas para Universidade Federal de Goiás, Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Esperança s/n, Campus Samambaia,
Goiânia, GO, Brasil, 74690-900.
Telefone: +55 (62) 3209-6118; e-mail: [email protected]
31
Resumo
O presente estudo comparou a virulência de conídios e blastosporos de isolados de
Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) e Beauveria
bassiana s.l. (IP 361 e CG 307) sobre larvas e fêmeas ingurgitadas do carrapato
Rhipicephalus microplus; além disso, avaliou o desenvolvimento desses propágulos na
cutícula do carrapato por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Larvas de
R. microplus foram tratadas com suspensão de conídios ou blastosporos nas
concentrações de 106, 107 e 108 propágulos/mL dos quatro isolados testados. Na menor
concentração avaliada, apenas o tratamento com conídios de IP 361 promoveu
mortalidade superior ao do grupo controle, resultado que corrobora com o cálculo de
concentração letal (CL50), cujo isolado apresentou melhor resultado. Fêmeas ingurgitadas
de R. microplus foram tratadas com suspensão de conídios e blastosporos na concentração
de 107 propágulos/mL. Foram avaliados diversos parâmetros biológicos das fêmeas,
diariamente, até o término da postura. Apenas nos grupos tratados com blastosporos de
IP 146 e IP 361 houve alteração de parâmetros biológicos em relação ao grupo controle,
como, por exemplo: menor índice nutricional das fêmeas e também índice de produção
de ovos. O percentual de controle de fêmeas tratadas com blastosporos de IP 146
(97,95%) e IP 361 (92,92%) foi maior em comparação aos tratamentos com conídios dos
mesmos isolados, respectivamente, 70,97% e 63,29%. Fêmeas de R. microplus tratadas
com suspensões de IP 146 e IP 361 na concentração de 107 propágulos/mL foram
incubadas por 0, 4, 8, 24, 48, 72 e 96 horas, e após cada tempo de incubação foram
fixadas. A cutícula ventral foi dissecada, sendo, após 10 dias, desidratas, secas e
recobertas por ouro para avaliação por MEV. Blastosporos de IP 146 e IP 361 iniciaram
seu desenvolvimento após 4 horas de incubação. Mesmo após 96 horas de incubação, não
foi observado nenhuma estrutura de penetração oriundo de blastosporos de M. robertsii,
mas foi encontrado evidência da penetração destes propágulos por aberturas naturais.
Blastosporos de B. bassiana apresentaram penetração após 4 horas de incubação. Foi
observado formação de tubos germinativos em conídios, de ambos os isolados, após 48
horas de incubação. Para os estágios de larva, foi observado um melhor desempenho de
conídios em relação a blastosporos; no entanto, blastosporos foram mais virulentos para
fêmeas ingurgitadas. Portanto, acredita-se que blastosporos sejam promissores para o uso
no biocontrole de carrapatos, já que estes demonstraram-se virulentos para adultos de R.
microplus, além de apresentarem rápido desenvolvimento sobre a cutícula desse
artrópode.
Palavras-chave: fungos entomopatogênicos; propágulos fúngicos; carrapato;
microscopia eletrônica de varredura; infecção.
1. Introdução
O carrapato Rhipicephalus microplus é conhecido como carrapato do boi, e
geralmente parasita somente bovinos, porém quando a população de carrapato atinge
níveis altos nas pastagens, o parasitismo pode se estender a outras espécies (ANGELO et
al., 2010). Massard e Fonseca (2004) citam que os carrapatos, de um modo geral,
32
apresentam algum grau de especificidade por hospedeiro, podendo o homem atuar como
hospedeiro alternativo.
Na medicina veterinária, os carrapatos apresentam grande importância por serem
vetores de diversos agentes causadores de doenças, além de promoverem consideráveis
perdas econômicas (FURLONG et al., 2005). Grisi et al. (2014) estimaram que R.
microplus, somente, é responsável por gastos superiores a 3 bilhões de dólares na pecuária
nacional anualmente. O método mais empregado para o controle de carrapatos é baseado
na utilização de acaricidas químicos; entretanto, o controle de carrapatos é dificultado
especialmente pelo elevado nível de resistência aos acaricidas químicos utilizados
convencionalmente (SOUZA HIGA, 2015).
A partir disso, novas alternativas têm sido empregadas ou investigadas para controle
de carrapatos. A integração de técnicas de controle tem sido descrita como benéfica,
potencializando possivelmente o controle desses artrópodes (BAHIENSE et al., 2006;
SOUSA et al., 2011; WEBSTER et al., 2015), além de evitar o uso exclusivo de acaricidas
químicos e assim, minimizando os problemas associados à utilização indiscriminada
desses produtos. Acaricidas à base de fungos entomopatogênicos vêm sendo cada vez
mais estudados para o controle biológico destes artrópodes. Este método de controle
apresenta uma série de vantagens em relação aos produtos químicos, destacando-se a
baixa poluição ambiental, não apresentam risco para animais vertebrados e possuem alta
eficácia contra artrópodes pragas (ALONSO-DÍAZ et al., 2007).
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana são os fungos entomopatogênicos
mais investigados quanto ao seu potencial para o controle de espécies de carrapatos em
todo o mundo (FERNANDES et al., 2008). A maioria dos produtos comerciais para o
uso em programas de controle biológico de artrópodes é a base de conídios, sendo
estimado que apenas 4% deles seja à base de blastosporos (FARIA; WRAIGHT, 2007).
Mascarin et al. (2015) demonstraram que é possível produzir blastosporos de forma
rápida, com baixo custo, e também aumentar o tempo de prateleira dos bioprodutos à base
de blastosporos. Apesar de alguns autores listarem vantagens no desenvolvimento e
produção de blastosporos de fungos entomopatogênicos em relação a conídios (VEGA et
al., 1999; JACKSON; JARONSKI, 2009), pouco se sabe sobre a eficácia de blastosporos
para o controle de carrapatos.
Esses benefícios podem superar possíveis desvantagens em relação aos conídios,
como a menor tolerância a fatores abióticos estressantes (KIM et al., 2013; OTTATI-DE-
33
LIMA et al., 2014), pois blastosporos são formados naturalmente, na hemolinfa do
hospedeiro invertebrado (FANG et al., 2010). Além disso, uma adequada formulação dos
blastosporos pode proteger esses propágulos contra fatores abióticos estressantes (KIM
et al., 2013) e garantir maior eficácia do bioproduto.
Apesar de alguns estudos compararem a eficácia de conídios e blastosporos para
insetos e carrapatos (LANE; TRINCI, 1991; KIRKLAND; CHO; et al., 2004;
KIRKLAND; WESTWOOD; et al., 2004) pouco se sabe sobre os mecanismos de
infecção de blastosporos. O mecanismo de infecção por conídios em carrapatos é melhor
esclarecido, onde estes, após aderirem a cutícula do hospedeiro, germinam e formam
tubos germinativos que culminam na formação do apressório e iniciam assim a invasão
fúngica (BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA et al., 2005).
A partir disso, o presente estudo comparou a virulência de blastosporos e conídios
de isolados de Metarhizium spp. (IP 146 e IP 363) e B. bassiana (IP 361 e CG 307),
originados do Brasil, para larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus, além de
determinar o tempo de desenvolvimento e modo de infecção desses propágulos na
cutícula de carrapatos por meio da microscopia eletrônica de varredura.
2. Material e Métodos
2.1 Origem e cultivo dos fungos
A partir de estudos prévios para avaliar a produção de blastosporos em meio
líquido, foram selecionados quatro isolados de Metarhizium spp. e cinco de Beauveria
bassiana (Tabela 1). Dos isolados avaliados, oito são provenientes do Centro-Oeste e um
do Nordeste Brasileiro.
34
Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos investigados no presente estudo.
Código Origem Substrato/Hospedeiro Espécie
IP 1 GO, Brasil Solo Metarhizium anisopliae s.l.
IP 46 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.
IP 146 GO, Brasil Solo M. robertsii s.l.
IP 361 GO, Brasil Amblyomma cajennense
[Ixodidae][Ordem: Ixodida] Beauveria bassiana s.l.
IP 363 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.
IP 364 GO, Brasil A. cajennense
[Ixodidae][Ordem: Ixodida] B. bassiana s.l.
CG 138 PE, Brasil Cosmopolites sordidus
[Curculionidae][Ordem: Coleoptera] B. bassiana s.l.
CG 307 GO, Brasil Solo B. bassiana s.l.
CG 484 MS, Brasil Diabrotica sp.
[Chrysomelidae][Ordem: Coleoptera] B. bassiana s.l.
IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública; CG: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Para a produção de conídios e blastosporos, foi utilizado meio Adamék modificado
(KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) com ou sem ágar respectivamente. Para obtenção
do caldo de amido utilizado no meio de cultura, foram misturados 5 g de maisena
(Maizena®, Unilever, São Paulo, Brasil) à 250 mL de água destilada; além de 3,15% de
caldo de milho os meios de cultura apresentavam 4,21% de glicose (Labsynth®, Produtos
para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) e de extrato de levedura (Difco
Laboratories®, Interlab, São Paulo, Brasil), e ainda 2,1% de Tween 80 (Labsynth®,
Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) 0,1%.
Para o cultivo dos blastosporos foram utilizados 150 mL do meio Adamék líquido
para cada frasco tipo Erlenmeyer (Pirex®, USA), sendo estes tampados com algodão
hidrófobo e colocados em agitador orbital a 150 rpm por 4 dias, em temperatura ambiente
(aproximadamente 27°C). Após o crescimento do fungo, o meio foi filtrado em funil com
gaze para remoção do micélio produzido durante o cultivo; o meio contendo blastosporos
foi colocado em tubos de centrifuga de 15 mL (Gene®, Ionlab Equip. Sup. Laborat. Hosp.
Ltda.), e centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos. Após primeira centrifugação o
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em Tween 80® 0,01% e centrifugado
novamente para retirada de resquícios do meio de cultura. Descartou-se novamente o
sobrenadante e o ressuspendeu em Tween 80® a 0,01%.
A produção de conídios ocorreu em placas de Petri (90x10mm) contendo meio
Adamék (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) acrescido de 2% de ágar (Himedia®,
HiMedia Lab. Pvt. Ltd.). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1°C com umidade
relativa ≥80%. Os conídios foram retirados da placa com auxílio de espátula e colocados
35
em tubos tipo Falcon (15 mL) contendo 10 mL de Tween 80® 0,01% e pérolas de vidro
(4 mm de diâmetro). Os tubos contendo as suspensões conidiais foram agitados em vortéx
até a completa homogeneização, e posteriormente filtrados em funil com gaze.
A quantificação das suspensões, de conídios ou blastosporos foi feita com o auxílio
da Câmara de Neubauer.
2.2 Obtenção e preparação dos carrapatos para bioensaios
Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram obtidas a partir de vacas em lactação,
naturalmente infestadas, sem contato prévio com carrapaticidas por pelo menos 30 dias.
As coletas foram realizadas em propriedades rurais da região metropolitana de Goiânia.
As fêmeas ingurgitadas coletadas foram levadas ao Laboratório de Patologia de
Invertebrados, situado no Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás, onde foram lavadas em água corrente e secas em papel toalha estéril.
Após a primeira lavagem, os carrapatos foram imersos respectivamente em água
destilada, solução de hipoclorito a 1% e em água destilada novamente, permanecendo 1
minuto em cada etapa. As fêmeas foram secas em papel toalha estéril e em seguida
tratadas (como será descrito a seguir), ou incubadas para permitir a oviposição.
Para obtenção das larvas de carrapatos, as fêmeas foram colocadas em placas de
Petri (100 × 15 mm) e fixadas pelo dorso com auxílio de fita adesiva dupla-face. Após 10
dias do início da postura, 50 mg da massa de ovos (aproximadamente 1000 ovos,
DRUMMOND et al., 1971) foram acondicionados em tubos de ensaio de vidro (15 x 100
mm), tampados com algodão hidrófilo e incubadas a 27±1°C e umidade relativa superior
a 80%. As larvas de R. microplus só foram utilizadas 7 dias após o término da eclosão
destas, a fim de que houvesse o completo enrigecimento da cutícula.
2.3 Bioensaios
2.3.1 Larvas não alimentadas de R. microplus
Foram produzidos 10 mL de suspensão de conídios ou de blastosporos na
concentração de 107 propágulos/mL para cada um dos 9 isolados estudados. Para os
bioensaios foram formados 3 grupos (grupo controle e grupos tratados com conídios ou
blastosporos) com 10 réplicas, para cada isolado avaliado. Cada tubo de ensaio contendo
aproximadamente mil larvas foi tratado com 1 ml de suspensão fúngica, sendo esta
36
espalhada por todo o tubo por aproximadamente 1 minuto, a fim de que todas as larvas
do tubo entrassem em contato com a suspensão de tratamento. Após esse período, os tubos
foram colocados invertidos nas estantes para absorção do excesso da suspensão de
tratamento pelo algodão. O grupo controle seguiu o mesmo método de tratamento das
larvas, no entanto, cada tubo de ensaio recebeu 1ml de solução estéril de Tween 80®
0,01%.
Em seguida, os tubos foram mantidos a 27 ±1 ºC com umidade relativa superior a
80%, sendo estimada visualmente a mortalidade das larvas a cada 2 dias, em
estereomicroscópio, sendo atribuídos valores em percentual que variaram de 0 a 100%,
em intervalos de 5%. Essa metodologia é baseada nos estudos de Grillo Torrado e
Gutierrez (1969) e Bittencourt et al. (1996).
Quatro isolados que apresentaram melhor desempenho na triagem foram
reavaliados, com três diferentes concentrações (106, 107 e 108 propágulos/mL), contra
larvas de R. microplus, utilizando metodologia semelhante ao teste anterior.
O experimento foi conduzido por três vezes, em dias diferentes, com diferentes
lotes de propágulos fúngicos. O cálculo matemático da concentração letal mediana (CL50)
e seu intervalo de confiança foram feitos pelo método de análise de próbites, segundo
Finney (1971) utilizando-se o programa “Probit or Logit Analysis”. As análises do efeito
do tratamento ou das diferentes concentrações sobre a mortalidade das larvas foram feitas
a partir da análise de variância, seguidos do teste de Student-Newman-Keuls (SNK), com
nível de significância de 5% (P ≤ 0,05).
2.3.2 Fêmeas ingurgitadas de R. microplus
Ambos propágulos de quatro isolados selecionados a partir do teste de triagem
foram avaliados contra fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Os carrapatos foram pesados
individualmente e separados por meio de cálculos de intervalo de classe [IC = (peso da
fêmea mais pesada - peso da fêmea mais leve)/número de fêmeas por grupo)], sendo
criados grupos de 8 indivíduos homogeneizados entre si de acordo com o peso.
As fêmeas de cada tratamento foram imersas por aproximadamente 1 minuto em
suspensão de blastosporos ou conídios (107 propágulos/mL) e, em seguida,
acondicionadas individualmente nos poços (volume 3,29 mL) de placas de cultura de
células (Prolab, São Paulo, Brasil). As fêmeas foram mantidas em câmara climatizada a
27 ± 1C e UR > 80%.
37
Os seguintes parâmetros biológicos foram investigados: peso inicial da fêmea
ingurgitada; peso da postura; período de postura (compreendido entre a postura do primeiro
e a do último ovo); peso da quenógina (determinado três dias após o término da postura) e
percentual de eclosão larval, avaliado através de uma leitura subjetiva da quantidade de
larvas eclodidas em relação à massa total de ovos, com o auxílio de microscópio
estereoscópio.
A partir dessas avaliações foram calculados o índice de produção de ovos (IPO) e
o índice nutricional (IN), conforme metodologia descrita por Bennet (1974), pelas
seguintes equações: IPO = peso da massa de ovos (g) / peso inicial da fêmea ingurgitada
(g) × 100; e IN = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) – peso da quenógina
(g) × 100. Foram calculados ainda a reprodução estimada (RE) e o percentual de controle,
conforme metodologia descrita por Drummond et al. (1971), usando as seguintes
equações: RE = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) × percentual de eclosão
larvas × 20.000 (constante que se refere ao número de ovos presente em 1 g de ovos de
R. microplus); Percentual de controle = RE média do grupo controle – RE média do
grupo tratado / RE média do grupo controle × 100.
Os dados referentes aos parâmetro biológicos das fêmeas foram submetidos à
análise de variância seguido de análise para comparação de médias. Período de pré-
postura e período de postura, utilizou-se o teste de Student-Newman-Keuls (SNK), e os
dados de IPO e IN o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ambos com nível de
significância de 5% (P ≤0,05).
2.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram higienizadas conforme descrito no
item 2.2, individualmente, e tratadas topicamente com 50 μL de suspensão de conídios
ou blastosporos na concentração de 107 propágulos/mL dos isolados IP 146 (M. robertsii)
e IP 361 (B. bassiana) na região ventral da fêmea com auxílio de uma micropipeta semi-
automática (de 20 a 200μm, Labmate soft®). Após cada tempo de incubação (0, 4, 8, 24,
48, 72 e 96 horas), uma fêmea ingurgitada de R. microplus foi imersa em 1mL de fixador
(2% de paraformaldeído, 2% de glutaraldeído, 3% de sacarose e tampão cacodilato de
sódio 0,1M pH 7,2) em tubos criogênicos (Global Trade Technology®, Monte Alto, SP)
de 2 mL.
38
Após 10 dias imersas no fixador, parte da cutícula ventral das fêmeas foi dissecada
e imersa em 1 mL de tampão cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,2), em novos tubos
criogênicos. Para desidratação e preparação das amostras, estas foram lavadas três vezes
(15 minutos cada) em tampão cacodilato de sódio (0,1M, pH 7,2). Após as lavagens, as
cutículas foram desidratadas em uma série gradual de soluções de etanol (30, 50, 70, 80
e 90%), permanecendo por 15 minutos em cada solução e passando duas vezes em etanol
100%, por 10 minutos cada etapa. Posteriormente, para secagem, as amostra foram
imersas em aproximadamente 300 µL de hexametildisilazano (Electron Microscopy
Sciences, Hatfield, PA, USA), onde foram mantidas por 6 minutos. Em seguida, o líquido
foi retirado e os tubos mantidos abertos para evaporação do reagente.
Após a secagem, as amostras foram submetidas a metalização, sendo montadas
em um stub e revestidas por ouro em um sputter-aplicator (Denton Vacuum, Desk V). Ao
final, as cutículas foram analisadas e eletromicrografadas no microscópio eletrônico de
varredura (MEV) Jeol JSM 6610 em uma voltagem de aceleração de 5 kV no Laboratório
Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic) da Universidade Federal de
Goiás, para avaliação do comportamento e desenvolvimento de conídios e blastosporos.
Os experimentos foram repetidos três vezes, em dias diferentes, com diferentes
propágulos fúngicos.
3. Resultados
Nos ensaios de triagem da virulência de conídios de Metarhizium spp., três
isolados (IP 1, IP 46 e ARSEF 324) promoveram mortalidade de larvas de R. microplus
inferior a 70% no 14º dia após o tratamento; os maiores percentuais de mortalidade foram
promovidos pelos isolados IP 146 (91%) e IP 363 (77%) (Figura 1). Nos tratamentos com
blastosporos, IP 1 e ARSEF 324 promoveram mortalidade média de larvas inferior a 15%,
sendo observado maiores percentuais nos tratamentos com os isolados IP 46 (82,2%), IP
363 (96,5%) e IP 146 (100%) no 14º dia após o tratamento. Na triagem com isolados de
Beauveria bassiana, os tratamentos com suspensão conidial promoveram média de
mortalidade das larvas de 17% (CG 138), 46% (CG 484), 70% (IP 364), 83,5% (CG 307)
e 99,5% (IP 361) após a última avaliação. Tratamentos com blastosporos de B. bassiana
promoveram mortalidade abaixo de 40% para larvas de Rhipicephalus microplus, em
todos os isolados avaliados.
39
Figura 3. Mortalidade média de larvas Rhipicephalus microplus tratadas com Tween 80 na concentração de 0,01% (controle) ou com suspensão
de conídios ou blastosporos (107 propágulos/mL) de isolados de Metarhizium spp. (IP 46, IP 146, IP 363 e IP 1) ou Beauveria bassiana (IP 361,
CG 138, CG 397, CG 484 e IP 364). Dados obtidos a partir de avaliação de dez réplicas em uma repetição.
40
Na avaliação da mortalidade acumulada de larvas não alimentadas de R. microplus no 10º
dia após o tratamento (Figura 2), foi evidenciado já na concentração de 106
propágulos/mL, que, apenas o grupo tratado com conídios de IP 361 promoveu
mortalidade de larvas maior do que o observado no grupo controle (F8,18= 4,47;
P=0,0039). Na concentração de 107 propágulos/mL, os tratamentos com blastosporos de
IP 146 e IP 361, e ambos propágulos de CG 307, não diferiram do controle (F1,18= 8,05;
P=0,0001). Na concentração mais alta, 108 propágulos/mL, apenas blastosporos de IP 361
promoveram mortalidade de larvas semelhante àquela apresentada pelo grupo controle
(F8,18=22,784; P<0,0001); enquanto que a mortalidade média de larvas tratadas com
conídios de CG 307 foi de 32,75% e a dos demais grupos de tratamento foi superior a
70%. Não houve diferença significativa entre as concentrações utilizadas para um grupo
tratado com mesmo isolado e propágulo fúngico apenas quando foi utilizado conídios de
IP 146 (F2,6=2,24; P=0,1871) e IP 363 (F2,6=4,68; P=0,0595) ou blastosporos de IP 146
(F2,6=1,99; P=0,2160). Não foi observada diferença entre conídios e blastosporos dos
isolados de Metarhizium, IP 146 e IP 363 nas concentrações de 106 (F1,4=0,20;P=0,6732;
F1,4=0,19;P=0,6849), 107 (F1,4=0,81;P=0,4171; F1,4=0,49;P=0,5187) e 108
(F1,4=0,51;P=0,5126; F1,4=0,08;P=0,7912) propágulos/mL, respectivamente. Os isolados
de B. bassiana, demonstraram diferença de virulência entre propágulos. Conídios de IP
361 promoveram maior mortalidade de larvas do que blastosporos desde a menor até a
maior concentração (F1,4=1786,0;P<0,0001; F1,4=899,87;P<0,0001;
F1,4=1249,3;P<0,0001). Blastosporos de CG 307 obtiveram melhor desempenho do que
conídios nas concentrações de 107 (F1,4=17,80;P=0,0134) e 108 (F1,4=47,66;P=0,0023)
propágulos/mL.
41
Figura 4. Mortalidade acumulada, no décimo dia pós-tratamento, de larvas não alimentadas de Rhipicephalus microplus tratadas com suspensões
de conídios ou blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP 361 e
CG 307), nas concentrações de 106, 107 e 108 propágulos/mL. Barras de diferentes propágulos do mesmo isolado seguidas por asterisco (*) diferem
entre si, dentro de uma mesma concentração.
42
Nos bioensaios com fêmeas ingurgitadas de R. microplus, o índice nutricional (IN)
(H=21,1250; P=0,0068) e o índice de produção de ovos (IPO) (H=17,7857; p=0,0229)
das fêmeas tratadas com blastosporos de IP 146 e de IP 361, foram os únicos tratamentos
que promoveram índices menores do que aqueles obtidos pelas fêmeas do grupo controle
(Tabela 3). Não houve diferença entre o período de pré-postura das fêmeas do grupo
controle e aquelas tratadas com suspensões fúngicas (F8,18 = 0,61689; P=0,7528). Todos
os tratamentos promoveram menor período de postura do que aqueles observados nas
fêmeas do grupo controle (F8,18=15,6; P=0,00). Blastosporos dos isolados IP 146 (Figura
3 A e B) e IP 361 (Figura 3 C e D) apresentaram percentual de controle de fêmeas 97,95%
e 92,92%, enquanto que conídios dos mesmos isolados apresentaram 70,97% e 63,29%,
respectivamente.
43
Tabela 2. Parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão em suspensão aquosa (107
propágulos/mL) de conídios ou blastosporos de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP
361 e CG 307). Médias seguidas de mesma letra não diferem quanto ao efeito do tratamento sobre o parâmetro biológico (F>6,305; H>17,7857;
p<0,05).
Tratamentos Período de pré-postura Período de postura IN* IPO* RE** Percentual de controle**
Controle 3,2ns 16,7a 71,83ac 52,04a 495975,81 -
IP 146 conídios 3ns 10,5bde 68,67ac 43,35ab 143975,7 70,97 (± 13,5)
IP 146 blastosporos 3,2ns 5,3c 48,05b 19,83b 10167,51 97,95 (± 2,0)
IP 363 conídios 3,2ns 12bd 80,12a 47,65a 202507,4 59,17 (± 16,4)
IP 363 blastosporos 3ns 8,7be 60,63ab 38,06ab 105398,0 78,75 (± 12,5)
IP 361 conídios 3ns 13,3d 59,32ab 44,79ac 182061,3 63,29 (± 5,1)
IP 361 blastosporos 3,2ns 7,7ce 42,3b 25,38bc 35086,9 92,92 (± 10,3)
CG 307 conídios 3,2ns 12bd 58,89ab 43,84ac 56873,5 88,53 (± 5,3)
CG 307 blastosporos 2,7ns 10,3bde 56,48cb 38,96ab 167219,5 66,29 (± 11,0)
*IN: Índice Nutricional= peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) – peso da quenógina (g) × 100 (Bennet, 1974); IPO: Índice de Produção de ovos= peso da massa de
ovos (g) / peso inicial da fêmea ingurgitada (g) × 100 (Bennet, 1974); **RE: Reprodução Estimada = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) × percentual de eclosão
larvas × 20.000 (Drummond, 1971); **Percentual de eclosão = RE média do grupo controle – RE média do grupo tratado / RE média do grupo controle × 100 (Drummond,
1971).
44
Figura 5. Exteriorização e conidiogênese de Metarhizium robertsii (IP 146) (A: vista
ventral e B: vista dorsal) e Beauveria bassiana (IP 361) (C: vista dorsal e D: vista
ventral) sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão
com suspensão de blastosporos (107 propágulos/mL). Após término da postura as
fêmeas foram incubadas a 27 ± 1°C, UR ≥ 80% até a completa exteriorização do fungo.
Quando foi avaliado o modo e o tempo de infecção de conídios e blastosporos
do isolado de M. robertsii (IP 146), por meio da microscopia eletrônica de varredura,
foi evidenciado maior velocidade de crescimento dos blastosporos com 4 horas de
45
incubação (Figura 4a), em relação a germinação e formação de apressórios de conídios
com 48 (Figura 4d) e 72 (Figura 4f) horas de incubação, respectivamente.
Figura 6. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus
tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Metarhizium
robertsii (IP 146) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas
após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:
blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório.
Apesar da velocidade de crescimento acelerado dos blastosporos em relação
aos conídios, não foi possível visualizar estruturas sugestivas de penetração dos
blastosporos através da cutícula, mesmo após 96 horas de incubação. No entanto,
46
algumas imagens sugerem que a penetração fúngica ocorra via aberturas naturais das
fêmeas, como abertura anal (Figura 5).
Figura 7. Eletromicrografia evidenciando o poro anal de fêmeas ingurgitadas de
Rhipicephalus microplus tratadas com suspensão de blastosporos de isolados de (A)
Metarhizium robertsii (IP 146), ou (B) Beauveria bassiana s.l. (IP 361), após os
tempos de incubação de 48 e 4 horas, respectivamente, a 27 ± 1°C com umidade
relativa superior a 80%.
O isolado IP 361 (B. bassiana), comportou-se de maneira semelhante ao IP
146, exceto por blastosporos apresentarem evidências de penetração através da
cutícula dos carrapatos 4 horas após incubação das fêmeas tratadas (Figura 6a),
enquanto que conídios iniciaram seu desenvolvimento com 48 horas de incubação
(Figura 6d). Após 48 horas de incubação foi visualizado a formação de novos
propágulos na cutícula das fêmeas, partir de hifas formadas após tratamento (Figura
6c).
47
Figura 8. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus
tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Beauveria
bassiana (IP 361) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas
após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:
blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório.
4. Discussão
O presente estudo reporta resultados promissores para blastosporos de isolados
de Metarhizium sp. e Beauveria bassiana, indicando que este pode ser um propágulo
fúngico a ser explorado no controle de carrapatos, embora a maioria dos trabalhos
48
indiquem conídios como principal propágulo para o uso em programas de biocontrole
(BITTENCOURT et al., 2003; ALONSO-DÍAZ et al., 2006; BARCI et al., 2009;
ÁNGEL-SAHAGÚN et al., 2010).
Alguns estudos apontam que a composição nutricional do meio de produção
pode ter efeito marcante na viabilidade, virulência e produção de propágulos (LANE;
TRINCI, 1991; KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1994; JACKSON et al., 1997;
ISSALY et al., 2005; MASCARIN; JACKSON, M. A.; et al., 2015). A partir disso, os
isolados utilizados nos testes do presente estudo, foram submetidos às mesmas
condições de manipulação. Os propágulos foram produzidos em mesmo meio de
cultura com ou sem ágar, para produzir conídios ou blastosporos respectivamente, para
que estes tivessem acesso aos mesmos tipos de nutrientes e em quantidades iguais.
Nos testes com larvas de R. microplus não foi observada diferença significativa
quanto a mortalidade das larvas tratadas com conídios ou blastosporos de Metarhizium
sp.; no entanto, isolados de B. bassiana demonstraram diferença entre os propágulos.
O tratamento com conídios de IP 361 (B. bassiana) foi o que promoveu maior
mortalidade de larvas já na menor concentração. Esses resultados estão de acordo com
os resultados de Lane e Trinei (1991), que avaliaram conídios e blastosporos de B.
bassiana para o controle de cigarrinha (Nephotettix virescens) e encontraram menores
CL50 nos tratamentos com conídios. Apesar disso, blastosporos do outro isolado de B.
bassiana avaliado, CG 307, demonstrou melhor desempenho do que conídios,
indicando que a diferença de virulência não está ligada somente às características de
cada propágulo, mas também ao fator genético e especificidade de cada isolado.
Contraditoriamente, nos testes realizados com fêmeas ingurgitadas de R.
microplus, em geral, blastosporos promoveram maior percentual de controle quando
comparado a conídios de um mesmo isolado. KIRKLAND et al. (2004) compararam
diferentes concentrações de suspensões de conídios e blastosporos de B. bassiana,
demonstrando um maior percentual de mortalidade no tratamento com conídios em
adultos de Amblyomma maculatum. Hartelt et al. (2008) testaram suspensões conidiais
e de blastosporos de M. anisopliae, e reportaram menor tempo letal (TL50) para larvas
e ninfas de Ixodes ricinus, quando essas foram tratadas com blastosporos.
Diferentes resultados de um mesmo isolado obtidos para os estágios de larva
e adultos do carrapato, possivelmente foram obtidos pelas características de infecção
49
de cada propágulo, as quais foram evidenciadas neste trabalho, durante a análise por
microscopia eletrônica de varredura.
Tradicionalmente, a infecção de fungos entomopatogênicos, como os dos
gêneros Metarhizium e Beauveria, ocorre por penetração através da cutícula do
artrópode alvo (KIRKLAND; CHO; et al., 2004). Porém, não foi evidenciado
apressório, em blastosporos de M. robertsii (IP 146), na cutícula de fêmeas
ingurgitadas de R. microplus, apesar de que, nos ensaios de virulência, foi observada
morte das fêmeas e consequente exteriorização do fungo. O atual trabalho sugere que
a penetração desses propágulos, em carrapatos, ocorra especialmente por penetração
em aberturas naturais, característica que dificultaria a infecção de larvas de carrapato
pelo fungo, já que estas apresentam menor número e tamanho de aberturas em relação
aos adultos (ESTRADA-PEÑA et al., 2012).
No entanto, blastosporos de B. bassiana (IP 361) formaram apressório e
apresentaram um crescimento acelerado em relação a conídios, demonstrando dupla
possibilidade de penetração, através da cutícula e por aberturas naturais de carrapatos.
Apesar dessa vantagem em relação aos conídios, é sabido que muitos aspectos
biológicos estão envolvidos e podem influenciar na virulência de fungos
entomopatogênicos. É sabido que a cutícula de carrapatos apresentam componentes
tóxicos aos conídios e tubos germinativos, os quais o fungo entra em contato durante
o processo de infecção (MENT et al., 2013). A partir disso, a penetração por aberturas
naturais pode impedir a exposição do fungo a esses componentes fungicidas.
Assim como no presente estudo, Vega et al. (1999) concluíram que o
crescimento de blastosporos, em relação a conídios foi mais rápido, quando avaliaram
Isaria fumosorosea (=Paecylomyces fumosoroseus) em cutícula de mosca branca. Os
autores citam ainda que blastosporos não necessitam de nutrientes externos para iniciar
a germinação, sendo esse um dos fatores que tornam esses propágulos mais ágeis para
iniciar o processo de infecção. Outro fator importante no processo de infecção por
blastosporos é a extensa colonização externa da cutícula do carrapato (Figuras 4e e
6e), podendo portanto, por pressão mecânica, favorecer a penetração das hifas, além
de dificultar as trocas gasosas pelo artrópode, a partir do tamponamento dos
espiráculos.
50
Foi observado também no presente estudo que ocorre a formação de novos
propágulos na cutícula de fêmeas tratadas com blastosporos, já que estes são pedaços
de hifas, produzidos por brotamento. Neste contexto, em comparação a conídios, o
tratamento com blastosporos pode potencializar o processo de infecção e
consequentemente a virulência do fungo.
Portanto, os resultados obtidos apontam evidências de que blastosporos são
promissores para o controle de carrapatos, e descrevem uma possível e importante
forma de infecção por fungos entomopatogênicos, uma vez que até então, a penetração
através da cutícula era a principal forma de penetração descrita para os gêneros
Metarhizium e Beauveria (BITTENCOURT et al., 1999; KIRKLAND; CHO; et al.,
2004; ARRUDA et al., 2005).
REFERÊNCIAS
ALONSO-DÍAZ, M. A. et al. Evaluation of Metarhizium anisopliae (Hyphomycetes)
for the control of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on naturally infested cattle in
the Mexican tropics. Veterinary Parasitology, v. 147, p. 336–340, 2007.
ANGELO, I. C. et al. Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick
Rhipicephalus microplus. Veterinary Parasitology, v. 172, p. 317–322, 2010.
ANGEL-SAHAGÚN, C. A. et al. Virulence of Mexican isolates of entomopathogenic
fungi (Hypocreales: Clavicipitaceae) upon Rhipicephalus (=Boophilus microplus)
(Acari: Ixodidae) larvae and the efficacy of conidia formulations to reduce larval tick
density under field conditions. Veterinary parasitology, v. 170, p. 278–86, 2010.
ARRUDA, W. et al. Morphological alterations of Metarhizium anisopliae during
penetration of Boophilus microplus ticks. Experimental & applied acarology, v. 37,
p. 231–44, 2005.
BAHIENSE, T. C.; FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P.
Compatibility of the fungus Metarhizium anisopliae and deltamethrin to control a
resistant strain of Boophilus microplus tick. Veterinary Parasitology, v. 141, p. 319–
324, 2006.
BARCI, L. A. G. et al. Seleção de isolados do fungo entomopatogênico Beauveria
bassiana (Ascomycetes: Clavicipitaceae) para o controle de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia
Veterinária, v. 18, n. 1, p. 7–13, 2009.
51
BENNET, G. F. Oviposition of Boophilus Microplus (Canestrini) (Acarida: Ixodidae)
I. Influence of tick size on the egg production. Acarologia, v. 16, p. 52–61, 1974.
BITTENCOURT, V. R. E. P.; MASCARENHAS, A. G.; FACCINI, J. L. H.
Mecanismo de infecçao do fungo Metarhizium anisopliae no carrapato Boophilus
microplus em condições experimentais. Ciência Rural, v. 29, n. 2, p. 351–354, 1999.
BITTENCOURT, V. R. E. P. et al. Avaliaçao dos efeitos do contato de Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill. com ovos e larvas de Boophilus microplus (Canestrini, 1887)
(Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 5, n. 2, p. 81–
84, 1996.
CAMARGO, M. G. et al. Effect of oil-based formulations of acaripathogenic fungi to
control Rhipicephalus microplus ticks under laboratory conditions. Veterinary
parasitology, v. 188, n. 1-2, p. 140–7, 2012.
DRUMMOND, R. O. et al. Laboratory testing of inseticides for control of the winter
tick. Journal of Economic Entomology, v. 64, p. 686–688, 1971.
ESTRADA-PEÑA, A. et al. Reinstatement of Rhipicephalus (Boophilus) australis
(Acari : Ixodidae) With Redescription of the Adult and Larval Stages. Entomological
Society of America, v. 49, n. 4, p. 794–802, 2012.
FANG, W. et al. A laccase exclusively expressed by Metarhizium anisopliae during
isotropic growth is involved in pigmentation, tolerance to abiotic stresses and
virulence. Fungal genetics and biology, v. 47, n. 7, p. 602–7, 2010.
FARIA, M. R. D.; WRAIGHT, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A
comprehensive list with worldwide coverage and international classification of
formulation types. Biological Control, v. 43, p. 237–256, 2007.
FERNANDES, E. K. K. et al. Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and
thermotolerance of Beauveria. Journal of invertebrate pathology, v. 98, n. 1, p. 69–
78, 2008.
FINNEY, D. S. Probit analysis. Cambrige: University Press, 1971.
FURLONG, J.; MARTINS, J. R. S.; PRATA, M. C. D. E. A. Carrapato: problemas
e soluções. 1st ed. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 2005.
GRILLO TORRADO, J. M. G.; GUTIERREZ, R. O. Método para medir la actividad
de los acaricidas sobre larvas de garrapata evolucion de sensibilidad. Revista de
Investigaciones Agropecuarias, v. 6, p. 135–158, 1969.
52
GRISI, L. et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in
Brazil. Brazilian Journal Veterinary Parasitology, v. 23, n. 2, p. 150–156, 2014.
HARTELT, K. et al. Biological control of the tick Ixodes ricinus with
entomopathogenic fungi and nematodes: Preliminary results from laboratory
experiments. International Journal of Medical Microbiology, v. 298, n. 1, p. 314–
320, 2008.
ISSALY, N. et al. Influence of nutrient, pH and dissolved oxygen on the production
of Metarhizium flavoviride Mf189 blastospores in submerged batch culture. Process
Biochemistry, v. 40, p. 1425–1431, 2005.
JACKSON, M. A; JARONSKI, S. T. Production of microsclerotia of the fungal
entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol
agent for soil-inhabiting insects. Mycological research, v. 113, p. 842–50, 2009.
JACKSON, M. A.; MCGUIRE, M. R.; LACEY, L. A.; WRAIGHT, S. P. Liquid
culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus
Paecilomyces fumosoroseus. Mycological Research, v. 101, n. 1, p. 35–41, 1997.
KIM, J. S. et al. An oil-based formulation of Isaria fumosorosea blastospores for
management of greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum (Homoptera:
Aleyrodidae). Pest Management and Science, v. 69, p. 576–581, 2013.
KIRKLAND, B. H.; CHO, E.; KEYHANI, N. O. Differential susceptibility of
Amblyomma maculatum and Amblyomma americanum (Acari : Ixodidea) to the
entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Biological
Control, v. 31, p. 414–421, 2004.
KIRKLAND, B. H.; WESTWOOD, G. S.; KEYHANI, N. O. Pathogenicity of
Entomopathogenic Fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae to Ixodidae
Tick Species Dermacentor variabilis , Rhipicephalus sanguineus , and Ixodes
scapularis. Bioone Research evolved, v. 41, n. 4, p. 705–711, 2004.
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Production of blastospores by three strains
of Metarhizium anisopliae (Metch.) sorokin in submerged culture. Biocontrol Science
and Technology, v. 2, n. 2, p. 127–135, 1992.
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Viability and virulence of blastospores of
Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin after storage in various liquids at different
temperatures. Biocontrol Science and Technology, v. 4, n. 3, p. 309–319, 1994.
53
LANE, B.; TRINCI, A. P. J. Influence of cultural conditions on the virulence of
conidia and blastospores of Beauveria bassiana to the green leafhopper, Nephotettix
virescens. Mycological Research (An International Journal of Fungal Biology), v.
95, n. 7, p. 829–833, 1991.
MASCARIN, G. M. et al. Liquid culture fermentation for rapid production of
desiccation tolerant blastospores of Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea
strains. Journal of invertebrate pathology, v. 127, p. 11–20, 2015.
MASSARD, C. L.; FONSECA, A. H. Carrapatos e doenças transmitidas comuns ao
homem e aos animais. A Hora Veterinária, v. 135, n. 1, p. 15–23, 2004.
MENT, D. et al. Role of cuticular lipids and water-soluble compounds in tick
susceptibility to Metarhizium infection. Biocontrol Science and Technology, v. 23,
n. 8, p. 956–967, 2013.
OTTATI-DE-LIMA, E. L. et al. Liquid production of entomopathogenic fungi and
ultraviolet radiation and temperature effects on produced propagules. Arquivos do
Instituto Biológico, v. 81, n. 4, p. 342–350, 2014.
SOUSA, L. A. D. et al. Potential synergistic effect of Melia azedarach fruit extract
and Beauveria bassiana in the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari :
Ixodidae) in cattle infestations. Veterinary Parasitology, v. 175, p. 320–324, 2011.
SOUZA HIGA, L. D. O. Acaricide Resistance Status of the Rhipicephalus microplus
in Brazil: A Literature Overview. Medicinal Chemistry, v. 5, n. 7, p. 326–333, 2015.
VEGA, F. E.; JACKSON, M. A; MCGUIRE, M. R. Germination of conidia and
blastospores of Paecilomyces fumosoroseus on the cuticle of the silverleaf whitefly,
Bemisia argentifolii. Mycopathologia, v. 147, p. 33–35, 1999.
WEBSTER, A. et al. Integrated control of an acaricide-resistant strain of the cattle tick
Rhipicephalus microplus by applying Metarhizium anisopliae associated with
cypermethrin and chlorpyriphos under field conditions. Veterinary parasitology, v.
207, n. 3-4, p. 302–8, 2015.
54
ARTIGO 2
Tolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e
Beauveria bassiana ao calor e à radiação UV-B
Bernardo, C.C.1, Pereira Júnior, R.A.1, Luz, C., Rangel, D. E. N.1,
Fernandes, E.K.K1*
1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás
(UFG), Goiânia, Goiás 74690-900, Brasil.
* Correpondências devem ser enviadas para Universidade Federal de Goiás, Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Esperança s/n, Campus Samambaia,
Goiânia, GO, Brasil, 74690-900.
Telefone: +55 (62) 3209-6118; e-mail: [email protected]
55
Resumo
O presente estudo avaliou comparativamente a tolerância ao calor e à radiação
ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos dos isolados IP 146 (Metarhizium
robertsii), IP 363 (Metarhizium anisopliae s.l.), IP 361 (Beauveria bassiana s.l.), CG
307 (B. bassiana s.l.) e ARSEF 324 (Metarhizium acridum). Para os testes de
termotolerância, suspensões conidiais ou de blastosporos (103 propágulos/mL) foram
acondicionadas em tubos de vidro com rosca e expostas a 45°C em banho-maria.
Conídios foram expostos por 0 (controle), 60, 120, 240 ou 360 minutos, enquanto
blastosporos foram tratados por 0 (controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120 e 150 minutos.
Após os tratamentos, 50 μL das suspensões foram inoculados e espalhados sobre a
superfície do meio batata dextrose ágar suplementado com extrato de levedura
(BDAL), em placas de Petri, e estas foram incubadas por sete dias a 27 ± 1°C com
umidade relativa superior a 80%. Após o período de incubação, foram contadas as
unidades formadoras de colônia (UFC) e calculado o percentual relativo de UFC dos
tratamentos em relação ao controle. Conídios de ARSEF 324 (79,1%) demonstraram
ser mais tolerantes ao calor do que conídios de IP 363 (55,5%), IP 146 (1,5%), CG 307
(0%) e IP 361 (0%), com apenas 2 h de exposição; assim como blastosporos no tempo
de 60 minutos, demonstrando percentual relativo médio de 100%, 12,3%, 30,7%, 55%
e 0%, respectivamente. Quando foi comparada a tolerância entre os propágulos nos
tempos de 60 e 120 minutos de exposição ao calor, conídios de IP 363 foram mais
tolerantes do que blastosporos em ambos tempos; enquanto blastosporos de CG 307
foram mais tolerantes do que conídios. A partir disso, propágulos do isolado ARSEF
324, foram expostos ao calor por 0 (controle), 1, 2, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 e 64
h. Até o tempo de 4 h, ARSEF 324 não demonstrou diferença na tolerância entre os
propágulos avaliados; após esse período, conídios foram mais tolerantes do que
blastosporos até o tempo de 48 h, e em seguida tornaram-se semelhantes quanto a
tolerância até 64 h de exposição. Para os ensaios de tolerância à radiação UV-B,
suspensões de conídios ou blastosporos (103 propágulos/mL) foram espalhadas em
placas de Petri contendo meio BDAL e expostas às doses de 0 (controle), 1,33, 2,67,
4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, a irradiância de Quaite de 743,75 mW m-2. Depois de
irradiadas, as placas foram incubadas e avaliadas assim como descrito no teste anterior.
Não houve diferença entre a tolerância de conídios e blastosporos, de um mesmo
isolado, expostos às diferentes doses de radiação avaliadas. Blastosporos de IP 146, IP
363, IP 361, CG 307 e ARSEF 324 não diferiram entre si quanto à tolerância à radiação
UV-B; ARSEF 324 foi o mais tolerante quando conídio foi o propágulo avaliado, não
demonstrando diferença no percentual de UFC nas doses avaliadas. Os resultados
demonstraram que há uma grande variação entre propágulos de um mesmo isolado
quanto a tolerância ao calor; no entanto, pequena variação foi observada quanto a
tolerância à radiação UV-B. Esses resultados mostram que blastosporos não são
necessariamente mais sensíveis a fatores abióticos do que conídios de um mesmo
isolado de fungo entomopatogênico, principalmente a UV-B. Além disso, formulações
adequadas que visem a proteção dos propágulos fúngicos contra fatores abióticos
estressantes são necessárias tanto para conídios quanto para blastosporos; deste modo,
considerando a tolerância ao calor ou à radiação UV-B, blastosporos são potencial
candidatos a ingrediente ativo de bioprodutos para controle de artrópodes.
Palavras-chave: Termotolerância; radiação ultravioleta; fungos entomopatogênicos;
propágulos fúngicos; controle microbiano.
56
1 Introdução
Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são os fungos
entomopatogênicos mais estudados no controle biológico de artrópodes
(FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). Segundo Rangel et al. (2004) o sucesso do
biocontrole está associado à manutenção da viabilidade dos propágulos fúngicos após
a aplicação no ambiente. Fatores abióticos como a radiação solar ultravioleta,
especialmente UV-B, e o calor reduzem significativamente a viabilidade de conídios
quando aplicados a campo, o que faz com que se tornem obstáculos importantes a
serem transpostos pelos fungos (RANGEL et al., 2008; FERNANDES et al., 2015).
Para a seleção de fungos entompatogênicos promissores para o biocontrole, a
tolerância a fatores estressantes é tão importante quanto à virulência desses fungos ao
artrópode alvo (XIE et al., 2012).
Conídios aéreos são os principais propágulos fúngicos utilizados em
bioprodutos comerciais, e apenas cerca de 4% dos produtos disponíveis possuem
blastosporos como ingrediente ativo (FARIA; WRAIGHT, 2007). Blastosporos são
estruturas fúngicas formadas por fungos entomopatogênicos durante o processo de
infecção no artrópode, naturalmente encontrados em sua hemocele (FANG et al.,
2010). Blastosporos são reportados como sendo promissores para o uso em programas
de controle biológico (MIRANPURI; KHACHATOURIANS, 1990; KLEESPIES;
ZIMMERMANN, 1994; VEGA et al., 1999; HARTELT et al., 2008), mas apesar
disso, pouco se sabe sobre a tolerância dessas estruturas a fatores abióticos.
Algumas vantagens da utilização de blastosporos em relação a conídios têm
sido relatadas devido ao menor custo e tempo de produção, além do rápido
desenvolvimento sobre o hospedeiro (VEGA et al., 1999; KIM et al., 2013). No
entanto, Kim et al., (2013) relataram desvantagens destes propágulos em relação aos
conídios, como a menor estabilidade ao armazenamento e a menor tolerância ao calor,
atribuindo a isso a membrana mais fraca de blastosporos do que a presente em
conídios. Estas desvantagens podem ser minimizadas acrescentando ou retirando
algum tipo de suplemento do meio de cultura utilizado na produção, ou ainda
utilizando formulações protetoras (JACKSON et al., 1997, 2003; KIM et al., 2013;
MASCARIN; JACKSON, M. A.; et al., 2015). Além disso, o rápido desenvolvimento
57
de blastosporos sobre a cutícula de artrópodes promove um menor tempo de exposição
desses propágulos a fatores estressantes, como calor e UV-B (VEGA et al., 1999).
A partir disso, o presente estudo visou avaliar comparativamente a tolerância
ao calor e a UV-B de conídios e blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP
146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium acridum (ARSEF 324) e
Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307).
2 Material e Métodos
2.1 Origem e cultivo dos isolados
A partir de ensaios de triagem da patogenicidade de isolados de fungos
entomopatogênicos para larvas de Rhipicephalus microplus (BERNARDO;
FERNANDES, dados não publicados), foram selecionados dois isolados de
Metarhizium e dois isolados de Beauveria bassiana sensu lato, com notável virulência,
para avaliação de sua tolerância a fatores abióticos estressantes (Tabela 1). O isolado
australiano de Metarhizium acridum, ARSEF 324, armazenado na ARS Collection of
Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF), nos Estados Unidos, foi inserido nos
testes por ser um isolado sabidamente tolerante ao calor e à radiação UV-B (BRAGA
et al., 2001; RANGEL et al., 2005b).
Tabela 3. Identificação dos isolados fúngicos utilizados nos testes de tolerância ao
calor (45ºC) e à radiação ultravioleta UV-B.
Código Origem Substrato/Hospedeiro Espécie
IP 146 GO, Brasil Solo Metarhizium robertsii s.l.
IP 361 GO, Brasil Amblyomma cajennense
[Ixodidae][Ordem: Ixodida]
Beauveria bassiana s.l.
IP 363 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.
CG 307 GO, Brasil Solo B. bassiana s.l.
ARSEF 324 Queensland,
Austrália
Austracris guttulosa
[Orthoptera: Acrididae]
M. acridum
IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Goiânia, GO, Brasil; CG: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil; ARSEF: Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal
Cultures, Ithaca, NY, Estados Unidos.
58
Para a produção de conídios e blastosporos, foi utilizado meio Adamék
modificado (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) com ou sem ágar
respectivamente. Para obtenção do caldo de amido utilizado no meio de cultura, foram
misturados 5 g de maisena (Maizena®, Unilever, São Paulo, Brasil) à 250 mL de água
destilada; além de 3,15% de caldo de milho os meios de cultura apresentavam 4,21%
de glicose (Labsynth®, Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) e de
extrato de levedura (Difco Laboratories®, Interlab, São Paulo, Brasil), e ainda 2,1% de
Tween 80 (Labsynth®, Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) 0,1%.
Para o cultivo dos blastosporos foram utilizados 150 mL do meio Adamék
líquido para cada frasco tipo Erlenmeyer (Pirex®, USA), sendo estes tampados com
algodão hidrófobo e colocados em agitador orbital a 150 rpm por 4 dias, em
temperatura ambiente (aproximadamente 27°C). Após o crescimento do fungo, o meio
foi filtrado em funil com gaze para remoção do micélio produzido durante o cultivo; o
meio contendo blastosporos foi colocado em tubos de centrifuga de 15 mL (Gene®,
Ionlab Equip. Sup. Laborat. Hosp. Ltda.), e centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos.
Após primeira centrifugação o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido
em Tween 80® 0,01% e centrifugado novamente para retirada de resquícios do meio
de cultura. Descartou-se novamente o sobrenadante e o ressuspendeu em Tween 80®
a 0,01%.
A produção de conídios ocorreu em placas de Petri (90x10mm) contendo meio
Adamék (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) acrescido de 2% de ágar (Himedia®,
HiMedia Lab. Pvt. Ltd.). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1°C com
umidade relativa ≥80%. Os conídios foram retirados da placa com auxílio de espátula
e colocados em tubos tipo Falcon (15 mL) contendo 10 mL de Tween 80® 0,01% e
pérolas de vidro (4 mm de diâmetro). Os tubos contendo as suspensões conidiais foram
agitados em vortéx até a completa homogeneização, e posteriormente filtrados em
funil com gaze.
A quantificação das suspensões, de conídios ou blastosporos foi feita com o
auxílio da Câmara de Neubauer.
59
2.2 Termotolerância
Alíquotas de 2 mL de suspensões de conídios ou blastosporos (103
propágulos/mL) foram transferidas para tubos de ensaio de vidro com rosca (16 × 125
mm) e imediatamente aquecidos em banho-maria a 45 ± 0,2 ºC.
Os tubos contendo 2 mL das suspensões de blastosporos foram submetidos aos
tempos de exposição de 0 (controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos.
As suspensões conidiais foram expostas ao calor por 0 (controle), 60, 120, 240 e 360
minutos.
Após cada tempo de exposição ao calor, uma alíquota de 50 µL
(aproximadamente 50 propágulos) foi inoculada em placas de Petri (90 x 15 mm)
contendo meio Batata Dextrose Ágar (Difco® Laboratories, distribuído por Interlab,
São Paulo, Brasil) acrescido de 1g/L-1 de extrato de levedura (BDAL), e 0,05%
cloranfenicol (p/v) para evitar contaminação por bactérias. O inóculo foi espalhado
pela superfície do meio com auxílio de Alça de Drigalski. As placas foram incubadas
a 27 ± 1ºC, em ausência de luz, por sete dias. Após esse período foram contadas as
colônias em cada placa e calculado, para cada tempo de exposição, o percentual
relativo (PR) de unidades formadoras de colônia (UFC):
𝑃𝑅 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑥 100
𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒
Conídios e blastosporos do isolado de melhor desempenho nos teste anterior,
foi submetido ainda à exposição prolongada ao calor (45 ± 0,2°C) pelos tempos de 0,
1, 2, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 e 64 horas, seguindo metodologia semelhante ao
ensaio anterior. Ambos os ensaios foram repetidos três vezes, em dias diferentes, e
com diferentes lotes de propágulos para cada experimento.
2.3 Tolerância à radiação ultravioleta UV-B
Suspensões de conídios ou blastosporos (103 propágulo/mL) foram inoculadas
(50 µL) em placas de Petri (90 × 15 mm) contendo meio BDAL, e espalhadas por toda
60
a superfície do meio com auxílio da Alça de Drigalski. As placas foram imediatamente
expostas a 743,75 mW m-2 de radiação UV-B de acordo com Quaite et al. (1992). As
amostras foram expostas à radiação UV-B em uma câmara de madeira contendo quatro
lâmpadas ultravioleta (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation, Cleveland, USA) com pico
de UV-B em 313 nm e mínima eliminação de radiação UV-A (Figura 1). As lâmpadas
foram ligadas previamente à exposição por 20 minutos para estabilização da emissão
de radiação.
Figura 9. Espectro da irradiação baseado na fórmula de Quaite (Quaite et al. 1992)
emitido por quatro lâmpadas fluorescentes (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation,
Cleveland, USA) em câmara de madeira confeccionada para exposição de
microrganismos à radiação ultravioleta. O valor da irradiância de Quaite (743,75
mWm-2) foi obtida com auxílio do espectrorradiômetro USB2000+RAD (Dunedin,
FL) coberto por diacetato de celulose para o completo bloqueio de comprimentos de
onda inferiores a 290 nm.
A temperatura na câmara foi mantida em 26 ± 1ºC por climatização da sala, e
a temperatura e umidade relativa foram registradas por um equipamento data logger
HOBO H8® (Onset Computer Corporation, Bourne, MA, USA) durante todo o
experimento. As placas de Petri contendo as amostras foram cobertas com um filme
de diacetato de celulose (JCS Industries, Le Mirada, CA, USA) com 0,13 mm de
espessura para bloquear radiação ultravioleta com comprimento de onda inferior a 290
nm (UV-C e pequenos comprimentos de onda de UV-B), que em condições naturais é
61
bloqueada pela atmosfera e não atinge a superfície terrestre. No entanto, este filtro
permite a passagem de UV-B (290–320 nm) em maior parte, e UV-A (320–400 nm).
Placas do grupo controle foram cobertas com papel alumínio para bloquear toda
radiação UV e mantidas dentro da câmara durante a exposição. O espectro da
irradiação foi mensurado com utilização de espectrorradiômetro USB 2000+RAD
(Dunedin, Flórida, Estados Unidos), e a dose determinada em kJm-2 em função do
espectro e do tempo de exposição (BRAGA et al., 2001).
Placas contendo suspensões de conídios ou blastosporos foram expostas a
doses de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, correspondendo aos
tempos de 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Após a exposição, as placas foram
incubadas a 27 ± 1ºC, em ausência de luz, por sete dias. Em seguida foram contadas
as colônias em cada placa e calculado o percentual relativo de UFC, como descrito no
item 2.2. Os experimentos foram conduzidos por três vezes, em dias diferentes e com
lotes de propágulos diferentes para cada experimento.
2.4 Análise estatística
Diferenças entre os percentuais relativos médios de UFC foram determinados
através de análise de variância fatorial (ANOVA fatorial), seguidos do teste Student-
Newman-Keuls (SNK). Comparação de termotolerância de conídios e blastosporos
nos tempos de 60 e 120 minutos de exposição foi realizada por ANOVA uma via. Para
todas as análises utilizou-se nível de significância de 5% (P ≤ 0,05).
3 Resultados
Grande variação de termotolerância foi observada entre os isolados
investigados. No tempo de 60 minutos de exposição de conídios a 45°C, foi observado
que IP 363 (M. anisopliae s.l.) foi tão tolerante quanto ARSEF 324 (M. acridum). Aos
120 minutos de exposição, no entanto, as médias do percentual relativo de UFC (PR)
de conídios dos isolados ARSEF 324 (79,1%) e IP 363 (55,5%) diferiram entre si e
dos demais isolados; já conídios de CG 307 (7,58%), IP 146 (1,5%) e IP 361 (0%)
62
apresentaram baixa tolerância ao calor com percentual médio próximo ou igual a zero
(F16,50 = 9,322; P < 0,001) (Figura 2).
Blastosporos dos isolados de Metarhizium spp., IP 363 (92%), ARSEF 324
(90,8%) e do isolado de B. bassiana, CG 307 (89,6%), apresentaram percentuais
relativos de UFC estatisticamente iguais até 30 minutos de exposição ao calor, sendo
os dois últimos (ARSEF 324 e CG 307) semelhantes até o tempo de 45 minutos, com
percentual médio de 85,8% e 84%, respectivamente. Blastosporos de IP 361 (B.
bassiana) foram menos tolerantes ao calor, diferindo dos demais isolados já no tempo
de 15 minutos de exposição (F36,98 = 20,379; P < 0,001) (Figura 2).
63
Figura 10. Termotolerância de propágulos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), M.
robertsii (IP 146), M. acridum (ARSEF 324) e Beauveira bassiana (IP 361 e CG 307)
aquecidos a 45 ± 0,2°C em banho-maria. Conídios foram expostos ao calor por 0
(controle), 60, 120, 240 e 360 minutos, enquanto blastosporos nos tempos de 0
(controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos. Desvio padrão calculado
sobre 3 repetições independentes.
Comparações do percentual relativo médio de UFC entre os propágulos de cada
isolado foram feitas nos tempos de 60 e 120 minutos de exposição ao calor. Conídios
de M. anisopliae s.l. (IP 363) foram mais tolerantes após 60 minutos de exposição do
64
que blastosporos do mesmo isolado (F1,4=11,707; P = 0,026), enquanto que
blastosporos de CG 307 mostraram-se mais tolerantes do que conídios (F1,4 = 14,18; P
= 0,019) (Figura 3). Os isolados IP 146 (F1,4 = 0,23; P = 0,655), ARSEF 324 (F1,4 = 1;
P = 0,373) e IP 361 (F1,4 = 3,73; P = 0,125) não demonstraram diferença na
termotolerância entre propágulos avaliados com 60 minutos de exposição. Após 120
minutos de tratamento, conídios de IP 363 (55,5%) continuaram apresentando maior
percentual de UFC do que blastosporos (0%) (F1,4 = 226,97; P < 0,001). Em
contrapartida, blastosporos (100%) de ARSEF 324 foram mais tolerantes do que
conídios (86,3%) após 120 minutos de exposição ao calor (F1,4 = 539,27; P < 0,001).
Os demais isolados IP 146 (F1,4 = 1; P = 0,373), IP 361 (ambos propágulos com
percentual igual a zero) e CG 307 (F1,4 = 3,98; P = 0,116), não demonstraram diferença
de tolerância ao calor entre propágulos no tempo de 120 minutos de exposição.
Figura 11. Termotolerância comparativa entre conídios e blastosporos de um mesmo
isolado em Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146),
Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307).
Médias seguidas por asterisco (*) ou duplo asterisco (**) diferem entre si (P < 0,05)
quando expostas a 45 ± 0,2°C, por 60 ou 120 minutos, respectivamente.
Não foi observada diferença estatística entre os propágulos de ARSEF 324 até
o tempo de 4 horas de tratamento (Figura 4). Após esse período, conídios de ARSEF
65
324 foram mais tolerantes ao calor do que blastosporos até o tempo de 40 horas de
exposição; no tempo de 48 horas e nos tempos subsequentes de exposição ao calor,
conídios e blastosporos igualaram-se novamente em tolerância (F12,26 = 7,323; P <
0,001), com conídios apresentando percentual relativo de UFC em torno de 20%. Com
16 horas de exposição ao calor, enquanto conídios apresentaram percentual relativo
médio de 57,3%, blastosporos já não apresentavam formação de colônias.
Figura 12. Termotolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium acridum
(ARSEF 324) expostos a 45 ± 0,2°C por 0 (controle), 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40,
48, 56 ou 64 horas. Médias seguidas por asterisco (*) indicam diferença do percentual
relativo médio de UFC entre os propágulos dentro de um mesmo tempo de exposição
(F12,26=7,323; P < 0,001).
Avaliando-se a diferença de tolerância entre propágulos de um mesmo isolado,
apenas conídios de ARSEF 324 na dose de 4,01 kJm-2 (F1,4 = 10,06; P = 0,033) e de
CG 307 nas doses de 1,33 (F1,4 = 10,88; P = 0,029), 2,76 (F1,4 = 18,12; P = 0,013), 4,01
(F1,4 = 21,33; P = 0,009) e 5,35 kJm-2 (F1,4 = 10,50; P = 0,031) apresentaram tolerância
superior a de blastosporos; para os demais isolados e doses não houve diferença de
tolerância entre os propágulos.
**
*
* **
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 4 6 8 16 24 32 40 48 56 64
Perc
entu
al re
lativo d
e U
FC
Tempo de exposição (horas)
Conídios Blastosporos
66
Conídios dos cinco isolados não diferiram entre si em tolerância até a dose de
4,01 kJm-2 (F20,60 = 1,78; P = 0,043); porém, quando expostos a doses maiores, o
isolado ARSEF 324 foi o único isolado que não demonstrou diferença de tolerância
entre as doses avaliadas. Houve queda na tolerância de conídios dos isolados avaliados,
com o aumentos das doses de radiação, exceto para o isolado ARSEF 324 (F5,12 = 0,69;
P = 0,635), demonstrado ser o isolado mais tolerante. Em relação aos blastosporos,
apenas o isolado CG 307 (F5,12 = 9,53; P < 0,001) demonstrou queda na tolerância a
UV-B entre a primeira dose (1,33 kJ m-2) e as demais (2,67 a 8,03 kJ m-2); ARSEF 324
(F5,12 = 1,15; P = 0,383), IP 146 (F5,12 = 1,21; P = 0,360), IP 363 (F5,12 = 1,50; P =
0,258) e IP 361 (F5,12 = 2,99; P = 0,055) não demonstraram diferença na tolerância a
UV-B entre as doses avaliadas.
67
Figura 13. Tolerância à radiação ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii
(IP 146), Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307), expostos às doses de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01,
5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, à 743,75 mW m-2 de irradiância de Quaite (QUAITE et al., 1992).
68
4. Discussão
Ambos os propágulos do isolado ARSEF 324 apresentaram maior
termotolerância quando comparado aos demais isolados avaliados; assim como os
ensaios de exposição à UV-B demonstraram que conídios desse isolado foram os mais
tolerantes. Estudos prévios com conídios desse isolado demonstraram tolerância
semelhante aos obtidos no presente trabalho tanto para calor quanto para UV
(RANGEL et al., 2005a, 2005b; FERNANDES et al., 2010), o que confirma a notável
tolerância desse isolado de M. acridum a fatores abióticos estressantes.
Micro-organismos os quais crescem em ambientes adversos tendem a
desenvolver mecanismos mais eficazes de proteção (RANGEL et al., 2008). A notável
tolerância de M. acridum ao calor em relação a outros fungos entomopatogênicos está
possivelmente relacionada ao local de isolamento deste fungo; essa espécie é isolada
em regiões quentes e áridas e apresenta certa especificidade por insetos da classe
Orthoptera, que apresentam comportamento de realizar exposição ao sol para elevar a
temperatura corpórea (BLANFORD; THOMAS, 2000). Apesar dos fungos
entomopatogênicos serem, em geral, mesofílicos, com temperatura de crescimento
variando entre 10 e 40 ºC e temperatura ótima entre 25 e 35 ºC (COONEY;
EMERSON, 1964), existe uma grande variabilidade entre as espécies e seus isolados
tanto na suscetibilidade ao calor (RANGEL et al., 2005b; FERNANDES et al., 2008)
quanto para à radiação ultravioleta (BIDOCHKA et al., 2001; RANGEL et al., 2005a;
FERNANDES et al., 2007), o que geralmente é atribuído à distribuição geográfica
destes isolados.
Apesar de vários trabalhos demonstrarem a tolerância de fungos
entomopatogêncios a fatores abióticos estressantes, pouco se sabe sobre o
comportamento de blastosporos frente ao calor e a outras intempéries do ambiente. No
presente estudo, blastosporos foram, de forma geral, menos tolerantes ao calor do que
conídios do mesmo isolado. Tal característica também foi observada por Kim et al.,
(2013) quando avaliaram a termotolerância de propágulos de Isaria fumosorosea. A
maior sensibilidade dos blastosporos ao calor em relação aos conídios poderia ser
prevista ao considerar que conídios são estruturas de resistência encontradas
normalmente no ambiente, enquanto que blastosporos são produzidos, durante o
69
processo de infecção, na hemocele do hospedeiro (ORTIZ-URQUIZA; KEYHANI,
2015), sendo portanto, estruturas não adaptadas para ambientes hostis.
Fungos entomopatogênicos reagem de diferentes formas quando submetidos a
estresses, desencadeando diferentes mecanismos de proteção e reparação causados por
essas condições. A exposição a altas temperaturas, por exemplo, induz a produção de
proteínas chamadas de heat shock (HSP), as quais previnem a desnaturação das
proteínas induzidas pela exposição ao calor (RICHTER et al., 2010), incrementando
assim a termotolerância do fungo (PLESOFSKY-VIG; BRAMBL, 1985). Dessa
forma, apesar de conídios e blastosporos apresentarem mecanismos semelhantes de
proteção contra o calor, possivelmente os danos causados aos blastosporos são
maiores.
Frente à exposição à radiação ultravioleta, fungos entomopatogêncios
apresentam mecanismos de proteção e também de reparação de danos. No presente
estudo, os ensaios com exposição à radiação UV-B demonstraram pouca variação de
tolerância entre isolados e seus propágulos nas diferentes doses avaliadas. Neste caso,
provavelmete, apesar dos danos causados pela exposição, os diferentes propágulos
apresentam os mesmos mecanismos de reparação, sendo portanto capazes de fazê-lo
apesar do dano inicial. As principais enzimas envolvidas nesse processo são as
fotoliases, as quais utilizam a luz como fonte de energia para a remoção dos dímeros
de pirimidina formados no DNA das células expostas a UV-B (KAO et al., 2005).
Contraditoriamente, Ottati-de-Lima et al. (2014) citam que blastosporos apresentam
baixa tolerância à radiação ultravioleta, porém neste estudo não é mencionada a dose
de radiação utilizada nos testes.
Apesar de mais sensíveis ao calor, blastosporos de M. robertsii (IP 146) e B.
bassiana (IP 361) iniciam a germinação mais rapidamente do que conídios
(BERNARDO; FERNANDES, dados não publicados), assim como observado por
Vega et al. (1999) para Isaria fumosorosa (=Paecylomyces fumosorosea). Tal
característica é importante, pois quanto mais rápido o processo de infecção, menor será
o tempo de exposição do propágulo a fatores abióticos estressantes (VEGA et al.,
1999), sendo maior a possibilidade de causar infecção e morte do hospedeiro. O tempo
de penetração do fungo através da germinação de conídios na cutícula de carrapatos
pode variar de 24 a 48 horas, apresentando com 72 horas massiva penetração dos
70
propágulos, portanto um longo período o qual o fungo fica exposto a fatores abióticos
adversos (ARRUDA et al., 2005; BERNARDO; FERNANDES dados não
publicados).
Segundo Jackson et al. (2010), o processo de produção do fungo pode ser
manipulado para obtenção de propágulos mais tolerantes e, consequentemente, mais
eficientes. A partir disso, algumas técnicas têm sido desenvolvidas no intuito de
maximizar o potencial de fungos entomopatogênicos para o biocontrole. Já foi relatado
que conídios submetidos a estresse durante o crescimento, seja ele nutricional,
osmótico ou térmico, tendem a apresentar maior tolerância ao calor e à radiação UV-
B (RANGEL et al., 2008). Além disso, as formulações têm sido intensamente
estudadas e têm demonstrado aficácia no incremento da tolerância de conídios
(ANGELO et al., 2010; CAMARGO et al., 2012; BARRETO et al., 2016) e
blastosporos (KIM et al., 2013) de fungos entomopatogênicos ao calor.
Vários fatores estão envolvidos na escolha adequada do fungo e do propágulo
a ser utilizado em programas de biocontrole, passando pelo comportamento do
artrópode alvo até a estratégia de aplicação do bioproduto. Ao considerar aplicações
do fungo no ambiente onde a praga está inserida (tratamento indireto), pode ser mais
apropriada a utilização de propágulos mais adaptados à condições adversas, como por
exemplo conídios. No entanto, se o intuito é o tratamento do artrópode alvo
(tratamento direto), propágulos que possuam mecanismos de infecção mais rápidos e
que, portanto, estejam menos expostos a fatores abióticos, como os blastosporos,
devem ser preferidos. Neste sentido, técnicas adequadas que visem aumentar a
tolerância ou proteger os propágulos fúngicos contra o calor e à radiação UV-B são
requeridas por ambos propágulos. Contudo, é importante desmistificar as
especulações sobre a tolerância de blastosporos; ambos propágulos estudados são
importantes e possuem qualidades e desvantagens, sendo prudente a avaliação como
um todo das características de cada propágulo e isolado, buscando minimizar as
desvantagens de cada um deles e potencializar seus pontos positivos.
71
REFERÊNCIAS
ANGELO, I. C. et al. Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick
Rhipicephalus microplus. Veterinary Parasitology, v. 172, p. 317–322, 2010.
ARRUDA, W. et al. Morphological alterations of Metarhizium anisopliae during
penetration of Boophilus microplus ticks. Experimental & applied acarology, v. 37,
p. 231–44, 2005.
BIDOCHKA, M. J. et al. Habitat Association in Two Genetic Groups of the Insect-
Pathogenic Fungus Metarhizium anisopliae: Uncovering Cryptic Species ? Apllied
and Environmental Microbiology, v. 67, n. 3, p. 1335–1342, 2001.
BLANFORD, A. S.; THOMAS, M. B. Thermal Behavior of Two Acridid Species :
Effects of Habitat and Season on Body Temperature and the Potential Impact on
Biocontrol with Pathogens. Biological Control, v. 29, n. 5, p. 1060–1069, 2000.
BRAGA, G. U. L. et al. Both Solar UVA and UVB Radiation Impair Conidial
Culturability and Delay Germination in the Entomopathogenic Fungus. , v. 74, n. 5, p.
734–739, 2001.
CAMARGO, M. G. et al. Effect of oil-based formulations of acaripathogenic fungi to
control Rhipicephalus microplus ticks under laboratory conditions. Veterinary
Parasitology, v. 188, p. 140–147, 2012.
COONEY, D. G.; EMERSON, R. Thermophilic fungi. An account of their biology,
activities and classification. San Francisco: W. H. Freeman, 1964.
FANG, W. et al. A laccase exclusively expressed by Metarhizium anisopliae during
isotropic growth is involved in pigmentation, tolerance to abiotic stresses and
virulence. Fungal genetics and biology, v. 47, n. 7, p. 602–7, 2010.
FARIA, M. R. D.; WRAIGHT, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A
comprehensive list with worldwide coverage and international classification of
formulation types. Biological Control, v. 43, p. 237–256, 2007.
FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P. Entomopathogenic fungi
against South American tick species. Experimental & applied acarology, v. 46, p.
71–93, 2008.
FERNANDES, E. K. K. et al. Characterization of Metarhizium species and varieties
based on molecular analysis, heat tolerance and cold activity. Journal of applied
microbiology, v. 108, n. 1, p. 115–28, 2010.
72
FERNANDES, É. K. K. et al. Tolerance of entomopathogenic fungi to ultraviolet
radiation: a review on screening of strains and their formulation. Current genetics, v.
61, n. 3, p. 427–40, 2015.
FERNANDES, E. K. K. et al. Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and
thermotolerance of Beauveria. Journal of invertebrate pathology, v. 98, n. 1, p. 69–
78, 2008.
FERNANDES, E. K. K. et al. Variability in tolerance to UV-B radiation among
Beauveria spp. isolates. Journal of Invertebrate Pathology, v. 96, p. 237–243, 2007.
HARTELT, K. et al. Biological control of the tick Ixodes ricinus with
entomopathogenic fungi and nematodes: Preliminary results from laboratory
experiments. International Journal of Medical Microbiology, v. 298, n. 1, p. 314–
320, 2008.
JACKSON, M. A.; CLIQUET, S.; ITEN, L. B. Media and Fermentation Processes for
the Rapid Production of High Concentrations of Stable Blastospores of the
Bioinsecticidal Fungus Paecilomyces fumosoroseus. Biocontrol Science and
Technology, v. 13, p. 23–33, 2003.
JACKSON, M. A.; DUNLAP, C. A; JARONSKI, S. T. Ecological considerations in
producing and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol.
BioControl, v. 55, p. 129145, 2010.
JACKSON, M. A. et al. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores
of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus. Mycological Research, v.
101, n. 1, p. 35–41, 1997.
KAO, Y. et al. Direct observation of thymine dimer repair in DNA by photolyase.
Proceedings of the National Academy of Science, v. 102, n. 45, p. 16128–16132,
2005.
KIM, J. S. et al. An oil-based formulation of Isaria fumosorosea blastospores for
management of greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum (Homoptera:
Aleyrodidae). Pest Management and Science, v. 69, p. 576–581, 2013.
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Production of blastospores by three strains
of Metarhizium anisopliae ( metch .) sorokin in submerged culture. Biocontrol
Science and Technology, v. 2, n. 2, p. 127–135, 1992.
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Viability and virulence of blastospores of
Metarhizium anisopliae ( Metch .) Sorokin after storage in various liquids at different
temperatures. Biocontrol Science and Technology, v. 4, n. 3, p. 309–319, 1994.
73
MASCARIN, G. M. et al. Liquid culture fermentation for rapid production of
desiccation tolerant blastospores of Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea
strains. Journal of invertebrate pathology, v. 127, p. 11–20, 2015.
MIRANPURI, G. S.; KHACHATOURIANS, G. G. Larvicidal activity of blastospores
and conidiospores of Beauveria bassiana ( strain GK 2016 ) against age groups of
Aedes aegypti.Veterinary Parasitology, v. 37, p. 155–162, 1990.
ORTIZ-URQUIZA, A.; KEYHANI, N. O. Stress response signaling and virulence:
insights from entomopathogenic fungi. Current genetics, v. 61, p. 239–49, 2015.
OTTATI-DE-LIMA, E. L. et al. Liquid production of entomopathogenic fungi and
ultraviolet radiation and temperature effects on produced propagules. Arquivos do
Instituto Biológico, v. 81, n. 4, p. 342–350, 2014.
PLESOFSKY-VIG, N.; BRAMBL, R. The Heat Shock Response of Fungi.
Experimental Mycology, v. 9, p. 187–194, 1985.
QUAITE, F. E.; SUTHERLAND, B. M.; SUTHERLAND, J. C. Action spectrum for
DNA damage in alfalfa lowers predicted impact of ozone depletion. Nature, v. 358,
p. 576-578, 1992.
RANGEL, D. E. N. et al. Evaluating physical and nutritional stress during mycelial
growth as inducers of tolerance to heat and UV-B radiation in Metarhizium anisopliae
conidia. Mycological Research, v. 112, p. 1362–1372, 2008.
RANGEL, D. E. N. et al. Influence of growth environment on tolerance to UV-B
radiation , germination speed, and morphology of Metarhizium anisopliae var .
acridum conidia. Journal of Invertebrate Pathology, v. 90, p. 55–58, 2005a.
RANGEL, D. E. N. et al. Variability in conidial thermotolerance of Metarhizium
anisopliae isolates from different geographic origins. Journal of invertebrate
pathology, v. 88, p. 116–25, 2005b.
RANGEL, D. E. N. et al. Variations in UV-B tolerance and germination speed of
Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal
of invertebrate pathology, v. 87, p. 77–83, 2004.
RICHTER, K.; HASLBECK, M.; BUCHNER, J. The heat shock response: life on the
verge of death. Molecular cell, v. 40, p. 253–66, 2010.
VEGA, F. E.; JACKSON, M. A; MCGUIRE, M. R. Germination of conidia and
blastospores of Paecilomyces fumosoroseus on the cuticle of the silverleaf whitefly,
Bemisia argentifolii. Mycopathologia, v. 147, p. 33–35, 1999.
74
XIE, X.-Q. et al. Additive contributions of two manganese-cored superoxide
dismutases (MnSODs) to antioxidation, UV tolerance and virulence of Beauveria
bassiana. Plos one, v. 7, n. 1, p. 1–12, 2012.
75
6 DISCUSSÃO
Ensaios de virulência de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e
Beauveria bassiana para larvas não alimentadas de Rhipicephalus microplus
demonstraram melhor desempenho de conídios de IP 361 (B. bassiana), com maior
mortalidade e menor CL50 em relação aos demais tratamentos. Porém, para fêmeas
ingurgitadas de R. microplus, blastosporos dos isolados IP 146 (Metarhizium robertsii)
e IP 361 (B. bassiana) foram os mais virulentos promovendo menores índices
nutricional e de produção de ovos, além de um maior percentual de controle.
A partir dessa diferença de suscetibilidade entre os estágios de
desenvolvimento do carrapato, foi pesquisado o modo de infecção dos propágulos de
M. robertsii (IP 146) e B. bassiana (IP 361) em fêmeas ingurgitadas de R. microplus.
Foi observado que blastosporos de ambos isolados avaliados apresentaram
crescimento acelerado sobre a cutícula, permitindo a rápida colonização externa do
carrapato, o que favoreceu a cobertura e a possível penetração de blastosporos por
aberturas naturais desses artrópodes. Em contrapartida, conídios penetram unicamente
através da cutícula do carrapato como demonstrado neste e em outros trabalhos
(BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA et al., 2005).
Apesar de não ser o único fator que influencia na virulência de fungos, a
cutícula é, no entanto, a primeira barreira a ser transposta (MENT et al., 2010). Durante
a infecção em carrapatos, fungos entomopatogênicos entram em contato com
componentes de cutícula desses artrópodes que são tóxicas aos conídios e aos tubos
germinativos (MENT et al., 2013). As características de infecção observadas no
presente estudo para blastosporos podem, portanto, amenizar a exposição destes
propágulos a componentes fungiostáticos da cutícula de R. microplus.
Larvas de R. microplus são menores do que adultos dessa espécie, além de não
apresentarem poro genital ou espiráculo, como evidenciado por Estrada-Peña et al.
(2012). Tais características podem justificar o fato de blastosporos terem sido, em
geral, mais virulentos para fêmeas ingurgitadas de R. microplus, enquanto conídios
dos mesmos isolados terem sido mais virulentos para larvas, já que o menor número e
tamanho das aberturas presentes nas larvas de carrapatos poderiam dificultar essa via
76
de penetração por blastosporos. Além disso, considerando que larvas de carrapatos
são, em geral, mais sensíveis a fungos entomopatogênicos do que fêmeas ingurgitadas
(CASTRO et al., 1997), a penetração do fungo por blastosporos através das aberturas
anal e genital pode justificar a maior virulência desses propágulos para fêmeas
ingurgitadas em relação às larvas.
Blastosporos de IP 361 (B. bassiana) demonstraram a formação de apressório
pelo menos 44 horas antes do que conídios do mesmo isolado. Apesar de não haver
evidência da penetração através da cutícula de carrapatos por blastosporos do isolado
IP 146 (M. robertsii), nos bioensaios foi evidenciado o feito da infecção sobre a
biologia das fêmeas ingurgitadas, e observada a exteriorização do fungo a partir do
cadáver das fêmeas tratadas. Segundo (LEGER, ST. et al., 1991), no entanto, a
formação de apressório não é um pré-requisito para o processo de infecção, já que
substâncias mucilaginosas responsáveis pela adesão dos fungos na cutícula do
artrópode são produzidas também a partir de hifas em crescimento, maiores que 2 μm.
Foi evidenciado a formação de novos blastosporos na cutícula de fêmeas
tratadas com blastosporos de IP 361, promovendo portanto uma renovação e aumento
do número dos propágulos na cutícula do carrapato. Tais características dos
blastosporos demonstram o potencial destes propágulos para o uso em programas de
biocontrole.
O rápido desenvolvimento de blastosporos em relação aos conídios também
foi demonstrado em Isaria fumosorosea sobre a cutícula de mosca branca (VEGA et
al., 1999) e em meio de cultura (JACKSON et al., 2003). Resultados promissores
foram demonstrados por Hall (1979) quando comparou conídios e blastosporos de
Lecanicillium lecanii (=Verticillium lecanii) contra Macrosiphonella sanborni
(Hemiptera: Aphididae), e comprovou que blastosporos foram duas vezes mais
virulento. Para carrapatos, foram reportados índices menores que 10% na muda de
larvas e ninfas ingurgitadas de Ixodes ricinus tratadas com blastosporos de M.
anisopliae (WASSERMANN et al., 2016).
Miranpuri e Khachatourians (1990) observaram virulência semelhante de
conídios e blastosporos de B. bassiana contra larvas de Aedes aegypti, assim como
Kim et al. (2013) demonstraram para propágulos de I. fumosorosea contra mosca
branca. Mesmo não demonstrando diferenças de virulência entre propágulos, tais
77
resultados mostram quão promissores são os blastosporos para o uso em programas de
biocontrole. Mascarin et al. (2015) citam que o baixo custo na produção e
processamento de micoacaricidas são cruciais para a comercialização destes. Neste
contexto, blatosporos demandam menor custo e tempo de produção do que conídios
(KIM et al., 2013), tornando-se assim propágulos que despertam interesse como
ingrediente ativo de bioprodutos.
Apesar de maior facilidade de produção em larga escala e da rápida germinação
sobre a cutícula de artrópodes, evidências indicam que blastosporos, de um modo
geral, seriam menos tolerantes ao calor e à radiação UV-B do que conídios (KIM et
al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al., 2014). Naturalmente, blastosporos são estruturas
em desenvolvimento encontradas no interior do artrópode infectado, enquanto
conídios são estruturas de resistência (ORTIZ-URQUIZA; KEYHANI, 2015). No
entanto, Vega et al. (1999) afirmaram que propágulos que germinam mais rapidamente
precisam de menos tempo para penetrar no hospedeiro, e deste modo, estes tendem a
ficar menos tempo expostos a fatores adversos do ambiente. Além disso, formulações
e diferentes técnicas de produção dos fungos podem aumentar a tolerância destes
propágulos a fatores estressantes (RANGEL et al., 2008; KIM et al., 2013).
Kim et al. (2013) demonstraram menor termotolerância de blastosporos de I.
fumosorosea em relação aos conídios da mesma espécie, porém citam que a
formulação destes em óleo aumentam significativamente sua tolerância. Cliquet e
Jackson (1999) demonstraram a influência dos componentes do meio de cultura na
tolerância de blastosporos de I. fumosorosea à secagem à quente, assim como Rangel
et al. (2006) observaram na tolerância à radiação UV-B de conídios de M. anisopliae.
De modo geral, conídios e blastosporos dos isolados avaliados apresentaram tolerância
semelhante às doses de radiação UV-B utilizadas no presente estudo. Portanto,
técnicas que visem incrementar a tolerâcia de propágulos fúngicos a fatores ambientais
adversos são necessários para ambos os propágulos, conídios e blastosporos.
Trabalhos que demonstrem isolados mais tolerantes e promovam o conhecimento das
respostas de cada propágulo e isolado ao artrópode alvo e às intempéries encontradas
em campo durante o uso do fungo em programas de biocontrole são importantes para
disseminar o uso do controle biológico.
78
7 CONCLUSÕES
1. Dentre os isolados avaliados, conídios foram mais virulentos para larvas de
Rhipicephalus microplus do que blastosporos;
2. Blastosporos de Metarhizium spp. foram mais virulentos para fêmeas ingurgitadas
de R. microplus do que conídios deste gênero, e também do que ambos propágulos
de B. bassiana,;
3. Blastosporos germinaram consideravelmente mais rápido do que conídios sobre a
cutícula de fêmeas ingurgitadas de R. microplus;
4. Dupla possibilidade de penetração de blastosporos de B. bassiana foi evidenciada
em carrapatos: por aberturas naturais e através da cutícula;
5. A formação de novos propágulos sobre a cutícula de fêmeas ingurgitadas de R.
microplus tratadas com blastosporos de Beauveria bassiana foi detectada;
6. Blastosporos de Metarhizium spp. foram mais sensíveis ao calor do que conídios;
7. A termotolerância de blastosporos em relação a de conídios de Beauveria
bassiana variou entre isolados;
8. De modo geral, blastosporos foram tão sensíveis à radiação UV-B quanto os
conídios dos mesmos isolados avaliados.
79
REFERÊNCIAS
ALONSO-DÍAZ, M. A. et al. Evaluation of Metarhizium anisopliae (Hyphomycetes)
for the control of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) on naturally infested cattle in
the Mexican tropics. Veterinary Parasitology, v. 147, p. 336–340, 2007.
ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. Controle microbiano de insetos. 2nd
ed., p.50–60, 1998. Piracicaba: Fundação de Estudos Agrários Luz de Queiroz -
FEALQ.
ANDERSON, J. F. The natural history of ticks. Medical Clinics of North America,
v. 86, n. 2, p. 205–218, 2002.
ANGELO, I. C. Avaliação dos perfis protéico e lipídico na resposta imune de
Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887) experimentalmente infectados com
fungos, 2011. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
ANGELO, I. C. et al. Efficiency of Lecanicillium lecanii to control the tick
Rhipicephalus microplus. Veterinary Parasitology, v. 172, p. 317–322, 2010.
ANGEL-SAHAGÚN, C. A. et al. Virulence of Mexican isolates of entomopathogenic
fungi (Hypocreales: Clavicipitaceae) upon Rhipicephalus (=Boophilus microplus)
(Acari: Ixodidae) larvae and the efficacy of conidia formulations to reduce larval tick
density under field conditions. Veterinary parasitology, v. 170, p. 278–86, 2010.
ARRUDA, W. et al. Morphological alterations of Metarhizium anisopliae during
penetration of Boophilus microplus ticks. Experimental & applied acarology, v. 37,
p. 231–44, 2005.
80
ASKARY, H.; BENHAMOU, N.; BRODEUR, J. Ultrastructural and cytochemical
characterization of aphid invasion by the hyphomycete Verticillium lecanii. Journal
of Invertebrate Pathology, v. 74, p. 1–13, 1999.
BAHIENSE, T. C.; FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P.
Compatibility of the fungus Metarhizium anisopliae and deltamethrin to control a
resistant strain of Boophilus microplus tick. Veterinary Parasitology, v. 141, p. 319–
324, 2006.
BARCI, L. A. G. et al. Seleção de isolados do fungo entomopatogênico Beauveria
bassiana (Ascomycetes: Clavicipitaceae) para o controle de Rhipicephalus
(Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia
Veterinária, v. 18, n. 1, p. 7–13, 2009.
BARRÉ, M. et al. In vitro and in vivo evaluation of deltamethrin and amitraz mixtures
for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae) in New
Caledonia. Veterinary Parasitology, v. 155, p. 110–119, 2008.
BENNET, G. F. Oviposition of Boophilus Microplus (Canestrini) (Acarida: Ixodidae)
I. Influence of tick size on the egg production. Acarologia, v. 16, p. 52–61, 1974.
BIDOCHKA, M. J. et al. Habitat Association in Two Genetic Groups of the Insect-
Pathogenic Fungus Metarhizium anisopliae: Uncovering Cryptic Species ? Apllied
and Environmental Microbiology, v. 67, n. 3, p. 1335–1342, 2001.
BISCHOFF, J. F.; REHNER, S. A.; HUMBER, R. A. A multilocus phylogeny of the
Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia, v. 101, p. 512–530, 2009.
BITTENCOURT, V. R. E. P. Trials to Control South American Ticks with
Entomopathogenic Fungi. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 916, p.
555–558, 2000.
81
BITTENCOURT, V. R. E. P. et al. Avaliação da ação in vivo de Metarhizium
anisopliae (Metschnikoff, 1879) Sorokin, 1883 aplicado sobre Brachiaria decumbens
infestada com larvas de Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae).
Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 12, n. 1, p. 38–42, 2003.
BITTENCOURT, V. R. E. P.; MASCARENHAS, A. G.; FACCINI, J. L. H.
Mecanismo de infecçao do fungo Metarhizium anisopliae no carrapato Boophilus
microplus em condições experimentais. Ciência Rural, v. 29, n. 2, p. 351–354, 1999.
BITTENCOURT, V. R. E. P. et al. Avaliaçao dos efeitos do contato de Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill. com ovos e larvas de Boophilus microplus (Canestrini, 1887)
(Acari: Ixodidae). Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 5, n. 2, p. 81–
84, 1996.
BLAGBURN, B. L.; DRYDEN, M. W. Biology, Treatment, and Control of Flea and
Tick Infestations. Veterinary Clinics of North America - Small Animal Practice, v.
39, p. 1173–1200, 2009.
BLANFORD, A. S.; THOMAS, M. B. Thermal Behavior of Two Acridid Species :
Effects of Habitat and Season on Body Temperature and the Potential Impact on
Biocontrol with Pathogens. Biological Control, v. 29, n. 5, p. 1060–1069, 2000.
BOWMAN, A. S.; NUTTALL, P. A. Ticks: Biology, Disease and Control. 1a ediçao
ed. Cambridge: Cambridge University Press, 2008.
BRAGA, G. U. et al. Both solar UVA and UVB radiation impair conidial culturability
and delay germination in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae.
Photochemistry and photobiology, v. 74, n. 5, p. 734–739, 2001.
82
BRAGA, G. U. L. et al. Molecular and physiological effects of environmental UV
radiation on fungal conidia. Current Genetics, v. 61, p. 405–425, 2015.
BRITO, L. G. et al. Bioecologia, importância médico-veterinária e controle de
carrapatos, com ênfase no carrapato dos bovinos,. Embrapa, p. 21, 2006. Rondônia.
BUTLER, M. J.; DAY, A. W. Fungal melanins: a review. Canadian Journal of
Microbiology, v. 1136, p. 1115–1136, 1998.
CAMARGO, M. G. et al. Effect of oil-based formulations of acaripathogenic fungi to
control Rhipicephalus microplus ticks under laboratory conditions. Veterinary
parasitology, v. 188, n. 1-2, p. 140–7, 2012.
CHANDLER, D. et al. Fungal biocontrol of Acari. Biocontrol Science and
Technology, v. 10, p. 357–384, 2000.
CHERRY, B. Y. L. M. The production of cuticle wax by engorged females of the cattle
ticks, Boophilus microplus (Canestrini). The Journal of Experimental Biology, v.
50, p. 705–709, 1969.
CLIQUET, S.; JACKSON, M. A. Influence of culture conditions on production and
freeze-drying tolerance of Paecilomyces fumosoroseus blastospores. Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 23, p. 97–102, 1999.
CLIQUET, S.; JACKSON, M. A. Impact of carbon and nitrogen nutrition on the
quality, yield and composition of blastospores of the bioinsecticidal fungus
Paecilomyces fumosoroseus. Journal of industrial microbiology & biotechnology,
v. 32, p. 204–210, 2005.
COONEY, D. G.; EMERSON, R. Thermophilic fungi. An account of their biology,
activities and classification. San Francisco: W. H. Freeman, 1964.
83
DRUMMOND, R. O. et al. Laboratory testing of inseticides for control of the winter
tick. Journal of Economic Entomology, v. 64, p. 686–688, 1971.
ESTRADA-PEÑA, A; JONGEJAN, F. Ticks feeding on humans: a review of records
on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission.
Experimental & applied acarology, v. 23, p. 685–715, 1999.
ESTRADA-PEÑA, A. et al. Reinstatement of Rhipicephalus (Boophilus) australis
(Acari : Ixodidae) With Redescription of the Adult and Larval Stages. Entomological
Society of America, v. 49, n. 4, p. 794–802, 2012.
FANG, W. et al. A laccase exclusively expressed by Metarhizium anisopliae during
isotropic growth is involved in pigmentation, tolerance to abiotic stresses and
virulence. Fungal genetics and biology, v. 47, n. 7, p. 602–7, 2010.
FARIA, M. R. D.; WRAIGHT, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A
comprehensive list with worldwide coverage and international classification of
formulation types. Biological Control, v. 43, p. 237–256, 2007.
FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P. Entomopathogenic fungi
against South American tick species. Experimental & applied acarology, v. 46, p.
71–93, 2008.
FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P.; ROBERTS, D. W.
Perspectives on the potential of entomopathogenic fungi in biological control of ticks.
Experimental Parasitology, v. 130, p. 300–305, 2012.
FERNANDES, E. K. K. et al. Characterization of Metarhizium species and varieties
based on molecular analysis, heat tolerance and cold activity. Journal of applied
microbiology, v. 108, n. 1, p. 115–28, 2010.
84
FERNANDES, É. K. K. et al. Tolerance of entomopathogenic fungi to ultraviolet
radiation: a review on screening of strains and their formulation. Current genetics, v.
61, n. 3, p. 427–40, 2015.
FERNANDES, E. K. K. et al. Cold activity of Beauveria and Metarhizium, and
thermotolerance of Beauveria. Journal of invertebrate pathology, v. 98, n. 1, p. 69–
78, 2008.
FERNANDES, E. K. K. et al. Variability in tolerance to UV-B radiation among
Beauveria spp. isolates. Journal of Invertebrate Pathology, v. 96, p. 237–243, 2007.
FERNÁNDEZ-SALAS, A.; RODRÍGUEZ-VIVAS, R. I.; ALONSO-DÍAZ, M. A.
First report of a Rhipicephalus microplus tick population multi-resistant to acaricides
and ivermectin in the Mexican tropics. Veterinary Parasitology, v. 183, p. 338–342,
2012.
FILHO, M. M. et al. Micoinseticidas e micoacaricidas no brasil : como estamos após
quatro décadas? Arquivos do Instituto Biológico, v. 76, n. 4, p. 769–779, 2009.
FINNEY, D. S. Probit analysis. Cambrige: University Press, 1971.
FLAMINI, G. Acaricides of natural origin, personal experiences and review of
literature (1990-2001). Studies in Natural Products Chemistry, v. 28, p. 381–451,
2003.
FOIL, L. D. et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-
borne diseases. Veterinary Parasitology, v. 125, p. 163–181, 2004.
FRIEDBERG, E. C. .; WALKER, G. C. .; SIEDE, W. DNA Repair and Mutagenesis.
1995.
85
FURLONG, J.; MARTINS, J. R. S.; PRATA, M. C. D. E. A. Carrapato: problemas
e soluções. 1st ed. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 2005.
GINDIN, G. et al. Pathogenicity of Metarhizium anisopliae ( Hypocreales :
Clavicipitaceae ) to Tick Eggs and the Effect of Egg Cuticular Lipids on Conidia
Development Pathogenicity of Metarhizium anisopliae ( Hypocreales :
Clavicipitaceae ) to Tick Eggs and the Effect of E. Entomological Society of
America, v. 46, n. 3, p. 531–538, 2009.
GINDIN, G. et al. The susceptibility of different species and stages of ticks to
entomopathogenic fungi. Experimental & applied acarology, v. 28, p. 283–288,
2002.
GOETTEL, M. S.; INGLIS, G. D. Fungi : Hyphomycetes. Manual of thechniques in
insect pathology. p.409, 1997.
GONZALES, J. C. O controle do carrapato bovino. Porto Alegre: Sulina, 1975.
GRILLO TORRADO, J. M. G.; GUTIERREZ, R. O. Método para medir la actividad
de los acaricidas sobre larvas de garrapata evolucion de sensibilidad. Revista de
Investigaciones Agropecuarias, v. 6, p. 135–158, 1969.
GRISI, L. et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in
Brazil. Brazilian Journal Veterinary Parasitology, v. 23, n. 2, p. 150–156, 2014.
GUDDERRA, N. P. et al. Hemolymph proteins in ticks. Journal os Insect
Physiology, v. 48, p. 269–278, 2002.
HALAOULI, S. et al. Fungal tyrosinases : new prospects in molecular characteristics
, bioengineering and biotechnological applications. Journal of Applied
Microbiology, v. 100, p. 219–232, 2006.
86
HALL, R. A. Pathogenicity of Verticillium lecanii conidia and blastospores against the
aphid, Macrosiphoniella sanborni. Entomophaga, v. 24, n. 2, p. 191–198, 1979.
HAMILTON, J. G. C.; SONENSHINE, D. E.; LUSBY, W. R. Cholesteryl oleate:
mounting sex pheromone of the hard ticks Dermacentor variabilis (Say) (Acari:
Ixodidae). Journal Insect Physiology, v. 35, n. 11, p. 873–879, 1989.
HARTELT, K. et al. Biological control of the tick Ixodes ricinus with
entomopathogenic fungi and nematodes: Preliminary results from laboratory
experiments. International Journal of Medical Microbiology, v. 298, n. 1, p. 314–
320, 2008.
HIDEG, E.; JANSEN, M. A K.; STRID, A. UV-B exposure, ROS, and stress:
inseparable companions or loosely linked associates? Trends in plant science, v. 18,
n. 2, p. 107–115, 2013.
ISSALY, N. et al. Influence of nutrient, pH and dissolved oxygen on the production
of Metarhizium flavoviride Mf189 blastospores in submerged batch culture. Process
Biochemistry, v. 40, p. 1425–1431, 2005.
JACKSON, M. A; JARONSKI, S. T. Production of microsclerotia of the fungal
entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol
agent for soil-inhabiting insects. Mycological research, v. 113, p. 842–50, 2009.
JACKSON, M. A.; CLIQUET, S.; ITEN, L. B. Media and Fermentation Processes for
the Rapid Production of High Concentrations of Stable Blastospores of the
Bioinsecticidal Fungus Paecilomyces fumosoroseus. Biocontrol Science and
Technology, v. 13, p. 23–33, 2003.
JACKSON, M. A.; DUNLAP, C. A; JARONSKI, S. T. Ecological considerations in
producing and formulating fungal entomopathogens for use in insect biocontrol.
BioControl, v. 55, p. 129145, 2010.
87
JACKSON, M. A. et al. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores
of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus. Mycological Research, v.
101, n. 1, p. 35–41, 1997.
JONSSON, N. N.; MAYER, D. G.; GREEN, P. E. Possible risk factors on Queensland
dairy farms for acaricide resistance in cattle tick (Boophilus microplus). Veterinary
parasitology, v. 88, p. 79–92, 2000.
KAO, Y. et al. Direct observation of thymine dimer repair in DNA by photolyase.
Proceedings of the National Academy of Science, v. 102, n. 45, p. 16128–16132,
2005.
KAUFMAN, W. R. Ticks : Physiological aspects with implications for pathogen
transmission. Ticks and Tick-borne Diseases, v. 1, p. 11–22, 2010.
KIM, J. S. et al. An oil-based formulation of Isaria fumosorosea blastospores for
management of greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum (Homoptera:
Aleyrodidae). Pest Management and Science, v. 69, p. 576–581, 2013.
KIRKLAND, B. H.; CHO, E.; KEYHANI, N. O. Differential susceptibility of
Amblyomma maculatum and Amblyomma americanum (Acari : Ixodidea) to the
entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Biological
Control, v. 31, p. 414–421, 2004.
KIRKLAND, B. H.; WESTWOOD, G. S.; KEYHANI, N. O. Pathogenicity of
Entomopathogenic Fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae to Ixodidae
Tick Species Dermacentor variabilis , Rhipicephalus sanguineus , and Ixodes
scapularis. Bioone Research evolved, v. 41, n. 4, p. 705–711, 2004.
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Production of blastospores by three strains
of Metarhizium anisopliae (Metch.) sorokin in submerged culture. Biocontrol Science
and Technology, v. 2, n. 2, p. 127–135, 1992.
88
KLEESPIES, R. G.; ZIMMERMANN, G. Viability and virulence of blastospores of
Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorokin after storage in various liquids at different
temperatures. Biocontrol Science and Technology, v. 4, n. 3, p. 309–319, 1994.
LACEY, L. A. et al. Insect pathogens as biological control agents: back to the future.
Journal of Invertebrate Pathology, v. 132, p. 1–41, 2015.
LANE, B.; TRINCI, A. P. J. Influence of cultural conditions on the virulence of
conidia and blastospores of Beauveria bassiana to the green leafhopper, Nephotettix
virescens. Mycological Research (An International Journal of Fungal Biology), v.
95, n. 7, p. 829–833, 1991.
LEGER, R. J. ST. et al. Prepenetration events during infection of host cuticle by
Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology, v. 58, p. 168–179, 1991.
LOPES, R. B. et al. Eficência de formulaçoes de Beauveria bassiana e Metarhizium
anisopliae para o controle de ninfas de Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787).
Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 16, n. 1, p. 27–31, 2007.
MARTINS, I. V. F. et al. Caderno de Parasitologia Veterinária. Alegre: EDUFES,
2007.
MASCARIN, G. M. et al. Glucose concentration alters dissolved oxygen levels in
liquid cultures of Beauveria bassiana and affects formation and bioefficacy of
blastospores. Applied microbiology and biotechnology, v. 99, p. 6653–65, 2015.
MASCARIN, G. M. et al. Liquid culture fermentation for rapid production of
desiccation tolerant blastospores of Beauveria bassiana and Isaria fumosorosea
strains. Journal of invertebrate pathology, v. 127, p. 11–20, 2015.
MASCARIN, G. M.; PAULI, G. Bioprodutos à base de fungos entomopatogênicos.
Controle Alternativo de Pragas e Doenças na Agricultura Orgânica. p.169–195,
2010.
89
MASSARD, C. L.; FONSECA, A. H. Carrapatos e doenças transmitidas comuns ao
homem e aos animais. A Hora Veterinária, v. 135, n. 1, p. 15–23, 2004.
MENT, D. et al. Role of cuticular lipids and water-soluble compounds in tick
susceptibility to Metarhizium infection. Biocontrol Science and Technology, v. 23,
n. 8, p. 956–967, 2013.
MENT, D. et al. Metarhizium anisopliae conidial responses to lipids from tick cuticle
and tick mammalian host surface. Journal of Invertebrate Pathology, v. 103, p. 132–
139, 2010.
MERLINI, L. S.; YAMAMURA, M. H. Estudo in vitro da resistência de Boophilus
microplus a carrapaticidas na pecuária leiteira do norte do estado do paraná. Semina:
Ciências Agrárias, v. 19, n. 1, p. 38–44, 1998.
MIRANPURI, G. S.; KHACHATOURIANS, G. G. Larvicidal activity of blastospores
and conidiospores of Beauveria bassiana (strain GK 2016) against age groups of Aedes
aegypti. Veterinary Parasitology, v. 37, p. 155–162, 1990.
ORTIZ-URQUIZA, A.; KEYHANI, N. O. Stress response signaling and virulence:
insights from entomopathogenic fungi. Current genetics, v. 61, p. 239–49, 2015.
OTTATI-DE-LIMA, E. L. et al. Liquid production of entomopathogenic fungi and
ultraviolet radiation and temperature effects on produced propagules. Arquivos do
Instituto Biológico, v. 81, n. 4, p. 342–350, 2014.
PAUL, N. D.; GWYNN-JONES, D. Ecological roles of solar UV radiation : towards
an integrated approach. Trends in Ecology and Evolution, v. 18, n. 1, p. 48–55, 2003.
PIRALI-KHEIRABADI, K. et al. Biological control of Rhipicephalus (Boophilus)
annulatus by different strains of Metarhizium anisopliae , Beauveria bassiana and
Lecanicillium psalliotae fungi. Parasitology research, v. 100, p. 1297–1302, 2007.
90
PLESOFSKY-VIG, N.; BRAMBL, R. The Heat Shock Response of Fungi.
Experimental Mycology, v. 9, p. 187–194, 1985.
POLAR, P. et al. Thermal characteristics of Metarhizium anisopliae isolates important
for the development of biological pesticides for the control of cattle ticks. Veterinary
parasitology, v. 134, p. 159–67, 2005.
RANGEL, D. E. N.; ANDERSON, A. J.; ROBERTS, D. W. Growth of Metarhizium
anisopliae on non-preferred carbon sources yields conidia with increased UV-B
tolerance. Journal of Invertebrate Pathology, v. 93, p. 127–134, 2006.
RANGEL, D. E. N. et al. Evaluating physical and nutritional stress during mycelial
growth as inducers of tolerance to heat and UV-B radiation in Metarhizium anisopliae
conidia. Mycological Research, v. 112, p. 1362–1372, 2008.
RANGEL, D. E. N. et al. Influence of growth environment on tolerance to UV-B
radiation , germination speed , and morphology of Metarhizium anisopliae var.
acridum conidia. Journal of Invertebrate Pathology, v. 90, p. 55–58, 2005a.
RANGEL, D. E. N. et al. Variability in conidial thermotolerance of Metarhizium
anisopliae isolates from different geographic origins. Journal of invertebrate
pathology, v. 88, p. 116–25, 2005b.
RANGEL, D. E. N. et al. Variations in UV-B tolerance and germination speed of
Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal
of invertebrate pathology, v. 87, p. 77–83, 2004
REHNER, S. A. et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic
entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia, v. 103, p. 1055–1073, 2011.
91
REIS, R. C. S.; FERNANDES, E. K. K.; BITTENCOURT, V. R. E. P. Fungal
formulations to control Rhipicephalus sanguineus engorged females. Annals of the
New York Academy of Sciences, v. 1149, p. 239–241, 2008.
RIBEIRO, V. L. et al. Acaricidal properties of the essencial oil Hesperozygis ringens
(Lamiaceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Bioresource
technology, v. 101, n. 7, p. 2506–2509, 2010.
RICHTER, K.; HASLBECK, M.; BUCHNER, J. The heat shock response: life on the
verge of death. Molecular cell, v. 40, p. 253–66, 2010.
ROT, A. et al. On-host control of the brown dog tick Rhipicephalus sanguineus
Latreille (Acari: Ixodidae) by Metarhizium brunneum (Hypocreales: Clavicipitaceae).
Veterinary parasitology, v. 193, p. 229–37, 2013.
RUSSO, J.; BREHÉLIN, M.; CARTON, Y. Hemocyte changes in reistant and
susceptible strains of D. melanogaster caused by virulent and avirulent strains of the
parasitic wasp Leptopilina boulardi. Journal of Insect Physiology, v. 47, p. 167–172,
2001.
SETLOW, B.; SETLOW, P. Role of DNA Repair in Bacillus subtilis Spore Resistance.
Journal of Bacteriology, v. 178, n. 12, p. 3486–3495, 1996.
SHANG, Y. et al. Improving UV resistance and virulence of Beauveria bassiana by
genetic engineering with an exogenous tyrosinase gene. Journal of invertebrate
pathology, v. 109, p. 105–109, 2012.
SONENSHINE, D. E. Biology of ticks 1. Nova York: Oxford University Press, 1991.
SONENSHINE, D. E.; LANE, R. S.; NICHOLSON, W. L. Ticks (Ixodida). In: G.
Mullen; L. Durden (Eds.); Medical and Veterinary Entomology. p.597, 2002.
92
SOSA-GOMEZ, D. R.; BOUCIAS, D. G.; NATION, J. L. Attachment of Metarhizium
anisopliae to the southern green stink bug Nezara viridula cuticle and fungistatic effect
of cuticular lipids and aldehydes. Journal of Invertebrate Pathology, v. 69, p. 31–
39, 1997.
SOUSA, L. A. D. et al. Potential synergistic effect of Melia azedarach fruit extract
and Beauveria bassiana in the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari :
Ixodidae) in cattle infestations. Veterinary Parasitology, v. 175, p. 320–324, 2011.
SOUZA HIGA, L. D. O. Acaricide Resistance Status of the Rhipicephalus microplus
in Brazil: A Literature Overview. Medicinal Chemistry, v. 5, n. 7, p. 326–333, 2015.
SUN, M. et al. Virulence of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and
Paecilomyces lilacinus to the engorged female Hyalomma anatolicum tick ( Acari :
Ixodidae ). Veterinary Parasitology, v. 180, p. 389–393, 2011.
TAYLOR, P.; GRAND, M. LE; CLIQUET, S. Impact of culture age on conidial
germination , desiccation and UV tolerance of entomopathogenic fungi. Biocontrol
Science and Technology, v. 23, n. 7, p. 847–859, 2013.
URQUHART, G. M. et al. Parasitologia Veterinária. 2a ed. Rio de Janeiro: Editora
Guanabara Koogan, 1996.
VEGA, F. E.; JACKSON, M. A; MCGUIRE, M. R. Germination of conidia and
blastospores of Paecilomyces fumosoroseus on the cuticle of the silverleaf whitefly,
Bemisia argentifolii. Mycopathologia, v. 147, p. 33–35, 1999.
WASSERMANN, M. et al. Biological control of Ixodes ricinus larvae and nymphs
with Metarhizium anisopliae blastospores. Ticks and Tick-borne Diseases, 2016.
93
WEBSTER, A. et al. Integrated control of an acaricide-resistant strain of the cattle tick
Rhipicephalus microplus by applying Metarhizium anisopliae associated with
cypermethrin and chlorpyriphos under field conditions. Veterinary parasitology, v.
207, n. 3-4, p. 302–8, 2015.
XAVIER-SANTOS, S.; LOPES, R. B.; FARIA, M. Emulsifiable oils protect
Metarhizium robertsii and Metarhizium pingshaense conidia from imbibitional
damage. Biological ControlONTROL, 2011.
XIE, X.-Q. et al. Additive contributions of two manganese-cored superoxide
dismutases (MnSODs) to antioxidation, UV tolerance and virulence of Beauveria
bassiana. Plos one, v. 7, n. 1, p. 1–12, 2012.ZHIOUA, E.; YEH, M. T.; LEBRUN, R.
A. Ultrastructure of the hemocytes of Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Acarologia,
v. 37, p. 173–179, 1996.
ZHIOUA, E.; YEH, M. T.; LEBRUN, R. A. Ultrastructure of the hemocytes of Ixodes
scapularis (Acari: Ixodidae). Acarologia, v. 37, p. 173–179, 1996.