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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
PERFIL DO PARASITISMO SANGUÍNEO POR ANÁLISES
MOLECULARES ENVOLVENDO Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon EM
CÃES SINTOMÁTICOS NA ÁREA METROPOLITANA DE GOIÂNIA,
GOIÁS
Sabrina Castilho Duarte
Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland C. Linhares
GOIÂNIA 2010
ii
SABRINA CASTILHO DUARTE
PERFIL DO PARASITISMO SANGUÍNEO POR ANÁLISES
MOLECULARES ENVOLVENDO Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon EM
CÃES SINTOMÁTICOS NA ÁREA METROPOLITANA DE GOIÂNIA,
GOIÁS
Tese apresentada para obtenção do
grau de Doutor em Ciência Animal junto
à Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Linha de Pesquisa
Parasitos e doenças parasitárias dos animais
Orientador:
Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares – UFG
Comitê de Orientação:
Profa Dra Lígia Miranda Ferreira Borges – UFG
Prof. Dr. Cirano José Ulhoa - UFG
GOIÂNIA
2010
iii
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
D812p
Duarte, Sabrina Castilho.
Perfil do parasitismo sanguíneo por análises moleculares
envolvendo Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon em cães
sintomáticos na área metropolitana de Goiânia, Goiás
[manuscrito] / Sabrina Castilho Duarte. - 2010. 79 f. : figs, tabs. Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Escola de
Veterinária, 2010. Bibliografia.
1. Diagnóstico de Hemoparasitos – Goiás (Estado) 2. Babesia,
Ehrlichia e Hepatozoon 3. Babesiose canina – Parasitologia
I.Título
CDU: 619:576.89:636.7
iv
Dedico este trabalho a minha família,
especialmente meu marido Alexandre e minhas filhas Alice e
Beatriz por viverem comigo a realização de sonhos pessoais e
profissionais.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me capacitado, proporcionado todas as oportunidades
e colocado em minha vida tantas pessoas e profissionais admiráveis;
Ao CNPq, por ceder bolsas de Doutorado aos programas de pós-graduação do País.
Ao programa de pós-graduação em Ciência Animal da EV/UFG por conceder-me a
bolsa, possibilitando minha dedicação integral a este projeto.
A Márcia Barnabé, faculdades Objetivo por me receber no corpo docente da
Universidade no início do doutorado quando ainda não havia bolsas disponíveis
possibilitando não apenas recursos financeiros como também crescimento
profissional e pessoal;
Ao laboratório de biologia molecular do ICB/UFG, em especial a Juliana Alves
Parente, pessoa tão querida, que realizou os sequenciamento dos isolados deste
estudo com muita disposição e competência. A professora Célia Soares por ceder
não apenas o laboratório e equipe como também todo material necessário as
reações de seqüenciamento;
Aos funcionários da creche/UFG que cuidaram da minha pequena Alice com tanto
amor. Recém nascida ela cresceu com sorriso no rosto vivendo a dura rotina de um
bebê que nasceu ―no doutorado‖. No espaço da creche, Alice conseguiu superar os
momentos da minha ausência sempre muito feliz. Seu sorriso na minha chegada
ficará eternamente marcado em minha lembrança e foi sempre bálsamo para
qualquer cansaço;
À Minha família que se esforçou junto comigo por esta conquista. Amo e agradeço
imensamente minhas queridas filhas Alice e Beatriz; mesmo com excesso de
atividades conseguimos juntas vencer todas as dificuldades. Agradeço ao meu
marido amado Alexandre de Lima que entendeu amorosamente tanto tempo
dedicado a minha formação profissional me auxiliando em tudo que estava ao seu
alcance;
vi
As minhas irmãs, especialmente a Herika C. D Fernandes que como uma mãe
socorria sempre, auxiliando com a Alice, com minhas ansiedades e momentos de
desanimo. Obrigada por ser tão presente em minha vida. A Danielha C. D. Jones por
juntamente com Rory Jones contribuir na correção dos textos em língua Inglesa;
A minha mãe Marina Leite Castilho Duarte (in memorian) por ter sido exemplo de
vida pra mim. Exemplo de conduta e atitude perante a vida como mãe, esposa e
profissional.
Ao meu eterno amigo e orientador Guido F. C. Linhares, que honra tê-lo como
orientador. Aprendi muito ao seu lado que nunca poupou esforços para ensinar,
sempre buscando a metodologia mais adequada, a informação mais segura, a
melhor forma de escrever, incansável na busca da excelência. Aprendi tudo que sei
de uma forma honrada e ética. Um dia sei que terei a oportunidade de orientar e
neste momento espero ser tão competente como ele.
A querida amiga Lígia M; F. Borges por ter sempre boas soluções e pela certeza de
apoio certo e confiável;
A minha amiga Carla C. B. Louly pela identificação dos carrapatos deste estudo, por
estar sempre por perto e pela certeza de ajuda segura.
Ao meu querido amigo, um pai para mim, professor Francisco Dias Filho pela torcida,
apoio diário. Agradeço pelas conversas que tanto enriqueceram;
As queridas professoras Valéria Sá Jaime e Maria Auxiliadora Andrade por serem
pessoas tão amáveis dispensando a todos carinho, auxílio e amizade. Agradeço por
terem auxiliado na correção deste trabalho mesmo tendo vários outros trabalhos a
serem corrigidos. Obrigada por terem atribuído importância e amor na correção desta
tese.
As professoras, membros da banca de qualificação, Rosangela Zacarias Machado,
Andrea Caetano da Silva, Lígia M. F. Borges e Valéria de Sá Jaime e aos
professores da banca de defesa professores: Carlos Luiz Massard, Abraão Garcia
vii
Gomes e José Luiz Barros de Araújo especialmente pelas sugestões que tornaram
este trabalho mais completo, claro e objetivo.
À UFG, especialmente ao Departamento de Medicina Preventiva. Agradeço à todos
os funcionários pelo carinho de sempre;
Aos meus ―irmãos‖ de trabalho ―filhos‖ do mesmo orientador: Herika Xavier, Osvaldo
José da Silveira Neto, José Carlos Favaro Junior e Fabrício O. Pereira e aos ―primos‖
Alberto Elias Marques e Hilary Hidasi pela convivência saudável, pelo carinho de
sempre e tantos ótimos momentos que passamos juntos.
As minhas amigas de jornada Vanessa Silvestre, Marina Pacheco, Débora Melo,
Paula Rogério e a querida Lívia pelo apoio e amizade de sempre.
Finalizo agradecendo a Vida. Pelos bons momentos que nos alegram e pelos maus
momentos que nos transformam.
viii
"Aquilo que você mais sabe ensinar, é o que você mais precisa aprender..." (RICHARD BACH)
ix
x
xi
RESUMO GERAL
Nos gêneros Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon são posicionadas as espécies de parasitos responsáveis pela babesiose, ehrlichiose e hepatozoonose respectivamente. Estes microrganismos têm em comum o fato de serem transmitidos por carrapatos vetores e causarem nos cães infectados sinais gerais como febre, anemia e icterícia acompanhados de infecções intracelulares. No estado de Goiás não haviam trabalhos com abordagem filogenética relativos a estes hemoparasitos. O objetivo geral do presente trabalho foi realizar análise molecular de isolados de Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon obtidos de cães sintomáticos na cidade de Goiânia, Estado de Goiás, verificando assim qual a espécie e subespécie envolvida nas infecções. Para isto, foi realizado extração de DNA das amostras, seguido da realização de PCR com oligonucleotídeos genéricos. Após a PCR obteve-se fragmentos da região do 18S rRNA para as amostras de Babesia e Hepatozoon e do 16S rRNA para a pesquisa de espécies do gênero Ehrlichia. Os produtos de PCR obtidos foram purificados e utilizados para o sequenciamento. Foram seqüenciadas 35 amostras de Babesia spp. e destas 17 foram utilizadas para os estudos filogenéticos. Duas amostras de Hepatozoon spp. foram seqüenciadas e 17 amostras de Ehrlichia spp sendo que apenas cinco foram utilizadas para as análises. As análises de identidade realizadas com as amostras seqüenciadas permitiram a identificação de B. canis vogeli, Hepatozoon canis e Ehrlichia canis. Quando confrontadas com as espécies e subespécies de referência de outras regiões do Brasil e do mundo apresentaram estreita similaridade molecular, o que demonstra a baixa variabilidade entre as diferentes amostras de diferentes regiões geográficas. Pela análise feita utilizando-se o programa MEGA4 e subsequente construção de árvores filogenéticas as amostras deste estudo formaram grupos próprios sempre em associação com as amostras de referência para as respectivas espécies. Dessa forma foi possível concluir que as amostras de B. c. vogeli, H. canis e E. canis provenientes de cães da cidade de Goiânia-GO apresentam estreita similaridade com isolados de outras regiões do mundo.
Palavras chave: babesiose, hemoparasitos, ehrlichiose, filogenia, hepatozoonose, PCR.
xii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: Considerações Gerais..................................................................
01
CAPÍTULO 2: ESTUDO FILOGENÉTICO DE Babesia spp. EM CÃES
10
CAPÍTULO 3: CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Hepatozoon spp. PROVENIENTE DE CÃES SINTOMÁTICOS RESIDENTES EM AREA URBANA NA CIDADE DE GOIANIA GOIÁS, BRASIL.......................................
31
CAPÍTULO 4: CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis PRESENTE EM CÃES DE GOIÂNIA-GO................
48
CAPÍTULO 5: Considerações Finais...................................................................
65
1
CAPÍTULO 1
CONSIDERAÇÕES GERAIS
As hemoparasitoses de cães compõem um grupo de enfermidades de
grande importância na Medicina Veterinária, atingindo animais de diferentes
regiões do mundo. Seus vetores, os carrapatos, têm maior prevalência nas
regiões de clima tropical e subtropical. Na região Centro-Oeste do Brasil são
abundantes, o que favorece a ocorrência de altas taxas de incidência dessas
enfermidades e condiciona o caráter endêmico das mesmas na região (LOULY,
2007; LESCHNIK et al., 2008).
Em todo o mundo os cães domésticos são acometidos por
hemoparasitos, dentre eles os protozoários Babesia canis, Babesia gibsoni,
Theileria annae, e Hepatozoon canis, e as rickettssias Ehrlichia canis, Ehrlichia
ewingii, Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma platys, Anaplasma phagocitophilum,
Neorickettsia sennetsu e Neorickettsia risticii (GREENE, 2006).
No Brasil, os hemoparasitos com maior casuística são B. canis, E. canis
e H. canis, os quais são transmitidos por carrapatos, sendo responsáveis por
doenças caracterizadas por febre, anemia e inapetência (RUBINI et al., 2009;
SANTOS et al., 2009).
A B. canis e a B. gibsoni são as espécies mundialmente mais
prevalentes em casos naturais de babesiose canina. De acordo com HOSKINS
(1991) B. canis é um parasito do grupo das ―grandes babesias‖, sendo encontrada
sob as formas de merozoítos e trofozoítos, ou ainda assumindo formas
indiferenciadas que correspondem às diferentes fases do processo de divisão
binária. Os merozoitos da B. canis, medem em torno de 2,4µm x 5,0µm quando
observados microscopicamente e se apresentam aos pares, de um a oito, no
interior das hemácias. B. gibsoni é um parasito pequeno, com tamanho de 1,0µm
x 3,2µm, normalmente encontrado em formas isoladas no interior das hemácias.
A primeira descrição relativa à babesiose foi feita por Victor Babes, na
Romênia, no final do século XIX, quando observou microrganismos no sangue de
bovinos importados da África, que apresentavam hemoglobinúria e febre alta. O
organismo observado foi denominado Haematococus bovis. No ano de 1893,
2
Starcovicci reavaliou o parasito, denominando-o Babesia bovis em homenagem a
Babes (KUTTLER, 1988).
Neste mesmo ano, os pesquisadores Smith & Kilborne estudando o
agente da Febre do Texas, na América do Norte, diagnosticaram um agente
semelhante ao descrito por Babes, que posteriormente foi denominado Babesia
bigemina. Estes pesquisadores, pela primeira vez, estabeleceram a relação de
transmissão de um protozoário por carrapato, na ocasião, o Rhipicephalus
(Boophilus) annulatus. Assim, sucessivamente, foram descritas B. bovis, B.
bigemina, B. gibsoni, Babesia divergens, Babesia major, Babesia felis, Babesia
ovata, Babesia canis, entre outras (UILENBERG, 2006).
As babesioses têm importância mundialmente reconhecida, ora por
prejuízos econômicos nas criações de animais de produção, ora por causar
problemas de saúde a animais de companhia, e, em determinadas situações,
afetar também o homem. O maior número de casos registrados de babesiose em
humanos se deve a B. microti ocorrendo na América do Norte e B. divergens com
maior freqüência na Europa (KRAUSE et al., 2003).
E. canis, agente da Ehrlichiose Monocítica Canina, é uma bactéria
Gram-negativa que normalmente infecta as células mononucleares sanguíneas,
principalmente monócitos e linfócitos de cães, gatos e homem (DUMLER, et al.,
2007). São caracterizados como organismos pequenos, pleomórficos, cocóides
ou elipsoidais que ocorrem intracitoplasmaticamente de forma isolada ou
formando uma inclusão compacta (mórula) em leucócitos circulantes dos
hospedeiros vertebrados. As mórulas geralmente apresentam numerosos
organismos individuais (KRIEG & HOLT, 1984).
A primeira descrição de do gênero Ehrlichia foi feita em cães infestados
por carrapatos na Argélia, no ano de 1935, por Donatien & Lestoquard. A espécie
observada foi denominada Riquettsia canis, porém em 1945 o parasito foi
renomeado como Ehrlichia canis. Dentro do mesmo gênero foram observadas
posteriormente as espécies: Ehrlichia bovis, Ehrlichia ovina, Ehrlichia
phagocithophila, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia
ondiri, Ehrlichia platys, Ehrlichia risticii, E. chaffeensis e Ehrlichia muris (GREENE,
2006). A ehrlichiose por E. canis ganhou notoriedade no período da guerra do
Vietnam (1968-1970) quando grande número de cães foi acometido pelo parasito
3
adoecendo com sinais hemorrágicos severos, resultando em altos índices de
letalidade e mortalidade (RISTIC & HOLLAND, 1993).
Esta enfermidade tem grande importância na clínica de pequenos
animais e saúde pública, já que é responsável por um grande número de casos
de morbidade e óbitos de cães, sendo capaz também de acometer seres
humanos (GREENE, 2006). As espécies responsáveis pela enfermidade em seres
humanos são: A. phagocytophilum, E. chaffeensis, E. ewingii, E. canis, e N.
sennetsu. No entanto DUMLER et al., (2007) considera que apenas as três
primeiras espécies citadas são suficientemente investigadas. No Brasil os
primeiros casos de ehrlichiose humana foram registrados por CALIC et al. (2004)
e COSTA et al. (2007) com diagnóstico sorológico positivo para E.chaffensis em
indivíduos com sintomas sugestivos de ehrlichiose no estado de Minas Gerais.
Com relação ao gênero Hepatozoon duas espécies são conhecidas
como causadoras de doença nos cães o Hepatozoon canis e o Hepatozoon
americanum. Estes agentes apresentam duas fases de desenvolvimento, uma na
corrente sanguínea e outra nos tecidos do hospedeiro vertebrado. Na fase
sanguínea é possível observar os gametócitos que possuem forma elipsóide e
medem aproximadamente 11x4μm, são envolvidos em uma membrana bem fina e
geralmente se situam no centro do neutrófilo, comprimindo seu núcleo lobulado
contra a membrana celular. A análise morfológica não possibilita a diferenciação
entre as espécies (WANER et al., 1994).
Na fase tecidual o primeiro ciclo esquizogônico do H. canis ocorre na
parede intestinal dos cães. Dois tipos de merontes são formados, um contendo
macromerozoítos que dão origem a novas formas esquizogônicas, e outro,
contendo micromerozoítos, que originam os gametócitos circulantes após
penetrarem nos leucócitos. Os merontes maduros possuem de dois a quatro
grandes macromerozoítos ou mais de 20 micromerozoítos. Em infecções por H.
canis os merontes são mais observados em órgãos parenquimatosos, sendo
raramente encontrados na musculatura. Já nas infecções por H. americanum, os
merontes são principalmente encontrados nos músculos (MASSARD, 1979,
BANETH et al., 2003).
A primeira espécie de Hepatozoon foi observada em 1905 por Bentley
na Índia ao examinar células polimorfonucleares de cães seguida da descrição de
4
James no mesmo ano. A designação do nome Hepatozoon canis foi estabelecida
por Wenyon em 1910 (GREENE, 2006).
A hepatozoonose acomete cães e várias outras espécies de animais em
várias regiões do mundo, tendo sido descrita na Ásia, África, sul da Europa, e
Américas do Norte e Sul (EWING ET AL., 2000, SPOLIDORIO et al., 2009).
Estudos epidemiológicos no Brasil têm demonstrado taxas variadas de
prevalência em cães de vários estados, incluindo Rio de Janeiro, Espírito Santo,
Rio Grande do Sul, Minas Gerais e São Paulo (MASSARD, 1979; MUNDIN et al.,
1992; O‘DWYER et al., 2001; RUBINI et al., 2005).
O diagnóstico clínico das hemoparasitoses é quase sempre inconclusivo
quanto à doença específica uma vez que os cães parasitados apresentam sinais
gerais como febre, anemia, inapetência e prostração geralmente associados a
presença de carrapatos fixados nos animais parasitados.
O diagnóstico laboratorial das hemoparasitoses pode ser realizado por
exames diretos e indiretos. O método direto é o mais utilizado na rotina
diagnóstica e baseia-se na observação microscópica do parasito em esfregaço
sanguíneo do animal em lâmina devidamente fixada e corada com preparações
tinturiais com base Romanovsky, como o Giemsa, Wright, Leishman, Rosenfeld
ou Panótico (KEER, 2003). Os métodos indiretos baseiam-se principalmente em
exames sorológicos para pesquisa de anticorpos.
O exame microscópico direto é o método convencional empregado para
detecção destes parasitos nos animais, entretanto, nem sempre é conclusivo para
a diferenciação entre espécies ou subespécies morfologicamente semelhantes.
Além disso em infecções de fase crônica onde a parasitemia é baixa, o exame
microscópico pode oferecer baixa sensibilidade. Assim sendo, a partir da década
de 1990, houve um incremento expressivo na adoção de técnicas de biologia
molecular para a detecção e identificação precisa das espécies ou subespécies
de hemoparasitos, especialmente em condições de baixa parasitemia ou em
situações onde a morfologia não é conclusiva (ZAHLER et al., 1998).
Entre as técnicas de biologia molecular a mais utilizada é a reação em
cadeia da polimerase (PCR). Esta é uma técnica que apresenta especificidade e
sensibilidade elevadas, sendo capaz de detectar fragmentos-alvo do agente em
amostras de sangue ou em outro tipo de amostra clínica, estando ou não os
5
parasitos viáveis (LAUERMAN, 1998). A PCR é o método de diagnóstico mais
apropriado para a confirmação do diagnóstico de infecções na fase crônica da
enfermidade. Além disso, é capaz de identificar o agente envolvido na infecção
por espécie ou mesmo de subespécie (MARTIN et al., 2005).
Os avanços na utilização das técnicas moleculares têm implicações
importantes em muitas áreas da parasitologia, possibilitando maior
esclarecimento, identificação precisa do parasito e novas abordagens no controle
do parasitismo. Estudos que proporcionam a caracterização genética dos
microrganismos têm fornecido informações a respeito de taxonomia e filogenia
auxiliando nos estudos de ecologia, genética de populações e epidemiologia. As
técnicas moleculares dessa forma são ferramentas que suprem as limitações das
técnicas convencionais de diagnóstico, identificação e diferenciação de
microrganismos (GASSER, 2006).
Para o desenvolvimento de estudos sobre caracterização genotípica de
microrganismos frequentemente é utilizado o sequenciamento genético,
preferencialmente de genes que mantêm alto grau de conservação dentro do
gênero avaliado e que apresentem sequências de nucleotídeos longas. Na
realização de estudos evolutivos sobre Babesia e Hepatozoon tem sido
frequentemente utilizadas sequências do gene 18S rRNA e, nos parasitos do
gênero Ehrlichia, o gene 16S rRNA (CARRET et al., 1999, ALLSOPP &
ALLSOPP, 2006).
DUMLER et al. (2001), com base em estudos genéticos envolvendo
genes de proteínas de superfície e genes de choque térmico groESL,
reorganizaram o gênero Ehrlichia. Na nova classificação as espécies E.
phagocitophila, E. platys e E. bovis passaram a pertencer ao gênero Anaplasma e
a serem denominadas Anaplasma phagocitophilum, A. platys e A. bovis,
respectivamente. As espécies E. risticii e E. sennetsu, que anteriormente
pertenciam ao gênero Ehrlichia, foram incluídas no gênero Neorickettsia. Esse
trabalho mostra a importância dos métodos baseados em técnicas de biologia
molecular, identificação e classificação taxonômica de microrganismos.
Outro exemplo sobre a aplicação de técnicas moleculares no estudo de
hemoparasitos é o estudo realizado por NEIMARK et al. (2001). Os autores, após
o seqüenciamento do gene 16S rRNA das espécies dos gêneros
6
Haemobartonella e Eperythrozoon, realizaram análises das características
morfológicas, que permitiram a reclassificação das mesmas pela remoção da
ordem Rickettsiales para a classe Mollicutes. Dessa forma, os microrganismos
foram renomeados como Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemofelis,
Candidatus Mycoplasma haemominutum e Mycoplasma haemosuis.
Os estudos genéticos realizados com auxílio de técnicas moleculares
possibilitam não apenas a reclassificação de microrganismos como também o
desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico oferecendo ferramentas mais
seguras e de rápida execução. As informações obtidas podem ser utilizadas em
estudos de resistência a drogas, análise do metabolismo de microrganismos
patogênicos, variantes antigênicos, desenvolvimento de vacinas e ainda oferecem
respaldo ao confronto de informações de diferentes regiões do mundo, validando
assim os estudos realizados (ALLSOPP & ALLSOPP, 2006; CARRET et al., 2009)
A realização de estudos dessa natureza é necessária e importante para
gerar maior conhecimento científico sobre os hemoparasitos, podendo não
apenas contribuir para o esclarecimento da epidemiologia das enfermidades por
eles causadas aos animais domésticos como também trazer informações que
possam elucidar os possíveis riscos relativos à saúde animal e humana.
O objetivo geral do trabalho foi realizar estudo filogenético de isolados
de Babesia, Ehrlichia e Hepatozoon obtidos de cães com sintomatologia
compatível com hemoparasitose canina na cidade de Goiânia, Estado de Goiás.
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9
25. RUBINI, A.S.; PADUAN, K.S.; CAVALCANTE, G.G.; RIBOLLA, P.E.M.;
O‘DWYER, L.H. Molecular identification and characterization of canine Hepatozoon species from Brazil. Parasitology Research, v.97, p.91-93, 2005.
26. RUBINI, A.S., PADUAN, K.S., MARTINS, T.F., LABRUNA, M.B., O‘DWYER, L.H. Acquisition and transmission of Hepatozoon canis (Apicomplexa: Hepatozoidae) by the tick Amblyomma ovale (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, n.164, p. 324-327, 2009.
27. SANTOS, F., COPPEDE, J.S., PEREIRA, A.L.A., OLIVEIRA, L.P., ROBERTO, P.G., BENEDETTI, R.B.R., ZUCOLOTO, L.B., LUCAS, F., SOBREIRA, L., MARINS, M. Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp. in dogs from Ribeirao Preto, Brazil. Veterinary Parasitology. n.179, p.145-148, 2009.
28. SPOLIDORIO, M.G., LABRUNA, M.B., ZAGO, A.M., DONATELE, D.M., CALIARI, K.M., YOSHINARI. Hepatozoon canis infecting dogs in the state of Spirito Santo, southeastern Brazil. Veterinary Parasitology, n.163, p.357-361, 2009.
29. UILENBERG, G. Babesia - a historical overview. Veterinary Parasitology, v.138, p.3-10. 2006.
30. WANER, T.; BANETH, G.; ZUCKERMAN, A.; NYSKA, A. Hepatozoon canis: Size measurement of gametocyte using image analysis technology. Comparative haematology international, v.4, p.177-179, 1994.
31. ZAHLER, M., SCHEIN, E., RINDER, H., GOTHE, R. Characteristic genotypes discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and pathogenicity to dogs. Parasitology Research, v.84, p.544–548, 1998.
10
CAPÍTULO 2
ESTUDO FILOGENÉTICO DE Babesia spp EM CÃES.
SABRINA CASTILHO DUARTE1, JULIANA ALVES PARENTE2,
MARISTELA PEREIRA3, CÉLIA MARIA DE ALMEIDA SOARES3, GUIDO
FONTGALLAND COELHO LINHARES4
Laboratório de Doenças Parasitárias, Escola de Veterinária da UFG, Campus II Cx postal 131 CEP: 74001-970.
Goiânia – GO, Brasil. Telefone: (062) 3521-1595
email: [email protected]
1. Doutoranda em Ciência Animal-Sanidade Animal, UFG; 2. Doutora em Ciências Médicas pela UNB; 3. Professora do Instituto de Ciências Biológicas da UFG; 4. Professor Adjunto da Escola de Veterinária da UFG;
RESUMO O gênero Babesia é composto por protozoários que causam enfermidades denominadas babesioses. Clinicamente, cães infectados apresentam febre, anorexia, fraqueza, anemia hemolítica, icterícia, hemoglobinúria e choque, acompanhados por infecção intraeritrocitária. Os cães geralmente são acometidos por Babesia canis ou Babesia gibsoni, sendo a primeira classificada em subespécies B. c. canis, B. c. vogeli e B. c. rossi. No Brasil a principal espécie de Babesia que acomete cães domésticos é a B. canis vogeli. O objetivo desse trabalho foi realizar estudo filogenético de amostras de Babesia em cães na cidade de Goiânia, Goiás. Para o estudo, foram obtidas amostras de sangue de 890 cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Goiás, apresentando sinais clínicos compatíveis com a babesiose canina. Somente amostras que apresentavam parasitos intra-eritrocitários foram mantidas no estudo. Estas foram então submetidas a extração de DNA e amplificação de um fragmento do gene 18S rRNA pela PCR. Posteriormente foi feita purificação do produto de PCR para realização de sequenciamento. Foram sequenciadas 35 amostras e após o sequenciamento foi feita análise de qualidade de sequências e mantidas 17 amostras. A análise de similaridade fornecida pelo BLASTn demonstrou que todas as sequências deste estudo eram correspondentes a B. c. vogeli. Foi realizado o depósito das sequencias obtidas no GenBank como novas sequências para o gene 18S rRNA. Pela utilização do programa Mega4 foi possível verificar que as amostras de B. c. vogeli provenientes de cães da cidade de Goiânia apresentam alto grau de similaridade molecular com os isolados de referência para a mesma subespécie de outras regiões do Brasil e do mundo. Amostras de B. c. vogeli de cães da cidade de Goiânia formam grupo filogenético bem definido, juntamente com amostras de referência de B. c. vogeli de diferentes regiões geográficas.
Palavras chave: Babesiose canina, Babesia canis, caracterização molecular, dendogramas, filogenia
11
ABSTRACT
The genus Babesia is represented by protozoans that cause diseases known as babesiosis. Naturally infected dogs may show signs fever, anorexia, weakness, hemotyc anemia, jaundice, hemoglobinuria and shock, in the presence of intraerythrocytic infection. Dogs are commonly affected by Babesia canis or Babesia gibsoni. B. canis is indeed divided into the subspecies B. c. canis, B. c. vogeli and B. c. rossi. Among these, B. c. vogeli is the main organism that occurs in domestic dogs in Brasil. The objetive of the present paper was to conduct a phylogenetic study on Babesia isolates from dogs of Goiânia, Goiás. For this purpose blood samples were obtained from 890 dogs referred to the Veterinary Hospital of the Federal University of Goiás, presenting clinical signs resembling canine babesiosis. Only samples showing intraerythrocytic parasites in blood smears with typical morphological features were maintained in the study. These samples were then submitted to DNA extraction process and amplification of a fragment of the 18S rRNA by PCR. Subsequently, the PCR products were purified and sequenced. Sequences were obtained from 35 samples but only 17 of these were kept after quality analysis procedure. Comparative similarity analysis inferred by BLASTn demonstrated that all sequences of this study were correspondent to B. c. vogeli. The sequences have been deposited in the GenBank database as new sequences of the 18S rRNA. Applying Mega4 software it was confirmed that the isolates of B. c. vogeli from dogs of Goiânia are strongly similar to other reference isolates of the same subspecies from other regions of Brasil and worldwide. It was concluded that the isolates of B. c. vogeli of this study are clusted in the same clade of the phylogenetic tree together with reference isolates from other geographic regions of the world.
Keywords: Babesia canis, canine Babesiosis, molecular characterization, phylogeny
1.0 INTRODUÇÃO
De acordo com KUTTLER (1988), duas espécies do gênero Babesia
têm os canídeos como hospedeiros naturais, a B. canis e a B. gibsoni, ambas
com ampla distribuição geográfica. A B. canis lato senso é classificada em
subespécies, denominadas Babesia canis canis, Babesia canis vogeli e Babesia
canis rossi, com base em estudos de especificidade pelo vetor e diferenças
antigênicas demonstradas nos experimentos de imunidade cruzada e testes
sorológicos (UILENBERG et al., 1989). Entretanto outros autores verificaram
diferenças genotípicas entre estes organismos e defendem este critério para a
classificação taxonômica dos mesmos em espécies distintas (ZAHLER et al.,
1998).
12
Quanto à distribuição geográfica, B. canis tem diferentes ocorrências
considerando-se as subespécies descritas. Sabe-se que a B. c. rossi é de
ocorrência na África do Sul (UILENBERG et al., 1989) e Sudão (OYAMADA et al.,
2005), a B. c. canis é endêmica na Europa (UILENBERG et al., 1989; CACCIO et
al., 2002, CRIADO-FORNELLIO et al., 2003; FOLDVARI et al., 2005) e a B. c.
vogeli, é ocorrente no Norte da África, América do Norte (UILENBERG et al.,
1989), Europa (CACCIO et al., 2002, CRIADO-FORNELLIO et al., 2003), Austrália
(JEFFERIES et al., 2003, MARTIN et al., 2006), Sudão (OYAMADA et al., 2005),
Turquia (GULANBER et al., 2006) e América do Sul (PASSOS et al., 2005;
DUARTE et al., 2008). Já a B. gibsoni é predominantemente encontrada na Ásia,
África, América do Norte, Europa e Austrália com relato no Brasil (LOBETTI,
1998; CASAPULLA et al., 1998; KJEMTRUP et al., 2000; ANO et al., 2001;
INOKUMA et al., 2004, TRAPP et al., 2006).
No Brasil a principal espécie de Babesia que acomete cães domésticos
é a B. canis vogeli (PASSOS et al., 2005; DUARTE et al., 2008). Existem ainda
duas referências para a ocorrência de B. gibsoni no Brasil. A primeira descrição
foi feita por BRACCINI e colaboradores (1992), em um trabalho utilizando-se
esfregaço sanguíneo de cão importado presente no Rio Grande do Sul. Os
autores relataram a presença de B. gibsoni com base na referida amostra. O
segundo trabalho foi desenvolvido com técnicas de biologia molecular e foi
desenvolvido por TRAPP et al. (2006) no Paraná. Os autores sequenciaram
quatro isolados que apresentaram 100% de similaridade com B. gibsoni subtipo
Asia 1. Ambas espécies de Babesia podem ser transmitidas pelo R. sanguineus, o
qual apresenta ocorrência comum em cães no Brasil, principalmente nas áreas
urbanas (LABRUNA et al., 2001; FRANQUE et al., 2007).
O exame microscópico direto é o método convencional empregado para
detecção de Babesia nos animais, é um exame conclusivo para o diagnóstico de
fácil execução e baixo custo, entretanto, nem sempre é conclusivo para a
diferenciação entre espécies morfologicamente semelhantes, porém
geneticamente distintas como, por exemplo, B. microti e B. gibsoni (CARRET et
al., 1999). O mesmo é verificado quanto à discriminação entre as subespécies de
B. canis.
13
Com os avanços recentes do conhecimento na área de biologia
molecular, cada vez mais são empregadas técnicas moleculares como
ferramentas indispensáveis para estudos sobre a sistemática (UILENBERG,
2006). As análises genéticas têm permitido a caracterização filogenética destes
organismos, resultando na emergência de grupos, assim como proposições de
novas posições taxonômicas para muitas espécies (KJEMTRUP & CONRAD,
2006).
ZAHLER et al. (2000), por meio de análises do 18S rRNA, fizeram
caracterização genotípica de um pequeno piroplasma, isolado de cão com
babesiose clínica adquirida na Espanha, mais próxima filogeneticamente às
espécies Babesia microti, Babesia rodhaini e Theileria equi, quando comparada à
Babesia gibsoni. A este novo patógeno os autores atribuíram o nome de Theileria
annae. Posteriormente, CAMACHO et al. (2001) verificaram que a ocorrência
desta nova espécie era frequente no noroeste da Espanha.
Com esta metodologia, foi também confirmada a presença incomum de
T. equi em amostras de sangue de cães assintomáticos na Espanha (CRIADO-
FORNELIO et al., 2004) e a ocorrência de uma nova espécie de Babesia em cães
(nome científico não atribuído), pertencente ao grupo das grandes babesias,
porém filogeneticamente distinta das demais já conhecidas. Em relação à B.
gibsoni, estudos recentes demonstraram a existência de, pelo menos três
espécies filogeneticas distintas (BIRKENHEUER et al., 2004).
O pleomorfismo observado em diferentes espécies de Babesia nos
hospedeiros vertebrados, confrontado com os resultados de estudos de biologia
molecular, tem gerado controvérsias quanto à classificação com base morfológica
adotada anteriormente para a diferenciação entre espécies. Supõe-se atualmente
que algumas espécies de Babesia são menos específicas do que se acreditava e
é provável que as espécies sejam capazes de infectar um maior número de
hospedeiros do que anteriormente registrado (KJEMTRUP et al, 2006; GRAY,
2006; HASELBARTH et al., 2007, HUNFELD et al., 2008).
Dessa forma os estudos com base genética vêm se tornando
fundamentais ao conhecimento da história evolutiva dos organismos, de forma a
possibilitar a reconstrução da filogenia dos grupos. Assim, com a combinação dos
métodos moleculares e tradicionais é possível reconstruir modelos mais precisos
14
que reflitam de forma correta as relações entre os organismos do gênero Babesia
(UILENBERG, 2006).
O objetivo desse trabalho foi realizar estudo filogenético de amostras de
babesia em cães apresentando quadros clínicos compatíveis com babesiose
canina oriundos da cidade de Goiânia, Estado de Goiás.
2.0 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Local e período de coleta das amostras
As atividades foram executadas na Universidade Federal de Goiás
(UFG) entre janeiro a agosto de 2008 distribuídas, conforme as fases de
desenvolvimento, no Hospital Veterinário (HV), no Laboratório de Diagnóstico de
Doenças Parasitárias (LDDP) da Escola de Veterinária (EV) e no Laboratório de
Biologia Molecular (LBM) do Instituto de Ciências Biológicas (ICB).
2.2 Seleção das amostras
Para o estudo, foram obtidas amostras de sangue, colhidas com EDTA
(Anticoagulante Universal, Doles), de 890 cães sintomáticos atendidos no Hospital
Veterinário da Universidade Federal de Goiás, apresentando sinais clínicos
compatíveis com a babesiose canina. Foram consideradas como amostras
positivas as que apresentavam parasitos intra-eritrocitários com características
morfológicas típicas de babesídeos, conforme parâmetros descritos por HOSKINS
(1991). A identificação morfológica foi realizada pelo exame microscópico de
esfregaços sanguíneos delgados, corados pelo Giemsa.
2.3 Extrações de DNA
As amostras de sangue, correspondentes aos esfregaços sanguíneos
positivos, foram submetidas ao processo de extração de DNA, empregando-se kit
comercial (GFX-Genomic Blood DNA Purification Kit®, Amersham Biosciences).
Os procedimentos para a extração foram realizados de acordo com as instruções
do fabricante, adotando-se o protocolo indicado para a extração a partir do
volume de 200 µL de sangue. Os eluatos obtidos no final das extrações foram
armazenados a -20 oC para posteriormente serem utilizados nas reações de PCR.
15
2.4 Oligonucleotídeos utilizados para amplificação do fragmento do 18S rRNA
Foram selecionados oligonucleotídeos gênero-específicos (Babesia
spp.) com o objetivo de se obter produtos da amplificação de uma sequência alvo
do gene 18S rRNA por PCR. Inicialmente, foram selecionadas sequências
depositadas em banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
codificantes para as seguintes espécies e subespécies do gênero Babesia, com
seus respectivos números de acesso: B. canis vogeli (AY072925), B. canis canis
(AY072926), B. canis rossi (L19079), B. gibsoni (AF231350), B. bovis (L31922), B.
bigemina (X59604) e B. equi (Z15105).
Em seguida, as sequências foram submetidas ao alinhamento múltiplo
de Clustal W (THOMPSON et al., 1999), através do software Megalign
(LaserGene, DNAStar, Inc.). O par de oligonucleotídeos gênero-específico foi
selecionado a partir de regiões conservadas do gene, de acordo com critérios
técnicos recomendados por LISBY (1999) e UNIVERSITY OF NEBRASKA (2007).
Após a seleção, os oligonucleotídeos foram submetidos à avaliação de
similaridade com as sequências do GenBank, utilizando-se o algoritmo BLASTN®
(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotides) (ALTSCHUL et al., 1990). As
sequências que apresentaram a identidade esperada para o gênero foram
sintetizadas (Prodimol – IDT), sob as designações Bab7 (sense) e Bab9 (anti-
sense).
2.5 Reações de PCR
As amostras de DNA total, extraídas dos respectivos amostras de
Babesia spp., foram submetidas ao processo de amplificação enzimática para a
obtenção de fragmentos-alvo gênero-específicos, por PCR.
Os ensaios de PCR foram realizados em volume de 50 µL com as
seguintes concentrações de reagentes: 1x de Tampão para PCR (PCR buffer
10X, Invitrogen), 2,0 mM de Cloreto de Magnésio (MgCl2) (Invitrogen); 0,2 mM de
dNTP (Amersham Biosciences); 10 pM do oligonucleotídeo sense (Bab7); 10 pM
do oligonucleotídeo antisense (Bab9); 1,25U de Taq DNA polimerase (Taq DNA
Polymerase 5 U/µL, Invitrogen) e 5 µL do DNA genômico extraído da amostra
conforme descrito anteriormente. O processo de amplificação foi realizado em
16
termociclador (Mastercycler Personal, Eppdendorf) programado para um ciclo
inicial de 94 oC por 2 min., seguido de 35 ciclos repetidos de 94 oC por 30 seg.,
56º por 30 seg. e 72 oC por 1 min. A programação era finalizada com 2 min. a
72oC para maximizar o processo de extensão.
Como controle positivo representativo do gênero Babesia nas reações
de PCR, foi utilizada amostra de DNA genômico de referência para B. canis vogeli
obtida no LDDP/EV/UFG, de acordo com DUARTE et al. (2008).
Os produtos de amplificação (10 µL) foram submetidos à eletroforese a
90 volts, durante 60 min, em gel de agarose 1,5% (Agarose NA – Amersham
Biosciences) e tampão TBE 1x. Como marcador de massa molecular foi
empregado o DNA Ladder 100 pb (Invitrogen).
Após as corridas, os géis foram corados por imersão em solução de
brometo de etídio (0,4 µg/mL) por 10 min. A visualização foi feita em aparelho
transiluminador de UV (Electronic UV Transilluminator, Ultra-Lum), em ambiente
escuro e a documentação fotográfica dos resultados das eletroforeses foi
efetivada em equipamento fotodocumentador de géis (Vilber Lourmat).
2.6 Purificações e sequenciamento das amostras
Para a obtenção dos fragmentos puros de DNA, os produtos de PCR
foram extraídos e purificados utilizando-se o kit comercial (QIAquick Gel
Extraction Kit Protocol, Qiagen), conforme recomendações do fabricante. Após a
identificação, as amostras foram refrigeradas e imediatamente encaminhadas
para a realização do sequenciamento.
Os produtos de PCR purificados, obtidos com as reações gênero
específicas empregando-se os oligonucleotídeos Bab7 e Bab9, foram submetidos
ao sequenciamento automático utilizando-se sequenciador automático
MegaBACE1000 (GE Healthcare). Para este processo foi utilizado o método da
incorporação de dideoxi (ddNTP), empregando-se o DYEnamic ET dye
terminator kit MegaBACE (GE Healthcare ). As sequências obtidas foram
analisadas pelo programa Phred e somente aquelas que apresentaram índice
igual ou superior a 20 foram mantidas no estudo.
17
2.7 Análise de similaridade
As sequências correspondentes aos produtos de PCR obtidos com os
oligonucleotídeos Bab7 e Bab9 dos isolados regionais foram submetidas ao
BLASTN para confirmação da identidade das sequências e, em seguida
analisadas quanto à porcentagem de identidade, empregando-se o método de
múltipla progressão de Clustal W (THOMPSON et al., 1999) por meio do
programa MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis – Software Version
4; TAMURA et al., 2007). A análise de identidade foi, ainda, realizada
comparando-se os isolados obtidos neste estudo com as sequências de
referência para espécies ou subespécies depositadas no GenBank.
2.8 Análises filogenéticas
Para o estudo filogenético foi construído dendograma incluindo as
sequências parciais do gene 18S rRNA dos diferentes isolados regionais obtidos
neste estudo e as seguintes sequências de referência para outras espécies de
piroplasmas, de diferentes regiões geográficas, com seus respectivos números de
acesso no GenBank: B. c. vogeli (Egito: AY371297, Austrália: AY102163, Japão:
AB083374, Brasil: AY371196, Venezuela: DQ297390, Argentina: EU362993,
EUA: AY371198 França: AY072925, Espanha: AY150061, Turquia: AM183215);
B. canis rossi: L19079 e DQ111760, B. canis canis: AY072926 e AY611729, B.
canis presentii: AY649326; B. gibsoni Asia-1 e Asia 2: AF175300 e AF175301, T.
annae: AF188001; B. equi: DQ287951, B. microti: U09833, B. conradae:
AF158072, Theileria annulata: EU083801 e Plasmodium falciparum: M19172. A
sequência do 18S rRNA de P. falciparum foi incluída na árvore como um
organismo filogeneticamente mais distante para utilização como espécie raiz na
construção da árvore filogenética.
A árvore filogenética foi construída pelo método neighbor-joining, com
bootstrap de 1.000 replicatas e parâmetros de distância evolutiva ajustados pela
substituição Kimura 2-parâmetros, a partir do alinhamento das sequências pelo
método Clustal-N. Para esta finalidade foi utilizado o programa MEGA4 para a
construção da árvore (http://www.megasoftware.net).
18
3.0 RESULTADOS
3.1 Amostras obtidas
No período de realização do estudo foram obtidos 35 amostras com
características morfológicas típicas de piroplasmas, os quais foram identificados
pela demonstração de formas parasitárias intra-eritrocitárias correspondentes a
trofozoítos e/ou merozoítos de babesídeos, avaliados ao exame microscópico dos
esfregaços sanguíneos, conforme HOSKINS (1991).
3.2 Determinação da especificidade analítica dos oligonucleotídeos
A partir do alinhamento realizado com as sequências do gene 18S rRNA,
foram desenhados os oligonucleotídeos Bab7 sense, gênero-específico, contendo
21 nucleotídeos, localizado em uma região conservada, das posições 619-639 do
alinhamento e o Bab9 antisense, gênero-específico, de 22 oligonucleotídeos,
localizado em uma região conservada, das posições 1091-1112. Análises de
similaridade realizadas pelo programa BLASTN confirmaram a especificidade
para os oligonucleotídeos Bab7 e Bab9 ao nível do gênero Babesia. A
temperatura de anelamento (Ta) para estes oligonucleotídeos foi calculada em
56ºC. A seqüência dos iniciadores consta no Quadro 1.
QUADRO 1 - Iniciadores selecionados para a amplificação de fragmentos gênero-
específicos de sequências localizadas no gene 18S de Babesia sp, pela PCR.
Especificidade analítica
Oligo Sequências Posição no alinhamento
Ta (°C)
Babesia sp. Bab7 5´-GGC TAC CAC ATC TAA GGA AG-3´ 619-639 55
Babesia sp. Bab9 5´-CTA AGA ATT TCA CCT CTG ACA G-3´ 1091-1112 57
Ta = temperatura de anelamento.
19
3.3 Amplificação do 18S rRNA
Empregando-se o par de oligonucleotídeos Bab7/Bab9, foram obtidos
produtos de amplificação das 35 amostras de piroplasmas, com tamanho de 490
pb do gene 18S rRNA de Babesia sp. (Figura 1).
As amostras que apresentaram bandas de baixa intensidade foram
desprezadas por serem considerados produtos de menor qualidade para o
sequenciamento. As demais amostras mantidas no estudo (n= 29) geraram
bandas nítidas do tamanho correspondente ao fragmento esperado, sem
amplificações inespecíficas.
Figura 1: Eletroforese dos produtos de PCR de 490 pb amplificados a partir do DNA de Babesia sp. das amostras obtidos de cães procedentes da cidade de Goiânia, Goiás. 1- controle positivo; linhas 2 a 8: amostras B. canis GO 1 a 07; linha 09: controle negativo.
3.4 Sequências e caracterização molecular das amostras de Babesia sp.
Após o sequenciamento dos 35 produtos de PCR purificados, 17
amostras apresentaram sequências de tamanhos de 269 nucleotídeos e valores
de Phred igual ou superior a 20. Estas foram então utilizadas nas análises
filogenéticas. Com base na análise de similaridade fornecida pelo algoritmo
BLASTn foi verificado que todas as sequências deste estudo (n=17) eram
correspondentes a Babesia canis vogeli. As amostras obtidas neste estudo foram
490pb
20
então depositados no GenBank como novas sequências para o gene 18S rRNA
sob os números GU386266, GU386267, GU386268, GU386269, GU386270,
GU386271, GU386272, GU386273, GU386274, GU386275, GU386276,
GU386277, GU386278, GU386279, GU386280, GU386281 e GU386282.
Todas as sequências, com exceção do isolado B. c. vogeli GO 04,
apresentaram 100% de identidade entre as mesmas. O isolado B. c. vogeli GO 04
foi 99,60% similar aos demais, sendo que a diferença se evidenciou por apenas
uma substituição (de A por G) na posição 128 do alinhamento (Quadro 2).
As amostras B. c. vogeli GO 01 a 03 e 05 a 17 apresentaram 100% de
identidade com os isolados provenientes da Austrália, Brasil, Japão e Venezuela.
Ainda nesta mesma análise as sequências da África do Sul, da Argentina, dos
Estados Unidos (EUA) e da França apresentaram 99,60% de identidade,
demonstrando apenas uma substituição de nucleotídeo. Nas demais sequências,
apesar de manterem alta percentagem de identidade (99,20%) foram verificadas
duas substituições (Quadro2).
No Quadro 2 são apresentados os dados referentes ao polimorfismo dos
nucleotídeos, entre as sequências parciais do gene 18S rRNA das amostras
obtidos neste estudo e outras 10 amostras representativas da subespécie B. c.
vogeli de outras regiões geográficas. Considerando-se que as sequências de
todos as amostras regionais deste estudo, com exceção da B. c. vogeli GO 04,
eram 100% idênticas, optou-se por incluir apenas a sequência B. c. vogeli 01 no
Quadro 2.
21
Quadro 2 - Comparação das sequências do gene 18S rRNA de B. canis vogeli provenientes de Goiânia–GO, Brasil, com outras sequências de diferentes regiões geográficas, tendo como base a numeração das posições polimórficas do fragmento de 271 pb do genótipo B. c. vogeli GO 01.
Genotipos/amostras Acesso
GenBank Identidade
a (%)
Polimorfismo na posição dos nucleotídeos 31 128 142 175 212
B. c. vogeli GO 01 GU386266 - A A T T T
B. c. vogeli GO 04
África do Sul
GU386269
AF548006
99,60
99,60
•
•
G*
G*
•
•
•
•
•
•
Argentina EU362993 99,60 C* • • • •
Austrália AY102163 100,00 • • • • •
Brasil AY371196 100,00 • • • • •
Egito AY371197 99,20 • • C* C* •
Espanha AY150061 99,20 C* • • • A*
EUA AY371198 99,60 C* • • • •
França AY072925 99,60 C* • • • •
Japão AB083374 100,00 • • • • •
Turquia AM183215 99,20 • • C* C* •
Venezuela DQ297390 100,00 • • • • •
(•): indica nucleotídeo conservado, (*): indica substituição, a: porcentagem de identidade da sequência de 269 pb
alinhada pelo ClustalW.
3.5 Análise filogenética das amostras de Babesia sp.
A árvore filogenética gerada pelo confronto entre as sequências
parciais do gene 18S rRNA das amostras regionais B. c. vogeli GO 01 e B. c.
vogeli GO 04 com as sequências correspondentes de referência para outras
espécies de piroplasmas, incluídas nesta análise, revelou que: (1) as espécies de
piroplasmas ficaram divididas em dois ―clados‖ distintos. O primeiro (bootstrap =
99%) foi formado pelas espécies e/ou subespécies: B. c. vogeli, B. c. canis, B.
gibsoni e B. c. rossi. O outro ―clado‖ (bootstrap = 74%) foi composto pelas
espécies B. microti, B. conradae e os theilerídeos T. annae, T. equi e T. annulata;
(2) as amostras B. c. vogeli GO 01 e GO 04 formaram agrupamento bem definido
juntamente com as cepas de referência para B. c. vogeli de outras regiões
geográficas incluídas nesta análise molecular. Esta relação filogenética foi
sustentada pelo alto índice de bootstrap para o algoritmo neighbor-joining (Figura
2); (3) o isolado B. c. vogeli GO 04 se caracterizou como um ramo (branch) ligado
à cepa B. c. vogeli da África do Sul (bootstrap = 64%); (4) B. canis presentii e B. c.
canis foram as espécies de babesídeos que apresentaram relação filogenética
mais distante as amostras B. c. vogeli GO 01 e B. c. vogeli GO 04 (bootstrap =
85%), seguidos por B. gibsoni (bootstrap = 99%) e B. c. rossi (bootstrap = 99%);
22
(5) B. conradae, T. equi, T. annulata, B. microti e T. annae formaram um ―clado‖
independente do grupo dos babesídeos, demonstrando assim maior distância
filogenética em relação as amostras deste estudo.
O resultado obtido nessa análise filogenética para o isolado B. c. vogeli
GO 01 deve ser considerado como válido também para as amostras 02, 03, e de
05 a 17, uma vez que os mesmos são 100% idênticos, como foi demonstrado
anteriormente na análise de porcentagem de similaridade e polimorfismo das
amostras.
B. c. vogeli Espanha (AY150061)
B. c. vogeli EUA (AY371198)
B. c. vogeli Argentina (EU362993)
B. c. vogeli Franca (AY072925)
B. c. vogeli Brasil (AY371196)
B. c. vogeli Australia (AY102163)
B. c. vogeli Egito (AY371197)
B. c. vogeli Turquia (AM183215)
B. c. vogeli Venezuela (DQ297390)
B. c. vogeli GO 01 (GU386266)
B. c. vogeli Japao (AB083374)
B. c. vogeli Africa do Sul (AF548006)
B. c. vogeli GO 04 (GU386269)
B. canis subsp. presentii (AY649326)
B. c. canis (AY072926)
B. c. canis (AY611729)
B. gibsoni Asia-1 (AF175300)
B. gibsoni Asia-2 (AF175301)
B. c. rossi (DQ111760)
B. c. rossi (L19079)
Babesia equi (DQ287951)
Theileria annulata (EU083801)
B. conradae (AF158702)
B. microti (U09833)
T. annae (AF188001)
Plasmodium falciparum (M19172)
98
89
50
74
99
99
99
68
85
92
64
63
64
87
Figura 2: Árvore filogenética construída a partir de fragmentos parciais do gene
18S rRNA de amostras regionais de Babesia sp. e sequências de referência
obtidas no GenBank (www.nvbi.nlm.nih.gov) pelo método neighbor-joining com
bootstrap = 1000. Os números de acesso das sequências estão listados na figura.
23
4.0 DISCUSSÃO
O exame parasitológico direto foi realizado como método de triagem com
o intuito único de confirmar a presença de babesídeos nas amostras de sangue
selecionadas para os estudos moleculares. O parâmetro morfológico se restringiu
à identificação das formas parasitárias típicas de piroplasmas, uma vez que a
morfologia pode ser inconclusiva para identificar a espécie de Babesia envolvida
na infecção, fato já mencionado por BIRKENHEUER et al. (2004), PASSOS et al.
(2005), ALLSOPP & ALLSOPP (2006) e DUARTE et al. (2008) e atribuído ao
pleomorfismo deste protozoário.
Os resultados alcançados com os testes de especificidade para os
oligonucleotídeos BAB7/BAB9 deram suporte para validar os ensaios de PCR
com os pares de oligonucleotídeos desenhados neste estudo como protocolos
confiáveis para amplificações gênero-específicas por PCR para o gênero Babesia
sp. Pela utilização destes oligonucleotídeos foi possível obter o fragmento
correspondente ao gene 18S rRNA com tamanho de fragmento de
aproximadamente 490pb.
A análise de similaridade entre as sequências das 17 amostras obtidas
neste estudo e as sequências disponibilizadas no GenBank revelaram
similaridade com o gene 18S rRNA de B. c. vogeli. Esta similaridade variou entre
99,2 a 100%. Dessa forma, os resultados confirmaram afiliação entre as amostras
obtidas e avaliadas neste estudo com as sequências de B. c. vogeli de outras
regiões do mundo o que pôde ser demonstrado também pela árvore filogenética
do tipo neighbor-joining.
As amostras deste estudo apresentaram estreita similaridade nas
comparações com isolados brasileiros e também com os provenientes de outras
regiões do mundo. Entende-se que novos genes devem ser pesquisados visando
uma abordagem que possa validar essa similaridade já que estudos envolvendo
outros organismos têm demonstrado variabilidade em isolados de diferentes
regiões do mundo (EIRAS, et al., 2008, BURLINI et al., 2009).
Os resultados aqui alcançados são equivalentes aos obtidos por
PASSOS et al. (2005) quanto a similaridade das amostras do Brasil e Japão.
Estudos conduzidos na Turquia por GULANBER et al (2006) comprovaram
também que o isolado B. c. vogeli daquele país apresenta 100% de similaridade
24
aos isolados do Egito e 99% de similaridade aos isolados do Brasil, Japão, França
e Espanha, observando diferenças de uma a quatro substituições. Portanto, a
maioria dos estudos sobre filogenia de B. c. vogeli realizados no País e em outras
partes do mundo corrobora os resultados apresentados no presente estudo.
EIRAS et al. (2008) concluíram que os isolados de B. c. vogeli
argentinos são distantes dos isolados das regiões do Brasil e Venezuela. Porém,
estes autores consideraram insuficiente o número de amostras avaliadas em sua
pesquisa para obtenção de conclusões definitivas. Entretanto, neste estudo a
sequência Argentina EU362993 depositada no GenBank por EIRAS et al. (2008)
agrupou-se em um ―clado‖ com as cepas da Espanha, França e EUA e
demonstrou estreita proximidade filogenética com as cepas brasileiras. Ressalta-
se que como cepas brasileiras foram consideradas a cepa publicada por PASSOS
et al. (2005) e as amostras apresentadas neste trabalho.
No presente trabalho foi realizado sequenciamento de 17 amostras. A
análise simultânea destas amostras confirmou a alta similaridade observada entre
as amostras regionais e permitiu diferenciação entre as outras espécies de
babesídeos e theilerídeos confrontadas no estudo.
No Brasil há registros anteriores que comprovaram, por meio de
técnicas moleculares, a ocorrência de B. c. vogeli no País. PASSOS et al (2005)
demonstraram similaridade entre as sequências do gene 18S rRNA entre quatro
amostras oriundas do estado de Minas Gerais e uma amostra proveniente de um
cão do estado de São Paulo, com porcentagem de identidade entre 99,4 a 100%.
DE SÁ et al. (2006) realizaram a caracterização molecular de B. c. vogeli em
estudos com RFLP-PCR utilizando amostras do Rio de Janeiro e DUARTE et al.
(2008), identificaram B. c. vogeli ao realizarem diagnóstico molecular de 30
amostras da cidade de Goiânia-GO empregando ensaio de PCR subespécie-
específico. Os resultados das análises moleculares apresentados neste trabalho
representam uma contribuição para o conhecimento da etiologia e distribuição
geográfica da babesiose canina no País, uma vez que comprova, em estudo
independente, a presença de B. c. vogeli entre isolados brasileiros, assim como
documentado anteriormente para amostras de Minas Gerais, São Paulo, Rio de
Janeiro e Goiás.
25
As subespécies B. c. canis, com distribuição geográfica conhecida na
Europa e B. canis rossi na África do Sul e Sudão (UILENBERG et al., 1989)
não foram identificadas entre as amostras deste trabalho, corroborando os
resultados obtidos por outros estudos realizados com isolados obtidos na América
do Sul (PASSOS et al., 2005; DUARTE et al., 2008).
TRAPP et al. (2006) encontraram, pela amplificação do gene SSU rRNA
e análise por sequenciamento, a espécie B. gibsoni, no Brasil, que até então só
havia sido relatada por identificação morfológica por BRACCINI et al., (1992). O
presente trabalho representa o primeiro estudo filogenético de amostras de
Babesia de origem canina desenvolvido no estado de Goiás. Nenhuma das
amostras caracterizadas no presente trabalho foi identificada como B. gibsoni, no
entanto, entende-se que há necessidade de realização de novas pesquisas, as
quais poderão avaliar um número maior de amostras oriundas do município de
Goiânia, assim como de outras regiões do estado de Goiás.
Além das espécies B. canis lato senso e B. gibsoni, reconhecidas
mundialmente como parasitos naturais dos canídeos (UILENBERG et al., 1989),
outros piroplasmas têm sido incriminados como agentes etiológicos de
hemoparasitoses em cães como T. annae (ZAHLER et al., 2000), B. microti
(ZAHLER et al., 2000, CAMACHO et al., 2001), B. conradae
(BIRKENHEUER et al., 2004) e T. equi (CRIADO-FORNELIO et al., 2004),
entretanto, nenhuma destas espécies foi identificada entre as amostras deste
trabalho.
A maioria dos estudos desenvolvidos no Brasil baseia-se em prevalência
sorológica, os quais evidenciam a ampla distribuição geográfica e a importância
da babesiose canina. No entanto, considerando-se a extensão territorial do País
os trabalhos de biologia molecular são ainda em pequeno número. Há, portanto, a
necessidade do incremento de pesquisas desta natureza, para contribuir com o
melhor conhecimento da identidade taxonômica precisa dos microrganismos
envolvidos nesta enfermidade, das diferentes regiões do País.
26
5.0 CONCLUSÃO
O sequenciamento parcial de fragmentos do gene 18S rRNA e as
análises de similaridade confirmam a identidade molecular de Babesia canis
vogeli entre amostras obtidas de cães na cidade de Goiânia.
As amostras de B. c. vogeli provenientes de cães da cidade de Goiânia
apresentam alto grau de similaridade molecular e formam grupo filogenético bem
definido com as amostras de referência para a mesma subespécie de outras
regiões do Brasil e do mundo.
AGRADECIMENTOS: Esse trabalho contou com o suporte financeiro do CNPq.
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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31
CAPÍTULO 3
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Hepatozoon spp. PROVENIENTE DE CÃES SINTOMÁTICOS RESIDENTES EM AREA URBANA NA CIDADE DE
GOIANIA GOIÁS, BRASIL
SABRINA CASTILHO DUARTE1, JULIANA ALVES PARENTE2,
OSVALDO JOSÉ DA SILVEIRA NETO3, CARLA CRISTINA BRAZ LOULY4,
CÉLIA MARIA DE ALMEIDA SOARES5; GUIDO FONTGALLAND COELHO
LINHARES5
Laboratório de Doenças Parasitárias, Escola de Veterinária da UFG, Campus II Cx postal 131 CEP: 74001-970.
Goiânia – GO, Brasil. Telefone: (062) 3521-1595 email: [email protected]
1. Doutoranda em Ciência Animal-Sanidade Animal, UFG; 2. Doutora em Ciências Médicas pela UNB; 3. Mestrando em Ciência Animal-Sanidade Animal, UFG;; 4. Pós doutoranda da UFG, PNPD CAPES; 5. Professora do Instituto de Ciências Biológicas da UFG; 6. Professor Adjunto da Escola de Veterinária da UFG;
RESUMO Existem mais de 300 espécies conhecidas no gênero de Hepatozoon que ocorrem em diferentes espécies de vertebrados. Entre estas apenas duas Hepatozoon canis e Hepatozoon americanum são conhecidas como causadoras de doença nos cães. Para o diagnóstico laboratorial diferentes métodos podem ser utilizados. O mais utilizado é o exame parasitológico direto, pela observação de formas parasitárias em esfregaços sanguíneos. O emprego de técnicas moleculares como a reação em cadeia de polimerase (PCR) tem sido intensificado nos últimos anos. O objetivo desse trabalho foi realizar estudo filogenético de amostras de Hepatozoon em cães de Goiânia, Goiás. Para o estudo, foram obtidas amostras de sangue de 40 cães sintomáticos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Goiás. Utilizando-se o exame parasitológico direto dentre as amostras estudadas apenas duas foram positivas para Hepatozoon. Estas foram então submetidas a extração de DNA e a amplificação de um fragmento do gene 18S rRNA pela PCR. Ambas apresentaram resultados positivos na PCR. Posteriormente foi feita purificação dos dois produtos de PCR para realização de sequenciamento. As sequencias foram submetidas a análises de similaridade pelo algoritmo BLASTn que demonstrou a identidade das mesmas correspondentes a espécie Hepatozoon canis. Foi realizado então o depósito das sequencias no GenBank como novas sequências para o gene 18S rRNA. Pela utilização do programa Mega4 foi possível verificar que as amostras de H. canis provenientes de cães da cidade de Goiânia apresentam alto grau de similaridade molecular com os isolados de referência para a mesma espécie de outras regiões do Brasil e do mundo, formando grupo filogenético bem definido, juntamente com amostras de referência de diferentes regiões geográficas. Palavras chave: Canis familiaris, Epidemiologia molecular, filogenia, Hepatozoon canis, Hepatozoonose.
32
ABSTRACT There are more than 300 species described in the genus Hepatozoon that occur in different vertebrates. Among these only Hepatozoon canis and Hepatozoon americanum are regarded to cause diseases in dogs known as canine hepatozoonosis. Different methods may be used for laboratory diagnosis. The most common is the direct parasitologic examination of parasites stages in blood smears. The use of molecular techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) has been largely incresed in the last decade. The objective of this experiment was to realize a phylogenetic study on Babesia isolates from dogs of Goiânia, Goiás. Firstly, blood samples were obtained from 40 syntomatic dogs referred to the Veterinary Hospital of the Federal University of Goiás. Among these only two samples were positive for Hepatozoon spp. by the direct parasitologic method. These samples were then submitted to DNA extraction process and amplification of a fragment of the 18S rRNA by PCR. Both samples were PCR positive. Subsequently, the PCR products of each sample were purified and sequenced. The sequences obtained were then analysed for similarity by BLASTn algorithm which identified both sequences of this study as Hepatozoon canis. The sequences were deposited in the GenBank database as new sequences of the 18S rRNA. Applying Mega4 software it was confirmed that the these isolates of H. canis from dogs of Goiânia are similar to other reference isolates of the same species from other regions of Brasil and worldwide. It was concluded that the isolates of H. canis of this study are clusted in the same clade of the phylogenetic tree together with reference isolates from other geographic regions of the world. Keywords: Canis familiaris, Hepatozoon canis, hepatozoonosis, molecular epidemiology, phylogeny
1.0 INTRODUÇÃO
A primeira espécie relacionada ao gênero Hepatozoon foi observada em
1905 por Bentley na Índia ao examinar células polimorfonucleares de cães. No
mesmo ano, ainda na Índia, James observou o protozoário no citoplasma de
leucócitos de sangue periférico de seis cães e o classificou como Leucocytozoon
canis. Wenyon, em 1910, revendo as observações de Bentley e James, sugeriu
que o nome genérico Leucocytozoon fosse substituído por Hepatozoon
(GREENE, 2006).
Atualmente, são conhecidas mais de 300 espécies no gênero
Hepatozoon em diferentes vertebrados, incluindo anfíbios, répteis, marsupiais,
aves e mamíferos, tendo na sua transmissão diferentes vetores, entre eles
carrapatos, piolhos, mosquitos, flebótomos, mosca Tsé-tsé, pulgas, ácaros e
triatomíneos (METZGER et al., 2008). Duas espécies são reconhecidas como
33
causadoras de doença nos cães, Hepatozoon canis e Hepatozoon americanum.
H. canis é um parasita que acomete cães em diversas regiões com maior
prevalência na África, Ásia e no sul da Europa; enquanto H. americanum é a
espécie que infecta cães no sul dos Estados Unidos (BANETH & SHKAP, 2003).
No Brasil, a hepatozoonose por H. canis foi reportada pela primeira vez
por MASSARD (1979) em cães da cidade do Rio de Janeiro. Posteriormente
relatos semelhantes foram registrados nos Estados de São Paulo (O‘DWYER et
al., 1997), Minas Gerais (MUNDIN et al., 1992), e Distrito Federal (PALUDO et al.,
2005).
O carrapato Rhipicephalus sanguineus é reconhecido como espécie
vetora de H. canis em várias partes do mundo. No entanto no Brasil apenas
Amblyomma ovale teve esta condição comprovada em estudos experimentais
(FORLANO et al., 2005; RUBINI et al., 2009).
A infecção nos cães por H. canis pode variar de subclínica, com baixa
parasitemia a uma doença grave com risco à vida do animal, principalmente em
filhotes ou animais imunossuprimidos (ELIAS & HOMANS, 1988; HERVAS et al.,
1995).
O método de diagnóstico de H. canis realizado rotineiramente se
fundamenta na identificação microscópica de gametócitos intra-leucocitários em
esfregaço de sangue periférico corados pelo Giemsa (IBRAHIM et al., 1989;
BANETH & WEIGLER, 1997). O gametócito deixa rapidamente o leucócito após
a colheita do sangue, principalmente pelo contato do sangue com o
anticoagulante EDTA, podendo dificultar o seu encontro nos esfregaços
sanguíneos (VINCENT-JOHNSON et al., 1997).
O desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico como a reação em
cadeia da polimerase (PCR) proporcionam avanço nas pesquisas em relação à
detecção e identificação das espécies de Hepatozoon de cães, assim como
também têm auxiliado na classificação taxonômica destes e de outros agentes
infecciosos. A PCR também auxilia na detecção de novas cepas ou variantes de
espécies e permite a detecção precoce de infecção (PERKINS & KELLER., 2001).
Os primeiros estudos envolvendo espécies de Hepatozoon e técnicas
moleculares começaram na década de 90. Espécies de Hepatozoon que infectam
serpentes foram geneticamente caracterizadas. Somente a partir do ano 2000
34
iniciaram-se os estudos filogenéticos envolvendo a caracterização molecular de
espécies de Hepatozoon que acometem a espécie canina (BANETH et al., 2000;
MATHEW et al., 2000; INOKUMA et al., 2002).
No Brasil, diferentes estudos envolvendo análises moleculares têm
comprovado a presença de H. canis em infecções naturais em cães (FORLANO
et al., 2005; RUBINI et al., 2005, GARCIA DE SÁ et al., 2007; RUBINI et al., 2008;
SPOLIDORIO et al., 2009), gatos (PEREZ et al., 2004) e outros felídeos
selvagens (RUBINI et al., 2006, METZGER et al., 2008).
O objetivo deste trabalho foi realizar estudo sobre a frequência de cães
portadores de Hepatozoon sp. entre animais sintomáticos atendidos no Hospital
Veterinário da Universidade Federal de Goiás, procedentes da cidade de Goiânia,
Estado de Goiás; e fazer a caracterização molecular e análise filogenética das
amostras de Hepatozoon obtidos.
2.0 METODOLOGIA
2.1 Seleção das amostras
Foram selecionadas por conveniência 40 amostras provenientes de cães
com sinais clínicos sugestivos de hemoparasitose, atendidos para consulta no
Hospital Veterinário (HV) da Universidade Federal de Goiás (UFG) no período
entre janeiro e agosto de 2008. Os animais apresentavam histórico de infestação
por carrapatos, febre, palidez de mucosa, inapetência e prostração.
Destes animais foram colhidas amostras de sangue com anticoagulante
(Anticoagulante Universal, Doles) para a realização do exame parasitológico
direto, como método de triagem para a identificação de portadores de gametócitos
de Hepatozoon sp. A identificação morfológica foi realizada pelo exame
microscópico de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa. Todas as
amostras, independente do encontro do parasito, foram utilizadas para as reações
de caracterização molecular.
Dos animais amostrados foram também colhidos exemplares de
carrapatos. Estes foram mantidos em álcool a 70% para posterior identificação
das espécies, conforme chave de identificação de BECHARA (2006).
35
2.2 Extrações de DNA
Todas as 40 amostras incluídas no estudo foram submetidas ao
processo de extração de DNA, empregando-se ―kit” comercial (GFX-Genomic
Blood DNA Purification Kit®, Amersham Biosciences). Os procedimentos para a
extração foram realizados de acordo com as instruções do fabricante, adotando-
se o protocolo indicado para a extração a partir do volume de 100µL de sangue.
Os eluatos obtidos no final das extrações foram armazenados a -20 oC para
serem utilizados nas reações de PCR.
2.3 Reações de PCR
As amostras de DNA total, extraídas das alíquotas de sangue (n =40)
foram então submetidas ao processo de amplificação enzimática para a obtenção
de fragmentos-alvo do gene 18S rRNA. Para esta finalidade foram empregados
os oligonucleotídeos sense (5´-GGC TAC CAC ATC TAA GGA AG-3´) e antisense
(5´-CTA AGA ATT TCA CCT CTG ACA G-3´)
Os ensaios de PCR foram realizados em volume de 50 µL com as
seguintes concentrações de reagentes: 1X de Tampão para PCR (PCR buffer
10X, Invitrogen), 2,0 mM de Cloreto de Magnésio (MgCl2) (Invitrogen); 0,2 mM de
dNTP (Amersham Biosciences); 10 pM do oligonucleotídeo sense; 10 pM do
oligonucleotídeo antisense; 1,25U de Taq DNA polimerase (Taq DNA Polymerase
5 U/µL, Invitrogen) e 5 µL do DNA genômico extraído da amostra conforme
descrito anteriormente. O processo de amplificação foi realizado em termociclador
(Mastercycler Personal, Eppdendorf) programado para um ciclo inicial de 94 oC
por 2 min., seguido de 35 ciclos repetidos de 94 oC por 30 seg., 56º por 30 seg. e
72 oC por 1 min. A programação era finalizada com 2 min. a 72 oC para maximizar
o processo de extensão.
Como controle positivo para as reações de PCR, foi utilizada amostra de
DNA genômico de referência para Hepatozoon spp. obtida no Laboratório de
Diagnóstico de Doenças Parasitárias da Escola de Veterinária da UFG.
Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose
1,5% (Agarose NA – Amersham Biosciences) em tampão TBE 1x contendo 10 µL
36
de amostra e submetidas à eletroforese a 90 volts, durante 60 min, com marcador
de massa molecular de 100 pb (DNA Ladder 100 bp Invitrogen).
Após as corridas, os géis foram corados por imersão em solução de
brometo de etídio (0,4 µg/mL) por 10 min. A visualização foi feita em
transiluminador de UV (Electronic UV Transilluminator, Ultra-Lum), e a
documentação fotográfica foi efetivada em equipamento fotodocumentador de
géis (Vilber Lourmat).
2.4 Purificações e sequenciamento das amostras
Foram purificados apenas os produtos de PCR que apresentaram
resultado positivo. As amostras positivas foram cortadas do gel após a
eletroforese, sob iluminação de UV, e purificados para a obtenção dos fragmentos
limpos, utilizando-se kit comercial (QIAquick Gel Extraction Kit Protocol, Qiagen).
Após a identificação, as amostras foram encaminhadas sob refrigeração para a
realização do sequenciamento.
O sequenciamento foi feito em seqüenciador automático
MegaBACE1000 (GE Healthcare). Para este processo foi utilizado o método da
incorporação de dideoxi (ddNTP), empregando-se o DYEnamic ET dye
terminator kit MegaBACE (GE Healthcare ). As sequências obtidas foram
analisadas pelo programa Phred para assegurar a qualidade do produto com
índice igual ou superior a 20.
2.5 Análise de similaridade
As sequências obtidas dos produtos de PCR avaliadas no presente
estudo foram submetidas a análise de similaridade pelo algorítmo BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), confrontando com o banco de sequências do
GenBank. Em seguida as sequências das amostras foram analisadas quanto à
porcentagem de identidade, empregando-se o método de múltipla progressão de
Clustal W (THOMPSON et al., 1999) utilizando-se o programa MEGA4 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis – Software Version 4; TAMURA et al., 2007). A
mesma análise de identidade foi realizada comparando as amostras obtidas neste
estudo com as sequências de referência do GenBank para a espécie H. canis de
37
diferentes regiões geográficas, e também com as sequências de H. americanum
(AF176836 e EU146062) e H. catesbianae (AF176837).
2.6 Análises filogenéticas
Para o estudo filogenético foi construído dendograma incluindo sequências
parciais do gene 18S rRNA, utilizadas como referência para diferentes amostras
regionais de Hepatozoon canis, confrontando-as com os amostras obtidas neste
estudo. As cepas de referência incluídas nesta análise e seus respectivos
números de acesso no GenBank foram H. canis: Brasil (FJ743476.1), Brasil
(DQ198378), Brasil (EF650846.1), Brasil (EU571737.1) Brasil (AY461376) e Brasil
(DQ071888). H. canis Croácia (FJ497022.1), H. canis Espanha (DQ439542.1), H.
canis França (EU622910.1), H. canis Israel (AF176835), H. canis Espanha
(AY150067). A sequência do 18S rRNA de P. vivax foi incluída na árvore como
um organismo filogeneticamente mais distante para enraizar a árvore.
Os alinhamentos foram realizados pelo método de Clustal W para
construir árvore filogenética do tipo Neighbor-Joining, com bootstrap de 1.000
replicatas e parâmetros de distância evolutiva ajustados pelo método de
substituição Kimura 2-parâmetros. Para esta finalidade foi utilizado o programa
MEGA4 visando à construção da árvore.
3.0 RESULTADOS
3.1 Amostras selecionadas pelo diagnóstico parasitológico direto
No período de realização do estudo foram colhidas amostras de sangue
de 40 cães apresentando sinais clínicos sugestivos de hemoparasitose. Dentre
estas, apenas duas foram positivas ao exame parasitológico direto. Observou-se
então a frequência de 5% de cães parasitados por Hepatozoon sp. entre os
animais com suspeita clínica atendidos no período determinado neste estudo.
A amostra número 01 foi obtida de um cão da raça Daschund, fêmea de
oito anos. O exame parasitológico apresentava gametócitos extra-celulares
(Figura 1a). A amostra de número 02 foi procedente de um cão sem raça definida
(SRD) macho de sete anos (Figura 1b). O exame parasitológico desta amostra
38
apresentava gametócitos intra-leucocitários típicos de Hepatozoon sp. Os dois
animais apresentavam ao exame clínico sinais inespecíficos como: febre, palidez
de mucosa, inapetência e prostração.
A identificação dos exemplares de carrapatos foi realizada apenas nas
amostras oriundas dos cães incluídos no estudo. Dentre os dois cães deste
trabalho apenas o cão número um apresentava no momento da consulta
carrapatos fixados, os quais foram examinados e avaliados. A análise foi feita em
carrapatos adultos, machos e fêmeas e ninfas. Após avaliação por chave de
identificação os instares foram classificados como Rhiphicephalus sanguineus.
Figura 1: a: Gametócito de Hepatozoon sp. observadas no isolado de nº 01, um
cão da raça Daschund, fêmea de oito anos, procedente da cidade de Goiânia,
Goiás (1000x); b: Gametócito no interior do neutrófilo Hepatozoon sp. observado
no interior do neutrófilo do cão de nº 02, SRD, macho, sete anos, procedente da
cidade de Goiânia, Goiás (1000x).
3.2 Amostras selecionadas pela PCR
As 40 amostras foram submetidas a reações de PCR. As duas
amostras com resultado positivo nesta etapa foram correspondentes as amostras
positivas no exame parasitológico e geraram fragmentos-alvo de tamanho
previsto de aproximadamente 500 pb, do gene 18S rRNA de Hepatozoon spp.
a b
39
Figura 1: Eletroforese dos produtos de PCR de 500 pb amplificados a partir do DNA de Hepatozoon sp. das amostras obtidas de cães sintomáticos, procedentes da cidade de Goiânia, Goiás. 1- marcador de 100 pb; Linha 2: controle positivo; linhas 3 e 4: amostras H. canis GO 1 e 02; linha 5: controle negativo. 3.3 Caracterização molecular das amostras
Após o sequenciamento dos produtos de PCR purificados, as duas
amostras foram submetidos a avaliação por BLASTn, e com base na análise de
similaridade fornecida por esta ferramenta, foi verificado que as amostras deste
estudo correspondiam a espécie H. canis. As amostras obtidas foram depositados
no GenBank como novas sequências para o gene 18S rRNA de Hepatozoon
canis sob os números GU386283 e GU386284.
As sequências foram então ajustadas para o mesmo comprimento de
191pb antes da realização do alinhamento múltiplo para a análise de similaridade
e polimorfismo dos nucleotídeos. Nesta avaliação as duas sequências designadas
H. canis GO 01 e H. canis GO 02 apresentaram 100% de similaridade entre si e
com os as amostras obtidas de cães das cidades brasileiras e dos países Croácia
e Espanha.
Dentre os isolados brasileiros de referência para o Brasil, apenas o
isolado brasileiro (EF650846) apresentou variação de nucleotídeos, com 98,95%
de similaridade. Esta diferença se evidenciou por duas substituições na posição
500pb
40
89 e 176 do alinhamento. Também com 98,95% e duas substituições o isolado de
Israel apresentou variações nas posições 21 e 176 do alinhamento. Os isolados
Brasil (AY461376) e Espanha apresentaram 99,48% de similaridade comparada
aos demais isolados.
O isolado que demonstrou a maior variação foi o isolado da França com
três substituições nas posições 21, 30 e 176. Ainda assim manteve alta
similaridade, de 98,43%. No quadro 2 é possível demonstrar o resultado da
comparação proporcional do polimorfismo dos nucleotídeos.
A análise comparativa das amostras deste estudo com as amostras de
H. americanum e H. catesbianae revelou 96,8 % e 94,20 % de similaridade,
respectivamente.
Quadro 2 - Comparação das sequências do gene 18S rRNA de Hepatozoon canis provenientes de Goiânia – GO, Brasil, com outras sequências de diferentes regiões geográficas, tendo como base a numeração das posições polimórficas do genótipo Hepatozoon canis 01.
Genotipos/amostras Acesso
GenBank Identidade
a (%)
Polimorfismo na posição dos nucleotídeos 21 30 89 162 176
H. canis GO 01 GU386283 - G C T G G
H. canis GO 02
Brasil
GU386284
FJ743476
100,00
100,00
•
•
•
• •
• •
• •
• Brasil DQ198378 100,00 • • • • •
Brasil EF650846 98,95 • • A • A Brasil EU571737 100,00 • • • • • Brasil DQ071888 100,00 • • • • • Brasil AY461376 99,48 • • • A • Croácia FJ497022 100,00 • • • • • Espanha DQ439542 99,48 • • • A • Espanha AY150067 100,00 • • • • • Israel AF176835 98,95 A • • • A
França EU622910 98,43 A T • • A
(•) indica nucleotídeo conservado, e (*) indica substituição, a porcentagem de identidade da sequência de 191 pb
alinhada pelo ClustalW.
3.4 Análise filogenética das amostras de Hepatozoon sp.
A árvore filogenética gerada pelo confronto entre as sequências
parciais do gene 18S rRNA das amostras regionais H. canis GO 01 e H. canis GO
02 com as sequências correspondentes de referência para outras espécies do
gênero Hepatozoon incluídas nesta análise, revelou que: (1) as espécies de
Hepatozoon canis e H. americanum ficaram separadas em ―clados‖ diferentes.
As espécies de H. canis de origem brasileira se agruparam na mesma ―clado‖
41
(bootstrap = 62%) demonstrando a alta similaridade entre elas. A ―clado” formada
pelas amostras de H. canis é sustentada pelo índice de bootstrap de 92%; (2) As
a de Goiânia analisados neste estudo se agruparam dentro da ―clado‖ composta
pelas cepas de referência de H. canis de outras regiões geográficas.
H. canis Brasil (AY461376)
H. canis Espanha (DQ439542.1)
H. canis Brazil (FJ743476.1)
H. canis Brazil (DQ071888.1)
H. canis GO 02 (GU386284)
H. canis GO 01 (GU386283)
H. canis Brasil (DQ198378)
H. canis Espanha (AY150067)
H. canis Croacia (FJ497022.1)
H. canis Brazil (EU571737.1)
H. canis Brazil (EF650846.1)
H. canis Franca (EU622910.1)
H. canis Israel (AF176835)
H. americanum (AF176836)
H. americanum (EU146062)
Plasmodium vivax (U93234)
74
63
92
62
Figura 1: Árvore filogenética construída a partir de fragmentos parciais do gene 18S rRNA de amostras regionais de Hepatozoon sp. e sequências de referência obtidas no GenBank (www.nvbi.nlm.nih.gov) pelo método neighbor-joining com bootstrap = 1000. Os números de acesso das sequências estão listados na figura.
4.0 DISCUSSÃO
A baixa porcentagem (5%) de animais positivos ao exame
parasitológico direto para H. canis, entre animais com sinais clínicos sugestivos
para a enfermidade, pode ser justificada pelo fato de que a hepatozoonose canina
não apresenta sinais reconhecidos como patognomônicos. Os sinais
considerados sugestivos podem ter como causa outra hemoparasitose ou mesmo
afecções de outra natureza. De acordo com BANETH & SHKAP, (2003) pode-se
suspeitar da doença quando os animais apresentarem febre, anorexia, perda de
peso, palidez de mucosas, corrimento ocular e fraqueza dos membros
posteriores. Os cães avaliados e incluídos neste trabalho apresentavam sinais
42
clínicos inespecíficos, conforme já relatado por O‘DWYER & MASSARD, (2002).
Estes sinais são condizentes com a citação de GREENE (2006) o qual considera
que os sinais dessa enfermidade variam desde um achado hematológico
acidental em um cão aparentemente saudável a uma doença debilitante e com
risco de morte. Encontros de associação de H. canis em animais sintomáticos
também foram citados nos estados de São Paulo (GONDIM et al., 1998) e Brasília
(PALUDO et al., 2003), corroborando com os resultados obtidos neste estudo.
A hepatozoonose tem como transmissor reconhecido mundialmente o
carrapato Rhipicephalus sanguineus. Até o presente, este fato não teve
confirmações nos experimentos conduzidos no Brasil, embora tenham sido
identificados estes carrapatos em cães portadores de H. canis em diferentes
regiões do País. No momento apenas o Amblyomma ovale teve a condição de
vetor comprovada. No presente estudo foi identificada a presença apenas da
espécie R. sanguineus encontrada em um dos cães avaliados, nenhuma outra
espécie de carrapato foi identificada. Este fato não pode ser conclusivo quanto a
participação da espécie R. sanguineus na transmissão da hepatozoonose apesar
de existirem trabalhos como de FORLANO et al. (2005), BANETH et al. (2007) e
RUBINI et al. (2009) que apontam para esta condição.
Além dos sinais anteriormente mencionados, os dois cães avaliados
neste estudo apresentavam ao exame parasitológico direto gametócitos de
Hepatozoon sp. A presença de gametócitos livres como verificado neste estudo é
um fato já mencionado por outros estudos previamente publicados, como os
desenvolvidos por LAINSON et al. (2003) e LIMA & SILVA (2004) estudando
amostras de H. caimani proveniente de jacaré. VINCENT-JOHNSON et al. (1997)
afirmaram que o gametócito deixa rapidamente o leucócito após a colheita do
sangue, principalmente pelo contato do sangue com o anticoagulante. Tal
condição também pode explicar o encontro extracelular do parasita em uma das
amostras avaliadas.
Embora ofereça um diagnóstico seguro o exame parasitológico não
oferece confiabilidade na diferenciação das espécies de Hepatozoon. Este fato
tem motivado, o uso de técnicas de biologia molecular em estudos envolvendo a
etiologia e a epidemiologia da hepatozoonose canina. Vários autores como
INOKUMA et al.(2002); FORLANO et al. (2005); RUBINI et al. (2005), GARCIA
43
DE SÁ et al. (2007); RUBINI et al. (2008); SPOLIDORIO et al. (2009) têm utilizado
a PCR para a identificação desses agentes. As reações de PCR realizadas nas
duas amostras obtidas no presente estudo confirmaram a presença de
Hepatozoon sp. nestas amostras.
A análise de similaridade entre as duas sequências regionais e as
sequências obtidas junto ao GenBank revelaram similaridade com o gene 18S
rRNA de H. canis. Até o momento todos os estudos realizados no Brasil com base
em métodos de biologia molecular foram semelhantes aos resultados analisados
no presente trabalho. Esta situação pode ser comprovada em relação aos
trabalhos publicados por RUBINI et al. (2005) e RUBINI et al. (2008) em São
Paulo; PALUDO et al. (2005) em Brasília; LASTA et al. (2009) no Rio Grande do
Sul, e SPOLIDORIO et al. (2009) no Espírito Santo em amostras obtidas de cães.
Outros estudos foram ainda desenvolvidos com amostras provenientes de felinos
e ainda assim a única espécie identificada foi H. canis (RUBINI et al., 2006;
METZER et al., 2008).
A análise de similaridade das amostras deste estudo em comparações
com outros isolados brasileiros foi de 100% na maioria dos confrontos realizados.
A variabilidade genética observada entre as amostras brasileiras de H. canis é
mínima. Resultados semelhantes foram relatados por RUBINI et al. (2005) e
LASTA et al. (2009).
Neste estudo realizou-se também uma comparação entre amostras de
H. canis regionais com um isolado de referência para H. americanum. A
similaridade verificada foi de 96,8%. INOKUMA et al. (2002), em estudo
semelhante também conduzido com duas amostras proveniente de cães,
encontraram 94% de similaridade comparando isolados do Japão com isolados de
Israel. O resultado obtido confirma a diferença genética entre as espécies H. canis
e H. americanum, embora pequena, anteriormente relatada por diferentes
trabalhos, tais como os desenvolvidos por VINCENT-JOHNSON et al. (1997),
BANETH et al. (2000) e MATHEW et al. (2000).
Considerando-se a ampla extensão territorial do Brasil e a escassez de
trabalhos nesta área, torna-se evidente a necessidade do incremento e estímulo
para novos trabalhos, envolvendo principalmente estudos sobre a epidemiologia,
44
métodos de diagnóstico, caracterização molecular e filogenia em diferentes
amostras biológicas (METZER et al., 2009).
Este trabalho é o primeiro estudo de caracterização molecular de
Hepatozoon, desenvolvido no estado de Goiás. O estudo possibilitou a
identificação de Hepatozoon canis presente nos cães atendidos no HV da UFG.
Novos estudos se fazem necessários considerando-se a importância de se obter
dados sobre um número cada vez maior de isolados e a disponibilização de
informações de diferentes regiões do Brasil. Da mesma forma trabalhos
associando transmissão experimental e biologia molecular são necessários no
sentido de se obter informações a respeito das espécies e possíveis genogrupos
dentro do gênero Hepatozoon ocorrentes no País.
5.0 CONCLUSÃO
O estudo de caracterização molecular com base em métodos
filogenéticos confirma a ocorrência de Hepatozoon canis em cães com
manifestação clínica compatível com hepatozoonose na cidade de Goiânia, GO.
Os isolados de H. canis oriundos de cães da cidade de Goiânia são
filogeneticamente idênticos aos isolados do Brasil e também similares quando
comparados aos isolados de referência de outras regiões geográficas.
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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hepatozoonosis in dogs in Israel. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.11,
p.365-370, 1997.
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45
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48
CAPÍTULO 4 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Ehrlichia canis PRESENTE EM CÃES
DE GOIÂNIA-GO.
SABRINA CASTILHO DUARTE1, JULIANA ALVES PARENTE2, CÉLIA
MARIA DE ALMEIDA SOARES3, GUIDO FONTGALLAND COELHO LINHARES4
Laboratório de Doenças Parasitárias, Escola de Veterinária da UFG, Campus II Cx postal 131 CEP: 74001-970.
Goiânia – GO, Brasil. Telefone: (062) 3521-1595
email: [email protected]
1. Doutoranda em Ciência Animal-Sanidade Animal, UFG; 2. Doutora em Ciências Médicas pela UNB; 3. Professora do Instituto de Ciências Biológicas da UFG; 4. Professor Adjunto da Escola de Veterinária da UFG;
RESUMO Ehrlichia canis é um parasito bacteriano intracelular obrigatório, agente da Ehrlichiose Monocítica Canina. Nas Américas a espécie de carrapato envolvida na transmissão é o Rhipicephalus sanguineus. O método de diagnóstico laboratorial de rotina é realizado pela demonstração direta das inclusões intraleucocitárias, a partir de preparações coradas de esfregaço sangüíneo ou do creme leucocitário. Mais recentemente a reação em cadeia da polimerase (PCR) introduzida como um método alternativo para aumentar a sensibilidade do diagnóstico, especialmente na fase crônica da enfermidade. O objetivo desse trabalho foi realizar estudo filogenético de amostras de Ehrlichia em cães na cidade de Goiânia, Goiás. Para o estudo, foram obtidas 40 amostras de sangue de cães sintomáticos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Goiás. Todas as amostras foram utilizadas para extração de DNA seguida da PCR por oligonucleotídeos gênero-específicos e posteriormente espécie-específicos para o gene 16S rRNA. Posteriormente foi realizada purificação do produto de PCR espécie específico para realização de sequenciamento. Destas 17 apresentaram-se PCR positivas tanto nas reações para gênero quanto a espécie E. canis. Foram sequenciadas 17 amostras e após o sequenciamento foi feita análise de qualidade de sequências e mantidas cinco amostras. A análise de similaridade fornecida pelo BLASTn demonstrou que as mesmas eram correspondentes à espécie Ehrlichia canis. Foi realizado o depósito das sequencias obtidas no GenBank como novas sequências para o gene 16S rRNA. Pela utilização do programa Mega4 foi possível verificar que as amostras de E. canis provenientes de cães da cidade de Goiânia apresentam alto grau de similaridade molecular com os isolados de referência para a mesma subespécie de outras regiões do Brasil e do mundo. Amostras de E. canis de cães avaliados neste estudo formam grupo filogenético bem definido, juntamente com amostras de referência de E. canis de diferentes regiões geográficas.
Palavras chave: Ehrlichiose monocítica canina, Pancitopenia tropical canina, filogenia, epidemiologia molecular, similaridades genéticas.
49
ABSTRACT The obligate intracellular bacterial parasite known as Ehlichia canis is the etiological agent of the Canina Monocytic Erhlichiosis. The most frequent method applied for routine laboratory diagnosis is based on the direct detection of intraleucocytic inclusions in either blood smears or buffy coat preparations. More recently the polymerase chain reaction (PCR) has been introduced as an alternative tool to improve sensitivity of diagnosis, especially in chronic phases of the disease. The objective of the present work was to proceed a phylogenetic study on Ehrlichia isolates from dogs of Goiânia, Goiás. Blood samples were collected from 40 syntomatic dogs referred to the Veterinary Hospital of the Federal University of Goiás. All samples were processed for DNA extraction and PCR using both genus and species-specific oligonucleotides for the 16S rRNA gene. PCR reactions resulted positive for both genus and species assays for 17 out of 40 tested samples. The species-specific PCR products of the 17 samples were purified and sequenced but only 5 of these were considered for subsequently molecular studies due to quality analysis results of the sequences. These 5 sequences were then analysed for similarity by BLASTn algorithm in which they could be identified as Hepatozoon canis. The sequences were deposited in the GenBank database as new sequences of the 16S rRNA. Using Mega4 software it was confirmed that the these isolates of E. canis from dogs of Goiânia are highly similar to other reference isolates of the same species from other regions of Brasil and worldwide. The isolates of E. canis evaluated in this study are phylogenetically similar to those reference isolates from other geographic regions of the world. Keywords: Canine monocytic ehrlichiosis, Tropical canine pancitopenia, phylogeny, molecular epidemiology, genetic similarities, Ehrlichiosis. 1.0 INTRODUÇÃO
Ehrlichia canis é uma bactéria intracelular obrigatória, Gram negativa,
da ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae, agente etiológico da Ehrlichiose
Monocítica Canina (EMC) (DUMLER et al., 2001). Tem no seu principal
mecanismo de transmissão a participação de carrapatos vetores. Nas Américas a
espécie de carrapato envolvida é o Rhipicephalus sanguineus (DAGNONE et al.,
2001).
Os canídeos são suscetíveis a diferentes espécies de riquétsias da
família Anaplasmataceae como: E. canis; E. ewingii, E. chaffeensis; A. platys, A.
phagocitophilum, Neorickettsia sennetsu, N. risticii e N. helminthoeca (HEADLEY
ET AL., 2006). Entre estas, as espécies E. chaffeensis e A. phagocitophilum são
os principais agentes envolvidos nos casos de ehrlichiose em seres humanos
50
(HOSKINS, 1991, GREENE, 2006). Embora E. ewingii, E. canis e N. sennetsu
também possam causar infecções humanos (DUMLER et al., 2007).
Alguns autores têm atribuído à E. canis um possível envolvimento em
infecções humanas na América do Sul, com alguns casos reportados na
Venezuela (PEREZ et al., 1996) Argentina (RIPOLI et al., 1999) e Brasil (CALIC et
al., 2004). Além da E. canis, a E ewingii também tem sido apontada como
responsável por casos humanos (BULLER et al., 1999), entretanto, a maior
importância das ehrlichiose humana é atribuída a infecções onde o agente
envolvido é a E. chaffeensis, responsável pelo maior número de casos,
principalmente nos EUA (DUMLER et al., 2007).
Em relação a distribuição geográfica a E. canis apresenta distribuição
mundial, já as infecções por E. ewingii estão restritas aos Estados Unidos. E.
chaffeensis é a principal causa da Ehrlichiose Monocítica Humana (EMH) nos
Estados Unidos, mas ocorre também em outras regiões da América do Norte,
Ásia e Europa (GREIG et al., 2006). No Brasil, estudos sorológicos demonstraram
a possível infecção em seres humanos (CALIC et al., 2004; COSTA et al., 2007).
Cães com ehrlichiose apresentam sinais clínicos inespecíficos, como
anemia, febre, secreção ocular, anorexia, depressão, perda de peso, poliartrite e
alterações hematológicas, como anemia arregenerativa e trombocitopenia
(DAGNONE et al., 2001).
O método de diagnóstico laboratorial de rotina é realizado pela
demonstração microscópica direta das inclusões intraleucocitárias, a partir de
preparações coradas de esfregaço sangüíneo ou do creme leucocitário (WOODY
& HOSKINS, 1991). Este exame é de rápida execução e de baixo custo,
entretanto nem sempre é eficaz, pela constante flutuação da parasitemia durante
o curso da enfermidade (ALVES et al., 2005).
Técnicas moleculares de diagnóstico, reconhecidamente mais
sensíveis, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm sido recentemente
empregadas para o diagnóstico de E. canis visando oferecer um diagnóstico mais
seguro e que permita a diferenciação da espécie de Ehrlichia envolvida na
enfermidade (HARRUS et al., 1998; ALVES et al., 2005; MARTIN et al., 2005;
DUMLER et al., 2007).
51
Para a caracterização molecular das espécies do gênero Ehrlichia tem
sido utilizada a análise filogenética de fragmentos do gene 16S rRNA amplificados
pela nested-PCR (MACHADO et al., 2006; CARVALHO et al., 2008; SANTOS et
al., 2009; OLIVEIRA et al., 2009) e pela PCR (PINYOOWONG et al., 2008).
No Brasil, ainda existem poucos estudos com abordagem filogenética e
de caracterização molecular, entretanto algumas pesquisas têm sido feitas
envolvendo agentes da família Anaplasmataceae por pesquisadores de diferentes
regiões do País. Na Bahia os estudos envolvendo a caracterização molecular de
E. canis foram conduzidos por CARVALHO et al. (2008) e no estado do Rio de
Janeiro MACIEIRA et al. (2005) realizaram estudo utilizando a PCR como método
de diagnóstico.
No estado de São Paulo AGUIAR et al. (2008) realizaram isolamento in
vitro de E. canis utilizando a cepa Jaboticabal DH82; SANTOS et al. (2009)
estudaram a incidência de E. canis nos cães de Ribeirão Preto e neste mesmo
ano OLIVEIRA et al. (2009) detectaram pela primeira vez E. ewingii em cães no
Brasil.
No estado do Paraná, DAGNONE et al. (2003) realizaram identificação
molecular de E. canis e HEADLEY et al. no ano de 2006 detectaram pela
primeira vez N. helminthoteca em cães desta região. LABRUNA et al. (2007)
utilizando amostras de Rondônia avaliou amostras sanguíneas provenientes de
carrapatos, seres humanos com histórico febril, cães e capivaras buscando
possíveis amostras de Ehrlichia spp. Nos cães foi detectado E. canis e nas
demais amostras nenhuma espécie de Ehrlichia foi detectada.
Nos diferentes estudos conduzidos mundialmente os genes mais
frequentemente utilizados relativos a filogenia de microrganismos do gênero
Ehrlichia estão o gene 16S rRNA, o gene que codifica a enzima citrato sintetase
(gltA), o gene groESL, genes que codificam proteínas de superfície. O gene 16S é
frequentemente utilizado porque apresenta baixas frequências de mutações,
sendo, altamente conservado entre populações de diferentes regiões geográficas
(DUMLER et al., 2001).
O objetivo desse trabalho foi obter amostras de Ehrlichia canis a partir
de amostras clínicas de cães da cidade de Goiânia, Estado de Goiás, e realizar a
52
caracterização molecular dos mesmos. Para esta finalidade foi realizada análise
filogenética de fragmentos parciais do gene 16S rRNA.
2.0 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostragem e extrações de DNA.
Para a realização do estudo foram obtidas 40 amostras de sangue
colhidas de cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de
Goiás (HV-UFG) no período de janeiro a agosto de 2008. Todas as amostras
foram colhidas de cães que apresentavam sinais clínicos compatíveis com
hemoparasitose no momento da consulta como: febre, palidez de mucosa,
inapetência, prostração, associados ou não à alterações da coagulação
sanguínea ou à infestação por carrapatos. As amostras de sangue foram colhidas
em tubo estéril contendo EDTA (Anticoagulante Universal, Doles). As amostras
foram aliquotadas em tubos do tipo Eppendorf de 1,5 mL e mantidas a -20 ºC para
posterior extração de DNA genômico. Para realização da extração foi utilizado kit
comercial (Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin Kit, GE - Healthcare) de acordo
com as instruções do fabricante para o volume inicial de 200mL de sangue.
Posteriormente, 5 µL do eluato obtido da extração de cada amostra foi utilizado
para realização das reações de PCR.
2.2 Oligonucleotídeos para amplificação do fragmento do gene 16S rRNA
Inicialmente foi selecionado um oligonucleotídeo sense gênero-
específico para o gene 16S rRNA de Ehrlichia spp. O oligonucleotídeo genérico
foi, portanto selecionado a partir de uma área conservada no alinhamento das
seguintes sequências de referência (GenBank - http://www.ncbi.nlm.nih.gov), com
seus respectivos números de acesso: E. canis (AF162860), E. canis Japão
(AF536827), E. ewingii (U96436), Anaplasma platys (AF1567844), E. chaffeensis
(U86665), Anaplasma phagocytophila (U02521), E. bovis (AF294789),
Neorickettsia risticii (M21290). O alinhamento das sequências foi realizado pelo
método de Clustal W (THOMPSON et al., 1999), empregando o programa
Megalign (LaserGene, DNAStar, Inc.).
53
Após a seleção, o oligonucleotídeo foi avaliado quanto à similaridade
com as sequências do GenBank, utilizando-se o algoritmo BLAST-N® (Basic Local
Alignment Search Tool Nucleotides) (ALTSCHUL et al., 1990). Após a
confirmação da identidade para o gênero a sequência foi sintetizada (Prodimol –
IDT), sob a designação Ebr6. Esse oligonucleotídeo foi utilizado em combinação
com o oligonucleotídeo gênero específico Ebr5 (anti-sense), anteriormente
publicado por ALVES et al. (2005), visando a obtenção de fragmento-alvo gênero-
específico de aproximadamente 840pb pela PCR.
Para as reações de PCR espécie-específicas foram empregados os
oligonucleotídeos Ebr1 (sense) e Ebr5 (anti-sense) para a amplificação do
fragmento-alvo de 765pb do gene 16S rRNA de E. canis (ALVES et al., 2005)
(Quadro 1).
QUADRO 1 - Iniciadores utilizados para a amplificação de fragmentos gênero e espécie-específicos de Ehrlichia sp. pela PCR. Especificidade
analítica
Oligo
Sequências Ta
(°C)
Ehrlichia spp. Ebr6 5´-CGA ACG CTG GCG GCA AG-3´ 53
Ehrlichia spp.. *Ebr5 5´-GGA GTG CTT AAC GCG TTA G-3´ 53
E. canis *Ebr1 5´- CCT CTG GCT ATA GGA AAT TG -3´ 53
*Ebr 5 e Ebr1 descritos por ALVES et al., 2005. Ta = temperatura de anelamento.
2.3 Diagnóstico gênero e espécie-específico por PCR
Os eluatos obtidos com as extrações de DNA a partir do sangue dos
cães amostrados (n=40) foram utilizados para testes de triagem, empregando-se
ensaio de PCR gênero-específico com os oligonucleotídeos Ebr5 e Ebr6. Em
seguida, as amostras com resultados positivos nesta etapa foram submetidas a
novas reações de PCR empregando-se o par de oligonucleotídeos Ebr1 e Ebr5
para amplificação espécie-específica de E. canis, conforme descrito acima.
Os ensaios da PCR foram realizados em volume de 50 µL com as
seguintes concentrações de reagentes: 1X de Tampão para PCR (PCR buffer
10X, Invitrogen), 2,0 mM de Cloreto de Magnésio (MgCl2) (Invitrogen); 0,2 mM de
dNTP (Amersham Biosciences); 10 pM do oligonucleotídeo sense (Ebr6 para as
54
reações Ehrlichia-específicas e Ebr1 para E. canis específicas); 10 pM do
oligonucleotídeo antisense (Ebr5); 1,25U de Taq DNA polimerase (Taq DNA
Polymerase 5 U/µL, Invitrogen) e 5 µL do DNA genômico extraído da amostra
conforme descrito anteriormente.
Como controle positivo para as reações da PCR, foi utilizada uma
amostra de DNA genômico de referência para E. canis obtida no Laboratório de
Diagnóstico de Doenças Parasitárias (LDDP) da Escola de Veterinária (EV) da
Universidade Federal de Goiás (UFG).
Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose
1,5% (Agarose NA – Amersham Biosciences) em tampão TBE 1x contendo 10 µL
de amostra, após à eletroforese a 90 volts, durante 60 min, com marcador de
massa molecular de 100 pb (DNA Ladder 100 bp Invitrogen).
Após as corridas, os géis foram corados por imersão em solução de
brometo de etídio (0,4 µg/mL) por 10 min. A visualização foi feita em
transiluminador de UV (Electronic UV Transilluminator, Ultra-Lum), e a
documentação fotográfica foi efetivada em equipamento fotodocumentador de
géis (Vilber Lourmat).
2.4 Purificação e sequenciamento das amostras
Os produtos da PCR E. canis-específicos (Ebr1/Ebr5-PCR) foram
cortados e removidos do gel de agarose sob iluminação de UV e imediatamente
submetidos ao processo de purificação empregando-se kit comercial (QIAquick
Gel Extraction Kit Protocol, Qiagen). Após a identificação as amostras foram
encaminhadas sob refrigeração para a realização do sequenciamento.
O sequenciamento foi realizado por seqüenciador automático
MegaBACE1000. Para este processo foi utilizado o método da incorporação de
dideoxi (ddNTP), empregando-se o DYEnamic ET dye terminator kit
MegaBACE (GE Healthcare ). As sequências obtidas foram analisadas pelo
programa estatístico Phred e somente aquelas com índice igual ou superior a 20
foram mantidas no estudo.
55
2.5 Análises dos isolados pelo método de múltiplo alinhamento e testes de
similaridade
Para a determinação da identidade molecular as sequências dos
produtos da PCR espécie-específicos dos isolados regionais foram,
individualmente, submetidas a análise de similaridade pelo algoritmo BLASTn,
tendo com base o banco de sequências do GenBank (ALTSCHUL et al., 1990).
As mesmas sequências foram então analisadas comparativamente
quanto à porcentagem de identidade molecular, empregando-se o método de
múltipla progressão de Clustal W (THOMPSON et al., 1999) pelo o programa
MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis – Software Version 4;
TAMURA et al., 2007). A mesma análise de identidade foi realizada comparando-
se os isolados obtidos neste estudo com as sequências de referência (GenBank)
para E. canis de outras regiões geográficas.
2.6 Análises filogenéticas
O estudo filogenético foi realizado pela construção de dendograma que
incluía sequências distintas obtidas a partir dos isolados regionais e as seguintes
sequências de referência para outras riquétsias oriundas de diferentes regiões
geográficas, com seus respectivos números de acesso no GenBank: E. canis
Peru (DQ915970), E. canis Venezuela (AF373613), E. canis Brazil-CO2
(EF195135), E. canis China (EF162826), E. canis África do Sul (U54805), E. canis
Brazil-SP (DQ460714), E. canis Japão (AF536827), E. canis Espanha
(AY530806), E. canis EUA (M73226), E. ewingii (U96436), E. chaffeensis
(U23503, EU181144, DQ345720), A. phagocytophilum ( EU287434, GU111747),
A. platys (AF156784, DQ401045), N. risticii (AF380257), N. sennetsu (M73219) e
Brucella sp. (GU085225).
Os alinhamentos foram realizados pelo método de Clustal W para
construir árvore filogenética do tipo Neighbor-Joining, com bootstrap de 1.000
replicatas e parâmetros de distância evolutiva ajustados pelo método de
substituição Kimura 2-parâmetros. Para esta finalidade foi utilizado o programa
MEGA4.
56
3.0 RESULTADOS
3.1 Detecção gênero e espécie-específica do gene 16S rRNA.
Pelos testes de triagem com o par de oligonucleotídeos Ebr6/Ebr5,
foram obtidos produtos de amplificação de 17 amostras, aplicado às 40 amostras
selecionadas, com tamanho de aproximadamente 840pb correspondente ao
fragmento-alvo previsto para o gene 16S rRNA de Ehrlichia sp.
As mesmas amostras (n=17) que apresentaram positividade neste
primeiro teste de PCR também foram positivas com o par de oligonucleotídeos
Ebr1 e Ebr5 gerando o produto espécie-específico de 765pb do gene 16S rRNA
de E. canis (Figura 1).
Figura 1: Eletroforese de produtos de amplificação espécie-específica de E. canis
por PCR, obtidos a partir de amostras provenientes de cães anêmicos,
procedentes da cidade de Goiânia, Goiás. 1- marcador de 100 pb; Linha 2:
controle positivo; linhas 3 e 5: isolados E. canis GO 01 e 07; linha4: amostra
negativa; linha 6: reação inespecífica; linha 7: poço sem amostra; linha 8: controle
negativo.
765pb
57
3.2 Caracterização molecular dos isolados de Ehrlichia sp.
Após o sequenciamento dos produtos de PCR purificados foram
mantidas no estudo apenas as sequências que apresentavam valores de Phred
igual ou superior a 20 reduzindo assim o número de amostras para cinco. Após
este procedimento, as cinco sequências restantes destes isolados, submetidas à
avaliação de similaridade pelo BLASTn apresentaram porcentagem de identidade
de 100% para a maioria das sequências de referência para E. canis registradas
no GenBank. Os isolados obtidos neste estudo foram então depositados no
GenBank como novas sequências para o gene 16S rRNA de E. canis sob os
números GU386285, GU386286, GU386287, GU386288 e GU386289.
Em seguida as sequências destes isolados foram ajustadas para o
comprimento comum de 463pb, antes da realização do alinhamento múltiplo.
No Quadro 2 é apresentado o resultado da comparação proporcional do
polimorfismo dos nucleotídeos entre as sequências parciais do gene 16S rRNA
dos isolados deste estudo e as de outras nove amostras representativas da
espécie E. canis, de outras regiões geográficas.
Pela análise comparativa foi verificado que os isolado E. canis 01, 02, 03
e 05 eram 100% idênticas as provenientes do Brasil-CO2, China , Espanha,
Japão, Peru e Venezuela. A cepa dos EUA apresentou uma substituição na
posição 72 do alinhamento, taxa de similaridade em 99,78%. O isolado E. canis
GO 04 apresentou uma inserção de um nucleotídeo na posição 414 do
alinhamento, demonstrando 99,78% de similaridade.
58
Quadro2: Comparação das sequências do gene 16S rRNA de E. canis
provenientes de Goiânia – GO, Brasil com outras sequências de diferentes
regiões geográficas.
Genotipos/isolados Acesso
GenBank Identidade
a (%) Polimorfismo na
posição dos nucleotídeos 72 228 414
E. canis GO 01 GU386285 - G C -
E. canis GO 02 GU386286 100,00 • • -
E. canis GO 03 GU386287 100,00 • • -
E. canis GO 04 GU386288 99,78 • • A
E. canis GO 05 GU386289 100,00 • • -
África do Sul U54805 100,00 • - -
Brasil CO2 EF195135 100,00 • • -
Brasil SP DQ460714 100,00 • • -
China AF162860 100,00 • • -
Espanha AY530806 100,00 • • -
EUA M73226 99,78 A • -
Japão AF536827 100,00 • • -
Peru DQ915970 100,00 • • -
Venezuela AF373613 100,00 • • -
(•) indica nucleotídeo conservado, (-) deleção, a A porcentagem de identidades da
sequência de 463 pb alinhada pelo ClustalW.
3.3 Análise filogenética dos isolados de Ehrlichia sp.
A árvore filogenética gerada pelo confronto entre as sequências
parciais do gene 16S rRNA dos isolados regionais E. canis GO 01 à E. canis GO
05 com as sequências de referência para outras espécies de riquétssias,
incluídas nesta análise, revelou que: as espécies do gênero Ehrlichia ficaram
divididas em dois ―clados‖ distintos. Um destes ―clados‖ foi formado pelas
espécies E. canis. O outro ―clado‖ foi composto pelas espécies E. chaffensis e E.
ewingii. Os isolados E.canis GO 01 à 05 formaram agrupamento bem definido
juntamente com as cepas de referência para E. canis de outras regiões
geográficas incluídas nesta análise molecular. O isolado de E. canis proveniente
dos EUA foi o mais distante filogeneticamente entre os isolados de E. canis
avaliados.
59
E. canis GO 02 (GU386286)
E. canis GO 04 (GU386288)
E. canis Venezuela (AF373613)
E. canis Brasil-CO2 (EF195135)
E. canis Japao (AF536827)
E. canis GO 03 (GU386287)
E. canis GO 01 (GU386285)
E. canis Africa do Sul (U54805)
E. canis Espanha (AY530806)
E. canis China (AF162860)
E. canis Peru (DQ915970)
E. canis GO 05 (GU386289)
E. canis EUA (M73226)
E. ewingii (U96436)
E. chaffensis Brasil (DQ345720)
E. chaffensis (EU181144)
E. chaffensis (U23503)
A. phagocytophilum Brasil (EU287434)
A. phagocitophilum (GU111747)
A. platys (AF156784.1)
A. platys (DQ401045)
N. risticii (AF380257)
N. sennetsu (M73219)
Brucella (GU085225)
99
96
83
90
100
71
93
99
98
65
Figura 2: Árvore filogenética obtida pela utilização dos cinco nucleotídeos de
Ehrlichia canis provenientes de Goiânia-GO, amplificados pelos oligonucleotídeos
Ebr1/Ebr5 agrupadas pelo método neighbor-joining no programa Mega4.
4.0 DISCUSSÃO
O exame de PCR gênero-específico utilizado como triagem foi escolhido
para possibilitar a detecção de outras espécies do gênero Ehrlichia entre as
amostras do estudo. Após o exame espécie-específico, constatou-se que todas as
amostras eram da espécie E. canis, o que ficou comprovado pelos estudos de
caracterização molecular subseqüentes.
Os resultados obtidos pela leitura das árvores filogenéticas demonstram
alta similaridade entre as amostras regionais e amostras de diferentes regiões
geográficas. Os mesmos suportam estudo precedente que indica que as cepas de
60
Ehrlichia de diferentes regiões geográficas são uniformes e que os estudos
desenvolvidos com base em um isolado são geralmente aplicáveis aos demais
(PINYOOWONG et al., 2008).
De acordo com DUMLER et al. (2001), o gene 16S rRNA é altamente
conservado com baixas freqüências de mutações. Este fato também foi
observado neste estudo, demonstrado pela alta similaridade entre a maioria dos
isolados regionais, tanto na comparação entre eles, como na comparação
realizada entre os diferentes isolados de regiões geográficas distantes
disponibilizados no GenBank. A alta similaridade das sequências de diferentes
regiões foi anteriormente observada por AGUIRRE et al. (2006); e PYNYWOONG
et al. (2008) e os resultados corroboram os resultados obtidos neste estudo.
No Brasil têm sido realizados estudos envolvendo biologia molecular na
busca de outras espécies do gênero Ehrlichia. Entre estes destacam-se os
primeiros diagnósticos com base em técnica molecular no País para E.
chaffeensis (MACHADO et al., 2006) e E. ewingii (OLIVEIRA et al., 2009). No
primeiro, a presença de E. chaffeensis foi confirmada em três animais silvestres
(Cervo do Pantanal - Blastocerus dichotomus) capturados no Mato Grosso do Sul,
pela técnica de nested-PCR. No estudo sete animais foram avaliados e três
destes apresentaram resultado positivo para o agente em exame da PCR. O
trabalho evidencia a primeiro relato da presença de E. chaffeensis por infecção
natural em animais do Brasil. A sequência obtida neste estudo foi incluída na
árvore filogenética do presente trabalho e a mesma formou um clado distinto
juntamente com outros dois isolados de E. chaffeensis, um proveniente de uma
amostra obtida de ser humano nos EUA (U23503), e outro isolado de carrapato
na Coréia (EU181144).
Considerando-se a extensão territorial do Estado, e o número de
amostras avaliadas é necessário o incremento de maior número de estudos desta
natureza, para contribuir com o melhor conhecimento da identidade taxonômica
dos microrganismos envolvidos nas infecções por Ehrlichia não apenas no estado
de Goiás, mas nas diferentes áreas do País.
No Brasil casos de ehrlichiose humana foram registrados por CALIC et
al. (2004) e COSTA et al. (2007) com diagnóstico sorológico positivo para
E.chaffeensis em indivíduos com sintomas sugestivos de ehrlichiose no estado de
61
Minas Gerais, o que aponta para a necessidade e a importância do emprego de
métodos moleculares em estudos envolvendo este tema.
5.0 CONCLUSÕES
1) Análises de similaridade molecular e testes espécie-específicos de
PCR identificaram a espécie E. canis entre diferentes amostras clínicas
provenientes de cães no município de Goiânia.
2) A análise filogenética permitiu a conclusão de que os isolados de E.
canis provenientes da cidade de Goiânia – GO, apresentam estreita similaridade
com isolados de E. canis das demais regiões do Brasil e outras regiões do
mundo.
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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65
CAPÍTULO 5
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho é o primeiro estudo filogenético de Babesia, Ehrlichia e
Hepatozoon desenvolvido com amostras de origem canina no estado de Goiás.
Possibilitou a identificação das espécies de parasitos presentes nos animais
atendidos no HV da UFG da escola de veterinária durante o período de janeiro a
agosto de 2008 e a verificação de similaridade existente entre estas amostras e
cepas de outras regiões do mundo.
Anteriormente, a identificação dos hemoparasitos era realizada
unicamente com base na morfologia, pela avaliação dos parâmetros e formas
intracelulares observadas nos esfregaços sanguíneos de animais vertebrados
infectados. Este diagnóstico, juntamente com a avaliação da especificidade do
hospedeiro (vertebrado e invertebrado), forneceu meios para a classificação de
várias espécies e estes critérios foram os únicos adotados até recentemente.
Há pouco mais de 10 anos, os parâmetros de identificação passaram a
ser reavaliados e dessa forma, além dos dados já conhecidos, foram agregadas
informações moleculares que contribuíram para uma melhor compreensão da
filogenética dos hemoparasitos e a denominação de novas espécies, até o
momento desconhecidas. As ferramentas moleculares devem ser consideradas
como acessórias à microscopia direta, pois sua fundamental importância se dá
pela capacidade em detectar e identificar precisamente as espécies e
subespécies de hemoparasitos, especialmente em condições de baixa
parasitemia ou em situações onde a morfologia não é conclusiva.
No presente trabalho foram identificadas espécies de hemoparasitos que
coincidem com as espécies identificadas por outros trabalhos desenvolvidos no
Brasil. Na pesquisa dos agentes do gênero Babesia identificou-se a subespécie
B. canis vogeli. Na do gênero Hepatozoon a espécie H. canis e do gênero
Ehrlichia foi identificada a E. canis.
Com base em informações nas pesquisas relacionadas a hemoparasitos
desenvolvidas em diferentes regiões do mundo entende-se que a relação
parasito-hospedeiro parece ser menos restrita do que se acreditava em estudos
66
anteriores e que espécies de hemoparasitos podem causar infecções em
diferentes hospedeiros, sejam animais domésticos, silvestres ou seres humanos.
Os resultados aqui obtidos proporcionaram conhecimentos importantes
para o esclarecimento da etiologia e epidemiologia dos agentes da babesiose,
ehrlichiose e hepatozoonose canina ocorrentes em cães da microrregião de
Goiânia-GO. As informações obtidas servirão de base para nortear novas
pesquisas científicas voltadas a estudos epidemiológicos, clínico-patológicos e
terapêuticos.
Considerando a ampla variedade de animais silvestres no Brasil que
podem servir como reservatórios para as riquétssias e prozoários que determinam
a infecção em seres humanos, os estudos relativos a estes agentes tornam-se
importantes na saúde pública.
Neste estudo não foram identificados agentes reconhecidos como
zoonóticos. Contudo, o desenvolvimento do trabalho propiciou a adoção e
aplicação de técnicas que podem agora ser utilizadas em futuras pesquisas com
este fim.
Conhecendo-se os reais agentes patogênicos e oferecendo informações
genéticas a respeito dos mesmos é possível classificar genes que propiciem a
infectividade do mesmo e criar métodos para silenciar genes que determinem sua
patogenicidade. Além disso, a disponibilidade de informações acerca das
hemoparasitoses na região de Goiânia pode ainda contribuir para o
esclarecimento dos reais agentes zoonóticos e possíveis riscos à saúde humana
no município.
As informações obtidas neste trabalho inserem o Estado de Goiás no
âmbito da pesquisa filogenética mundial, já que as sequências disponibilizadas no
banco de dados mundial, o GenBank, podem ser agora utilizadas por diferentes
pesquisadores em todo o mundo. Os dados gerados são de grande importância,
pois oferecem informações de isolados brasileiros que podem ser confrontados
com isolados de outras regiões do País. Até recentemente não havia informações
disponíveis de isolados brasileiros, sendo possível a realização de estudos
utilizando-se apenas isolados de outras regiões do mundo. Entende-se que estas
informações podem não ser suficientes, tanto pela grande extensão territorial do
Estado, quanto pelo grande número de animais suscetíveis aos patógenos
67
avaliados, mas são fundamentais para gerar uma biblioteca de dados que
norteiem pesquisas futuras.
O trabalho colaborou para a disponibilização e adoção de técnicas
moleculares para fins de pesquisa e extensão no âmbito da Escola de Veterinária
da UFG, o que também possibilitará a transferência de tecnologia a alunos da
Universidade e parceiros de outras instituições.
A execução do projeto contribuiu ainda para o treinamento e capacitação
na técnica de seqüenciamento de amostras de DNA, técnica esta que tem
possibilitado avanços importantes no conhecimento científico sobre a natureza
dos microrganismos. Além disso, foi possível obter informações acerca da
construção de árvores filogenéticas, interpretação e processamento dos dados
fornecidos pelo sequenciador automático, aspecto fundamental, uma vez que o
processamento destes dados é o grande entrave no desenvolvimento de estudos
com esta finalidade.
Acredita-se que novos estudos se façam necessários, considerando-se a
importância de serem coletados dados sobre um número cada vez maior de
isolados e a disponibilização de informações de diferentes regiões do Brasil. Da
mesma forma trabalhos associando transmissão experimental e biologia
molecular são fundamentais no sentido de se obter informações a respeito das
espécies e possíveis genogrupos ocorrentes no Brasil.
