Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris

Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos

Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) e de cães domiciliados no ciclo de transmissão da leishmaniose visceral no município de Camaçari, localidade de Barra do

Pojuca, Bahia

CYRO DE MORAES BARBOSA GOMES NETO

SALVADOR - BAHIA

2006

ii


PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES

DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA

DO POJUCA, BAHIA

Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Franke Co-orientadora: Profª Drª Maria Emília Bavia

Salvador – Bahia 2006

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FICHA CATALOGRÁFICA GOMES NETO, Cyro de Moraes Barbosa PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA – Salvador, 28 de agosto de 2006, 79p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, 2006. Orientador – Prof. Dr. Carlos Roberto Franke Co-orientador – Profª Drª Maria Emília Bavia Palavras-chave – Leishmaniose, leishmaniose visceral canina, reservatórios, Didelphis albiventris, sariguê, gambá, timbú.

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PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis

albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES

DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE

VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO

POJUCA, BAHIA


Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.

Salvador, 28 de agosto de 2006

Comissão Examinadora:

___________________________________________ Prof. Dr. Carlos Roberto Franke – EMV/UFBA

Orientador

__________________________________________ Prof. Dr. Paulo Henrique Palis Aguiar – EMV/UFBA

___________________________________________ Prof. Dr. Wilfried Klein – Instituto de Biologia/UFBA

v

Dedico este trabalho a todos aquelesque direta ou indiretamente tenhamcontribuído para o meu crescimentopessoal e profissional.

vi

AGRADECIMENTOS

• À DEUS, por tudo o que sei que Ele tem reservado para mim e mesmo

pelo que ainda ignoro pois confio em Sua sabedoria;

• A meus pais, Cyro de Moraes Barbosa Gomes Júnior e Dalva Liz Pires Moreira Gomes, que de uma forma ou de outra sempre zelaram

por mim e proveram os subsídios necessários ao meu bom

desenvolvimento. Com ênfase, à minha Mãe, Dalva Liz Pires Moreira Gomes, pessoa mais importante em toda a minha vida, sendo o alicerce

de toda nossa família e constituindo-se na minha maior incentivadora.

• A minha sempre presente e amada Vó Maria – Maria Moreira da Rocha Pires (in memorian) que com seu jeito simples sempre me

incentivava e estimulava a continuar a obter o que ela carinhosamente

chamava de “diploma de Doutor”

• Aos meus amados Arthur, Guilherme e Shirlei Pimentel Santos Barbosa Gomes, que me propiciaram a constituição de uma família.

Agradeço assim, todo o amor, carinho, momentos felizes, enfim a nossa

convivência ate então;

• Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pela amizade e companheirismo

ao longo dos últimos anos e bem como pela liberdade e confiança em

mim depositados com o intuito de desenvolvermos esse projeto;

• Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pelo apoio logístico e financeiro

em muitos momentos quando o LIVE não pôde suprir sozinho tais

gastos ligados à minha pesquisa;

• Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pela orientação ao longo desses

anos;

• Aos amigos e colegas, Alberto Conceição Bispo, Antonio Eduardo Araújo Barbosa, Aroldo Borges Carneiro, Danielle Custódio Leal, Fred da Silva Julião, Joseph Mathias Urban e Shirlei Pimentel Santos Barbosa Gomes, pelo trabalho de campo de captura de

marsupiais e coleta de amostras biológicas, bem como pela realização

de questionários epidemiológicos aos proprietários de cães examinados

no estudo.

vii

• Aos amigos e colegas, Adriano Costa de Alcântara, Bárbara Maria Paraná da Silva Souza, Danielle Custódio Leal, Débora Cristina Portella Medina Barboza, Diana Vianna Velloso Bittencourt e Lídia Silva Oliveira, do Laboratório de Infectologia Veterinária (LIVE), pela

realização dos exames laboratoriais das amostras coletadas em Barra

do Pojuca, tanto de marsupiais quanto de cães;

• Aos Médicos-veterinários amigos Alberto Conceição Bispo, Alex Aguiar de Oliveira, Antonio Marcos Machado Regis, Fred da Silva Juliao, Nivaldo de Jesus que foram companheiros em muitos

momentos de minha graduação.

• Ao LIVE pelo subsídio de grande parte deste projeto, custeando aos

gastos de aluguel, de água e luz do imóvel utilizado como base de

pesquisa em Barra do Pojuca;

• Ao Professor Geovane Bonina Costa, pelo empréstimo do Freezer do

Lana (Laboratorio de Nutrição Animal) que por sinal consumia uma

energia incomensurável;

• À FAPESB pela bolsa de mestrado de um ano, bem como pelo auxilio

financeiro ao projeto de mestrado no ano de 2005;

• Ao Mestrado em Medicina Veterinária Tropical (Ciência Animal nos Trópicos), mais especificamente nas pessoas de seu coordenador na

época, o Prof. Dr. Ricardo Castelo Branco Albinati, do Prof. Dr. Carlos

Roberto Franke e de Jefferson Costa;

• Aos acadêmicos em Medicina Veterinária da UFBA, Ana Paula Portela

Gomes, Ana Paula, Ianei Oliveira;

• A Secretária de Saúde de Camaçari;

• Ao Centro de Controle de Zoonoses (M.V. Marcos Nogueira);

• Ao Centro de Saúde de Barra do Pojuca, mais especificamente aos

agentes de saúde João Gifone, Manuel, Francisco e Antônio;

viii

“De tudo ficou, ficaram três coisas: a certeza que estamos sempre começando,

a certeza que é preciso continuar a certeza que podemos ser interrompidos

antes de terminar. Fazer da interrupção

um novo caminho, fazer da queda um passo de dança,

do medo, uma escada, do sonho, uma ponte

e da procura, um encontro.

Fernando Sabino

ix

SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................x

RESUMO.........................................................................................................xi SUMMARY......................................................................................................xii 1. INTRODUÇÃO......................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 4

2.1. ETIOLOGIA....................................................................................... 4

2.2. DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA........................................................ 9

2.3. VETOR.............................................................................................. 11

2.4. CONTROLE...................................................................................... 12

2.4.1. Técnicas parasitológicas para o diagnostico da LV................ 17

2.5. RESERVATÓRIOS............................................................................27

2.5.1. Cão (Canis familiaris)...............................................................27

2.5.2. Animais Selvagens...................................................................29

2.5.2.1. Raposas.........................................................................31

2.5.2.2. Marsupiais......................................................................32

3. ARTIGO CIENTÍFICO..............................................................................36 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS.....................................................................55 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................56 ANEXO I. Questionário Epidemiológico ........................................................77

x

LISTA DE ABREVIATURAS ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais não-

renováveis

K Corresponde a G ou T (Combinação de primer degenerado)

LV Leishmaniose visceral

LVC Leishmaniose visceral canina

OMS Organização Mundial de Saúde

OPD Orto-FenilenoDiamina (ortho-PhenyleneDiamine)

PCR Reação em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction)

S Corresponde a C ou G (Combinação de primer degenerado)

W Corresponde a A ou T (Combinação de primer degenerado)

xi

GOMES NETO, C.M.B. PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL (Didelphis albiventris) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSAO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICIPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador,

Bahia, 2006. 56 p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciência Animal nos

Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,

2006.

RESUMO

O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem

sendo citado na literatura como importante reservatório de algumas zoonoses,

dentre elas a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de

Chagas, doenças consideradas pela Organização Mundial de Saúde (OMS)

como endemias de ação prioritárias. Nosso estudo na localidade de Barra do

Pojuca, Camaçari, Bahia, avaliou a prevalência da leishmaniose visceral em

marsupiais e cães pelas técnicas de ELISA e PCR. Os resultados apontam

para uma participação da espécie Didelphis albiventris na epidemiologia da

doença com uma soroprevalência de 26,7% (4/15) e 64,7% (11/17) positivos na

PCR. A prevalência da população canina foi de 15,6% (39/253), mostrando que

comparada a estudos realizados em 2003 esta taxa não tem diminuído, apesar

do controle vetorial e do reservatório canino realizado pelos agentes da saúde

na área. Os resultados mostram a necessidade de ampliar o conhecimento,

buscando definir com clareza o papel da espécie Didelphis albiventris no ciclo

de transmissão da L. chagasi e o risco que representa para as populações

humanas e caninas nas áreas endêmicas.

PALAVRAS-CHAVE: leishmaniose visceral, Didelphis albiventris, reservatório

selvagem, Leishmania chagasi, Bahia

xii

GOMES NETO, C.M.B. THE EVALUATION OF OPOSSUM (Didelphis albiventris) AND DOMICILIATED DOGS INVOLVEMENT IN THE VISCERAL LEISHMANIASIS TRANSMITION CYCLE IN THE MUNICIPALITY OF CAMAÇARI, LOCALITY OF BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador, Bahia,

2006. 56 p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciência Animal nos

Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,

2006.

SUMMARY The opossum Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) has

been considered an important reservoir of some zoonosis in the literature, like

visceral and cutaneous leishmaniasis and Chagas disease, which are

considered by WHO as high priority endemic diseases. Our study, carried out in

the area of Barra do Pojuca (Camaçari, Bahia), evaluated the visceral

leishmaniasis seroprevalence in opossum and dogs using indirect ELISA and

PCR. The findings point out the involvement of Didelphis albiventris in the

disease epidemiology, presenting a seroprevalence of 26,7% (4/15) and 64,7%

(11/17) positivity by PCR. The canine population prevalence reached 15,6%

(39/253), showing that, compared to a study performed in 2003, its prevalence

is not decreasing, despite vector and canine reservoir control has been done by

the health control agents in the area. The results presented here clearly ask for

an increase of knowledge, looking to define properly the role of Didelphis

albiventris in the Leishmania chagasi transmission cycle and risk for human and

canine populations in the endemic areas.

KEYWORDS: Visceral Leishmaniasis, Didelphis albiventris, wild reservoirs,

Leishmania chagasi, Bahia

1

1. INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose causada por protozoários do gênero

Leishmania, transmitida ao homem, ao cão, e a alguns animais selvagens,

principalmente àqueles de hábitos sinantrópicos, através da picada da fêmea do

flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (LUTZ & NEIVA 1912) (BADARÓ, et al. 1986;

LAINSON et al. 1987; GRIMALDI et al. 1989; CORREDOR et al. 1989a,

ASHFORD, 1997; TRAVI, 1998a) quando do advento de seu repasto sanguíneo,

onde este inocula formas promastigotas do parasito L. chagasi (CUNHA &

CHAGAS, 1937) em um outro hospedeiro (BRASIL, 2003). A LV é causada pela L.

chagasi (nas Américas) e Leishmania infantum (no Velho Mundo). A L. chagasi é o

principal responsável pela infecção leishmaniótica no Brasil (MARZOCHI et al.,

1981; DESJEUX, 1996; MILES et al., 1999).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) a incidência anual da LV no

mundo é de cerca de 500.000 novos casos humanos, dos quais 90% concentram-

se no Brasil, Bangladesh, Nepal (DESJEUX, 2004; BERN et al. 2005), Índia e

Sudão. A doença no Brasil é predominante na Região Nordeste com

aproximadamente 77% dos casos nacionais (BRASIL, 2003), valendo ressaltar

que esta proporção está diminuindo em virtude do surgimento de novos focos na

região Sudeste, principalmente em Minas Gerais (OLIVEIRA et al. 2001). O estado

da Bahia desponta entre os estados brasileiros como o de maior número de casos

de leishmaniose visceral humana, tendo registrado em média 1.500 novos casos

por ano (FRANKE, et al. 2002b, BRASIL, 2003).

A LV é uma doença de grande impacto na saúde pública (CUNHA et al. 1995;

TESH, 1995; DESJEUX, 1996; BEVILACQUA et al., 2001; SAVANI et al., 2003),

caracterizando-se pela evolução crônica e debilitante (DEANE & DEANE, 1954;

MARZOCHI, et al. 1981), além de oportunista (WHO, 1997; WOLDAY et al. 1999;

LYONS et al. 2003) e especialmente agressiva aos indivíduos com nutrição

2

deficiente e de baixa condição socioeconômica (CERF et al. 1987), ou que vivam

em regiões especialmente afetadas por longas secas agravadas pela ocorrência

periódica do El Niño (EVANS et al. 1990, 1992; THOMPSON et al. 2002; FRANKE

et al. 2002a). Segundo SHERLOCK (1996), o ciclo de transmissão da LV envolve

a participação de animais selvagens como marsupiais (Didelphis albiventris) e

raposas (Cerdocyon thous Linnaeus, 1766), além de outras espécies selvagens e

domésticas (cachorro-do-mato, marsupiais, asnos, roedores) (COURTENAY et al.

1994, 1996; ZERPA et al. 2002; CERQUEIRA et al. 2003; MOHEBALI et al. 2005),

porém, dados epidemiológicos mais precisos ainda são insuficientes para

quantificar estas relações, demandando estudos específicos com este propósito

(ARIAS & NAIFF, 1981; SILVEIRA et al. 1982; TRAVI et al. 1994, 1998a, 1998b;

CABRERA et al. 2003; LAINSON, et al. 2005).

Com a descoberta de um espécime de D. albiventris naturalmente infectado por L.

chagasi em Jacobina – Bahia (SHERLOCK et al. 1984, 1988b) e com a

confirmação através de infecção experimental (SHERLOCK et al. 1988a), o

espectro epidemiológico da LV no mundo foi ampliado, no entanto as medidas

praticadas pelos órgãos de saúde para o controle da LV permanecem sendo o

diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, controle da população

canina e vetorial (DEANE & DEANE, 1954; ALENCAR, 1956; DYE, 1996; BRASIL,

2003). A inclusão de medidas relativas ao controle populacional de reservatórios

selvagens do parasito ainda não tem sido cogitada, apesar dos indícios sobre o

papel de reservatório destas espécies, contribuindo para a reintrodução do

parasito nas populações humanas e caninas em áreas onde as ações de controle

são aplicadas (DYE, 1996; DIETZE et al. 1997).

Os didelfídeos (do latim Di = duplo e Delphos = ventre), como o próprio nome

indica, possuem uma gestação dividida em duas fases, onde uma etapa ocorre no

útero do animal, seguida pela fase final que transcorre no marsúpio. As espécies

do gênero Didelphis têm sido utilizadas experimentalmente em vista desta

característica reprodutiva (RENFREE, 1981; CÁCERES, 2002), permitindo a

3

observação do desenvolvimento embrionário em virtude da produção de embriões

facilmente acessíveis, o que se torna interessante aos estudos histológicos,

toxicológicos e reprodutivos (BLOCK, 1960; SHERWOOD, et al. 1969). Alguns

autores têm se dedicado ao estudo deste gênero, abordando temas como: a dieta,

o comportamento, o uso e distribuição espacial e o potencial de dispersor de

sementes em floresta pela espécie D. albiventris (CÁCERES, 2000; 2002; 2005); a

participação do D. albiventris na epidemiologia da Doença de Chagas (JANSEN et

al. 1991, 1997, 1999, 2003, 2005; SCHWEIGMANN et al. 1999) entre outros

aspectos.

O presente trabalho dedicou-se à avaliação do possível envolvimento da espécie

D. albiventris no ciclo da leishmaniose visceral canina (LVC), objetivando contribuir

para o conhecimento sobre este novo aspecto epidemiológico e para a reflexão

sobre o aprimoramento das medidas de controle desta zoonose.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ETIOLOGIA

O primeiro reconhecimento dos parasitos pertencentes, atualmente, ao gênero

Leishmania foi feito por CUNNINGHAM em 1885. Apesar disso, somente em 1900

William Leishman encontrou formas amastigotas distintas em vertebrados

infectados por Trypanossoma. Em 1903, Charles Donovan também encontrou o

mesmo parasito em pacientes que apresentavam a Doença de Chagas. No

entanto as anotações de Leishman só foram publicadas em 1903, em virtude da

coincidência nas datas os pesquisadores foram homenageados através do nome

dado ao parasito - Leishmania donovani.

O gênero Leishmania Ross, 1903 (Kinetoplastida: Trypanossomatidae) inclui

aproximadamente 30 espécies diferentes que são classificadas em dois

subgêneros, Leishmania e Viannia, possuindo padrões epidemiológicos distintos e

algumas espécies com acentuada preferência por reservatórios específicos

(MOMEM, 2000).

Nicole e Compte (1908), em trabalho realizado na Tunísia, encontraram

leishmania em cães e sugerem a efetiva participação dos colonizadores

portugueses e espanhóis na introdução da L. chagasi no Novo Mundo, através da

provável vinda de cães infectados acompanhando os primeiros colonizadores.

As leishmanioses representam um grande impacto à saúde pública nas regiões de

sua ocorrência, sendo considerada pela OMS como uma das seis principais

endemias da atualidade. Os protozoários pertencentes ao complexo Donovani,

envolvidos na forma visceral da doença são divididos em três espécies L. chagasi,

L. infantum e L. donovani, as quais apresentam ainda sub-espécies que diferem

entre si por ínfimas frações gênicas, distribuição geográfica, predileção por

5

hospedeiros, reservatórios e vetores (CUNHA et al. 1995; TESH 1995; DESJEUX,

1996; BEVILACQUA et al., 2001; SAVANI et al. 2003).

O agente etiológico da LV nas Américas é o protozoário denominado L. chagasi.

Este protozoário apresenta um ciclo biológico heteroxênico, apresentando duas

formas distintas: a forma promastigota, presente no vetor (Lutzomyia longipalpis)

que se caracteriza por ser flagelada e considerada como a forma infectante

(transmitida pelo vetor aos novos hospedeiros - homem, cães ou animais

selvagens), e a forma aflagelada ou amastigota, encontrada no interior de

macrófagos e monócitos, apresentando um tropismo pelo sistema fagocítico

mononuclear dos hospedeiros e reservatórios (DESJEUX et al. 1983; LAINSON et

al. 1985; LE PONT & DESJEUX, 1985; BRASIL, 2003; TAUIL, 2006).

Dentre os principais fatores responsáveis pelo aumento de risco de infecção por L.

chagasi em humanos, a presença de cães infectados é um dos mais importantes

em áreas periurbanas e urbanas. A elevação da prevalência canina precede

freqüentemente ao surgimento de novos casos humanos de LV na mesma área

(PARANHOS-SILVA et al. 1996; COSTA et al. 1990, 1999). Especialmente em

crianças, o estado nutricional apresenta um relacionamento direto com a forma

evolutiva de manifestações clinicas da doença, apresentando os sintomas

clássicos evidenciados em indivíduos em estagio de subnutrição ou desnutrição

avançados (ZERPA et al. 2003). Estudos experimentais na África tem

demonstrado que uma pessoa que apresente uma alimentação deficitária em

energia, proteína, ferro e vitamina A tende a apresentar falhas no funcionamento

dos linfonódos e conseqüentemente incapacidade de responder imunologicamente

às alterações decorrentes da LV (CERF et al. 1987; HARRISON et al. 1986;

ANSTEAD et al. 2001; ALVAR et al. 2006).

Além dos fatores sócio-econômicos, determinantes da qualidade de vida das

populações, condições ambientais como, influencia da temperatura,

desmatamento, seca prolongada, criação de animais domésticos (cão, galinhas,

6

porcos, caprinos, bovinos) ou determinadas práticas agrícolas que atraiam direta

ou indiretamente o vetor e ou reservatórios selvagens ao peridomicílio, contribuem

para o aumento do risco de infecção das populações humanas e caninas

susceptíveis. (LANE, 1986; BRAZIL et al. 1987; CERF et al. 1987; MUTINGA et al.

1989; KILLICK-KENDRICK, 1990; BRANDAO-FILHO et al. 1999; LAMPO, 2000;

ALEXANDER et al. 2002; FRANKE, 2002a; BERN et al. 2005; MORAES SILVA,

2006).

A incidência da LV em crianças é mais proeminente em virtude do

desenvolvimento incompleto de seu sistema imune, visto que ainda não se atingiu

a maturidade imunológica. Estudos científicos vêm sendo realizados com o

objetivo de se determinar em que momento essa maturidade é atingida, no

entanto sabe-se que a faixa etária de 24 a 71 meses é a mais atingida pela LV.

Outra categoria que apresenta grande incidência corresponde a dos indivíduos

adultos portadores de AIDS ou de outras patologias de caráter imunodepressor

(PEARSON et al. 1996; SUNDAR et al. 1994; DI MARTINO et al. 1997; BADARÓ

et al. 1990; CALDAS et al. 1999; THOMPSON, et al. 2002; PAREDES et al. 2003).

Os portadores de co-infecção Leishmania/HIV têm sido considerados importante

fonte de infecção, através da doação de sangue ou quando são usuários de

drogas injetáveis pelo compartilhamento da seringa (ALVAR et al. 1994).

O clima desempenha um importante papel no ciclo epidêmico da LV, através de

alterações ecológicas, demográficas e ambientais, movimentos populacionais e

processos de urbanização, especialmente em regiões endêmicas expostas a

regimes pluviométricos irregulares, com prolongados períodos de estiagem.

ELNAIEM e colaboradores (2002) provaram que a influencia da precipitação

pluviométrica media e da altitude exercem sobre a presença e a incidência de LV

no Sudão. Com o corrente fenômeno de “aquecimento global” as alterações

ecológicas e ambientais de origem natural ou antrópica podem levar a alterações

em toda estrutura de fauna e flora de uma região conduzindo à formação de um

novo microclima propicio à proliferação de flebótomos ou ao seu deslocamento

7

para uma região anteriormente indene para LV. Os processos de urbanização,

movimentos de transumância, êxodo rural e outras formas de migração também

podem acarretar em adensamentos populacionais e ter como conseqüência a

habitação em condições de pobreza e de precariedade higiênico-sanitária, fatores

relevantes em se tratando de LV (TRAVI et al. 2002; BALDI et al. 2004). Entre as

influências que o clima pode ocasionar em relação à incidência da LV já estão

comprovadas, a diminuição da carga vetorial e conseqüente queda nas

incidências canina e humana, outra influencia seria o aumento do êxodo rural. A

modificação da paisagem natural, tanto por influência humana ou não pode

conduzir ao surgimento de novos ciclos da doença em uma região (TEODORO,

1987). Como alterações climáticas, normalmente, originam-se de causas

múltiplas, é de se esperar que os resultados dessas alterações também sejam os

mais variados possíveis, sendo assim, em se tratando do impacto que essas

possíveis alterações possam ter frente a incidência da LV, é imprescindível que os

estudos relacionados a esse tema considerem tanto a sazonalidade quanto os já

conhecidos fenômenos climáticos (PATZ et al. 2000; ELNAIEM et al. 2002;

FRANKE et al. 2002a).

Observa-se em períodos longos de seca uma redução da densidade da população

vetorial (de flebotomíneos), reduzindo conseqüentemente a pressão de infecção e

a incidência da LV. Com a chegada do período de chuvas, a densidade vetorial

que estava minimizada passa a multiplicar-se intensamente levando a um

reequilíbrio da quantidade inicial dessa população. Nesse intervalo de tempo, a

população de hospedeiros (homens e cães) tornou-se mais suscetíveis a infecção,

em virtude das migrações e de nascimentos de crianças, ocorridos desde o início

da estação de seca, compondo uma população sem exposição prévia ao parasito.

Nestes casos observa-se um incremento da incidência da LV nas regiões mais

atingidas pela seca (THOMPSON et al. 2002; PETERSON et al. 2002). Fato

semelhante foi observado por FRANKE e colaboradores (2002a) associado à

ocorrência do fenômeno climático conhecido por El Niño e sua influência

acentuada na região semi-árida do Estado da Bahia, quando os autores

8

observaram a elevação periódica da incidência anual da LV posterior a todos os

períodos de ocorrência do El Niño. A partir dessa analise do El Niño, em estudo

realizado na Colômbia, CARDENAS e colaboradores (2006) verificaram que a

incidência de LV aumentava com a chegada do El Niño e diminuía nas fases em

que La Niña se manifestava.

Alterações ambientais de caráter antrópico, como desmatamento, promoção de

queimadas, construção de habitações, aberturas de estradas entre outras, estão

associadas ao surgimento endêmico da LV, em virtude da redução dos nichos

ecológicos de espécies animais e vetores (potencialmente infectados com L.

chagasi) e do aumento de disputas intra e interespecificas por espaço e alimento,

ocasionando a imigração destes para as áreas periurbanas em busca de alimento

e abrigo, dando início a disseminação de LV nas populações humana e canina

destas áreas (PATZ et al. 2000; MOLYNEUX, 1998; GUERRA et al. 2004).

KILLICK-KENDRICK (1997) relata a característica inicial da LV na região sul da

Europa como sendo predominantemente rural, evoluindo na atualidade para um

perfil epidemiológico mais urbano, devido à migração de pessoas e animais

infectados e aglomeração de pessoas em condições precárias de saneamento

básico.

Algumas profissões a exemplo de garimpeiros, pesquisadores, dentre outras,

expostas ao contato direto e prolongado com o meio natural, e pessoas que se

dedicam ao acampamento, escotismo, entre outras atividades ou esportes que

tenham o ambiente de silvático como componente, expõem-se mais às picadas do

inseto vetor incrementando o risco de infecção, valendo ressaltar que em estudo

realizado em tribos indígenas de Roraima os garimpeiros serviram realmente

como fonte de infecção (GUERRA, et al. 2004).

9

2.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

A LV está amplamente distribuída pelo mundo, ocorrendo em todos os continentes

com exceção da Antártida e Austrália (DEREURE et al. 1999). No entanto, alguns

poucos países concentram a maior parte da casuística como Bangladesh, Nepal,

Índia, Sudão e Brasil registrando cerca de 90% dos casos. A LV é endêmica em

88 países (22 das Américas e 66 no Velho Mundo), apresentando uma incidência

média anual de 500.000 casos (MONTEIRO et al. 1994; DESJEUX, 1996).

HAMIDI e colaboradores (1982) avaliaram no Norte do Irã a prevalência de LV

entre chacais e cães, registrando 4/161 chacais e 3/100 cães parasitologicamente

positivos, sendo que a sorologia (IFAT), realizada em um número mais reduzido

de animais, apresentou positividade em 6/48 e 6/34 respectivamente.

FIGURA 01. Distribuição de casos leishmaniose visceral no mundo segundo a Organização Mundial de Saúde, 2003. No Brasil, a LV concentra-se na região Nordeste com o registro de

aproximadamente 72% dos casos nacionais (BRASIL, 2003). Há pouco menos de

uma década esse numero correspondia a 92%, no entanto com o surgimento de

novos casos da doença em outras capitais e metrópoles brasileiras, a exemplo do

Rio de Janeiro (RJ), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina

10

(PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e mais

recentemente as epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS),

Campo Grande (MS) e Palmas (TO). Historicamente, o estado da Bahia tem

apresentado o maior número de novos casos de LV humana dentre os estados

brasileiros, com uma média de 1.500 casos por ano e um acelerado processo de

expansão da área endêmica nas últimas décadas (FRANKE, et al. 2002b,

BRASIL, 2003). Franke e colaboradores (2002b) demonstraram, através de mapas

temáticos, baseados em uma longa serie histórica (1985 a 1999) da leishmaniose

visceral e cutânea no estado da Bahia, que a propagação da doença é um fato

concreto e que com o passar dos anos vem se intensificando.

FIGURA 02. Distribuição de casos autóctones de leishmaniose visceral segundo município, Brasil 2002.

11

2.3 VETOR

O principal vetor da LV no Brasil é a Lutzomyia longipalpis (LUTZ & NEIVA, 1912),

havendo relatos também do envolvimento da Lutzomyia cruzi no Estado do Mato

Grosso Sul. (DOS SANTOS et al. 1998). O L. longipalpis (Diptera: Psychodidae:

Phlebotominae) é um inseto díptero flebotomíneo vulgarmente denominado de

“asa branca”, “birigui”, “tatuquira”, “mosquito palha”, “cangalhinha”, medindo de 1 a

3 mm apresentando o comportamento de pousar com as asas entreabertas e de

voar em pequenos saltos. Informações a respeito de comportamento, habitat,

hábitos reprodutivos ainda são escassos. (DEANE, 1961; LAINSON, et al. 1977,

1984, 1985; ZELEDON, et al. 1984; GONÇALVES, 1985; CARRASCO &

MORRISON, 1998).

A L. chagasi é transmitida pela fêmea da espécie L. longipalpis, a qual apresenta

hábito hematófago, especialmente durante seu período reprodutivo, em virtude da

demanda por um suprimento protéico necessário a produção de ovos. A ingestão

de sangue em um animal infectado – com macrófagos contendo formas

amastigotas de L. chagasi – irá acarretar a infecção do vetor. Decorridos alguns

dias (aproximadamente sete dias), essas formas amastigotas sofreram alterações

bioquímicas e estruturais e convertem-se em formas intermediárias (exclusiva do

vetor) denominadas paramastigotas e começam a fixar-se nas paredes do

aparelho digestivo do inseto até atingir a probóscide do inseto, se transformam na

forma flagelada infectante denominada promastigota. Considera-se que o acúmulo

destas formas na probóscide do inseto dificulte novos repastos sanguíneos,

fazendo com que o vetor aumente a freqüência destes repastos, possivelmente

ampliando o número de animais picados. Esta obstrução parcial da probóscide

provocaria, também, um movimento de regurgitação do conteúdo (inclusive com

formas promastigotas do parasito) para o interior do hospedeiro durante o ato de

sugar o sangue o que facilitaria a disseminação da infecção entre um número

maior de hospedeiros (DYE, 1996; LAINSON et al.2005).

12

Matéria orgânica, sombra e umidade são condições essenciais para o

desenvolvimento de larvas de L. longipalpis, sendo essa espécie de flebotomíneo

muito bem adaptada ao ambiente antropizado, e, por conseguinte, provando que a

presença desta espécie em grandes centros urbanos é plenamente viável e fator

desencadeador de surtos epidêmicos de LV (FERRO et al. 1997; OLIVEIRA et al.

2000; RANGEL & LAINSON 2003; MISSAWA & LIMA 2006; OLIVEIRA et al.

2006). O vetor tem hábito noturno quando busca ativamente os animais para seu

repasto sangüíneo. Exemplares adultos são encontrados durante o dia abrigados

em fendas nas pedras, cavernas, galinheiros ou no peridomicílio e intradomicílio.

As fêmeas são atraídas pelos feromônios exalados pelos machos e também por

odores de outros animais, a exemplo de emanações da pele de seres humanos,

bem como pelo CO2 resultante da respiração de cada individuo ou animal

(OSHAGHI et al., 1994; HAMILTON & RAMSOONDAR, 1994; URIBE, 1999;

PINTO et al. 2001; O`SHEA et al. 2002).

2.4 CONTROLE

Para o controle dos focos epidêmicos da LV no Brasil, têm sido preconizadas três

medidas de intervenção: 1. Realização de inquérito sorológico na população

canina, seguido da eliminação dos cães soropositivos; 2. Controle do vetor pela

utilização de inseticidas; 3. Diagnóstico e tratamento dos casos humanos da

doença (WHO, 1993; 1996; LACERDA, 1994; ASHFORD, 1998). Estas medidas já

haviam sido sugeridas desde a década de cinqüenta por DEANE (1954, 1958), e

continuam sendo, praticamente, os únicos recursos para conter os focos

epidêmicos da LV. Mais recentemente, em 2003, com o lançamento do Manual de

13

Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral do Ministério da Saúde, uma nova

medida vem sendo estimulada para tentar controlar a LV definitivamente. Tal

medida baseia-se na conscientização das populações residentes em áreas de

risco de infecção por LV através de atividades de educação em saúde que visem

uma integração maior entre a referida comunidade e os agentes de saúde locais

(BRASIL, 2003).

A LV corresponde atualmente a uma zoonose que apresenta rápida expansão

geográfica no Brasil. Ao longo das últimas décadas, a ineficiência das medidas de

controle ate então adotadas ou a sua não aplicação adequada conduzem a uma

redução apenas temporária da incidência da doença nas áreas atingidas

(SHERLOCK, 1996; FRANKE, 2002b).

A realização de inquéritos sorológicos caninos (amostrais ou censitários), além de

sua função de controle do reservatório canino em extensas áreas, tem papel

fundamental na detecção de focos silenciosos da doença e na delimitação de

regiões ou setores de maior prevalência, onde a execução das medidas de

controle se faz mais necessária. No entanto, limitações no orçamento e na

disponibilidade de pessoal capacitado reduzem a contribuição dos inquéritos a

simples dados gerais de prevalência, pouco adicionando à compreensão das

interações entre ambiente, hospedeiro, reservatório, vetor e aspectos

socioeconômicos próprios da região. No entanto, é justamente com base no

conhecimento sobre estas interações locais que as estratégias de controle da LV

devem ser elaboradas e continuamente ajustadas às subseqüentes alterações

identificadas através de pesquisas específicas (DESJEUX, 2001).

Duas hipóteses são normalmente formuladas para tentar explicar a ineficiência

das medidas de controle da LV e, sobre estas hipóteses, baseia-se quase a

totalidade das investigações epidemiológicas já realizadas. A primeira hipótese

consiste no fato que os testes sorológicos utilizados nos inquéritos caninos falham

ao tentar detectar todos os casos positivos na área estudada, permitindo a

14

permanência de cães infectados, os quais serão responsáveis pela continuidade

da transmissão do parasito nas áreas endêmicas (ALVES & BEVILACQUA, 2004);

a segunda hipótese: nos focos endêmicos da LV, a presença de pessoas com

infecção assintomática constituem importante reservatório do parasito, viabilizando

a continuidade da transmissão nas populações humanas e caninas. Na atual

literatura, ambas hipóteses seriam capazes de justificar o baixo impacto da

eliminação de cães soropositivos sobre a redução da incidência humana da LV

observado em recentes pesquisas (PARANHOS-SILVA et al., 1996; DIETZE,

1997; ASHFORD et al. 1998). No entanto, na literatura brasileira é marcante a

falta de dados conclusivos sobre o envolvimento da fauna sinantrópica (espécies

de roedores, marsupiais e raposas) atuando como reservatório primário da L.

chagasi e sua relação com o registro de casos caninos e humanos da doença.

A hipótese sobre o envolvimento de espécimes de roedores, marsupiais e raposas

na epidemiologia da LV é tão coerente quanto as anteriores para explicar a

ineficiência das medidas de controle, podendo, esta terceira hipótese ser

formulada como segue: o endemismo da LV é decorrente da existência de uma ou

mais espécies de animais silvestres de hábito sinantrópico, ainda não

corretamente avaliadas, atuando como reservatório primário da L. chagasi e

contribuindo, como tal, para uma contínua reintrodução do parasito nas

populações humana e canina através da ação do vetor.

Os trabalhos realizados por LAINSON (1988) e ASHFORD (1996), fornecem

vários exemplos que corroboram com esta hipótese, apresentando uma revisão

sobre as espécies de animais domésticos e selvagens, possivelmente envolvidas

na epidemiologia das leishmanioses na América Latina e em outros continentes.

Além destes, outros trabalhos, também, apontam para a necessidade de estudos

mais detalhados sobre a participação de espécies sinantrópicas no ciclo da LV,

dentre eles podemos citar: MELO et al. (1988) e SILVA et al. (2000) estudando as

raposas; HEISH et al. (1959) e BETTINI et al. (1980) estudando roedores;

15

SHERLOCK et al. (1984, 1988) e CORREDOR et al. (1989b) estudando

marsupiais e roedores.

A LV é uma das doenças mais negligenciadas no mundo atualmente, com um

impacto significativo nas comunidades de baixa renda, em virtude do investimento

no desenvolvimento de novas drogas ser escasso (YAMEY et al. 2002). Alem

disso, o tratamento de cães com drogas anti-leishmaniais, segundo REITHINGER

(2002), não é uma política de controle prático e eficaz, devido à manutenção do

parasito nas comunidades para uma reinfeçcao do flebotomíneos e perpetuação

da infecção em comunidades endêmicas; outro fator complicador reside no

elevado custo das drogas e da alta taxa de reincidiva entre cães tratados e

clinicamente curados (MODABBER, 1989; ROJAS et al. 2006). O que se denota

do supracitado é, realmente, que não se cura um animal portador de LV e sim se

ameniza os sinais clínicos decorrentes dessa doença. Considera-se assim, que as

estratégias alternativas de controle canino, como o uso de coleira impregnada com

inseticida tópico (deltametrina) associadas às medidas higiênico sanitárias

preconizadas são necessárias enquanto se aguarda a criação de uma vacina para

leishmaniose com eficácia comprovada e cobertura vacinal satisfatória (KILLICK-

KENDRICK et al. 1997; GAVGANI et al. 2002).

O tratamento clínico de cães portadores de LV não é recomendado em virtude da

possibilidade, ainda que remota, de se fomentar a formação de cepas resistente

do parasito ao tratamento com antimoniais pentavalentes. Outrossim, a presença

parasitos nos cães infectados que, por ventura, estejam sob tratamento, torna-se

16

um risco iminente de reinfecçao aos seres humanos e animais que coabitem o

mesmo ambiente que esse animal tratado (MODABBER 1989; ALVAR et al. 1994;

REITHINGER, 2002; ROJAS et al. 2006 BERMAN et al. 1982; Jackson 1990;

Robledo et al. 1999 ). No Brasil, o único antimoniato encontrado para uso

comercial no Brasil é o Glucantime (antimoniato de N-metil glucamina) distribuído

pelo sistema único de saúde, no entanto o Ministério da Saúde proibiu a utilização

deste medicamento por veterinários em seus pacientes em virtude de ser um

medicamento de uso humano, no tratamento de cães. Esta medida tem

estimulado, por parte dos clínicos veterinários, a importação do medicamento,

permanecendo o risco de surgimento de parasitos resistentes em decorrência da

rotina de tratamento da LV canina.

17

2.4.1 Técnicas parasitológicas para o diagnostico da LV O exame parasitológico pode ser feito a partir de biópsias aspirativas esplênicas,

medulares, hepáticas e de linfonódos das seguintes formas: 1ª) exame direto dos

aspirados em lâminas por microscopia ótica; 2ª) microscopicamente, verificando

os cultivos in vitro dos aspirados; e 3ª) inoculando animais de laboratório como os

hamsters (Mesocricetus spp.), esperando o surgimento dos sinais clínicos para

executar a detecção do parasito (BRASIL, 2006).

No exame direto, esfregaços ou “imprints” são preparados, fixados em lâmina

por uma solução alcoólica e corados (panótico) para posterior avaliação da

presença de Leishmania sp. nos macrófagos (BRASIL, 2006).

As amostras podem também ser inoculadas em meio de cultivo (meio

monofásico de inseto Schneider ou meio bifásico - meio NNN – Novy, MacNeal

e Nicolle acrescido de agar sangue e coberto com um meio líquido RPMI 1624

contendo entre 10 – 30% de soro fetal bovino - SFB) e cultivadas por 4 a 5

semanas, a 22-28°C, até que as promastigotas de Leishmania spp. possam ser

visualizadas por microscopia invertida ou ótica (BARROUIN-MELO et al. 2006a;

BRASIL, 2006; SCHUSTER & SULLIVAN, 2002; SINGH & SIVAKUMAR, 2003;

SUNDAR & RAI, 2002).

Por último, hamsters podem ser inoculados em laboratório, mas este

procedimento não possui valor diagnóstico por requerer um tempo

consideravelmente longo para que haja o desenvolvimento da sintomatologia e

a confirmação diagnóstica (BRASIL, 2006).

Assim, o exame parasitológico diagnóstico da LVC depende da punção de um

órgão acometido pela infecção (baço, medula óssea, fígado e linfonódos) e na

avaliação via cultivo (BARROUIN-MELO et al. 2006a, 2006b). As principais

desvantagens desta técnica diagnóstica são: 1) a coleta invasiva; 2) tempo para

avaliação diagnóstica; 3) necessidade de meios de cultivo; 4) contaminação

devido à manipulação da amostra; e 5) o teste só pode ser feito em laboratórios

18

especializados.

a) Teste de Aglutinação Direta (DAT)

O teste de aglutinação direta permite o reconhecimento dos antígenos

presentes em promastigotas na microplaca de poliestireno de fundo em V pelos

anticorpos e na aglutinação, formando um produto visual que permite a leitura

(EL-HARITH et al. 1987, 1988; SUNDAR & RAI, 2002). O teste é feito com 11

diluições seriais. A menor diluição onde a aglutinação ainda pode ser

visualizada, é considerada o título do soro avaliado. O teste é lido 18 horas após

a sua execução (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004;


O FAST é semelhante ao DAT podendo ser realizado em 3 horas, executado

com apenas uma diluição e está sendo avaliado, apresentando sensibilidade e

especificidade semelhantes ao DAT (SILVA et al. 2005).

As desvantagens dos testes DAT e FAST estão relacionadas a dependência da

reação antígeno-anticorpo que confirma a presença de anticorpos produzidos

pelo hospedeiro, capazes de reconhecer os antígenos do parasito expostos,

sofrendo aglutinação, permitindo a detecção visual. Além disso, a reatividade

destes anticorpos pode acontecer com antígenos semelhantes de outros

agentes infecciosos, permitindo a conclusão de resultados falso-positivos. Por

último, a permanência da reatividade e produção de anticorpos por períodos

longos é comum e impede a utilização destes exames para avaliação

prognóstica (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO e MELO, 2004;


b) Teste Rápido Anticorpo para L. donovani (TRALd)

O Teste Rápido Anticorpo para L. donovani (TRALd) está associado a adsorção

de uma proteína (Ex. rK39) a uma tira de papel de nitrocelulose contendo, em

19

outra região da mesma fita de papel, proteína A – ouro coloidal que, ao migrar

pelo papel, permite a detecção da reação antígeno-anticorpo que produz um

precipitado visível identificando o soro positivo (CERQUEIRA et al. 2003;

GONTIJO & MELO, 2004).

A desvantagem deste teste tem sido demonstrada em avaliações à campo onde

sua sensibilidade tem sido inferior a de outros testes (Ex. DAT), possivelmente,

devido as diferentes temperaturas ambientais, o que permite a desnaturação

das proteínas associadas ao teste e ao menor tempo de migração das

moléculas no papel filtro, por causa da rápida evaporação, gerando resultados

falso-negativos. A segunda desvantagem é a leitura subjetiva, ocasionando

resultados duvidosos (ZIJLSTRA et al., 2001).

c) Imunofluorescência Indireta (IFI)

A imunofluorescência indireta (IFI), ou teste com anticorpo imunofluorescente

(“Immuno Fluorescent Antibody Test – IFAT”), utiliza-se de lâmina de vidro com

poços sensibilizados com promastigotas ou amastigotas de Leishmania sp.

caracterizadas que, posteriormente, serão expostas ao soro do paciente e a um

anticorpo conjugado a um fluorocromo e contra-corada com azul de Evans. Esta

lâmina será então lida em microscópio de fluorescência. O resultado é a

recíproca da maior diluição do soro do paciente onde a positividade ainda pode

ser detectada (BRASIL, 2006).

O kit de diagnóstico da Leishmaniose brasileiro, produzido por BioManguinhos

(FIOCRUZ), utiliza promastigotas e apresenta 90% de sensibilidade e 80% de

especificidade quando o ponto de corte escolhido é 1:40 (FIOCRUZ, 2006). Na

Índia, títulos reativos, a partir de 1:20, são considerados significantes e títulos de

1:128 são considerados diagnósticos para leishmaniose. O uso da forma

amastigota aumenta a sensibilidade para 96% e mantém a especificidade em

torno de 98%, tendo sido capaz de excluir reatividade cruzada com antígenos

de outros tripanossomatídeos em avaliações feitas na Índia (SINGH e

SIVAKUMAR, 2003).

20

As desvantagens deste teste são o pequeno número de exames por lâmina (10

– 12 amostras por lâmina menos os poços para os controles positivo e

negativo); a reatividade cruzada; a ocorrência de falsos-positivos e falsos-

negativos; e o protocolo é trabalhoso e dificilmente feito a campo (ALVES &

BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004; LEONTIDES et al. 2002;

SINGH & SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR & RAI, 2002).

d) Ensaio de Imunoadsorção Ligado à Enzima (ELISA)

O ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA – “Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay”), ensaio imunoenzimático (EIE) ou imunoensaio

enzimático (EIA – “Enzyme ImmunoAssay”), faz uso de microplacas de

poliestireno de 96 poços, preenchidas ou sensibilizadas com antígenos em

concentrações variando de 100ng até 5µg por poço da placa (ATTA et al., 2004;

BARROUIN-MELO et al., 2006a, 2006b; CABRERA et al., 1999; INIESTA et al.,

2002; LEMESRE et al., 2005; METTLER et al., 2005; MORAES-SILVA et al.,

2006; SAHA et al., 2005; SALOTRA et al., 2003; SOLANO-GALLEGO et al.,

2001, 2003; TALMI-FRANK et al., 2006; VERCAMMEN et al., 2002; ZARAGOZA

et al., 2003), muito embora quantidades diferentes, menores do que as citadas

anteriormente, sejam relatadas em vários trabalhos, principalmente, com

antígenos purificados ou recombinantes (BRAZ et al., 2002; METTLER et al.,

2005; ZERPA et al., 2002; ZIJLSTRA et al., 2001).

Existem algumas variações deste ensaio (direto, indireto, “sandwich”, captura,

inibição, celular, etc), mas, para o diagnóstico da leishmaniose visceral, o mais

amplamente utilizado tem sido o indireto, permitindo a avaliação do soro do

animal infectado, mediante utilização de um sistema enzimático. Assim,

diluições do soro suspeito são adicionadas a placa sensibilizada e bloqueada

para, posteriormente, adicionar-se um anticorpo conjugado a uma enzima,

peroxidase ou fosfatase alcalina (as mais comumente usadas), uma substância

cromogênica e um substrato da enzima capaz de oxidá-la, permitindo a

mudança de cor no poço da placa gerando uma leitura visual (subjetiva) ou

21

objetiva com o apoio de um espectrofotômetro, também conhecido como leitor

de ELISA, com filtros de comprimento de onda específicos para o cromógeno

utilizado (CROWTHER, 2001; GIBBS, 2006).

A reatividade cruzada de diversos antígenos utilizados neste teste, compostos

de extratos “brutos” ou “crus”, como o SLA (Antígeno solúvel de leishmania ou

“Soluble-Leishmania Antigen”), embora sejam amplamente utilizados para

sensibilização das placas, têm sido demonstradas contra outras espécies de

leishmania e com organismos filogeneticamente relacionados como o

Trypanosoma cruzi (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004;

METTLER et al., 2005; SUNDAR e RAI, 2002).

A utilização do antígeno solúvel de promastigotas (SLA) ou de amastigotas de

Leishmania sp., é recomendada para a avaliação epidemiológica em áreas

endêmicas devido a sua alta sensibilidade e especificidade, detectando animais

sintomáticos e assintomáticos com maior freqüência do que antígenos

recombinantes, especificamente o antígeno rK39, além do seu menor custo e da

facilidade de execução do teste ELISA quando comparado com técnicas mais

laboriosas como o PCR (SREENIVAS et al., 2002; METTLER et al., 2005).

A associação entre testes ELISA com antígeno solúvel (promastigotas ou

amastigotas de Leishmania sp.) e com um antígeno recombinante, por exemplo,

o rk39, levariam os resultados sorológicos para um nível superior (MAALEJ et

al., 2003; METTLER et al., 2005).

e) “Western Blotting” ou “Immunoblotting”

O “Western Blotting” ou “Immunoblotting” depende da separação eletroforética

(em campo elétrico) de proteínas em um gel de poliacrilamida (“PAGE” ou

“SDS-PAGE” – “Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”)

que, posteriormente, é transferido para o papel de nitrocelulose ou fluoreto de

polivinilideno (“PVDF” – “PolyVinyliDene Fluoride”) e submetido aos anticorpos

do soro do paciente e revelado com anticorpos conjugados a uma enzima

22

capazes de detectar as imunoglobulinas do soro do paciente (HARLOW e

LANE, 1988). Esta técnica tem sido testada para o diagnóstico sorológico da

leishmaniose (SINGH e SIVAKUMAR, 2003).

A maior sensibilidade e especificidade do “Western blotting” ou “Immunoblotting”

está relacionada ao fato de que os diferentes anticorpos produzidos em

resposta a infecção podem reconhecer as diferentes frações do complexo

antigêncio, separado eletroforeticamente, permitindo o reconhecimento de forma

específica e individual, gerando perfis de reconhecimento distintos, capazes de

confirmar e diferenciar a infecção por Leishmania de outros parasitos, além do

monitoramento, do prognóstico do paciente e da detecção de reações cruzadas,

como demonstrado nas revisões de Sundar e Rai (2002), Singh e Sivakumar

(2003) e nos trabalhos de Atta (2004), Iniesta (2002), Lasri (2003), Saha (2005),

Vercammen (2002), Zaragoza (2003) e seus colaboradores.

A desvantagem desta técnica diagnóstica está na dificuldade de sua execução

(pessoal treinado e equipamentos específicos), na produção do antígeno

utilizado, e, assim como nas outras técnicas sorológicas, a ausência de resposta

(imunossupressão), denota falsos-negativos (MATHIS e DEPLAZES, 1995;

SINGH e SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR e RAI, 2002).

f) Intradermo Reação ou Reação de Montenegro

A intradermo reação, reação de Montenegro, hipersensibilidade tardia do tipo IV

ou DTH (“Type IV Delayed-Type Hypersensitivity”), detecta a resposta imune

celular adquirida que se desenvolve pela ativação dos linfócitos T CD4+

sensibilizados, muito embora células TCD8+ também já tenham sido

associadas. Estas células, após serem apresentadas ao antígeno pelas células

apresentadoras de antígeno dos tecidos, as células de Langerhans, por

exemplo, são estimuladas, tornando-se ativadas e respondendo ao estímulo

antigênico com produção de , entre outras) e quimiocinas (“MIF –?, TNF-a TNF-

?citocinas (IL-2, IFN- Macrophage-Inhibition Factor”, “MCF – Macrophage

Chemotatic Factor” e MAF - “Macrophage Activating Factor”) que mediam a

23

atração para o sítio de inoculação e, posteriormente, ativam macrófagos,

monócitos e linfócitos T. As células ativadas, entre elas os macrófagos, se

acumulam causando inchaço e eritema local. O processo inflamatório instaurado

induz os macrófagos a liberarem enzimas para o meio extracelular causando

destruição tissular que pode ser detectada e medida após 48 – 72 horas da

inoculação do antígeno. Assim, na reação de Montenegro, são inoculados 100 a

500mL de uma solução contendo de 5x106 – 4x108.mL-1 promastigotas de

Leishmania sp. mortas em solução veicular de salina com fenol em um braço e

apenas a solução veicular no outro, que, após 48 – 72 horas, produzirão, em

pacientes sensibilizados e responsivos, uma reação com diâmetro maior ou

igual a 5mm ou, em alguns relatos, 10mm (BRAZ et al., 2002; GONTIJO et al.,

2002; KUBY et al., 1997; MARQUES et al., 2006; OPAS, 2006; ZERPA et al.,

2002).

Esta reação é geralmente ausente ou discreta em pacientes acometidos pela

infecção aguda por Leishmania sp., indicando, em pacientes sintomáticos de

área endêmica, a presença da infecção. Por outro lado, pacientes com reação

positiva apresentam resistência à doença ou a presença de infecção na fase

subclínica e, quando testados pós-tratamento, a positividade tem valor

prognóstico positivo, indicando a cura (SINGH e SIVAKUMAR, 2003).

As maiores desvantagens deste teste são: 1) a inexistência de um antígeno

padronizado; 2) a reatividade cruzada com lepra lepromatosa e tuberculose

glandular; e 3) a falta de estudos rigorosos a campo para a validação do seu

uso diagnóstico e determinação dos valores de sensibilidade, especificidade e

preditivos positivos e negativos (BRASIL, 2006; SINGH e SIVAKUMAR, 2003;

SUNDAR e RAI, 2002).

2.2.3 Eletroforese de Isoenzimas

A eletroforese de isoenzimas ou eletroforese multilocular de enzimas MLEE -

“MultiLocus Enzyme Electrophoresis”, é usada para avaliar a correlação

24

taxonômica entre diferentes organismos, como, por exemplo, na caracterização

de cepas de Leishmania sp. (GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al., 1999).

A técnica MLEE utiliza-se de um suporte físico (gel) para a corrida eletroforética

das enzimas em soluções aquosas. Eletromorfo é a denominação dos padrões

eletroforéticos de separação e, os padrões eletromórficos conjuntamente

recebem o nome de zimodema. Cada zimodema caracteriza as diferentes

Leishmania sp. (BAÑULS et al., 1999; GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al.,

1999).

Várias enzimas são utilizadas para avaliar as cepas de Leishmania como a

malato desidrogenase NADP+ (MDH); malato desidrogenase NAD+ (ME);

glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH); 6-fosfogluconato desidrogenase

(6PGDH); isocitrato desidrogenase (IDH); purina nucleosídio fosforilase (NP1 ou

NP2); fosfoglucomutase (PGM); diaforase (DIA); glutamato oxaloacetato

transaminase (GOT1 ou GOT2); mannose-fosfato isomerase (MPI); glicose

fosfato isomerase (GPI); fumarato hidratase (FH); glutamato desidrogenase

(GLUD); nucleoside hidrolase deoxiinosine (NH); peptidase d (PEP-D); alanina

aminotransferase (ALAT); e aconitase (ACON), entre outras (BAÑULS et al.,

1999; CHICHARRO et al., 2002; GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al.,

1999).

A migração destas enzimas pode variar de acordo com à modificação das bases

de DNA que determinam a codificação dos aminoácido que compõem a cadeia

polipeptídica expressa pelo alelo homólogo de outra cepa de Leishmania sp.,

modificando a carga elétrica da enzima e, portanto, a migração eletroforética

(ZAIDI, KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003).

A desvantagem da MLEE está associada a avaliação dos produtos dos genes e

não das sequências genéticas o que permite que mutações silenciosas passem

desapercebidas e, assim, cepas distintas possam ser consideradas idênticas

(ZAIDI, KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003; ZEMANOVÁ et al. 2004).

25

Outra desvantagem é a necessidade do cultivo de grandes quantidades de cada

cepa a ser avaliada ou da amostra obtida e de amostras de referência para que

a comparação possa ser feita, aumentando a chance de interferências e

contaminações devido a manipulação. Outra desvantagem está relacionada ao

baixo valor prognóstico e a ausência de poder de resolução para discernir enter

recidivas e re-infecções (EL TAI et al., 2001; MORALES et al., 2001; ZAIDI,

KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003).

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Esta técnica utiliza-se de sequências de 18 a 25 pares de bases (“primers” ou

iniciadores), em média 20 pares de bases, produzidas comercialmente e

complementares as sequências-alvo no material genético da amostra a ser

avaliada (DNA ou RNA molde), na presença de excesso de dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP e dTTP), a enzima Taq DNA polimerase, o íon divalente magnésio

(Mg++) na forma de MgCl2 ou MgSO4 em concentrações variadas (1 – 4mM),

em solução tampão Tris-HCl (10-50mM e pH=8,3 – 8,8) contendo uma

concentração máxima de 50mM de KCl, embora outras formulações existam

(INNIS, 1989).

A reação é feita em um equipamento chamado de termociclador ou máquina de

PCR que altera as temperaturas rapidamente (4°C até 100°C), passando pelas

temperaturas de desnaturação, 94 – 97°C; anelamento, 55 – 65°C; e extensão,

geralmente, 72°C. Durante a desnaturação, o DNA é separado em duas fitas

simples; no anelamento, ocorre a interação dos iniciadores com a sequência de

DNA-alvo; e, na extensão, a cópia do DNA é feita pela Taq DNA polimerase.

Esta reação é feita de forma cíclica (20 – 40 ciclos) levando a detecção de um

produto que, quando corado por brometo de etídio ou SYBR green, se torna

visível sobre uma lâmpada ultravioleta (UV) após a separação eletroforética

(HOWELL, JOBS e BROOKES, 2006; INNIS, 1989).

A utilização das diversas variantes da técnica de PCR (PCR-RFLP; PCR-SSCP;

NESTED-PCR; Multiplex-PCR, Real Time-qPCR, entre outras) na avaliação da

26

diversidade genética se torna um aspecto crucial em campos como a

taxonomia, o diagnóstico, a avaliação epidemiológica, a genotipagem e a

genética de populações dos agentes causadores das leishmanioses, assim

como outras doenças, e vem sendo amplamente difundida e utilizada, com

resultados que apresentam alta sensibilidade e especificidade, além de

excelente repetibilidade e eficácia (CORTES et al., 2004; EL TAI et al., 2001;

FERROGLIO et al., 2005; HARRIS et al., 1998; KUHLS et al., 2005;

ROTUREAU et al., 2006; ZAIDI KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003).

A sensibilidade desta técnica está associada a quantidade de DNA-alvo

presente na amostra coletada e, assim, genes ou seqüências de DNA multi-

cópias, aumentam este parâmetro. A especificidade , por sua vez, correlaciona-

se com todo o resto (todos os outros reagentes da reação) e, primordialmente,

com a seqüência dos “primers” (BENSOUSSAN et al., 2006; INNIS, 1989).

As desvantagens desta técnica estão relacionadas ao 1º) seu alto custo financeiro;

2º) a necessidade de estudos das seqüências genômicas dos alvos a serem

avaliados para a definição da seqüência dos “primers”; 3º) a necessidade de áreas

isoladas para cada etapa da reação (preparação dos tubos de reação, extração de

DNA e análise dos produtos); e 4º) a impossibilidade atual de execução à campo.

27

2.5 RESERVATÓRIOS A definição corrente de reservatório abrange qualquer ser humano, animal,

artrópode, planta ou matéria inanimada onde vive e se multiplica um agente

infeccioso, do qual depende para sua sobrevivência, reproduzindo-se de maneira

a que possa ser transmitido a um hospedeiro suscetível. (Amer. Assoc. Publ.

Health). Um reservatório de infecção é definido como o sistema ecológico em que

um agente infeccioso sobrevive persistentemente (WHO, 1984).

Hospedeiro, segundo a Associação Americana de Saúde Pública, é a pessoa ou

animal vivo, inclusive aves e artrópodes, que, em circunstâncias naturais permitem

a subsistência ou o alojamento de um agente infeccioso. O hospedeiro primário ou

definitivo é aquele em que o agente chega à maturidade ou passa por sua fase

sexuada. O secundário ou intermediário é aquele que se encontra em fase larvária

ou assexuada.

ASHFORD (1996) enfatiza a importância de se conhecer a taxonomia tanto dos

prováveis reservatórios quanto das espécies de vetores incriminadas no ciclo de

transmissão das leishmanioses e define o hospedeiro reservatório como sendo um

mamífero responsável pela manutenção, por longo tempo, de uma população de

agentes infecciosos. Desta forma, teoricamente, a eliminação do hospedeiro

reservatório implicaria na eliminação do agente etiológico presente no foco

doença, no entanto, no caso das leishmanioses, às vezes, é possível prevenir a

transmissão do parasito sem necessariamente eliminar o hospedeiro reservatório.

A incriminação de um determinado reservatório de Leishmania exige a

demonstração de que a população parasitária precisa daquele mamífero em

particular para a manutenção da infecção. Cinco são os critérios que caracterizam

um reservatório primário: 1) superposição da distribuição geográfica e temporal

dos reservatórios e vetores; 2) sobrevivência do hospedeiro reservatório

suficientemente longa para garantir a transmissão; 3) prevalência da infecção

entre os reservatórios em níveis superiores a 20%; 4) manutenção do parasito na

28

pele ou sangue em quantidades suficientes para infectar facilmente o vetor e 5) a

espécie de parasito encontrada no reservatório e no homem ser a mesma

(CHABLE-SANTOS et al., 1995). Por outro lado, de acordo com Shaw (1988), os

hospedeiros podem ser classificados em três tipos: 1) reservatório primário, onde

o hospedeiro é responsável pela manutenção do ciclo do parasito em natureza; 2)

reservatório secundário, em que o hospedeiro infectado serve como fonte de

infecção para o vetor, mas não é capaz de manter o ciclo indefinidamente e 3)

hospedeiro acidental, aquele que se infecta mas não representa fonte de infecção.

2.5.1 Cão (Canis familiaris)

Atualmente, o cão vem sendo incriminado como reservatório da LV, e, como

hospedeiro doméstico dessa zoonose, sendo provavelmente, o mais importante

reservatório natural relacionado com casos humanos (ALENCAR, 1959; MILES et

al., 1999; MONTEIRO et al. 2005). Esse hospedeiro apresenta variações no

quadro clínico da doença, passando de animais aparentemente sadios a

oligossintomáticos podendo chegar a estágios graves da doença, com intenso

parasitismo cutâneo (ABRANCHES et al. 1991; COSTA et al. 1999; DEANE &

DEANE, 1955b). Assim, o cão representa uma fonte de infecção para o vetor,

sendo um importante elo na transmissão da doença para o homem (DEPLAZES et

al., 1995).

Outrossim, esse papel mantenedor da infecção leishmaniotica em determinada

região pode ser incrementado pela coexistência de outros fatores, como a

presença de espécies selvagens sinantrópicas, atuando como potenciais fontes de

infecção para a população canina em áreas peri-urbanas (MUTINGA et al., 1989;

XIMENES, SOUZA e CASTELLÓN, 1999; ALEXANDER et al., 2002; SILVA,

2003). LYSENKO (1971) sugere que a leishmaniose causada pela L. donovani

originou-se de canídeos selvagens (raposas, chacais e lobos) na Ásia Central, e

que posteriormente acometeu o cão devido ao seu estreito contato com o homem.

29

Em cães, a Leishmania coloniza todos os órgãos, em contraste com o que ocorre

em seres humanos, nos quais o parasito está quase que totalmente restrito ao

sistema hematopoiético (BERRAHAL et al. 1996). MARZOCHI e colaboradores

(1985) ao analisar epidemiologicamente a LV, consideraram a doença canina mais

importante que a humana devido a sua alta prevalência nas áreas endêmicas, em

virtude do intenso parasitismo dérmico desenvolvido pelos cães. Outro fator

marcante incide no fato de ser elevado o número de cães infectados e

assintomáticos que passam desapercebidos pelos proprietários e pelo serviço de

vigilância epidemiológica, o que retarda a identificação e retirada destes cães das

áreas, contribuindo para a continuação do ciclo de transmissão do parasito.

O Nordeste Brasileiro segundo ASHFORD (1996) é considerado uma zona de alta

prevalência de LV canina e estima que 20 a 30% da população canina esteja

permanentemente infectada. O autor ressalta, também, que a queda de pêlos em

cães, normalmente observada nos casos clínicos, expõe grandes áreas do corpo

do animal a elevado parasitismo, tornando-o uma fonte de infecção importante em

virtude de facilidade do acesso do vetor ao corpo do hospedeiro.

Os cães são considerados por LAINSON (1988) como hospedeiro amplificador da

LV, principalmente em estágios avançados da doença, em virtude do intenso

parasitismo dérmico. No entanto, o curso, muitas vezes, letal da doença nesta

espécie sugere que o cão é um hospedeiro relativamente recente da L. chagasi e

a relação parasito-hospedeiro se encontra ainda pouco ajustada. Fato que fica

mais aparente pela comparação com a infecção clinicamente assintomática,

normalmente, observada em canídeos selvagens (LAINSON, 1988).

A importância do reservatório canino é ainda mais acentuada em virtude de falhas

na aplicação das medidas de controle nesta espécie, principalmente no tocante ao

diagnóstico sorológico da LV. A utilização ainda freqüente do teste IFI

(imunofluorescência indireta) no diagnóstico da LV canina, como observado por

CABRERA e colaboradores (2003) induz a resultados falso-negativos, acarretando

30

a permanência de animais infectados na área, contribuindo para a manutenção da

endemicidade.

31

2.5.2. Animais Selvagens

A possível existência de reservatórios selvagens ajuda na perpetuação do parasito

numa região endêmica, tendo em vista que as medidas de controle da LV estão

restritas à eliminação de cães soropositivos, à borrifação do peridomicílio e

domicílio com inseticida de ação residual e ao diagnóstico e tratamento precoce

dos casos humanos (CABRERA, 2003).

O acúmulo de lixo, bem como, a criação de animais domésticos para o consumo

humano, a exemplo de galinhas, potencializa a participação de possíveis

reservatórios selvagens a exemplo do Cerdocyon thous (raposa) e do D.

albiventris (sariguê) e Rattus rattus (rato preto) na epidemiologia da LV, uma vez

que contribuem para atrair estas espécies para a proximidade do convívio humano

(ALEXANDER et al., 2002).

No continente americano, as raposas (Lycalopex sp., Cerdocyon sp.) e marsupiais

(Didelphis spp.) têm sido incriminado como hospedeiros reservatórios selvagens

do agente causal da LV (SHERLOCK et al., 1988; LAINSON, 1990).

Além das espécies de marsupiais e canídeos selvagens, freqüentemente

incriminados como reservatórios potenciais de diversas espécies de leishmania,

estes protozoários têm sido isolados de outros hospedeiros selvagens, a exemplo

do tatu (Dasypus novemcinctus), segundo relato de LAINSON e colaboradores

(1979) que encontraram um espécime infectado, e alertaram sobre a possibilidade

desta espécie interagir no ciclo de transmissão da leishmaniose. Em 1982,

LAINSON e colaboradores relatam a co-infecção por Leishmania sp. e

Trypanossoma cruzi em tatus em estudo objetivando comparar o perfil enzimático

de diversas espécies de Leishmania.

LAMPO e colaboradores (2000) consideram que morcegos possam servir como

fonte alimentar para o L. longipalpis e conseqüentemente aventam a possibilidade

32

de servirem como hospedeiro de Leishmania sp. Acreditam ainda que se os

morcegos se enquadrarem nesse papel, poderão estar perpetuando o parasito no

ambiente selvagem alem de outras espécies já conhecidas como os canídeos e

marsupiais. Sendo assim, LAMPO e colaboradores (2000), ampliam o campo de

visão no tocante a epidemiologia dessa zoonose.

GIANNINI (1985) destaca a importância, tanto do Rattus rattus, quanto do Rattus

norvegicus como importantes reservatórios de muitas doenças humanas em

virtude do caráter sinantrópico dessas espécies. A natureza cosmopolita dos ratos

e suas freqüentes migrações, seja por enchentes, falta de alimento ou,

involuntariamente, através de navios e outros meios de transporte são possíveis

fatores de difusão da L. chagasi (LAINSON, 1988).

Através de técnicas moleculares TRAVI e colaboradores (1998), pela primeira vez,

demonstraram que o roedor Proechimys pode ser infectado por L. chagasi.

LAINSON et al. (2002) sugerem a participação do roedor da espécie Proechimys

canicollis como possível hospedeiro reservatório da L. chagasi na Colômbia.

HOOSGSTRAL & HYNEMAN (1969) relatam sobre a possibilidade de carnívoros

(Felis serval e Genetta) terem se infectado por via oral com leishmania ao

ingerirem roedores.

O possível envolvimento da espécie de réptil Tarentola mauritanica (gecko),

atuando como reservatório da leishmaniose cutânea foi comentada por BELOVA

(1971).

33

2.5.2.1 Raposas

Canídeos selvagens são incriminados em diversas regiões do mundo como

reservatórios da LV (DEANE & DEANE, 1954; ALENCAR, 1956; ABRANCHES et

al. 1984).

DEANE & DEANE (1954) utilizaram um espécime de Lycalopex vetulus infectado

com L. chagasi para avaliar o potencial desta espécie de infectar vetores que nela

se alimentem, e verificaram que todos os dez flebótomos utilizados no

experimento, não só foram atraídos a se alimentarem no animal, como todos se

apresentaram infectados posteriormente. DEANE & DEANE (1955a) ao

examinarem 33 raposas (Lycalopex vetulus) encontraram 12,1% (4/33) infectados.

DEANE & DEANE (1962) consideram a Lycalopex vetulus (raposa) um

reservatório recente da L. donovani em virtude do grau de severidade da doença

para essa espécie, ou seja, o fato da raposa adoecer quanto infectada por

Leishmania indica que este animal não está tão bem adaptado como outros

possíveis reservatórios da leishmaniose. Os autores comentam que a eliminação

desta espécie nas áreas habitadas pelo homem parece ser uma medida de

controle complementar importante que traria vantagens adicionais como a redução

dos casos de raiva.

As raposas podem servir como agentes introdutores da leishmaniose em novas

áreas em virtude de que esses animais percorrerem longas distâncias,

aproximando-se com freqüência de cães de rua na busca por alimentos nas

lixeiras de áreas residenciais (LAINSON, 1988).

Na região Nordeste do Brasil a espécie de raposa Cerdocyon thous corresponde

ao principal reservatório silvestre da L. chagasi (COURTENAY, 1996).

34

2.5.2.2 Marsupiais

O gambá, também chamado de mucura na Amazônia e Brasil Meridional, de

sarigué, sariguê, saruê ou sarigueia na Bahia, de timbú ou cassaco de

Pernambuco ao Ceará, e de micurê no Mato Grosso é um mamífero marsupial do

gênero Didelphis. O nome gambá tem origem na língua tupi-guarani, onde "gã'bá"

ou "guaambá" significa uma mama oca, uma referência ao marsúpio, a bolsa

ventral onde se encontram as mamas e onde os filhotes vivem durante parte de

seu desenvolvimento (WIKIPEDIA, 2006). Nas Américas, os marsupiais

pertencentes à família Didelphidae que comporta 65 espécies divididas em 12

gêneros (HUNSAKER, 1977).

Espécies do gênero Didelphis têm sido apontadas como potenciais reservatórios

de Leishmania sp. e, em vista do hábito sinantrópico ser uma característica que

permeia este gênero, a importância destas espécies para a saúde pública deverá,

no futuro, ser considerada, incluindo na pauta das pesquisas, estudos sobre a

biologia, dinâmica populacional, hábito alimentar e papel epidemiológico destas

espécies.

Vários pesquisadores têm se esforçado em contribuir para o conhecimento sobre

a relação entre os marsupiais e as leishmanioses, a seguir listaremos os principais

autores e suas observações sobre o tema:

SHERLOCK e colaboradores (1984) analisando possíveis infecções

leishmanióticas em mamíferos silvestres no município de Jacobina (Bahia - Brasil)

relatam o primeiro registro de um marsupial (D. albiventris), conhecido localmente

como gambá, infectado naturalmente por L. donovani. Apesar do trabalho

realizado por YOSHIDA e colaboradores (1979) que examinaram 10 marsupiais

(D. marsupialis aurita) e cinco roedores por hemocultura e inoculação intradérmica

de punção de fígado e baço em hamster. Dessas inoculações, apenas uma

amostra proveniente de um dos marsupiais apresentou resultado positivo. A

35

caracterização bioquímica do parasito isolado demonstrou, tratar-se de uma

infecção por Leishmania mexicana (GRIMALDI JR., et al. 1985).

DEDET e colaboradores (1989) durante uma investigação epidemiológica sobre a

leishmaniose cutânea na Guiana Francesa, entre os anos de 1981 e 1987,

capturaram, 122 marsupiais (D. marsupialis), dos quais apenas dois animais

estavam infectados por L. braziliensis guyanensis. Outra espécie também

capturada foi o D. albiventris, num total de sete espécimes, porem nenhum deles

apresentou infecção. Pelo baixo número de animais infectados, DEDET e

colaboradores (1989) creditam aos didelfídeos o papel de hospedeiro ocasional,

concordando com o sugerido por LAINSON e colaboradores (1981).

CORREDOR e colaboradores (1989b) identificaram a presença de L. chagasi em

32,4%, sendo que em 12/37 dos exemplares de D. marsupialis capturados em

uma área endêmica na Colômbia, próximo às residências humanas. Os autores

concluem que o D. marsupialis representa um reservatório ideal de L. chagasi

devido à sua elevada abundância nas áreas endêmicas, sua prolificidade e seu

comportamento sinantrópico.

CÁCERES (2003) ao estudar o comportamento do D. aurita quanto ao modo como

essa espécie animal interagia em seu habitat natural avaliando a amplitude de seu

deslocamento e variação alimentar que consumia, em um fragmento de floresta no

sul do Brasil, relata que em virtude das fêmeas desses animais serem maiores,

mais pesadas e conseqüentemente menos ágeis elas se concentram em regiões

onde a fonte de recursos como água e alimentos são mais abundantes. Em

decorrência disso, os machos didelfídeos, acompanham esse condicionamento,

principalmente, durante o período reprodutivo se aproximando de áreas habitadas

pelas populações humanas.

TRAVI et al (1998a) avaliaram a relação hospedeiro–parasito–vetor em marsupiais

infectados experimentalmente com L. chagasi, utilizando recursos clínicos,

36

parasitológicos, histopatológicos e entomológicos, visto que tentativas anteriores

de infectar o D. marsupialis tinham se mostrado de difícil realização segundo

SHERLOCK e colaboradores (1988). As culturas de aspirado esplênico

demonstraram altíssima carga parasitária quando comparados aos demais

tecidos, sendo seguida por linfonodos, fígado e sangue. Os autores relataram que

D. marsupialis infectados por L. chagasi com quadro subclínico da doença não

apresentaram alterações hepáticas significativas. A ausência de formas

amastigotas na pele e em órgãos linfóides de um marsupial com título 1:320 para

leishmania já havia sido observada por outros autores, tanto em infecção natural

quanto experimental. No entanto, neste caso, o parasito pode ser detectado

através de inoculação intra-dérmica em hamsters. Este resultado confirma estudos

prévios e reforça o fato de que marsupiais podem estar naturalmente infectados

sem apresentar sintomas clínicos, mas mantendo o parasito em seus tecidos

(CABRERA, 2003).

TRAVI et al (1998b) estudando a dinâmica de infecção por L. chagasi em

pequenos mamíferos em duas áreas de floresta tropical seca (uma reserva

florestal protegida e uma área agrícola) dentro de uma área endêmica para LV na

Colômbia e observaram a ocorrência de duas espécies mais comumente positivas

para LV, o D. marsupialis e o Proechimys canicollis. Os autores obtiveram por

PCR 14,3% (3/21) de prevalência de infecção nos D. marsupialis capturados na

área de reserva e 9,5% (13/137) dentre os marsupiais capturados na área

agrícola. Não foi registrada diferença significativa na taxa de infecção em D.

marsupialis quando comparado ao fator sexo, todavia animais adultos se

apresentaram infectados com mais freqüência do que os exemplares jovens.

ADLER et al. (1997) relata sobre a capacidade de adaptação do D. marsupialis à

ambientes alterados pela ação antrópica, corroborando as observações de TRAVI

e colaboradores (1998b) que observaram um número maior destes marsupiais em

um campo agrícola quando comparado com uma reserva florestal.

37

A realização do presente trabalho objetivou ampliar o conhecimento sobre a

epidemiologia da LV, com especial ênfase na avaliação da participação da espécie

D. albiventris no ciclo de transmissão da doença e na prevalência da população

canina residente em uma localidade endêmica para LV situada no município de

Camaçari, Bahia.

38

3. ARTIGOS CIENTIFICOS

ARTIGO ENCAMINHADO AREVISTA CIENCIA ANIMALBRASILEIRA

39

Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) e de cães domiciliados na epidemiologia da leishmaniose visceral no município de Camaçari, localidade de Barra do Pojuca, Bahia GOMES NETO1, C.M.B; FRANKE2, C.R.; ALCANTARA1, A.C.; BARBOSA3,

A.E.A., URBAN, J.M.; STÖCKER, A.; GOMES4, S.P.S.B.; BISPO4, A.C.; LEAL5,

D.C.;BITTENCOURT5, D.V.V.; CARNEIRO5, A.J.B.

1 – Mestrando (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos); 2 – Prof. Dr. da Escola de Medicina Veterinária – UFBA; 3 – Biólogo; 4 – Médico Veterinário Autônomo; 5 – Acadêmicos de graduação de Medicina Veterinária - UFBA RESUMO

O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem sendo

citado na literatura como importante reservatório de algumas zoonoses, dentre

elas a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de Chagas,

doenças consideradas pela O.M.S. como endemias de ação prioritárias. Nosso

estudo na localidade de Barra do Pojuca, Camaçari, Bahia, avaliou a prevalência

da LV em marsupiais e cães pelas técnicas de ELISA e PCR. Os resultados

apontam para uma participação da espécie D. albiventris na epidemiologia da

doença com uma soroprevalência de 26,7% (4/15) e 64,7% (11/17) positivos na

PCR. A prevalência da população canina foi de 15,6% (39/253), mostrando que

comparada a estudos realizados em 2003 esta taxa não tem diminuído, apesar do

controle vetorial e do reservatório canino realizado pelos agentes da saúde na

área. Os resultados mostram a necessidade de ampliar o conhecimento, buscando

definir com clareza o papel da espécie D. albiventris no ciclo de transmissão da L.

chagasi e o risco que representa para as populações humanas e caninas nas

áreas endêmicas.

PALAVRAS-CHAVE: leishmaniose visceral, Didelphis albiventris, reservatório

selvagem, Leishmania chagasi, Bahia

40

THE EVALUATION OF OPOSSUM Didelphis albiventris LUND, 1840 (DIDELPHIMORPHIA, DIDELPHIDAE) AND DOMICILIATED DOGS INVOLVEMENT IN THE VISCERAL LEISHMANIASIS TRANSMITION CYCLE IN THE MUNICIPALITY OF CAMAÇARI, LOCALITY OF BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador, Bahia, 2006. 56 p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em

Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade

Federal da Bahia, 2006.

SUMMARY The opossum Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) has been

considered an important reservoir of some zoonosis in the literature, like visceral

and cutaneous leishmaniasis and Chagas disease, which are considered by WHO

as high priority endemic diseases. Our study, carried out in the area of Barra do

Pojuca (Camaçari, Bahia), evaluated the visceral leishmaniasis seroprevalence in

opossum and dogs using indirect ELISA and PCR. The findings point out the

involvement of D. albiventris in the disease epidemiology, presenting a

seroprevalence of 26,7% (4/15) and 64,7% (11/17) positivity by PCR. The canine

population prevalence reached 15,6% (39/253), showing that, compared to a study

performed in 2003, its prevalence is not decreasing, despite vector and canine

reservoir control has been done by the health control agents in the area. The

results presented here clearly ask for an increase of knowledge, looking to define

properly the role of D. albiventris in the Leishmania chagasi transmission cycle and

risk for human and canine populations in the endemic areas.

KEYWORDS: Visceral Leishmaniasis, Didelphis albiventris, wild reservoirs,

Leishmania chagasi, Bahia

41

INTRODUÇÃO O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem sendo

citado na literatura com importante reservatório de algumas zoonoses, dentre elas

a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de Chagas

(SHERLOCK et al., 1984, 1996; LLANOS-CUENTAS, 1999; HERRERA et al.,

2005; JANSEN et al., 1991, 1997), doenças consideradas pela Organização

Mundial de Saúde (OMS) como endemias de ação prioritárias (WHO 1997).

SHERLOCK (1984) fez o primeiro relato sobre a infecção do D. albiventris por

leishmania e a cepa isolada foi identificada como Leishmania donovani, o

marsupial foi capturado no município de Jacobina, Bahia. Após este relato,

CORREDOR et al. (1989), na Colômbia, examinaram 37 exemplares de D.

marsupialis, encontrando 12 (32,4%) infectados por Leishmania chagasi sem

apresentarem sinais clínicos da doença, segundo os autores, estes marsupiais

ocorrem em abundância nas áreas endêmicas do país. TRAVI et al. (1998b)

encontrou exemplares de D. marsupialis infectados por L. chagasi na Colômbia, e

comparando a freqüência de captura e prevalência da infecção em uma área de

reserva florestal (14,3%, 3/21) e em uma área de floresta degradada (9,5%,

13/137), concluido que a espécie representa um importante reservatório de L.

chagasi e que estes marsupiais apresentam elevada capacidade de adaptação a

ambientes antropizados, representando um risco para a saúde pública. CABRERA

et al. (2003) em um estudo de foco de LV em Barra de Guaratiba, Rio de Janeiro,

obtiveram nos D. marsupialis capturados em uma área uma soroprevalência de

infecção por L. chagasi, 29% (9/31) de positividade demonstrando o envolvimento

desta espécie de marsupial na epidemiologia da LV. Estes resultados tornam

evidente a necessidade de aprimorarmos o conhecimento sobre este potencial elo

do ciclo de transmissão da L. chagasi em áreas endêmicas com vistas a um

melhor delineamento das ações de controle desta zoonose. O presente estudo

objetivou avaliar a prevalência de infecção por L. chagasi nas populações de D.

42

albiventris e de cães domésticos em uma localidade do Estado da Bahia, e

analisar a possível associação epidemiológica entre estas espécies na

manutenção do endemismo da LV na região estudada.

MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi realizado na localidade de Barra do Pojuca, município de Camaçari

(12º42'S e 38º20'O), Bahia no período de junho de 2005 a maio de 2006. A

localidade é situada a cerca de 50 km da cidade de Salvador, capital do Estado. A

população de Camaçari é de 161.727 habitantes segundo o censo demográfico

realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2000). O

município apresenta clima úmido, o período chuvoso ocorre entre os meses de

abril e junho, a média pluviométrica anual é superior a 1.600 mm e a temperatura

média anual é de 25,4ºC. Com base em ortofotos (1:8.000) da localidade de Barra

do Pojuca, a área foi dividida em 150 quadrantes com área de 10.000 m2 cada,

dos quais, por critério de alternância, 65 deles foram incluídos no estudo.

A escolha do município Camaçari como área de estudo para o possível

envolvimento de marsupiais na epidemiologia da LV levaram em consideração os

seguintes aspectos:

1) A crescente incidência da doença registrada nas populações humana e canina

residentes nesta região;

2) A alta densidade populacional encontrada neste município, representando um

ambiente propício ao surgimento de focos epidêmicos da doença;

3) O acelerado desenvolvimento deste município e migração de pessoas e

animais possivelmente infectados. A contínua pressão migratória, em sinergismo

com as decorrentes alterações ambientais e o crescimento desorganizado deste

centro urbano, com assustadores índices de pobreza e baixa qualidade de vida,

43

são fatores presentes em todos os focos epidêmicos da leishmaniose visceral,

descritos na literatura mundial

Nos quadrantes selecionados procedeu-se a colocação de 25 armadilhas

colapsáveis do tipo Tomahawk e Sherman utilizando-se banana, abacaxi, ovos e

mamão como isca para atrair os marsupiais. As armadilhas foram dispostas ao

entardecer e recolhidas até as oito horas do dia seguinte, permanecendo este

período uma vez em cada quadrante. Os marsupiais capturados foram

anestesiados com uma combinação de Cloridrato de cetamina (Ketamina Agener

– Ketamina 10% - Agener União) e Cloridrato de Xilazina (Calmium – Xilazina 2% -

Agener União) na proporção de 1:2, utilizando-se a dose de 0,3 mL/kg de peso

vivo. Com o animal anestesiado, procedeu-se a coleta de até 3 mL de sangue por

punção intra-cardíaca ou punção da veia da caudal. Todos os procedimentos

foram precedidos de tricotomia e rigorosa assepsia local. A captura dos

marsupiais ocorreu com a devida permissão do IBAMA (Protocolo Nº

2006.001284/04-70) e todos os animais, após se recuperarem da anestesia, foram

soltos no mesmo local da captura. Nos quadrantes em que havia casas com cães,

em cada casa, foi aplicado um questionário (dados não publicados) aos

proprietários e todos os cães residentes foram contidos fisicamente, com utilização

de mordaças, submetidos à coleta de uma amostra de 3 a 5 mL de sangue por

punção venosa cefálica ou jugular, sem utilização de anestésicos e,

posteriormente as amostras foram destinada à sorologia por ensaio

imunoenzimático (ELISA) e ao diagnóstico pela PCR, assim como as amostras

coletadas nos marsupiais. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas,

específicas para cada um dos dois testes, e conservadas a –20ºC até o momento

de uso.

44

A localização dos quadrantes foi feita através do sistema de posicionamento

global – GPS (Garmim – 12 canais GPS45).

Figura 1. Composição artificial da área de estudo (localidade de Barra do Pojuca – Camaçari - Bahia). a partir de cinco ortofotos produzidas pela Conder e editadas com auxilio do software Photo Stich Cânon para alinhamento perfeito das projeções

45

O ensaio imunoenzimatico (ELISA) para avaliação de soros de cães e de

marsupiais foram executados como a seguir: Placas de poliestireno para EIA/RIA

(Corning, USA) foram sensibilizadas com 100µL de antígeno de L. chagasi

(5µg/mL) em tampão carbonato-bicarbonato (0,05M, pH=9,6) a 4°C, “overnight”.

No dia seguinte, o antígeno foi desprezado e a placa foi lavada 4 vezes com PBS-

T (NaCl 0,15M + Tampão fosfato 0,01M, pH=7,2±0,2 + 0,05% de Tween 20). Após

as lavagens, 100µL dos soros controles (positivo e negativo) e dos soros testes

caninos foram aplicados em duplicata, diluídos 500 vezes e os soros de

marsupiais diluídos 20 vezes em PBS-T-M (NaCl 0,15M + Tampão fosfato 0,01M,

pH=7,2±0,2 + 0,05% de Tween 20 + 5% de leite desnatado) e incubados por 1

hora a temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram lavadas com PBS-

T por 4 vezes e 100 µL de um conjugado IgG de coelho anti-IgG de cão conjugado

com Peroxidase (código A9042, SIGMA St Louis, MO – USA), diluído 25.000

vezes, foi adicionado às placas dos soros caninos, enquanto 100 µL de um

conjugado proteína A Peroxidase (código 10-1023, ZYMED, Invitrogen, San

Francisco, CA – USA), diluído 8.000 vezes, foi utilizado para as placas de

marsupiais e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. A revelação, após 4

lavagens sucessivas com PBS-T, foi feita com uma solução contendo OPD

(0,4mg/mL, SIGMA St Louis, MO – USA) e peróxido de hidrogênio a 0,015% em

tampão citrato-fostato (0,1M e 0,2M, respectivamente, pH=5,1) adicionando-se

100µL e, após 15 minutos, a reação foi parada com 50 µL por poço de uma

solução de ácido sulfúrico 4N e a placa submetida a leitura em leitor de ELISA

com filtro de 492nm. As densidades obtidas nas diferentes placas de ELISA dos

soros caninos foram corrigidas diminuindo-se a média dos brancos dos valores

dos controles positivos da mesma placa e correlacionando-a com o valor da placa

seguinte corrigida da mesma forma. O ponto de corte para o ELISA canino foi

0,143 enquanto o de marsupiais foi de 0,167, ambos determinados pela curva

ROC (“Receiver Operating Characteristics”), utilizando-se um soro positivo e um

soro negativo de marsupial, confirmados por cultura e sorologia, gentilmente

cedidos pelo Prof. Dr. Heitor Miraglia Herrera ou um “pool” de soros caninos com

cultura positiva e negativa (controles do teste), apresentando sensibilidade de

46

100% e especificidade de 90% (para o ELISA canino) e 100% de sensibilidade e

100% de especificidade para o (ELISA de marsupiais), com um Intervalo de

Confiança de 95%.

Amostras de sangue periférico foram mantidas em tubos contendo EDTA a -20°C

até que a extração do DNA fosse executada, lavando-se o sangue em TE (Tris

10mM e EDTA 1mM, pH=8,0). Após esta lavagem, os leucócitos foram

ressuspensos em uma solução contendo 10mM Tris, 1mM EDTA, 1%SDS e

100µg/mL proteinase K, “overnight”, a 37°C. A solução foi então aquecida a 100°C

por 15 minutos para inativar a proteinase K e centrifugada a 13.000xg. Dois µL do

sobrenadante foram utilizados para a reação de PCR. Quando houve negatividade

da amostra, uma extração fenólica foi efetuada, seguida de precipitação etanólica

e a PCR repetida para confirmar a negatividade e a ausência de inibidores de

PCR. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi feita com base nos primers

degenerados descritos por DEGRAVE et al., 1994; MARQUES et al., 2006;

PASSOS et al., 1996; RODGERS, POPPER e WIRTH, 1990; VOLPINI et al.,

2004, os quais reconhecem a região conservada do minicírculo do DNA de

cinetoplastídeo (kDNA, presente na família Trypanosomatidae), gerando, na

amplificação por PCR, produtos de aproximadamente 116-120pb de comprimento

para os subgêneros Leishmania e Viannia, respectivamente. Foram utilizados

primers degenerados (primers com combinação múltipla de nucleotídeos em

determinadas posições da cadeia) que pareavam com as seqüências dos

minicírculos de Leishmania kDNA. A reação foi feita em tubo de PCR,

adicionando-se 1µM de cada primer 150: 5' – GGGKAGGGGCGTTCTSCGAA – 3'

e 152: 5' – SSSWCTATWTTACACCAACCCC – 3' (IDT Technologies, USA);

200µM de dNTPs (Amersham, USA); 1,5mM de MgCl2; 1U de Taq DNA

polimerase (New England Biolabs – MA, USA) em tampão 10x (500mM de KCl,

100mM de (NH4)2SO4, 200mM de Tris-HCl e 1% de Triton X-100, pH=8.8) para um

volume final de 10µL, em 30 ciclos de 94°C por 1 minuto, 65°C por 1 minuto e

72°C por 1 minuto, seguido de 5 minutos a 72°C. Os produtos de PCR foram

observados e fotografados em um gel de agarose a 2% contendo SYBR green

47

(Molecular Probes, Invitrogen, USA) diluído 10.000 vezes em tampão TBE 0,5X

(Tris-borato 0,045M e EDTA 1mM, pH=8,3) com uma voltagem constante de 5-10

V/cm. A presença de uma banda de 116-120 pares de base confirma o diagnóstico

positivo para leishmania.

48

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos 65 quadrantes estudados foram analisados 253 cães e 17 marsupiais. Em

46,2% (30/65) dos quadrantes havia casas com cães, estando situados em área

urbana ou peri-urbana (sítios) da localidade de Barra de Pojuca. Um total 52,3%

(34/65) dos quadrantes estavam situados em áreas desabitadas com paisagem

formando um mosaico de resquícios de mata, áreas alagadas, coqueirais e

bananais, tendo o relevo caracterizado por encostas escarpadas. Todos os 17

marsupiais capturados pertenciam à espécie D. albiventris. Dentre eles o peso

variou de 300 a 1.600g, sendo que 12 eram machos e cinco fêmeas. 16

exemplares foram capturados em quadrantes com casas (zonas urbana e peri-

urbana) e apenas um foi capturado em área desabitada. Como não se tinha

conhecimento a cerca de quais espécies de marsupiais era freqüente na

localidade de Barra do Pojuca e como o que investigávamos era a participação

desses marsupiais, indistintamente em relação a espécie animal pertenceriam,

podemos ter incorrido em falhas quanto ao melhor tipo de isca a ser adotada para

captura. Em virtude disso variamos no tipo de isca utilizada. Provavelmente, a não

especificidade e uniformidade das iscas utilizadas em todos os quadrantes de

estudo tenha nos levado a capturar um numero menor de marsupiais do que

prevíamos. Segundo relato dos habitantes locais, estes marsupiais (na região são

chamados vulgarmente de sariguê) são freqüentemente vistos nas vizinhanças. O

maior número de marsupiais capturados nas áreas com habitações humanas

confirma o hábito sinantrópico desta espécie e sua capacidade de adaptação aos

ambientes alterados pelo homem. Esta tendência comportamental foi observada

por TRAVI et al. (1989b) na espécie D. marsupialis na Colômbia, onde um número

elevado deste marsupial foi capturado em uma área de floresta intensamente

antropizada em comparação com uma área de reserva florestal. CABRERA et al.

(2003) durante o estudo de um foco de LV em Barra de Guaratiba, Rio de Janeiro,

capturaram 31 espécimes de D. marsupialis nas imediações das casas estudadas.

49

Os resultados sorológicos dos cães e marsupiais examinados para leishmaniose

vísceral são apresentados na Tabela 1. Apesar da localidade de Barra do Pojuca

ser atendida pelo Centro de Controle de Zoonoses de Camaçari em suas ações de

controle da LV, especialmente no tocante a borrificação com inseticida de ação

residual e retirada dos cães soropositivos da área, a soroprevalência encontrada

ainda é elevada e, considerando os resultados de JULIÃO (2004) quando em

2003, estudando a mesma área, obteve uma soroprevalência canina média de

27% nos focos de LV analisados pelo autor, Barra do Pojuca parece manter

elevadas taxas de prevalência ao longo do tempo, expondo a população humana

a um elevado risco de infecção. CUNHA e colaboradores (1995), em um estudo

realizado na localidade Monte Gordo, também no município de Camaçari,

encontrou taxas de soroprevalência de LV de 6,3% em cães e 14% em humanos

e, nestes últimos, uma taxa aproximada de 30% de intradermorreação positiva ao

teste Monte Negro. Estes dados proporcionam uma impressão sobre o grave risco

a que estão submetidas às populações humanas residentes em áreas endêmicas

de LV.

De acordo com nossas informações, os dados de soroprevalência e PCR de LV

em marsupiais apresentados neste trabalho são os primeiros registros no Estado

da Bahia. A taxa de 26,7% (4/15) de soroprevalência na espécie D. albiventris

(Tabela 1) é elevada e sugere o envolvimento desta espécie no ciclo de

transmissão do parasito na área de estudo. Os resultados da PCR obtidos dos

marsupiais capturados neste estudo revelam uma taxa de infecção de 64,7%

(11/17), demonstrando de forma clara a participação desta espécie na

epidemiologia da LV na área estudada.

50

TABELA 1. Resultados do ensaio imunoenzimático (ELISA) para leishmaniose

visceral feito nos cães e marsupiais coletados na localidade de Barra do Pojuca,

situada no município de Camaçari, Bahia.

CÃES MARSUPIAIS

ELISA ELISA PCR

Positivo 39 (15,6%) 4 (26,7%) 11 (64,7%)

Negativo 214 (84,6%) 11 (73,3%) 6 (35,3%)

n 253 (100%) 15 (100%) 17 (100%)

Resultados obtidos por CORREDOR e colaboradores (1989b), estudando a

espécie D. marsupialis na Colômbia demonstram também uma elevada

prevalência de infecção por L. chagasi, os autores registram a prevalência de

32,4%, (12/37) nos marsupiais capturados em uma área endêmica Colômbia,

próximos às residências humanas. Os autores concluem que o D. marsupialis

representa um reservatório ideal de L. chagasi devido à sua elevada abundância

nas áreas endêmicas, sua prolificidade e seu comportamento sinantrópico. TRAVI

et al (1998a) avaliaram a relação hospedeiro–parasito–vetor em marsupiais

infectados experimentalmente com L. chagasi, utilizando recursos clínicos,

parasitológicos, histopatológicos e entomológicos, visto que tentativas anteriores

de infectar o D. marsupialis tinham se mostrado de difícil realização segundo

SHERLOCK e colaboradores (1988). As culturas de aspirado esplênico

demonstraram altíssima carga parasitária quando comparados aos demais

tecidos, sendo seguida por linfonodos, fígado e sangue. Os autores relataram que

D. marsupialis infectados por L. chagasi com quadro subclínico da doença não

apresentaram alterações hepáticas significativas. A ausência de formas

amastigotas na pele e em órgãos linfóides de um marsupial com título 1:320 para

leishmania já havia sido observada por outros autores, tanto em infecção natural

51

quanto experimental. No entanto, neste caso, o parasito pode ser detectado

através de inoculação intra-dérmica em hamsters. Este resultado confirma estudos

prévios e reforça o fato de que marsupiais podem estar naturalmente infectados

sem apresentar sintomas clínicos, mas mantendo o parasito em seus tecidos

(CABRERA, 2003). TRAVI et al (1998b) estudando a dinâmica de infecção por L.

chagasi em pequenos mamíferos em duas áreas de floresta tropical seca (uma

reserva florestal protegida e uma área agrícola) dentro de uma área endêmica

para LV na Colômbia e observaram a ocorrência de duas espécies mais

comumente positivas para LV, o D. marsupialis e o Proechimys canicollis. Os

autores obtiveram por PCR 14,3% (3/21) de prevalência de infecção nos D.

marsupialis capturados na área de reserva e 9,5% (13/137) dentre os marsupiais

capturados na área agrícola. Não foi registrada diferença significativa na taxa de

infecção em D. marsupialis quando comparado ao fator sexo, todavia animais

adultos se apresentaram infectados com mais freqüência do que os exemplares

jovens. ADLER et al. (1997) relata sobre a capacidade de adaptação do D.

marsupialis à ambientes alterados pela ação antrópica, corroborando as

observações de TRAVI e colaboradores (1998b) que observaram um número

maior destes marsupiais em um campo agrícola quando comparado com uma

reserva florestal. Estes trabalhos, apesar de terem sido realizados em outras

regiões e com uma espécie de marsupial diferente da analisada em nosso estudo,

são semelhantes aos nossos resultados de prevalência e de preferência por

ambientes antropizados ou próximos das áreas habitadas por pessoas. Esta

capacidade de adaptação dos Didelphis sp. ao ambiente humano e a elevada

freqüência de animais infectados por Leishmania sp. tornam estas espécies

potenciais elos no ciclo de transmissão de L. chagasi e indicam a necessidade de

mais pesquisas visando esclarecer o papel desta espécie na epidemiologia da LV.

52

CONCLUSÕES

A espécie de marsupial predominante na localidade de Barra do Pojuca é a

Didelphis albiventris e a freqüência de captura nos quadrantes situados em áreas

urbanas e peri-urbanas, indica um comportamento sinantrópico da espécie.

A soroprevalência e os resultados da PCR nos marsupiais indicam que a espécie

participa do ciclo de transmissão da L. chagasi, no entanto são necessários mas

estudos para definir seu verdadeiro papel na epidemiologia da LV no tocante ao

risco que representam às populações humanas e caninas nas áreas endêmicas.

Apesar das ações de controle da LV efetuadas pelo Centro de Controle de

Zoonoses de Camaçari na localidade de Barra do Pojuca, a soroprevalência da

doença na população canina não foi reduzida, o que pode apoiar a hipótese da

participação de espécies selvagens, como os marsupiais, na epidemiologia da

doença, atuando como reservatórios da L. chagasi e fonte de disseminação da

doença na área.

53

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a: Fundação Alexander von Humboldt pela doação dos

equipamentos para a realização da PCR (III-ERSX-BRA/1067633) cedidos ao

Prof. Dr. Carlos Roberto Franke; ao apoio financeiro número 478702/2003-5 do

CNPq - Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnológico; a

FAPESB – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia a bolsa de

mestrado concedida ao primeiro autor; ao Centro de Controle de Zoonoses do

município de Camaçari; e ao Centro de Saúde de Barra do Pojuca, bem como às

colaborações técnicas de Bárbara Maria Paraná da Silva Souza; Danielle Custódio

Leal; Débora Cristina Portela Medina Barbosa; e Lídia Silva de Oliveira.

54

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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55

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56

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nosso estudo demonstrou que na localidade de Barra do Pojuca a espécie

predominante de marsupial é a Didelphis albiventris a qual foi com freqüência

capturada nos quadrantes situados em áreas urbanas e peri-urbanas, indicando

um comportamento sinantrópico da espécie. A soroprevalência e os resultados da

PCR nos marsupiais indicam que a espécie participa do ciclo de transmissão da L.

chagasi, no entanto são necessários mais estudos para definir seu verdadeiro

papel na epidemiologia da leishmaniose visceral no tocante ao risco que

representam às populações humanas e caninas nas áreas endêmicas. Apesar das

ações de controle da leishmaniose visceral efetuadas pelo Centro de Controle de

Zoonoses de Camaçari na localidade de Barra do Pojuca, a soroprevalência da

doença na população canina não foi reduzida, o que pode apoiar a hipótese da

participação de espécies selvagens, como os marsupiais, na epidemiologia da

doença, atuando como reservatórios da L. chagasi e fonte de disseminação da

doença na área.

57

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76

ANEXO I

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA - ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA

LABORATÓRIO DE INFECTOLOGIA VETERINÁRIA - LIVE FICHA PARA COLETA DE SANGUE EM VISITA DOMICILIAR - BARRA DO POJUCA

Data da coleta: ____/____/200_

Registro Nº: ____________ Referência: _________ UTM: __________ X ___________

Quadrante:_________

DADOS DO PROPRIETÁRIO

Nome (Chefe da família): Telefone: Endereço: FNS: Bairro: Nº de moradores (idades: ) Nº de cães na casa: Quanto tempo reside em Barra do Pojuca ?

DADOS DO CÃO

Nome: Sexo ( 1 ) M ( 2 ) F

Idade: ( 1 ) < 1 ano ( 2 ) 1 a 5 anos ( 3 ) > 5 anos

Raça ( 1 ) ( 2 ) SRD

Pêlo ( 1 ) Curto ( 2 ) Médio/Longo

Peso ( 1 ) < 5 kg ( 2 ) 5 até 20 kg ( 3 ) > 20kg

Estado corporal ( 1 ) Caquexia ( 2 ) Normal

Mucosas ( 1 ) Normal ( 2 ) Hipocorada ( 3 ) Congesta

( 4 ) Ictérica

Comportamento ( 1 ) Apático ( 2 ) Ativo

Estado da pele

77

Alopecia ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Ulceras Nasais ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Labiais ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Hiperqueratose ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Escoriação ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Emaciação: ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Onicogrifose ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Olhos ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Alimentação ( 1 ) Comida/ Mista

( 2 ) Ração

Forma de criação ( 1 ) Não sai ( 2 ) Sai

Tempo de posse

Origem ( 1 )Barra do Pojuca ( 2 ) Camaçari

( 3 )Outros

( 4 )Ignorada

Especificar:

Este cão já foi vacinado ?

( 1 ) Sim. Qual ? Quando ? ( 2 ) Não

Sabe o que é leishmaniose / calazar? ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

É a primeira vez que faz exame no animal? ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Qual o resultado? ( 1 ) Positivo ( 2) Negativo

Quando foi feita a sorologia?

Observação:

Já teve cão positivo para Calazar? Sim ( 1 ) Quando: ( 2 ) Não

O que fez ?

Já houve algum caso em casa ou na vizinhança de calazar humano?

Sim ( 1 ) Quando:

( 2 ) Não

Sabe sobre cão com calazar eliminado no vizinho? Sim ( 1 ) Quando:

( 2 ) Não

78

Tem outros animais ?

( 1 ) Não ( 2 ) Gato

( 3 ) Galinha

( 4 )Porco

( 5 )Outro

Presença de animais silvestres perto de casa ?

Rato ( 1 ) Freqüentemente ( 2 ) Às vezes

( 3 ) Raramente

Sariguê ( 1 ) Freqüentemente ( 2 ) Às vezes

( 3 ) Raramente

Raposa ( 1 ) Freqüentemente ( 2 ) Às vezes

( 3 ) Raramente

Outros/Observação

Qual o destino do lixo?

( 1 ) Queima/Enterra/Acumula a céu aberto

( 2 ) Coleta Qual a freqüência?

( 1 ) Semanal ( 2 ) Quinzenal ( 3 ) Mensal

Tem água encanada ?

( 1 ) Sim ( 2 ) Não. De onde vem ?

Tem rede de esgoto ?

( 1 ) Sim ( 2 ) Não. Para onde vai ?

Quintal na casa ? ( 1 ) Sim ( 2 ) Não

Quando foi a última dedetização ? ( 1 ) Sim. Quando: ( 2) Não

Existem agrupamentos de árvores nas proximidades (mata) ?

( 1 ) Sim ( 2) Não

Documents

Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris