POLIMORFISMOS DNA

GPH 08/10/2009 - LM

A Diversidade no G.H.As mutaes esto na origem das muitas formas de diversidade no genoma sem consequncias clnicas ou fenotpicas - polimorfismos. Este tipo de diversidade gentica comummente utilizada para: estudos populacionais (estudo da diversidade gentica humana); estudos forenses (identificao individual e testes de paternidade; marcadores genticos (mapeamento gnico).

Mutaes, polimorfismos ou variantes ?Polimorfismo - ocorrncia na populao de pelo menos 2 alelos (de um gene ou sequncia de DNA), com frequncia do alelo mais raro 1% na populao geral.

A Diversidade no G.H.At aos anos 80 Grupos sanguneos Protenas do sangue

Depois dos anos 80 Polimorfismos de DNA

Fig 3.3 Jobling, Hurles & Tyler-Smith, 2004.

Distribuio dos diferentes tipos de polimorfismos ao longo do cromossoma.

POLIMORFISMOS DNASingle Nucleotide Polymorphisms -SNPsMicrossatlites Minissatlites Sequncias ALU

1. Single Nucleotide Polymorphisms SNPsDiferena de um nucletido entre 2 sequncias homlogas de DNA.

Alelo 1

ATACTA

Alelo 2

ATAATA

Forma mais simples e mais abundante de variabilidade no genoma humano: 2 milhes apontados em bases dados e 10 milhes estimados para o genoma (1 snp / 1250 pb).

Deteco de SNPDeteco por PCR - enzima restrio (RFLPs)Primer ER

CC

CT

TT150 pb 100 pb 50 pb

Alelo C

CER

Alelo T

T50 pb 100 pb

+

+

Digesto com enzimas de restrio500 pb 5- ///////////////////////////////////////////////////GAATTC/////////////// -3 GAATTC Eco RIDIGESTO

400 pb 5- ///////////////////////////////////////////////////G -3

100 pb

+

5- AATTC/////////////// -3

500 pb 5- ///////////////////////////////////////////////////GAATTC/////////////// -3MUTAO

5- ///////////////////////////////////////////////////GTATTC/////////////// -3 GAATTC Eco RIDIGESTO

500 pb 5- ///////////////////////////////////////////////////GTATTC/////////////// -3

Deteco de SNP por PCR - enzima restrio (RFLPs)Gel de Agarose

+

TT

AA

TA

TA

TT

TT

Gel de Acrilamida

+

Deteco de SNPsSnapShot SequenciaoM1 70 M6 2 M1 72 M2 6 M2 01

Microarrays SSCP

Mtodos estudo de SNPs

Jobling, Hurles & Tyler-Smith, 2004. (Fig 4.8)

Aplicaes Polimorfismos SNP Estudo da diversidade gentica populaes humanas (GENTICA POPULACIONAL). Estudos de ligao gnica (linkage analysis) identificao de genes responsveis por doenas mendelianas (co-segregao de polimorfismo com alelos responsveis por fentipo clnico, em famlias afectadas). Estudos de associao identificao de genes responsveis por doenas multifactoriais (incidncia de polimorfismo marcador em populaes de indivduos afectados e normais). Farmacogentica Estudo da variabilidade gentica dos indivduos em relao a drogas especficas.

Estudos populacionais

Estudos populacionaisHaplogrupos do cromossoma Y identificados numa amostra da populao portuguesa por estudo de marcadores bi-allicos (SNPs).

SRY1532

M213

M96

M9

M35 M304 12f2 M170

92R7 M201 M34 M81 M78

M173

M172

P25

SRY1532

M70

M26 M269 J(xJ1a,J2) I (xI1b2) G E3b3a E3b2 E3b1

R1b3

R1b

R1a

K2

J2

DNA repetitivo mltiplo (em tandem) (VNTRs)Sequncias de DNA repetidas um nmero varivel de vezes, algumas altamente variveis (polimrficas). Satlite - blocos de DNA com centenas de kb a Mb, com unidades repetitivas >25 pb. Exemplos componentes dos centrmeros. Telmeros - DNA repetitivo com motivos 6 pb (TTAGGG), que se estende por 10-15 kb. Minissatlites unidades repetitivas de 10-100 pb, em n de cpias 5 a 1000. Hipervariveis (alelos mltiplos). Microssatlites (STRs) unidades repetitivas 2-5 pb, com n de cpias tipicamente entre 10 a 30. Hipervariveis (alelos mltiplos).

2. MINISSATLITESMS31; 7p22 ACCCACCTCCCACAGACACT

Alelo 1

7 repetiesAlelo 2

8 repeties

Sequncias repetitivas com 8-100 pb, em blocos de 0,1-20kb. Elevada variabilidade: elevado n alelos nas populaes. Alelos so discriminados pelo tamanho

RE

Minissatlites MinissatlitesDeteco por Deteco por

Southern blot Southern blotGenomic DNA

AplicaesDNA FingerprintA - Pesquisa de parentesco

Minissatlites utilizados no DNA fingerprint possuem sequncia comum sonda multilocus.

Southern-blot (sonda unilocus)

1

2

3

4

5

6

3. MICROSSATLITESShort Tandem Repeats (STRs)AAT

Primer D

Alelo 1Primer D

10 repeties

Primer R

Alelo 2 12 repetiesPrimer R

Sequncias repetitivas, com 2-6 pb, em blocos at ~150 pb. Elevada variabilidade: elevado n alelos nas populaes. Localizao: regies inter-gnicas; intres; exes.

Discriminao dos alelos por tamanho, aps PCR: regies flanqueadoras para os primers no variam.

Mecanismo mutacional STRs - slippageTaxa de mutao = 10-3 a 10-4 por locus por gerao.

Mutao ocorre como resultado de erros de alinhamento durante a replicao do DNA.

+ 1 repeat

- 1 repeat

Exemplos de Microssatlites Exemplos de Microssatlites

Deteco de STRsPCR electroforese em gel de acrilamida(colorao com nitrato de prata)

+TH01 TPOX CSF Anlise de 3 STRs: kit Promega em gel acrilamida

PCR Multiplex Amplificao at 10 marcadores de uma s vez (PCR amplification kits) Utilizao de fluorocromos de cores diferentes para distinguir alelos STR com tamanhos semelhantes Equipamento adequado ABI Prism

Identificao individual com STRs multiplexAmpFlSTR SGM Plus kit DNA Size (base pairs)

Two different individuals

amelogenin D19

D3

D8 TH01 VWA

D21 FGA

D16 D18 D2

amelogenin D3 D19 D8 VWA TH01

Probabilidade de mesmo gentipo: ~1 em 3 triliesD16 D21 FGA D18 D2

Anlise simultnea de STRs

Microssatlites vantagens anlise por PCR utiliza quantidades de DNA reduzido ou degradado altamente polimrficos deteco automtica largamente distribudos pelo genoma (centenas marcadores STR identificados) selectivamente neutros (quando localizados em regies no codificantes)

Microssatlites aplicaes Estudo da diversidade gentica das populaes Gentica forense(Identificao individual; estudos de paternidade)

Estudos de ligao gnica (linkage analysis) Estudos de associao

Aplicaes: gentica forenseSTRs autossmicos nos testes de paternidade

3?

alelos 1-2 alelos 1-3

Aplicaes: gentica forenseSTRs autossmicos nos testes de paternidadeM F PP M F PP

alelos1 2 3

alelos1 2 3

1/2

1/3

2/3

1/2

1/3

2/2

Excluso

Teste de paternidadePP

FILHO

ME

Testes permitem 99,99% probabilidade de paternidade 100% probabilidade de excluso

No

exemplo

verifica-se

100% probabilidade de excluso do pretenso pai (PP)

4. Sequncias Alu Sequncias de DNA repetitivo com ~300pb disperso pelo genoma Elemento SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) ainda activo no genoma humano. Multiplica-se por retrotransposio (retroelemento). Nome deriva da enzima de restrio Alu I. Existe em cerca de 1 milho de cpias (10,6% do genoma). Tem cerca de 300 pb. encontrado normalmente em regies extragnicas e intres Origem: recente, na evoluo dos primatas (65 MA); a partir do gene 7SL (rRNA).

Sequncias Alu estrutura Bipartida - possui regio rica em A no centro.

Na regio 3 possui uma sequncia poli-A Existem diversas famlias de elementos caracterizadas por mutaes especficas.

Alu,

Exemplo de uma sequncia ALU.

Sequncias Alu - polimorfismos Presena (+) ou ausncia (-) da sequncia Alu em regies homlogas do DNA (sistema bi-allico). Conhecidos em cerca de 800 locais no genoma Deteco: PCR - electroforese agarose

BibliografiaJobling, Hurles & Tyler-Smith. Human Evolutionary Genetics. 2004

Captulo 3